DE69923708T2

DE69923708T2 - Nachweisverfahren für microthrix parvicella

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Publication number: DE69923708T2
Application number: DE69923708T
Authority: DE
Inventors: James Michael LARKIN; Sheila Patrick; Sydney Andrew THOMPSON
Original assignee: Questor Technologies Ltd
Current assignee: Questor Technologies Ltd
Priority date: 1998-12-05
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2019-12-07
Also published as: DE69923708D1; GB9826758D0; EP1155323B1; ATE289070T1; EP1155323A1; AU768015B2; WO2000034786A1; AU1666700A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des Nachweises von Bakterienpopulationen in Abwässern, wie beispielsweise aktiviertem Schlamm, Schlammaufbereitungsteichen und anderen Abfallbehandlungsverfahren, die in der Industrie allgemein verwendet werden. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis der Spezies Microthrix.
Microthrix parvicella ist ein in gemischten wässrigen Systemen mit herkömmlichen Mitteln schwer in situ nachweisbares Bakterium. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum spezifischen Nachweisen und Markieren von M. parvicella in einer Reihe von komplexen Proben. Durch das Nachweisen und Quantifizieren dieses Organismus wird es möglich sein, die in Abwässern auftretenden, durch diesen Organismus erzeugten Absetzungsprobleme besser zu kontrollieren.
Gegenwärtig werden zwei Methodiken zum Identifizieren von M. parvicella in gemischten Proben verwendet: durch herkömmliche taxonomische Identifizierung unter Verwendung von durch Eikelboom (1968) und anderen entwickelte Schlüssel und durch die Verwendung von spezifischen Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungs-DNA-Sonden (FISH-DNA-Sonden) (entworfen aus einzigartigen 16S rRNA DNA-Sequenzen). Erstere wird routinemäßig in der Industrie verwendet, letztere ist gegenwärtig auf Forschungsstudien beschränkt (Erhart et al., 1997). Die Quantifizierung von M. parvicella in Reinkultur wird gegenwärtig durch Protein- oder Trockengewichtbestimmungen durchgeführt (vgl. Slijkhuis et al. 1984). In der Vergangenheit wurden verschiedene Verfahren angewendet, um die Anzahl der M. parvicella-Fäden über direkte Auszählverfahren (Bradford et al., 1998) zu schätzen, diese sind jedoch subjektiv und erbringen lediglich konservative Schätzungen.
Die schlüsselartige taxonomische Identifizierung beruht auf der kombinierten Verwendung der mikroskopischen Färbemittel und morphologischen Charakteristika. Dies führt dazu, dass sie langsam ist und eine Operatorschulung und Ausgaben in beträchtlichem Maße erfordert. Die morphologische Identifizierung ist weitgehend subjektiv und berücksichtigt nicht möglicherweise vorhandene ungewöhnliche M. parvicella-Wachstumsformen. In-Situ-DNA-Sonden sind sehr präzise, sind aber, was die verwendeten Materialien betrifft, relativ kostspielig. Zusätzlich werden die für jeden Assay benötigte Zeit und Kosten aufgrund der Notwendigkeit, die Zellen zu permeabilisieren, um das Einführen der Sonde in die Zelle zu ermöglichen, gesteigert. Das Ausmaß der Fluoreszenz variiert je nach Anzahl der in der Zelle vorhandenen Ribosomen. In Zeiten geringer Nährstoffverfügbarkeit oder anderen Zeiten, in denen die Zelle nicht wächst, kann die Anzahl der Ribosomen niedrig sein, was zu einem schwachen Fluoreszenzsignal führt. Zusätzlich schließt die variable Beschaffenheit von Abwasser die Entwicklung eines Assay-Verfahrens, das regelmäßig auf eine große Bandbreite an Proben anwendbar ist, aus. Die Auszählung anhand von Proteinmessungen und Trockengewicht ist nur in Reinkulturen möglich, ist nicht in der Abwasserindustrie anwendbar und kann lediglich eine empirische Schätzung bereitstellen. Direkte Zählungen sind von einer korrekten Ausgangsdiagnose abhängig und eignen sich nicht für das Auszählen von Fäden innerhalb von Flocken.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Diagnose von in aktiviertem Schlamm oder Abwasser vorhandenen Populationen des Bakteriums Microthrix parvicella zu produzieren.
