DE69837093T2

DE69837093T2 - Epididymales Vorwärtsbeweglichkeitsprotein aus der Ziege

Info

Publication number: DE69837093T2
Application number: DE69837093T
Authority: DE
Inventors: Indian Inst. Chem.Biology Gopal Chandra Jadavpur Calcutta 700 032 Majumder; Indian Inst.Chemical Biol. Bijay Shankar Jadavpur Calcutta 700 032 Jaiswal
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: DE69837093D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes, neues Forward Motility Protein aus dem Nebenhoden und ein Verfahren zur Isolierung des Forward Motility Proteins aus dem Nebenhoden, welches als ein die Fruchtbarkeit aktivierendes/blockierendes Mittel geeignet ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Isolierung eines gereinigten, neuen Forward Motility Proteins aus dem Nebenhoden der Ziege, welches als die Fruchtbarkeit aktivierendes Mittel sowie als die Fruchtbarkeit blockierendes Mittel geeignet ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Forward Motility Protein (FMP) hat das Potenzial zur Verwendung als empfängnisverhütender Impfstoff zur Regulierung von Bevölkerungswachstum. FMP hat auch das Potenzial zur Verbesserung einiger der Probleme der Unfruchtbarkeit beim Menschen (aufgrund geringer Spermienbeweglichkeit): ein großes gesellschaftliches Problem bei allen menschlichen Rassen. Es hat auch das Potenzial zum Lösen einiger der Probleme der Tierzucht (aufgrund unzureichender Spermienbeweglichkeit), wodurch Milch- und Fleischproduktion gesteigert werden.
Bevölkerungsexplosion stellt in allen Entwicklungsländern, einschließlich Indien, ein Hauptproblem dar. Obwohl einige empfängnisverhütende Verfahren verfügbar sind, unterliegen sie Einschränkungen in Bezug auf unerwünschte Nebenwirkungen/geringere Wirksamkeit. Einige dieser Verfahren sind wiederum für Millionen von bedürftigen Menschen ziemlich teuer. Ein weiteres weltweites soziales Problem von gewaltigem Ausmaß stellt die Unfruchtbarkeit beim Menschen dar. Es wird angenommen, dass etwa 15% der Paare unfruchtbar sind. Millionen von unfruchtbaren Menschen in der ganzen Welt führen ein armseliges Leben. Einer der Gründe der Unfruchtbarkeit beim Menschen stellt die geringe Spermienbeweglichkeit dar. Obwohl mehrere hochentwickelte Assistierte Fortpflanzungstechnologien (z.B. IVF: in vitro-Befruchtung, ICSI: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion) zur Lösung der Probleme von oligospermen und asthenozoospermen Patienten (mit geringer Spermienbeweglichkeit) zur Lösung der Probleme verfügbar sind, sind diese Technologien sehr kostspielig und die Erfolgsquote ist äußerst gering. Zur Lösung der Probleme der Bevölkerungsexplosion und Unfruchtbarkeit beim Menschen ist es wesentlich, ein fundamentales Verständnis der biochemischen Grundlage der Fortpflanzungsvorgänge aufzuweisen. Der folgende Abschnitt gibt einen kurzen Überblick über die Literatur über die Spermienentwicklung des Nebenhodens: Ein bedeutsames Ereignis bei der männlichen Fortpflanzungsfunktion.
