DE69931763T2

DE69931763T2 - Nachweis von produkten von apoptosis

Info

Publication number: DE69931763T2
Application number: DE69931763T
Authority: DE
Inventors: Stefan Holdenrieder; Martin Busch; Heinz Bodenmüller; Georg Fertig; Andreas Schalhorn; Petra Stieber
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: DE19811739A1; DE69931763D1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, bei dem die Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten bestimmt wird, um die Wirksamkeit der Tumortherapie zu ermitteln. Des weiteren ist die Verwendung eines Verfahrens zur Bestimmung von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten zur Bestimmung der Wirksamkeit der Tumortherapie Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Eine eukaryontische Zelle kann auf zwei grundsätzlich unterschiedlichen Wegen absterben. Ein Weg ist die Nekrose, ein Absterben der Zelle als Folge einer Schädigung, z. B. aufgrund einer unzureichenden Blutzufuhr und damit Unterversorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen, oder als Folge einer Vergiftung oder physikalischen Schädigung (mechanische Verletzung, Frost oder Hitze). Der andere Weg, der sogenannte programmierte Zelltod, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung und Funktionsfähigkeit von Geweben, Organen und Organismen als Ganzes (J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). Die auf diese Weise abgestorbenen Zellen weisen im Zytoplasma mit Histonen assoziierte DNA-Fragmente als Mono- und Oligonukleosome auf. Ein solches Erscheinungsbild wird auch bei einem induzierten Zelltod beobachtet, wie er z. B. durch ionisierende Strahlen (Yamada et al., Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65) oder bestimmte monoklonale Antikörper, wie z. B. anti-Fas (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169 (1989), 1747-1756) oder anti-APO-1 (Trauth et al., Science 245 (1989), 301-304) ausgelöst wird. Auch zytotoxische T-Zellen und Natural Killer-Zellen bewirken einen solchen induzierten Zelltod mit dem beschriebenen Erscheinungsbild (Sanderson, Biol. Rev. 56 (1981), 153-197, S. Curnow et al., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993), 149-155 und Berke, Immunol. Today 12 (1991), 396-399). Sie bewirken jedoch auch eine erhöhte Permeabilität der Plasmamembran, wie sie bei einer Nekrose beobachtet wird (Krähenbühl et. al., Immunol. Today 12 (1991), 399-402). Die beschriebene Art des programmierten oder induzierten Zelltods wird als Apoptose (Wyllie et al., Int. Rev. of Cytol. 68 (1980), 251-301) bezeichnet. Sie ist charakterisiert durch bläschenförmige Ausstülpungen der Plasmamembran, Kondensation des Zytoplasmas und Aktivierung von endogenen Endonukleasen. Im Gegensatz zur Nekrose handelt es sich bei der Apoptose also um einen aktiven Prozeß der eukaryontischen Zelle. Er wird daher auch nicht bei einem Abtöten der Zellen durch Erhitzen, Einfrieren und Auftauen oder Lyse mit einem lytisch wirkenden Antikörper bewirkt (R. Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983), 6361-6365). Die bei der Apoptose aktivierte calcium- und magnesiumabhängige Endonuklease spaltet den DNA-Doppelstrang in den leicht zugänglichen Linkerregionen zwischen den Nukleosomen in Mono- und Oligonukleosomen. Die DNA in den Nukleosomen hingegen ist mit den Core-Histonen H2A, H2B, H3 und H4 eng assoziiert und deshalb geschützt vor der Spaltung durch die Endonuklease (Burgoyne et al., Biochem. J. 143 (1974), 67 und Stach et al., J. Neurochem. 33 (1979), 257). Daher ist nach der Extraktion der DNA und Auftrennung im Agarosegel die für apoptotische Zellen typische "DNA-Leiter" zu erkennen, ein Muster von DNA-Fragmenten mit einer Länge von ca. 180 Basenpaaren bzw. einem Vielfachen davon (Wyllie, Nature 284 (1980), 55-556 und J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). Die Plasmamembran der Zellen bleibt in diesem frühen Stadium der Apoptose intakt. Es kommt zur Anreicherung der Mono- und Oligonukleosomen im Zytoplasma der sterbenden Zelle (Duke et al., Lymphokine Research 5 (1986), 289-299).
Zur Apoptose kommt es während der embryonischen Periode und während der Entwicklung des Immun- und Nervensystems zum Zweck der Homeostase zum Regulieren der Anzahl von Zellen (beispielsweise in der Darmschleimhaut) und um die Funktion von Zellen im Organismus sicherzustellen; sie tritt auch bei pathologischen Prozessen wie entzündlichen Reaktionen, als Resultat von ischämischen Läsionen (z. B. bei einem Hirntrauma (Schlaganfall), Herzinfarkt, Lungenembolie), bei Autoimmunkrankheiten (wie systemischem Lupus erythematodes (SLE)), als Abwehrreaktion nach Knochenmarktransplantationen und Transplantationen anderer Organe (Hostversus-Graft, Graft-versus-Host-Reaktion) auf (Darzynkiewicz, Cytometry, 1997, 27: 1-20, Kerr, Cancer 1994, 73: 2013-2025, Kornbluth, Immun letters 1994, 43: 125-132, K. Matsushita, Neuroscience 83 (1998), 439-448 und R. Majno and I. Joris, Am. J. Path 146 (1995), 3-15).
Apoptotische Prozesse können bei Patienten mit malignen und benignen Tumoren beobachtet werden (Leon, Cancer Res. 37 (1977), 646-650; Shapiro, Cancer 51 (1983), 2116-2120 und Fournie, Cancer Letters 91 (1995), 221-227). So wird bei malignen Tumoren oft ein vermehrter Zellumsatz beobachtet, d. h. die Zellproliferationsrate wie auch die Zelltodrate ist erhöht (Kerr, Cancer 73 (1994), 2013-2025 und Cotter, Anticancer Research 10 (1990), 1153-1160). Letztere ist Ausdruck massiven apoptotischen Zelluntergangs. Geregelter, programmierter Abbau von DNA, Zellkern und Organellen, Verpackung des Zellinhaltes in "apoptotic bodies", sowie Phagozytose durch Makrophagen und Nachbarzellen sorgen für vollständiges Recycling ohne Rückstände (Darzynkiewicz, Cytometry 27 (1997), 1-20, Kerr, Cancer 73 (1994), 2013-2025 und Cotter, Anticancer Research 10 (1990), 1153-1160). Ist dieses Entsorgungssystem überlastet, gelangen zelluläre Bestandteile unter anderem auch in den Blutkreislauf (Emlen, J. Immunol 152 (1994), 3685-3692, Kornbluth, Immun Letters 13 (1994), 125-132, Emlen, J. Immunol. 148 (1992), 3042 und Franek, FEBS Letters 284 (1991), 285-287). So wurden in Serum und Plasma von Patienten mit malignen Tumoren höhere DNA-Konzentrationen gefunden (Leon, Cancer Res. 37 (1977), 646-650 and Shapiro, Cancer 51 (1983), 2116-2120 und Fournie, Cancer Letters 91 (1995), 221-227), wobei die DNA in der Zirkulation vornehmlich gebunden an Histone in Form von Mono- und Oligonukleosomen vorliegt (Rumore, J. Clin. Invest 86 (1990), 69-74 und Burlingame, J. Immunol 156 (1996), 4783-4788).
