DE69919512T2

DE69919512T2 - Verfahren zur bestimmung von protheseinfektionen

Info

Publication number: DE69919512T2
Application number: DE69919512T
Authority: DE
Inventors: Cristina Maria THALLER; Gianmaria Rossolini; Laura Selan; Claudio Passariello
Original assignee: Bracco SpA
Current assignee: Bracco SpA
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: US7807395B2; US20020197280A1; AU2520299A; NO325631B1; CA2319575C; EP1053474A1; ES2228007T3; JP2002502978A; NO20003919L; EP1053474B1; JP4934729B2; ITMI980197A1; IT1298539B1; IL137439A0; WO1999040440A1; NO20003919D0; CA2319575A1; JP2010145416A; DK1053474T3; DE69919512D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur Bestimmung der Prothese-Infektionen, bei denen mindestens ein Staphylococcus-Stamm involviert ist. Das Verfahren beruht auf der Detektion von Antikörpern, die mit einem Schleim-Polysaccharid reagieren, gebildet durch virulente Staphylococcus-Stämme, aus Blutproben oder anderen biologischen fluiden Proben.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, das bei dem obigen Verfahren verwendet werden kann, ausgehend von Kulturen von virulenten Staphylococcus-Stämmen, wie auch das Polysaccharid selbst, das bei dem genannten Verfahren erhalten wird.
Prothese-Infektionen sind ein ernstes Problem bei der all– gemeinen Chirurgie, bei kardiovaskulärer Chirurgie, in der Orthopädie, der Ophtalmologie und der Odontologie, alle Sektoren, bei denen die Einführung von Biomaterialien routinemäßig geworden ist. Prothetische Vorrichtungen werden vielfach in der Onkologie für künstliche Ernährung und in der Chemotherapie verwendet.
Die meisten signifikanten Aspekte von Prothese-Infektionen sind die Folgenden:

– ihr Auftreten wird im Allgemeinen in 2 bis 6% der Fälle angegeben, gefolgt auf die erste Einführung des Biomaterials;
– wenn ein Biomaterial durch ein neues ersetzt wird, ist als Konsequenz der Infektion das Auftreten von Re-Infektionen ungefähr 60%;
– die Infektionen können einen funktionellen Verlust von Organen oder ihrer Teile oder sogar einen Tod der Patienten in 25 bis 45% der Fälle verursachen, obgleich in einigen Fällen, wie bei der Herzchirurgie, die Mortalität wesentlich höher ist und auf einigen Gebieten der Medizin, beispielsweise der Odontologie, keine Mortalität mit Prothese-Infektionen assoziiert ist;
– der Krankenhausaufenthalt der Patienten ist oft lang und teuer;
– die Diagnose dieser Infektion ist schwierig wegen der fast vollständigen Abwesenheit spezifischer klinischer Anzeichen;
– der größere Teil dieser Infektion (über 85%) wird durch Koagulase-negative Staphylococci (und in geringerem Ausmaß durch Koagulase-positive Staphylococci) verursacht, obgleich andere Mikroorganismen, wie enterische Bakterien, Pseudomonae und Enterococci, ebenfalls in verschiedenen Fällen isoliert werden können (häufig in Assoziierung mit mindestens einem Staphylococcus-Stamm).

