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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Rasterkraftmikroskopie (RKM) und Vorrichtungen und Verfahren zur
effektiven Messung von intermolekularen Wechselwirkungen wie beispielsweise
Rezeptor/Ligand-, Antikörper/Antigen-
und DNA-Wechselwirkungen durch Rasterkraftmikroskopie.
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2. Beschreibung verwandter
Gebiete
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Bei herkömmlicher Rasterkraftmikroskopie wird
eine Probe mit einer auf einem Ausleger montierten Sonde mit feiner
Spitze abgetastet, und jede Auslenkung der Sondenspitze, die über die
Probe bewegt wird, wird gemessen, um die Topographie der Probe zu
bestimmen. Auslenkungen der Sondenspitze, wenn diese über die
Probenoberfläche
bewegt wird, können
mithilfe verschiedener Verfahren überwacht werden, einschließlich optischer
Reflexion, Interferometrie und piezoelektrischer Dehnungsmessverfahren.
Siehe beispielsweise das US-Patent mit der Register-Nr. 33.387 von
Binnig, US-Patent Nr. 5.144.833 von Amer et al., US-Patent Nr. 5.463.897 von
Prater et al., US-Patent Nr. Re. 34.489 von Hansma et al. und US-Patent
Nr. 5.260.824 von Okada et al.
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In den letzten Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie
dazu verwendet worden, Grenzflächeneigenschaften
und intermolekulare Wechselwirkungen, wie beispielsweise Elastizität, Reibung,
Adhäsion, Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen
und Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen
zwischen einzelnen Molekülen
zu messen. Um Bindungswechselwirkungen zwischen komplementären Liganden
und Rezeptoren zu messen, können
die Sondenspitze eines Auslegers und eine Probenoberfläche auf
verschiedene Weisen chemisch modifiziert werden, um die komplementären Liganden
und Rezeptoren aneinander zu binden. (Zur Vereinfachung wird/werden
die auf dem Ausleger oder ähnli chen
Strukturen immobilisierte(n) Verbindungen) hierin als "Bezugs"verbindung(en) und
die auf dem Proben-Trageelement oder der Probenoberfläche immobilisierte(n)
Verbindungen) als "Proben"-Verbindung(en) bezeichnet.) Die
Sondenspitze und Probenoberfläche
können dann
nahe zueinander oder in Kontakt gebracht werden, so dass ein Ligand
und ein Rezeptor wechselwirken oder eine Bindung ausbilden. Wenn
die Sondenspitze und Probenoberfläche dann getrennt werden, bricht
die Ligand-Rezeptor-Bindung zusammen, und das Ausmaß der Wechselwirkungskraft
zwischen dem Ligand und dem Rezeptor kann gemessen werden. Die Verwendung
von Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung intermolekularer Kräfte ist beispielsweise
in den folgenden Patenten und Veröffentlichungen beschrieben:
US-Patent Nr. 5.363.697 von Nakagawa; US-Patent Nr. 5.372.930 von
Colton et al.; Florin E.-L. et al., "Adhesion Forces Between Individual Ligand-Receptor
Pairs", Science
264, S. 415–417
(1994); Lee G. U. et al., "Sensing
Discrete Streptavidin-Biotin Interactions with Atomic Force Microscopy", Langmuir 10 (2),
S. 354–357
(1994); Dammer U. et al., "Specific
Antigen/Antibody Interactions Measured by Force Microscopy", Biophysical Journal
70, S. 2437–2441(Mai
1996); Chilikoti A. et al., "The
Relationship Between Ligand-Binding Thermodynamics and Protein-Ligand
Interaction Forces Measured by Atomic Force Microscopy", Biophysical Journal
69, S. 2125-2130
(Nov. 1995); Allen S. et al., "Detection
of Antigen-Antibody Binding Events with the Atomic Force Microscope", Biochemistry, Bd.
36, Nr. 24, S. 7457–7463
(1997); und Moy V. T. et al., "Adhesive
Forces Between Ligand and Receptor Measured by AFM", Colloids and Surfaces
A: Physicochemical and Engineering Aspects 93, S. 343–348 (1994).
Wenn Wechselwirkungen zwischen Molekülen in Flüssigkeiten untersucht werden,
können
die Versuchsbedingungen, wie beispielsweise pH, Puffer/Ionen-Konzentration,
Puffer/Ionen-Art, usw., variiert werden, um die Wirkung zu bestimmen,
die diese auf die Wechselwirkungskräfte haben.
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Rasterkraftmikroskopie besitzt großes Potenzial
zur Verwendung in Screening-Anordnungen für Verbindungen, wie beispielsweise
Bibliotheken von Verbindungen, die durch kombinatorische Verfahren
hergestellt wurden, um nützliche
Ligand/Rezeptor-Wechselwirkungen
zu identifizieren und nützliche
Medikamente zu entdecken. Moder ne Verfahren der kombinatorischen
Chemie, Parallelsynthese und Mikrolithographie ermöglichen
die Herstellung großer,
kompakter Bibliotheken von chemischen Analogen in räumlich ansteuerbaren
Anordnungen. Rasterkraftmikroskopie mit chemisch modifizierten Sondenspitzen
bietet eine Möglichkeit
zum Screenen dieser Anordnungen. Die Ausrüstung und Verfahren, die derzeit
für Rasterkraftmikroskopie
eingesetzt werden, sind jedoch für
wiederholte Messungen oder effizientes Screenen von großen Volumina
nicht geeignet. Vor allem sind chemisch modifizierte Ausleger-Sondenspitzen
zerbrechlich und können
leicht beschädigt
oder inaktiviert werden. Bei einer typischen chemisch modifizierten
Ausleger-Sondenspitze sind nur die Moleküle, die am äußersten Punkt der Spitze gebunden
sind, für
Kraftwechselwirkungen mit einem Substrat verfügbar. Der entscheidende Bereich
der Sondenspitze ist typischerweise sehr klein, und die Anzahl der
daran gebundenen Moleküle
ist sehr gering; wenn etwas passiert und diese wenigen Moleküle beschädigt werden,
der Zugang zu diesem kleinen Bereich der Sondenspitze blockiert
oder anderweitig inaktiviert wird, dann ist die Sondenspitze wertlos
und muss ausgetauscht werden. Ein Austausch der Sondenspitze erfordert
normalerweise den Austausch des gesamten Auslegers – ein teures und
zeitaufwendiges Verfahren. Darüber
hinaus bietet eine typische Ausleger-Sondenspitze nur einer einzigen
Bezugsverbindung Platz, die auf der Spitze immobilisiert wird, so
dass der Ausleger jedes Mal ausgetauscht oder modifiziert werden
muss, wenn gewünscht
wird, eine andere Bezugsverbindung einzusetzen.
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Die Erfindung ist durch die unabhängigen Ansprüche 1, 18
und 39 definiert.
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Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird
ein Proben-Trageelement für
Rasterkraftmikroskopie bereitgestellt, das eine Proben-Tragebasis
mit einer Vielzahl von Vorsprüngen
umfasst, wobei jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen
Substratbereich umfasst, der chemisch modifiziert worden ist, indem
darauf eine Probenverbindung oder eine Linkerverbindung immobilisiert
wurde, die eine Probenverbindung binden kann, worin die Probenverbindungen
oder Linkerverbindungen auf jedem der Vorsprünge gleich oder voneinander
verschieden sind.
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Gemäß einem zweiten Aspekt der
Erfindung wird eine Vorrichtung zum Messen einer Wechselwirkung
zwischen einer Bezugsverbindung und zumindest einer Probenverbindung
bereitgestellt, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst:
ein
Proben-Trageelement mit einer Vielzahl von Vorsprüngen, wobei
jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
umfasst, der chemisch modifiziert worden ist, indem darauf eine
Probenverbindung immobilisiert wurde, worin die Probenverbindungen
auf jedem der Vorsprünge
gleich oder voneinander verschieden sein können,
ein Bezugsverbindungs-Trageelement
mit einem Oberflächenbereich,
der chemisch modifiziert worden ist, indem darauf zumindest eine
Bezugsverbindung immobilisiert worden ist,
ein Mittel zur Steuerung
der relativen Position und Ausrichtung des Bezugsverbindungs-Trageelements und
des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und
Wechselwirkung zwischen der auf dem Oberflächenbereich des Bezugsverbindungs-Trageelements
immobilisierten Bezugsverbindung und der auf dem an der Spitze befindlichen
Substratbereich des ausgewählten
Vorsprungs immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, sowie
ein
Mittel zum Messen eines physikalischen Parameters, der mit der Wechselwirkung
zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung in Zusammenhang
steht.