Die absolute Menge an apoptotischen Produkten, beispielsweise an Nukleosomen, im Serum kann korrelliert werden mit dem Ausmaß der malignen Erkrankung. Fortgeschrittene Erkrankungen weisen z. T. eine erheblich höhere Konzentration von Serum-Nukleosomen auf. Bekannt ist des weiteren, daß durch Radiotherapie, Hyperthermie, Hormonablation und durch verschiedene zytostatische Medikamente Apoptose induziert wird (Kerr, Cancer 73 (1994), 2013-2025 und Sakakura, Br. J. Cancer 77 (1998), 159-166).
In der WO93/09437 wird ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von löslichen nuklearen Matrixproteinen in Körperflüssigkeiten und extrazellulären Medien beschrieben. Dieses Verfahren wird als geeignet für die Kontrolle der Lebensfähigkeit von Zellen und Gewebe, zur Untersuchung des Fortschreitens einer Krankheit oder ihrer Behandlung und zur Untersuchung der Zytotoxizität unbekannter Verbindungen beschrieben.
In der WO96/40985 wird ein Verfahren zur quantitativen Messung der Apoptose durch Bestimmung der E(γ-Glutamyl)lysinisodipeptidkonzentration offenbart. Die oben erwähnten Verfahren sind nicht besonders als schnelle Marker für die Wirksamkeit der Therapie von Patienten, bei denen die Apoptose als Folge einer Krankheit oder Therapie induziert ist, geeignet. Außerdem sind die beschriebenen Verfahren für die tägliche Anwendung in der Klinik unzweckmäßig.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Veränderung der Konzentration an apoptotischen Produkten in von Patienten entnommenen Proben mit der Effizienz der Therapie korreliert, wobei es sich hierbei um Patienten handelt, bei denen die Apoptose als Folge von Krankheit oder Therapie induziert ist. Hierbei handelt es sich um Tumorpatienten bzw. Patienten, die einer chemotherapeutischen bzw. einer radiotherapeutischen Behandlung unterzogen wurden, oder Patienten mit akuten entzündlichen Prozessen während einer Behandlung mit Antibiotika. Dies bedeutet, daß sich der Verlauf der Therapie durch Messung der Konzentration von apoptotischen Produkten in von den zuvor erwähnten Patienten entnommenen Proben kontrollieren läßt.
Insbesondere wurde gefunden, daß sich die Konzentration an apoptotischen Produkten im Serum von Tumorpatienten während einer Radiotherapie oder Chemotherapie als Marker für die Wirksamkeit der Behandlung verwenden läßt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Patienten, bei denen aufgrund einer Krankheit oder Therapie die Apoptose induziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Serumproben durch Inhibieren von Ca²⁺- und Mg²⁺-abhängigen Endonukleasen und Endonukleasen mit einem sauren pH-Wert-Optimum mit EDTA stabilisiert sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleosomen in von Patienten entnommenen Proben, wobei es sich bei den Patienten um Tumorpatienten oder Patienten, die sich einer chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlung unterziehen oder Patienten mit akuten entzündlichen Prozessen während einer Behandlung mit Antibiotika handelt, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Nukleosomen in den geeigneten Patientenproben mit der Wirksamkeit der Therapie korreliert wird und somit als Follow-up für die Therapie dient.
Geeignete Patientenproben im Sinne der vorliegenden Erfindung sind: Serum, Plasma, Liquor, Sputum (Bronchialsekret), Asziten (Peritonealflüssigkeit), das Material von der Punktur der Pleurahöhle, Synovia (Gelenkschmiere) und Urin. Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man vorzugsweise Serumproben, insbesondere bei der Bestimmung der Wirksamkeit einer Tumortherapie.
Die Wirksamkeit einer Tumortherapie läßt sich anhand der Remissionsrate auf der Basis von bildgebenden Verfahren (Röntgenstrahlen, Computertomographie) bestimmen. Definitionsgemäß ist eine "vollständige Remission" als das vollständige Verschwinden eines Tumors für wenigstens acht Wochen zu verstehen, und "teilweise Remission" bedeutet eine Regression der Tumormanifestationen um mehr als 50% hinsichtlich ihres Volumens; "keine Veränderung" steht für den Zustand zwischen einer 50%igen Abnahme und einer 25%igen Zunahme der Tumormasse; "Progression" bezeichnet eine Progression von mehr als 25% (UICC-Kriterium).
Die Patientenproben, beispielsweise Serumproben, werden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bestimmt.
Apoptotische Produkte, deren Konzentration sich messen läßt, sind beispielsweise Nukleosomen oder Produkte von Caspasen (z. B. Fragmente von Zytokeratinen), APO-I (fas), APO-2, APO-3, Bcl-2, blk, Caspasen, fas-Rezeptorfragmente, fos, FLICE-Enzyme, mdm-2, TNF-α, TNF-Rezeptorfragmente), es kommen jedoch auch andere am apoptotischen Prozeß beteiligte Substanzen als Analyt in Betracht.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von apaptotischen Produkten, insbesondere Nukleosomen, in geeigneten Patientenproben von Tumorpatienten, bei denen die Wirksamkeit der Therapie mit der Konzentration der apoptotischen Produkte in diesen Patientenproben, insbesondere der Konzentration von Nukleosomen, korreliert wird.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten, bei dem man

a) das Serum eines Tumorpatienten mit einem Anti-Histon-Antikörper und mit einem Anti-DNA-Antikörper inkubiert, wobei einer der Antikörper vor, während oder nach dieser Inkubation an eine Festphase gebunden wird und es sich bei dem anderen Antikörper um einen markierten Antikörper handelt,
b) die feste und die flüssige Phase voneinander trennt und
c) den Marker in einer der beiden Phasen zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten bestimmt. Beispielsweise eignet sich für die Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten der kommerziell erhältliche Cell Death Detection^Plus-ELISA der Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland.

Bei einer Anwendung in flüssigen Medien werden zur quantitativen Bestimmung der Konzentration an Nukleosomen einige Abänderungen vorgenommen:
Unter anderem verwendet man eine Standardkurve mit hochapoptotischem Material anstelle eines auf eine negative Kontrolle bezogenen Konzentrationsfaktors (KF) als Basis für die Interpretation: Das Standardmaterial erhält man beispielsweise durch Inkubation von Vollblut von mehreren (gesunden) Blutspendern.
Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines Verfahrens zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Serumproben von Tumorpatienten zur Bestimmung der Wirksamkeit der Tumortherapie. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Cell Death Detection^Plus-ELISA-Kits von Boehringer Mannheim zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Blutproben von Tumorpatienten.
