DE69835534T3

DE69835534T3 - Wirkstoffkombination aus cpy2a enzyme inhibitoren und nikotine und ihre therapeutische anwendung

Info

Publication number: DE69835534T3
Application number: DE69835534T
Authority: DE
Inventors: M. Edward Toronto SELLERS; F. Rachel Toronto TYNDALE
Original assignee: Nicogen Inc
Current assignee: Nicogen Inc
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2010-09-23
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: AU762671B2; PT1033979E; CN1299276A; CA2312851A1; DE69835534T2; EP1033979B9; DE69835534D1; EP1033979B1; WO1999027919A2; EP1033979A2; BR9815128A; CN100362995C; AU1328699A; EP1033979B2; AU762671C; ES2273441T3; WO1999027919A3; JP2001524516A; ES2273441T5; NZ505439A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die Steuerung des Nikotinmetabolismus in einer Person; und Verstärkung von Nikotinersatztherapien.
Übersicht über den Stand der Technik
Nikotin ist eine der am meisten verwendeten psycho-aktiven Drogen der Welt. Die Weltgesundheitsorganisation berichtet, dass es derzeit mehr als 1 Milliarde Raucher weltweit gibt, oder grob gesprochen ein Drittel der Weltbevölkerung im Alter von 15 Jahren und alter. Es ist gut bekannt, dass Rauchen mit einem höheren Auftreten von vielen Krankheiten, einschließlich verschiedener Typen von Krebs, Atemwegserkrankungen, kardiovaskulären Krankheiten, gastrointestinalen Krankheiten sowie auch einer Vielzahl anderer medizinischer Komplikationen in Verbindung steht (Lee et al, Arch. Intern. Med., „Cigarette smoking, nicotine addiction, and its pharmacologic treatment,” 153 (1): 34–48 (1993)).
Nikotin ist die primäre Komponente, die in Tabak vorhanden ist und die für die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Tabakabhängigkeit verantwortlich ist (Henningfield et al., J Pharmacol. Exp. Ther.: „Abuse liability and pharmacodynamic characteristics of intravenous and inhaled nicotine,” 234(1): 1–12 (1985)). Insbesondere ist in der Wissenschaft bekannt, dass abhängige Raucher ihre Rauchgewohnheiten zur Aufrechterhaltung von zentralen Nikotinspiegeln anpassen (McMorrow MJ, et al., „Nicotine's role in smoking: an analysis of nicotine regulation,” Psychological Bulletin, 93(2): 302–27 (1983); Russell MSH, „Nicotine intake and its regulation by smokers. Tobacco Smoking and nicotine,” Advances in behaviour biology, Martin WR, et al., New York, Plenum Press, 31: 25–50 (1987)). Es wurde weiters bewiesen, dass (i) Rauchen ansteigt, wenn der Nikotingehalt in den Zigaretten abgesenkt wird (Benowitz NL, „Drug Therapy. Pharmacologic Aspects of Cigarette Smoking and Nicotine Addiction,” New Engl. J. Med., 319(20): 1318–30 (1988)), (ii) Rauchen ansteigt, wenn die Nikotinausscheidung durch Urinansäuerung ansteigt (Benowitz NL, ”The Use of Biologic Fluid Samples in Assessing Tobacco Smoke Consumption,” NIDA Res. Monogr., 48: 6–26 (1983)), und (iii) Rauchen mit der Verabreichung von Nikotin mit gleichzeitigem I. V. oder Nikotinpflastern abnimmt (Benowitz, NL et al., „Nicotine Metabolic Profile in Man: Comparison of Cigarette Smoking and Transdermal Nicotine”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 268(1): 296–303 (1994); und Benowitz, NL et al., „Intravenous Nicotine Replacement Suppresses Nicotine Intake From Cigarette Smoking”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254 (3): 1000–5 (1990)).
Im Hinblick auf die Schlüsselrolle von Nikotin in der Erzeugung von Tabakabhängigkeit und Regulierung des Rauchverhaltens ist es wichtig, das Muster des Nikotinmetabolismus und die Quellen der Veränderung dieses Metabolismus in Menschen zu verstehen.