Hodenspermatozoen von Säugern sind unbeweglich und unfruchtbar. Während des Durchtritts durch den Nebenhoden erwerben diese Zellen Vorwärtsbeweglichkeit, welche für ihre Fähigkeit zur Befruchtung der weiblichen Eier wesentlich ist. Biochemische Grundlage für den Entwicklungsvorgang der Nebenhodenspermien wird noch nicht weitgehend verstanden. Es wird auf Hoskins D. D., Brandt N. und Acott T.S., Fed Proc, 37, 2534–2542, 1978; Majumder G. C., Dey C. S., Halder S. und Barua M., Arch Androl, 24, 287–303,S 1990 verwiesen. Nebenhodenplasma (EP)/Samenplasma (SP) besitzen einen Faktor, der im unreifen Nebenhodensperma des Caputs, welches vom Stier stammt, in vitro-Vorwärtsbeweglichkeit (FM) induziert. Es wird auf Acott, T. S., und Hoskins, D. D. J Biol Chem, 253, 6744–6750, 1978, Hoskins, D. D., Brandt, H. und Acott, T. S. Fed. Proc. 37, 2534–2542, 1978 verwiesen. Für den Fall von Hamstern wird auf Cornwall, G. A., Smyth, T. S., Vindivich, D., Harter, C., Robinson, J. und Chang, T. S. K. Biol Reprod 35, 1065–1074, 1986 verwiesen. Und für den Fall der Ziege wird auf Jaiswal, B. S. und Majumder, G. C., Int J Androl, 19, 97–102, 1996 verwiesen. Hoskins und seine Mitarbeiter (Acott, T. S. und Hoskins, D. D. J Biol Chem, 253, 6744–6750, 1978, Hoskins, D. D., Brandt, H. und Acott, T. S. Fed. Proc. 37, 2534–2542, 1978) haben den aktiven Bestandteil von SP und EP aus dem Rind teilweise aufgereinigt und als Forward Motility Protein (FMP) bezeichnet. FMP stammt aus dem Nebenhoden, nach seiner Synthese im Nebenhoden wird der Faktor in das Nebenhodenplasma ausgeschieden und anschließend tritt es in das Samenplasma über (Brandt, H., Acott, T. S., Johnson, D. J., und Hoskins, D. D. Biol. Reprod. 19, 830–835, 1978). Zur Isolierung von FMP haben diese Forscher verschiedene Fraktionierungsmethoden, wie im Folgenden näher ausgeführt, verwendet. Das SP vom Rind wurde bei 90°C für 10 Minuten erwärmt und anschließend bei 1,78,000xg für 60 Min zur Entfernung der ausgefällten Proteine zentrifugiert. Das sich ergebende überstehende Fluid wurde Sepharose 6B-Chromatographie unter Verwendung eines Puffers, der 4 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol und 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthält, unterworfen. Durch diese Verfahren wurde FMP etwa 15-fach gereinigt. Alternativ wurde der Faktor auch weiterhin durch Concanavalin A-Agarose-Affinitätschromatographie des wärmebehandelten SP teilweise gereinigt. FMP bindet an Concanavalin A und wurde mit 0,25 M-α-Methyl-D-mannosid eluiert. Das isolierte FMP enthielt verschiedene Proteine, wie durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gelelektrophorese gezeigt, und der Reinheitsgrad von FMP ist nicht bekannt. Unter Verwendung ähnlicher Verfahren wurde SMP aus EP vom Rind isoliert, obwohl dessen Reinheitsgrad nicht bekannt ist. FMP ist ein wärmestabiles Glycoprotein von 37 KDa, von dem angenommen wird, dass es für die Initiierung der FM des Spermas während der Nebenhodenspermienentwicklung wesentlich ist. FMP induziert in den unreifen/unbeweglichen Nebenhodenspermatozoen des Caputs vom Rind in vitro Vorwärtsbeweglichkeit.