Insbesondere wurde die Nukleosomkonzentration im Serum im Verlauf einer radiotherapeutischen oder chemotherapeutischen Behandlung von Patienten mit einer malignen Tumorerkrankung beobachtet und mit dem klinischen Verlauf und Tumormarkern korreliert. So wurde beispielsweise die Nukleosomkonzentration im Serum vor der Therapie und zu bestimmten Zeitpunkten während und nach dem Ende der jeweiligen Therapie bestimmt. Es traten sehr rasch nach Beginn der Therapie unterschiedlich stark erhöhte Konzentrationen von Nukleosomen im Serum auf, die im Therapieverlauf beobachtet wurden und insbesondere bei der Bestrahlung eine Therapieeffizienz frühzeitig anzuzeigen scheinen.
Das Maximum des Auftretens von Apoptose während der Chemotherapie ist etwa 24 bis 48 Stunden nach dem Beginn der Verabreichung von Arzneimitteln zu erwarten, je nach den gewählten zytostatischen Mitteln und der Dosierung (Meyn, Cancer Chemother. Pharmakol. 33 (1994), 410-414), und Nukleosomen treten mit einer leichten zeitlichen Verzögerung bezogen auf die Apoptose im Blutkreislauf auf.
Die Therapie wurde in Zyklen mit einer Länge, die je nach Protokoll zwischen 1 und 5 Tagen lag, und die durch Pausen von mehreren Wochen (gewöhnlich 3 bis 4 Wochen) unterbrochen waren, durchgeführt. Zur Bestimmung der Kinetik der Nukleosomkonzentration im Serum wurden Blutproben beispielsweise vor Beginn des ersten Zyklus, am zweiten und am vierten Tag des Zyklus ent nommen, jeweils vor der Verabreichung des zytostatischen Mittels. Diese Vorgehensweise wurde bei jedem neuen Zyklus wiederholt. Der Ausgangswert vor Beginn der Therapie, das Ansteigen der Konzentration der Nukleosomen im Serum, der während der Therapie erreichte Maximalwert, die Abnahme der Nukleosomkonzentration und der Maximalwert zwischen den Zyklen sowie die Kinetik der basalen Nukleosomkonzentrationen, die jeweils vor Beginn eines neuen Zyklus bestimmt wurden, wurden mit dem klinischen Verlauf korreliert.
Bei vielen Patienten kam es nach drei bis vier Tagen zu einer Zunahme bei der Nukleosomkonzentration, und anschließend zu einer langsamen Abnahme. Wurde der Zyklus wiederholt, so fand man wiederum eine Zunahme, die jedoch in vielen Fällen weniger ausgeprägt war. Zwischen dem klinischen Verlauf und der Kinetik der basalen Nukleosomkonzentration, die vor jedem neuen Zyklus bestimmt wurde, gab es eine Korrelation. Bei Patienten mit einer Regression der Tumorkrankheit kam es meistens zu einer Abnahme der basalen Nukleosomkonzentration. Eine Zunahme der basalen Nukleosomkonzentration wurde hauptsächlich bei Patienten mit einer Progression der Krankheit beobachtet (siehe Beispiel).
Während einer Strahlentherapie kann mit einem maximalen Auftreten der Apoptose etwa vier Stunden nach Beginn der Behandlung gerechnet werden, worauf sich eine langsame Abnahme der Apoptosehäufigkeit anschließt (Mirkovic, Radiother. Oncol. 33 (1994), 11-16); die Freisetzung von Nukleosomen in den Blutkreislauf ist nach einer kurzen Latenzzeit zu erwarten.
Die Behandlung erfolgt täglich, fünf Tage pro Woche, über einen Zeitraum von vier bis sechs Wochen, gemäß den entsprechenden Richtlinien für Tumorkrankheiten. Blutproben wurden zum Beispiel vor der ersten Fraktion, drei Stunden, sechs Stunden, einen Tag (d. h. vor der zweiten Fraktion), vier Tage, sieben Tage und wöchent lich nach Beginn der Behandlung entnommen. Der Anfangswert vor Beginn der Behandlung, die Zunahme bei der Konzentration der Nukleosomen im Serum, der während der Behandlung erzielte Maximalwert, die Verzögerung des Absinkens der Nukleosomkonzentration und der während oder zum Ende der Behandlung erreichte Minimalwert wurden mit dem klinischen Verlauf korreliert.
Bei den meisten Patienten kam es bereits sechs bis 24 Stunden nach der ersten Strahlungsfraktion zu einer sehr raschen Zunahme bei der Nukleosomkonzentration in unterschiedlichem Ausmaß, was von dem Tumortyp und dem prätherapeutischen Ausgangswert abhängt. Weiterhin nahm die Nukleosomkonzentration nach Latenzzeiten verschiedener Länge auf Minimalwerte unterschiedlicher Größen ab, wobei eine frühzeitige Abnahme und niedrige Minimalkonzentrationswerte mit einer Regression des Tumors korreliert werden können (siehe Beispiel).
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, bei dem die Nukleosomkonzentration im Serum oder in anderen Patientenproben mit der Reaktion von Patienten, die sich einer hydrothermalen Behandlung unterziehen, korreliert wird, oder bei dem die Nukleosomkonzentration im Serum oder anderen Patientenproben mit den Abwehrreaktionen des Immunsystems bei Patienten, die sich einer Knochenmarktransplantation unterzogen haben, korreliert wird; bei beiden Behandlungen würde man eine massive Induktion des Absterbens von Zellen erwarten. Auch ist es bei systemischen Tumorkrankheiten und vor allem den verschiedenen Formen von Leukämie und Lymphomen möglich, durch die Bestimmung der Nukleosomkonzentration im Serum frühzeitige und verläßliche Informationen zur Wirksamkeit der Therapie und zur Einschätzung der Prognose zu erhalten.
Weiterhin ermöglicht die Bestimmung von Nukleosomen im Serum von Patienten nach einem akuten ischämischen Ereignis wie nach Herzinfarkt oder Hirninfarkt ein frühzeitiges Abschätzen des Ausmaßes der Schädigung. Der Test kann weiterhin zum Follow-up und zur Einschätzung der Prognose angewendet werden. Selbst bei Patienten mit akuten entzündlichen Prozessen oder mit Autoimmunkrankheiten – vor allem bei SLE, einer Krankheit, bei der das Auftreten von Nukleosomen und Anti-Nukleosom-Antikörpern im Serum von pathologischer Bedeutung ist – lassen sich die Intensität und die Kinetik des pathologischen Prozesses mit diesem Parameter nachweisen.
Durch die Bestimmung der Nukleosomkonzentration in anderen Körperflüssigkeiten läßt sich das Ausmaß und das Fortschreiten lokaler Prozesse untersuchen: beispielsweise in der zerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten mit Hirntumoren, mit entzündlichen Krankheiten, mit Hirnblutungen, mit degenerativen Krankheiten, nach Hirntraumen und nach zerebralem ischämischen Insult (Schlaganfall).
Bei Asziten ist eine frühe diagnostische bzw. prognostische Information vorstellbar im Fall einer peritonealen Dissemination eines malignen Tumors und im Material einer Punktur der Pleurahöhle, im Fall einer malignen pleuralen Effusion.
Darüber hinaus könnte ein frühzeitiger Nachweis im Urin bei einem tumorösen oder entzündlichen Prozeß in der Niere und in den verbleibenden Harnwegen sowie im Sputum (der Bronchialsekretion) bei malignen Vorgängen in der Lunge möglich sein.