In Menschen werden 60–85% des Nikotins in den inaktiven Metaboliten Cotinin metabolisiert (Benowitz et al. 1994). Das Cytochrom P450 (CYP) System wurde in den Metabolismus von Nikotin einbezogen. Ein Nachweis für die CYP-Involvierung in den Nikotinmetabolismus stammt von Rattenleberstudien, mit welchen gezeigt wurde, dass rekonstituierte gereinigte CYPs und spezifische Antikörper in der Lage sind, den Nikotinmetabolismus zu inhibieren. Insbesondere haben die Rattenstudien gezeigt, dass Phenobarbital induzierbare CYPs (das sind die CYPs; -2B1, -2B2, -2C6 und -3A2) in den Nikotinmetabolismus involviert sind. Von 12 geprüften menschlichen CYP-Formen zeigte CYP2B6 die höchste Nikotinoxidaseaktivität, wogegen CYP2E1 und CYP2C9 dazwischen liegende Niveaus zeigten (Flammang et al., ”Nicotine metabolism by cDNA-expressed human cytochrome P-450s,” Biochem. Arch., 8: 1–8 (1992)). cDNA-Studien haben CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 und CYP2E1 einbezogen und eine mögliche Rolle für CYP2A6 im Nikotinmetabolismus in isolierten Expressionssystemen ergeben (Flammang et al., 1992; McCracken et al., ”Cotinin formation by cDNA-expressed human cytochromes P450,” Med. Sci. Res., 20: 877–878 (1992)).
In der gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung S. N. PCT/CA97/00506 (angemeldet am 17. Juli 1997), deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, lehren die gegenwärtigen Erfinder, dass das genetisch-polymorphe CYP2A6 Enzym das Hauptenzym ist, welches für diese Stoffwechselumwandlung verantwortlich ist. In menschlichen Bevölkerungen existiert eine beachtliche interindividuelle Variabilität in der hepatischen CYP2A6 Funktion, gemessen in vivo und in vitro (Yamano S, et al., ”The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human liver microsomes”, Biochemistry, 29: 1322–1329 (1990); Cholerton S, et al., ”Comparison of a novel thin-layer chromotographic-fluorescence detection method with a spectrofluorometric method for the determination of 7-hydroxycoumarin in human urine”. Journal of Chromatography, 575(2): 325–30 (1992); Rautio A, et al., ”Interindividual variability of coumarin 7-hydroxylation in healthy volunteers, ”Pharmacogenetics 2(5): 227–33 (1992); und Iscan et al., ”Interindividual variability of coumarin 7-hydroxylation in a Turkish population,” Eur. J. Clin. Pharmacol. 47(4): 315–318 (1994)).
WO 95/34679 beschreibt, dass Cumarin, manchmal in Verbindung mit Cimetidin, verwendet wird, um neoplastische Krankheiten zu behandeln. RU 2066998 beschreibt ein antivirales Mittel, welches Cichorium intybus aufweist. WO97/13489 beschreibt ein Antidepressivum, welches Hyperikum enthält. Nakagina et al (J. Pharmacol. Exp. Ther. 272: 1010–1015, 1996) beschreibt, dass die pharmakologischen Wirkungen von Tabak (d. h. von Rauchen) von Nikotin herrühren und dass die metabolische Umwandlung von Nikotin zu Continine und Trans-3'-Hydroxycotinin durch die Wirkung des Enzyms CYP2A6 durch Cumarin inhibiert wird. Yamazaki et al (Carcinogenesis, 13(10), 1789–1794, 1992) beschreibt, dass CYP2A6 die Umwandlung von Tabakrauch zugehörigen Nitrosaminen zu gentoxischen Produkten katalysiert.
Tabakprodukte sind Vehikel für die Abgabe von Nikotin an den Blutstrom, welcher Nikotin rasch zum Gehirn und anderen Organen transportiert. Nikotin produziert viele physiologische und verhaltensspezifische Wirkungen, einschließlich der Veränderung der Gehirnchemie und Funktion, welche zur Abhängigkeit eines Individuums von Nikotin führt. Abhängige Raucher stellen ihre Rauchgewohnheiten ein, um Nikotin im Gehirn und im Körper zu regulieren. Nachweise beinhalten, dass Rauchen verstärkt wird, wenn der Nikotingehalt der Zigaretten abgesenkt ist (Benowitz 1988), bzw. Rauchen verstärkt wird, wenn die Nikotinausscheidung durch Harnsäuerung erhöht ist (Benowitz 1983), und dass das Rauchen durch gleichzeitige I. V. Abgabe von Nikotin oder Nikotinpflastern verringert wird (Benowitz et al. 1994; Benowitz NL, et al. 1990).