Ferner ist es auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren der Quantifizierung von Microthrix parvicella für die Fälle, in denen es diagnostiziert wurde, bereitzustellen.
Vorzugsweise wird das Verfahren des Nachweises und der folgenden Isolierung zur Ermöglichung der Quantifizierung durch die Verwendung von neuartigen Antikörpern, die eine Spezifität für M. parvicella aufweisen, katalysiert.
Ein geeigneter Antikörper ist von Zell-Linie MP5B106A, die an der European Collection of Cell Cultures (Europäische Zellkultursammlung) am 30. November 1999 unter der Zugangsnummer 99113020 hinterlegt worden ist, herleitbar.
Vorzugsweise werden die spezifischen neuartigen Antikörper durch die Verwendung eines Immunoassays oder von mikroskopischen Mitteln nachgewiesen.
Die Antikörper können mit Fluoreszenzstoffen, Enzymen oder ähnlichen Molekülen konjugiert oder indirekt durch die Verwendung eines sekundären konjugierten Antikörpers markiert werden, um die selektive Sichtbarmachung der Zellen von M. parvicella zu ermöglichen.
Die Antikörper können auch an eine Eisen-/Polystyrol-Perle gebunden sein, um eine immunmagnetische Trennung zu erlauben.
Die gegenwärtige Erfindung weist ferner den Vorteil auf, dass sie ein neuartiges Verfahren bereitstellt, das die schwierige Aufgabe durchführt, M. parvicella in gemischten wässrigen Systemen nachzuweisen, und dabei gleichzeitig eine beträchtliche Einsparung hinsichtlich Kosten, Zeit und Operatorschulung, welche bei vorherigen Verfahren für das Durchführen des Vorgangs erforderlich waren, bereitstellt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf mehrere monoklonale Antikörper, die eine Spezifität für Candidates Microthrix parvicella aufweisen. Es werden mehrere hybride murine Zell-Linien, die für Microthrix parvicella spezifische Antikörper absondern, offenbart. Diese Antikörper sind nützlich beim Nachweis und der Isolierung von Microthrix parvicella aus wässrigen Proben wie beispielsweise aktiviertem Schlamm.
Microthrix parvicella ist ein häufiges Erregerbakterium des als fadenförmiges Blähen (filamentous bulking) bekannten Abwasserabsetzungsphänomens, insbesondere dort, wo kommunaler Müll erhalten wird (Blackall et al., 1995, Eikelboom et al. 1998). Es verursacht außerdem erhebliches Schäumen und Aufschwämmen anaerober biologischer Reinigungsanlagen (Dillner Westlund et al. 1998). Mehrere in Abwasseraufbereitungsanlagen in West-, Nord-, Süd- und Mitteleuropa durchgeführte Studien zeigten auf, dass M. parvicella der dominate Mikroorganismus ist (Eikelboom et al., 1998, Wanner et al. 1998). Gegenwärtige Versuche, diesen Organismus zu kontrollieren, waren nur begrenzt erfolgreich (Madoni und Davoli, 1993). Gegenwärtig kann die Routinediagnose nur auf qualitative und semi-quantitative Weise unter Verwendung herkömmlicher mikrobiologischer taxonomischer Instrumente durchgeführt werden (Eikelboom, 1968) und unterliegt daher mehrdeutigen Interpretationen.
