DE69932205T2

DE69932205T2 - Verwendung von Carprofen und dessen Derivaten zur Vorbeugung oder Behandlung degenerativer Gelenkerkrankung

Info

Publication number: DE69932205T2
Application number: DE69932205T
Authority: DE
Inventors: Nigel Anthony East Lyme Evans; Carolyn Rose Old Lyme Kilroy; Kristin Marie Groton Lundy; Jean-Pierre St. Lambert Pelletier; Anthony Paul Stonington Ricketts
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2019-05-06
Also published as: IL129992A0; ZA993478B; CA2272463C; DE69932205D1; JP2003183160A; TWI222360B; CA2272463A1; HU9901698D0; US20010002401A1; EP0970694A3; US20030008911A1; US6506785B2; JP3749634B2; AU3120899A; HUP9901698A3; ATE332131T1; HUP9901698A2; KR19990088495A; EP0970694B1; EP0970694A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Carprofen bei Katzen, Hunden und Pferden als Mittel zur Prävention einer Knorpel- und subchondralen Knochenschädigung und -abnahme in den entzündeten Gelenken derartiger Säuger. Eine derartige Schädigung des Knorpels und subchondralen Knochens ist eine natürliche Folgeerscheinung des Prozesses einer Osteoarthritis und von deren Nachwirkungen, wenn sie bei den Säugern auftritt. Die Fähigkeit von Carprofen, dieses unerwartete Ergebnis zu erreichen, wird als "Chondroprotektion" bezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Carprofen wurde bisher als COX-2-selektives nichtsteroidales entzündungshemmendes Arzneimittel (NSAID) verwendet, dessen Aktivität zumindest teilweise auf der starken und selektiven Hemmung des induzierbaren Cyclooxygenase-II (COX-2)-isoenzyms beruhte. Eine derartige Aktivität schließt jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass Carprofen, wie andere NSAIDs, Hemmaktivität in Bezug auf die Enzyme, die am Lipoxygenaseweg beteiligt sind, besitzt oder dass es gegen die Suppression, Rekrutierung und Migration von Entzündungszellen und die Freisetzung von Enzymen und von Sauerstoff stammenden freien Radikalen aus derartigen Zellen aktiv ist. Zwar ist einschlägig klar, dass alle diese Aktivitäten offensichtliche Relevanz für die Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) besitzen, doch sind sie nicht ebenso klar relevant für die Behandlung von Osteoarthritis (OA). Tatsächlich ist bekannt, dass es einige NSAIDs gibt, die die Progression von OA verschlimmern, und einige pathologische Knorpel- und Knochenveränderungen resultieren aus der Überbeanspruchung beeinträchtigter Gelenke als Ergebnis einer NSAID-induzierten Analgesie. Dieses Phänomen wird als Analgesiearthropathie bezeichnet.
OA weist eine komplexe multifaktorielle Kausalität und beträchtliche Variabilität in deren klinischem Ausdruck auf, doch scheint eine Synovialentzündung eine Schlüsselkomponente von OA zu sein. Ferner kann eine Synovialschädigung infolge einer Kommunikation zwischen Synovialzellen und Knorpelzellen (Chondrocyten) die Disaggregation von Proteoglykanen (PGs) stimulieren und aktivierte Synovialzellen produzieren eine große Zahl löslicher Faktoren, beispielsweise Interleukin-1 (IL-1), Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α) und Prostaglandine, die eine Gelenkknorpelabnahme induzieren können. Eine direkte Schädigung von Chondrocyten stimuliert ferner Matrixmetalloprotease (MMP)-Aktivität, beispielsweise Kollagenasen, Stromelysine und Gelatinasen, und die Produktion verschiedener Entzündungsmediatoren. In jedem Fall ist eine verringerte Funktionalität von Gelenkknorpel für die Pathogenese von OA fundamental. Die Depletion von PGs aus den Geweben von OA-Gelenken unterwirft die Chondrocyten und Zellen des subchondralen Knochens und der Synovialis anomalen mechanischen Belastungen wegen der Elastizität, die die PGs Knorpel verleihen.
Knorpel ist grundlegend ein PG-Aggregat, das einem Protein-Kohlehydrat-Komplex umfasst, dessen filamentöse Struktur aus einem einzigen langen Hyaluronsäuremolekül, an das längere Kernproteine nicht-kovalent gebunden sind, aufgebaut ist. Diese Proteinketten wiederum weisen über Serinseitenketten kovalent an sie gebundene Chrondroitinsulfat- und Keratinsulfatketten auf. Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und Keratinsulfat sind alle Beispiele für Glykosaminoglykane (GAGs), d.h. Polysaccharide, die Polymere von wiederkehrenden Disaccharideinheiten, in denen einer der Zucker entweder N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin ist, umfassen. In Knorpel bindet die PG-Struktur Kollagen und sie trägt dazu bei, dass die Kollagenfasern in einem dichten starken Netzwerk gehalten werden. Kollagenfasern werden wiederum aus dem grundlegenden Tropokollagenmolekül gebildet, das eine Tripelhelix aus drei Polypeptidketten von jeweils einer Länge von etwa 1000 Resten ist.
In einem gegebenen Gelenk erfolgen kontinuierlich Stoffwechselprozesse, die für dessen Reparatur und Normalisierung anschließend nach dem Erfahren einer Schädigung, wie eines Traumas, desselben notwendig sind. Daher muss eine Verbindung, damit sie ein akzeptables chondroprotektives Mittel ist, zu allererst fähig sein, eine derartige Chondrocytenstoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, d.h. nicht die zelluläre Replikation und Biosynthese von Matrixkomponenten, die Teil des Heilungsprozesses sind, zu hemmen oder zu stören. Im Hinblick darauf erkennt der Fachmann, dass viele NSAIDs eine deutliche Hemmwirkung auf die Biosynthese der Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix zeigen. Gleichzeitig muss ein akzeptables chondroprotektives Mittel fähig sein, der abbauenden Wirkung von Mediatoren, wie verschiedenen Cytokinen, Prostaglandinen und Proteinasen, an dem Knorpel entgegenzuwirken. Daher ist es einschlägig akzeptiert, dass potentielle chondroprotektive Arzneimittel sowohl im Hinblick auf deren positive Wirkungen auf anabolische Pfade sowie deren Fähigkeit zur Hemmung katabolischer Prozesse beurteilt werden sollten. Katabolische Ereignisse, die typischerweise überwacht werden, umfassen unter anderem die Freisetzung und Hemmung von Matrix abbauenden Enzymen, Wirkungen auf die Prostaglandin- und Leukotrienbiosynthese und die Fähigkeit des Testarzneimittles zur Hemmung von IL-1-vermitteltem Abbau von Gelenkknorpel. Anabolische Ereignisse, die untersucht wurden, umfassen üblicherweise die Fähigkeit eines Testarzneimittels zur Stimulierung der Synthese von Protein, Kollagen, PGs und Hyaluronsäure (HA).
Zwar ist der hier verwendete Ausdruck "chondroprotektives Mittel" so zu verstehen, dass er die Verbindungen bezeichnet, deren Hauptwirkort der Knorpel ist, doch wird auch angenommen, dass derartige chondroprotektive Mittel auch entzündungshemmende Wirkung im Hinblick auf das Synovium besitzen können, positiv die Biosynthese von Zellen in subchondralen Knochen und anderen Bindegeweben, wie synovialen Fibroblasten, positiv beeinflussen können und die Migration von Entzündungszellen zur Hemmung des Entzündungsprozesses vermitteln können.
Wegen des bedeutenden Ausmaßes, in dem alle Säuger Evolution und embryogene Übereinstimmung teilen, produzieren sie ähnliche Zellen, Gewebe und Organsysteme mit homologen genetischen Codes, die vergleichbare Proteineinheiten exprimieren, die in äquivalenten Stoffwechselwegen arbeiten. Vorzugsweise ist die vorliegende Erfindung jedoch auf zahlreichere und wirtschaftliche bedeutende Arten, wie Katzen, Hunde und Pferde, gerichtet. Einige dieser Arten sind für Probleme von Gelenkknorpeldegeneration und -abnahme stärker empfindlich oder diesen zugeneigt als andere.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Kommerzielle Zubereitungen, die bisher als potentielle chondroprotektive Mittel untersucht wurden, umfassen Tiaprofenic acid, TA, Diclofenac-natrium, Tribenosit, Pentosanpolysulfat-natrium, Arteparon^® (eine Marke von Luitpld-Werk, München, Deutschland) und Rumalon^® (Marke von Robapharm Limited, Basel, Schweiz). Die verschiedenen Strukturen dieser Mittel können auf folgende Weise demonstriert oder erklärt werden:

Pentosanpolysulfatnatrium (n = 6–12)
Arteparon^® wird durch Extraktion von GAGs aus Rinderlunge und Trachealgeweben und anschließende Sulfatveresterung bestimmter Zuckerhydroxygruppen hergestellt.
Rumalon^® ist ein GAG-Peptidassoziationskomplex mit hohem Molekulargewicht, der aus Rinderknorpel und Knochenmark isoliert wurde.
Keine der oben beschriebenen Verbindungen legt in irgendeiner Weise Carprofen zur prophylaktischen Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung nahe.
G. Lust, A.J. Williams, N. Burton-Wurster, K.A. Beck und G. Rubin, "Effects of Intramuscular Administration of Glacosaminoglycan Polysulfates on Signs of Incipient Hip Dysplasia in Growing Pups", American Journal of Veterinary Research, 53(10), 1992, 1836-1843, behandelten heranwachsende junge Hunde, die für Hüftdysplasie empfindlich waren, mit GAG-Polysulfaten, die als Adequan^® von Luitpold-Werk, München, Deutschland, erhältlich waren. Hüftgelenke wurden radiographisch untersucht und intraartikuläre Gewebe wurden makroskopisch und biochemisch beurteilt. Lust et al. folgerten, dass, obwohl eine signifikante Verringerung des Knorpel-Fibronektingehalts erfolgte, der Proteoglykangehalt und die beobachteten Mittelwerte pathologischer Puktezahlen des Gelenks zwischen Kontroll- und behandelten Hunden nicht statistisch unterschiedlich waren. Eine frühere Untersuchung unter Verwendung des gleichen Arzneimittels wurde festgestellt, die eine Verringerung von Knorpeldegeneration, Hemmung von Proteasen und Förderung der Proteoglykanbildung in Kniegelenken von Hunden berichtet hatten, wenn Kreuzbänder zur Erzeugung eines instabilen Kniegelenks mit anschließender Entwicklung von Osteoarthritis reseziert worden waren.
Der genaue Wirkmechanismus von Carprofen bei der prophylaktischen Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht klar verstanden, es wird jedoch als unwahrscheinlich angesehen, dass er irgendeine Gemeinsamkeit mit den vermuteten Wirkmechanismen, durch die GAG-Polysulfate wirken, gemeinsam hat.
P.S. McNamara, S.A. Johnston und R.J. Todhunter, "Slow-Acting Disease-Modifying Osteoarthritis Agents", Osteoarthritis, 27(4), 1997, 863-881, untersuchten die krankheitsmodifizierende Wirksamkeit von oralen Produkten, die als Nahrungsergänzungsmittel betrachtet werden, beispielsweise polysulfatiertes Glykosaminoglykan (PSGAG), ob sie eine positive Wirkung auf Knochenmatrixsynthese und Hyaluronan (HA)-synthese durch die Synovialmembran sowie eine Hemmwirkung auf katabolische Enzyme in osteoarthritischen Gelenken aufweisen. Eine günstige Modifikation der schmerzvollen klinischen Zeichen von Osteoarthritis durch Nahrungsergänzungsprodukte, die Glucosamin und Chondroitinsulfat (CS) enthalten, wurden nur als durch anekdotische Beweisanzeichen und nicht durch eine wissenschaftliche Bewertung gestützt ermittelt. Im Hinblick auf Hyaluronsäure (HA) wurde eine Studie festgestellt, bei der atrophischer Säugergelenkknorpel mit HA behandelt wurde und ein chondrostabilisierender Effekt erhalten wurde. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die HA durch Herunterregulierung von Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α) wirkte. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde HA als potentielle Form einer Therapie für OA bei Säugern betrachtet. Es wurde ferner gefolgert, dass PSGAG eine günstige Zusatzbehandlung für OA, wenn es frühzeitig verabreicht würde, wäre, auf der Basis einer Untersuchung, die eine krankheitsmodifizierende Wirkung auf die Knorpelhomöostase zeigte, auf der Basis einer verringerten mikroskopischen Strukturänderung, der Retention von Proteoglykan in Knorpel und einer veringerten Proteinaseaktivität bei Vergleich mit der Aktivität in Kontrollgelenken. Es wurde ermittelt, dass Pentosanpolysulfat (PPS) eine Gelenkknorpelschädigung signifikant verringert, beruhend auf einer groben und histologischen Beurteilung und der Beibehaltung eines normalen Gelenkknorpelproteoglykangehalts. Die Tetracycline Doxycyclin und Minocyclin können wegen ihrer Fähigkeit zur nen wegen ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität von Metalloproteinasen, Kollagenase und Gelatinase eine krankheitsmodifizierende Wirkung ergeben.
Die oben beschriebenen pleiotropen Wirkungen auf Gelenkgewebe, die mit den diskutierten verschiedenen Behandlungsmitteln erhalten wurden, können durch Wirkmechanismen erhalten werden, von denen einer oder mehrere Carprofen und den Carprofenderivaten, die in den Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gemeinsam sind. Jedoch legt keines dieser Mittel wegen derer großen Strukturnichtähnlichkeit in irgendeiner Weise Carprofen und die Carprofenderivate der vorliegenden Erfindung nahe.
H.P. Benton, P.B. Vasseur, G.A. Broderick-Villa und M. Koolpe, "Effect of Carprofen on Sulfated Glycosaminoglycan Metabolism, Protein Synthesis, and Prostaglandin Release by Cultured Osteoarthritic Mammal Chondrocytes", American Journal of Veterinary Research, 58(3), 1997, 286-292, raten nach der Feststellung, dass die entzündungshemmenden Wirkungen von Carprofen wahrscheinlich durch eine Hauptwirkungsweise vermittelt sind, die in keiner Beziehung zu der Cyclooxygenaseenzymhemmung, die der mit NSAID-Aktivität verbundene Hauptmechanismus ist, steht, zur Berücksichtigung der direkten Wirkungen auf Knochen- und Knorpelmetabolisierung von NSAIDs, die zur Behandlung von Arthritis verwendet werden. NSAIDs wie Aspirin und Indomethacin unterdrücken eine Gelenkschwellung und die Infiltration von Entzündungszellen in die Gelenkhöhle, doch können derartige NSAIDs gleichzeitig die IL-1-Aktivität stimulieren und die Wirkung dieses Cytokins kann wiederum zur Stimulierung von Matrixabbau und zur Hemmung von neuer Matrixsynthese führen. Daher kann eine Hochregulierung von IL-1 nachteilige Langzeitwirkungen auf die Knorpelbeibehaltung haben. Unter Verwendung von Zellkulturen von Säugerknorpelexplantaten und der Messung der Wirkung von Carprofen auf GAG-Synthese und -Abbau, Proteinsynthes, Zelllebensfähigkeit und Prostaglandinfreisetzung wurde ermittelt, dass Carprofenkonzentrationen von 1 und 10 μg/ml eine potentiell vorteilhafte Wirkung auf das Beibehalten von Knorpelmatrix durch selektive Stimulation von neuer Knorpel-GAG-Synthese ohne eine direkte Wirkung auf den Knorpelproteoglykanabbau hat ten. Jedoch wurde die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen festgestellt.
Wie durch die oben diskutierte technische Literatur aufgezeigt, konzentrierte sich viel Interesse auf die Rolle von Cytokinen bei einer Gelenkerkrankung, da die Gelenkknorpelintegrität durch die Balance zwischen Cytokinbetriebenen anabolischen und katabolischen Prozessen aufrechterhalten wird. Jedoch ist der spezifische Beitrag einer Cytokinwirkung zur Pathophysiologie von OA nicht gut verstanden. Siehe C.I. Westacott und M. Sharif, "Cytokines in Osteoarthritis: Mediators or Markers of Joint Destruction?", Seminars in Arthritis and Rheumatism, 25(4), 1996, 254-272.
Eine Vielzahl von Tests und Tiermodellen wurde auf dem Fachgebiet entwickelt, um den multifakturellen Charakter von Gelenkknorpeldegeneration und die vielen Wirkmechanismen, durch die sie erfolgt, zu erhellen. Eines der bedeutenderen dieser Tiermodelle ist das Kreuzband-defiziente Säugerkniemodell, wobei das vordere Kreuzband des linken Knies eines Säugersubjekts durchschnitten ist, während das rechte Kniegelenk nicht operiert wurde und als normale Kontrolle belassen wird. Der in dem linken Säugerkniegelenk induzierte Stress ergibt schließlich Osteoarthritis, doch wird auch eine wesentliche Wiederholung der sehr frühen pathologischen Veränderungen in dem Säugergelenk, insbesondere im Hinblick auf Veränderungen des Charakters des subchondralen Knochens und der Degeneration des darüber liegenden Gelenkknorpels hervorgerufen. Für eine Diskussion von einigen der Studien, die unter Verwendung des Kreuzband-defizienten Säugermodells durchgeführt wurden, siehe K.D. Brandt, "Insights into the Natural History of Osteoarthritis Provided by the Cruciate-Deficient Mammal", Annals of the New York Academy of Sciences, 732, 1994, 199-205.
Weitere Untersuchungen, die das Kreuzband-defiziente Säugermodell und andere Tests verwendeten, um mehr Licht auf die frühen Veränderungen bei Gelenkknorpeldegeneration und Osteoarthritis und die für diese Veränderungen verantwortlichen Wirkmechanismen zu werfen, sind in den folgenden Artikeln aus der technischen Literatur beschrieben:

D. D. Dean, J. Martel-Pelletier, J-P. Pelletier, D.S. Howell, J.F. Woessner, Jr., "Evidence for Metalloproteinase and Metalloproteinase Inhibitor Imbalance in Human Osteoarthritic Cartilage", J. Clin. Invest., 84, 1989, 678-685;
J. Martel-Pelletier, J-M. Cloutier, J-P. Pelletier, "Cytokines, Interleukin-1 and the Tumor Necrosis Factor in Human Osteoarthritic Tissues", Trans. Orthrop. Res. Soc., 15, 1990, 111;
J. Martel-Pelletier, R. McCollum, J. DiBattista, M-P. Faure, J.A. Chin, S. Fournier, M. Sarfati, J-P. Pelletier, "The Interleukin-1 Receptor in Normal and Osteoarthritic Human Articular Chondrocytes", Arthritis & Rheumatism, 35, 1992, 530-540;
J-P. Pelletier, M-P. Faure, J.A. DiBattista, S. Wilhelm, D. Visco, J. Martel-Pelletier, "Coordinate Synthesis of Stromelysin, Interleukin-1, and Oncogene Proteins in Experimental Osteoarthritis – An Immunohistochemical Study", Am. J. Pathol, 142, 1993, 95-105; und
G. Hilal, J. Martel-Pelletier, J-P. Pelletier, P. Ranger, D. Lajeunesse, "Osteoblast-Like Cells from Human Subchondral Osteoarthritic Bone Demonstrate an Altered Phenotype in Vitro", Arthritis & Rheumatism, 41(5), 1998, 891-899.