Gegenstand der Erfindung
Den Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung eines gereinigten, neuen Forward Motility Proteins (FMP) aus dem Nebenhoden der Ziege dar, welches insbesondere aus dem EP des Nebenhodens der Ziege stammt. Ein weiterer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung eines neuen FMP (125 KDa) aus dem EP der Ziege, welches sich vom FMP vom Rind, wie oben erwähnt, stark unterscheidet. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung haben wir zum ersten Mal die vollständige Reinigung von FMP erreicht: Der Initiator/Aktivator der physiologischen Spermienbeweglichkeit aus dem EP. Das isolierte FMP, welches durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, ist homogen, wie durch herkömmliche Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und isoelektrische Fokussierungsmethoden bewiesen wurde, was zur Folge hat, dass die Reinheit von FMP nahezu 100% ist. Das erhaltene FMP (125 KDa) unterscheidet sich von dem FMP mit 37 KDa, welches von Acott T. S. und Hoskins D. D., J. Biol. Chem. 253, 6744–6750, 1978, teilweise aus SP vom Rind gereinigt wurde. FMP ist hochimmunogen und sein Antikörper hemmt die FM von reifen Spermien stark, was zur Folge hat, dass FMP das Potenzial aufweist, als empfängnisverhütender Impfstoff zu dienen. Da das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Protein eine hohe Wirksamkeit zur Stimulierung der Beweglichkeit von reifen Spermatozoen aufweist, hat das FMP die Möglichkeit, einige der Probleme der Unfruchtbarkeit beim Menschen aufgrund der geringen Spermienbeweglichkeit zu verbessern. Das FMP aus dem Nebenhoden der Ziege, welches durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, weist im Vergleich zu den Beweglichkeits-fördernden Proteinen aus dem Serum vom Menschen (etwa 200 kDa) eine auffallend unterschiedliche Molekülmasse auf. Verwiesen werden kann auf die Patente Nr. WO 9012032 , 18. Okt., 1990, US 530 4464, 19 . Apr., 1994; US 545 3354, 26 . Sept. 1995. Es unterscheidet sich auch vom Büffelserum (66 kDa), welches in unserer Patentanmeldung Nr. EP 0 939 085, 1 . Sept. 1999 beschrieben und beansprucht worden ist, das die Möglichkeit zur Behandlung von Unfruchtbarkeit beim Menschen aufgrund geringer Spermienbeweglichkeit aufweist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes, neues Forward Motility Protein des Nebenhodens der Ziege und ein Verfahren zur Isolierung des Forward Motility Proteins des Nebenhodens bereit, welches als die Fruchtbarkeit aktivierendes/blockierendes Mittel geeignet ist, welches das Unterwerfen des Nebenhodenplasmas der Ziege gegenüber mehrfachen Fraktionierungen bis zur Reinigung umfasst, um das gereinigte neue Forward Motility Protein des Nebenhodens zu erhalten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Fraktionierung unter Verwendung von Verfahren wie zum Beispiel Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose/Sephadex als Ionenaustauscher-Harz, Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Carboxymethyl (CM)-Cellulose/Sephadex als lonenaustauscher-Harz, Concanavalin A-Sepharose-4B-Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung unter Verwendung von Polypuffer-Austauscher, welcher als PBE-94-Harz bezeichnet wird, Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Aluminiumoxidgel oder Hydroxyapatit von BioRad und Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Sephacryl/Sephadex als unlösliche Matrix oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Das Verfahren dieser Erfindung umfasst (a) Reinigung und Charakterisierung eines neuen FMP und (b) die Methoden für dessen Reinigung aus dem EP der Ziege. Unsere Erfindung berichtet zum ersten Mal die Reinigung bis hin zur offensichtlichen Homogenität von FMP aus EP. Die Reinheit des isolierten FMP ist unter Verwendung mehrerer moderner analytischer Methoden, wie zum Beispiel PAGE, HPLC, Isoelektrofokussierung etc. begründet worden. Die Molekülmasse von nativem FMP, die durch Sephacryl S-200-Gelfiltration, HPLC und herkömmlicher PAGE bestimmt wurde, beträgt etwa 125 KDa. Es ist ein dimeres Protein mit Untereinheiten von etwa 70 und 54 KDa. Der Faktor weist hohe