Während diese Infektionen auftreten, sind die Bakterien stark an die Oberfläche der Biomaterialien geklebt und bilden Kolonien, die im Verlauf der Zeit Biofilme bilden, die fast die gesamte Oberfläche des Biomaterials bedecken und somit einer Gewebeintegration entgegenstehen.
Nach der Adhäsion erleiden die Bakterien wichtige metabolische Modifizierungen, ihre Replikationsrate wird verringert, obgleich sie eine hohe biosynthetische Aktivität beibehalten. Die Hauptprodukte dieser Aktivität sind extracelluläre Polysaccharide (im Allgemeinen als Schleim angegeben), die eine dicke und dichte faserartige Schicht bilden und die Bakterienzellen vor Chemikalien, Bestrahlungen, Phagozyten und Antikörpern schützen.
In Schleim eingebettete Bakterien, die auf Biomaterialien wachsen, zeigen, wenn sie Antibiotika ausgesetzt sind, minimale inhibitorische und minimale bakterizide Konzentra tionen, die selbst hunderte Male höher sein können als die entsprechenden werte, die erhalten werden, wenn Bakterien in Abwesenheit von Biomaterial gezüchtet werden.
Wenn ein Biofilm eine bestimmte kritische Masse erreicht, setzt er in die umgebende flüssige Umgebung kleine Aggregate von Bakterienzellen frei, die sich bewegen können und neue Oberflächen von dem Biomaterial kolonisieren.
Prothese-Infektionen sind häufig durch mangelnde und nicht-spezifische klinische Anzeichen gekennzeichnet, die sehr oft mit kleinen viralen Episoden verwechselt werden und die nach einer üblichen Antibiotika-Therapie verschwinden um sich nach einiger Zeit wieder zu manifestieren. Diese Episoden sind im Allgemeinen auf die Freisetzung kleiner Bakterienaggregate aus dem Biofilm zurückzuführen, die, wenn sie im Blut zirkulieren, leicht durch die Immunabwehr des Wirts erkannt werden und Fieber verursachen und die, indem sie in Planktonform sind, leicht durch übliche Antibiotika abgetötet werden, wodurch die Beseitigung der Infektion nachgeahmt wird. Klinische Anzeichen werden in den fortgeschrittenen Phasen der Infektion offensichtlich mit der Bildung von Schwellungen des weichen Gewebes, welches das Transplantat umgibt, oder von Fisteln oder offensichtlichen Anzeichen einer allgemeinen Gesundheitsgefährdung, erhalten.
Bedingt durch diese besonderen Eigenschaften ist eine frühe Diagnose extrem schwierig, auch als Folge von dem hohen Auftreten falsch negativer Ergebnisse, die auf mikrobiologische Kulturanalysen folgen, abhängig von der Tatsache, dass sessile Bakterien sich nicht leicht an in vitro-Kulturbedingungen anpassen können.
Bis heute hat die Diagnose von vaskulären Implantatinfektionen auf der Analyse objektiver klinischer Parameter, Blutparameter und Instrumentenwerten, erhalten durch Ultrasonographie, Computertomographie, magnetische Resonanz, Ösophago-Gastro-Duodenoskopie und Szintigraphie, gefolgt auf die Injektion radioaktiv-markierter Leukozyten, beruht. Dieser Weg kann in den meisten Fällen nicht die frühen Phasen einer Infektion zeigen wegen der ungenügenden Empfindlichkeit oder dem Fehlen gut definierter Kriterien für die Deutung der werte und Bilder.
Insgesamt sind die tatsächlichen Diagnosemöglichkeiten vollständig ungenügend, insbesondere in der frühen Phase der Krankheit, die für eine erfolgreiche Therapie günstiger ist.
Karamanos N.K. et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 342, Nr. 2 (1997), S. 389-395, beschreiben ein 20-kDa-Polysaccharid von Staphylococcus epidermidisextracellulärem Schleim, das durch Antikörper erkannt wird, die einen statistisch signifikanten Unterschied in dem Grad der Reaktivität unter S. epidermidis und anderen Staphylococcus-Spezies zeigen.
In der GB 992 132 werden Polysaccharidverbindungen beschrieben, die gegen Infektionen durch unterschiedliche Stämme von Staphylococcus aureus immunisieren können. Die Polysaccharide können durch Erhitzen des Phenol-unlöslichen, wasserunlöslichen festen Materials, erhalten durch Extraktion bestimmter Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol in einem wässrigen Lösungsmittel, mit verdünnter Essigsäure hergestellt werden.
Die WO 90/03398 beschreibt ein Kapsel-Polysaccharid-Adhesin-Antigen, isoliert aus dem Schleim von Stämmen von pathogenem S. epidermidis, und Antikörper, die dagegen gezüchtet wurden, die diagnostisch zum Nachweis mit größerer Genauigkeit der Anwesenheit von Staphylococcus epidermidis-Stämmen unter der allgemeinen Population von Bakterien verwendet werden können.
Es wurde jetzt ein verlässliches und nicht teures Verfahren gefunden, das Gegenstand der Erfindung ist, das leicht mit Serumproben oder anderen biologischen Fluiden durchgeführt werden kann und mit dem die Anwesenheit von Infektionen, bei denen Prothese-Vorrichtungen involviert sind, selbst in der frühen Phase der Entwicklung nachgewiesen werden kann. Dieses Verfahren kann routinemäßig durch konstantes Überwachen der Patienten, die mit der Einführung von irgendeiner Prothese-Vorrichtung behandelt wurden, und bei denen das Risiko der Infektion besteht, insbesondere verursacht durch Staphylococci, durchgeführt werden.
Dieses Verfahren umfasst die quantitative Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern, spezifisch gerichtet gegen extracelluläre Polysaccharide, extrahiert aus virulenten Staphylococci-Stämmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung dieser extracellulären Polysaccharide aus auf geeignete weise gezüchteten Staphylococcus-Zellen.
Staphylococcus-Stämme, die für dieses Verfahren verwendet werden können, sind sowohl Koagulase-negative als auch -positive, entweder virulente oder solche, die Schleim bilden. Insbesondere sind virulente Staphylococcus epidermidis- oder Staphylococcus aureus-Stämme bevorzugt.
Diese Stämme können entweder direkt von Patienten, die an Prothese-Infektion leiden oder aus Standardkultursammlungen der Bezugsstämme erhalten werden. Die Charakteristika eines solchen typischen Stamms werden in dem folgenden Beispiel 1 angegeben. Die Versuche waren ebenfalls aufschlussreich, wenn sie unter Verwendung von einem Staphylococcus aureus-Stamm, hinterlegt von der Anmelderin bei DSMZ Nr. 111942, durchgeführt wurden.
Bakterien werden in einem flüssigen Medium, das von Hussain et al., J. Med. Microbiol. 34:143-147, 1991 (HHW-Medium) beschrieben wird, mit einigen Modifizierungen, wie im folgenden Beispiel 2 berichtet, gezüchtet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Polysaccharide umfasst im wesentlichen die folgenden Stufen:

a) Züchten eines Schleim-erzeugenden virulenten Staphylococcus epidermidis- oder aureus-Stamms in modifiziertem HHw-Medium während einer Zeit von 4 bis 6 Tagen;
b) Homogenisierung der Bakterienzellen in einem physiologischen Puffer;
c) Zentrifugieren bei 13.000 × g während 15 Minuten und Abtrennen des Überstands;
d) Entsalzen durch Dialyse des Überstands unter Verwendung von Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 12 kDa;
e) Gefrieren und Lyophilisierung der bei (d) erhaltenen Lösung;
f) Suspendieren des lyophilisierten Materials in einer Entproteinisierungslösung, beispielsweise Trichloressigsäure;
g) Zentrifugieren bei 30.000 × g der bei (f) erhaltenen Lösung und Abtrennen des Überstands unter Zugabe von Ethanol;
h) Zentrifugieren des Überstands der Stufe (g) bei 20.000 × g, wobei das Polysaccharid erhalten wird;
i) Waschen des präzipitierten Polysaccharids mit absolutem Ethanol, Dehydratisierung im Vakuum und Suspension in sterilem H₂O.

Die quantitative Bestimmung des gereinigten Polysaccharids kann beispielsweise gemäß dem Verfahren, beschrieben von Pelkonen et al., Journal of Bacteriology 170, 2646, 1988, durchgeführt werden.
Das nach dem obigen Verfahren erhaltene Polysaccharid wird in dem Assay zur Bestimmung der Antikörper in Serum oder anderen biologischen Fluiden aus Patienten, die eine Prothese-Vorrichtung eingesetzt haben, verwendet.
Bevorzugt wird bei dem Assay die Anwesenheit von Antikörpern der Klasse IgG oder IgM bestimmt, wobei bekannte immunochemische Verfahren verwendet werden, beispielsweise der Enzym-gebundene Immunoadsorbens-Assay (ELISA), die Gelimmunpräzipitation, die Immundiffusion oder die Gegen-Immun-Elektrophorese, der Radioimmunassay, die Komplementfixierung und passive Hämoagglutination.
Ein Festphasen-verfahren ist bevorzugt, in dem das Polysaccharid an einer festen Oberfläche immobilisiert ist, wie beispielsweise Mikrotitervertiefungen, und dann kann die Reaktion mit der Probe erfolgen bei Bedingungen, die für die Bildung des Immunkomplexes geeignet sind. Nachdem der Immunkomplex einmal gebildet wurde, kann er durch Umsetzung mit geeigneten Molekülen, beispielsweise Antikörpern oder ihren immunkompetenten Fragmenten, markiert mit radioaktiven Isotopen, mit chemilumineszierenden oder fluorogenen Substanzen gezeigt werden oder er kann mit Enzymen, die kolorimetrische Reaktionen katalysieren, und anderen ähnlichen Substanzen gekuppelt werden.
Die Wirksamkeit des durch die Erfindung beschriebenen Verfahrens wurde durch die folgenden Experimente bestätigt.
Bei einem ersten Satz von Experimenten wurden Seren von 15 Patienten mit vaskulärer Implantat-Infektion analysiert. Die Anwesenheit der Prothese-Infektion in diesen Patienten wurde durch mikrobiologische Analyse von Proben sowohl aus den Periprotese-Geweben und den Implantaten selbst nach ihrem chirurgischen Ersatz bestätigt. Mindestens ein Staphylococcus-Stamm wurde aus jeder Probe isoliert.
von diesen 15 Patienten zeigten 11 offensichtliche klinische Anzeichen einer Infektion, während 4 nur nichtspezifische Anzeichen einer Infektion zeigten, aber bei der Szintigraphie nach der Infektion von ^99mTc-markierten Leukozyten positiv waren.
Seren von 10 erwachsenen Personen, gesunde Personen beiderlei Geschlechts, wurden als negative Kontrollen verwendet.
Die Reaktivität dieser Seren wurde in einem ELISA-Format analysiert, und zwar gegenüber:

a- monospezifischen Biofilmen, gebildet durch unterschiedliche Staphylococcus-Stämme (sowohl klinische Isolate als auch Vergleichsstämme), gebildet auf kleinen Polypropylenzylindern (0,5 × 1 mm);
b- polyspezifische Biofilme, gebildet durch unterschiedliche Staphylococcus-Stämme (sowohl klinische Isolate als auch Vergleichsstämme), gebildet auf kleinen Polypropylenzylindern (0,5 × 1 mm);
c- Oberflächenproteinen, extrahiert aus Kulturen unterschiedlicher Staphylococcus-Stämme;
d- den Polysacchariden, beschrieben in der vorliegenden Erfindung, extrahiert aus Kulturen von Staphy– lococcus aureus DSM 11942 und von Staphylococcus epidermidis SA 1545 (vergleiche Beispiel 1 für die Charakterisierung dieser Stämme).

Die Versuche ergaben die folgenden Ergebnisse:

a- sowohl die IgG- als auch IgM-Antikörpertiter gegenüber monospezifischen oder polyspezifischen Staphylococcus-Biofilmen oder Staphylococcus-Oberflächen und sekretorischen Proteinen waren nicht signifikant unterschiedlich bei infizierten und nichtinfizierten Patienten;
b- sowohl die IgG- und IgM-Antikörpertiter gegenüber dem Staphylococcus-Polysaccharid der Erfindung waren signifikant unterschiedlich bei infizierten und nicht-infizierten Patienten; sie erlaubten weiterhin die Differenzierung zwischen offensichtlich symptomatisch infizierten Patienten und paucisymptomatischen, Szintigraphie-positiven Patienten.

