CN106645804A - 一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法。所述方法将40～50μg/mL的胶原蛋白单体溶液在云母晶面上形成胶原蛋白膜层，在原子力显微镜的接触模式下，利用探针对溶液中的胶原蛋白膜层施加10^‑8～10^‑6N的力，将膜层加工成具有特定取向的蛋白纳米纤维阵列。本发明的具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿具有良好的亲水性能，表面的胶原蛋白具有优异的生物相容性，可以用于细胞培养。本发明可应用于生产细胞培养器皿，制备高特异性的生物探针以及合成新型微纳材料领域。

Description

一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层 比色皿的方法

技术领域

本发明涉及比色皿的改进，具体涉及一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法。

背景技术

1989年，《科学》杂志报导Drake等人利用原子力显微镜(AFM)的接触模式观测云母片上的凝血酶催化血纤蛋白原的聚合反应时，观察到了平行的弯曲纤维阵列【Science,1989,243,1586】。1990年，《Langmuir》杂志报导Lin等人利用原子力显微镜(AFM)的接触模式观测免疫球蛋白G(4-4-20 IgG2)在PBS缓冲液中的自组装时，也发现了蛋白质沉积而成的褶皱结构，其脊部呈反复弯曲状，但整体取向大致平行【Langmuir,1990,6,509】。然而，在这些试验中，观测者均未注意到探针对成纤的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法，该方法操作简便，能够精确控制生成的胶原蛋白纳米纤维阵列结构的走向。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法，具体步骤如下：

步骤1，将云母片固定在载玻片上，用胶带撕开云母片表层使其露出新鲜晶面，清洗干净；

步骤2，在云母片的新鲜晶面上滴加40～50μg/mL的胶原蛋白单体溶液，培育2～3小时，培育结束后清洗除去吸附不牢的胶原蛋白；

步骤3，将云母晶面用水浸润，利用原子力显微镜对胶原蛋白进行加工，采用接触模式，探针上施加的力为10^-8～10^-6N，得到设定取向的蛋白纳米纤维阵列；

步骤4，将加工后的云母片粘结成比色皿。

发明人发现在原子力显微镜的接触模式下，在探针上施加合适的力，胶原蛋白可以形成整体取向一致的纤维阵列，且与单体的自组装能力无关。基于单根纤维的特性以及纤维阵列的取向与探针扫描方向的关系，发明人提出了原子力显微镜探针的扫把机理，即：在原子力显微镜的接触模式下，样品作用于探针上的力可分解成水平与垂直方向，其中垂直方向上的力会使悬臂发生弯曲。在扫描过程中，垂直方向的力或悬壁的弯曲度应保持恒定，这由压电传感器通过调节悬臂高度来控制。当作用在探针上的力大于样品分子与基质的结合力时，探针将样品分子推动，像扫把一样扫动分子并堆积起来。此时探针受力和悬臂弯曲度都会增大，当垂直方向的力大过压电传感器设置的阈值时，系统便将悬臂上提以缓解压力。于是，探针便滑过堆积的样品分子表面。随着垂直方向的力进一步减小，压电传动系统将探针再次放低来进行新一轮的扫把运动。这样，每一行扫描结束后，探针会将样品分子扫成几堆。当接下来的一行扫描时，又会形成新的样品分子堆积。如果行距合适使得相邻两行的样品分子堆能相互接触，它们便很可能随机结合起来，形成了呈之字形的随机反复弯曲的单根纤维，其大致取向垂直于探针的行扫描方向。

本发明中，在云母片表面的不同区域使用原子力显微镜的接触模式来制造蛋白纳米纤维时，在合适的探针作用力下才能产生纤维，当探针作用力远大于吸附分子与基质或分子之间的作用力时，探针便可能将蛋白分子扫出扫描区域；纤维取向垂直于探针行扫描方向；单根纤维的尺寸由探针作用力和扫描行间距共同决定。本发明操作简便，能够精确控制生成的胶原蛋白纳米纤维阵列结构走向，比色皿表面接触角均值达到9.5°，具有良好的亲水性能，可用于细胞培养。此外，本发明比色皿相对的两个云母片上的蛋白纳米纤维阵列可加工成统一方向，具有很好的偏振特性。若作为掩模，也可以结合电化学方法合成新型的生物传感器。