Die Internationale Patentanmeldung PCT/IB98/00662 betrifft die Verwendung entzündungshemmender Mittel, die nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneimittel (NSAID) sind, zur Behandlung von Schmerz und Entzündung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung der Verwendung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hunden und Pferden, die in der Zukunft an derartigen Schädigungen leiden können, und diese Prävention verbessert, vermindert, hebt auf oder verhindert eine Läsion, Schädigung oder Abnahme von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen anschließend an die frühen Stadien der Degeneration.
Ferner erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung der oben beschriebenen Verwendung von Carprofen zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hunden und Pferden, wobei der Status des Säugers, der derzeit oder vorausschauend sich in den frühen Stadien befindet und daher eine derartige Behandlung benötigt, bestimmt wird durch

(1) positive Ergebnisse aus der klinischen Untersuchung und Beurteilung der Gelenke des Säugers, einschließlich einer Messung einer Hüftdysplasieprogression;
(2) die Durchführung eines invasiven chirurgischen Eingriffs an einem oder mehreren Gelenken des Säugers;
(3) positive Ergebnisse einer Untersuchung von einem oder mehreren Gelenken des Säugers unter Verwendung nichtinvasiver Verfahren einschließlich von radiographischer und Magnetresonanzbildgebung (MRI); oder
(4) positive Ergebnisse eines biochemischen Tests, der an Körperflüssigkeiten oder Gelenkgewebe des Säugers im Hinblick auf eine oder mehrere der im folgenden angegebenen Substanzen durchgeführt wurde: erhöhtes Interleukin-1-beta (IL-1β), erhöhter Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α), erhöhtes Verhältnis von IL-1β zu IL-1-Rezeptorantagonistprotein (IRAP), erhöhte Expression von p55-TNF-Rezeptoren (p55 TNF-R), erhöhtes Interleukin-6 (IL-6), erhöhter Leukämiehemmfaktor (LIF), unveränderter oder verringerter insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), verringerter transformierender Wachstumsfaktor-beta (TGFβ), unveränderter oder verringerter Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), unveränderter oder verringerter basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF), erhöhtes Keratinsulfat, erhöhte Matrixmetalloproteasen (MMPs) einschließlich Stromelysin, erhöhtes Verhältnis von Matrixmetalloproteasen (MMPs) einschließlich Stromelysin zu Gewebeinhibitor von Metalloproteasen (TIMP), erhöhtes Osteocalcin, erhöhte alkalische Phosphatase, erhöhtes, auf einen Hormonreiz reagierendes cAMP, erhöhter Urokinaseplasminogenaktivator (uPA), erhöhtes Knorpeloligomermatrixprotein und erhöhte Kollagenase.

Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt die Durchführung der oben beschriebenen Verwendung zur Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hun den und Pferden durch Verabreichen von Kombinationen von Verbindungen, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure mit einem oder mehreren Mitgliedern, die aus der Gruppe von im wesentlichen polysulfatierten Glykosaminglykan (PSGAG), Glucosamin, Chondroitinsulfat (CS), Hyaluronsäure (HA), Pentosanpolysulfat (PPS), Doxycyclin und Minocyclin ausgewählt sind, umfassen.
Ferner wird die oben beschriebene Verwendung bereitgestellt, wobei die therapeutisch wirksame Menge von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure und insbesondere des (+)(S)-Enantiomers von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure systemisch dem Säuger verabreicht wird, wobei die systemische Verabreichung

(1) eine Injektion oder Infusion in geeignete Körpergewebe oder -höhlen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die chondroprotektive Verbindung in geeigneter flüssiger Form zur intramuskulären oder intravenösen Abgabe derselben oder als Depot zur Abgabe derselben enthält;
(2) die Instillation in geeignete Körpergewebe oder -höhlen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die chondroprotektive Verbindung in einer geeigneten festen Form für eine feste Implantatzusammensetzung zur Abgabe derselben durch verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung enthält oder
(3) die Einnahme einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die chondroprotektive Verbindung in einer zur peroralen Abgabe derselben geeigneten festen oder flüssigen Form enthält, umfasst.

Ferner wird die oben beschriebene Verwendung zur Prävention der Osteoarthritis bereitgestellt, die die Einnahme oder Verabreichung einer festen peroralen Dosierungsform, die aus der Gruppe von oralen Tabletten, Kapseln und Mikroteilchen mit verzögerter Freisetzung oder nachhaltiger Freisetzung, die eine systemische Zufuhr des Wirkstoffs in gesteuerter Weise über einen Zeitraum von mindestens 10 h liefern, ausgewählt ist, umfasst.
Noch des weiteren wird die oben beschriebene Verwendung bereitgestellt, wobei die therapeutisch wirksame Menge der Verbindung lokal verabreicht wird, was

(1) eine Injektion oder Infusion an einer lokalen Stelle in den frühen Stufen einer Degeneration von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die Verbindung in einer geeigneten flüssigen Form zur intrartikulären, intrachondrialen, intrakostalen, intraostealen, intrapelvinen, intraspinalen, intrasternalen, intrasynovialen oder intratarsalen Abgabe derselben einschließlich von Komponenten, die eine verzögerte Freisetzung, gesteuerte Freisetzung und/oder nachhaltige Freisetzung der chondroprotektiven Verbindung an der lokalen Stelle liefern; oder als Depot zur Abgabe derselben, wobei die Zusammensetzung eine Speicherung der chondroprotektiven Verbindung und danach eine verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung derselben liefert, enthält; oder
(2) die Instillation einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die chondroprotektive Verbindung in geeigneter Form für ein festes Implantat zur Abgabe derselben enthält, wobei die Zusammensetzung optional eine verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung der chrondroprotektiven Verbindung an der lokalen Stelle liefert, umfasst.

Noch ferner erfolgt die Bereitstellung der oben beschriebenen Verwendung, wobei die therapeutisch wirksame Menge der chondroprotektiven Verbindung an den Säuger in einer Menge verabreicht wird, die, als mg pro kg Körpergewicht des Mitglieds pro Tag ausgedrückt, den Bereich von 0,01 mg/kg bis 20,0 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,1 mg/kg bis 12,0 mg/kg/Tag, noch günstiger 0,5 mg/kg bis 10,0 mg/kg/Tag und noch besser 0,5 mg/kg bis 6,0 mg/kg/Tag umfasst. Die Verabreichung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure wird typischerweise durch Dosierung mit einer Rate von 4,0 mg/kg/Tag bereitgestellt.
Noch des weiteren werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitgestellt, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure umfassen; und wobei, wenn beide gebildeten Enantiomere zusammen vorhanden sind, das (+)(S)-Enantiomer in einer Menge von mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 %, noch günstiger mindestens 95 % und noch besser mindestens 99 % vorhanden ist. Insbesondere wird die im Vorhergehenden und im folgenden beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, wobei der Inhibitor vollständig aus dem (+)(S)-Enantiomer von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure besteht.
Ebenfalls bereitgestellt werden die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wobei die therapeutisch wirksame Menge von chondroprotektivem Carprofen im Kontext des verwendeten Dosierungsprotokolls und der verwendeten Verabreichungsparameter ausreichend ist, um einem Mitglied, das mit einer Menge der chondroprotektiven Verbindung behandelt wird, mit einer Menge der chondroprotektiven Verbindung, ausgedrückt als mg pro kg Körpergewicht des Mitglieds pro Tag, im Bereich von 0,01 mg/kg bis 20,0 mg/kg/ Tag, vorzugsweise 0,1 m/kg bis 12,0 mg/kg/Tag, noch günstiger 0,5 mg/kg bis 10,0 mg/kg/Tag und noch besser 0,5 mg/kg bis 8,0 mg/kg/Tag zu versorgen. Die Verabreichung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure wird typischerweise durch Dosierung mit einer Rate von 4,0 mg/kg/Tag bereitgestellt.
Noch des weiteren werden die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitgestellt, wobei die therapeutisch wirksame Menge von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure in einer zur lokalen Verabreichung geeigneten Dosierungsform bereitgestellt wird, die

(1) eine Injektion oder Infusion an einer lokalen Stelle in den frühen Stadien der Degeneration von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen in geeigneter flüssiger Form zur intraartikulären, intrachondrialen, intrakostalen, intraostealen, intrapelvinen, intraspinalen, intrasternalen, intrasynovialen oder intratarsalen Abgabe derselben, die Komponenten umfasst, die eine verzögerte Freisetzung, gesteuerte Freisetzung und/oder nachhaltige Freisetzung der chondroprotektiven Verbindung liefern, oder für ein Depot zur Abgabe derselben, wobei die Zusammensetzung eine Speicherung der Verbindung und danach eine verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung derselben an der lokalen Stelle liefert; oder
(2) eine Installation der pharmazeutischen Zusammensetzung in geeigneter fester Form für eine feste Implantatzusammensetzung zur Abgabe derselben, wobei die Zusammensetzung optional verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung derselben liefert, umfasst.