Daher ist es ein Ziel dieser Anmeldung, neuartige monoklonale und polyklonale für Candidatus M. parvicella spezifische Antikörper bereitzustellen, die für den eindeutigen Nachweis und die eindeutige Auszählung geeignet sind.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beispielhaft erläutert, wobei:
1a und 1b fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, die auf 16S RNA basieren, darstellen,
2 die Immunfluoreszenz von M. parvicella RN1 unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantikörpern zeigt,
3 die durch eine Auswahl von Antikörpern erzeugte Immunfluoreszenz darstellt,
4 eine Probe an kommunalem Abfall, die mit einem Cocktail an Antikörpern sondiert wurde, zeigt,
5 eine Probe an kommunalem Abfall, die mit einem monoklonalen Antikörper in Phasenkontrast und Fluoreszenzfeldern sondiert wurde, zeigt,
6 eine Probe an kommunalem Abfall, die mit einem monoklonalen Antikörper in Phasenkontrast und Fluoreszenzfeldern sondiert wurde, zeigt,
7 eine Probe an kommunalem Abfall, die mit einem monoklonalen Antikörper in Phasenkontrast und Fluoreszenzfeldern sondiert wurde, zeigt,
8 pharmazeutischen Abfall, der mit einem monoklonalen Antikörpercocktail in Phasenkontrast und Fluoreszenzfeldern sondiert wurde, zeigt,
9 polyklonale Antikörper, die sich in verschiedenen Wachstumsstadien von M. parvicella unterscheiden, zeigt.
Ein neuartiger monoklonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung wird wie folgt produziert. Das heißt, der Anti-M. parvicella-Antikörper wird durch die Immunisierung einer BALB/c-Maus mit dem Gram-positiven heterotrophen M. parvicella-Strang RN1, der aus einer herkömmlichen Abwasseraufbereitungsanlage isoliert wurde (Rossetti et al., 1997), das Bilden von fusionierten Zellen (Hybridomen) zwischen Antikörper bildenden Milzzellen, die aus den tierischen und den Maus-Myelomzellen erhalten wurden (P3 × 63Ag8-653 (NS-0/1) Zell-Linie), das anschließende Vermehren der fusionierten Zellen, Auswählen der Zellen, die einen Antikörper bilden, der eine Spezifität für M. parvicella aufweist, aus den vermehrten fusionierten Zellen und Kultivieren von Antikörper bildenden Zellen, die diese produzieren, produziert.
Ein Anti-M. parvicella-Antikörper wäre in der quantitativen und qualitativen Bewertung von in aktiviertem Schlamm oder anderen Abwässern vorhandenen Populationen des M. parvicella, entweder durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie oder ein anderes, dem Fachmann bekanntes Immunoassay oder als ein Reagens, das für die Extraktion anderer M. parvicella-Stränge aus gemischten mikrobiellen Gemeinschaften zu verwenden ist, nützlich.
Polyklonale Antikörper, die für M. parvicella spezifisch sind, werden durch Immunisierung eines Kaninchens gegenüber M. parvicella RN1 präpariert. Nach einer geeigneten Anzahl von Immunisierungen wird das Tier zum Ausbluten gebracht und ein Serum, das polyklonale Antikörper enthält, erhalten.
Für den Nachweis eines Antikörpers wird ein Enzymimmunoassay eingesetzt. Die Herstellung monoklonaler Antikörper für M. parvicella wird durch das Beibehalten und Züchten der obigen Antikörper bildenden Klone in einem RPMI-Medium durchgeführt (ICN-Flow Laboratories, Vereinigtes Königreich).
Die vorliegende Erfindung bietet gegenüber herkömmlichen Techniken zahlreiche Vorteile:

1. Die Identifizierung von M. parvicella ist aufgrund der hohen Spezifität der verwendeten Antikörper eindeutig.
2. Es ist kein Zellvorbehandlungsschritt erforderlich, wodurch für das gesamte Assay eine bedeutende Zeit- und Kosteneinsparung erzielt wird. Dies ermöglicht es, das Verfahren auch für die durchflusszytometrische Analyse anzuwenden, was eine On-line-Analyse ermöglicht.