Proteinspezifität sowie Affinität zum Induzieren von FM in vitro im unreifen Nebenhodensperma auf. FMP in einer Menge von 30 μg/ml zeigte maximale Beweglichkeits-fördernde Aktivität. FMP ist auch in der Lage, die FM des reifen Spermas der Cauda der Ziege zu steigern. Ca²⁺ und Mg²⁺ stimulieren die Aktivität des FMP. Behandlung von Spermatozoen mit FMP verursachte einen wesentlichen Anstieg der Menge von zyklischem AMP im Inneren der Spermien, wodurch nahegelegt wird, dass FMP die Spermienbeweglichkeit durch Aktivieren der Membran-gebundenen Adenylzyklase stimuliert. Es stellt ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt (PI) von etwa 4,75 dar. Es ist gegenüber Wärmebehandlung bei 100°C für 3 Min stabil. Es ist ein Glykoprotein, das mit hoher Affinität an Concanavalin A (Con A) bindet. Es enthält Mannose, Galactose und N-Acetylglucosamin etwa in den Verhältnissen von 6:1:6. FMP verliert seine Aktivität merklich, wenn es mit α-Mannosidase, β-N-Acetylglucosaminidase und proteolytischen Enzymen inkubiert wird, wodurch angezeigt wird, dass sowohl die Zucker- als auch Proteinteile für seine biologische Aktivität wesentlich sind. Immunofluoreszenz-Untersuchungen zeigen, dass FMP auf der äußeren Oberfläche des Spermiums mit besonderem Schwerpunkt auf die Kopfregion positioniert ist. FMP ist stark immunogen. Antikörper gegen FMP hemmen die FM von reifem Ziegensperma sowie die FMP-induzierte Beweglichkeitsinitiierung im unreifen Spermium in vitro merklich. Unter Verwendung von Enzymgekoppeltem Immunadsorptions-Assay (ELISA) ist die Verteilung von FMP in einer Vielfalt von Geweben und in einigen Körperfluiden untersucht worden. Die spezifische Aktivität von FMP ist im Nebenhodenplasma am höchsten. FMP oder/und immunologisches) kreuzreaktives) Proteine) liegen im Knochenmark und Blutserum in wesentlichen Mengen vor. Die anderen untersuchten Gewebe weisen niedrige/unwesentliche Mengen von FMP auf. Der Faktor kommt in der Spermien-Plasmamembran vor, und die Membran-gebundene FMP-Menge steigt während der Spermienentwicklung des Nebenhodens merklich an. Das gereinigte Protein (FMP) aus dem EP der Ziege ist ein physiologisches Beweglichkeits-aktivierendes Protein. FMP ist ein neues Beweglichkeitsförderndes Protein, dessen Eigenschaften sich von denjenigen, über die in der Literatur berichtet wurde, deutlich unterscheiden (Acott, T. S. und Hoskins, D. D. J. Biol. Chem., 253, 6744–6750, 1978).
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht im Wesentlichen aus der Isolierung von FMP aus dem Nebenhodenplasma der Cauda der Ziege und Reinigung des Proteins. Nebenhodenplasma wurde zunächst mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Das die Beweglichkeit aktivierende Mittel wurde mit 30–70% Sättigung des Salzes sedimentiert. Die Salzfraktion von FMP wurde anschließend einem Anionenaustauscher-Harz, wie zum Beispiel DEAE-Cellulose/Sephadex unter Verwendung von Alkalipuffer mit geringer Ionenstärke (z.B. 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0) unterworfen. Der Faktor bindet an das Harz und kann bei höherer Konzentration des Salzes, wie zum Beispiel 100–200 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, von der Säule eluiert werden. Das FMP kann auch durch Kationen-Austauschchromatographie unter Verwendung von CM-Cellulose/Sephadex als Harz und Säurepuffer mit geringer Ionenstärke (z.B. 10 mM Na-Acetat-Puffer, pH 5,6) gereinigt werden, wenn das die Beweglichkeit aktivierende Mittel (FMP) nicht an das Harz bindet. Das teilweise gereinigte FMP, wie nach Ionen-Austauschchromatographie erhalten, wurde weiterhin durch Concanavalin A-Affinitätschromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharose-4B-Affinitätsmatrix gereinigt. FMP bindet an die Matrix und kann mit 0,25–0,50 M α-Methyl-D-manopyranosid von der Säule eluiert werden. Das die Beweglichkeit aktivierende Mittel kann weiterhin durch Chromatofokussierung unter Verwendung von PBE 94-Harz (Pharmacia) und Polypuffer 74 als Elutionspuffer gereinigt werden. Das die Beweglichkeit fördernde Mittel wurde anschließend Adsorptionschromatographie unter Verwendung einer unlöslichen Gelsuspension (z.B. Aluminiumoxidgel- oder Hydroxyapatitgel-Bead von BioRad) unterworfen. Für Adsorptionsuntersuchungen kann ein Puffer mit geringer Ionenstärke (z.B. 10–20 mM Kaliumphosphat, pH 7–8) verwendet werden. Der Faktor bindet an das Gel und kann mit einer verhältnismäßig hohen Salzkonzentration (z.B. 500 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 bis 8,0) eluiert werden. Das teilweise gereinigte FMP, wie nach Adsorptionschromatographie erhalten, wurde weiterhin durch Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Sephacryl/Sephadex als unlösliche Matrix oder HPLC-Säule unter Verwendung von Phosphatpuffer von variierenden pH-Werten (6,9 bis 7,5) und variierenden Ionenstärken (100–150 mM) gereinigt. Eine geeignete Kombination dieser Verfahren führt zu etwa 200- bis 500-facher Reinigung des die Beweglichkeit-aktivierenden Mittels aus dem Nebenhodenplasma mit Gewinnung von etwa 10 bis 20% der Gesamtaktivität, die in dem Nebenhodenplasma vorliegt.
Diese Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die das Forward Motility Protein des Nebenhodens der Ziege zusammen mit einem beliebigen geeigneten Träger umfassen. Beispiele geeigneter Träger sind Kulturmedien oder andere Salzlösungen. Die pharmazeutischen Zubereitungen werden gemäß per se bekannter Verfahren hergestellt. Die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der Erfindung weisen Möglichkeiten für die Behandlung von Unfruchtbarkeit auf.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird weiterhin im Folgenden unter Verwendung von Beispielen veranschaulicht, welche nicht den Umfang der Erfindung einschränken sollen.
Beispiel: 1
Nebenhoden der Cauda der Ziege wurden aus den örtlichen Schlachthäusern gesammelt. EP wurde, wie bereits beschrieben, aus den Nebenhoden der Cauda hergestellt (Roy N., Majumder G. C. und Chakraborty C. K. Andrologia, 17, 200–206, 1985). Während der Extraktion des EP wird es mit einer modifizierten Ringerlösung (RPS-Medium: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 10 mM Glucose, 16,3 mM Kaliumphosphat, pH 6,9, Penicillin, 50 Einheiten/ml) verdünnt. Das hergestellte EP enthält 5 bis 10 mg Protein/ml. EP enthält FMP, das in vitro in dem unreifen Sperma des Caputs des Nebenhoden, wie bereits berichtet, die Initiierung von FM verursacht (Jaiswal B. S. und Majumder G. C. Int. J. Androl. 19., 97–102, 1996).
Zur Isolierung von FMP wurde 250 ml EP verwendet, das 8,8 mg Protein/ml und 100 Einheiten FMP/ml, eine Einheit FMP enthält, die als Menge des Faktors definiert ist, der bei 10% der Spermienzellen FM induziert. EP wurde zunächst einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung unter Verwendung von 0–30% und 30–70% Sättigung von Ammoniumsulfat unterworfen. In jedem Schritt wurde die Proteinsuspension für 15 Min bei 18000 g zentrifugiert, und das sedimentierte Proteinpellet wurde in 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, gelöst, während die Überstände weiterer Sättigung durch das Hinzufügen des festen Ammoniumsulfats unterworfen wurden. Etwa 90% der FMP-Aktivität wurde durch 30–70% Sättigung von Ammoniumsulfat sedimentiert. Die aktive Fraktion aus der (NH₄)₂SO₄-Fraktionierung wurde gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 dialysiert. Das erhaltene FMP wurde anschließend weiterhin durch Ionenaustauschchromatographie über eine Säule (0,75 × 7,5 cm) von DEAE-Cellulose gereinigt, die vorher mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 äquilibriert wurde. FMP bindet an das Harz, und die Hauptmenge der FMP-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von Kaliumphosphat-Puffer (165–185 mM), pH 8,0 eluiert. Die aktiven FMP-Fraktionen wurden vereinigt und durch Amicon-Ultrafiltration über PM-30-Membran konzentriert. Die FMP-Zubereitung wurde anschließend in Puffer-1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 1,0 mM CaCl₂, 1,0 mM MgCl₂ und 1,0 mM MnCl₂) dispergiert und anschließend Con A-Sepharose-Aftinitätschromatographie unterworfen. Die Probe wurde auf eine Con A-Sepharose-Säule (1 × 12 cm) aufgetragen, die zuvor mit Puffer-I äquilibriert wurde. FMP bindet an das Harz, und es wurde mit 0,5 M α-Methyl-D-mannopyranosid eluiert.