Tabelle 1. Bereich, Mittelwerte und Standardabweichung sowohl für IgG- als auch IgM-Titer, erhalten in ELISA-Assays, durchgeführt an Serumproben von 11 Patienten mit einer symptomatischen vaskulären Implantatinfektion, 4 Patienten mit pauci-symptomatischer vaskulärer Implantatinfektion, aber positiv bei der Szintigraphie nach der Injektion von ^99mTc-markierten Leukozyten und 10 gesunden Vergleichspersonen unter Verwendung des Polysaccharids, extrahiert aus Kulturen von S. aureus DSM 11942, um Mikrotitervertiefungen zu sensibilisieren.
Tabelle 2. Bereich, Mittelwerte und Standardabweichung von sowohl IgG- als auch IgM-Titern, erhalten in ELISA-Assays, durchgeführt an Serumproben von 11 Patienten mit symptomatischer vaskulärer Implantatinfektion, 4 Patienten mit pauci-symptomatischer vaskulärer Implantatinfektion, aber positiv bei der Szintigraphie nach der Injektion von ^99mTc-markierten Leukozyten und 10 gesunden Kontrollpersonen unter Verwendung des Polysaccharids, extrahiert aus Kulturen von S. epidermidis SA 1545, um Mikrotitervertiefungen zu sensibilisieren.
In einem zweiten Satz von Experimenten wurde eine große Zahl an Seren zur Bestimmung von sowohl IgG- als auch IgM-Titern gemäß ELISA-Test analysiert, wobei diese durchgeführt wurden und nur Polysaccharide der Erfindung zur Sensibilisierung der Mikrotitervertiefungen verwendet wurden. während dieser gesamten Versuche wurde Polysaccharid, extrahiert aus dem Stamm SA 1545 (wie in Beispiel 1 beschrieben), verwendet.
Insgesamt 97 Seren wurden bei diesen Versuchen geprüft. von diesen 97 Seren wurden 19 aus Kontrollpatienten, die nicht infiziert waren, erhalten und die kein vaskuläres Implantat trugen, 3 wurden aus Kontroll-Patienten erhalten, die nicht infiziert waren, die aber ein vaskuläres Implantat trugen, und 5 wurden aus Patienten erhalten, die ein vaskuläres Implantat, infiziert mit Gram-negativen Bakterien, trugen, 13 wurden aus Patienten erhalten, die nicht infiziert waren, aber ein vaskuläres Implantat trugen und mit vorheriger Diagnose von vaskulärer Implantatinfektion, verursacht durch Staphylococcus spp., und 57 wurden aus Patienten erhalten, die ein vaskuläres Implantat trugen, infiziert durch Staphylococcus spp.
Sowohl IgG- als auch IgM-Titer wurden in allen diesen Seren unter Verwendung von 1/160- und 1/320-Verdünnungen von Seren bestimmt; zwei Sätze von Duplikat-Bestimmungen wurden sichergestellt um Intra-Versuchs- und Inter-versuchs-Reproduzierbarkeit des Assays zu bestimmen. Die ELISA-Assays wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse, die bei diesem zweiten Satz von Experimenten erhalten wurden, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3. Ergebnisse der enzymgebundenen Immunosorbens-Assays (ELISA), durchgeführt unter Verwendung des Polysaccharidpräparats aus S. epidermidis SA 1545 an 97 Serumproben.
Die IgM-Titer von jeder Serumprobe, die für die statistische Bewertung verwendet wurden, waren Mittelwerte für vier unterschiedliche Bestimmungen, erhalten bei zwei unterschiedlichen Versuchen. Die IgG-Titer von jeder Serumprobe, die für die statistische Bewertung verwendet wurden, waren Mittelwerte für zwei Bestimmungen, erhalten in einem Versuch.
Die Ergebnisse aus dem Student-T-Test für den vergleich mit IgM-Titern, gemessen bei einer Serumverdünnung = 1:160: A(A1 + A2) vs. D: p = 1,7 × 10-15. B vs. D: p = 2,0 × 10-4. C vs. D: p = 7,2 × 10-8. A + B + C vs. D: p = 5,3 × 10-23. A + C vs. B: p = 0,142. A vs. C: p = 2,07 × 10-11.
Die Ergebnisse aus dem Student-T-Test für den Vergleich mit IgG-Titern, gemessen bei einer Serumverdünnung = 1:320: A(A1 + A2) vs. D: p = 4,5 × 10-21. B vs. D: p = 7,5 × 10-8. C vs. D: p = 8,0 × 10- 7. A + B + C vs. D: p = 3,1 × 10-21. A + C vs. B: p = 0,265. A vs. C: p = 0,024.
Kommentare

• Die Antikörpertiter, nachweisbar gegenüber dem Schleim-Polysaccharid (SP) von S. epidermidis SA 1545, zeigten signifikante Unterschiede in Gruppen der unterschiedlichen Personen gemäß ihrer klinischen Diagnose.
• Signifikant höhere Antikörpertiter gegenüber SA 1545-SP wurden in Patienten festgestellt, die vaskuläre Implantate trugen, infiziert durch Staphylococcus spp., verglichen mit: i) Kontrollpersonen ohne Diagnose einer solchen Infektion, die entweder ein vaskuläres Implantat trugen oder nicht; ii) Patienten, die ein vaskuläres Implantat trugen, infiziert mit Gram-negativen Bakterien; iii) Personen, die ein vaskuläres Implantat trugen, aber nicht infiziert waren, von denen aber eine frühere Diagnose von vasku lären Implantatinfektionen durch Staphylococcus spp. beschrieben wurde. Diese Werte zeigen insgesamt, dass die vaskuläre Implantatinfektion, verursacht durch Staphylococcus spp., eine spezifische humorale Immunantwort gegenüber SP hervorruft und dass diese Antwort durch Enzymimmunoassays unter Verwendung einer festen Phase, sensibilisiert mit SA1545 SP-Präparat, wie in der Patentanmeldung beschrieben, nachgewiesen werden kann.
• Analyse des isotypischen Ansprechens Anti-SA 1545 SP bei den obigen Gruppen von Personen zeigte signifikante Unterschiede sowohl von IgM- als auch von IgG-Antikörper-Titern. Die IgM-Titer stehen in enger Beziehung mit dem Zustand der aktiven Infektion, verursacht durch Staphylococcus spp.