3. Die Signalstärke ist besser und über die Zellen gleichmäßiger als die, die durch Verwendung von 16S rRNA-Sonden erhalten wurde.
4. Das Assay ist einfach, es erfordert nur wenige Schritte und minimale Operatorschulung. Die meisten Komponenten des Assays sind kostengünstig und leicht zu beziehen.

A. Präparation des monoklonalen Antikörpers
Microthrix parvicella RN1 wurde bei einer Inkubationstemperatur von 15–20°C für 3–4 Wochen, oder bis Kolonien sichtbar wurden, auf einem komplexen Agarmedium (R2AM: pro Gramm zweifach destilliertem Wasser; Hefeextrakt, 0,5 g, Protease Pepton, 0,5 g Casaminosäuren, 0,5 g, lösliche Stärke, 0,5 g, MgSO₄·7H₂O, 0,10 g, KH₂PO₄, 0,3 g CaCl₂·2H₂O, 0,05 g, NaEDTA, 50 mg, Na₂MoO₄, 20 mg, NMS-Spurenelementlösung (Atlas, 1996) 1 ml, Vitaminzusatz (Eikelboom, 1968), 1 ml, Glukose, 0,5 g, Pyruvat, 0,5 g) kultiviert.
Die mikrobielle Identität von Microthrix parvicella RN1 wurde durch partielles Sequenzieren des 16S rRNA-Gens und durch Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (nach dem Verfahren von Erhart et al., 1997) (1a) unter Verwendung von speziesspezifischen 16S rRNA-Oligonukleotiden bestätigt. 1b zeigt das Auftreten des Bakteriums unter normalen Bedingungen (weißes Licht, Phasenkontrast).
Für die Produktion aller Antikörper wurde bakterielle Biomasse durch das Waschen von 30 Tage alten Zellkolonien von R2AM-Agar mit physiologisch gepufferter Kochsalzlösung (PBS) erhalten.
Der polyklonale Antikörper wurde erhalten, indem ein Kaninchen alle 10 Tage mit 0,8 ml einer Suspension (verabreicht an 4 Stellen in Mengen von 0,2 ml) von M. parvicella-RN1 in PBS (optische Dichte von etwa 0,6 bei 650 nm) subkutan immunisiert wurde, bis Immunfluoreszenz von M. parvicella-RN1 auf Objektträgern durch das Verwenden von Serumproben festgestellt werden konnte (in diesem Fall nach 3 solcher Immunisierungen). An diesem Punkt wurde das Wirtstier, ein Kaninchen, zum Ausbluten gebracht und das Serum fachgemäß erhalten. Serum wurde zur Immunfluoreszenz unter Verwendung einer geeigneten Verdünnung in PBS verwendet. 2 zeigt die Immunfluoreszenz von M. parvicella RN1 unter Verwendung einer 1:1000 Verdünnung polyklonaler Kaninchenantikörper.
Zellkolonien wurden dann geerntet/mit einer physiologischen Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in PBS mit einem pH-Wert von 7,3 suspendiert, um eine Absorbanz bei 650 nm von 0,2000 zu ergeben. 0,2 ml der erhaltenen Suspension wurden in die Bauchfellhöhle einer BALB/c- Maus injiziert, und 36 Tage später wurden 0,2 ml der gleichen Suspension auf gleiche Weise injiziert. Die Maus wurde am 4. Tag nach der letzten Immunisierung getötet, um die Milz zu entnehmen, und die Milzzellen wurden in dem RPMI 1640-Medium suspendiert (ICN-Flow Laboratories, Vereinigtes Königreich). Die übliche Zellfusion wurde dann auf eine auf dem Fachgebiet bekannte Art durchgeführt (Lutton et al., 1991), und Einzelzellklone wurden erhalten. Diese Klone wurden dann in RPMI 1640-Medium kultiviert und mittels herkömmlichen Mitteln auf IgG-Produktion überprüft. Positive Hybridome wurden ausgewählt und weiter kultiviert und mittels des Immunfluoreszenzverfahrens wie folgt auf für M. parvicella spezifische Antikörper überprüft.