附图说明

图1为原子力显微镜接触模式下探针的扫把机理示意图。

图2为实施例1制得的去离子水覆盖的云母晶面上的胶原蛋白膜层的原子力显微镜表面形貌图。

图3为实施例1制得的具有胶原蛋白纳米纤维阵列的原子力显微镜高度图。

图4为实施例1接触模式下原子力显微镜探针在去离子水覆盖的云母晶面的不同区域制造胶原蛋白纤维阵列。

图5为实施例2制得的具有胶原蛋白纳米纤维阵列的原子力显微镜高度图。

图6为实施例2制得的具有胶原蛋白纳米纤维阵列的原子力显微镜高度图。

图7为实施例2云母晶面上的静态接触角，其中A为崭新的(001)晶面，B为具有胶原蛋白纳米纤维膜层覆盖的晶面。

图8为实施例2制得的胶原蛋白纳米纤维阵列膜层的透射比测试图。

图9为实施例2具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法，具体步骤如下：

步骤1，将云母片切割成约1cm×1cm的方片，用双面胶贴在载玻片中央，用单面透明胶带撕开云母片表层使露出新鲜晶面，用去离子水润洗晶面两次；

步骤2，取适量5mg/mL的胶原蛋白单体溶液，用去离子水稀释至40μg/mL；

步骤3，立刻滴上40μg/mL的胶原蛋白单体溶液覆盖云母晶面3小时，培育完成后除去云母晶面上的胶原蛋白单体溶液，并用去离子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白质；

步骤4，用去离子水覆盖云母晶面，进行胶原蛋白的原子力显微镜表征与加工试验。原子力显微镜对胶原蛋白样品进行表征工作模式设置为轻敲模式，行扫描方向平行于探针悬臂方向，振幅约100nm，驱动频率约8kHz，接近探针悬臂在溶液中的共振频率，加工工作模式为接触模式，施加在探针上的力在10^-8到10^-6N之间，两种扫描模式的分辨率均为256×256。

AFM对样品进行表征和加工，图2是具有代表性的5μm×5μm区域，其表面均方根粗糙度约为0.8nm，这种不均匀性可能是胶原蛋白单体的随机覆盖导致。然而在原子力显微镜的接触模式下对同一区域进行两次同样的扫描，接着使用轻敲模式进行表征如图1所示，在原子力显微镜的接触模式下，样品作用于探针上的力可分解成水平与垂直方向，其中垂直方向上的力会使悬臂发生弯曲。在扫描过程中，垂直方向的力或悬壁的弯曲度应保持恒定，这由压电传感器通过调节悬臂或样品台的高度来控制。当作用在探针上的力大于样品分子与基质的结合力时，探针将样品分子推动，像扫把一样在图B中扫动分子并堆积起来。此时探针受力和悬臂弯曲度都会增大，当垂直方向的力大过压电传感器设置的阈值时，系统便将悬臂上提以缓解压力。于是，探针便如图C所示滑过堆积的样品分子表面。随着垂直方向的力进一步减小，在图D中压电传动系统将探针再次放低来进行新一轮的扫把运动。这样，每一行扫描结束后，探针会将样品分子扫成几堆。当接下来的一行扫描时，又会形成新的样品分子堆积。如果行距合适使得相邻两行的样品分子堆能相互接触，它们便很可能随机结合起来，形成了呈之字形的随机反复弯曲的单根纤维，其大致取向垂直于探针的行扫描方向。

AFM加工得到如图3所示的胶原蛋白纳米纤维阵列图。接触模式的行扫描方向平行于探针悬臂方向(图中用白色箭头标出)，探针作用力设置为1×10^-7N。图3中单根胶原蛋白纳米纤维呈反复弯曲状，但整个纳米纤维阵列的取向较为一致，大致垂直于接触模式的探针行扫描方向。数据分析结果显示，单根蛋白纳米纤维的长度从几百纳米到几微米不等，平均高度约2nm，宽度约150nm，阵列中纳米纤维间距并不均匀，从互相接触到几百纳米不等。接触模式下的初次扫描可以均衡云母表面的蛋白单体分布，对同一区域进行两次同样的扫描便可以得到较稳定且排列规则的蛋白纳米纤维阵列，两次以上的扫描对单根纳米纤维的局部排列有显著改变，但对纳米纤维阵列的整体形貌影响不大。