Beispiel 1: Cell Death Detection^Plus-ELISA
Testprinzip
Der Cell Death Detection^Plus-ELISA (Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1 774 425) basiert auf dem quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassay-Prinzip. Es werden zwei monoklonale Maus-Antikörper, die gegen DNA und Histone gerichtet sind, verwandt. Der Test kann mit zytoplasmatischen Lysaten, Kulturüberständen, Plasma, Serum und anderen Körperflüssigkeiten durchgeführt werden und erlaubt einen spezifischen Nachweis von Mononukleosomen und Oligonukleosomen. Die hier angeführte Beschreibung gilt für Messungen in flüssigen Medien:
Testverfahren
Je 20 μl des zu testenden Materials werden in eine Vertiefung einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Es werden 80 μl eines Immunoreagenz, bestehend aus biotinylierten Anti-Histon-Antikörpern, Peroxidase-markierten Anti-DNA-Antikörpern und Inkubationspuffer (1% BSA, 0,5% Tween, 1 mM EDTA in PBS), zugegeben, mit einer Adhäsivfolie bedeckt und für zwei Stunden auf einem MTP-Rüttler (500 U/min) inkubiert. Während dieser Inkubationszeit reagiert der Anti-Histon-Antikörper mit der Histonkomponente der Nukleosomen und fixiert den Komplex mittels Biotin an die mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte. Außerdem bindet der Anti-DNA-Antikörper an die DNA-Komponente der Nukleosomen. Bei diesem Verfahren wird sowohl ds- als auch ss-DNA erkannt. Nach Entfernen der noch ungebundenen Antikörper durch dreimaliges Waschen mit jeweils 300-400 μl Inkubationspuffer werden die fixierten Komplexe mit 100 μl ABTS (2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolinsulfonat) inkubiert, die MTP mit einer Adhäsivfolie verschlossen und bei 250 U/min gerüttelt. Das Substrat reagiert mit der Peroxidase-Markierung der Anti-DNA-Antikörper und bewirkt einen zu diesen Antikörpern proportionalen Farbumschlag. Nach einer entsprechenden Zeit, in der sich die Farbe entwickeln kann, wird sie photometrisch bei d = 405 nm gegen die Substratlösung als Leerwert (Referenzwellenlänge d = 492 nm) quantifiziert .
Beispiel 2: Modifikation und Standardisierung
Standardmaterial
Anstelle eines Anreicherungsfaktors wird eine Standardkurve mit hochapoptotischem Material als Interpretationsbasis herangezogen:
Durch Inkubation von EDTA-Vollblut dreier gesunder Blutspender über 24 Stunden wird Apoptose induziert. nach Zentrifugation wird das Plasma lyophilisiert und bei 4°C gelagert. Bei Resuspension zu verschiedenen Zeitpunkten werden reproduzierbare Maximalwerte im oberen Meßbereich des Photometers bei einer optischen Dichte (OD) von 2500 mE erzielt; es liegt eine gute Langzeitstabilität sowie ein lineares Verdünnungsverhalten im gesamten Bereich von 0 bis 2500 mE vor. Eine Vergleichbarkeit sowohl innerhalb eines Tests als auch zwischen mehreren Testansätzen ist somit gewährleistet.
Als höchster Standardwert wird die 1:24-Verdünnung des Standardmaterials mit Inkubationspuffer verwendet, die nach 30 min 2500 mE erreicht. Die weiteren Verdünnungsschritte (1:24, 1:32, 1:48, 1:64, 1:96, Leerwert) ergeben eine lineare Verdünnungskurve, die einer Ursprungsgerade entspricht (1).
Mit dem ELISA läßt sich bereits ein Nukleosomgehalt von 10³ Zellen nachweisen.
Meßzeit
Um eine vertretbare Meßungenauigkeitsgrenze von 5% aufgrund von aus den Pipettierschritten herrührenden Verzögerungen nicht zu überschreiten, wird die ABTS-Inkubationszeit auf 30 Minuten festgelegt.
Meßeinheit
Möglicherweise sind Nukleosomen unterschiedlich zugänglich für die Bindung von Antikörpern, abhängig von der Form, in der sie vorliegen: als Mononukleosomen oder Oligonukleosomen, letztere mit oder ohne Tertiärstruktur. Die Menge an gebundenen und POD-markierten Anti-DNA-Antikörpern entspricht somit nicht unbedingt der genauen Nukleosomkonzentration im Probenmaterial.
Deshalb wird von einer absoluten Konzentrationsangabe abgesehen und eine Skalierung mit sogenannten AUs (Arbitrary Units) eingeführt. 1000 AU werden dem höchsten Standardwert (2500 mE nach 30 min) gleichgesetzt; die Skalierung erfolg linear. Damit wird der Unkenntnis über das Verhältnis von Mononukleosomen zu Oligonukleosomen und der dadurch bedingten Variabilität, was die Menge an Bindungsstellen der Antikörper betrifft, Rechnung getragen, gleichzeitig jedoch die Vergleichbarkeit zwischen den Tests gesteigert.
Beispiel 3: Präanalytische Standardisierung
Matrix
Bei den vorliegenden Untersuchungen wird als Matrix Serum verwendet. Hämolyse kann zu falschpositiven Testergebnissen führen; die Zentrifugation erfolgt deshalb in einem Zeitraum von zwei Stunden nach der Entnahme für 15 min bei 3000 U/min.
Stabilisierung der Probe
Durch Zugabe von 1/10 Volumenteilen an 100 mM EDTA (TRIS-Puffer, pH-Wert 8) direkt nach dem Abseren werden Ca²⁺- und Mg²⁺-abhängige Endonukleasen, z. B. DNase I, und im Sauren tätige Endonukleasen, wie DNase II mit einem Aktivitäts-Optimum bei pH 4,5 inhibiert. Somit wird einer möglichen Abspaltung von Ansatzstellen der Anti-DNA-Antikörper und einer Abnahme der Meßwerte vorgebeugt.
Testvorbereitung
Nach Auftauen ist auf Angleichung an die Zimmertemperatur und sorgsame Homogenisierung des Probenmaterials zu achten. Die Serumproben werden 1:4 mit Inkubationspuffer (20 μl Serum, 60 μl Inkubationspuffer) verdünnt und anschließend in den Test eingesetzt.
Im Vergleich mit der Standardkurve läßt sich bei Verdünnungen des Serums eine lineare Verdünnungsgerade beobachten (1).
Beispiel 4: Beschreibung der Patientengruppe
Seren von insgesamt 507 Probanden wurden analysiert. Davon waren 445 Seren von Patienten, die im Zeitraum vom August 1996 bis zum Dezember 1997 in Behandlung waren, sowie 62 von gesunden Personen.
Gesunde Personen
Untersucht wurden Seren von 62 gesunden Personen. Die Altersverteilung der Personen reichte von 20 bis 60 Jahre mit einem Mittelwert von 35 Jahren; es nahmen 33 Frauen (53%) und 29 Männer (47%) an der Studie teil.