Während im Fachgebiet Schritte zum Erlangen des Verständnisses des Musters des Nikotinmetabolismus und der Quellen der Veränderung des Metabolismus in Menschen gemacht wurden, gibt es nach wie vor Raum für Verbesserung. Ein Bereich, der geringe oder überhaupt keine Aufmerksamkeit gefunden hat, ist in der Diagnose der Risiken für Rauchen und Tabak-bedingte Krebse, z. B. bei Nichtrauchern in relativ jungem Alter. Insbesondere würde es wünschenswert sein, ein Mittel zu haben, durch welches es möglich wäre, schon früh Individuen zu identifizieren, welche: (i) erhöhtes Risiko haben Raucher zu werden; (ii) weniger rauchen, wenn sie abhängig werden, und/oder (iii) ein relativ niedrigeres Risiko für Krebs aufweisen könnten, welches sowohl durch verminderte Rauchexposition und verminderte enzymvermittelte Aktivierung der Tabakrauch-Prokarzinogene bedingt ist.
Neben der Nikotinabhängigkeit als Ergebnis von Tabakgebrauch wird Nikotin selbst nicht als gefährlich eingestuft, nämlich es wird nicht als kausales Mittel bei Krebs und Herz- und Lungenkrankheiten angesehen. Es sind die anderen Produkte, die in Tabakprodukten gefunden werden, die als gefährlich eingestuft werden, einschließlich Verbrennungsprodukte wie Kohlenmonoxid, Gase und Teer.
Nikotinersatztherapien (folgend in der Beschreibung auch als „NRT's” bezeichnet) werden verwendet, um Nikotin an Personen abzugeben, mit dem Versuch, einem Individuum zu helfen, von Tabakprodukten Abstand zu nehmen. In einer Vereinte-Nationen-Konferenz für Handel und Entwicklung, welche „Roundtable an Social and Economic Aspects of Reduction of Tobacco Smoking by Use of Alternative Nicotine Delivery Systems” betitelt wurde, September 22–24, 1997 wurde in einem Versuch, die tabakabhängige Krankheitsziffer und Sterblichkeit zu verringern, kürzlich vorgeschlagen, dass Nikotinersatztherapien leichter zugänglich sein sollen als Tabak.
Das Rauchen von Tabakprodukten führt zu einem schnellen Abgabemechanismus von Nikotin an den Blutstrom, da beinahe alles vom Tabakrauch absorbierte Nikotin den systemischen Kreislauf erreicht, ohne notwendiger Weise zuerst durch die Leber hindurchzugehen. Aus diesem Grunde basierten herkömmliche Nikotinersatztherapien auf der Verwendung eines Abgabesystems (z. B. transdermal und dergleichen), welches Nikotin systemisch abgeben wird.
Leider sind die derzeit im Handel erhältlichen NRT's relativ unangenehm zu verwenden und zu applizieren und werden durch viele Patienten nicht gewünscht. Zum Beispiel sind transdermale (z. B. transdermal, Kaugummi, und dergleichen) NRT's mit gelegentlichen Hautirritationen assoziiert und Kaugummi (und andere bukkale Abgabesysteme) NRT's werden als schlechten Geschmack aufweisend wahrgenommen. Weiters werden die transdermalen und Kaugummi NRT's durch die Abgabe von inkonstanten Nikotinniveaus an den Patienten geplagt. Noch weitere, alternative Abga be-NRT-Systeme, wie Inhalatoren und Nasensprays, haben Akzeptanz durch Patienten nicht erreicht.
Es ist zu bemerken, dass nach Wissen der Erfinder, eine orale Nikotinersatztherapie derzeit nicht kommerziell erhältlich ist. Während es nicht gewünscht ist, an irgendeine spezielle Theorie oder Wirkungsweise gebunden zu sein, ist angenommen, dass der Grund dafür wie folgt ist. Orales Nikotin muss zuerst durch die Leber gelangen bevor es in den systemischen Kreislauf eintritt. Als Ergebnis tritt ein sehr starker Metabolismus von Nikotin auf. Insbesondere orales Nikotin wird etwa 60–85% von Nikotin zu Coninin durch die Leber umgewandelt, so dass nur 15–40% des oralen Nikotins den systemischen Kreislauf erreicht (Benowitz et al, „Stable isotope studies of nicotine kinetics and bioavailability,” Clin. Pharmacol. Ther., 