Die Existenz eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen Titern von infizierten und nicht-infizierten Patienten erlaubt die Aufstellung eines Brechpunktswertes, über den es möglich ist, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Existenz eines Infektionsvorgangs zu definieren. Es ist weiterhin möglich, dieses Verfahren zu verwenden um den Patienten nach dem Einsatz des Implantats zu überwachen und den Antikörper-Titer, der zum Zeitpunkt der Implantierung verwendet wurde, als spezifischen Vergleichswert bei den folgenden Untersuchungen zu verwenden.
Es scheint so zu sein, dass das oben beschriebene Verfahren verschiedene Vorteile hat, verglichen mit bekannten diagnostischen verfahren auf diesem Gebiet, da es leicht durchzuführen ist, billig ist und erlaubt, zuverlässige Ergebnisse zu erhalten (ohne das Erfordernis invasiver Verfahren), selbst in den frühen Phasen der Infektion, wenn alle anderen verfügbaren verfahren häufig versagen, klare diagnostische Informationen zu geben; dieses Verfahren erlaubt weiterhin die periodische Beobachtung von Patienten für das Auftreten latenter Infektionen und kann verlässliche Informationen bei therapeutischen Verläufen geben.
Die Erfindung betrifft schließlich einen Kit für die Durchführung des Assays, der das Polysaccharidpräparat, Standard-Antikörper und Reagentien für die Detektion in geeigneten Behältern zusammen mit Trägern, Exzipientien und Additiven, wie Konservierungsmittel und Stabilisatoren, umfasst.
Bevorzugt wird der Kit Mikrotiterstreifen, prä-sensibilisiert mit dem Antigen zusammen mit positiven und negativen Vergleichsseren (mit ihren ursprünglichen Titern) enthalten.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Charakterisierung eines Bakterienstamms, der für den Assay geeignet ist.
Ein Staphylococcus epidermidis-Stamm, bezeichnet mit SA 1545 – mit dem numerischen Code 6704773, wenn er für die Identifizierung getestet wurde mit dem API 20-STAPH-Identifizierungssystem, wurde aus Aorta-bifemoralem Implantat, explantiert aus einem erwachsenen Mann, isoliert.
Das Isolat zeigte einen offensichtlichen Dimorphismus von Kolonien, wenn es auf Columbia-Agarplatten gezüchtet wurde, supplementiert mit 5%igem defibriniertem Schafsblut. Es war negativ für die Mannitfermentierung, wenn es auf Mannit-Salzagar mit Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm oder weniger nach 18 h Inkubation bei 37°C gezüchtet wurde.
Das Isolat war empfindlich gegenüber den folgenden Antikörpern, analysiert unter Verwendung eines Kirby-Bauer-Assays: Gentamycin, Vancomycin, Ofloxacin, Erytromycin, Imipenem, Cephalotin, Amoxicillin+Clavulansäure, Cefoperazon.
Das biochemische Muster des Isolats ist wie folgt:
In vielen anderen Fällen wurden die Stämme, die ähnliche Eigenschaften zeigten und gleichermaßen für den erfindungsgemäßen Assay verwendet werden können, isoliert.
Beispiel 2
Herstellung des Kulturmediums

Das Kulturmedium enthält die folgenden Verbindungen pro 1 Liter:

Na₂HPO₄(2H₂O)	10 g
KH₂PO₄	3 g
L-Asparaginsäure	150 mg
L-Alanin	100 mg
L-Arginin	100 mg
L-Cystin	50 mg
Glycin	100 mg
L-Glutaminsäure	150 mg
L-Hystidin	100 mg
L-Isoleucin	150 mg
L-Lysin	100 mg
L-Leucin	150 mg
L-Methionin	100 mg
L-Phenylalanin	100 mg
L-Prolin	150 mg
L-Serin	100mg
L-Threonin	150 mg
L-Tryptophan	100 mg
L-Tyrosin	100 mg
L-Valin	150 mg
Glucose	10 g
MgSO₄(7H₂O)	500 mg
Biotin	0,1 mg
Nicotinsäure	2 mg
D-Pantotensäure	2 mg
Pyridoxal	4 mg
Pyridoxamin	4 mg
Riboflavin	2 mg
Thiamin	2 mg
Adenin	20 mg
Guanin	20 mg
CaCl₂(6H₂O)	10 mg
MnSO₄	5 mg
(NH₄)₂SO₄FeSO₄(6H₂O)	6 mg