** Patienten mit gutartigen Erkrankungen
Es wurden 108 Seren von Patienten mit gutartigen Erkrankungen untersucht: 39 hatten gutartige Magen-Darm-Erkrankungen (hauptsächlich Kolitis, Pankreatitis, Cholecystolithiasis, Subileus verschiedener Ätiologie), 13 hatten gutartige Lungenerkrankungen (vor allem Emphysem, Pneumonie), 37 hatten gutartige gynäkologische Erkrankungen (vor allem Eierstockzysten, Endometriose, Uterusmyomatose), 19 hatten andere gutartige Erkrankungen (vor allem Abszesse, knotenförmige Kröpfe, koronare Herzkrankheit).
50 der 108 an akuten entzündlichen Erkrankungen leidenden Patienten wurden in fünf verschiedene Kategorien eingeteilt (jeweils zehn), entsprechend der Konzentrationen an C-reaktivem Protein:
(I: CRP ≤ 1 ng/ml, II: 1 ng/ml < CRP ≤ 5 ng/ml, III: 5 ng/ml < CRP ≤ 10 ng/ml; IV: 10 ng/ml < CRP ≤ 20 ng/ml, V: 20 ng/ml < CRP).
Patienten mit soliden Tumoren
Zusätzlich wurden Seren von 337 Patienten mit soliden Tumoren (CA = Carcinoma) untersucht; diese wurden in 38 Bronchial-CAs, 60 Colon-CAs, 44 andere gastrointestinale CAs, 58 Brust-CAs, 43 Ovarial-CAs, 19 andere gynäkologische CAs, 8 ENT-CAs, 16 Lymphome, 20 Nieren-CAs, 17 Prostata-CAs und 14 andere CAs unterteilt.
Blutproben wurden jeweils vor der operativen Primärtherapie oder vor der Chemotherapie oder Radiotherapie entnommen, um die spontane prätherapeutische Zelltodrate über die Nukleosombestimmung zu messen.
Verlaufsbeobachtung
Von diesen 337 Patienten wurden zudem 16 Patienten unter sowohl primärer als auch sekundärer Radiotherapie (6 mit Bronchial-CA, 4 mit Lymphomen, 4 mit ENT-CA, 2 mit Colon-CA) und 20 Patienten unter Chemotherapie (7 mit Lymphomen, 6 mit Colon-CA, 2 mit Pankreas-CA, 2 mit Bronchial-CA, 2 mit Sarkomen, 1 mit ENT-CA) im Verlauf beobachtet.
Bei den mit Strahlung behandelten Patienten wurden vor der Bestrahlung und 3, 6, 24 und 72 Stunden und eine Woche nach dem Start der Bestrahlung und zudem vor Beginn der jeweils ersten wöchentlichen Bestrahlungseinheit Blutproben entnommen. Da das Therapieschema der meisten Patienten eine tägliche Bestrahlung vorsah, ist zu berücksichtigen, daß nach der vierten Messung eine erneute Therapieeinheit erfolgte.
Bei den Patienten unter Chemotherapie wurde vor der Therapie und am zweiten und vierten Tag und eine Woche nach der ersten Dosisgabe und außerdem wöchentlich oder vor Beginn des nächsten Therapiezyklus der Nukleosomgehalt gemessen.
Beispiel 5: Methodische Ergebnisse
Matrix
Wir testeten parallel Serum und Plasma von zehn Probanden, davon waren vier gesunde, vier Tumorpatienten und zwei Patienten mit akut entzündlichen Erkrankungen. In diesem Fall wurden im Serum meistens höhere Nukleosomkonzentrationen gefunden als im Plasma (N = 9). Bei einem Patienten mit extrem hohen CRP-Werten von über 45 ng/ml waren die Meßergebnisse im Serum und im Plasma gleichermaßen hoch.
Stabilität
Diese Serum- und Plasmaproben wurden mit und ohne Zusatz von 10 mM EDTA (pH 8) bei 24°C, 4°C, -20°C und -80°C über einen Zeitraum von drei Wochen gelagert. Die beste Stabilität wurde bei Serum beobachtet, das unmittelbar nach der Zentrifugation mit 10 mM EDTA (pH 8) (siehe oben) versetzt und bei einer Temperatur von -20°C oder -80°C gelagert wurde (2).
Präanalytik
Einfluß der Hämolyse
Leichte Hämolyse wurde in einer Vollblutprobe durch kurzes Schütteln und Wärmeexposion (37°C) über vier Stunden induziert. Nach Abseren wurde damit ein gesundes apoptosearmes Serum titriert. Das Meßsignal stieg mit zunehmender Hämolysatmenge stetig an (3).
Einfluß des Zentrifugierzeitpunktes
Nach der Blutabnahme wurden Vollblutproben unter verschiedenen Lagerungsbedingungen (37°C, 25°C, 4°C) für 0, 2, 4 und 6 Stunden vor der Zentrifugation aufbewahrt. Danach wurden sie mit EDTA (siehe oben) versetzt oder unbehandelt eingefroren. Je größer der Zeitraum wurde, desto höhere Werte wurden im Serum gemessen. Dieser Effekt war bei einer Lagerung bei höheren Temperaturen (37°C) ausgeprägter.
Einfluß des Zeitpunktes der EDTA-Zugabe
Nach der Zentrifugation wurden Seren bei 37°C, 25°C und 4°C gelagert, ehe ihnen nach 0, 2, 4, 6 oder 8 Stunden 10 mM EDTA (pH 8) zugegeben wurden, wonach sie sofort bei -20°C eingefroren wurden. Je später das EDTA dem Serum zugesetzt wurde, desto niedriger waren die im Serum erhaltenen Signale. Ausnahmen waren sehr niedrige oder über dem Meßbereich liegende Werte, die konstant blieben. Die Temperatur hatte keinen wesentlichen Einfluß.
Einfluß des Einfrierzeitpunktes
Seren wurden nach der Zentrifugation und sofortiger Zugabe von 10 mM EDTA bei 37°C, 25°C und 4°C für 0, 2, 4 und 6 Stunden aufbewahrt, ehe sie bei -20°C tiefgefroren wurden. Weder Zeit noch Temperatur nahmen Einfluß auf die erhaltenen Meßsignale (4).
Langzeitstabilität des Probenmaterials
Die Langzeitstabilität wurde bei drei bei -20°C eingefrorenen Seren (x₁ – x₃) mit niedrigen (x₁ = 55 AU) mittelhohen (x₂ = 297 AU) und hohen (x₃ = 481 AU) Testresultaten nach 1, 2, 3, 4 und 6 Monaten überprüft. Bei allen drei Seren wurden stabile Meßsignale erhalten, mit einem VK von 4,2%-9,2% (5)
Qualitätskriterien des Tests
Impräzision
Zur Beurteilung der Meßungenauigkeit wurden die Variationskoeffizienten zweier Serenpools (x₁ – x₄) ermittelt. Abhängig von den Meßwerten lag der Inter-Assay-VK (n = 14) zwischen 8,6% (x₁ = 455 AU) und 13,5% (x₂ = 235 AU), der Intra-Assay-VK (n = 10) bewegte sich zwischen 3,0 (x₃ = 327 AU) und 4,1% (x₄ = 181 AU), wobei bei Seren mit höheren Meßwerten die Impräzision niedriger war.