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Gemäß einem dritten Aspekt der
Erfindung wird ein Verfahren zum Testen zumindest einer Probenverbindung
auf Wechselwirkung mit zumindest einer Bezugsverbindung bereitgestellt,
wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
- (a)
das Bereitstellen eines Proben-Trageelements mit einer Vielzahl
von Vorsprüngen,
wobei jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
und ein Bezugsverbindungs-Trageelement mit einem Oberflächenbereich
aufweist,
- (b) das chemische Modifizieren des an der Spitze befindlichen
Substratbereichs jedes Vorsprungs des Proben-Trageelements, um darauf
eine Probenverbindung zu im mobilisieren, worin die Probenverbindungen
auf jedem der Vorsprünge gleich
oder voneinander verschieden sein können,
- (c) das chemische Modifizieren des Oberflächenbereichs des Bezugsverbindungs-Trageelements, um
darauf zumindest eine Bezugsverbindung zu immobilisieren,
- (d) das Koppeln des Proben-Trageelements und des Bezugsverbindungs-Trageelements
an eine Vorrichtung, die Mittel zur Steuerung der relativen Position
und Ausrichtung des Proben-Trageelements und des Bezugsverbindungs-Trageelements
umfasst, um einen bestimmten Vorsprung des Proben-Trageelements
auszuwählen
und eine Wechselwirkung zwischen einer auf dem Oberflächenbereich
des Bezugsverbindungs-Trageelements
immobilisierten Bezugsverbindung und der auf der an der Spitze befindlichen
Substratfläche
des ausgewählten
Vorsprungs immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, sowie Mittel
zum Messen eines physikalischen Parameters, der mit der Wechselwirkung
zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung in Zusammenhang
steht,
- (e) das Steuern der relativen Position und Ausrichtung des Bezugsverbindungs-Trageelements und
des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und
eine Wechselwirkung zwischen einer Bezugsverbindung und der auf
dem ausgewählten
Vorsprung immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, und
- (f) das Messen eines physikalischen Parameters, der mit der
Wechselwirkung zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung
auf dem ausgewählten
Vorsprung in Zusammenhang steht.
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So wird der Probenträger so modifiziert,
dass anstatt einer flachen Oberfläche, auf der über einen relativ
großen
Bereich Moleküle
der Probenverbindung oder -verbindungen ausgebreitet sind, eine Vielzahl
von Vorsprüngen
vorhanden ist, auf deren Spitzen Moleküle der Probenverbindung oder
-verbindungen immobilisiert sind. Das Proben-Trageelement dieser
Erfindung kann mehrere Millionen dieser Vorsprünge pro Quadratzentimeter aufweisen.
Das Immobilisieren der Probenverbindungen auf die Spitzen von Vorsprüngen anstelle
einer flachen Oberfläche
platziert die Probenverbindungen in einer leichter zugänglichen
Position, so dass es bei der Durchführung von Messungen mole kularer
Wechselwirkungen zwischen einer Probenverbindung und einer Bezugsverbindung
nicht notwendig ist, die Bezugsverbindung am Ende einer Ausleger-Sondenspitze
zu platzieren, um Zugang zu den Probenmolekülen zu haben. Auf einzelne
Moleküle
der Probenverbindungen kann durch Bezugsverbindungen zugegriffen
werden, die auf einer Oberfläche
auf dem Ausleger immobilisiert sind. Somit dient die zweite Veränderung der
Rasterkraftvorrichtung zur Modifizierung des Auslegers, so dass
die Bezugsverbindung oder -verbindungen direkt auf einem Oberflächenbereich
am freien Ende des Auslegers und nicht auf einer Sondenspitze immobilisiert
werden.
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Beim Betrieb des Rasterkraftmikroskops
zur Messung molekularer Wechselwirkungen gemäß vorliegender Erfindung wird
der Oberflächenbereich am
freien Ende des Auslegers in Kontakt mit oder in die Nähe eines
bestimmten Vorsprungs gebracht, so dass Wechselwirkungen zwischen
einem Molekül
der Bezugsverbindung und einem Molekül der Probenverbindung gemessen
werden können.
Piezoelektrische Übersetzer,
die derzeit in der Rasterkraftmikroskopie eingesetzt werden, sind
präzise
genug, um einen speziellen aus Millionen von Vorsprüngen auf dem
Proben-Trageelement mit einem bestimmten Abschnitt auf dem Oberflächenbereich
des Auslegers auszurichten.
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Die Vorsprünge in der vorliegenden Erfindung
sind Ausleger-Sondenspitzen in herkömmlicher Rasterkraftmikroskopie
insofern ähnlich,
dass sie die Isolierung einer kleinen Anzahl einzelner Moleküle in einem
kleinen Bereich in einer zugänglichen
geometrischen Konfiguration ermöglichen,
so dass Messungen an einzelnen Molekülen oder an einer kleinen Anzahl
von Molekülen
vorgenommen werden können.
Ein bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin,
dass, während
bei herkömmlicher
Rasterkraftmikroskopie nur eine einzige Sondenspitze vorhanden ist,
die sich auf dem Ausleger befindet, in der vorliegenden Erfindung
zahlreiche analoge Strukturen vorhanden sind - die Vorsprünge -, die
sich auf dem Proben-Trageelement befinden. Bei einem herkömmlichen
Rasterkraftmikroskop muss, wenn die Ausleger-Sondenspitze beschädigt oder
inaktiviert ist, ein Versuch abgebrochen werden, bis die Spitze
ausgetauscht ist. Bei der vorliegenden Erfindung kann, wenn ein
bestimmter Vorsprung beschädigt
oder inak tiviert ist, der Ausleger einfach über einem anderen Vorsprung
mit derselben darauf immobilisierten Probenverbindung positioniert
werden, und die Messungen können
fortgesetzt werden. Tausende oder Millionen von Vorsprüngen pro
Quadratzentimeter können
geschaffen und mit einer Probenverbindung oder -verbindungen chemisch
modifiziert werden.
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Auf dem Oberflächenbereich des Auslegers können Milliarden
oder Billionen von Molekülen
der Bezugsverbindung immobilisiert sein, von denen jedes zur Messung
von Wechselwirkungen mit einer auf einem Vorsprung immobilisierten
Probenverbindung verwendet werden kann. Wenn Moleküle der Bezugsverbindung,
die sich auf einem Teil des Auslegers befinden, im Laufe eines Versuchs
beschädigt oder
inaktiviert werden, kann der Ausleger neu positioniert werden, so
dass stattdessen unbeschädigte, aktive
Moleküle
der Bezugsverbindung, die sich auf einem anderen Abschnitt des Auslegers
befinden, verwendet werden können.
Außerdem
kann der Oberflächenbereich
des Auslegers in räumlich
ansteuerbare Unterbereiche unterteilt werden, auf denen jeweils
eine andere Bezugsverbindung immobilisiert ist. Eine Reihe von verschiedenen
Bezugsverbindungen kann auf separaten, räumlich ansteuerbaren Unterbereichen
auf der Oberfläche
des Auslegers immobilisiert werden, so dass keine Notwendigkeit
besteht, jedes Mal der Ausleger auszutauschen muss, wenn gewünscht wird,
eine andere Bezugsverbindung zu verwenden.
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Mittels Durchführung der oben beschriebenen Änderungen
am Probenträger
und am Auslegers ist es nun möglich,
Rasterkraftmikroskopie für
effizientes Screenen von großen
Volumina von Probenverbindungen und zur Durchführung von wiederholten Messungen
von molekularen Wechselwirkungen einzusetzen, so dass Ergebnisse
mit statistischer Exaktheit nachgeprüft werden können, ohne dass Forscher sich
darüber
Sorgen machen müssen,
aufgrund einer Beschädigung
oder Inaktivierung der Bezugsverbindung mitten in einem Versuch
den Ausleger austauschen zu müssen.