Darauffolgend wurden Klone durch Vereinzelung per Verdünnung erneut geklont und erneut auf Spezifität überprüft. Die folgenden Zell-Linien wurden erhalten: MP5B106A, MP4B5, MP4C3, MP2C11 und MP3E12. Die Immunfluoreszenz, die durch eine Auswahl von Antikörpern (MP5B106A, MP4B5 und MP2C11, repräsentativ für allgemeine Erscheinung ausgewählt) erzeugt wurde, wenn diese mit M. parvicella RN1 und einem fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörper zur Reaktion gebracht wurde, ist in 3a–3c gezeigt.
Die Spezifitäten der vermutlichen monoklonalen Antikörper für Microthrix parvicella-Bakterien wurde durch Immunfluoreszenzmikroskopie und durch eine Farbreaktion gemäß einem Enzymantikörperassay bestimmt. Die Immunfluoreszenzmikroskopie wurde wie in Ramage et al. (1998) beschrieben, durchgeführt: der monoklonale Antikörper wurde während einer Inkubationsserie an durch Formaldehyd abgetötete, auf einem Mikroskopträger befestigte Zellen gebunden. Ein sekundärer Anti-Maus-Ziegen-Antikörper, der entweder mit TRITC der FITC (Biorad, USA) markiert ist, wurde in einer weiteren Inkubationsserie an diesen Antikörper gebunden. UV-Mikroskopie unter Einsatz eines geeigneten Filters ermöglicht die Visualisierung von markierten Zellen. Unmarkierte Zellen fluoreszierten unter diesen Bedingungen nicht.
Die Spezifitäten der monoklonalen und polyklonalen Antikörper in Bezug auf andere fadenförmige und nicht-fadenförmige Bakterien, die häufig in Abwasseraufbereitungsanlagen vorzufinden sind, werden untersucht. Escherichia Coli-Kulturen (NCIMB Typ Strang 11943), Haliscomenobacter hydrossis (ATCC 27775), Sphaerotilus natans (NCIMB 11196), Thiothrix spp. Isolat (bereitgestellt durch R. Brigmon, Westinghouse Savannah River Company, South Carolina, US, isoliert aus Orange Springs, Florida), Gordonae amarae (nocardia arnarae NCIMB 11222), Propionibacterium acnes (Typ 1 und 2), Rhodococcus MJL100 (NCIMB 12038) und Lactobacillus plantarum wurden untersucht. Keines zeigte eine bedeutende Kreuzreaktivität im Anschluss an Immunfluoreszenzmikroskopie.
B. Nachweis von M. parvicella in Proben
Das verwendete Assay wird nach dem von Ramage et al. (1998) beschriebenen ausgeführt:

1. Lufttrocknen einer 30 μm Probe auf einem Teflon beschichteten Multiwell-Objektträger (ICN-Flow Laboratories, Vereinigtes Königreich).
2. Zum Fixieren der Zellen auf dem Objektträger können zwei Verfahren gleichermaßen verwendet werden. Entweder werden sie bei 4°C in 4% Formaldehyd (in physiologisch gepufferter Kochsalzlösung (PBS)) fixiert, gefolgt von Dehydration in eiskaltem absoluten Alkohol für 10 Minuten. Oder Fixieren von luftgetrockneter klebriger Substanz in eiskaltem Methanol für 10 Minuten. In beiden Fällen wird der Objektträger vor der Lagerung oder Verwendung luftgetrocknet.
3. Auftragen von 30 μl Antikörperlösung auf die luftgetrocknete klebrige Substanz (bei passender Verdünnung) und Inkubieren bei 37°C für 45 Minuten.
4. Abwaschen des Antikörpers, Waschen in PBS für 30 Minuten.
5. Auftragen des sekundären fluoroszenz-markierten (z. B. FITC) Anti-Maus-Ziegenantikörpers (Biorad, USA) und 45-minütiges Inkubieren wie zuvor. Wiederholtes 30-minütiges Waschen.