49(3): 270–7 (1991); Svensson, „Clinical Pharmacokinetics of nicotine,” Clin. Pharmacokinet., 12(1): 30–40(1987); and Zins, et al. ”Pharmacokinetics of nicotine tartrate alter single-dose liquid enema, oral, and intravenous administration,” J. Clin. Pharmacol., 37(5): 426–36 (1997)). Da der Erstschritt-Abbau von Nikotin so wirkungsvoll ist und hohe Konzentrationen von Nikotin nicht angewendet werden können ohne das Verdauungssystem zu irritieren, ist bis jetzt die orale Verabreichung (z. B. eine Tablette) ein unwirksames Abgabesystem für Nikotin. Im Licht desselben gibt es keine bekannte wirksame orale Nikotinersatztherapie. Es wäre wünschenswert eine solche Therapie zu haben, da es angenehmer für den Patienten wäre und genauer durch den Arzt gesteuert werden würde (z. B. Verschreiben der Dosierung auf Grund des Körpergewichtes und verwandte Faktoren, welche schwierig in Betracht zu ziehen sind, wenn Nikotinpflaster oder Kaugummi verschrieben wird).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, dass die Variation im Nikotinmetabolismus innerhalb der Einzelpersonen auf die unterschiedliche Expression von CYP2A Isozymen zurückzuführen ist; CYP2A6 wurde gezeigt, dass es das Hauptnikotinabbauenzym in der menschlichen Leber ist. Von Cumarin, einem spezifischen CYP2A6-Substrat, wurde gefunden, dass es spezifisch und selektiv den Nikotinmetabolismus zu Cotinin um 84% ± 11% in Testlebern inhibiert und der Zusatz von Orphenadrin (ein CYP2B6-Inhibitor) die Inhibierung verstärkt. Es wurde gefunden, dass Methoxsalen und Tranylcypromin auch potente Inhibitoren von CYP2A6 und damit des Metabolismus von Nikotin zu Cotinin sind. Die Daten zeigen, dass die Variabilität in CYP2A6 Expression zu Veränderungen innerhalb der Individuen beim Nikotinmetabolismus führt, was wiederum verhaltensmäßige Konsequenzen, wie mehr oder weniger Zigaretten zu rauchen, haben kann. Daher können Inhibitoren von CYP2A6 verwendet werden, um den Nikotinmetabolismus zu steuern, und insbesondere den Nikotinmetabolismus substantiell zu verringern und dabei den Tabakgebrauch zu beeinflussen.
Allgemein gesprochen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines CYP2A6 Inhibitors zur Zubereitung eines Medikamentes zur gleichzeitigen Verwendung mit Nikotin bei der Behandlung eines Zustandes, der eine Regelung des Nikotinstoffwechsels erfordert, wie in den Ansprüchen spezifiziert.
Die Erfinder haben ermittelt, dass die Gegenwart eines mutanten Allels des menschlichen Cytochrom P450 Enzyms CYP2A6 (in dieser Beschreibung kurz als „CYP2A6” bezeichnet) in einem Individuum für ein Individuum voraussagend ist, welches: (i) ein vermindertes Risiko, ein Raucher zu werden, aufweist, (ii) weniger Rauchen wird, wenn er/sie abhängig wird, und/oder (iii) relativ geringeres Risiko für Krebs aufweisen kann, welches sowohl auf die geringere Rauchexposition und auf die geringere CYP2A6 vermittelte Aktivierung von Tabakrauch und anderen Prokarzinogensubstraten zurückzuführen ist.
Diese Erfindung stellt die Verstärkung einer oralen Nikotintherapie wie eine orale Verabreichung von Nikotinbitartrat, durch Nikotinmetabolismus durch selektive Inhibierung von CYP2A6, gegebenenfalls mit weiterer selektiver Inhibierung von CYP2B6, bereit. Bevorzugte Inhibitoren von CYP2A6 schließen Tranylcypromin ein.
Die Erfindung kann verwendet werden, um einen Zustand, der Nikotinverabreichung verlangt, zu behandeln, und zwar bevorzugt durch Verabreichung des CYP2A6 Inhibitors, der zusammen mit einer oralen Formulierung von Nikotin genommen wird, gegebenenfalls auch Verabreichung eines CYP2B6 Inhibitors. Bevorzugte Inhibitoren von CYP2A6 schließen Tranylcypromin ein.
Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass verschiedene natürliche Produkte Inhibitoren des Enzyms CYP2A sind. Dementsprechend sieht die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung von CYP2A6 vor, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge eines natürlichen Produktes oder eines Extraktes eines natürlichen Produktes an ein Individuum, das dafür Bedarf hat, aufweist, wobei dieses Verfahren bei der Behandlung von Zuständen hilfreich ist, welche die Regulation von CYP2A6 Aktivität erfordern. In einer Ausführungsform ist das natürliche Produkt Hypericum oder ein Hypericumextrakt.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung klar. Aspekte dieser Erfindung können noch genauer in einer oder mehreren der U.S.-Provisional-Patentanmeldungen mit Nummern 60/067,20; 60/067,021; 60/084,847; und 60/107,392 beschrieben sein. Es ist allerdings zu verstehen, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur als Veranschaulichung gegeben sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird unter Hinweis auf die Zeichnungen besser verstanden werden in welchen:
1 das Ergebnis einer Studie illustriert, welche CYP2A6 Aktivität in heterozygoten CYP2A6 Individuen und Wildtyp CYP2A6 Individuen als Funktion der Zeit nach der Abgabe eines CYP2A6 Substrates zeigt;
2A bis 2D chemische Strukturen von einigen repräsentativen CYP2A6 Inhibitoren zeigen;
3 ein Diagramm ist, welches die Korrelation zwischen Cumarin (c) Testsitzungen am nüchternen Morgen und an einem nicht nüchternen Nachmittag illustriert;
4 ein Diagramm ist, welches einen Zeitverlauf der gesamten 7-Hydroxycumarin-Konzentration zeigt, welche in dem Plasma von Personen ermittelt wird, denen 100 mg Cumarin verabreicht wurden;
5 und 6 das Ergebnis der im Beispiel 1 beschrieben Studie illustrieren;
7 die mittleren Plasma-Nikotinkonzentrationen in der Studie, wie in Beispiel 8 berichtet, illustriert;
8 den aktuellen Wunsch nach Rauchen in der Studie, die in Beispiel 8 berichtet ist, illustriert;
9 das mittlere Atem-Kohlenmonoxid in der Studie, die im Beispiel 9 berichtet wird, veranschaulicht:
10 das Verhältnis von erhöhten Plasmanikotin zu erhöhten Atemkohlenmonoxid in Beispiel 9 veranschaulicht;
11 die mittlere Anzahl von Zigaretten die während der Rauchperiode in Beispiel 9 konsumiert werden, illustriert;
12 die mittlere Anzahl von Zigarettenzügen, die in jeder 10-Minuten-Periode während der Rauchperiode in Beispiel 9 genommen wurden, illustriert;
13 die mittlere Latenzzeit zwischen den beiden ersten Zigaretten in Beispiel 9 illustriert;
14 die mittleren Gramm-Mengen von Tabak die in Beispiel 9 verbrannt wurden, veranschaulicht.
15 die Wirkung der CYP2A6 Inhibitoren Methoxsalen und Tranylcypromin auf das Ansteigen der Bioverfügbarkeit von oral zugeführtem Nikotin mit der gleichzeitigen Reduktion des Wunsches zu rauchen, illustriert;
16 ein Diagramm ist, welches die Wirkung von Hypericumextrakten auf den Nikotinmetabolismus durch exprimierte menschliche cDNA CYP2A6 zeigt.
17 ein Diagramm ist, das die mittlere Plasmakonzentration von Nikotin gegenüber Zeit in der Gegenwart von Johanneskraut oder einem Placebo zeigt.
18 ein Balkendiagramm ist, welches die mittlere Plasmakonzentration von Nikotin in der Gegenwart von Johanneskraut oder einem Placebo zeigt.
19 Diagramme sind, welche die Wirkung von Esculetin auf den Nikotinmetabolismus durch menschliche Lebermikrosomen zeigen.
20 die chemische Struktur von verschiedenen Verbindungen die in natürlichen Produkten gefunden wurden, zeigt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie in der gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung S. N. PCT/CA97/00506 beschrieben, inhibiert die Inhibierung von CYP2A6 (und gegebenenfalls CYP2B6) den Metabolismus von Nikotin. Insbesondere wurde gefunden, dass CYP2A6 ein Hauptenzym zum Abbau von Nikotin in menschlicher Leber ist und dass durch Inhibierung von CYP2A6 der Abbau von Nikotin zu Continin in der Leber inhibiert ist.
Diagnostische Gesichtspunkte:
Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass Individuen, die CYP2A6 Mutantenallele in sich tragen (i) ein geringeres Risiko aufweisen Raucher zu werden, (ii) weniger Rauchen werden wenn er/sie abhängig wird und/oder (iii) ein relativ geringeres Risiko für Krebs haben können, welches sowohl auf geringere Rauchexposition als auch geringere CYP2A6 vermittelte Aktivierung von Tabakrauch und anderen prokarzinogenen Substraten zurückgeht.
In einem Aspekt, der nicht Teil der Erfindung ist aber für das Verständnis der Erfindung hilfreich ist, ist ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos eines Individuum zur Entwicklung von Krebs vorgesehen, welches die Bestimmung des Gentyps oder Phänotyps von einem CYP2A-Allel in dem Individuum aufweisen kann, wobei die Gegenwart eines Mutant-Allels eine Voraussage für ein vermindertes Risiko von Rauchen ist. Bevorzugt ist das CYP2A Enzym CYP2A6.