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Die Vorrichtung und das Verfahren
gemäß vorliegender
Erfindung sind nicht auf Rasterkraftmikroskopie-Instrumente auf
Ausleger-Basis beschränkt.
Das Proben-Trageelement kann auch Probenverbindungen für andere
Arten von Kraftmikroskopen halten – zusätzlich zu jenen, die die Verwendung
eines Auslegers bedingen. Allgemein gesagt werden die Probenverbindung
oder Probenverbindungen auf den an der Spitze befindlichen Substratbereichen
von Vorsprüngen
eines Proben-Trageelements immobilisiert, und die Bezugsverbindung
oder Bezugsverbindungen werden auf dem Oberflächenbereich eines Bezugsverbindungs-Trageelement
immobilisiert. Jedes beliebige auf dem Gebiet der Erfindung bekannte
Verfahren kann verwendet werden, um die relative Position des Proben-Trageelements und
des Bezugsverbindungs-Trageelements zu steuern und intermolekulare
Wechselwirkungen zwischen Probenverbindungen und Bezugsverbindungen
zu messen.
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Bereitgestellt wird ein Proben-Trageelement für Rasterkraftmikroskopie,
das eine Proben-Tragebasis mit einer Vielzahl von Vorsprüngen umfasst, wobei
jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
umfasst, der chemisch modifiziert worden ist, indem darauf eine
Probenverbindung oder eine Linkerverbindung immobilisiert wurde,
die eine Probenverbindung binden kann, worin die Probenverbindungen
oder Linkerverbindungen auf jedem der Vorsprünge gleich oder voneinander verschieden
sind.
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Bereitgestellt wird außerdem ein
Ausleger für
Rasterkraftmikroskopie, der einen Ausleger-Körper mit einem fixierten Ende
und einem freien Ende umfasst, wobei das freie Ende einen Oberflächenbereich
mit einer Vielzahl von räumlich
ansteuerbaren Unterbereichen aufweist, wobei die einzelnen Unterbereiche
chemisch modifiziert wurden, indem unterschiedliche Bezugsverbindungen
darauf immobilisiert wurden.
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Bereitgestellt wird außerdem ein
Ausleger für
Rasterkraftmikroskopie, der einen Ausleger-Körper mit einem fixierten Ende
und einem freien Ende umfasst, wobei das freie Ende einen Oberflächenbereich
mit einer Vielzahl von darauf immobilisierten Kügelchen verschiedener Größenkategorien
aufweist, wobei auf den Kügelchen
Bezugsverbindungen immobilisiert sind, worin auf jeder Größenkategorie
von Kügelchen
eine andere Bezugsverbindung immobilisiert ist.
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Bereitgestellt wird außerdem eine
Vorrichtung zum Messen der Wechselwirkung zwischen einer Bezugsverbindung
und zumindest einer Probenverbindung, wobei die Vorrichtung Folgendes
umfasst:
ein Proben-Trageelement mit einer Vielzahl von Vorsprüngen, wobei
jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
umfasst, der chemisch modifiziert worden ist, indem darauf eine
Probenverbindung immobilisiert wurde, worin die Probenverbindungen
auf jedem der Vorsprünge
gleich oder voneinander verschieden sein können,
ein Bezugsverbindungs-Trageelement
mit einem Oberflächenbereich,
der chemisch modifiziert worden ist, indem darauf zumindest eine
Bezugsverbindung immobilisiert worden ist,
ein Mittel zur Steuerung
der relativen Position und Ausrichtung des Bezugsverbindungs-Trageelements und
des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und
Wechselwirkung zwischen der auf dem Oberflächenbereich des Bezugsverbindungs-Trageelements
immobilisierten Bezugsverbindung und der auf dem an der Spitze befindlichen
Substratbereich des ausgewählten
Vorsprungs immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, sowie
ein
Mittel zum Messen eines physikalischen Parameters, der mit der Wechselwirkung
zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung in Zusammenhang
steht.
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Bereitgestellt wird außerdem eine
Vorrichtung zum Messen einer Wechselwirkung zwischen zumindest einer
Bezugsverbindung und zumindest einer Probenverbindung, wobei die
Vorrichtung Folgendes umfasst:
ein Proben-Trageelement mit
einer Vielzahl von Vorsprüngen,
wobei jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
umfasst, der chemisch modifi ziert worden ist, indem darauf eine
Probenverbindung immobilisiert wurde, worin die Probenverbindungen
auf jedem der Vorsprünge
gleich oder voneinander verschieden sein können,
einen Ausleger mit
einem fixierten Ende und einem freien Ende, wobei das freie Ende
einen Oberflächenbereich
aufweist, der chemisch modifiziert wurde, indem zumindest eine Bezugsverbindung
darauf immobilisiert wurde,
worin das Proben-Trageelement so
angepasst ist, dass es auf einem Probengestellteil eines Rasterkraftmikroskops
aufliegen kann, und der Ausleger so angepasst ist, dass er mit einem
Ausleger-Halteabschnitt eines Rasterkraftmikroskops verbunden werden
kann.
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Bereitgestellt wird außerdem ein
Verfahren zum Testen zumindest einer Probenverbindung auf Wechselwirkung
mit zumindest einer Bezugsverbindung, wobei das Verfahren folgende
Schritte umfasst:
- (a) das Bereitstellen (1)
eines Proben-Trageelements mit einer Vielzahl von Vorsprüngen, wobei jeder
Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich aufweist,
und (2) eines Bezugsverbindungs-Trageelements mit einem Oberflächenbereich,
- (b) das chemische Modifizieren des an der Spitze befindlichen
Substratbereichs jedes Vorsprungs des Proben-Trageelements, um darauf
eine Probenverbindung zu immobilisieren, worin die Probenverbindungen
auf jedem der Vorsprünge gleich
oder voneinander verschieden sein können,
- (c) das chemische Modifizieren des Oberflächenbereichs des Bezugsverbindungs-Trageelements, um
darauf zumindest eine Bezugsverbindung zu immobilisieren,
- (d) das Koppeln des Proben-Trageelements und des Bezugsverbindungs-Trageelements
an eine Vorrichtung, die Mittel zur Steuerung der relativen Position
und Ausrichtung des Proben-Trageelements und des Bezugsverbindungs-Trageelements
umfasst, um einen bestimmten Vorsprung des Proben-Trageelements
auszuwählen
und eine Wechselwirkung zwischen einer auf dem Oberflächenbereich
des Bezugsverbindungs-Trageelements
immobilisierten Bezugsverbindung und der auf der an der Spitze befindlichen
Substratfläche
des ausgewählten
Vorsprungs immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, sowie Mittel
zum Messen eines physikalischen Parameters, der mit der Wechselwirkung
zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung in Zusammenhang
steht,
- (e) das Steuern der relativen Position und Ausrichtung des Bezugsverbindungs-Trageelements und
des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und
eine Wechselwirkung zwischen einer Bezugsverbindung und der auf
dem ausgewählten
Vorsprung immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, und
- (f) das Messen eines physikalischen Parameters, der mit der
Wechselwirkung zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung
auf dem ausgewählten
Vorsprung in Zusammenhang steht.
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Bereitgestellt wird außerdem ein
Verfahren zum Testen zumindest einer Probenverbindung auf Wechselwirkung
mit zumindest einer Bezugsverbindung, wobei das Verfahren folgende
Schritte umfasst:
- (a) das Bereitstellen eines
Rasterkraftmikroskops, das
ein Proben-Trageelement mit einer
Vielzahl von Vorsprüngen,
wobei jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
aufweist, und
einen Ausleger mit einem fixierten und einem
freien Ende, wobei das freie Ende einen Oberflächenbereich mit einer Vielzahl
von räumlich
ansteuerbaren Unterbereichen aufweist, umfasst,
- (b) das chemische Modifizieren des an der Spitze befindlichen
Substratbereichs jedes Vorsprungs, so dass auf den einzelnen Vorsprüngen gleiche oder
voneinander verschiedene Probenverbindungen immobilisiert werden,
- (c) das chemische Modifizieren der räumlich ansteuerbaren Unterbereiche
des Oberflächenbereichs
am freien Ende des Auslegers, um auf jedem Unterbereich eine andere
Bezugsverbindung zu immobilisieren,
- (d) das Steuern der relativen Position und Ausrichtung des Auslegers
und des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Unterbereich des Auslegers
und einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und eine Wechselwirkung
zwischen einer auf dem gewählten
Unterbereich immobilisierten Bezugsverbindung und der auf dem gewählten Vorsprung
immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, und
- (e) das Messen eines physikalischen Parameters, der mit der
Wechselwirkung zwischen der gewählten
Bezugsverbindung und der gewählten
Probenverbindung in Zusammenhang steht.