6. Anbringen des Objektträgers und Betrachten mit einem Epifluoreszenzmikroskop oder ähnlichem. Fadenförmige M. parvicella-Zellen fluoreszieren gemäß der verwendeten Fluoreszenzmarkierung und dem verwendeten Filter.

Andere Verfahren können in der Art des verwendeten markierten sekundären Antikörpers abweichen oder alternativ können die Anti-M. parvicella-Antikörper direkt mit einer geeigneten chemischen Kennzeichnung gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren markiert werden. Zur durchflusszytometrischen Analyse (d. h. computergesteuerte Analyse von Fluoreszenzpartikeln, die einen Laser passieren) kann der markierte Antikörper auch direkt auf eine Probe aufgetragen werden.
Vermutliche Microthrix parvicella-Fäden wurden in einer Reihe von Proben aus petrochemischem Abfall, kommunalen Kläranlagen und Fischereiabfall unter Verwendung der zuvor genannten Immunfluoreszenz nachgewiesen. In einer Reihe von Proben (andere Abwasseraufbereitungsanlagen, andere petrochemische Anlagen, pharmazeutischer Anlagenabfall), die zuvor für frei von M. parvicella befunden wurden, wurden keine Fluoreszenzfäden nachgewiesen.
Die folgenden Figuren stellen den Nachweis natürlicher Populationen von M. parvicella-Populationen in Abwässern durch die Immunfluoreszenzmikroskopie dar.
4a bis 4c zeigen eine Probe kommunalen Abfalls, die mit einem FITC-markierten Cocktail der beschriebenen monoklonalen Antikörper und TRITC-markierten Antikörper sondiert wurde. Es werden identische Ansichten unter sowohl dem Phasenkontrast als auch der UV-Anregung gezeigt (das UV-Anregungsbild zeigt als M. parvicella identifizierte Fluoreszenzfäden). In beiden Fällen sieht man die selben Fäden fluoreszierend.
5a, 5b, 6a, 6b, 7a und 7b zeigen eine Probe kommunalen Abfalls, die mit einem FITC-markierten monoklonalen Antikörper (MP2C11, MP4B5 bzw. MP5B106A) sondiert wurde; sowohl der Phasenkontrast als auch die fluoreszierenden Ansichten werden gezeigt. Fluoreszierende Fäden wurden als M. parvicella identifiziert.
8a und 8b zeigen pharmazeutischen Abfall, bei dem zuvor festgestellt wurde, dass er keine M. parvicella enthält, die mit einem FITC-markierten monoklonalen Antikörper-Cocktail, wie zuvor beschrieben, sondiert wurden. Nicht-Microthrix-Fäden zeigen keine Fluoreszenz.
9a bis 9d zeigen die Fähigkeit des polyklonalen Antikörpers, verschiedene Wachstumsstadien von M. parvicella in situ zu unterscheiden. In zwei Proben kommunalen Abfalls unterscheiden sich die Stufen der Fluoreszenz, wobei sie sich nur durch ihren relativen Sauerstoffgehalt differenzieren. Dies deutet an, dass die Präsentation einiger der Epitope durch das Wachstumsstadium des Bakteriums beeinflusst wird.
Die Fluoreszenz-Markierung der Bakterien verbessert die Anwendbarkeit der digitalen Bildanalyse unter Verwendung von im Handel erhältlicher Software wie beispielsweise PC Image (Foster Findlay Associates) oder ähnlichem, die das Auszählen von Unterpopulationen ermöglicht, außerordentlich.
Zur durchflusszytometrischen Analyse (d. h. computergesteuerte Analyse von Fluoreszenzpartikeln, die einen Laser passieren) kann der fluoreszenzmarkierte Antikörper auch direkt auf eine Probe aufgetragen werden (Leiserson, 1985).