Die Zubereitung des Mediums entspricht der wie von Hussain, Hastings, White, J. Med. Microbiol. 34:143-147, 1991 beschrieben, mit den folgenden Modifizierungen, die das Präparat betreffen: nachdem alle Komponenten des Mediums abgewogen sind, wird MgSO₄(7H₂O) in destilliertem Wasser gelöst, dann werden alle verbleibenden Komponenten einzeln unter kontinuierlichem Schütteln zugegeben. L-Cystidin muss vor der Zugabe zu dem Medium in 2-3 Tropfen 5N NaOH gelöst werden.
Nachdem alle Komponenten gelöst sind (obgleich eine kleine Menge an Präzipitat vorhanden sein kann), wird das Volumen auf 1 l mit destilliertem Wasser eingestellt und durch Filtration durch poröse 0,2 μm-Membranen sterilisiert.
Beispiel 3
Herstellung des Polysaccharids
Stämme werden in 1000 ml modifiziertem HHW-Medium während 6 Tagen bei 37°C unter Schütteln gezüchtet.
Das bakterielle Pellet wird durch Zentrifugation bei 13.000 × g während 15 Minuten bei 4°C gesammelt, in 20 ml steriler eiskalter physiologischer Salzlösung suspendiert (NaCl 0,9%) und bei -20°C 2 h gefroren. Die Bakteriensuspension wird dann bei Raumtemperatur aufgetaut und 10mal während 30 Sekunden mit 30-Sekunden-Intervallen homogenisiert.
Das Homogenat wird dann bei 13.000 × g während 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert; der entstehende Überstand wird bei 4°C gelagert, während die entstehenden Pellets erneut in 20 ml steriler eiskalter Salzlösung suspendiert und wie oben beschrieben homogenisiert wurden. Der Überstand, der bei der zweiten Homogenisierungsstufe erhalten wurde, wird zu dem zuvor erhaltenen gegeben und durch Dialyse gegen 1000 Volumen destilliertem Wasser bei 4°C während 2 h unter Verwendung von Dialysemembranen mit einer Ausschluss grenze von 12 kDa entsalzt. Die Probe wird dann bei -80°C gefroren, lyophilisiert, in 5% (Gew./vol.) Trichloressigsäure suspendiert und 15 Minuten bei 4°C inkubiert.
Die Probe wird dann bei 30.000 × g während 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert; 4 Volumina eiskaltes absolutes Ethanol werden dann zu dem Überstand gegeben, der weiter bei 4°C 48 h inkubiert wird. Das Massen-Polysaccharid wird dann durch Zentrifugierung bei 20.000 × g während 30 Minuten bei 4°C gesammelt, mit 0,5 Volumina eiskaltem absolutem Ethanol gewaschen, im Vakuum dehydratisiert und schließlich in 2 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Das wie oben beschrieben erhaltene Polysaccharid wird zur Sensibilisierung von Mikrotitervertiefungen nach geeigneter Verdünnung (typischerweise in 50 μl-Aliquots) verwendet.
Beispiel 4
Durchführung des ELISA-Assays
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 50 μl Polysaccharid, hergestellt gemäß Beispiel 3 und verdünnt 1/80 in sterilem destilliertem Wasser, sensibilisiert, auf geeignete weise abgedichtet und 18-24 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen geleert und 5mal mit 100 μ1 0,05% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen.
Die Vertiefungen wurden dann geleert, mit 200 μl l0%iger Sojamilch in PBS gesättigt, auf geeignete Weise abgedichtet und bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann geleert, wie oben beschrieben gewaschen und 50 μl Aliquots der verdünnten Seren wurden zugegeben. Die Seren umfassen einen nicht-positiven vergleich und einen negativen Vergleich, sie werden typischerweise 1/160 und 1/320 in PBS verdünnt. Nach der Zugabe der Seren werden die Ver tiefungen auf geeignete Weise abgedichtet und bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann geleert, wie oben beschrieben gewaschen und 50 μl entweder „Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-human IgG" (beispielsweise DAKO Code P0214) (verdünnt 1/15.000 in 10%iger Sojamilch in PBS) oder „Peroxidase-Conjugated Rabbit anti-Human IgM" (beispielsweise DAKO Code P0215) (verdünnt 1/1500 in 10%iger Sojamilch in PBS) wurden zugegeben. Die Vertiefungen wurden dann auf geeignete Weise abgedichtet, bei 37°C 1 Stunde inkubiert, geleert und wie oben beschrieben gewaschen.