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Bereitgestellt wird außerdem ein
Verfahren zum Testen zumindest einer Probenverbindung auf Wechselwirkung
mit zumindest einer Bezugsverbindung, wobei das Verfahren folgende
Schritte umfasst:
- (a) das Bereitstellen einer
Vorrichtung, die Folgendes umfasst:
ein Proben-Trageelement
mit einer planaren Anordnung von verjüngten oder abgerundeten Vorsprüngen, worin
die Höhe
jedes Vorsprungs zwischen etwa 1 und etwa 10 μm liegt, der Krümmungsradius
jedes Vorsprungs an der Spitze zwischen etwa 5 und etwa 1.000 nm
liegt und der Abstand zwischen benachbarten Vorsprüngen zwischen
etwa 2 und etwa 50 μm
liegt, und worin jeder Vorsprung einen an der Spitze befindlichen Substratbereich
aufweist, der durch Immobilisieren einer Probenverbindung darauf
chemisch modifiziert wurde, worin die Probenverbindungen auf jedem
der Vorsprünge
gleich oder voneinander verschieden sein können, und
einen Ausleger
mit einem fixierten und einem freien Ende, wobei das freie Ende
einen im Wesentlichen flachen Oberflächenbereich mit einer Fläche von
zumindest 0,01 μm2 aufweist, und worin der Oberflächenbereich
in eine Vielzahl von räumlich
ansteuerbaren Unterbereichen unterteilt ist,
- (b) das chemische Modifizieren des an der Spitze befindlichen
Substratbereichs, um darauf eine Probenverbindung zu immobilisieren,
worin die Probenverbindungen auf jedem der Vorsprünge gleich
oder voneinander verschieden sein können,
- (c) das chemische Modifizieren der räumlich ansteuerbaren Unterbereiche
des Oberflächenbereichs
am freien Ende des Auslegers, um auf jedem Unterbereich eine andere
Bezugsverbindung zu immobilisieren,
- (d) das Koppeln des Proben-Trageelements an einen Probengestellteil
eines Rasterkraftmikroskops und Koppeln des Auslegers an einen Ausleger-Halteabschnitt
des Rasterkraftmikroskops, worin das Rasterkraftmikroskop Mittel
zur Steuerung der relativen Position und Ausrichtung des Auslegers
und des Proben-Trageelements umfasst, um einen bestimmten Vorsprung
auszuwählen
und eine Wechselwirkung zwischen einer auf dem Oberflächenbereich
am freien Ende des Auslegers immobilisierten Bezugsverbindung und
der auf der an der Spitze befindlichen Substratfläche des
ausgewählten
Vorsprungs immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, sowie Mittel
zum Messen eines physikalischen Parameters, der mit der Wechselwirkung
zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung in Zusammenhang
steht, umfasst,
- (e) das Steuern der relativen Position und Ausrichtung des Auslegers
und des Proben-Trageelements, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und
eine Wechselwirkung zwischen einer auf dem gewählten Unterbereich immobilisierten Bezugsverbindung
und der auf dem ausgewählten
Vorsprung immobilisierten Probenverbindung zu bewirken, und
- (f) das Messen eines physikalischen Parameters, der mit der
Wechselwirkung zwischen der gewählten
Bezugsverbindung und der gewählten
Probenverbindung in Zusammenhang steht.
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Kurzbeschreibung
der Abbildungen
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1 (Stand
der Technik) ist eine schematische, vergrößerte Darstellung einer Wechselwirkung zwischen
einem herkömmlichen
Ausleger und einem herkömmlichen
Substrat.
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2 ist
eine schematische, vergrößerte Darstellung
einer Wechselwirkung zwischen einem Ausleger und einem Proben-Trageelement
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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3 ist
eine schematische, vergrößerte Draufsicht
auf einen Abschnitt eines Proben-Trageelements
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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4 ist
eine schematische, vergrößerte Seitenansicht
des freien Endes des Auslegers gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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5 ist
eine schematische, vergrößerte Unteransicht
des freien Endes des Auslegers gemäß einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Detaillierte
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
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Wie in 1 (Stand
der Technik) schematisch dargestellt, umfasst ein herkömmliche
Rasterkraftmikroskop-Ausleger 1 eine spitze Abtastnadel oder
eine scharfe Spitze 2, die modifiziert sein kann, um Moleküle 3 darauf
zu immobilisieren. Die Abtastnadel wird mit einem Substrat 4 in
Kontakt oder in seine Nähe
gebracht, so dass eine Wechselwirkung zwischen Molekülen auf
der Abtastnadel und auf dem Substrat immobilisierten Molekülen 5 gemessen
werden kann.
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Wie in 2 schematisch
dargestellt, umfasst die Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise
einen Ausleger 10 mit einem freien Ende 15, das
einen Oberflächenbereich 20 aufweist, der
chemisch modifiziert ist, um Moleküle 30 einer Bezugsverbindung
darauf zu immobilisieren. Das Proben-Trageelement 40 umfasst
eine Vielzahl von Vorsprüngen 45,
die jeweils einen an der Spitze befindlichen Substratbereich 48 mit
darauf immobilisierten Probenmolekülen 50 umfassen. Gemäß vorliegender
Erfindung können
Wechselwirkungen zwischen Bezugsmolekülen und Probenmolekülen gemessen
werden, indem der Oberflächenbereich
des Auslegers mit dem an der Spitze befindlichen Substratbereich
auf einem der Vorsprünge
in Kontakt oder in dessen Nähe
gebracht wird.
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Das Proben-Trageelement umfasst eine
Proben-Tragebasis mit einer Vielzahl von Vorsprüngen, von denen jeder einen
an der Spitze befindlichen Substratbereich umfasst. Im Allgemeinen
sollten die Vorsprünge
eine Größe und Form
aufweisen, die es nur einer kleinen Anzahl von Molekülen der
Probenverbindung ermöglichen,
auf der äußersten Spitze
jedes Vorsprungs immobilisiert zu werden, so dass einzelne Moleküle der Probenverbindungen
zur Untersuchung isoliert werden können. (Typischerweise sind
die Vorsprünge
nur unter einem optischen Mikroskop erkennbar und sind mit freiem
Auge nicht klar erkennbar.) Die Vorsprünge sind vorzugsweise verjüngt oder
abgerundet, wobei der Krümmungsradius an
der Spitze zwischen etwa 5 und etwa 1.000 nm liegt. Der Krümmungsradius
an der Spitze eines Vorsprungs sollte je nach Deckung (Anzahl an
Molekülen
pro Flächeneinheit)
der Moleküle
der Probenverbindung gewählt
werden, die darauf immobilisiert werden soll. Für Verbindungen, die in relativ
geringer Menge oder Deckung vorliegen, oder die schwer zu immobilisieren
sind, sollten Vorsprünge
mit relativ großen
Krümmungsradien
verwendet werden; für diese
Art von Probenverbindungen werden beispielsweise abgerundete oder
halbkugelförmige
Formen bevorzugt. Der große
Krümmungsradius
trägt dazu bei,
die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen,
dass auf jedem Vorsprung zumindest ein Probenmolekül immobilisiert
ist. Für
Moleküle,
die leicht zu immobilisieren sind und in hoher Deckung vorliegen,
sollten verjüngte
Vorsprünge
mit relativ kleinen Radien verwendet werden. Für diese Art von Probenverbindungen
werden pyramidenförmige
oder konische Formen bevorzugt. Die kleinen Krümmungsradien tragen dazu bei, sicherzustellen,
dass, obwohl während
des Immobilisierungsvorgangs eine große Anzahl von Molekülen an jeden
Vorsprung gebunden werden kann, einzelne Moleküle an den äußersten Spitzen der Vorsprünge zur
Untersuchung isoliert werden können.