Tabakrauch enthält eine Anzahl von tabakspezifischen prokarzinogenen Nitrosaminen, zum Beispiel das N-Nitrosodiethylamin und 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK). Diese Verbindungen werden Pro- oder Prä-Karzinogene genannt, da sie durch den Körper aktiviert werden. Insbesondere können diese Tabakrauchprokarzinogene durch CYP2A6 aktiviert werden (Crespi, et al, „Human cytochrome P450IIA3: cDNA sequence, role of the enzyme in the metabolic activation of promutagens, comparison to nitrosamine activation by human cytochrome P450IIE1,” Carcinogenesis 11(8): 1293–1300 (1990); Yamazaki et al, „Cytochrome P4502E1 and 2A6 enzymes as major catalysts for metabolic activation of N-nitrosodialkylamines and tobacco-related nitrosamines in human liver microsomes,” Carcinogenesis 13(10): 1789–94 (1992)). Daher können Individuen, die CYP2A6 Nullallele aufweisen, auch weniger wirksam sein bei der Bioaktivierung von Tabakrauch-Prokarzinogenen zu Karzinogenen. Dies ist insbesondere von Interesse, da ethnische Variationen in den Häufigkeiten für CYP2A6 Varianten Allele existieren, (Nowak et al, 1998; Fernandez-Salguero P, et al, ”A genetic polymorphism in coumarin 7-hydroxylation: sequence of the human CYP2A genes and identification of variant CYP2A6 alleles,” Am. J. Hum. Genet., 57(3): 651–60 (1995); Yoloi and Kamataki, 1998) und in Verbindung stehen können mit den ethnischen Differenzen bei Auftreten und Histologie von Lungenkrebs (Groeger et al, 1997). Daher können Individuen, die CYP2A6 defekte Allele aufweisen, aus drei Gründen ein geringeres Risiko besitzen tabakbedingte Krebse und andere medizinische Komplikationen zu entwickeln. 1) Sie haben ein geringeres Risiko Raucher zu werden. 2) Wenn sie tabakabhängig werden rauchen sie weniger als jene ohne beeinträchtigten Nikotinmetabolismus was zu geringeren Expositionen zu tabakbedingten Prokarzinogenen führt (Law, et al., ”The dose-response relationship between cigarette consumption, biochemical markers and risk of lung cancer,” Br. J. Cancer 75(11): 1690–1693 (1997)). 3) Sie können weniger tabakbezogene Prokarzinogene aktivieren. Diese drei Faktoren legen eine signifikante Reduktion bei tabakbedingten Krebsen für Träger von CYP2A6 defekten Allelen nahe.
In einem nicht Teil der Erfindung darstellenden Aspekt, welcher für das Verständnis der Erfindung allerdings hilfreich ist, ist ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos eines Individuum zur Entwicklung von Krebs vorgesehen, welches das Bestimmen des Gentyps oder des Phänotyps eines CYP2A Allels in einem Individuum beinhaltet, wobei die Gegenwart eines Mutantenalleles eine Vorhersage eines verminderten Risikos des Rauchens ist. Bevorzugt ist das CYP2A Enzym CYP2A6.
Der diagnostische Aspekt beinhaltet sowohl phänotypische als auch gentypische Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum Wildtyp oder mutante Allelformen für CYP2A6 besitzt. Der phänotypische Versuch kann durch eine metabolische Studie ausgeführt werden, welche in Wirklichkeit ein in vivo Enzym-Versuch für die CYP2A6 Aktivität ist. Dieser Versuch kann durch das Verabreichen einer Dosis eines CYP2A6 Substrates, z. B. Nikotin oder Cumarin, und die Beobachtung des physiologischen Spiegels des Substrates und/oder des Produkts des enzymatischen Metabolismus des Substrates in dem Individuum zu einem oder mehrerer Zeiten während und nachfolgend der Verabreichung der Testdosis vorgenommen werden. Typischerweise werden die Spiegel in einem biologischen Fluid, wie Blut, Plasma oder Urin gemessen und zwar unter Verwendung von gut bekannten Versuchen für diese speziellen Komponenten, von welchen Beispiele hierin offenbart werden. Ein Beispiel eines in-vivo-Phänotyp- und Enzymaktivitätsversuches ist in Beispiel 3 weiter unten wiedergegeben. Dieser phänotypische Versuch kann verwendet werden, um Individuen basierend auf deren normal-exprimierten Niveau von CYP2A6 zu klassifizieren, welches im Allgemeinen korrespondieren wird mit dem Gentyp des Individuums als homozygot für vollaktives CYP2A6, heterozygot oder homozygot für ein niedriger aktives Allel, in abnehmender Reihenfolge der Nikotinmetabolismusrate.