Nach dem letzten waschen wurden 50 μl chromogenes Substrat für Peroxidase (beispielsweise BM Blue POD Substrat Boehringer Mannheim, Code 1484281) in jede Vertiefung gegeben.
Die Vertiefungen wurden dann 10 Minuten bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 μl 0,5N H₂SO₄ beendigt. Der OD_450nm-wert jeder Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Ablesegeräts unter Verwendung einer nicht-behandelten Vertiefung, enthaltend 100 μl 0,5N H₂SO₄, als Blindprobe bewertet.
Als allgemeine Regel sollte der OD_450nm-Wert für den positiven vergleich nicht über dem wert von 1,5 liegen.
wenn dies der Fall ist, muss der Assay wiederholt werden, wobei die Inkubationszeit des Peroxidasesubstrats verringert wird.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von prosthetischen Infektionen, bei denen mindestens ein Staphylococcus-Stamm involviert ist, das Detektieren von Antikörpern aus Blutproben oder aus Proben anderer biologischer Flüssigkeiten umfasst, wobei die Antikörper mit einem Polysaccharid reagieren, das durch die folgenden Schritte erhalten wird: a) Kultivieren eines Schleim-produzierenden, virulenten Staphylococcus epidermidis- oder aureus-Stamms in einem Medium mit HHW-Zusammensetzung über einen Zeitraum von vier bis sechs Tagen; b) Homogenisieren der Bakterienzellen in einem physiologischen Puffer; c) Zentrifugieren mit 13 000 × g für 15 Minuten und Abtrennen der Überstände; d) Entsalzen des Überstands durch Dialyse, wobei Membranen mit einem Cut off-Wert von 12 kDa verwendet werden; e) Gefrieren und Lyophilisieren der in (d) erhaltenen Lösung; f) Suspendieren des lyophilisierten Materials in einer entproteinisierenden Lösung; g) Zentrifugieren der in (f) erhaltenen Lösung mit 30 000 × g und Abtrennen des Überstands unter Zusatz von Ethanol; h) Zentrifugieren des Überstands von Schritt (g) mit 20 000 × g unter Erhalt des Polysaccharids; i) Waschen des präzipitierten Polysaccharids mit absolutem Ethanol, Dehydratisieren in Vakuum und Suspendieren desselben in sterilem H₂O.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Antikörper IgG oder IgM sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das in Form von ELISR, einer Gelimmunpräzipitation, Immundiffusion, Counterimmunelektrophorese, eines Radioimmunassays, einer Komplementfixierung vorliegt.
Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids aus Kulturen von Schleim-produzierenden, virulenten Staphylococcus epidermidis- oder aureus-Stämmen, das umfasst: a) Kultivieren eines Schleim-produzierenden, virulenten Staphylococcus epidermidis- oder aureus-Stamms in einem Medium mit HHW-Zusammensetzung über einen Zeitraum von vier bis sechs Tagen; b) Homogenisieren der Bakterienzellen in einem physiologischen Puffer; c) Zentrifugieren mit 13 000 × g für 15 Minuten und Abtrennen der Überstände; d) Entsalzen des Überstands durch Dialyse, wobei Membranen mit einem Cut off-Wert von 12 kDa verwendet werden; e) Gefrieren und Lyophilisieren der in (d) erhaltenen Lösung; f) Suspendieren des lyophilisierten Materials in einer entproteinisierenden Lösung; g) Zentrifugieren der in (f) erhaltenen Lösung mit 30 000 × g und Abtrennen des Überstands unter Zusatz von Ethanol; h) Zentrifugieren des Überstands von Schritt (g) mit 20 000 × g unter Erhalt des Polysaccharids; i) Waschen des präzipitierten Polysaccharids mit absolutem Ethanol, Dehydratisieren in Vakuum und Suspendieren desselben in sterilem H₂O.