Ein Proben-Trageelement kann mit verschiedensten Vorsprüngen mit
unterschiedlichen Krümmungsradien konstruiert
werden, so dass dasselbe Trageelement zur Immobilisierung unterschiedlicher
Arten von Probenverbindungen eingesetzt werden kann.
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Prinzipiell ist die Gesamtgröße des Proben-Trageelements
nicht eingeschränkt,
aber in der Praxis wird die Größe des Proben-Trageelements
im Allgemeinen nach der Größe des Probenhalter-
oder Gestellbereiches des jeweils verwendeten Rasterkraftmikroskop-Instruments, gewählt. Die
Größe und der
Abstand der Vorsprünge
können
so gewählt
sein, dass sie der Größe eines
bestimmten Auslegers oder Bezugsverbindungs-Trageelements angepasst
sind, so dass der an der Spitze befindliche Substratbereich jedes
Vor sprungs für
den Ausleger oder das Bezugsverbindungs-Trageelement zugänglich ist.
Genauer gesagt sollte der Abstand zwischen den Vorsprüngen größer sein
als die Breite des Bezugsverbindungs-Trageelements, so dass das
Bezugsverbindungs-Trageelement gesteuert werden kann, um jeden Vorsprung
ohne Störung
von benachbarten Vorsprüngen
anzusteuern. Auf der anderen Seite beschränkt ein zu großer Abstand
der Vorsprünge
die Anzahl an Vorsprüngen,
die auf einer kleinen Fläche gebildet
werden können.
Die Breite der Vorsprünge an
ihrem breitesten Punkt beträgt
vorzugsweise etwa 0,5 bis 5 μm
und der Abstand zwischen benachbarten Vorsprüngen etwa 2 bis 50 μm. So kann
ein Proben-Trageelement, das nur einige Quadratzentimeter groß ist, Millionen
von Vorsprüngen
aufweisen.
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Bei manchen Rasterkraftmikroskopen
wird ein Ausleger in einem fixen Winkel zur Oberfläche des
Probensubstrats gehalten, während
der Ausleger und das Substrat relativ zueinander bewegt werden.
Wenn diese Art von Mikroskop mit einem Ausleger und einem Proben-Trageelement
gemäß vorliegender
Erfindung verwendet wird, kann die Höhe der Vorsprünge beeinflussen,
wie groß die
Oberfläche des
Auslegers ist, die für
die äußerste Spitze
der Vorsprünge
zugänglich
ist. Wenn ein Vorsprung nicht hoch genug ist, ist die Fläche des
Auslegers, die in die vom freien Ende wegführende Richtung zugänglich ist,
beschränkt,
weil das freie Ende in das Proben-Trageelement hineinragen würde. Die
Höhe der Vorsprünge beträgt vorzugsweise
1 bis 10 μm.
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Wie in 3 schematisch
dargestellt, umfasst das Proben-Trageelement typischerweise eine planare
Anordnung von Vorsprüngen 45.
Die Vorsprünge
sind vorzugsweise regelmäßig, beispielsweise
in einer quadratischen Anordnung, angeordnet, so dass die Lage der
einzelnen Vorsprünge
leicht überwacht
werden kann. Um die Überwachung
der Lage der einzelnen Vorsprünge
und die Unterscheidung verschiedener Vorsprünge zu erleichtern, kann die
Proben-Tragebasis Markierungen umfassen, die durch ein optisches
Mikroskop erkennbar sind. Um die Unterscheidung bestimmter Vorsprünge zu erleichtern,
können
außerdem
Gruppen von Vorsprüngen
durch leere Reihen oder Säulen
voneinander getrennt werden.
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Neben einer planaren Anordnung sind
auch andere Konfigurationen möglich.
Beispielsweise könnte
dasselbe Proben-Trageelement eine Terrassenstruktur aufweisen, wobei
auf jeder Terrasse zumindest eine Reihe von Vorsprüngen vorliegt.
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Das Proben-Trageelement kann aus
jedem mikrobearbeitbarem Material bestehen. Vorzugsweise ist das
Proben-Trageelement ein Silziumwafer. Die Vorsprünge sind vorzugsweise Teil
der Tragebasis und können
mithilfe herkömmlicher
Mikrobearbeitungsverfahren, wie beispielsweise Photomuterung und Ätzen des
Proben-Trageelements, hergestellt werden. Genauer gesagt können Mikrobearbeitungsverfahren
verwendet werden, die jenen zur Herstellung herkömmlicher Ausleger-Sondenspitzen ähnlich sind,
um die Vorsprünge
des Proben-Trageelements auszubilden. Ein Verfahren zur Herstellung
verjüngter
Mikrominiatur-Silikonstrukturen ist beispielsweise in den US-Patenten
Nr. 5.201.992 und 5.204.581 von Andreadakis beschrieben. Das Proben-Trageelement
kann auch durch Gießen
in eine mikrobearbeitete Form hergestellt werden. Das Proben-Trageelement kann
mit einer oder mit mehreren Schichten eines Materials beschichtet
werden, das zur Bindung bestimmter Arten von Probenverbindungen
nützlich ist.
Beispielsweise kann das Proben-Trageelement mit einer Goldschicht überzogen
werden, was die Immobilisierung von thiolhältigen Verbindungen ermöglicht.
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Die an der Spitze befindlichen Substratbereiche
der Vorsprünge
werden modifiziert, um mithilfe eines beliebigen auf dem Gebiet
der Erfindung bekannten Verfahrens zur kovalenten oder nicht kovalenten
Immobilisierung eines chemischen oder biochemischen Bestandteils
auf einem Substrat Probenverbindungen darauf zu immobilisieren.
Genauer gesagt können
chemische Verfahren, die zur Modifizierung herkömmlicher Ausleger-Sondenspitzen und Probenoberflächen eingesetzt
werden, zur Modifizierung der Vorsprünge gemäß vorliegender Erfindung verwendet
werden. Eine allgemeine Behandlung der Immobilisierungschemie findet
sich in Lee et al., "Chemically-specific
Probes for the Atomic Force microscope", Israel Journal of Chemistry, Bd. 36,
S. 81–87
(1996).
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Auf dem Gebiet der Erfindung bekannte
elektrochemische und elektrostatische Verfahren können zur
Immobilisierung von Probenverbindungen auf den Vorsprüngen verwendet
werden. Beispielsweise kann das elektrostatische Potential der Oberfläche des
Proben-Trageelements beeinflusst werden, um Probenverbindungen auf
den äußersten
Spitzen der Vorsprünge
zu konzentrieren.
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Die auf den Vorsprüngen immobilisierten Probenverbindungen
können
gleich oder voneinander verschieden sein, je nach Art der Forschung,
die betrieben wird. Wenn ein Forscher beispielsweise nur an der
Untersuchung der Wechselwirkung einer Bezugsverbindung auf dem Ausleger
mit einer einzigen Probenverbindung interessiert ist, kann das Proben-Trageelement
so modifiziert werden, dass nur eine Verbindung auf den Vorsprüngen immobilisiert wird.
Wenn ein Forscher auf der anderen Seite an der Untersuchung der
Wechselwirkung einer Bezugsverbindung mit einer Reihe von unterschiedlichen
Probenverbindungen interessiert ist, könnte das Proben-Trageelement
so modifiziert werden, dass verschiedene Verbindungen auf unterschiedlichen, räumlich ansteuerbaren
Vorsprüngen
immobilisiert werden. Vorzugsweise würde jede Probenverbindung auf
einer Reihe von Vorsprüngen
immobilisiert werden, so dass, wenn ein Vorsprung mit einer bestimmten
darauf immobilisierten Probenverbindung beschädigt wird, ein anderer Vorsprung
mit derselben Probenverbindung zur Untersuchung gewählt werden
kann. Außerdem
können
Versuche, wenn jede Probenverbindung auf einer Reihe unterschiedlicher
Vorsprünge
immobilisiert ist, wiederholt und Ergebnisse mit statistischer Exaktheit
nachgeprüft
werden. Jedes beliebige auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Mustergebungsverfahren,
einschließlich aber
nicht ausschließlich
Photomusterung und μ-Kontaktkopieren,
können
verwendet werden, um Anordnungen von Vorsprüngen zu schaffen, auf denen
verschiedene Verbindungen immobilisiert sind. Wenn elektrochemische
Verfahren eingesetzt werden, um Probenverbindungen an die Vorsprünge zu binden,
können
verschiedene Probenverbindungen auf dasselbe Proben-Trageelement
aufgebracht werden, indem separate Elektroden auf unterschiedlichen
Abschnitten des Proben-Trageelements verwendet werden. Darüber hinaus
können
kombinatorische Syntheseverfahren eingesetzt werden, um in situ
kombinatorische Bibliothe ken zu schaffen, wobei Vorsprünge mit
unterschiedlichen Elementen der kombinatorischen Bibliothek darauf
immobilisiert werden. Beispiele für Verfahren zur Herstellung
von Polypeptid- oder Oligonukleotid-Anordnungen sind in Fodor et
al., "Light-Directed,
Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis", Science 251, S. 767–773 (1991),
im US-Patent Nr. 5.143.854 von Pirrung et al. und im US-Patent Nr.