Analytische Spezifität
Ein Meßsignal ist mit der Komplexbildung von biotinylierten Anti-Histon-Antikörpern, Nukleosomen und mit Peroxidase markierten DNA-Antikörpern verbunden: Nichtbiotinylierte Anti-Histon-Antikörper wurden zu dem Standard-Immunoreagenz mit biotinylierten Anti-Histon-Antikörpern gegeben, das mit hochapoptotischem Serum inkubiert wurde. Die gemessenen Signale nahmen mit zunehmender Konzentration der nichtbiotinylierten Anti-Histon-Antikörper rapide ab, was auf einen kompetitiven Verdrängungswettkampf der mit und ohne Biotin versehenen Anti-Histon-Antikörper hinweist, und näherte sich asymptotisch der Region von gesunden Personen.
Nukleosomen, freie DNA, Hintone, Anti-Histone oder Anti-DNA-Antikörper alleine können also keine störenden Veränderungen der OD hervorrufen (6).
Lowest detection dose (LDD)
Die niedrigste zu detektierende Konzentration wurde aus dem Mittelwert (n = 20) + 3x Standardabweichung des Leerwertes als 16 AU berechnet.
Testmodifikationen
Standardkurve und Meßeinheit
Durch Erstellen einer Standardkurve wie oben beschrieben war es möglich, eine Interassay-Impräzision von weniger als 10% zu erzielen.
Darüber hinaus konnte durch Messung in AU (Arbitrary Units) verglichen mit mU optischer Dichte die Interassay-Impräzision (N = 14) von 15,3% auf 8,6% (x₁ = 455 AU = 1007 mU) und von 17,0% auf 13,5% (x₂ = 235 AU = 437 mU) verbessert werden, während die Interassay-Impräzision (N = 10) konstant war: 3,0% bzw. 3,3% (x₃ = 327 AU = 882 mU) und 4,1% bzw. 4,0% (x₄ = 181 AU = 480 mU).
Klinische Ergebnisse
Meßergebnisse und Werteverteilung
Gesunde Probanden
Nukleosomkonzentrationen von unter 100 AU wurden im Serum von 60 der 62 (= 96,8%) gesunden Probanden gemessen. Nur zwei (= 3,2%) wiesen Nukleosomkonzentrationen zwischen 100 und 200 AU auf. Der Medianwert betrug 24 AU, der Mittelwert 34 AU. Dabei konnten keine Unterschiede bezüglich des Alters, des Geschlechts oder der Lebensgewohnheiten (z. B. Rauchen, Alkohol) der Probanden festgestellt werden.
Patienten mit benignen Krankheiten
Bei Patienten mit benignen Krankheiten (N = 108) wurde bei 59,3% der Fälle im Serum eine Nukleosomkonzentration über 100 AU gefunden und bei 17,6% lag dieser Wert über 500 AU, der Medianwert betrug 147 AU, der Mittelwert 271 AU.
Eingeteilt nach Organsystemen waren bei benignen Lungenkrankheiten 61,5% über 100 AU und 15,4% über 500 AU, bei benignen Gastrointestinalkrankheiten waren 48,7% über 100 AU und 23,1% über 500 AU, bei benignen gynäkologische Krankheiten waren 67,6% über 100 AU und 10,8% über 500 AU und bei allen anderen benignen Krankheiten waren 63,2% über 100 AU und 21,1% über 500 AU.
Von diesen benignen Erkrankungen wurden 50 mit akuten entzündlichen Erkrankungen und einem bekannten CRP-Wert ausgewählt: bei den Patienten aus Gruppe 1 (CRP ≤ 1 ng/ml) (N = 10) lag die Nukleosomkonzentration im Serum bei 40% über 100 AU und bei 10% über 500 AU, bei Patienten aus Gruppe 2 (1 ng/ml < CRP ≤ 5 ng/ml) (N = 10) lag der Wert bei 50% über 100 AU und bei 20% über 500 AU, bei Patienten aus Gruppe 3 (5 ng/ml < CRP 10 ng/ml) (N = 10) lag der Wert bei 80% über 100 AU und bei 30% über 500 AU, bei Patienten aus Gruppe 4 (10 ng/ml < CRP ≤ 20 ng/ml) (N = 10) lag der Wert bei 80% über 100 AU und bei 30% über 500 AU, bei Patienten aus Gruppe 5 (CRP > 20 ng/ml) (N = 10) lag der Wert bei 80% über 100 AU und bei 60% über 500 AU. Dies zeigt, daß es beim Serum von Patienten mit höheren CRP-Werten eine Tendenz zu höheren Nukleosomkonzentrationen gibt.
Patienten mit soliden Tumoren
Bei Patienten mit verschiedensten soliden Tumoren ist, unabhängig von der Lokalisation, eine große Bandbreite an Werten vorzufinden. Bei 63,2% der Patienten lag die Serumnukleosomkonzentration über 100 AU und bei 24,6% über 500 AU. Der Medianwert wurde als 183 AU berechnet, der Mittelwert als 329 AU.
Nukleosomkonzentrationen im Serum von mehr als 100 AU wurden insbesondere bei 92,1% der Patienten mit Bronchial-CA, bei 58,3% der Patienten mit Colon-CA, bei 54,5% der Patienten mit anderen gastrointestinalen CAs, bei 75,9% der Patientinnen mit Mamma-CA, bei 72,1% der Patientinnen mit Ovarial-CA, bei 68,4% der Patientinnen mit anderen gynäkologischen CAs, bei 75,0% der Patienten mit ENT-CA, bei 56,3% der Patienten mit Lymphomen, bei 40,0% der Patienten mit Nieren-CA, bei lediglich 5,9% der Patienten mit Prostata-CA und bei 50,0% der Patienten mit anderen CAs gemessen.
Wir fanden Nukleosomkonzentrationen von über 500 AU bei 36,8% der Patienten mit Bronchial-CA, bei 21,7% der Patienten mit Colon-CA, bei 22,7% der Patienten mit anderen gastrointestinalen CAs, bei 25,9% der Patientinnen mit Mamma-CA, bei 34,9% der Patientinnen mit Ovarial-CA, bei 21,1% der Patientinnen mit anderen gynäkologischen CAs, bei 12,5% der Patienten mit ENT-CA, bei 37,5% der Patienten mit Lymphomen, bei 15,0% der Patienten mit Nieren-CA, bei 0% der Patienten mit Prostata-CA sowie bei 14,3% der Patienten mit anderen CAs (7a, b, c und 13).
Verlaufsbeobachtung
Die Nukleosomkonzentration im Serum wurde beim Followup bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen sowie bei Patienten während der Radiotherapie und der Chemotherapie beobachtet, um einen Vergleich zwischen der Entwicklung der Nukleosomkonzentration im Serum und den klinischen Befunden und dem Ansprechen auf die Therapie zu erstellen.
Bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen korreliert die Nukleosomkonzentration im Serum mit dem CRP und den klinischen Befunden (objektivierbar z. B. durch Sonographie), d. h. bei den akuten Stadien der Krankheit wurde eine hohe Nukleosomkonzentration im Serum und ein hoher CRP gefunden, und beide Werte nahmen bei der Verbesserung des klinischen Zustands parallel zueinander ab (8).