Der diagnostische Aspekt beruht auch auf dem Analysieren einer DNA-enthaltenen Körperprobe eines Individuums auf die Gegenwart eines Mutantallels eines menschlichen Cytochrom P450 Enzyms CYP2A6. Wie hier durch die gesamte Beschreibung verwendet soll die Bezeichnung „Mutantenallele” alle Allele umfassen, die eine verminderte oder fehlende CYP2A6 Aktivität besitzen, das heißt einschließlich von Nullallelen. Die Gegenwart des Mutantallels von CYP2A6 kann durch herkömmliche Gentyp- oder Phänotyp-Versuche bestimmt werden.
Viele CYP2A6 Allele wurden identifiziert, einschließlich aber nicht beschränkt auf das Wildtyp Allel (in dieser Beschreibung durchwegs als „CYP2A6*1” bezeichnet) und zwei defekte oder Nullmutantenallele („CYP2A6*2” bzw. „CYP2A6*3” (siehe Fernandez-Salguero, et al. 1995), deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Das CYP2A6*2 Allel unterscheidet sich vom Wildtyp Allel durch eine einzelne Punktmutation, welche zu einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Histidin am Kodon 1609 führt. In vitro und in vivo Studien haben gezeigt, dass dieses Allel ein Nullallel ist. Mutationen bei dem CYP2A6*3 Allel treten in den Exons 3, 6 und 8 auf. Erst kürzlich wurde ein zusätzliches CYP2A6 Allel identifziert, welches aus einer gesamten CYP2A6 Gendeletion besteht (Nunoya K et al, 1998 „A new deleted allele in the human cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) gene found in individuals showing poor metabolic capacity to coumarin and (+)-cis-3,5-dimethyl-2-(3-pyridyl)thiazolidin-4-one-hydrochloride (SM-12502). Pharmacogenetics 1998, 8: 239–249. Natürlich können zusätzliche Mutantenallele, die CYP2A6 Enzyme mit verminderter Aktivität kodieren, in Individuen gefunden werden, die durch phänotypische und/oder gen-typische Methoden identifiziert wurden und von diesen Individuen ist auch zu erwarten, dass sie ein geringeres Risiko zur Entwicklung von Krebs und eine geringeres Risiko des Rauchens besitzen.
Das Individuum, das für diagnostische Methoden (sowie die später beschriebenen prophylaktischen und therapeutischen Methoden) in Erwägung gezogen wird, kann jede Art von Säugetier sein, aber ist bevorzugt ein Primat und stärker bevorzugt ein Mensch.
Vorzugsweise ist die körperliche Probe ein Fluid wie Blut oder Blutplasma. Alternativ kann die Körperprobe ein Gewebe sein. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, für die Erläuterung von allgemeinen Versuchstechniken die für diagnostische Methoden wie sie hierin beschrieben sind, nützlich sind.
Unter Bezugnahme auf 1 ist in dort das Ergebnis von CYP2A6 Aktivität in einer Gruppe (Gruppe I) von Individuen wiedergegeben, welche heterozygote CYP2A6 Aktivität aufweisen (d. h., jedes Individuum dieser Gruppe hat ein einzelnes Mutantenallel von CYP2A6 und ein einzelnes aktives Allel von CYP2A6) und einer Gruppe von Individuen (Gruppe II), welche Wildtyp CYP2A6 Aktivität besitzen (d. h. jedes Individuum dieser Gruppe hat zwei aktive Allele von CYP2A6). Blutplasmaproben von jedem der Individuen beider Gruppen wurden nach Verabreichung von Cumarin (100 mg) zu 35 Minuten, 45 Minuten und 75 Minuten entnommen. Cumarin 7-Hydroxylierung wurde verwendet, um die komplementäre Aktivität von CYP2A6 zu ermitteln. Die Ergebnisse der Phänotypversuchsreihe zeigen klar, dass die Gruppe I-Individuen eine deutlich niedrigere CYP2A6 Aktivität (weniger als die Hälfte bei 35 und 45 Minuten) aufweisen, als die Gruppe II-Individuen.