5.445.934 von Fodor et al. offenbart. Die in diesen Publikationen
beschriebenen Verfahren können
für die
Immobilisierung von kombinatorischen Bibliotheken von Probenverbindungen
auf den Vorsprüngen
gemäß vorliegender Erfindung
angepasst werden.
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Bei Immobilisierung einer Probenverbindung oder
von Probenverbindungen auf den an der Spitze befindlichen Substratbereichen
der Vorsprünge
ist es unwichtig, ob das jeweilige Verfahren die Probenverbindung
auch auf anderen Abschnitten des Proben-Trageelements immobilisiert,
solange der Zugang zu dem auf der Spitze befindlichen Substratbereich
nicht blockiert wird.
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Wenn hierin bereitgestellt wird,
dass das Proben-Trageelement eine Proben-Tragebasis mit einer Vielzahl
von Vorsprüngen
umfasst, worin "jeder Vorsprung" einen an der Spitze
befindlichen Substratbereich aufweist, der durch die Immobilisierung
einer Probenverbindung darauf modifiziert ist, sollen Fälle, bei
denen ein Proben-Trageelement auch Vorsprünge aufweist, die nicht chemisch
modifiziert sind, nicht aus dem Schutzumfang der Erfindung ausgeschlossen
werden. Ein Forscher kann beispielsweise nur einen Abschnitt eines
Proben-Trageelements chemisch modifizieren und den verbleibenden
Abschnitt des Proben-Trageelements unberührt lassen. Oder eine Probenverbindung
kann so schwer auf ein Substrat zu immobilisieren sein, dass nur
ein Teil der Vorsprünge
eines Proben-Trageelements erfolgreich modifiziert werden kann und
die restlichen Vorsprünge
unmodifiziert sind. Diese Fälle
liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
auch ein Proben-Trageelement, das modifiziert ist, um eine Linkerverbindung
auf den an der Spitze befindlichen Substratbereichen der Vorsprünge zu immobilisieren, worin
die Linkerverbindung eine Verbindung ist, die zur Bindung einer
Probenverbindungen fähig
ist. Diese Ausführungsform
bietet Flexibilität,
indem sie einem Forscher erlaubt, eine bestimmte Probenverbindung
oder bestimmte Probenverbindungen auszuwählen, um das Proben-Trageelement
an einem späteren
Zeitpunkt nach dem anfänglichen
Immobilisierungsschritt zu binden. Jede auf dem Gebiet der Erfindung
bekannte Linkerverbindung zur Bindung einer Probenverbindung an
ein Substrat kann eingesetzt werden. Typische Linkerverbindungen
sind heterobifunktionelle Vernetzer, die einen Teil des Moleküls aufweisen,
das zur Bindung einer bestimmten Substratart funktionalisiert ist,
und einen Teil des Moleküls,
das zur Bindung einer bestimmten Probenverbindungsart funktionalisiert
ist. Zur Bindung der Linkerverbindung an ein Siliziumsubstrat kann
die Linkerverbindung beispielsweise eine oder mehrere funktionelle
Silangruppen der Formel -O(CH2)nSi(OR)3–mCLm aufweisen, worin R = CH3 oder
CH2CH3 ist, m eine
ganze Zahl von 0 bis 3 ist und n eine ganze Zahl von etwa 9 bis
etwa 25 ist. Zur Bindung der Linkerverbindung an ein goldbeschichtetes
Substrat kann die Linkerverbindung eine oder mehrere funktionelle
Thiolgruppen aufweisen. Der Proben-bindende Teil der Linkerverbindung
kann ebenso gewählt
sein, um bestimmte Arten von Probenverbindungen, wie beispielsweise
Proteine oder Nukleinsäuren,
zu binden. Die Linkerverbindung kann beispielsweise eine oder mehrere
Maleimidgruppen umfassen, die thiolhältige Reste von Polypeptiden
binden, oder die Linkerverbindung kann eine oder mehrere Succinimidgruppen
umfassen, welche die Aminogruppen von Polypeptiden oder Nukleinsäuren binden.
Die Linkerverbindung kann auch durch Licht aktivierbar sein, so
dass die Verbindung erst nach Bestrahlung zur Bindung einer Probenverbindung
fähig ist.
Beispiele für
durch Licht aktivierbare Linkerverbindungen, die auf Silizium immobilisiert werden
können,
sind in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/797.325 von Conrad
et al., eingereicht am 10. Februar 1997, beschrieben.
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Es ist zu erwarten, dass das Proben-Trageelement
gemäß vorliegender
Erfindung meist in Rasterkraftmikroskopen mit einem Ausleger verwendet wird,
wie es hierin beschrieben ist. Das Proben-Trageelement kann jedoch
auch als Probenträger
zum Halten von Pro benverbindungen für andere Arten von Mikroskopie
auf Sondenbasis, wie beispielsweise Rastertunnelmikroskopie und
Rasterkraftmikroskopie, verwendet werden, und zwar in einem Aufbau, in
dem es von Vorteil ist, eine Probe auf geometrisch zugängliche
Weise auf den äußersten
Spitzen einer Vielzahl von Vorsprüngen zu immobilisieren. Andere Mechanismen
zur Kraftweitergabe und andere Arten von Plattformen zum Halten
einer Bezugsverbindung als ein herkömmlicher Ausleger können ebenfalls eingesetzt
werden. In dieser Anmeldung bezieht sich der Begriff "Bezugsverbindungs-Trageelement" auf jede Struktur – egal ob
Ausleger oder nicht –,
die einen Oberflächenbereich
bereitstellt; auf dem die Bezugsverbindung immobilisiert wird, so
dass sie in eine Position gebracht werden kann, um mit der Probenverbindung
auf eine Weise wechselzuwirken, dass physikalische Parameter, die
mit der Wechselwirkung in Zusammenhang stehen, gemessen werden können. Ein
Mechanismus zur Kraftweitergabe kann an das Bezugsverbindungs-Trageelement
oder das Proben-Trageelement gekoppelt sein. In einer Variation
von Rastersondenmikroskopie, die in Amrein, M., et al., "A Novel Forcesensing
Arrangement for Combined Scanning Force/Scanning Tunnelling Microscopy
Applied to Biological Objects",
Journal of Microscopy, Bd. 179, S. 261–265 (3. September 1995) und
in Schenk, M., et al., "An
Electret Microphone as a Force Sensor for Combined Scanning Probe
Microscopy", Ultramicroscopy
65, S. 109–118 (1996),
die beide durch Verweis hierin aufgenommen sind, beschrieben ist,
wird eine Probe oben auf einem Kraftumwandler, der eine Elektret-Mikrophon-Membran
ist, montiert, und Beugungen der Membran als Reaktion auf Kraft,
die von einer Sondenspitze ausgeübt
wird, werden gemessen. Das Proben-Trageelement gemäß vorliegender
Erfindung und ein Bezugsverbindungs-Trageelement könnten für diese
Art der Anordnung oder für ähnliche
Aufstellungen, bei denen das Proben-Trageelement mit einem Kraftaufnehmer
verbunden ist, angepasst werden.
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Das Bezugsverbindungs-Trageelement
ist vorzugsweise ein Ausleger. Der Ausleger kann aus jedem beliebigen
auf dem Gebiet der Erfindung zur Verwendung bei Rasterkraftmikroskop-Auslegern
bekannten Material, einschließlich
Si, SiO2, Si3N4, Si3N4Ox, Al oder aus piezoelektrischen Materialien bestehen.