FMP wurde weiterhin durch Chromatofokussierung über PBE-94: ein Produkt von Pharmacia, gereinigt. Eine Säule (0,7 × 10 cm) von lonenaustauscher-Harz PBE-94 wurde mit 25 mM Imidazol-HCl, pH 7,4, äquilibriert, und die FMP-Probe wurde darauf aufgetragen. Während die Probe darüber läuft, wurde die Säule mit äquilibrierendem Puffer gewaschen. FMP wurde anschließend mit Polypuffer 74-HCl, pH 4,0 (Pharmacia) eluiert, wobei das Volumen jeder Fraktion 1 ml beträgt. Die aktiven FMP-Fraktionen wurden vereinigt, durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung von PM – 30-Membran konzentriert und anschließend gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, dialysiert. Die sich ergebende FMP-Zubereitung wurde mit 10 ml Aluminiumoxidgel (250 mg/ml, Sigma Chemical Co.), welches in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, suspendiert wurde, gemischt. Das Gemisch wurde für 1 hr bei 4°C gerührt. Die Suspension wurde anschließend bei 500 g für 10 Min zentrifugiert. Der Überstand (nicht-adsorbierte Fraktion) wurde verworfen, und das gebundene FMP wurde mit 0,5 Kaliumphosphat, pH 7,5, eluiert. Die FMP-Zubereitung wurde durch Ultrafiltration über Amicon PM-30-Membran konzentriert und in RPS-Medium, pH 6,9, dispergiert. FMP wurde anschließend über eine Sephacryl S-200-Gelfiltrationssäule (0,9 × 50 cm), die mit RPS-Medium, pH 6,9, äquilibriert wurde, chromatographiert. Elution wurde mit den äquilibrierenden Pufferfraktionen (jeweils 1 ml), die in einer LKB-Fraktioniervorlage gesammelt wurden, ausgeführt und Proteingehalte der Fraktionen wurden durch Extinktion bei 280 nm kontrolliert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung von PM-30-Membran konzentriert. Alle Reinigungsschritte wurden bei 0–4°C ausgeführt. Durch diese Verfahren wurde FMP etwa 500-fach gereinigt, wobei die spezifische Aktivität des gereinigten Faktors etwa 5000 Einheiten/mg Protein beträgt. Das isolierte FMP war etwa 100% rein. Die Ausbeute des reinen FMP betrug etwa 0:6 mg von 250 ml der EP-Zubereitung und die Gesamtgewinnung seiner Aktivität betrug etwa 12%.