Spezielle Dosierungsformen der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen feste perorale Dosierungsformen, die aus der Gruppe von oralen Tabletten, Kapseln, Caplets und mehrteiligen Systemen mit verzögerter Freisetzung, die eine Freisetzung und Absorption im Magen unter Ermöglichen einer zum Magen des Säugers distalen Abgabe verhindern, und oralen Tabletten, Kapseln und Mikroteilchen mit Langzeitfreisetzung, die eine systemische Abgabe des Wirkstoffs in kontrollierter Weise bis zu einem Zeitraum von 24 h ergeben, ausgewählt sind.
Daher werden gemäß der vorliegenden Erfindung Kombinationen von einem oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Mitteln zusammen mit der 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure, die die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bilden, bereitgestellt. Es wird bereitgestellt, dass, wenn ein Gelenk gleichzeitig durch Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren infiziert ist, der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Kombination mit einem oder mehreren antibiotischen, antimykotischen, Antiprotozoen- oder antiviralen Mitteln verabreicht wird. Ferner kann das chondroprotektive Carprofen in Kombination mit einem oder mehreren Mitgliedern verabreicht werden, die aus der im wesentlichen aus den Klassen von Inhibitoren bestehenden Gruppe ausgewählt sind und wofür Beispiele die im folgenden angegebenen umfassen: H₁-Rezeptorantagonisten; Kinin-B₁- und -B₂-Rezeptorantagonisten; Leukotrien-LTC₄-, -LTD₄/LTE₄- und -LTB₄-Inhibitoren; PAF-Rezeptorantagonisten; Gold in der Form einer Aurothiogruppe zusammen mit verschiedenen hydrophilen Gruppen; Immunsuppressiva, beispielsweise Cyclosporin, Azathioprin und Methotrexat; entzündungshemmende Glucocorticoide, beispielsweise Dexamethason; antiparasitische Breitspektrumantibiotika, beispielsweise die Avermectine und die Milbemycine; Penicillamin; Hydroxychloroquin; Antigichtmittel, beispielsweise Colchicin; Xanthinoxidaseinhibitoren, beispielsweise Allopurinol, und Uricosurica, beispielsweise Probenecid, Sulfinpyrazon und Benzbromaron. Ferner wird bereitgestellt, dass das chondroprotektive Carprofen in Kombination mit Therapeutika verabreicht werden kann, die zur Behandlung von Erkrankungszuständen, Syndromen und Symptomen, die bei älteren Säugern gefunden werden, vorgegeben sind, die ein oder mehrere Mitglieder umfassen, die aus der Gruppe von im wesentlichen kognitiven Therapeutika, die gegen Gedächtnisverlust und -schwäche wirken sollen; Antidyskinesie/Antiparkinsonmitteln, beispielsweise Selegelin; Antihypertonika und anderen kardiovaskulären Arzneimitteln, die die Folgen von Atherosklerose, die Hypertonie, Myokardischämie einschließlich Angina, dekompensierte Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt umfassen, aufheben sollen, die aus Diuretika, Vasodilatatoren, wie Hydralazin, β-Adrenorezeptorantagonisten, wie Propranolol, Inhibitoren des Angiotensin II Converting Enzyme-Inhibitoren (ACE-Inhibitoren), wie Enalapril, die zur Behandlung geriatrischer Säuger mit Mitralinsuffizienz verwendet werden, und Enalapril allein und in Kombination mit neutralen Endopeptidaseinhibitoren, Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten, wie Losartan, Renininhibitoren, Calciumkanalblockern, wie Nifedipin, Sympatholytika, wie Methyldopa, α₂-adrenergen Agonisten, wie Clonidin, α-Adrenorezeptorantagonisten, wie Prazosin, und HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren (Antihypercholesterinämika), wie Lovastatin oder Atorvastatin, ausgewählt sind; Antineoplastika, insbesondere antimitotische Arzneimittel, die die Vincaalkaloide, wie Vinblastin und Vincristin, umfassen; Wachstumshormon-Sekretagoga; starken Analgetika; lokalen und systemischen Anästhetika und H₂-Rezeptorantagonisten und anderen gastroprotektiven Mitteln ausgewählt sind.
Noch des weiteren wird bereitgestellt, dass die obigen Kombinationen von Therapeutika zur Behandlung akuter Zustände bei Säugern verwendet werden, wobei bakterielle Infektionen gleichzeitig mit den frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen auftreten; wobei das für diesen Zweck verwendete Protokoll die Verabreichung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure in Kombination mit anderen Medikationen, die auf einer regelmäßig programmierten Basis zur Behandlung chronischer Zustände verwendet werden; die Formulierung der chondroprotektiven Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren anderen Therapeutika, die die geplante Kombination bilden sollen, zu einer passenden Dosie rungsform, die alle die Kombination bildenden Arzneimittel enthält, wobei dies, wenn die verschiedenen Arzneimittel variierende Halbwertszeiten aufweisen, die Bildung von Formen der Arzneimittel mit gesteuerter Freisetzung mit unterschiedlichen Freisetzungszeiten, durch die eine relativ gleichförmige Dosierung erreicht wird, umfasst; eine Dosierungsform von arzneimittelhaltigem Futter, in dem die in der Kombination verwendeten Arzneimittel zusammen im Gemisch in der Futterzusammensetzung vorhanden sind, umfasst. Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Coverabreichung bereitgestellt, wobei die Kombination von Arzneimitteln durch die gleichzeitige Verabreichung der in Kombination zu gebenden Arzneimittel erreicht wird; was die Coverabreichung mittels unterschiedlicher Dosierungsformen und -verabreichungswege; die Verwendung von Kombinationen gemäß unterschiedlichen, jedoch regelmäßigen und kontinuierlichen Dosierungsprogrammen, wodurch gewünschte Plasmaspiegel der beteiligten Arzneimittel in dem zu behandelnden Säuger aufrechterhalten werden, auch wenn die die Kombination bildenden einzelnen Arzneimittel nicht gleichzeitig dem Säuger verabreicht werden, umfasst.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Medikamens zur Prävention von Osteoarthritis, das für Katzen, Hunde und Pferde anwendbar ist, die in der Zukunft an einer Verletzung, Schädigung oder Abnahme von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen in einem oder mehreren Gelenken eines derartigen Säugers leiden können. Katzen, Hunde und Pferde sind unter Säugern gegenüber entzündlichen Erkrankungen und Prozessen, wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, traumatische oder degenerative Gelenkerkrankung, die Verwendung geschädigter Gelenke, bestehende oder beginnende Hüftdysplasie und Osteochondrose, besonders empfindlich. Eine wichtige Begleiterscheinung dieser entzündlichen Erkrankungen und Prozesse ist eine tatsächliche oder prospektive Schädigung oder Erosion von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen, die in den Gelenken derartiger Katzen, Hunde und Pferde vorhanden ist, die eine Entzündung erlitten oder erleiden können.
Eine Entzündung bei Säugern kann durch die Verabreichung eines nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittels (NSAID), beispielsweise ARQUEL^®, Meclofenamsäure, behandelt werden, obwohl nur zwei Therapeutika dieses Typs durch die Food and Drug Administration, Committee on Veterinary Medicine (FDA/CVM), zur Verwendung bei Hunden in den Vereinigten Staaten zugelassen sind. Eine viel größere Vielzahl von NSAIDs wurde zur Verwendung bei Menschen zugelassen und sie lieferten daher wesentlich größere Wirksamkeits- und Sicherheitsdaten aufgrund von klinischen Versuchen und Prüfungsuntersuchungen. Daher werden Folgerungen in Bezug auf die Wirkungsweisen und andere pharmakologische Aspekte der Wirkung von NSAIDs im veterinärmedizinischen Kontext, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung nichthumaner Säuger häufig von der Erfahrung bei humanen Säugern ausgehend extrapoliert. Die hier vorliegende Beschreibung zieht ähnliche Vorteile aus dem hohen Grad physiologischer Gemeinsamkeit zwischen diesen Säugerarten zum Beleg von vielen der zugrunde liegenden Aspekte der vorliegenden Erfindung.
Die Behandlung von Säugern mit entzündungshemmenden Mitteln ist aus zwei Gesichtspunkten besonders mühsam. Erstens begleiten die pathologischen Veränderungen in Knorpel und subchondralem Knochen in den Gelenken von Säugern sehr häufig Osteoarthritis, die eine multifaktorielle und sich unterschiedlich ausdrückende Erkrankung ist, die immer noch nicht vollständig verstanden ist, was Entscheidungen über eine passende Therapie häufig schwierig macht. Beispielsweise wird, obwohl ein gewisser Grad an Synovialentzündung eine übliche Komponente von Osteoarthritis zu sein scheint, diese Entzündung als aufgrund der Wirkungen von während des Knorpelabbaus freigesetzten Immunogenen entstehend betrachtet. In letzter Zeit wurde dieses Paradigma jedoch in Frage gestellt. Zweitens kann eine Langzeitanwendung der meisten NSAIDs, insbesondere der im Hinblick auf die Verwendung stärker etablierten tatsächlich die Progression von Osteoarthritis verschlimmern. Im Lichte dieser Probleme und Ungewissheiten ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung umso überraschender, dass das chondroprotektive Carprofen zur Prävention einer derartigen Gelenkknorpelschädigung verwendbar ist, während es gleichzeitig keinen nachteiligen Einfluss auf den Verlauf einer Entzündung im beteiligten Säugergelenk hat. Dieser und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden aus der Beschreibung der Merkmale und Eigenschaften von Knorpel in dem Säugergelenk, die für die prophylaktische Verwendung der vorliegenden Erfindung besonders relevant sind, in den folgenden Absätzen besser verstanden.
Knorpel ist ein faserhaltiges Bindegewebe, das in mehreren Formen, beispielsweise als hyaliner Knorpel, elastischer Knorpel und Faserknorpel, existiert. Hyaliner Knorpel ist eine etwas elastische halbtransparente Substanz mit einer opaleszierenden bläulichen leichten Färbung, die aus einer basophilen, faserhaltigen Grundsubstanz mit Hohlräumen (Lacuna), in denen die Chondrocyten, reife Knorpelzellen, auftreten, besteht. Er ist ein hochspezialisiertes Bindegewebe, das Wasser, Kollagen und Proteoglykane umfasst, die zusammen ein einzigartiges faserverstärktes Wassergel erzeugen, das steif, jedoch elastisch ist und beträchtliches Stoßabsorptionsvermögen aufweist. Die Proteoglykan(PG)komponente ist ein Protein-Kohlehydrat-Komplex, der eine filamentöse Struktur aufweist. Der Kern dieser filamentösen Struktur ist ein einziges langes Molekül von Hyaluronsäure, die ein Glykosaminoglykan (GAG), d.h. ein Polymer aus wiederkehrenden Disaccharideinheiten, in denen einer der Zucker entweder N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin ist, ist. In Hyaluronsäure umfasst beispielsweise die wiederkehrende Disaccharideinheit das Monosaccharidderivat N-Acetylglucosamin mit einer glykosidischen Bindung β (1 → 4) zu dem Monosaccharidderivat Glucuronsäure, das wiederum eine glykosidische Bindung α (1 → 3) zu der nächsten N-Acetylglucosamineinheit des wiederkehrenden Disaccharids hat.
An den Hyaluronsäure-Filamentkern von Knorpel sind wiederum eine regelmäßige Serie längerer Kernproteine, die Kollagen umfassen, nicht-kovalent mit Hilfe eines "Verknüpfungsproteins" gebunden. Die Basiseinheit von Kollagen ist das Tropokollagenmolekül, eine Tripelhelix aus drei Polypeptidketten einer Länge von jeweils etwa 1000 Resten. An jedes dieser längeren Kernkollagenmoleküle ist wiederum über eine Serinseitenkette eine regelmäßige Serie von Chondroitinsulfat- und Keratansulfatketten gebunden. Chondroitinsulfat und Keratansulfat sind ähnlich der oben beschriebenen Hyaluronsäure ebenfalls Beispiele für Glykosaminoglykan(GAG)polymere, bei denen für das Polymer wiederkehrender Disaccharideinheiten einer der Zucker GalNAc-6s, d.h. N-Rcetylgalactosamin mit einer Sulfatgruppe am Kohlenstoff 6, sein muss. Die Glykosaminoglykane, die Komponenten der Knorpelstruktur sind, sind Polysaccharide, in denen die Zuckerreste so modifiziert sind, dass sie Polymere produzieren, die eine breite Vielzahl von Eigenschaften aufweisen, die Polypeptiden im Hinblick auf deren Strukturkomplexität nahe kommen. Daher ist ersichtlich, dass Gelenkknorpel, d.h. Knorpel, der in den Gelenken von Säugern gefunden wird, aus einer sehr aufwendigen und komplexen Molekülstruktur besteht. Um die Art und Weise zu verstehen, in der sich die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit dem Problem einer Knorpelschädigung und -abnahme befassen, ist es jedoch auch notwendig, den Aufbau von Knorpel und dessen Umgebung im Gelenk im makroskopischen Maßstab zusätzlich zu der eben angegebenen Untersuchung im mikroskopischen Maßstab zu untersuchen.
Wie oben beschrieben umfasst Gelenkknorpel die lebenden Zellen (Chondrocyten), die das interstitielle Material, das allgemein als die extrazelluläre Matrix bezeichnet wird, erzeugen und von diesem umgeben sind. Da Osteoarthritis als Fehlen bzw. Defekt der (beweglichen, mit Synovia ausgekleideten) Junctura synovialis definiert ist, folgt daraus, dass in einem derartigen Gelenk immer mindestens zwei bewegliche Knochenoberflächen gefunden werden, die aufeinander treffen würden, wenn nicht die Tatsache bestünde, dass sie von der synovialen Membran, die Synovialflüssigkeit, eine transparente alkalische viskose Flüssigkeit, die den Gelenkhohlraum füllt, sezerniert, und Gelenkknorpel, der sich zwischen den gelenkbildenden Knochenoberflächen, üblicherweise an diesem Punkt anstelle der Synovialmembran befindet, umgeben sind.
Die früheste grobe pathologische Feststellung bei Osteoarthritis ist eine Erweichung des Gelenkknorpels in üblicherweise belasteten Bereichen der Gelenkoberfläche, die im Falle des Kniegelenks des Säugers, insbesondere bei Osteoarthritismodellen, die eine Durchtrennung des Kreuzbands im Kniegelenk umfassen, aus der Femorcondyle und dem Schienbeinkopf bestehen. Mit der Progression von Osteoarthritis geht die Integrität der Knorpeloberfläche verloren und der Gelenkknorpel wird dünn, wobei sich vertikale Fissuren in die Tiefe des Knorpels in einem als Fibrillation bezeichneten Prozess ausdehnen. Gelenkbewegung kann bewirken, dass fibrillärer Knorpel Segmente abgibt, die den darunterliegenden (subchondralen) Knochen freilegen, der dann Sklerose erleidet. Es können sich auch subchondrale Zysten entwickeln, die mit Synovialflüssigkeit gefüllt sein können. An den Gelenkrändern bilden sich Osteophyten (Knochensporne).
Veränderungen im Hinblick auf den subchondralen Knochen spielen ebenfalls eine Rolle bei der Pathologie der Knorpelzerstörung. Untersuchungen der Gelenke von Säugern, insbesondere Hunden, die eine vorherige Kreuzbanddurchtrennung erfuhren, zeigen subchondrale Sklerose und Osteopenie, d.h. Knochenverlust in den subchondralen Trabeculae. Anschließend an diese Veränderungen ergibt sich eine Verdickung der subchondralen Platte. Der Verlust an subchondralem Knochen erhöht die mechanische Belastung an dem darüber liegenden Gelenkknorpel, was zu dessen Degeneration führt. Die anschließende Verdickung der subchondralen Platte beeinflusst negativ intrinsische Reparaturmechanismen und trägt dadurch zur Progression des Knorpelabbaus bei.
Der Abbau der extrazellulären Matrix des Knorpels wird von mitotischer Teilung der Chondrocyten begleitet, die sich dann zu Clustern formen. Es besteht eine Verringerung der Glykosaminoglykankomponenten des Knorpels und eine unregelmäßige Proteoglykandepletion. In vielen Fällen ersetzt Faserknorpel, der durch eine extrazelluläre Matrix aus dicken kompakten parallelen Kollagenbündeln gekennzeichnet ist, hyalinen Knorpel. Jedoch sollte angemerkt werden, dass diese und die oben beschriebenen pathologischen Veränderungen im Hinblick auf Gelenkknorpel für spätere Stadien einer Osteoarthritis charakteristisch sind und dass eine Hypertrophie, d.h. Verdickung des Gelenkknorpels, als erstes erfolgt, was durch den Kreuzband-defizienten Säuger, insbe sondere das Hundekniegelenkmodell gezeigt wurde. Eine Knorpelverdickung resultiert aus einem erhöhten Wassergehalt, einer Zunahme der Proteoglykansynthese und einer Zunahme an sowohl dem Gehalt als auch der Konzentration von Proteoglykanen in dem Gelenkknorpel. Dieses Stadium einer hypertrophen Reparatur des Gelenkknorpels kann eine gewisse Zeit bestehen bleiben, doch fehlen dem Reparaturknorpelgewebe, das gebildet wird, die Elastizität und Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischer Belastung, die normaler hyaliner Knorpel besitzt. Schließlich hört die Proteoglykanproduktion auf und die Chondrocyten können nicht länger deren extrazelluläre Matrix aufrechterhalten. Dieses Endstadium führt zum Verlust von Gelenkknorpel der vollen Dicke.
Synovitis, d.h. eine Entzündung der Synovialis, der Synovialmembran, kann zur Pathologie von Knorpelschädigung und -verlust beitragen. Eine Synovialentzündung ist durch intensive Infiltration der Synovialflüssigkeit durch mononucleäre Zellen, durch Synovialmembranzellenhyperplasie und durch lymphatische Aggregate gekennzeichnet. Synovitis trägt signifikant zur Knorpelschädigung bei rheumatoiden und anderen entzündlichen Arthropathien bei. Die Rolle einer Synovialentzündung in den frühen Stadien von OA ist weniger gut verstanden, jedoch ist Synovitis im klinischen Stadium von OA vorhanden. Kreuzband-defiziente Säugerkniemodelle, insbesondere das Pond-Nuki-Modell, wobei das Kreuzband durch eine Blindstoßinzision durchtrennt wurde, rufen intraartikuläre Blutung hervor. Wenn Hämostase beobachtet wird und die Blutung sorgfältig kontrolliert wird, kann Synovitis vermieden werden. Wenn jedoch ein Vergleich zwischen einer Gruppe von Säugern mit Synovitis und einer Gruppe von Säugern ohne Synovitis durchgeführt wird, sind Veränderungen im Hinblick auf Gelenkknorpel bei den zwei Gruppen ununterscheidbar.
Wie bereits angegeben sind die Aktivitäten von Cytokinen ein wichtiger Teil der Pathologie einer Knorpelschädigung und -abnahme. Cytokine sind intrazelluläre Botenstoffe, die in der normalen Physiologie eine wesentliche Rolle spielen und im Hinblick auf Gelenkknorpel dessen Integrität durch Steuerung der konkurrierenden anabolischen und katabolischen Prozesse, die auftreten, aufrechterhalten. Die Cytokine werden von Zellen freigesetzt und weisen häufig mehrfache und überlappende Aktivitäten auf. Cytokine sind lösliche Glykoproteine, die nichtenzymatisch in pikomolaren bis nanomolaren Konzentrationen unter Regulierung einer Wirtszellenfunktion wirken. Die Freisetzung der Cytokine wird durch spezifische Signale veranlasst und die Cytokine beeinflussen verschiedene Funktionen in den Zellen, auf die sie zielgerichtet sind, durch Beeinflussung der Genexpression in diesen Zellen. Cytokine haben eine relativ kurze Halbwertszeit und üben ihren Einfluss innerhalb der unmittelbaren Umgebung der Wirtszelle (autokrine Aktivität) und an benachbarten Zellen (parakrine Aktivität), die sie durch den intrazellulären Raum erreichen, aus. Cytokine können an Rezeptoren auf deren Wirtszelloberfläche oder eine Nachbarzelloberfläche oder innerhalb der Wirtszelle an einen internen Faktor oder durch direkte Zelle-Zelle-Kommunikation über membrangebundene Cytokine binden.
Cytokinhomöostase wird durch dessen Interaktion mit natürlich vorkommenden Inhibitoren aufrechterhalten. Rezeptorantagonisten binden kompetitiv an die Cytokinbindungsstelle unter Verhinderung einer Signalübermittlung, Autoantikörper binden an das Cytokin und neutralisieren es, und cytokinbindende Proteine und lösliche Rezeptoren entfernen das Cytokin aus dem Pool aktiver Mediatoren. Beispielsweise blockiert das IL-1-Rezeptorantagonistprotein (IRAP) die Bindung von IL-1 an dessen beide Rezeptoren. Autoantikörper für IL-1α (sIL-1R) und Insulinähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsproteine (IGF-BPs) existieren und sie können zur Entfernung der Cytokinliganden aus dem Pool aktiver Mediatoren dienen oder die proteolytische Zerstörung der Cytokine verhindern oder als Transportproteine für die Cytokine fungieren. Cytokine können auch der Aktivität anderer Cytokine entgegenwirken. Beispielsweise wird IL-1-Aktivität in Gegenwart von transformierendem Wachstumsfaktor-beta (TGFβ) und IGF-1 verringert.
Eine Zerstörung des komplizierten Gleichgewichts zwischen den oben beschriebenen Cytokinen und deren Regulatoren kann zu pathologischen Veränderungen des Gelenks führen oder dazu beitragen. In einem derartigen Gelenk schützt der Gelenkknorpel den subchondralen Knochen vor mechanischen Belastungen. Der Knorpel ist ein hoch spezialisiertes Bindegewebe, das Wasser, Kollagen und Proteoglykane umfasst, die zusammen ein einzigartiges faserverstärktes Hydrogel erzeugen, das steif, jedoch elastisch ist und ein beträchtliches Stoßabsorptionsvermögen aufweist. Die extrazelluläre Matrix des Knorpels wird durch die Chondrocyten, die hochaktiv sind, produziert und die Integrität dieser Matrix wird durch ein Gleichgewicht zwischen den Wirkungen der katabolischen Cytokine I1-1α, β und TNFα und der anabolischen Cytokine IGF und TGFβ aufrechterhalten. I1-1α, β und TNFα wirken durch Induktion der Produktion von spezifischen Matrix abbauenden Metalloproteasen, während IGF und TGFβ als Wachstumsfaktoren durch Induktion der Produktion der makromolekularen Baublöcke von Knorpel, Kollagen und der Proteoglykane wirken. Andere Cytokine und deren Inhibitoren sowie Gewebeinhibitoren von Metalloprotease (TIMP) beeinflussen ebenfalls dieses Gleichgewicht, das als Matrixhomöostase bezeichnet wird.
Der hier verwendete Ausdruck "Metalloprotease" soll die Matrixmetalloproteasen (MMPs), die insbesondere diejenigen in dieser Enzymfamilie umfassen, die üblicherweise erhöhte Konzentrationen während einer Gelenkknorpeldegeneration zeigen, d.h. die Stromelysine, die Kollagenasen und die Gelatinasen, bezeichnen. Kollagenase ist allgemein für den Abbau von nativem Kollagen verantwortlich; Stromelysin ist allgemein für den Abbau der Proteoglykane verantwortlich; und Gelatinase ist allgemein für den Abbau von denaturiertem Kollagen verantwortlich. Ein Enzym mit MMP-Eigenschaften, Aggrecanase, wird ebenfalls von diesem Ausdruck umfasst, da es für die Proteolyse von Knorpelproteoglykanaggregaten verantwortlich ist, die während der frühen Stadien von Knorpeldegeneration vorhanden sind. Die drei Kollagenasen, die im Gelenkknorpel während der frühen Stadien einer Degeneration vorhanden sind, sind Kollagenase-1 (MMP-1), Kollagenase-2 (MMP-8) und Kollagenase-3 (MMP-13). von den drei Stromelysinen, Stromelysin-1 (MMP-3), Stromelysin-2 (MMP-10) und Stromelysin-3 (MMP-11), tritt nur Stromelysin-1 im Gelenkknorpel während der frühen Stadien von dessen Degeneration auf.
Die frühen Stadien der pathologischen Veränderungen, die zu Knorpelschädigung und -abnahme führen, umfassen eine versuchte Reparatur durch die erhöhte Synthese von Matrixmakromolekülen. Der Aufbau des Reparaturknorpels ist jedoch aufgrund einer geänderten Zusammensetzung und Verteilung der Glucosaminoglykankomponente und einer Veränderung im Hinblick auf dessen Fähigkeit zur Aggregation mit der Hyaluronsäurekomponente defizient. Während dieser pathologischen Veränderung freigesetzte Teilchen können auch zu entzündlichen Veränderungen der Synovialmembran führen. Jedoch können trotz dieser beginnenden Pathologie die Anfangsstadien einer Knorpelschädigung und -abnahme symptomlos mit relativ wenig Schmerzen sein. Daher ist eine passende Aufgabe die Identifizierung der extrazellulären Matrixkomponenten und Cytokine, für die messbare Veränderungen identifiziert werden können, wobei das Profil eines Säugersubjekts in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme vor einem fokalen Knorpelverlust radiographisch identifiziert werden kann. Das Erfüllen dieser Aufgabe ermöglicht eine diagnostische Klassifizierung von Säugern, die Kandidaten für eine frühe pharmakologische Intervention sind, bevor eine signifikante Knorpeldegeneration auftritt.
IL-1, das als IL-1α und Il-1β auftritt, ist ein katabolisches Cytokin, das eine Gelenkknorpelschädigung und -abnahme bei Säugergelenken vermittelt. Es wirkt durch Suppression der Synthese von Typ-II-Kollagen, das im Gelenkknorpel gefunden wird, während es die Synthese von Typ-I-Kollagen, das für Fibroblasten kennzeichnend ist, fördert, indem es die Produktion von am Matrixabbau beteiligten Enzymen induziert und die Fähigkeit von Chondrocyten zur Synthese von neuen Proteoglykanen unterdrückt. Die Zahl der IL-1-Rezeptoren an der Oberfläche von Chondrocyten im Gelenkknorpel in den frühen Stadien einer Degeneration, die besetzt werden müssen, um eine katabolische Enzymproduktion auszulösen, beträgt nur ein Viertel des Werts, der normalerweise erforderlich ist (1 % gegenüber 4 %). IL-1 und dessen Modulator IRAP werden in autokriner und parakriner Weise durch die gleichen synovialen Makrophagen produziert und die IRAP-Produktion kann in Gegenwart von Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor (GM-CSF) erhöht wer den. Es besteht jedoch signifikante Ungleichheit zwischen der Wirksamkeit von IL-1 und IRAP, wobei etwa 130-fach mehr IRAP erforderlich ist, um die Wirkungen von IL-1 aufzuheben, was in Chondrocyten und Knorpelexplantaten ermittelt wurde. Jedes Ungleichgewicht zwischen IL-1 und IRAP verschlimmert die Degeneration von Gelenkknorpel weiter.
Folglich ist es auch eine entsprechende Aufgabe, Konzentrationen von IL-1 und IRAP und deren Verhältnisse bei Säugern in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration und die gleichen Werte bei nicht so betroffenen Säugern zu ermitteln, so dass messbare Veränderungen identifiziert werden können, die ein Säugersubjekt in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme profilieren, bevor ein fokaler Knorpelverlust radiographisch identifiziert werden kann. Diese Ergebnisse liefern eine diagnostische Klassifizieren von Säugern, die Kandidaten für eine frühe pharmakologische Intervention, bevor eine signifikante Knorpeldegeneration auftritt, sind. Ferner kann der Anteil von IL-1α und IL-1β sezernierenden Makrophagen, die in der Synovia und Synovialgewebe eines Gelenks in den frühen Stadien von Gelenkknorpeldegeneration auftreten, detektiert werden und er ist signifikant größer als der Anteil ähnlicher Zellen, die aus Synovia und Synovialgewebe von normalen Gelenken, d.h. Gelenken, die sich nicht in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration befinden, isoliert werden. Hier ergeben diese Ergebnisse erneut eine diagnostische Klassifizierung von Säugern, die Kandidaten für eine frühe pharmakologische Intervention, bevor eine signifikante Knorpeldegeneration auftritt, sind.
Noch des weiteren treten Veränderungen im subchondralen Knochen auf, bevor große Änderungen im Gelenkknorpel offensichtlich werden, da Cytokine, die zum Auslösen und Aufrechterhalten des Entzündungsprozesses verantwortlich sind, durch Mikrorisse durch die verkalkte Zone Zugang zu den unteren Knorpelschichten erhalten. Der Metabolismus der beteiligten Chondrocyten wird nachteilig beeinflusst und zusätzlich produzieren die Chondrocyten in der Mittelzone des Gelenkknorpels viele Cytokine einschließlich derjenigen, die zum Auslösen und Aufrechterhalten des Entzündungsprozesses verantwortlich sind. Diese Chondrocyten, die in autokriner Weise wirken, tragen daher zur Zerstörung ihrer eigenen extrazellulären Matrix bei. Der erhöhte Wassergehalt des Gelenkknorpels erleichtert diesen Prozess ebenfalls durch Erhöhen der Diffusion der Entzündungscytokine in der gesamten Matrix. Folglich besteht eine passende Aufgabe darin, Konzentrationen verschiedener Entzündungscytokine, die durch Chondrocyten, Synovialzellen und/oder subchondrale Osteocyten bei Säugern, insbesondere Hunden, während des Prozesses von Gelenkknorpeldegeneration produziert werden, und die gleichen Werte bei nicht so betroffenen Säugern zu ermitteln, so dass messbare Veränderungen identifiziert werden können, die ein Säugersubjekt in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme, bevor ein fokaler Knorpelverlust radiographisch identifiziert werden kann, profilieren. Diese Ergebnisse liefern eine diagnostische Klassifizierung von Säugern, die Kandidaten für eine frühe pharmakologische Intervention, bevor eine signifikante Knorpelschädigung auftritt, sind.
Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα) besitzt nur ein Zehntel der Wirksamkeit von IL-1 im Hinblick auf die Degeneration von Gelenkknorpel, doch nimmt dessen Konzentration in Synovia signifikant in den Kniegelenken von Säugern, insbesondere mit durchtrennten Kreuzbändern, im Vergleich zu dem entgegengesetzten, nicht operierten Knie zu. Es besteht auch eine verstärkte Expression von p55-TNF-Rezeptoren (TNF-R) auf Chondrocyten, die aus in derartigen Kniegelenken vorhandenem Gelenkknorpel isoliert wurden. Daher ist es, da TNFα eine Rolle bei den pathologischen Veränderungen, die in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme auftreten, spielt, in ähnlicher Weise eine passende Aufgabe, Konzentrationen von TNFα und TNF-R in den Gelenken von Säugern in den frühen Stadien einer Gelenkknorpelschädigung und die gleichen Werte bei nicht so betroffenen Säugern zu ermitteln, so dass messbare Veränderungen identifiziert werden können, die ein Säugersubjekt in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme, bevor ein fokaler Knorpelverlust radiographisch identifiziert werden kann, profilieren. Diese Ergebnisse ergeben eine diagnostische Klassifizierung von Säugern, die Kandidaten für eine frühe pharmakologische Intervention, bevor eine signifikante Knorpeldegeneration auftritt, sind.
Interleukin-6 (IL-6) ist ein multifunktionales Cytokin, spielt jedoch eine inflammatorische Rolle und findet sich in erhöhten Konzentrationen in Gelenken und Synovia geschädigter Gliedmaßen in Vergleich zu Kontrollgliedmaßen. IL-6 ist auch für eine verstärkte Expression von TNF-R an Chondrocyten und erhöhte Proteoglykanproduktion durch Chondrocyten sowie Induktion der Glykosaminoglykanfreisetzung verantwortlich. Die Ermittlung von IL-6-Konzentrationen in Gelenken, Synovia und Chondrocyten von Säugergelenken in den frühen Stadien einer Gelenkknorpelschädigung und -abnahme im Vergleich zu einer Kontrolle kann als diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung von Säugern, die passende Kandidaten für eine pharmakologische Behandlung, bevor irgendein fokaler Knorpelverlust aufgrund einer radiographischen Untersuchung offensichtlich ist, sind, verwendet werden.
Leukämiehemmfaktor (LIF) wird durch Monocyten, Granulocyten, T-Zellen, Fibroblasten und andere Zellarten, die mit Entzündungszuständen in Verbindung stehen, produziert. Synoviocyten und Chondrocyten synthetisieren und sezernieren LIF in Gegenwart von IL-1β und TNFα. Daher kann die Ermittlung von im Vergleich Erhöhungen der Konzentrationen von LIF diagnostisch zur Wahl von Säugerkandidaten für eine pharmakologische Behandlung der frühen Stadien von Gelenkknorpelschädigung und -abnahme verwendet werden.
Die Degeneration, Schädigung und Abnahme von Gelenkknorpel bei Säugern wird durch ein Ungleichgewicht zwischen den Cytokinen, die die oben beschriebenen katabolischen Prozesse antreiben, und den Cytokinen, die zur Beibehaltung der Synthese- und proliferativen Reaktionen der Chondrocyten im Knorpel verantwortlich sind, verursacht. Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-1), transformierender Wachstumsfaktor-beta (TGFβ), Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor, beispielsweise basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), sind alle mitogen im Hinblick auf die Chondrocyten und stimulieren Matrixsynthese im Gelenkknorpel.
Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) existiert als Typ I und II, und IGF-I ist ein starker Mediator der Knorpelsynthese. Ferner verringert er den Abbau und fördert er die Synthese von Proteoglykanen auch in Gegenwart von IL-1β und TFNα. Serumspiegel von IGF-1 werden durch Bindungsproteine hoher Affinität (ZGF-BPs) aufrechterhalten und IGF-1 ist sowohl im Hinblick auf Knochen- als auch Knorpel-Turnover wichtig. Spiegel von IGF-1 im Vergleich zu einer Kontrolle ermöglichen eine diagnostische Bewertung von Säugerkandidaten für eine frühe pharmakologische Behandlung von Gelenkknorpeldegeneration.
Transformierender Wachstumsfaktor (TGFβ) wird durch Chondrocyten produziert und er ist ein mächtiges Mitogen für das Turnover von sowohl Knorpel als auch Knochen. Ferner stimuliert er die Synthese von Matrix und weist er entzündungshemmende Aktivität auf. Er hemmt auch den Abbau der Matrix durch Stimulierung der Proteaseinhibitorproduktion und die Blockierung von Kollagenase- und Metalloproteasefreisetzung. Noch ferner fördert er eine Knorpelreparatur durch Stimulierung der Produktion von Kollagen, Fibronektin, Inhibitoren von Plasminogenaktivatoren und Gewebeinhibitoren von Metalloproteasen (TIMP) durch verschiedene Zellen im Säugergelenk. Synoviaspiegel von TGFβ sind in den Gelenken von Säugern in den frühen Stadien einer Gelenkknorpelschädigung und -abnahme niedrig. Infolgedessen ermöglichen Spiegel von TGFβ im Vergleich zu einer Kontrolle eine diagnostische Beurteilung von Säugerkandidaten für eine frühe pharmakologische Behandlung einer Gelenkknorpeldegeneration.
Mit fortschreitender Degeneration, d.h. Katabolismus des Gelenkknorpels im Säugergelenk, werden eine Zahl von Metaboliten produziert, die als Marker der Knorpeldegeneration sowohl im Hinblick auf deren Auftreten als auch deren Fortschreiten verwendbar sind. Beispielsweise setzt ein Knorpelabbau durch IL-1α und IL-1β oder TFNα Glykosaminoglykane (GAGs) frei, die in der Synovia eines zu testenden Säugers ermittelt werden können. Des weiteren ändern sich GAG-Spiegel nach einer Behandlung, so dass es möglich ist, den Verlauf einer pharmakologischen Intervention unter Ver wendung von Synovia-GAG-Spiegeln als Marker des Gelenkknorpel-Turnover zu überwachen.
Da der Abbau von Gelenkknorpel Kollagen sowie die anderen Knorpelkomponenten umfasst, dienen mehrere Kollagenprodukte als Marker eines Knorpelabbaus beim Säuger, insbesondere einer Hundegelenkknorpelschädigung und -abnahme. Typ-II-spezifische Kollagenabbauprodukte, beispielsweise Neoepitope von 20–30 Aminosäuren, können in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Synovia, Plasmaserum oder Urin, identifiziert werden. Das Vorhandensein von Neoepitopen in diesen Körperflüssigkeiten kann als Indikator für das Einsetzen und die Progression von OA verwendet werden.
Keratansulfat ist ein spezielles GAG, das ein Epitop 5D4 aufweist, dessen Konzentrationen in Synovia als Marker einer frühen Gelenkknorpelschädigung und -abnahme verwendet werden können. Umgekehrt sind Konzentrationen von Chondroitinsulfat, eines anderen speziellen GAG, als Zahl der Epitope ausgedrückt, mit anabolischen Ereignissen im Gelenkknorpel von Säugern in den frühen Stadien einer Knorpelschädigung und -abnahme verbunden. Die Spiegel bzw. Konzentrationen dieser Epitope in Synovia, insbesondere 3B3, 7D4 und 846, können durch spezifische monoklonale Antikörper, die sie erkennen, bestimmt werden. Das 3B3-Epitop wird auf Chondroitinsulfatketten von Knorpel während einer Reparatur und des Remodelling der extrazellulären Matrix exprimiert und infolgedessen korrelieren dessen Konzentrationen in Synovia invers mit denen des oben genannten 5D4. Die Expression von 3B3 in neu synthetisierten PGs in der Oberflächen- und oberen Mittelschicht des Gelenkknorpels bedeutet, dass 3B3 mit frühen Veränderungen im Gelenkknorpel von Säugern in den frühen Stadien einer Knorpeldegeneration verbunden ist. Demgemäß ermöglicht die Bestimmung von 3B3-Konzentrationen in der Synovia von Testsäugern und der Vergleich dieser Konzentrationen mit Kontrollwerten die Erzeugung eines diagnostischen Profils eines Säugers, der ein passender Kandidat für eine frühe pharmakologische Behandlung ist.
Weitere Marker einer anabolischen Knorpelaktivität sind die Propeptide von Typ-II-Prokollagen (PIIP). Typ II ist das Hauptkollagen von Gelenkknorpel und es wird durch Chondrocyten als Prokollagen produziert. Während des Prozesses der Kollagenfibrillenbildung werden das nicht-kollagenartige Aminopropeptid und Carboxypropeptid abgespalten und in Körperflüssigkeiten freigesetzt, wo sie als Reflexion anabolischer Aktivität im Gelenkknorpel gemessen werden können. Die Konzentrationen von Carboxy-PIIP steigen und dessen Synoviaspiegel korrelieren mit einem radiographischen Nachweis von Veränderungen im Knorpel. Daher ermöglicht die Ermittlung von Carboxy-PIIP-Spiegeln in Synovia und ein Vergleich mit Kontrollen die Identifizierung von Säugerkandidaten für eine frühe pharmakologische Behandlung.
Ein Ungleichgewicht im Hinblick auf das Stromelysin/ TIMP-Verhältnis im Hinblick auf die Gelenkknorpel- und Gelenkfluida von Säugern in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration ist auch zur Identifizierung derartiger Säuger verwendbar. Eine veränderte Gelenkbelastung nach einer Schädigung bewirkt die Produktion von Stromelysin im Übermaß, ein Enzym, das durch Chondrocyten und Synoviocyten unter dem Einfluss von IL-1 produziert wird. Die Konzentrationen von Stromelysin sind auch höher in fibrillärem Knorpel als sie in von der beteiligten Schädigung entfernterem Knorpel sind. Die erhöhten Stromelysinspiegel können nur über einen ziemlich kurzen Zeitraum auftreten, doch besteht, wenn die Schädigungen des Gelenks die Gezeitenmarkezone des Knorpelgelenks überschreitet und den subchondralen Knochen erreicht, eine substantielle Wahrscheinlichkeit einer anschließenden Gelenkknorpeldegeneration, der üblicherweise eine Versteifung des subchondralen Knochens vorausgeht.
Ferner gibt es in dem Kreuzband-defizienten Säugermodell, das bei der Detektion der frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration verwendet wird, eine erhöhte Zahl von Zellen, die an der Synthese von Stromelysin, IL-1α, IL-1β und drei Oncogenproteinen, c-MYC, c-FOS und c-JUN, beteiligt sind. In der Synovialis werden diese hauptsächlich in den auf der Oberfläche befindlichen Synoviaauskleidungszellen gefunden, während im Knorpel die Zellen die Chondrocyten auf den Oberflächen- und Mittelschichten die die Zellen in den fibrillären Bereichen des Tibiakopfes sind. Ferner diffundieren Stromelysin und IL-1 in die Knorpelmatrix des Tibiakopfes. Stromelysin, das Komponenten von Bindegewebe, die Proteoglykane und Typ-IX-Kollagen umfassen, abbaut, wird aktiv in der Synovialis von Säugern in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration synthetisiert und ist das primäre proteolytische Enzym, das an der Knorpelzerstörung beteiligt ist. Erhöhte Konzentrationen von Stromelysin-mRNA wie auch erhöhte Spiegel von Kollagenase-mRNA sind in der Synovia derartiger Säuger detektierbar. Erhöhte Spiegel beider Isoformen von IL-1, jedoch insbesondere IL-1β, stimulieren die erhöhte Synthese von Stromelysin durch Verstärkung der synovialen Fibroblasteninduktion von Stromelysin und der Kollagenasegenexpression. Gleichzeitig induziert IL-1 mRNA eines Gewebeinhibitors von Metalloprotease (TIMP) nicht und die Konzentrationen dieses Inhibitors bleiben unverändert, während die detektierbaren Konzentrationen von Metalloproteasen in der Synovialis dramatisch erhöht werden.
Die Metalloproteasen werden durch Chondrocyten als Proenzyme, die aktiviert werden müssen, bevor ein Abbau von Makromolekülen der extrazellulären Matrix stattfinden kann, sezerniert. Die Aktivierung umfasst eine enzymatische Kaskade, in der Serinproteasen, die das Plasminogenaktivator/ Plasmin-System umfassen, eine Rolle spielen.
Die Integrität des Gelenkknorpels in einem Säugergelenk hängt von der ausreichenden Unterstützung, die es von dem Knochenbett, das es bedeckt, erhöht, d.h. den Struktureigenschaften des darunter liegenden subchondralen Knochens, ab. Änderungen in diesem Knochenbett gehen abbauenden Veränderungen im Gelenkknorpel voraus. Diese Änderungen umfassen einer erhöhte Versteifung des subchondralen Knochens, die durch eine Abnahme des Stoßabsorptionsvermögens begleitet ist. Diese Veränderungen des subchondralen Knochens werden durch eine unpassende Reparatur von Trabekelmikrorissen, die wiederum von einer übermäßigen Belastung des Gelenks herrühren, verursacht. Trabekelverdickung des subchondralen Knochens ist Teil einer Knochenveränderung, die zu einer(m) erhöhten Knochenmineraldichte und/oder -volumen in betroffenen Gelenken führt, was wiederum durch einen Knochenzelldefekt in den Osteoblasten verursacht ist, was zu veränderten Phänotypeigenschaften in diesen osteoblastenähnlichen Zellen des subchondralen Knochens führt.
Diese Veränderungen im Hinblick auf die subchondrale Knochendichte sind nicht nur Beweisanzeichen für ein Ungleichgewicht in dem Knochenremodellingprozess, sondern auch ein Schlüsselbestandteil eines letztendlich erfolgenden fokalen Knorpelverlusts. Knochensklerose beruht auch auf einer Dysregulation dieses Knochenremodellingprozesses. Ferner treten ortsbezogene Unterschiede des Osteoblastenstoffwechsels auf, die zur Produktion unterschiedlicher knorpelabbauender Moleküle führen. Diese Änderungen der Osteoblastenmetaboliten führen wiederum zu entsprechenden Änderungen des Chondrocytenmetabolismus, was sie für eine cytokininduzierte Aktivität der oben beschriebenen Arten empfindlicher macht. Diese Osteoblastenanomalie und ein unterschiedlicher Phänotyp sind durch divergierende Produktionsmengen von Osteocalcin, alkalischer Phosphatase, cAMP, das auf einen Hormonreiz reagiert, Urokinaseplasminogenaktivator (uPA) und insulinähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) gekennzeichnet.
Ein weiteres Beweisanzeichen für die Beteiligung subchondraler Knochenaktivität an einer letztendlichen Gelenkknorpeldegeneration ist eine Verengung des Gelenkzwischenraums, die durch Knochenszintigraphie ermittelt werden kann. Diese Veränderungen der subchondralen Knochenaktivität werden durch entsprechende Änderungen von spezifischen Knochenzellmetaboliten, beispielsweise Osteocalcin, begleitet. Osteocalcin ist ein von Vitamin K abhängiges calciumbindendes Knochenprotein, das das am häufigsten vorkommende Nichtkollagenprotein im Knochen ist. Erhöhte Osteocalcinspiegel sind ein Marker des Knochen-Turnover in verschiedenen Erkrankungszuständen, die insbesondere die frühen Stadien von Gelenkknorpeldegeneration umfassen. Körperflüssigkeitsspiegel, insbesondere Synoviaspiegel von Osteocalcin korrelieren direkt mit subchondralen Knochenveränderungen, die durch Szintigraphie ermittelt werden.
Zusätzlich zu Markern von subchondraler Knochenaktivität als Indikatoren der frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration bei Säugern sind Metabolite von Knorpel- und Synovialisaktivität ebenfalls als Marker, die die frühen Stadien einer derartigen Knorpeldegeneration anzeigen, verwendbar. Beispielsweise dient die Detektion erhöhter Serumspiegel von oligomeren Matrixprotein von Knorpel als Marker des Knorpel-Turnover. In ähnlicher Weise dient die Detektion hoher Konzentrationen von Hyaluronat in Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum, als Marker einer Synovilentzündung. In beiden Fällen zeigen die erhöhten Körperflüssigkeitsspiegel, insbesondere Serumspiegel dieser Metabolitmarker die frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration an.
Der hier verwendete Ausdruck "Körperflüssigkeit" soll alle die zugänglichen Körperflüssigkeiten umfassen, die als klinische Proben verwendbar sind, die eine zu testende Verbindung in so ausreichender Konzentration in der Flüssigkeit enthalten, dass sie innerhalb der Nachweisgrenzen der verwendeten Testvorrichtung oder des verwendeten Testansatzes liegen. Körperflüssigkeiten umfassen daher Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Synovia und intestitielle und andere extrazelluläre Flüssigkeiten.
Wie bei allen entzündlichen immunochemischen und sonstigen biologischen Tests der oben beschriebenen Art muss deutliche Sorgfalt bei der Gewinnung und Aufbewahrung der zu testenden Flüssigkeiten aufgewandt werden. Es sollten Schritte unternommen werden, um eine Proteolyse der zu testenden Verbindungen in den Flüssigkeiten zu vermeiden, und ein Einfrieren ist üblicherweise berechtigt, wenn der beteiligte Test nicht innerhalb eines kurzen Zeitraums durchgeführt werden kann. Üblicherweise ist es bevorzugt, Synovia statt Sterum zu verwenden, aufgrund der Wahrscheinlichkeit, dass größere Konzentrationen der zu testenden Verbindungen in der Synovia vorhanden sind. Andererseits ergeben erhöhte Viskositätsgrade in Synoviaflüssigkeiten Probleme in Immunoassaysystemen, mit denen sich der Durchführende befassen muss. Schließlich ist es, wie aus der obigen Beschreibung klar ist, bevorzugt, Längsstudien einer Auswahl von Cytokinen und Markern sowie von deren jeweiligen Inhibitoren und Bindungsproteinen durchzuführen, um ein möglichst genaues Profil bei der Bestimmung, ob ein Säugersubjekt in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration ist und daher ein Kandidat für eine pharmakologische Intervention ist, zu erhalten.
Zwar können Laborbestimmungen biologischer Aktivität unter Verwendung von einer speziellen Rasse durchgeführt worden sein, doch wird angenommen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hunden und Pferden verwendbar sind.
Eine Variation der Ergebnisse entsteht aufgrund einer Zahl von Faktoren, die die spezielle Art eines Säugers sowie des spezifischen individuellen Säugers, dem die chondroprotektive Verbindung verabreicht wird, umfassen. Das Stadium, bis zu dem die Erkrankung fortgeschritten ist, d.h. das Ausmaß der Läsion, Schädigung oder der Abnahme des Gelenknorpels oder des subchondralen Knochens, die bereits stattgefunden hat, beeinflusst die Ergebnisse. Je weiter die Erkrankung fortgeschritten ist, desto schwieriger wird es, den Erkrankungsprozess anzuhalten oder aufzuheben. Die spezielle chondroprotektive Verbindung, die zur Verabreichung ausgewählt ist, kann ebenfalls eine Auswirkung auf die Ergebnisse haben, wie dies auch die Dosis der verabreichten Verbindung, die Art und der Ort der Verabreichung derselben und die spezielle verwendete Dosierungsform haben können.
Der Ausdruck "Prävention", der hier in Bezug auf die Verabreichung der chondroprotektiven Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, soll sowohl die therapeutische Aufgabe der Verabreichung sowie die tatsächlich durch die Verabreichung erreichten therapeutischen Ergebnisse bezeichnen. Wie oben diskutiert wurde, kann das Ausmaß einer durch Verabreichung der chondroprotektiven Verbindungen erreichten Therapie von einer Verschlechterung bis zu einer signifikanten Verringerung des Verlaufs der Erkrankung einschließlich einer Aufhebung des Erkrankungsprozesses reichen. Die höheren Grade einer therapeutischen Wirksamkeit führen zu einer Prävention von irgendeiner Läsion, Schädigung oder Abnahme von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen anschließend an die frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel oder subchondralem Knochen.
Pathologische Veränderungen im Hinblick auf den subchondralen Knochen umfassen eine Sklerose desselben, eine zunehmende Dichte mit abnehmender Spannkraft und Elastizität desselben und eine sich verringernde Fähigkeit, erfolgreich verschiedenen Arten von mechanischer Belastung zu widerstehen, insbesondere die Fähigkeit der Absorption mechanischer Stöße. Diese pathologischen Veränderungen umfassen insbesondere eine unpassende Reparatur von Trabekelmikrorissen mit Trabekelverdickung und pathogene Veränderungen im Hinblick auf Osteoblastenmetabolitenproduktion und veränderten Phänotyp.
Entsprechend wird durch die vorliegende Erfindung die Verwendung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure allein bereitgestellt, oder, wenn beide Enantiomere zusammen vorhanden sind, ein racemisches oder nicht-racemisches Gemisch derselben bereitgestellt.
Carprofen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann gemäß dem organischen Chemiker üblicher Erfahrung bekannte Syntheseverfahren hergestellt werden.
Die Syntheseansätze zur Herstellung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Carprofen sind detailliert im US-Patent Nr. 3 896 145 beschrieben.
Ein racemisches Gemisch aus (R)- und (S)-Enantiomeren resultiert, wenn ein 50:50-Gemisch der zwei Enantiomere besteht. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das (S)-Enantiomer der Carprofenverbindung mit einem chiralen Kohlenstoff das Enantiomer, das den höchsten Aktivitätsgrad im Hinblick auf die Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hunden und Pferden, die in der Zukunft an derartigen Schädigungen leiden können, besitzt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von nur dem (S)-Enantiomer von Carprofen, 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure, als Wirkstoff. Jedoch werden andere Ausführungsformen ebenso als innerhalb des Umfangs dieser bevorzugten Gattung der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. Beispielsweise können nichtracemische Gemische der (R)- und (S)-Enantiomere verwendet werden, und in diesem Fall ist das (S)-Enantiomer in einer Menge von mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 %, noch günstiger mindestens 95 % und am besten mindestens 99 % vorhanden. Da die (R)- und (S)-Enantiomere im Hinlick auf Molekulargewicht, Dichte und dergleichen identisch sind, ist es unnötig, eine Basis für die oben angegebenen Prozentzahlen festzulegen. Mit anderen Worten, können sie Prozentzahlen, bezogen auf das Gewicht, Volumen, chemische Äquivalenz und dergleichen sein. Der Grund dafür, die oben angegebenen Mengen des (R)-Enantiomers einzuschließen, sind einfach die praktischen Umstände, dass es nicht erforderlich ist, absolut jede letzte Spur des (R)-Enantiomers aus dem racemischen Gemisch zu entfernen. Es können auch Gründe vorliegen, dies durchzuführen, was vorteilhafte gesamte biologische Eigenschaften betrifft.
Dem Fachmann ist auch klar, dass die in dieser Beschreibung an anderer Stelle angegebenen Bereiche von Dosierungsmengen für die Carprofenverbindung im Hinblick auf ein racemisches 50:50-Gemisch von Enantiomeren beschrieben sind, wenn eine chirale Verbindung beteiligt ist. Dies erfolgte hauptsächlich aus Bequemlichkeitsgründen. Wenn der als Therapeutikum verwendete Wirkstoff ein von einem 50:50-Gemisch verschiedenes Enantiomerengemisch umfasst, oder wenn das Therapeutikum im wesentlichen 100 % des (+)(S)- oder (–)(R)-Enantiomers allein umfasst, kann der Fachmann üblicher Erfahrung die erforderliche tatsächliche Menge einer Dosierung in einer sehr einfachen Weise einfach durch Multiplizieren der angegebenen Dosierungsmengen mit einem Faktor, der das Verhältnis der zu verwendenden Menge des Enantiomers zu der Menge, die für die angegebene Dosierung auf der Basis eines 50:50-Gemisches der Enantiomeren vorhanden ist, berechnen. Beispielsweise ist, wenn die angegebene Dosierung 4 mg/kg/Tag für das racemische 50:50-Gemisch beträgt, die entsprechende Dosierungsmenge, wenn im wesentlichen 100 % eines (+)(S)-Enantiomers verwendet werden, die Hälfte der angegebenen Menge, d.h. 2 mg/kg/Tag.
Da die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die ein Mitglied einer Carprofenverbindung enthalten, die Verwendung von racemischen Gemischen, die 50 % (S)-Enantiomer enthalten, sowie nichtracemischen Gemischen mit etwa 99 % oder weniger des (S)-Enantiomers zusammen mit weniger als 50 % des (R)-Enantiomers betrachten, muss eine Auftrennung von Racematen der Carprofenverbindungen mit einem chiralen Kohlenstoff in die optisch ak tiven Isomere durchgeführt werden. Dies kann unter Verwendung bekannter Verfahren und einschlägiger Techniken ohne weiteres erreicht werden. Beispielsweise können einige racemische Gemische als Eutektika ausgefällt werden, wonach sie getrennt werden können. Jedoch ist es üblicherweise bevorzugt, chemische Verfahren zur Auftrennung zu verwenden, gemäß denen Diasteomere aus dem racemischen Gemisch mit einem optisch aktiven Auftrennungsmittel gebildet werden. Beispielsweise eine optisch aktive Base, beispielsweise D-α-Methylbenzylamin, die mit der Carboxylgruppe umgesetzt werden kann. Die auf diese Weise gebildeten Diastereomere werden dann durch selektive Kristallisation getrennt und in das entsprechende optische Isomer umgewandelt.
Vom Umfang der vorliegenden Erfindung werden alle therapeutisch aktiven und pharmazeutisch akzeptablen Salzformen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Carprofenverbindung umfasst. Dies umfasst insbesondere Säureadditionssalze derselben, wobei "A" als irgend etwas anderes ausser "Hydroxy" definiert ist, die durch Behandeln der Verbindungen der Formel (I) mit pharmazeutisch akzeptablen organischen und anorganischen Säuren gebildet werden, beispielsweise Hydrohalogenide, wie Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid; andere Mineralsäuren und deren entsprechende Salze, wie Sulfat, Nitrat, Phosphat und dergleichen; und Alkyl- und Monoarylsulfonate, wie Ethansulfonat, Toluolsulfonat und Benzolsulfonat; und andere organische Säuren und deren entsprechende Salze, wie Acetat, Tartrat, Maleat, Succinat, Citrat, Benzoat, Salicylat, Ascorbat und dergleichen.
Bei der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Carprofenverbindung können Salze derselben durch Behandlung mit pharmazeutisch akzeptablen Basen gebildet werden. Beispiele für derartige Basen sind Alkalimetallhydroxide, die Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid und Lithiumhydroxid umfassen; Erdalkalimetallhydroxide, wie Bariumhydroxid und Calciumhydroxid; Alkalimetallalkoxide, beispielsweise Kaliumethanolat und Natriumpropanolat; und verschiedene organische Basen, wie Piperidin, Diethanolamin und N-Methylglutamin. Ebenfalls umfasst werden die Aluminiumsalze.
Wenn 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure oder deren Entantiomere oder Salze als Wirkstoffe in der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, können sie in pharmazeutischen Standarddosierungsformen eingearbeitet werden. Beispielsweise sind sie verwendbar, wenn sie in systemischen oder lokalen, oralen oder parenteralen Applikationen verabreicht werden und für diesen Zweck mit den üblichen pharmazeutischen Streckmitteln, Verdünnungsmitteln und Adjuvanzien, beispielsweise organischen und anorganischen inerten Trägermaterialien, wie Wasser, Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, pflanzlichen Ölen, Gummis, Polyalkylenglykolen und dergleichen kombiniert werden. Diese pharmazeutischen Zubereitungen können in einer festen Form, beispielsweise als Tabletten, Kapseln, und insbesondere in Kombination mit einem oder für ein Gemisch mit einem für Säuger geeigneten schmackhaften Nahrungsbestandteil verwendet werden; oder sie können in flüssiger Form, beispielsweise als Lösungen und Elixiere, verabreicht werden. Pharmazeutische Streckmittel und Adjuvanzien, die zugesetzt werden können, umfassen Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, antimikrobielle Mittel und andere Stabilisatoren; Netzmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel und Antikuchenbildungsmittel; Duft- und Farbadditive; Zusammensetzungen zur Verbesserung der Komprimierbarkeit oder zur Erzeugung einer verzögerten, nachhaltigen oder gesteuerten Freisetzung des Wirkstoffs; und verschiedene Salze zur Änderung des osmotischen Drucks der pharmazeutischen Zusammensetzung oder zur Wirkung als Puffer. Spezielle Dosierungsformen, die mit Erfolg verwendet wurden, umfassen eine 5%ige Mischmicellenlösung von Carprofen zur intravenösen Injektion, eine 3%ige wohlschmeckende Paste und orale Tabletten in 25-mg-, 75-mg- und 100-mg-Dosierungen.
Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung, insbesondere denjenigen, worin der Inhibitor 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure umfasst und beide erhaltenen Enantiomere zusammen vorhanden sind, besteht eine bevorzugte Ausführungsform in der Verwendung eines nichtracemischen Gemischs. Vorzugsweise ist es in derartigen bevorzugten nichtracemischen Gemischen erwünscht, dass das (+)(S)-Enantiomer in einer Menge von mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 %, noch günstiger mindestens 95 % und am besten mindestens 99 % vorhanden ist. Daher ist bei derartigen nichtracemischen Gemischen das (+)(S)-Enantiomer die vorherrschende Komponente, da es signifikant wirksamer als das (–)(R)-Enantiomer im Hinblick auf die Bereitstellung von Chondroprotektion ist. Die entsprechend kleineren Mengen des (–)(R)-Enantiomers, d.h. weniger als 15 %, weniger als 10 % bzw. weniger als 5 % werden optional umfasst, wenn eine Balance chondroprotektiver Eigenschaften als günstig erachtet wird. Wenn die vorhandene Menge des (–)(R)-Enantiomers weniger als 5 % und weniger als 1 % beträgt, spiegelt der Grund für die Einarbeitung üblicherweise die praktischen Umstände des zur Trennung der Enantiomere verwendeten Verfahrens wider. Wenn dieses Verfahren zeitaufwendig oder ressourcenaufwendig ist, ist es häufig von einem praktischen Standpunkt aus günstig, dass dieser kleinere Anteil des (–)(R)-Enantiomers einfach in das fertige Endprodukt eines nichtracemischen Gemischs übertragen wird.
Die Verbindung 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure kann einem zu behandelnden Säuger systemisch als pharmazeutische Zusammensetzung in geeigneter flüssiger Form durch Injektion oder Infusion verabreicht werden. Es gibt eine Zahl von Stellen und Organsystemen im Körper des Säugers, die es ermöglichen, dass die passend formulierte pharmazeutische Zusammensetzung, sobald sie injiziert oder infundiert ist, in den gesamten Körper und alle Organsysteme des zu behandelnden Säugers eindringt. Eine Injektion ist eine Einzeldosis der pharmazeutischen Zusammensetzung, die zwangsweise, üblicherweise durch eine Spritze, in das beteiligte Gewebe eingeführt wird. Die häufigsten Arten von Injektionen sind intramuskulär, intravenös und subkutan. Im Gegensatz dazu ist eine Infusion die allmähliche Einführung der pharmazeutischen Zusammensetzung in das beteiligte Gewebe. Die häufigste Art einer Infusion ist intravenös. Andere Arten einer Injektion oder Infusion umfassen intraarteriell, intra- oder transdermal (einschließlich subkutan) oder intraspinal, insbesondere intrathekal. In diesen flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann die chondroprotektive Verbindung in Lösung als der gelöste Stoff enthalten sein. Dies ist die häufigste und bevorzugteste Art einer derartigen Zusammensetzung, sie erfordert jedoch Carprofen in einer Salzform, die eine vernünftig gute Wasserlöslichkeit aufweist. Wasser (oder Kochsalzlösung) ist das bei weitem bevorzugte Lösemittel für derartige Zusammensetzungen. Gelegentlich können übersättigte Lösungen verwendet werden, jedoch zeigen diese Stabilitätsprobleme, die sie für eine Verwendung auf alltäglicher Basis unpraktikabel machen.
Wenn es nicht möglich ist, eine Form von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure zu erhalten, die den erforderlichen Grad an Wasserlöslichkeit hat, was manchmal auftreten kann, ist es dem Fachmann geläufig, eine Emulsion herzustellen, die eine Dispersion kleiner Globuli einer Flüssigkeit, der diskontinuierlichen oder inneren Phase, in einer zweiten Flüssigkeit, der kontinuierlichen oder äußeren Phase, mit der sie nicht mischbar ist, ist. Die zwei Flüssigkeiten werden durch die Verwendung von Emulgatoren, die pharmazeutisch akzeptabel sind, in einem emulgierten Zustand gehalten. Daher kann 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure, wenn es ein wasserunlösliches Öl ist, in einer Emulsion, in der es die diskontinuierlichen Phase ist, verabreicht werden. Auch kann, wenn der Inhibitor wasserunlöslich ist, jedoch in einem Lösemittel, das mit Wasser mischbar ist, gelöst werden kann, eine Emulsion verwendet werden. Zwar wird die Verbindung am häufigsten als die diskontinuierliche oder innere Phase verwendet, was als Öl-in-Wasser-Emulsion bezeichnet wird, doch kann sie auch als die diskontinuierliche oder interne Phase einer inversen Emulsion, die üblicherweise als Wasser-in-Öl-Emulsion bezeichnet wird, verwendet werden. In diesem Fall ist die Verbindung in Wasser löslich und kann als einfache wässrige Lösung verabreicht werden.
Jedoch invertieren inverse Emulsionen bei Injektion oder Infusion in ein wässriges Medium, wie Blut, und sie bieten den Vorteil der Bereitstellung einer rascheren und effizienten Dispersion der Verbindung in das wässrige Medium, als sie unter Verwendung einer wässrigen Lösung erhalten werden kann. Inverse Emulsionen werden durch die Verwendung geeigneter, einschlägig bekannter pharmazeutisch akzeptabler Emulgatoren hergestellt. Wenn die Verbindung begrenzte Wasserlöslichkeit aufweist, kann sie auch als suspendierter Feststoff in kolloidaler oder Mikroteilchenform in einer Suspension, die unter Verwendung geeigneter pharmazeutisch akzeptabler Suspendiermittel hergestellt wurde, verabreicht werden. Die die Verbindung enthaltenden suspendierten Feststoffe können auch als Zusammensetzungen mit verzögerter, nachhaltiger und/oder gesteuerter Freisetzung formuliert werden.
Während eine systemische Verabreichung am häufigsten durch Injektion oder Infusion einer Flüssigkeit durchgeführt wird, gibt es viele Situationen, in denen es vorteilhaft oder auch notwendig ist, die Verbindung als Feststoff zuzuführen. Eine systemische Verabreichung von Feststoffen wird durch Instillation einer pharmazeutischen Zusammensetzung in einer geeigneten festen Form, die die Verbindung enthält, durchgeführt. Die Instillation der Verbindung kann die Instillation einer festen Implantatzusammensetzung in geeignete Körpergewebe oder -höhlungen umfassen. Das Implantat kann eine Matrix von biokompatiblen und bioerodierbaren Materialien umfassen, in denen Teilchen einer festen Verbindung dispergiert sind oder in denen Globuli oder isolierte Zellen einer flüssigen chondroprotektiven Verbindung gefangen sind. Günstigerweise wird die Matrix aufgebrochen und vom Körper vollständig absorbiert. Die Zusammensetzung der Matrix wird auch vorzugsweise so gewählt, dass sie eine gesteuerte, nachhaltige und/oder verzögerte Freisetzung der Verbindung über längere Zeiträume, sogar mehrere Monate, ergibt.
Eine wesentliche Zahl der hier beschriebenen Dosierungsformen kann so formuliert werden, dass sie eine gesteuerte, nachhaltige und/oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs aus der Dosierungsform ergibt. In einem besonders bevorzugten Aspekt der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die eine verzögerte, nachhaltige und/oder gesteuerte Freisetzung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure ergeben, werden alle derartigen oral verabreichten Dosierungsformen, die zu einer Plasmakonzentration der Verbindung von mindestens 10 μg/ml während mindestens 4 h, vorzugsweise während mindestens 8 h, noch günstiger mindestens 12 h, und noch günstiger mindestens 16 h, und noch günstiger mindestens 20 h und am besten etwa 24 h führen, umfasst. Vorzugsweise werden die oben beschriebenen Dosierungsformen, die zu einer Plasmakonzentration des Inhibitors von mindestens 15 μg/ml während mindestens 4 h, vorzugsweise mindestens 8 h, noch günstiger mindestens 12 h, und noch günstiger mindestens 20 h und am besten etwa 24 h führen, umfasst. Noch besser werden die oben beschriebenen Dosierungsformen, die zu einer Plasmakonzentration des Inhibitors von mindestens 20 μg/ml während mindestens 4 h, vorzugsweise mindestens 8 h, noch günstiger mindestens 12 h, und noch günstiger mindestens 20 h und noch besser etwa 24 h führen, umfasst.
Demgemäß ist eine verwendbare Dosierungsform mit gesteuerter Freisetzung von Carprofen gemäß der vorliegenden Erfindung eine, die einen Carprofenplasmaspiegel von größer als 2 μg/ml für den größten Teil des Tages nach einer einzigen oralen Dosis mit 4,41 mg/kg (2 mg/lb) aufrechterhält. Bevorzugte orale Dosierungsformen von Carprofen mit gesteuerter Freisetzung gemäß der vorliegenden Erfindung sind solche, die eine Plasmacarprofenkonzentration von größer als 10 μg/ml über einen Zeitraum aufrechterhalten, deren größer als derjenige ist, währenddem eine Dosierungsform von Carprofen mit unmittelbarer Freisetzung einen vergleichbaren Plasmaspiegel aufrechterhält, wenn die Dosierungsform mit unmittelbarer Freisetzung und die Dosierungsform mit gesteuerter Freisetzung mit der gleichen Dosis, beispielsweise 4,41, 3,97, 3,53, 3,09 mg/kg (2, 1,8, 1,6 oder 1,4 mg/lb), verabreicht werden. Beispielsweise halten bevorzugte orale Dosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung dieser Erfindung mit 4,41 mg/kg (2 mg/lb) eine Plasmacarprofenkonzentration von größer als 10 μg/ml während mehr als 10,5 h aufrecht.
Carprofendosierungsformen mit unmittelbarer Freisetzung, die Dosen von 3,97 mg/kg (1,8 mg/lb) enthalten, halten eine Plasmacarprofenkonzentration von über 10 μg/ml während 9,5 h, 8,5 h bzw. 7,5 h aufrecht. Bevorzugte orale Caprofendosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung mit 3,97 mg/kg (1,8 mg/lb) halten eine Plasmacarprofenkonzentration von über 10 μg/ml während größer als 9,5 h aufrecht. In ähnlicher Weise betragen die Schwellenzeitdauer für Dosen von 3,53 mg/kg (1,6 mg/lb) und 3,09 mg/kg (1,4 mg/lb) 8,5 h bzw. 7,5 h. Die Leistungseigenschaften für bevorzugte orale Carprofendosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung mit Dosen von höher als 4,41 mg/kg (2 mg/lb) oder weniger als 3,09 mg/kg (1,4 mg/lb) können in ähnlicher Weise unter der Annahme linearer Pharmokokinetik berechnet werden. Noch günstigere orale Carprofendosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung sind diejenigen, die eine Plasmacarprofenkonzentration von größer als 10 μg/ml über einen Zeitraum aufrechterhalten, der größer als der oder gleich dem ist, der beobachtet wird, wenn eine Carprofendosierungsform mit unmittelbarer Freisetzung mit einer beliebigen höheren Dosis dosiert wird.
Die am stärksten bevorzugten oralen Carprofendosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung sind diejenigen, die Plasmacarprofenspiegel von über etwa 10 μg/ml über einen Zeitraum aufrechterhalten können, der größer als die oder gleich der Zeit ist, die für eine Carprofendosierungsform mit unmittelbarer Freisetzung von 4,41 mg/kg (2 mg/lb) beobachtet wird (10,5 h), wenn die oralen Carprofendosierungsformen mit gesteuerter Freisetzung mit einer Dosis von weniger als 4,41 mg/kg (2 mg/lb) verabreicht werden. Die Leistung eines oralen Dosierungsform mit unmittelbarer Freisetzung mit 4,41 mg/kg (2 mg/lb) wird als der fundamentale Standard für Zwecke dieses Vergleichs genommen, da 4,41 mg/kg (2 mg/lb)/Tag die derzeit empfohlene und akzeptierte wirksame orale Dosis gemäß der hier beschriebenen vorliegenden Erfindung ist.
Der Ausdruck "Implantat" bezeichnet immer eine feste pharmazeutische Zusammensetzung, die das chondroprotektive Carprofen enthält, während der Ausdruck "Depot" üblicherweise eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung der Formel (I) enthält, impliziert, die in geeigneten Körpergeweben oder -höhlungen unter Bildung eines Reservoirs oder Pools abgelagert wird, die langsam in umgebende Gewebe und Organe wandert und schließlich systemisch verteilt wird. Jedoch werden diese Unterscheidungen einschlägig nicht immer strikt angewandt und infolgedessen wird angenommen, dass von dem Umfang der vorliegenden Erfindung flüssige Implantate und feste Depots und auch gemischte feste und flüssige Formen für die einzelnen umfasst werden.
Andere Mittel einer systemischen Verabreichung, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure in entweder flüssiger oder fester Form verwenden können, umfassen transdermale Wege. Insbesondere können transdermale Pflaster, die gemäß bekannter Arzneimittelabgabetechnologie hergestellt werden können, hergestellt und auf die Haut eines zu behandelnden Säugers appliziert werden, wonach der Wirkstoff aufgrund der einformulierten Löslichkeitseigenschaften durch die Epidermis und in die Hautschichten der Haut eines Säugers wandert, wo er als Teil des allgemeinen Blutkreislaufs des Säugers aufgenommen wird, was letztendlich eine systemische Verteilung des Wirkstoffs über einen gewünschten längeren Zeitraum ergibt. Ebenfalls umfasst werden Implantate, die unter der Epidermisschicht der Haut, d.h. zwischen der Epidermis und der Dermis der Haut des zu behandelnden Säugers, appliziert werden. Ein derartiges Implantat wird entsprechend bekannten Prinzipien und üblicherweise bei dieser Zufuhrtechnologie verwendeten Materialien formuliert und kann derart hergestellt werden, dass eine gesteuerte, nachhaltige und/oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs in den systemischen Blutkreislauf des Säugers bereitgestellt wird. Derartige subepidermale (subkutikuläre) Implantate ergeben die gleiche Installationsmöglichkeit und Abgabeeffizienz wie transdermale Pflaster, jedoch ohne die Beschränkung, dass sie einen Abbau, einer Schädigung oder zufälligen Entfernung infolge des Freiliegens auf der obersten Schicht der Haut eines Säugers unterliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen spezieller Arten, die zur oralen Verabreichung an Säuger geeignet sind, können ebenfalls ersonnen werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur peroralen Verabreichung, d.h. Aufnahme durch den Mund oder Verabreichung durch den Mund, geeignet sind, können fest oder flüssig sein. Bevorzugte perorale Dosierungsformen zur systemischen Verabreichung sind Feststoffe, beispielsweise wohlschmeckende orale Zusammensetzungen, wie sich schnell auflösende wohlschmeckende Oblaten, Tabletten, Kapseln, Caplets und dergleichen, und Flüssigkeiten, beispielsweise Lösungen, Suspensionen, Emulsio nen und dergleichen. Pharmazeutische Zusammensetzungen spezieller Arten, die zur oralen Verabreichung an Säuger geeignet sind, können verwendet werden, und sie umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, derartige Mittel wie eine orale Paste, die der rückwärtigen Zunge des zu behandelnden Säugers zuzuführen ist, eine körnige Form, die durch Einarbeiten in die Nahrung eines Säugers zuzuführen ist, und eine kaubare Form, wobei der Wirkstoff zusammen mit dem wohlschmeckenden Kaumaterial aufgenommen wird, oder eine kaubare Form, die den Wirkstoff durch Auslaugen aus dem Körper des Kaumaterials, das nicht aufgenommen wird, während der Mastikation durch den zu behandelnden Säuger zuführen kann. Wie einschlägig bekannt ist, berücksichtigt die Formulierung derartiger wohlschmeckender Zusammensetzungen das Verhalten eines Säugers im Hinblick auf das Ausmaß der Mastikation der Dosierungsform, die stattfindet, und die erhaltene Dosierungsmenge.
In Bezug auf andere Verabreichungswege und entsprechende Dosierungsformen, die hier beschrieben sind, werden zur oralen Verabreichung geplante Dosierungsformen auch günstigerweise derart formuliert, dass sie eine gesteuerte, nachhaltige und/oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs ergeben. Typischerweise umfassen diese orale Tabletten, Kapseln und mehrteilige Systeme mit verzögerter Freisetzung sowie enterisch überzogene Tabletten und Kapseln, die eine Freisetzung und Absorption des Wirkstoffs im Magen des Säugers verhindern und eine zum Magen distale enterische Abgabe, d.h. im Darm des Säugers, ermöglichen. Andere typische orale Dosierungsformen umfassen orale Tabletten, Kapseln und mehrteilige Systeme mit nachhaltiger Freisetzung, die eine systemische Abgabe des Wirkstoffs in gesteuerter Weise über einen längeren Zeitraum, beispielsweise einen Zeitraum von 24 h, ergeben. Wenn eine rasche Abgabe des Wirkstoffs erforderlich oder gewünscht ist, kann eine orale Dosierungsform mit gesteuerter Freisetzung in der Form einer sich schnell auflösenden Tablette, die auch vorzugsweise hoch lösliche Salzformen des Wirkstoffs umfasst, hergestellt werden.
Die hier angegebene Beschreibung der Dosierungsformen, die als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend be trachtet werden, klassifizierte, im wesentlichen aus Gründen der Bequemlichkeit, derartige Formen in solche zur lokalen und systemischen Verabreichung sowie in feste und flüssige Formen. Beispielsweise machte die hier gegebene Beschreibung bereits offensichtlich, dass einige Verabreichungswege zwar scheinbar lokal sind, jedoch auch systemische Wirkung oder Folgen haben können. Die hier gezogene Linie zwischen flüssigen und festen Dosierungsformen kann in der tatsächlichen Praxis auch undeutlich sein. Beispielsweise umfasst eine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete orale Dosierungsform eine gemischte feste und flüssige Formulierung. Mikroemulsionsformulierungen, die auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen, können als gemischte feste und flüssige Dosierungsform gekennzeichnet werden.
6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure kann lokal einem Gelenk in dem zu behandelnden Säuger verabreicht werden. Eine lokale gegenüber einer systemischen Verabreichung umfasst eine stärker fokussierte gegenüber einer stärker generalisierten Art und Weise der Abgabe der die chondroprotektive Verbindung enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger in den frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration. Jedoch neigt die Verwendung von Depots und Implantaten sowie von Formulierungen mit verzögerter, nachhaltiger und gesteuerter Freisetzung zu einem Verwischen dieser Unterschiede. Entsprechend können die oben beschriebenen flüssigen und festen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure enthalten, zum größten Teil auch zur lokalen Verabreichung verwendet werden, wobei Betonung auf die Wahl von Komponenten für die Zusammensetzungen gelegt wird, die zur Förderung einer Absorption der Verbindungen in den lokalen Geweben am Ort der Verabreichung tendieren, die jedoch auch zur Verhinderung einer Infiltration und Migration des Inhibitors in stärker außenliegende und entfernte Gewebe tendieren, was zu einer systemischen Übertragung führt.
Eine lokale Verabreichung konzentriert sich auf geeignete Gelenkgewebe, in die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure injiziert, infundiert, implantiert, deponiert, insertiert oder instilliert werden kann. Eine derartige Verabreichung kann, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Verabreichung umfassen, die intraartikulär, intrachondrial, intrakostal, intraligamentös, intramedulär, intramuskulär, intraosteal, intrapelvin, intraspinal, intrasternal, intrasynovial, intratarasal, intrathekal oder intravenös ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen in flüssiger Form, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure enthalten, bieten den Vorteil, dass sie Injektionen der Flüssigkeit in den Gelenkort oder in enger Nähe zu diesem ermöglichen. Durch direkte Injektion der Verbindung in das Gelenk, ist es möglich, eine hohe Konzentration der Verbindung innerhalb eines kurzen Zeitraums zu erreichen, wodurch nicht nur der Zugang der Verbindung zu den Gelenkgeweben und daher die therapeutische Aktivität der Verbindung verstärkt wird, sondern auch gleichzeitig das Auftreten ungünstiger nachteiliger Reaktionen, die sonst auftreten können, zu minimieren. Das Ergebnis ist eine hohe lokale Konzentration der Verbindung mit einer entsprechend niedrigen systemischen Übertragungskonzentration.
Injektionen können auch mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure enthalten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form mit verzögerter Freisetzung, gesteuerter Freisetzung oder nachhaltiger Freisetzung ist, durchgeführt werden. Diese Formulierungen einer anerkannten Zusammensetzung können Kombinationen von Feststoffen, Halbfeststoffen, Gelen oder anderen Flüssig/Fest-Kombinationen sein, in denen eine erodierbare Matrix oder eine Reihe von Überzügen verwendet wird, um eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung mit einer vorgegebenen Rate oder variablen Raten, falls gewünscht, bereitzustellen. Die Ausdrücke "verlängerte Freisetzung" und "lang wirkend" sowie andere werden zur Beschreibung dieser Formulierungen verwendet. Alle derselben verwenden verschiedene Kombinationen von bioerodierbaren Polymeren, beispielsweise verschiedenen Cellulosepolymeren, und natürlichen Materialien, beispielsweise Maisstärke und Magnesiumstearat, um eine langsame und/oder gleichmäßige Verteilung der in der Matrix enthaltenen Verbindung zu erhalten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in den Gelenkort injiziert werden, wenn sie in geeigneter Weise flüssig oder suspendierbar sind, oder durch andere Mittel zugeführt werden, wenn sie mehr fester Natur sind.
Die therapeutisch wirksame Menge zur Prävention von Osteoarthritis von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure wird allen zu behandelnden Säugern in einer Menge verabreicht, die als Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht des Säugers pro Tag ausgedrückt wird: "mg/kg/Tag". Der hier verwendete Ausdruck "pro Tag" sollte nicht so interpretiert werden, dass es zwangsläufig erforderlich ist, dass eine spezielle Dosierungsform dem zu behandelnden Säuger auf täglicher Basis verabreicht wird. Der Ausdruck "pro Tag" ist nur eine Angabe des kleinsten passenden, jedoch willkürlichen Zeitabschnitts, der als Teil der Gesamteinheit zur Messung der verabreichten Dosis einer chondroprotektiven Verbindung verwendet wird. Die Dosis, d.h. die therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung zur Prävention von Osteoarthritis liegt üblicherweise im Bereich von 0,01 mg/kg/Tag bis 20,0 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,1 mg/kg/Tag bis 12,0 mg/kg/Tag, noch günstiger 0,5 mg/kg/Tag bis 10,0 mg/kg/Tag und noch besser 0,5 mg/kg/Tag bis 8,0 mg/kg/Tag. Beispielsweise wiegt ein Säuger von 50 lb 23 kg (1 kg = 2,2 lb) und er wird daher vorzugsweise mit 10 mg bis 180 mg eines Therapeutikums pro Tag behandelt. Die gebrochenen Mengen sind nicht signifikant und die Dosierungen werden in passender Weise auf eine Zahl gerundet, die Einheitsdosierungsmengen entspricht, die ohne weiteres erhältlich sind. Wenn die Dosierungsform beispielsweise eine injizierbare Flüssigkeit ist, können die bevorzugten Dosierungsmengen genauer erhalten werden. Andererseits ist es, wenn die Dosierungsform beispielsweise eine orale Tablette ist, notwendig, eine stärkere Näherung der bevorzugten Dosierung durchzuführen. Daher kann die 10-mg-Dosis durch Halbieren einer 25-mg-Tablette angenähert werden und die 180-mg-Dosis durch die Verwendung einer 100-mg-Tablette zusammen mit einer 75-mg-Tablette oder drei 25-mg-Tabletten angenähert werden, da diese typischen Dosierungsmengen für orale Tabletten sind. Wie dem Fachmann geläufig ist, wird, wenn die am häufigsten verwendete Dosierungsform die orale Tablette ist, und eine große Zahl von Säugern auf einer täglichen Basis behandelt wird, zusätzliche Bequemlichkeit durch die Verwendung einer Dispensiervorrichtung erhalten, die alle verfügbaren Dosierungsmengen der Tabletten, beispielsweise 25-mg-, 75-mg- und 100-mg-Tabletten, enthält. Auf diese Weise kann tatsächlich jede bevorzugte Dosierungsmenge unter Verwendung einer Kombination der Tabletten und/oder Hälften derselben angenähert werden.
Für den erfahrenen Fachmann, wie einen Veterinärmediziner, ist es notwendig, nicht nur den bevorzugten Verabreichungsweg und die entsprechende Dosierungsform und Menge zu bestimmen, sondern der Fachmann muss auch das Dosierungsprotokoll, d.h. die Häufigkeit einer Dosierung, bestimmen. Allgemein ausgedrückt ist es sehr wahrscheinlich, dass die Wahl zwischen einer einmal täglichen (s.i.d.) Dosierung und einer zweimal täglichen (b.i.d.) Dosierung erfolgt, und dass die erstere eine schnellere und tiefergehende Therapie ergibt, während die letztere eine weniger tiefe, jedoch nachhaltigere Therapie ergibt. Jedoch berücksichtigt diese Verallgemeinerung nicht derartige wichtige Variablen, wie die spezifische Art einer beteiligten Gelenkknorpel- oder subchondralen Knochendegeneration oder -zerstörung, das beteiligte spezifische therapeutische Mittel und dessen Pharmakokinetik und den beteiligten speziellen Patienten (Säuger). Für ein auf dem Markt zugelassenes Produkt wird ein großer Teil dieser Information bereits durch die Ergebnisse von durchgeführten klinischen Studien zur Gewinnung der Zulassung bereitgestellt. In anderen Fällen kann eine derartige Information in direkter Weise entsprechend den Lehren und Richtlinien, die in der vorliegenden Beschreibung enthalten sind, im Lichte der Kenntnis und Erfahrung des Fachmanns erhalten werden. Die Ergebnisse, die erhalten werden, können auch mit Daten von entsprechenden Beurteilungen eines zugelassenen Produkts in den gleichen Tests erhalten werden.
Die oben angegebenen Bereiche für Dosierungsmengen, die auch in dieser Beschreibung an anderer Stelle angegeben sind, gelten für racemische Gemische von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure mit einem chiralen Kohlenstoff. Wie dem Fachmann üblicher Erfahrung, d.h. einem praktizierenden Tierarzt oder einer Person mit einem fortgeschritte nen Grad und Erfahrung in Tiergesundheitsbelangen klar ist, variiert, wenn etwas anderes als ein racemisches Gemisch von Verbindungen von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure beteiligt ist, die therapeutisch wirksame chondroprotektive Menge. Wenn beispielsweise 85 % des Gemischs ein (S)-Enantiomer sind, tendiert dies üblicherweise zur Verringerung der notwendigen Dosierung. Diese Überlegungen basieren auf einer angenommenen gleichen Wirksamkeit und der Tatsache, dass das (S)-Enantiomer signifikant stärker aktiv als das (R)-Enantiomer ist. Jedoch muss der Grad der Differenz zwischen den Aktivitäten der zwei Enantiomere auch andere Unterschiede, insbesondere Unterschiede der Pharmakokinetik zwischen den zwei Enantiomeren, bei der Bestimmung der passenden Dosierung berücksichtigen. Beispielsweise wurde ermittelt, dass ein signifikanter Unterschied der Clearanceraten zwischen den (+)(S)- und (–)(R)-Enantiomeren besteht. Diese hat wiederum eine berechenbare Auswirkung auf die Menge von zu verabreichenden aktiven Verbindungen. Üblicherweise erfolgen derartige Bestimmungen auf einer Fall-zu-Fall-Basis durch den Fachmann, wobei diese jedoch dem Fachmann üblicher Erfahrung geläufig sind, wie auch das Einrichten der Verfahren, wodurch für die Stützung von Rechnungen notwendigen Daten erhalten werden können.
Typische Dosierungsformen und -mengen umfassen