Die chemische Zusammensetzung des Auslegers ist nicht entscheidend
und ist vorzugsweise ein Material, das leicht mikrobearbeitet werden kann
und die erforderlichen mechanischen Eigenschaften aufweist, so dass
es für
Rasterkraftmikroskop-Messungen verwendet werden kann. Desgleichen
kann der Ausleger jede beliebige Größe und Form aufweisen, die
auf dem Gebiet der Erfindung für
Rasterkraftmikroskop-Ausleger bekannt sind, außer dass er anders als herkömmliche
Ausleger keine Abtastnadel oder keine Sondenspitze an seinem freien
Ende aufweisen muss. Stattdessen weist der Ausleger am freien Ende
einen Oberflächenbereich
auf, der chemisch modifiziert ist, indem zumindest eine Bezugsverbindung
darauf immobilisiert wurde. Vorzugsweise ist der Ausleger rechteckig
("Sprungbrett"-Form) oder "V"-förmig.
Die Größe des Auslegers
liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 5 Mikrometer bis etwa 1.000
Mikrometer in Bezug auf die Länge,
von etwa 1 Mikrometer bis etwa 100 Mikrometer in Bezug auf die Breite
und von etwa 0,04 Mikrometer bis etwa 5 Mikrometer in Bezug auf
die Stärke. Typische
Rasterkraftmikroskop-Ausleger sind etwa 100 Mikrometer lang, etwa
20 Mikrometer breit und etwa 0,3 Mikrometer stark. Im Allgemeinen
ermöglicht
eine Vergrößerung des
Auslegers einen größeren chemisch
modifizierten Oberflächenbereich,
wodurch wiederum eine größere Anzahl
von Molekülen darauf
immobilisiert werden kann. Durch eine Vergrößerung des Auslegers nehmen
jedoch im Allgemeinen die Empfindlichkeit des Auslegers gegenüber bestimmten
intermolekularen Wechselwirkungen und die Genauigkeit von Kraftmessungen
ab.
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Das fixierte Ende des Auslegers kann
so angepasst werden, dass der Ausleger mit einem Ausleger-Halteabschnitt
eines herkömmlichen
Rasterkraftmikroskops zusammenpasst oder mit ihm verbunden werden
kann.
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Der chemisch modifizierte Oberflächenbereich
des Auslegers befindet sich auf dem Abschnitt des Auslegers, der
dem Proben-Trageelement gegenüberliegt,
wenn der Ausleger in ein Rasterkraftmikroskop eingebaut wird. Der
Oberflächenbereich
ist vorzugsweise eine ebene Fläche
mit zumindest 0,01 μm2
nahe dem Ende des Auslegers.
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Der Oberflächenbereich des freien Endes des
Auslegers kann modifiziert werden, um eine Bezugsverbindung mithilfe
eines beliebigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahrens
zur Immobilisierung einer chemischen Bestandteils auf einem Substrat
zu immobilisieren. Typischerweise weist der Oberflächenbereich
Milliarden oder Billionen von Molekülen der darauf immobilisierten
Bezugsverbindung auf.
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In einer alternativen Ausführungsform
kann der Oberflächenbereich
des Auslegers durch Immobilisieren von Kügelchen darauf modifiziert
werden. Kügelchen
bestimmter Größen können verwendet werden,
um die Krümmungsradien
oder andere geometrische Merkmale der Vorsprünge des Proben-Trageelements
einzustellen. Außerdem
können Kügelchen
als Weg zur Anbindung einer Vielzahl von verschiedenen Bezugsverbindungen
an den Ausleger verwendet werden. Unterschiedliche Bezugsverbindung
können
auf verschieden großen
Kügelchen immobilisiert
werden, d. h. jede Bezugsverbindung wird auf einer bestimmten Kügelchengröße immobilisiert,
und die Kügelchen
können
dann zufällig
auf dem Ausleger immobilisiert werden. Bei der Durchführung von
Messungen der Wechselwirkung zwischen Bezugsverbindungen und auf
einem Proben-Trageelement gemäß vorliegender
Erfindung immobilisierten Probenverbindungen können spezielle Bezugsverbindungen
durch die Größe der Kügelchen,
an die sie gebunden sind, unterschieden werden. Diese Ausführungsform
stellt einen praktischen Weg zur Immobilisierung einer Vielzahl
von verschiedenen Bezugsverbindungen auf dem Ausleger bereit. Beispiele
für Kügelchengrößen verschiedener Kategorien,
die voneinander unterschieden werden können, sind 2 bis 2 nm große Kügelchen,
10 bis 15 nm große
Kügelchen
und 20 bis 25 nm große
Kügelchen.
Diese Ausführungsform
ist in 4 dargestellt, die
eine schematische, vergrößerte Seitenansicht des
freien Endes eines Auslegers 100 mit kleinen Kügelchen 110,
auf denen eine erste Bezugsverbindung 115 immobilisiert
ist, mittleren Kügelchen 120,
auf denen eine zweite Bezugsverbindung 125 immobilisiert ist,
und großen
Kügelchen,
auf denen eine dritte Bezugsverbindung 135 immobilisiert
ist, zeigt.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann der Oberflächenbereich
des Auslegers oder Bezugsverbindungs-Trageelements in räumlich ansteuerbare Unterbereiche
unterteilt sein, wobei auf jedem Unterbereich eine andere Bezugsverbindung
immobilisiert ist. Der Ausleger dieser Ausführungsform kann mithilfe jedes
beliebigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahrens zur
Herstellung räumlich
ansteuerbarer Anordnungen von immobilisierten Verbindungen, wie
beispielsweise durch Photomusterung, hergestellt werden. Obwohl
die Anzahl räumlich
ansteuerbarer Unterbereiche nur durch die Auflösung von Mustergebungsverfahren,
die zur Schaffung der Unterbereiche eingesetzt werden, und die Auflösung des
Verfahrens, das zur Steuerung der relativen Position des Auslegers
und des Proben-Trageelements eingesetzt wird, beschränkt ist,
beträgt die
Anzahl dieser Unterbereich vorzugsweise etwa 10 oder weniger. Diese
Ausführungsform
ist in 5 dargestellt,
die eine schematische, vergrößerte Unteransicht
des freien Endes eines Auslegers 200 zeigt, der die Unterbereiche 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 und 290 mit
den darauf immobilisierten Bezugsverbindungen 215, 225, 235, 245, 255, 265, 275, 285 und 295 aufweist.
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Durch Immobilisieren von bis zu 10
verschiedenen Bezugsverbindungen auf dem Oberflächenbereich des Bezugsverbindungs-Trageelements
und von bis zu 1.000 verschiedenen Probenmolekülen auf den Vorsprüngen des
Proben-Trageelements ist es möglich,
bis zu 10.000 verschiedene molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen,
ohne das Bezugsverbindungs-Trageelement oder das Proben-Trageelement
auszutauschen. Die Verfahren und Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung können verwendet
werden, um Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen, Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen und
Wechselwirkungen zwischen DNA oder RNA und komplementären Strängen zu
untersuchen oder screenen. Ein Rezeptor kann beispielsweise auf
dem Oberflächenbereich
des Bezugsverbindungs-Trageelements immobilisiert werden, und eine
große
Bibliothek von möglichen
Liganden kann gescreent werden, um zu bestimmten, ob einer davon
mit dem Rezeptor wechselwirkt, und um die Stärke der Wechselwirkung zu messen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird rasches, effizientes und statistisch
exaktes Screening von möglichen
Bestandteilen für
pharmazeutischen und landwirtschaftlichen Ein satz in großem Umfang
ermöglicht.
Alternativ dazu kann auch ein Ligand auf dem Oberflächenbereich
des Bezugsverbindungs-Trageelements immobilisiert werden, und eine
Bibliothek von möglichen
Rezeptoren kann gescreent werden, um zu bestimmen, ob der Ligand mit
einem davon wechselwirkt. Ähnliche
Verfahren können
verwendet werden, um Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen
und die Wechselwirkungen von DNA oder RNA mit komplementären Strängen zu screenen.