Andere anwendbare mikroskopische Verfahren können in der Art des verwendeten markierten sekundären Antikörpers abweichen oder alternativ kann der Anti-M. parvicella-Antikörper direkt mit einer geeigneten chemischen Kennzeichnung gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren markiert werden. Derartige Abweichungen umfassen Folgendes:

i) Immunogold- oder Immunosilber-Markierung, tauglich für herkömmliche Lichtmikroskopie.
ii) Meerrettich-Peroxidase und alkalische Phosphatase mit einem Festsubstrat können ebenfalls verwendet werden, um eine gefärbte Markierung zu erzeugen, wenn an einem sekundären Antikörper gebunden.
iii) Radioaktiv markierte sekundäre Antikörper können ebenfalls verwendet werden, und Zellen, die durch Mikroautoradiographie sichtbar gemacht werden.

C. Immunmagnetische Trennung
Eine weitere Anwendung ist die Inkorporierung in eine im Handel erhältliche immunmagnetische Trennung. In diesem Fall ist der Antikörper an eine Kunststoffperle mit einem Eisenkern gebunden. Zielzellen verbinden sich mit dem anhaftenden Antikörper. Die Perlen mit den anhaftenden Zellen können dann durch Verwendung eines Magneten von der Probe entfernt werden. Dieses Verfahren kann für das Entfernen von M. parvicella aus einer Probe zu Forschungszwecken verwendet werden.
Zielzellen oder -Extrakt können auf eine taugliche Membran konzentriert werden (z. B. Nitrocellulose). Anschließend wird der Antikörper aufgetragen, inkubiert, der Überschuss ausgewaschen, gefolgt von einem sekundären Antikörper, der entweder mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiert ist. In Gegenwart eines tauglichen Festsubstrats und unter Befolgung eines vorgeschriebenen Inkubierungsschrittes werden die Zielzellen unter Verwendung eines tauglichen Kolorimeters farbmetrisch markiert und quantifiziert.
Literaturnachweis

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Claims

Ein Verfahren zum Nachweisen von Microthrix parvicella, wobei das Verfahren den Schritt beinhaltet, M. parvicella mit Antikörpern, die eine Spezifität für M. parvicella aufweisen, reagieren zu lassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das einen Immunoassay und/oder mikroskopische Mittel beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Antikörper mit Fluoreszenzstoffen oder Enzymen konjugiert oder indirekt durch die Verwendung eines sekundären konjugierten Antikörpers markiert sind, um eine selektive Sichtbarmachung der Zellen von M. parvicella zu ermöglichen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner einen Schritt umfasst, um M. parvicella zu isolieren.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Antikörper an (eine) Eisen-/Polystyrol-Perle(n) gebunden sind, um eine immunmagnetische Trennung zu erlauben.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei M. parvicella in einem wässrigen System nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper aus mindestens zwei monoklonalen Antikörpern besteht.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper von der Zell-Linie MP5B106A, die an der European Collection of Cell Cultures (Europäische Zellkultursammlung) am 30. November 1999 unter der Zugangsnummer 99113020 hinterlegt worden ist, herleitbar ist.
Verfahren zum Nachweisen von Microthrix parvicella gemäß Anspruch 1 in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Anwenden von Antikörpern, die Microthrix parvicella spezifisch an die Probe binden, Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung der Antikörper in der Probe, wobei die Bindung der Antikörper auf die Anwesenheit von Microthrix parvicella hinweist.
Zell-Linie MP5B106A, hinterlegt an der European Collection of Cell Cultures am 30. November 1999 unter der Zugangsnummer 99113020.
Antikörper, produziert von der Zell-Linie gemäß Anspruch 11.
Antikörper gemäß Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Ein Cocktail von Antikörpern, der aus mindestens zwei monoklonalen Antikörpern besteht und mindestens einen monoklonalen Antikörper umfasst, der von der Zell-Linie gemäß Anspruch 11 zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 produziert worden ist.