Patienten unter Chemotherapie sind nur individuell und mit Kenntnis der klinischen Hintergründe beurteilbar. Charakteristisch für die meisten der beobachteten Patienten war ein steiler Anstieg der Nukleosomkonzentration im Serum mit je nach Medikament unterschiedlicher Latenz (24-72 Stunden) nach Beginn der Therapie. Im weiteren Verlauf sanken die Werte oft wieder ab. Infektionen oder andere Nebenwirkungen riefen unter anderem eine zeitweilige Erhöhung der Nukleosomkonzentration hervor und erschwerten die Beurteilung des Verlaufs (9)
Weder der prätherapeutische Wert, die Zunahmerate oder der Maximalwert der Zunahme korrelierten mit der therapeutischen Reaktion. Zwischen den Zyklen kam es regelmäßig zu einer Abnahme der Nukleosomkonzentration, unabhängig von dem weiteren Verlauf der Krankheit. Schließlich eignet sich ein Vergleich der basalen Nukleosomwerte als Kriterium für die Beurteilung des Therapieverlaufs, die jeweils zu Beginn eines neuen Therapiezyklus gemessen werden: Bei allen acht Patien ten mit einer teilweisen oder vollständigen Remission wurde eine Abnahme der basalen Nukleosomkonzentration beobachtet, während nur bei Patienten mit einer Progression der Krankheit eine Zunahme beobachtet wurde (14).
Patienten unter Radiotherapie: Durch massive Apoptose-Induktion trat zu Beginn der Radiotherapie zumeist eine rapide Erhöhung der Serumnukleosomkonzentration auf. Die Latenzzeit von 6-24 Stunden war kürzer als bei der Chemotherapie. Außerdem fällt bei einigen Patienten nach drei oder sechs Stunden ein zwischenzeitlicher Abfall der Nukleosomkonzentration im Serum auf, ehe sie danach rasch ansteigt. Im Verlauf ist – manchmal nach anhaltend hohen Werten – bei vielen Fällen ein Abfall zu beobachten, der häufig mit einer Regression des Tumors, die später durch bildgebende Verfahren bestätigt werden konnte, assoziiert war (10).
Es bestand eine Korrelation zwischen der prätherapeutischen Nukleosomkonzentration und der maximalen Nukleosomkonzentration während der Radiotherapie: 7 von 16 Patienten hatten ähnlich hohe prätherapeutische und maximale Werte über 500 AU, 5 von 16 hatten jeweils ähnlich niedrige Werte unter 100 AU, 4 von 16 zeigten einen starken Anstieg von beträchtlich unter 500 AU auf beträchtlich über 500 AU. Weder die prätherapeutische Nukleosomkonzentration noch die maximale Nukleosomkonzentration während der Radiotherapie korrelierten mit der Reaktion auf die Therapie (Remission des Tumors).
Bei 9 von 10 Patienten mit einer teilweisen oder vollständigen Remission war es möglich, innerhalb von 24 Stunden nach Erreichen des Maximalwerts den Beginn einer Abnahme der Nukleosomkonzentration im Serum zu beobachten.
Im Gegensatz dazu begann bei 3 von 5 Patienten, bei denen eine Progression der Krankheit beobachtet wurde, die Abnahme der Nukleosomkonzentration im Serum mehr als sieben Tage nach dem Erreichen des Maximalwertes, bei einem der fünf Patienten zwischen zwei und sieben Tagen und bei einem Patienten innerhalb von 24 Stunden. Ein Patient, bei dem sich die Krankheit nicht änderte, zeigte ebenfalls innerhalb von weniger als 24 Stunden den Beginn einer Abnahme der Nukleosomkonzentration.
Darüber hinaus korrelierte die Reaktion auf die Therapie mit dem Endwert der Abnahme der Nukleosomkonzentration im Serum: bei 9 von 10 Patienten mit vollständiger oder teilweiser Tumorremission lagen die Minimalwerte unter 100 AU, während sie bei 4 von 5 Patienten mit Progression über 100 AU lagen. Der Patient, bei dem sich die Krankheit während der Therapie nicht änderte, hatte einen Minimalwert unter 100 AU (15).
Weitere Beispiele anderer Krankheiten Bei Patienten mit Hirninfarkt (Schlaganfall) wurde unmittelbar nach der Einlieferung in das Krankenhaus (bis zu sechs Stunden nach dem Ereignis) Blut entnommen, und in täglichen Abständen wurde die Konzentration von Nukleosomen im Serum bestimmt. Die drei untersuchten Personen hatten unmittelbar nach dem Infarkt unterschiedliche Werte, die nach einem bis drei Tagen auf den Bereich von gesunden Personen abnahm. Bei einem Patienten kam es zu einem zeitweiligen Anstieg bei dem Serumnukleosomwert (11).
Bei einem Patienten mit cerebralem Lymphom wurde die Nukleosomkonzentration im Liquor untersucht. Der Liquor wurde aus der Wirbelsäule entnommen, um einen zwischenzeitlichen übermäßigen Liquordruck, der mit einer Verschlechterung des klinischen Zustands des Patienten einherging, abzubauen, und entsprechend der Serumbehandlung mit 10 mM EDTA gemischt.
Auch im Liquor wurden meßbare Konzentrationen von Nukleosomen gefunden, und eine Erhöhung der Liquornuk- 1eosomwerte ging mit einer klinischen Verschlechterung einher, während bei einem stabilen klinischen Zustand des Patienten niedrige Werte gefunden wurden (12).
Legenden für die Figuren und Tabellen:
1: Standardkurve und Serumsverdünnungskurve
Die Standardkurve sowie die Serumsverdünnungskurve sind lineare Ursprungsgeraden. Die niedrigste Verdünnung des Standardmaterials (1:24 mit der Inkubationspuffermischung) erreicht nach 30 min eine optische Dichte im oberen Meßbereich des Photometers (bei 2500 mU). Die standardisierte Verdünnung der Seren (1:4 mit einer Inkubationspuffermischung) überschritt den Meßbereich nur in Ausnahmefällen.
2: Vergleich zwischen Serum (S) und Plasma (P) ohne (-) und mit (+) Zusatz von 10 mM EDTA
Die Nukleosomkonzentration im Serum ist beträchtlich höher als im Plasma. Die Stabilität der gemessenen Nukleosomkonzentration wird durch Zusatz von 10 mM EDTA (ph 8) unmittelbar nach dem Zentrifugieren optimiert (Probenaufbewahrungstemperatur: -20°C).
3: Einfluß von Hämolyse
Wird ein Serum mit niedrigem Nukleosomgehalt von einem gesunden Probanden mit einem leicht hämolysierten Serum titriert, erhöht sich das gemessene Signal in einer dosisabhängigen Weise.
4: Einfluß der EDTA-Zugabe
Seren, die nach dem Zentrifugieren bei 4°C aufbewahrt und nach verschiedenen Latenzzeiten mit 10 mM EDTA versetzt wurden (S1-3), zeigen eine Abnahme der gemessenen Werte, die von der Zeitverzögerung abhängen, während Seren, die unmittelbar nach der Zentrifugation mit 10 mM EDTA versetzt und anschließend über verschiedene Zeitspannen bei 4°C aufbewahrt wurden (E1-3), stabile Meßwerte zeigten (siehe Text).