(1) eine intravenöse Verabreichung von Carprofen mit einer Dosisrate von 4,0 mg/kg/Tag, bezogen auf das Körpergewicht, die in die rechte Kopfvene injiziert wird;
(2) eine orale Verabreichung von Carprofen mit einer Dosisrate von 4,0 mg/kg/Tag, bezogen auf das Körpergewicht, als orale Paste, die auf die rückwärtige Zunge gespritzt wird, die 1 h vor der Fütterung gegeben wird; und
(3) eine orale Verabreichung von Carprofen mit einer Dosisrate von 4,0 mg/kg/Tag, bezogen auf das Körpergewicht, als 25-mg-, 75-mg- und 100-mg-Tablettenzubereitungen, die auf die rückwärtige Zungen des zu behandelnden Säugers platziert werden, wobei sie 1 h vor der Fütterung gegeben werden.

Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können auch mit anderen therapeutisch aktiven Bestandteilen, die dem Fachmann mit Erfahrung auf diesem Gebiet ohne weiteres klar sind und die üblicherweise durch die Umstände, unter denen das Therapeutikum der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, bestimmt werden, kombiniert werden. Beispielsweise wird, wenn ein Gelenk gleichzeitig durch Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien, Pilze, Protozoen, Viren, infiziert ist, der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Kombination mit einem oder mehreren antibiotischen, antimykotischen, Antiprotozoen- oder antiviralen Mitteln verabreicht. Der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit NSAIDs sowie Inhibitoren anderer Mediatoren einer Entzündung verabreicht werden. Weitere Klassen derartiger Inhibitoren und Beispiele derselben umfassen beispielsweise H₁-Rezeptorantagonisten, Kinin-B₁- und -B₂-Rezeptorantagonisten, Prostaglandininhibitoren, wie PGD-, PGF-, PGI₂- und PGE-Rezeptorantagonisten; Thromboxan-A₂ (TXA2-)Inhibitoren, 5- und 12-Lipoxygenaseinhibitoren, Leukotrien-LTC₄-, -LTD₄/LTE₄- und -LTB₄-Inhibitoren; PAF-Rezeptorantagonisten; Gold in der Form einer Aurothiogruppe zusammen mit verschiedenen hydrophilen Gruppen; Immunsuppressiva, beispielsweise Cyclosporin, Azathioprin und Methotrexat; entzündungshemmende Glukokortikoide, beispielsweise Dexamethason; antiparasitische Breitspektrumantibiotika, beispielsweise die Avermectine und Milbemycine; Penicillamin; Hydroxychloroquin; Antigichtmittel, beispielsweise Colchicin, Xanthinoxidaseinhibitoren, beispielsweise Allopurinol, und Urikosurika, beispielsweise Probenecid, Sulfinpyrazon und Benzbromaron.
Die Klasse therapeutischer Mittel, die antiparasitische Breitspektrumantibiotika sind, beispielsweise die Avermectine und die Milbemycine, sind besonders gute Kandidaten zur Coverabreichung und andere Arten einer Kombinationstherapie mit den chondroprotektiven Verbindungen der Formel (I), da diese Endo- und Ectoparasitizide auf einer chronischen Basis an Säuger, insbesondere Katzen und Hunde, zur Behandlung schwerer parasitischer Infestationen verabreicht werden. Eine der bedeutendsten von diesen ist Dirofilaria immitis, die ein sehr schädigender und häufig letaler Parasitenbefall von Katzen und Hunden ist. Die Avermectine sind eine Klasse pentacyclischer 16-gliedriger Lactone, die im Hinblick auf die Struktur mit den Milbemy cinen verwandt sind, und sie werden aus Kulturen von Streptomyces avermitilis isoliert. Spezifische Mittel umfassen Avermectin A_1a/b', Avermectin A_2a/b', Avermectin B_1a/b' und Avermectin B_2a/b'. Die Avermectine sind detaillierter in US 4 310 159 , das hier in seiner Gesamtheit als Bezug aufgenommen ist, beschrieben. Die Milbemycine sind eine Familie neuer Macrolidantibiotika mit insektizider und akarizider Aktivität und sie werden aus Kulturen von Streptomyces hygroscopicus isoliert. Die Milbemycine sind detaillierter in US 3 950 360 beschrieben. Eine weitere Familie von Verbindungen, die von dem Umfang der antiparasitischen Breitspektrumantibiotika erfasst werden, ist eine, die im Hinblick auf chemische Struktur und biologische Aktivität mit den Avermectinen und Milbemycinen verwandt ist, die durch die Formel (II) dargestellt werden kann:
Diese Familie von Makroliden ist detaillierter in WO 94/15944 und EP 0677054 beschrieben.
Da die frühen Stadien einer Gelenkknorpelschädigung unter geriatrischen Säugern überwiegend vorhanden sind, ist dem Fachmann klar, dass das chondroprotektive Carprofen auch in Kombination mit therapeutischen Mitteln, die zur Behandlung von Erkrankungszuständen, Syndromen und Symptomen, die auch überwiegend bei älteren Säugern gefunden werden, geplant sind, verabreicht werden kann. Derartige Therapeutika und die Zustände, bei denen sie verwendet werden, umfassen beispielsweise kognitive Therapeutika zur Wirkung gegen Gedächtnisverlust und -beeinträchtigung; und Anti dyskinesie/Antiparkinsonmittel, beispielsweise Selegelin. Eine weitere weitere große Klasse derartiger Therapeutika umfasst Antihypertonika und andere kardiovaskuläre Arzneimittel, die zur Aufhebung von Hypertonie, Myokardischämie einschließlich von Angina, dekompensierter Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt bekannt sind, beispielsweise Diuretika, Vasodilatatoren, wie Hydralazin, β-Adrenorezeptorantagonisten, wie Propranolol, Inhibitoren des Angiotensin II Converting Enzyme (ACE-Inhibitoren), wie Enalapril, die zur Behandlung geriatrischer Säuger mit Mitralinsuffizienz verwendet werden, und Enalapril allein und in Kombination mit neutralen Endopeptidaseinhibitoren, Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten, wie Losartan, Renininhibitoren, Calciumkanalblocker, wie Nifedipin, Sympatholytika, wie Methyldopa, α₂-adrenergen Agonisten, wie Clonidin, α-Adrenorezeptorantagonisten, wie Prazosin, und HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren (Antihypercholesterinämika), wie Lovastatin.
Eine noch weitere Klasse derartiger Therapeutika umfasst Antineoplastika, insbesondere antimitotische Arzneimittel einschließlich der Vincaalkaloide, wie Vinblastin und Vincristin, zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen; Therapeutika zur Behandlung von Niereninsuffizienz; Antifettsuchtarzneimittel zur Behandlung der Probleme eines übermäßigen Gewichts bei Säugern; Antiparasitenmittel zur Behandlung von sowohl Endo- als auch Ectoparasiten bei üblicherweise betroffenen Säugern und Antipruritisarzneimittel zur Behandlung verschiedener Arten von Pruritis bei Säugern.
Weitere Arten von Arzneimitteln, die in Kombination mit den entzündungshemmenden Mitteln der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Wachstumshormon-Sekretagoga; starke Analgetika; lokale und systemische Anästhetika und H₂-Rezeptorantagonisten und andere gastroprotektive Mittel. Dem Fachmann üblicher Erfahrung ist klar, dass einige der obigen Kombinationen von Therapeutika sehr häufig zur Behandlung verschiedener akuter Zustände bei Säugern, beispielsweise bakteriellen Infektionen, die gleichzeitig mit einer degenerativen Gelenkerkrankung auftreten, verwendet werden. Jedoch besteht ein gleiches, falls nicht größeres Interesse an dem Teil derartiger Fachleute bei der Behandlung chronischer Zustände bei Säugern.
Gemäß einem Protokoll, das für diesen Zweck verwendet wird, wird in Betracht gezogen, dass 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure in Kombination mit anderen Medikationen, die auf einer regelmäßigen Programmbasis verwendet werden, zur Behandlung chronischer Zustände, wie Hyperlipidämie, verabreicht wird. Es wird auch in Betracht gezogen, dass eine Verabreichung in Kombinationen eine Zahl unterschiedlicher Formen annehmen kann und dennoch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist. Beispielsweise kann die chondroprotektive Verbindung Carprofen einfach mit einem oder mehreren der anderen Therapeutika, die die geplante Kombination bilden sollen, einfach zu einer herkömmlichen Dosierungsform, wie einer oralen Tablette, formuliert werden, die alle die Kombination bildenden Arzneimittel enthält. Variierende Halbwertszeiten für die unterschiedlichen Arzneimittel können durch die Personen mit Erfahrung bei der Herstellung von Formulierungen durch die Erzeugung von Formen mit gesteuerter Freisetzung der Arzneimittel mit unterschiedlichen Freisetzungszeiten derart, dass eine relativ gleichförmige Dosierung erreicht wird, abgestimmt werden. Ein als die Dosierungsform verwendetes, Medikamente enthaltendes Futter konnte auch gemäß bekannten Prinzipien auf dem Gebiet der Formulierung hergestellt werden, wobei die in der Kombination verwendeten Arzneimittel einfach zusammen im Gemisch in der Futterzusammensetzung vorhanden waren. Die vorliegende Erfindung betrachtet ferner eine Coverabreichung, wobei die Kombination von Arzneimitteln durch die gleichzeitige Verabreichung der in Kombination zu gebenden Arzneimittel erreicht wird. Eine derartige Coverabreichung könnte auch mittels verschiedener Dosierungsformen und Verabreichungswege erfolgen. Die vorliegende Erfindung betrachtet ferner die Verwendung derartiger Kombinationen gemäß unterschiedlicher, jedoch regelmäßiger und kontinuierlicher Dosierungsprogramme, wodurch gewünschte Plasmaspiegel der beteiligten Arzneimittel in dem zu behandelnden Tier aufrechterhalten werden, auch wenn die die Kombination bildenden individuellen Arzneimittel nicht gleichzeitig dem Säuger verabreicht wurden. Alle derartigen Kombinationen sind auf einschlägig bekannte Weise zu planen und zu verabreichen.
Wie oben beschrieben umfasst die Verwendung der vorliegenden Erfindung zwei Basisstufen:

(I) Feststellen des Status einer Katze, eines Hunds oder eines Pferdes, die prospektiv eine derartige Behandlung benötigen; und darauf
(II) zur Prävention der Osteoarthritis Verabreichen einer zur Behandlung therapeutisch wirksamen Menge von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure an den Säuger.

Die verschiedenen Aspekte der Stufe (II) wurden oben bereits detailliert diskutiert. Daher werden nun die Aspekte von Stufe (I) detailliert diskutiert.
Das Feststellen des Status des Säugers, der ein Behandlungskandidat ist, ist notwendig.
Es ist möglich, zu identifizieren, dass der Säugerkandidat entweder sehr wahrscheinlich eine derartige Behandlung in der nächsten Zukunft benötigt oder die Erwartung hierfür besteht. Eine prospektive Notwendigkeit einer Behandlung kann durch die Bestimmung positiver Faktoren, die nach der Erfahrung des Fachmanns direkt zu den frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen führen, festgestellt werden. Beispielsweise kann der Fachmann aufgrund der klinischen Untersuchung des Säugers, insbesondere eines Hundes, feststellen, dass er beginnende Hüftdysplasie hat und diese Folgerung durch radiographischen Beweis bestätigen, woraus gemäß etablierten Messverfahren bestimmt werden kann, dass der Hund innerhalb der nächsten Zeit Hüftdysplasie entwickelt.
Daher kann die Notwendigkeit einer Behandlung durch

(1) positive Ergebnisse aufgrund der klinischen arthroskopischen Untersuchung und Beurteilung der Gelenke des Kandidatensäugers bestimmt werden. Die Diagnose einer beginnenden oder realisierten Hüftdysplasie wurde bereits diskutiert. Andere klinische Symptomologie und Zeichen umfassen die aufgrund einer direkten Untersuchung der Gelenke des Säugerkandidaten erhaltenen. Der Fachmann sollte sich auch bewusst sein, dass
(2) die Durchführung eines invasiven chirurgischen Eingriffs an einem oder mehreren Gelenken des Säugerkandidaten unter den meisten Umständen von sich aus ein ausreichender Grund für die Folgerung ist, dass eine Behandlung benötigt wurde. Dies folgt aus der Tatsache, dass ein invasiver Eingriff an dem Gelenk eines Säugers, insbesondere eines Hundes, unvermeidlich die Fähigkeit des Gelenks, seine gewohnte Belastung so effizient wie vor dem Eingriff zu tragen, verschlechtert. Die erhöhte mechanische Belastung an dem Gelenk führt nach der Erfahrung des Fachmanns direkt zu den frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen. Ein derartiger chirurgischer Eingriff am Gelenk ruft auch eine Effusion von Blut und anderen Flüssigkeiten, die Cytokine und andere Faktoren, die Verursacher einer Entzündung sind, enthalten, hervor, und ermöglicht dadurch deren Migration und Absorption in die festen Gewebe des Gelenks einschließlich des Knorpels und subchondralen Knochens. Der Fachmann erkennt, dass dies auch direkt zu den frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen führen kann. Ferner kann die Notwendigkeit einer Behandlung durch
(3) positive Ergebnisse aufgrund einer Untersuchung von einem oder mehreren Gelenken des Säugers unter Verwendung nichtinvasiver Verfahren, die radiographische und Magnetresonanzbildgebung (MRI) umfassen, bestimmt oder bestätigt werden. Die letztere Technik ist zur Bewertung von Weichteilen besser als die erstere. MRI ist eine Technik zur multiplanaren Körperbildgebung, die eine erhöhte Weichteilkontrastauflösung zeigt. Da MRI Weichteilveränderungen sichtbar machen kann, ist es zur Bildgebung der Pathologie der frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchrondralem Knochen geeignet. Die Notwendigkeit einer Behandlung kann auch durch
(4) positive Ergebnisse eines biochemischen Tests, der an Körperflüssigkeiten und Gelenkgewebe des Säugerkandidaten im Hinblick auf eine oder mehrere der im folgenden angegebenen Substanzen durchgeführt wurde, bestimmt oder bestätigt werden: erhöhtes Interleukin-1-beta (IL-1β), erhöhter Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), erhöhtes Verhältnis von IL-1β zu IL-1-Rezeptorantagonistenprotein (IRAP), erhöhte Expression von p55-TNf-Rezeptoren (p55 TNF-R), erhöhtes Interleukin-6 (IL-6), erhöhter Leukämiehemmfaktor (LIF), un veränderter oder verringerter insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), verringerter transformierender Wachstumsfaktor-beta (TGFβ), unveränderter oder verringerter Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), unveränderter oder verringerter basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF), erhöhtes Keratansulfat, erhöhtes Stromelysin, erhöhtes Verhältnis von Stromelysin zu Gewebeinhibitor von Metalloproteasen (TIMP), erhöhtes Osteocalcin, erhöhte alkalische Phosphatase, erhöhtes cAMP, das auf Hormonreiz reagiert, erhöhter Urokinaseplasminogenaktivator (uPA), erhöhtes Knorpeloligomermatrixprotein und erhöhte Kollagenase.