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Um molekulare Wechselwirkungen zwischen einer
Bezugsverbindung und einer Probenverbindung zu untersuchen, können die
relative Position und Ausrichtung des Bezugsverbindungs-Trageelements
und des Proben-Trageelements mithilfe jedes beliebigen Mittels gesteuert
werden, um einen bestimmten Vorsprung auszuwählen und eine Wechselwirkung
zwischen der auf dem Oberflächenbereich des
Bezugsverbindungs-Trageelements
immobilisierten Bezugsverbindung und der auf dem auf der Spitze
befindlichen Substratbereich des gewählten Vorsprungs immobilisierten
Probenverbindung zu bewirken. Entweder das Bezugsverbindungs-Trageelement
oder das Proben-Trageelement oder beide können bewegt, gescannt oder
oszilliert werden. Wenn der Ausleger auf verschiedenen Unterbereichen
immobilisierte Bezugsverbindungen aufweist, kann die relative Position
des Auslegers und des Proben-Substratelements auch so gesteuert
werden, dass nur ein gewählter
Unterbereich des Auslegers mit einem gewählten Vorsprung wechselwirkt.
Vorzugsweise wird das Mittel zur Steuerung der relativen Position und
Ausrichtung des Auslegers und des Proben-Trageelements durch Einsatz
eines piezoelektrischen Antriebs erzielt, der elektrische Signale
mit Sub-Nanometer-Auflösung
in mechanische Bewegungen umwandeln kann.
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Jeder mit der Wechselwirkung zwischen
einer Bezugsverbindung und einer Probenverbindung in Zusammenhang
stehende Parameter, der durch Rasterkraftmikroskopie gemessen werden
kann, kann mithilfe der Vorrichtung und des Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung gemessen werden. Physikalische Parameter umfassen Adhäsion, Elastizität und Veränderungen
der Resonanzeigenschaften, wie beispielsweise Amplitude, Frequenz
und Phase, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die physikalischen Para meter
können
mithilfe jedes beliebigen bekannten Verfahrens gemessen werden,
einschließlich
optischer Beugung, optischer Interferometrie und piezoelektrischer
Effekte, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Wechselwirkungskräfte zwischen
der Bezugsverbindung und der Probenverbindung, wenn diese in Kontakt
gebracht oder der Kontakt zwischen ihnen gelöst bzw. diese nahe zueinander
gebracht oder wieder voneinander entfernt werden, werden vorzugsweise
durch Messen der Abweichungen des Auslegers von seiner Gleichgewichtsposition
gemessen. Abweichungen des Auslegers können mithilfe einer Reihe von
Verfahren gemessen werden, einschließlich durch Reflektieren eines
Laserstrahls von der Rückseite
des Auslegers auf einen positionsempfindlichen Detektor.
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Messungen können in jedem Medium und unter
allen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden, die für Rasterkraftmikroskopie
geeignet sind, einschließlich
unter normalen Umgebungsbedingungen oder in einem flüssigen Medium,
ohne auf diese beschränkt
zu sein. In einem flüssigen
Medium können
Versuchsbedingungen, wie beispielsweise pH, Ionenkonzentration und
die Gegenwart von Inhibitoren oder Kompetitoren, geregelt und variiert
werden.
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Im Handel erhältliche Rasterkraftmikroskop-Instrumente
können
zur Steuerung der relativen Position des Auslegers und des Proben-Trageelements
und zur Messung physikalischer Parameter, die mit der Wechselwirkung
zwischen Bezugsverbindungen auf dem Ausleger und Probenverbindungen auf
dem Proben-Trageelement eingesetzt werden. Typischerweise besitzen
im Handel erhältliche
Rasterkraftmikroskope abnehmbare Ausleger und Probenträger, so
dass diese Instrumente modifiziert werden können, indem diese einfach durch
Ausleger und Proben-Trageelemente gemäß vorliegender Erfindung ersetzt
werden. Das Verfahren zur Durchführung
von Messungen kann automatisiert und computerisiert werden, so dass
eine große
Anzahl von Probenverbindungen, wie beispielsweise in einer kombinatorischen
Bibliothek, rasch, effizient und mit statistischer Exaktheit analysiert
werden kann. Der Ausleger und das Proben-Trageelement gemäß vorliegender
Erfindung können
auch in einem Rasterkraftmikroskop eines Typs ver wendet werden,
das mehrere unabhängig
gesteuerte Ausleger umfasst, wie es beispielsweise im US-Patent
Nr. 5.047.633 von Finlan et al. beschrieben ist, das durch Verweis
hierin aufgenommen ist.
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Die Vorrichtung gemäß vorliegender
Erfindung kann auch als Sensor für
Umweltveränderungen
verwendet werden. In einem Sensor werden Verbindung mit bekannter
Wechselwirkung als Bezugsverbindung und als Probenverbindungen verwendet. Eine Änderung
der Wechselwirkung zwischen der Bezugsverbindung und der Probenverbindung
weist auf Umweltveränderungen,
wie beispielsweise die Gegenwart von störenden Molekülen, hin.
Die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops als Sensor ist beispielsweise
im US-Patent Nr. 5.371.930 von Coton et al. beschrieben.
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Der Beschreibung der Erfindung folgen
nun Beispiele, die zur Veranschaulichung bestimmter Anwendungen
der Erfindung dienen, einschließlich
der besten Umsetzungsform der Erfindung. Diese spezifischen Beispiele
dienen nicht als Einschränkung
des Schutzumfangs der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung.
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BEISPIEL
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Ein Proben-Trageelement mit einer
mikrobearbeiteten Anordnung von verjüngten Vorsprüngen wurde
mithilfe herkömmlicher
Silzium-Mikrobearbeitungsverfahren hergestellt. Genauer gesagt wurde ein
Siliziumwafer bearbeitet, indem eine Oxidschicht gebildet und dann
die Schicht mit einem Photoresist-Muster mit systematisch variierenden
Radien gebildet wurde. Das belichtete Oxid wurde dann abgeätzt, wodurch
geschützte
Maskeninseln oder Oxidkappen erhalten wurden. Durch anisotropes Ätzen wurde
die Siliziumschicht um und unter den Oxidkappen geätzt, um
pyramidenförmige
Vorsprünge
mit Kappen zu erhalten. Das Ätzen
wurde fortgesetzt, bis die Kappen sich lösten. Die verbleibenden Strukturen wurden
durch Oxidbildung und -entfernung nachgebessert, um eine Anordnung
von pyramidenförmigen Vorsprüngen mit
systematisch variierenden Krümmungsradien
an den Spitzen herzustellen. Streptavidin wurde auf den äußersten Spitzen
der Vorsprünge immobilisiert.
Biotinyliertes PEG und Aminosilan wurden auf einem 20 μm breiten,
2 μm starken
und 440 μm
langen Silizium-Ausleger NanoProbe von Digital Instruments mit einer
nominalen Kraftkonstante von 0,08 N/m immobilisiert. Das Proben-Trageelement und
der Ausleger wurden in ein modifiziertes, im Handel erhältliches
Rasterkraftmikroskop auf Basis optischer Strahlablenkung (Digital
Instruments Nanoscope IIIa) eingebaut, das verwendet wurde, um die
Adhäsionskräfte in Zusammenhang
mit der Trennung des Auslegers und des Proben-Trageelements zu messen.
In diesem Vorgang wurde der Ausleger über einem der pyramidenförmigen Vorsprünge zentriert, und
der z-Piezo wurde mit einer Dreieckswelle angeregt, was bei 10 Hz
zwischen dem Ausleger und dem Vorsprung zu einer relativen vertikalen
Bewegung von 3 μm
führte.
Ein Schrittmotor wurde verwendet, um den Ausleger in die Nähe der äußersten
Spitze des Vorsprungs abzusenken (weniger als 2 μm, aber keine Berührung).
An diesem Punkt wurden der z-Piezo-Bereich und die Frequenz auf
500 nm bzw. 1 Hz verringert. Ein Trigger-Algorithmus wurde ausgelöst, so dass
der Ausleger daran gehindert wurde, mehr als 1,0 nN an Kraft auf
die äußerste Spitze
des Vorsprungs einwirken zu lassen. Adhäsionsmessungen wurde vorgenommen
und Kraftkurven aufgezeichnet. Der Ausleger wurde dann über einem
anderen Vorsprung positioniert, und die Messungen wurden wiederholt.