另选了一块如图4所示的10μm×10μm区域来制造蛋白纳米纤维，图中白色箭头平行于探针悬臂。首先，在A区域(5μm×5μm)利用原子力显微镜的接触模式连续扫描两次，行扫描方向垂直于探针悬臂方向，探针作用力设置为2×10-7N。紧接着在B区域(2.5μm×2.5μm)使用同种模式、相同方向以及相同探针作用力进行两次连续扫描。接下来，在C区域(5μm×5μm)利用接触模式连续扫描两次，行扫描方向平行于探针悬臂方向，探针作用力增加到5×10-7N。接着，在D区域(2.5μm×2.5μm)使用同种模式和相同方向进行两次连续扫描，但是探针作用力增加到1×10-6N。最后，我们在原子力显微镜的轻敲模式下对整个区域进行表征，得到了图4中分块的胶原蛋白纳米纤维阵列图。很显然，A区域和C区域的纳米纤维阵列的取向互相大致垂直，均垂直于接触模式下探针的行扫描方向。对比图2、3，在图4的A区域由于探针作用力增加，单根蛋白纤维的平均宽度增加到约270nm，而在B区域由于扫描行间距变小产生更大重叠区域，蛋白纤维变得稀疏和粗壮，单根蛋纤维高度约5nm，宽度约350nm。在C区域，由于探针作用力进一步增加，可能有大量蛋白分子被探针带出该区域，纤维变得稀疏且单薄。在D区域，当探针的作用力较图1增加了一个数量级时，胶原蛋白分子基本上被探针“扫”走了。

实施例2

一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法，具体步骤如下：

步骤1，将云母片切割成约1cm×1cm的方片，用双面胶贴在载玻片中央，用单面透明胶带撕开云母片表层使露出新鲜晶面，用去离子水润洗晶面两次；

步骤2，取适量5mg/mL的胶原蛋白单体溶液，用去离子水稀释至50μg/mL；

步骤3，立刻滴上50μg/mL的胶原蛋白单体溶液覆盖晶面2小时，然后除去云母晶面上的蛋白质溶液，并用去离子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白质；

步骤4，用去离子水覆盖云母晶面进行胶原蛋白的原子力显微镜表征与加工试验，得到设定取向的蛋白纳米纤维阵列。然后将云母片粘结成比色皿。

在去离子水覆盖的云母片表面的不同区域使用原子力显微镜的接触模式来制造蛋白纳米纤维时，当其他条件一样，仅扫描方向不同时，我们得到了如图5、6所示的结果。图5、6是两个不同位置的2.5μm×2.5μm区域。两区域均使用原子力显微镜的接触模式连续扫描两次，紧接着使用轻敲模式来进行表征(图中白色箭头为平行探针悬臂方向)；接触模式的探针作用力均设置为1×10^-7N。在接触模式下，图5区域的行扫描方向为平行于探针悬臂方向，图6的方向为垂直于探针悬臂方向。图5、6中蛋白纤维密度较图3稀疏，平均高度约3nm，宽度约200nm。尽管单根纤维呈反复弯曲状，但整个纤维阵列的取向大致垂直于接触模式下的行扫描方向。

分别对崭新的和已有胶原蛋白纳米纤维膜层覆盖的云母晶面样品进行静态水滴接触角的基线圆法测试，为减小测量误差，我们对同一样品取了3个点进行测量后取其平均值。结果如图7所示。在图7(A)中崭新的云母晶面接触角测量均值为25.8°，而图7(B)有蛋白纳米纤维覆盖的晶面接触角均值仅为9.5°。很显然，胶原蛋白纳米纤维膜层显著地增强了云母晶面的亲水性。

同时对胶原蛋白纳米纤维膜层做透射分析，透射波长范围为360-1100nm，结果如图8所示。从透射图可以看出，从400nm之后，透射比为80％以上，随着波长的增大，透射比稳定在90％左右，说明此膜层具有良好的透光性能。

综上所述，对制得的具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层的比色皿在AFM和接触角测试仪上进行性能表征，结果表明按照实例2的工艺参数，制得的胶原蛋白纳米纤维阵列膜层的比色皿，如图9所示，具有很好的线性排列特性、接触角小、亲水性好、细胞培养特性、生物传感器特性。

Claims (1)

1.一种利用原子力显微镜制备具有胶原蛋白纳米纤维阵列膜层比色皿的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，将云母片固定在载玻片上，用胶带撕开云母片表层使其露出新鲜晶面，清洗干净；

步骤2，在云母片的新鲜晶面上滴加40～50μg/mL的胶原蛋白单体溶液，培育2～3小时，培育结束后清洗除去吸附不牢的胶原蛋白；

步骤3，将云母晶面用水浸润，利用原子力显微镜对胶原蛋白进行加工，采用接触模式，探针上施加的力为10^-8～10^-6N，得到设定取向的蛋白纳米纤维阵列；

步骤4，将加工后的云母片粘结成比色皿。