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Zum weiteren Beleg der Verwendung der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Absätzen spezielle Beschreibungsbeispiele für typische Verfahren angegeben, die bei der Durchführung der Verfahren verwendet werden können. Jedoch sollen die Beispiele nur der Erläuterung dienen und in keinster Weise als eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung, für deren Zweck die vorliegenden Ansprüche angehängt sind, genommen werden.
Beispiel 1
Drei Gruppen skelettmäßig reifer hybrider Säuger, die jeweils 20 bis 25 kg wogen, werden in einer Studie, deren Aufgabe die Feststellung subchondraler Knochenveränderungen, die Marker für die frühen Stadien einer Gelenkknorpeldegeneration bei Säugern sind und die demgemäß zur Identifizierung von Säugern, die passende Kandidaten für eine pharmakologische Intervention sind, verwendet werden können, ist, verwendet.
In Gruppe I wird Osteoarthritis in diesen Säugern (n = 4) unter Verwendung des chirurgischen Verfahrens gemäß der Beschreibung in J-P. Pelletier, J. Martel-Pelletier, R.D. Altman, L. Ghandur-Mnaymneh, D.S. Howell, J. F. Woessner, Jr., "Collagenolytic Activity and Collagen Matrix Breakdown of the Articular Cartilage in the Pond-Nuki Mammal Model of Osteoarthritis", Arthritis Rheum, 26, 1983, 866-874, induziert, wobei die Säuger mit einer intravenösen Injektion von Natriumpentobarbital (25 mg/kg) anästhesiert werden und das vordere Kreuzband des rechten Knies durch eine Stichinzision durchtrennt wird. Nach der Operation werden die Säuger im Käfig gehalten und ad libitum sich bewegen gelassen. Die Tiere erhalten Carprofen, 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure, mit einer Dosis von 2,2 mg/kg bid po 8 Wochen verabreicht, wobei 4 Wochen nach der Operation begonnen wird. Die rechten Knie von nicht operierten Säugern (n = 4) dienen als normale Kontrollen. Die Gruppen II und III (n = 4, jede Gruppe) werden in der gleichen Weise bearbeitet, erhalten jedoch keine Behandlung. Die Säuger in den Gruppen I und II werden durch intravenöse Überdosierung mit Nembutal 12 Wochen nach der Operation getötet, während die Tiere in der Gruppe II auf die gleiche Weise 4 Wochen nach der Operation getötet werden. Normale Säuger werden ebenfalls als Kontrolle verwendet.
Das proximale Ende der Tibia wird wie im folgenden beschrieben entfernt, in einer kalten physiologischen Kochsalzlösung gespült und vor der und während der Dissektion auf Eis gesetzt. Normale Knochenproben werden aus Pfropfenexplantaten von bei einer Dissektion gewonnenen mittleren Tibiaköpfen erhalten. Mittlere Tibiaköpfe werden zur Herstellung von Explantaten und primären Knochenzellkulturen extrahiert; kein marginales kortikales Knochengewebe wird umfasst. Der darüber liegende Knorpel wird zunächst von den Tibiaköpfen entfernt und Pfropfenexplantate werden ausschließlich aus dem Mittelbereich des mittleren Kopfes herausseziert. Das trabekuläre Knochengewebe wird dann von der subchondralen Knochenplatte wegseziert. Alle Manipulationen werden unter einem Vergrößerungsmikroskop durchgeführt, um die vollständige Entfernung von Knorpel und Trabekelknochen sicherzustellen. Die subchondrale Knochenplatte der Tibiakopfproben wird dann in zwei Portionen geteilt. Die subchondralen Knochenproben der normalen Säuger wurden als konsistent dünner als die der Osteoarthritissäuger beobachtet, wobei bei diesen auch beobachtet wurde, dass sie offensichtlich Sklerose aufweisen.
Die erste Gruppe von Proben wird zur Herstellung von Knochenproben ex vivo mit einem Nassgewicht von 100–200 mg zur Explantatkultur verwendet. Explantate werden dreimal durch Verwirbeln von Proben in serumfreiem BGJ-Medium (Sigma, St.Louis, MO) gewaschen und in dem gleichen Medium bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % O₂/ 95 % CO₂ kultiviert. Konditionierte Medien werden nach 5-tägiger Kultur unter diesen Bedingungen gewonnen und bei –80 °C vor einem Test aufbewahrt.
Der zweite Teil der Proben wird zur Herstellung von Primärzellkulturen gemäß der Beschreibung in D. Lajeunesse, L. Busque, P. Ménard, M.G. Brunette, Y. Bonny, "Demonstration of an Osteoblast Defect in Two Cases of Human Malignant Osteoporosis: Correction of the Phenotype after Bone Marrow Transplant", J. Clin Invest, 98, 1996, 1835-1842, mit geringen Modifikationen verwendet. Knochenproben werden in kleine Stücke (2 mm²) geschnitten, bevor der nacheinander erfolgenden Verdau in Gegenwart von 1 mg/ml Typ-I-Kollagenase (Sigma) in Ham's F-12/Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma) ohne Serum, bei 37 °C während 20, 20 und 240 min erfolgt. Diese Behandlung entfernt sowohl haftende als auch verbleibende Knochenmarkzellen von den kortikalen Knochenstücken.
Nach Waschen mit dem gleichen Medium werden die verdauten Knochenstücke in BGJ-Medium, das 20 % fetales Rinderserum enthält (FBS; Wisent, St. Bruno, Quebec, Kanada) kultiviert. Dieses Medium wird alle 2 Tage ersetzt, bis Zellen in den Petrischalen beobachtet werden, wonach dann das Kulturmedium durch frisches Medium, das 10 % FBS enthält, ersetzt wird. Bei Konfluenz werden Zellen einmal mit 25 000 Zellen/cm² in 24-Vertiefungen-Platten (Falcon, Lincoln Park, NJ) überführt und 5 Tage vor dem Test gezüchtet. Unter diesen Kulturbedingungen erhaltene Zellen zeigen einen osteoblastenähnlichen Zellphänotyp, was in dem oben genannten Artikel aus der wissenschaftlichen Literatur durch Lajeunesse et al. festgestellt wurde. Konditionierung erfolgt während der letzten zwei Kulturtage in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 nM 1,25(OH)₂D₃ (1,25-Dihydroxy-Vitamin D) für maximale Stimulation in Ham's F-12/DMEM, das 2 durch Aktivkohle abgestreiftes FBS enthält, wobei eine Maximalstimulation von alkalischer Phosphataseaktivität und Osteocalcinsekretion erhalten wird, was in dem oben genannten Artikel aus der wissenschaftlichen Literatur von Lajeunesse et al. angegeben wird. Das Medium wird am Ende der Inkubation gewonnen und dann bei –80 °C vor dem Test eingefroren. Zellen werden dann zweimal mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4, gewaschen und in alkalische-Phosphatasepuffer (100 mM Glycin, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, 1 % Triton X-100, pH-Wert 10,5) 60 min unter Rühren bei 4 °C solubilisiert.
Zur cAMP-Bestimmung werden Zellen 15 min in Gegenwart eines Phosphodiesteraseinhibitors (1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, Sigma) in Ham's F-12/DMEM, das 0,5 % Rinderserumalbumin (fettsäurefreie Fraktion von V; Sigma) enthält, vorinkubiert. Am Ende der Vorinkubation werden die Zellen 5 min in dem gleichen Medium, das entweder 100 nM humanes Parathormonfragment 1-34 (PTH; Penninsula, Belmont, CA), 5 nM Prostaglandin E₂ (PGE₂; Sigma), 1 μM Forskolin (Sigma) oder Vehikel enthält, inkubiert und die Reaktion wird mit 3%iger Perchlorsäure (Endkonzentration) gestoppt. Cyclische AMP-Spiegel werden dann durch Radioimmunoassay (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) gemäß der Beschreibung in D. Lajeunesse, G.M. Kiebzak, C. Frondoza, B. Sacktor, "Regulation of Osteocalcin Secretion by Human Primary Bone Cells and by the Human Osteosarcoma Cell Line MG-63, Bone, 14, 1991, 237-250, beurteilt.
Die Osteocalcinfreisetzung wird in konditioniertem Ham's F-12/DMEM (1:1), das für die letzten 2 Tage der Kultur Osteoblasten-ähnlicher Zellen gemäß der Beschreibung in dem oben genannten Artikel aus der wissenschaftlichen Literatur von Lajeunesse et al. hergestellt wurde, das 2 % Aktivkohle behandeltes FBS enthielt, und in Gegenwart von 50 nM 1,25(OH)₂D₃ oder Vehikel (0,1 % Ethanol) ermittelt. Naszierendes Osteocalcin wird unter Verwendung eines spezifischen Enzymimmunoassays (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) bestimmt. Die Nachweisgrenze dieses Tests beträgt 0,5 ng/ml, und 2 % Aktivkohle-behandeltes FBS enthält < 01 ng/ml Osteocalcin. Die Aktivität zellulärer alkalischer Phosphatase wird an zur Osteocalcinfreisetzung verwendeten Zellen als die Freisetzung von p-Nitrophenol, das ausgehend von p-Nitrophenylphosphat (12,5 mM Endkonzentration) bei 37 °C während 30 min nach Solubilisieren der Zellen in alkalische-Phosphatasepuffer, der oben beschrieben ist, hydrolysiert wurde, bestimmt. Alkalische Phosphatase wird unmittelbar an Aliquots bestimmt. Die Proteinbestimmung wird durch die Bicinchoninsäuremethode gemäß der Beschreibung in P.K. Smith, R.I. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D. Provenzano et al., "Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid", Anal Biochem, 150, 1985, 76-85, durchgeführt.
Zur Beurteilung von uPA, PAI-1 und IGF-1 wird konditioniertes Medium von subchondralen Knochenexplantaten (100–200 mg Nassgewicht pro getestetes Explantat, 5 Tage Konditionierung) und von konfluenten Osteoblasten-ähnlichen Zellen, die mit Ham's F-12/DMEM ohne PBS, jedoch mit einem Gehalt von 1 % Insulin-Transferrin-Selen-Gemisch (ITS, Sigma) während der letzten zwei Kulturtage inkubiert wurden, verwendet. Zunächst werden uPA-Spiegel durch spezifischen enzymgekoppelten Immunsorptionstest (ELISA; American Diagnostica, Greenwich, CT) bestimmt. Dann wird das Verfahren gemäß der Beschreibung in P. Leprince, B. Rogister, G.A. Moonen, "Colorimetric Assay for the Simultaneous Measurement of Plasminogen Activators and Plasminogen Activator Inhibitors in Serum-Free Conditioned Media from Cultured Cells", Anal Biochem. 177, 1989, 341-346, zur Bestimmung der Aktivität von uPA über die Hydrolyse des spezifischen Substrats DL-Val-Leu-Arg-p-nitroanilid (Sigma), die p-Nitroanilin freisetzt, das bei 405 nm detektiert werden kann, verwendet. PAI-1-Spiegel werden durch ELISA unter Verwendung von Materialien, die von American Diagnostica (Greenwich, CT) erhältlich sind, bestimmt. IGF-1 wird unter Verwendung eines ELISA hoher Empfindlichkeit (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX), der keine Kreuzreaktion mit Insulin eingeht, bestimmt. Untersuchungen mit interner Kontrolle werden mit dem Medium allein, das 1 % IST enthält, durchgeführt und alle erhaltenen Werte sollten unterhalb der Nachweisgrenze sein. Für das konditionierte Medium von Knochenexplantaten werden Proben direkt verarbeitet, während für Zellkulturproben 3 oder 4 Überstände gepoolt, lyophilisiert und dann in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4 rekonstituiert werden. Proben werden dann nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in S. Mohan, C.M. Bautista, S.J. Herring, T.A. Linkhart, D.J. Baylink, "Development of Valid Methods to Measure Insulin-like Growth Factors-I and -II in Bone Cell-Conditioned Medium", Endocrinology, 126, 1990, 2534-42, behandelt.
Die Ergebnisse der obigen Bewertungen bestätigen deren Detektierbarkeit und Fähigkeit, die Existenz der frühen Stadien einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen bei Säugern festzustellen.

Claims

Verwendung von 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Osteoarthritis bei Katzen, Hunden und Pferden, die in der Zukunft an derartigen Schädigungen leiden können.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die therapeutisch wirksame Menge eine Dosierung mit einer Rate von 2,0 mg/kg/Tag bis 4,0 mg/kg/Tag liefert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung feste perorale Dosierungsformen umfasst, die aus der Gruppe von oralen Tabletten, Kapseln, Caplets und mehrteiligen Systemen mit verzögerter Freisetzung, die die Freisetzung und Absorption im Magen verhindern, um eine vom Magen des Säugers distale Abgabe zu ermöglichen, und oralen Tabletten, Kapseln und Mikroteilchen mit Langzeitfreisetzung, die eine systemische Abgabe des Wirkstoffs in kontrollierter Weise bis zu einem Zeitraum von 24 h ergeben, ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich Kombinationen von Verbindungen umfasst, die 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure zusammen mit einem oder mehreren Mitgliedern, die aus der im wesentlichen aus polysulfatiertem Glykosaminoglykan (PSGAG), Glucosamin, Chondroitinsulfat (CS), Hyaluronsäure (HA), Pentosanpolysulfat (PPS), Doxycyclin und Minocyclin bestehenden Gruppe ausgewählt sind, umfassen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich Kombinationen von einem oder mehreren anderen therapeutisch aktiven Mitteln zusammen mit 6-Chlor-α-methyl-9H-carbazol-2-essigsäure umfasst, die umfassen: (A) wenn das eine oder mehrere Gelenke gleichzeitig durch Mikroorganismen, die Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren umfassen, schwer infiziert sind, die chondroprotektive Verbindung in Kombination mit einem oder mehreren antibiotischen, antimykotischen, Antiprotozolen- oder antiviralen Therapeutika; (B) in Kombination mit einem oder mehreren Mitgliedern, die aus der Gruppe von im wesentlichen H₁-Rezeptorantagonisten; Kinin-B₁- und -B₂-Rezeptorantagonisten; Leukotrien-LTC₄-, -LTD₄/LTE₄- und -LTB₄-Inhibitoren; PAF-Rezeptorantagonisten; Gold in der Form einer Aurothiogruppe zusammen mit hydrophilen Gruppen; Immunsuppressiva, die aus Cyclosporin, Azathioprin und Methotrexat ausgewählt sind; entzündungshemmende Glucocorticoiden, beispielsweise Dexamethason; antiparasitischen Breitspektrumantibiotika, beispielsweise den Avermectinen und Milbemycinen; Penicillamin; Hydroxychloroquin; dem Antigichtmittel Colchicin; dem Xanthinoxidaseinhibitor Allopurinol und Uricosurica, die aus Probenecid, Sulfinpyrazon und Benzbromaron ausgewählt sind, ausgewählt sind; und (C) in Kombination mit Therapeutika, die zur Behandlung von Erkrankungszuständen, Syndromen und Symptomen, die bei älteren Säugern gefunden werden, vorgesehen sind, die ein oder mehrere Mitglieder umfassen, die aus der Gruppe von im wesentlichen kognitiven Therapeutika, die gegen Gedächtnisverlust und -schwäche wirken sollen; Antidyskinesie/Antiparkinsonmitteln, beispielsweise Selegelin; kardiovaskulären Arzneimitteln, die die Folgen von Atherosklerose, die Hypertonie, Myokardischämie einschließlich Angina, dekompensierte Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt umfassen, aufheben sol len, die aus Diuretika, Vasodilatatoren, β-Adrenorezeptorantagonisten, Inhibitoren des Angiotensin II Converting Enzyme (ACE-Inhibitoren), die zur Behandlung geriatrischer Säuger mit Mitralinsuffizienz verwendet werden, Enalapril allein und in Kombination mit neutralen Endopeptidaseinhibitoren, Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten, Renininhibitoren, Calciumkanalblockern, Sympatholytika, α₂-adrenergen Agonisten, α-Adrenorezeptorantagonisten und HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren (Antihypercholesterinämika) ausgewählt sind; Antineoplastika; antimitotischen Arzneimitteln, die Vinblastin und Vincristin umfassen; Wachstumshormon-Sekretagoga; starken Analgetika; lokalen und systemischen Anästhetika und H₂-Rezeptorantagonisten und anderen gastroprotektiven Mitteln ausgewählt sind.