Beispiel 2
Nebenhoden der Cauda der Ziege wurden aus den örtlichen Schlachthäusern gesammelt. EP wurde anschließend, wie bereits berichtet, aus dem Nebenhoden der Cauda hergestellt (Roy N., Majumder G. C. und Chakraborty C. K. Andrologia, 17, 200–206, 1985). Während der Extraktion von EP wird es mit RPS-Medium verdünnt. EP-Extrakt (500 ml: 9,6 mg Protein/ml) wurde anschließend Ammoniumsulfat-Fraktionierung unter Verwendung von 0–30% und 30–70% Sättigung von Ammoniumsulfat unterworfen. In jedem Schritt wurde die Proteinsuspension für 15 Min bei 18000 g zentrifugiert, und das sedimentierte Proteinpellet wurde in 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, gelöst, während die Überstände weiterer Sättigung durch das Hinzufügen des festen Ammoniumsulfats unterworfen wurden. Etwa 90% der FMP-Aktivität wurde durch 30–70% Sättigung von Ammoniumsulfat sedimentiert. Die aktive Ammoniumsulfat-Fraktion wurde gegen 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,6, dialysiert, und anschließend CM-Cellulosechromatographie unterworfen. Das Harz wurde mit 10 mM Na-Acetatpuffer, pH, 5,6, äquilibriert. Nach Passage der Probe wurde die Säule mit äquilibrierendem Puffer gewaschen. Die Säule wurde anschließend nacheinander mit jeweils 50 ml 10 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,6, eluiert, der 0,1 M, 0,2 M, 0,5 M und 1 M NaCl enthält. Der Hauptanteil von FMP (etwa 95%) band nicht an das Harz. Die nicht-zurückgehaltene Fraktion von FMP wurde durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung von PM-30-Membran konzentriert und gegen Puffer-1 dialysiert. Die dialysierte FMP-Fraktion wurde anschließend Con A-Sepharose-Affinitätschromatographie unterworfen. FMP bindet an die Con A-Affinitätsmatrix. Nach angemessener Reinigung der Säule mit Puffer-1, wurde FMP mit 0,5 M α-Methyl-D-mannopyranosid eluiert. Die aktive FMP-Fraktion wurde anschließend durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung von PM-30-Membran konzentriert und dann gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS: 50 mM Natriumphosphat, das 0,9% NaCl, pH 7,0, enthält) dialysiert. Das dialysierte FMP wurde anschließend über eine Sephacryl S-200-Gelfiltrationssäule (1 × 50 cm) chromatographiert, welche zuvor mit PBS äquilibriert wurde. 1 ml-Fraktionen wurden in einer LKB-Fraktioniervorlage gesammelt. Das Elutionsprofil von FMP wurde durch Extinktion bei 280 nm kontrolliert. Die aktiven FMP-Fraktionen wurden vereinigt, durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung von PM-30-Membran konzentriert und gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, konzentriert. Die sich ergebende FMP-Zubereitung wurde anschließend auf eine Hydroxyapatit-Säule (1 × 5 cm) aufgetragen. Das auf Hydroxyapatitgel adsorbierte FMP wurde mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, eluiert. Die aktiven FMP-Fraktionen wurden vereinigt, durch die Amicon-Ultrafiltration konzentriert und bei –70°C gelagert.
Alle Isolierungsschritte würden bei 0–4°C durchgeführt. Der Faktor wurde um das etwa 400-fache mit etwa 20% Ausbeute gereinigt. Das isolierte FMP war etwa 90% rein. Etwa 2,6 mg des teilweise gereinigten FMP wurden aus 500 ml EP-Zubereitung (enthaltend etwa 4,8 g Protein) erhalten.
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung liegen darin, dass sie ein neues Produkt aus den Nebenhoden entwickelt hat, das für verschiedene Verwendungen Möglichkeiten aufweist:

1. Antikörper von FMP hemmt stark die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien, welche für die Fruchtbarkeit der männlichen Geschlechtszellen wesentlich ist, was darauf hindeutet, dass FMP-Antikörper das Potenzial zum Blockieren der männlichen Fruchtbarkeit aufweist. Daher hat FMP das Potenzial, als empfängnisverhütender Impfstoff zu dienen.
2. Eine der wesentlichen Ursachen für Unfruchtbarkeit beim Menschen ist die geringe Spermienbeweglichkeit. Als aktivierendes Mittel der Spermienvorwärtsbeweglichkeit, welche für die Fruchtbarkeit der Spermien wesentlich ist, weist es die Möglichkeit auf, einige der Probleme der Unfruchtbarkeit beim Menschen zu verbessern.