5: Langfristige Stabilität
Seren mit niedrigen, mittleren und hohen Nukleosomkonzentrationen zeigten nach Zusatz von 10 mM EDTA (ph 8) und Aufbewahrung bei -20°C über wenigstens sechs Monate gute Stabilität.
6: Analytische Spezifität
Nichtbiotinylierte Anti-Histon-Antikörper werden durch Titration in zunehmenden Konzentrationen zu dem biotinylierte Anti-Histon-Antikörper enthaltenden Standardimmunoreagens gegeben. Das gemessenen Signal, das in konzentrationsabhängiger Weise in den Normalbereich von gesunden Personen (100 AU) abnimmt, spiegelt die exklusive Quantifizierung von Komplexen, die aus nichtbiotinylierten Anti-Histon-Antikörpern, Nukleosomen und mit Peroxidase markierten DNA-Antikörpern gebildet werden, wider.
7a, 7b und 7c: Verteilung von Werten für die spontane Nukleosomkonzentration im Serum
Über 95% der gemessenen Nukleosomkonzentrationen im Serum von gesunden Probanden sind unter 100 AU; bei Patienten mit benignen Erkrankungen sowie bei Patienten mit soliden Tumoren werden für die Nukleosomkonzentrationen alle Werteniveaus gefunden. In diesem Zusammenhang gibt es zwischen verschiedenen Tumortypen erkennbare Unterschiede (siehe auch Text).
8: Patient mit akuter entzündlicher Erkrankung
Bei dieser Patientin mit Cholangitis und Cholestase nahm die Nukleosomkonzentration zunächst parallel zum C-reaktiven Protein zu und dann während einer antibiotischen Behandlung, die mit einer Verbesserung des klinischen Zustands einherging, ab.
9: Patient unter Chemotherapie
Bei diesem Patienten, der wegen eines metastasierenden Pankreaskarcinoms behandelt wurde, stieg nach Beginn eines Zyklus mit 1000 mg/m² Gemcitabin (Tag 1, 8, 15) und 50 mg/m² Cisplatin (Tag 1, 15) (1) die Nukleosomkonzentration im Serum steil an und fiel danach langsam ab. Wegen klinisch progressiver Verschlechterung wurde ein neues Therapieschema mit 300 mg/m² Folsäure und 500 mg/m² 5-Fluoruracil (jeweils an Tagen 1 bis 5) (2) angesetzt. Auch hier zeigte sich zunächst ein rapider Anstieg der Nukleosomkonzentration, jedoch gab es hier nur eine teilweise Abnahme. Die Krankheit hatte einen progredienten Verlauf, was auch am stetigen Anstieg des CEA zu ersehen war.
10: Patient unter Radiotherapie
Bei diesem Patienten mit einem metastatisierten Bronchial-Karcinom kam es schon am ersten Tag der Strahlentherapie (Gesamtdosis 60 Gy, tägliche Teildosis 2,0 Gy, Strahlungsvolumen 9,9 1) nach einer vorübergehenden Abnahme zu einem deutlichen und schnellen Anstieg der Serumnukleosomkonzentration. Erst nach einigen Wochen gingen die Werte zurück, zeitgleich mit einer radiologisch nachweisbaren Regression des Tumors. Aufgrund einer Infektion stieg die Nukleosomkonzentration am 40sten Tag leicht an, um dann nochmals abzufallen. Mit dem Auftreten von multiplen Metastasen und eines malignen Pleuraergusses wurden wieder höhere Nukleosomkonzentrationen im Serum gemessen.
11: Patient mit cerebralem Insult
Drei Patienten mit verschiedenen Verläufen der Nukleosomkonzentration im Serum nach cerebralem Insult (Schlaganfall).
12: Nukleosomkonzentration im Liquor
Bei diesen Patienten mit einer cerebralen Lymphominfektion wurde die Nukleosomkonzentration im Liquor während des Verlaufs der Krankheit bestimmt. Bei einer Verschlechterung des klinischen Zustands (Tage 15-19) wurde ein Anstieg der Nukleosomwerte im Liquor beobachtet, während die Werte niedrig waren, wenn der Zustand stabil war.
13: Häufigkeitsverteilung der spontanen Nukleosomkonzentration im Serum
Medianwert (M), Mittelwert (x), Standardabweichung (σ), KNS-Werte über 100 AU und 500 AU in gesunden Probanden, Patienten mit benignen und malignen Erkrankungen.
14:
Korrelation des klinischen Verlaufs bei Patienten unter Chemotherapie, wobei die basale Nukleosomkonzentration im Serum jeweils zu Beginn eines neuen Therapiezyklus bestimmt wurde.
15:
Korrelation des klinischen Verlaufs bei Patienten unter Radiotherapie mit a) der Verzögerung bei der Abnahme der Serumnukleosomkonzentration nach Erreichen des Maximalwertes während der Therapie und b) der minimalen Serumnukleosomkonzentration während oder nach Abschluß der Therapie.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Patienten, bei denen aufgrund einer Krankheit oder Therapie die Apoptose induziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Serumproben durch Inhibieren von Ca²⁺- und Mg²⁺-abhängigen Endonukleasen und Endonukleasen mit einem sauren pH-Wert-Optimum mit EDTA stabilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Patienten um Tumorpatienten oder Patienten, die sich einer chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlung unterziehen oder Patienten mit akuten entzündlichen Prozessen während einer Behandlung mit Antibiotika oder Patienten nach einem akuten ischämischen Ereignis oder Patienten, die sich einer hyperthermalen Behandlung unterziehen, handelt und die Konzentration der Nukleosomen in den Serumproben der Patienten mit der Wirksamkeit der Therapie korreliert wird und somit als Follow-up für die Therapie dient.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Serumproben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei a) das Serum eines Tumorpatienten mit einem Anti-Histon-Antikörper und mit einem Anti-DNA-Antikörper inkubiert wird, wobei einer der Antikörper vor, während oder nach dieser Inkubation an eine Festphase gebunden wird und es sich bei dem anderen Antikörper um einen markierten Antikörper handelt, b) die feste und die flüssige Phase voneinander getrennt werden und c) der Marker in einer der beiden Phasen zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten bestimmt wird.
Kit zur Bestimmung von Nukleosomen nach Anspruch 4, enthaltend einen Anti-Histon-Antikörper und einen Anti-DNA-Antikörper, wobei einer der Antikörper vor, während oder nach dieser Inkubation an eine Festphase gebunden wird und es sich bei dem anderen Antikörper um einen markierten Antikörper handelt, und weiterhin enthaltend EDTA als Stabilisierungsmittel zum Inhibieren von Ca²⁺- und Mg²⁺-abhängigen Endonukleasen und Endonukleasen mit einem sauren pH-Wert-Optimum.
Verwendung eines Kits nach Anspruch 5 zur Kontrolle der Reaktion von Patienten, bei denen als Folge einer Krankheit oder Therapie die Apoptose induziert ist, auf eine Therapie.