3. Ein beliebiger Defekt der Beweglichkeit der Spermatozoen, die aus Nutztieren stammen, hat auch eine nachteilige Wirkung auf die Zucht dieser Tiere. Es ist sorgfältig belegt, dass Tierprodukte in der Weltwirtschaft eine wichtige Rolle spielen. Als aktivierendes Mittel der Spermienvorwärtsbeweglichkeit weist FMP daher eine enorme praktische Möglichkeit zum Verbessern der Zucht von Nutztieren auf, wodurch die Produktion einer Vielfalt von Tierprodukten, wie zum Beispiel Milch, Fleisch, Leder, Wolle etc. gesteigert wird.

Claims

Forward Motility Protein, welches aus dem Nebenhodenplasma der Ziege isoliert ist und eine Molekülmasse von 125 kDa aufweist; zwei Untereinheiten von 70 und 54 kDa umfasst; ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 4,75 ist; durch Ca²+ und Mg²+ aktiviert wird; gegenüber Wärmebehandlung bei 100°C für 3 Min stabil ist; ein Glycoprotein mit Mannose, Galactose und N-Acetylglucosamin als Zuckerresten ist und dessen Zuckerseitenkette und Proteinanteil für dessen Aktivität wesentlich ist.
Forward Motility Protein nach Anspruch 1, welches für das Aktivieren der Spermienbeweglichkeit eine hohe Proteinspezifität aufweist.
Forward Motility Protein nach Anspruch 1 oder 2, welches für das Aktivieren der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien bei 30 μg/ml eine optimale Wirksamkeit aufweist.
Forward Motility Protein nach einem der Ansprüche 1–3, welches stark immunogen ist.
Forward Motility Protein nach einem der Ansprüche 1–4, dessen Antikörper die Vorwärtsbeweglichkeit von Spermien stark hemmt.
Forward Motility Protein nach einem der Ansprüche 1–5, welches in hohen Mengen im Nebenhodenplasma der Cauda vorkommt.
Forward Motility Protein nach Anspruch 1, welches auf der äußeren Oberfläche des Spermienkopfes positioniert ist.
Forward Motility Protein nach Anspruch 1, welches in vitro in unreifem Sperma des Nebenhoden zur Initiierung von Vorwärtsbeweglichkeit erforderlich ist.
Verfahren zur Isolierung eines Forward Motility Protein aus dem Nebenhodenplasma der Ziege, welches gemäß Anspruch 1 definiert ist, welches Fraktionieren des Nebenhodenplasmas der Ziege, Reinigen des Motility Proteins aus dem obigen fraktionierten Plasma des Nebenhodens durch chromatographische Verfahren umfasst, wobei die Fraktionierung unter Verwendung von Ammoniumsulfat im Konzentrationsbereich von bis zu 70% Sättigung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Reinigung des Proteins durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Adsorptionschromatographie, Molekularsiebchromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei Ionenaustauscherharze, die zur Chromatographie verwendet werden, ausgewählt sein können aus Carboxymethylcellulose/Sephadex, Diethylaminoethylcellulose/Sephadex, Polypufferaustauscher, der als PBE 94-Harz bezeichnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die zur Adsorptionschromatographie verwendeten Materialien ausgewählt sein können aus Aluminiumoxidgel und Hydroxyapatit.
Verfahren zum Steigern der Spermienbeweglichkeit in vitro, umfassend das Hinzufügen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu den Spermien in vitro, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Proteinmakromolekül, welches gemäß Anspruch 1 definiert ist, umfasst, welches die Spermienbeweglichkeit stimuliert, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wodurch die Spermien dahingehend verbessert werden, dass sie bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit beim Menschen eine verbesserte Vorwärtsbeweglichkeit aufweisen und bei Nutztieren einige der Zuchtprobleme lösen.