Alternativ dazu ist der Proband ein Individuum das einen CYP2A6 Genotyp verbunden mit einer aktiven Form des Enzyms aufweist. Der CYP2A6 Gentyp eines Individuums und die Gegenwart eines aktiven CYP2A6 Enzyms in einem Individuum kann unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren und Techniken bestimmt werden. Zum Beispiel wurde Cumarin 7 Hydroxylierung verwendet, um die CYP2A6 Aktivität zu messen (siehe, Cholerton, et al (1992) und Rautio, et al. (1992)).
Das Erkennen durch die vorliegenden Erfinder, dass CYP2A6 das Hauptenzym im Nikotinstoffwechsel in der menschlichen Leber ist legt nahe, dass das Enzym in einem Individuum überprüft werden kann, um das Risiko des Individuums, eine Tabakabhängigkeit zu entwickeln, zu bestimmen. Die Bestimmung von CYP2A6 Spiegeln kann auch verwendet werden, um in einem Individuum geeignete konventionelle Nikotinersatztherapien, wie Nikotinpflaster und Nikotingummi auszuwählen und zu beobachten. Es ist unwahrscheinlich, dass konventionelle Nikotinersatztherapien (z. B. Nikotingummi, Nikotinpflaster, Spray, Lungeninhalationen oder andere Formen) ein hohes Erfolgs ergebnis haben werden, wenn ein Individuum hohe Niveaus von CYP2A6 aufweist, obwohl solche Individuen gute Kandidaten für eine verstärkte NRT gemäß den hierin beschriebenen Verfahren sein können. Umgekehrt wird, wenn ein Individuum sehr niedrige Niveaus von CYP2A aufweist, das Verabreichen von Nikotin bei hohen Dosen wahrscheinlich zu erhöhter Toxizität und Nebeneffekten führen. Weiters kann die gleichzeitige Verabreichung eines CYP2A6 Inhibitors mit bestehenden NRT erwartet werden, die Kinetik von Nikotin aus dieser Quelle zu verringern und die Wirksamkeit von NRT (Erörtert weiter unten unter therapeutische Methoden) verstärken.
Therapeutische Aspekte:
Wie bereits vorher erwähnt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Behandlung von Zuständen, die eine Reduktion der Aktivität eines CYP2A6 Enzyms verlangen. Insbesondere bezieht sich der therapeutische Aspekt der vorliegenden Erfindung auf die Behandlung und Vorbeugung von Rauchen, einer in vivo Karzinogenbildung und Krebs in einem Individuum. All dies involviert die Abgabe eines CYP2A6 Inhibitors an ein Individuum.
Wie in der Beschreibung verwendet, bedeuten die Begriffe „Vorbeugung gegen Rauchen” und Vorbeugen gegen Rauchen wie sie in der Beschreibung verwendet werden, dass die Wahrscheinlichkeit des Beginnens mit Rauchen (d. h. das Fortschreiten von einer Zigarette bis zum regulären Rauchen) in einem derzeit nicht rauchendem Individuum (d. h. einer Person die niemals geraucht hat oder ein Ex-Raucher ist) und die Rückkehr zum Rauchen eines früheren Rauchers (d. h. Rückfallsprävention) erheblich abgeschwächt ist.
Die Begriffe „Regulierung des Rauchens” und „Regulieren des Rauchens” wie sie in dieser Beschreibung durchwegs verwendet werden, sollen angeben dass die Menge die gegenwärtig von einem rauchenden Individuum geraucht wird, reduziert oder zumindest nicht erhöht wird.
Die Begriffe „Behandlung des Rauchens” oder „Behandeln des Rauchens” meint das Beenden des gesamten Rauchens oder die mengenmäßige Reduktion des Rauchens wie sie sich in einem geringeren Gebrauch von Tabakprodukten, einer Abnahme des Musters des Gebrauches oder in der Abnahme der Tabakrauchexposition widerspiegelt. Das Maß von Tabakrauchexposition kann durch Analysieren des Atemkohlenmonoxids gemessen werden.
In einem Aspekt, der nicht Teil der Erfindung jedoch für das Verständnis der Erfindung hilfreich ist, ist ein Verfahren der Regulierung der Bildung von Karzinogenen in einem Individuum vorgesehen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge von einer oder mehreren Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) Substanzen, welche die CYP2A Aktivität inhibieren; (ii) Substanzen welche Transkription, Translation des CYP2A kodierenden Gens oder beides inhibieren; (iii) Substanzen, welche das Gesamte oder einen Teil des CYP2A kodierenden Gens entfernen. Bevorzugt ist das CYP2A CYP2A6.
Die Begriffe „Regulierung der Karzinogenbildung” und Regulierung des Bilden eines Karzinogens wie sie in dieser Beschreibung durchwegs verwendet sind, sollen bedeuten, dass das Auftreten von Karzinogenbildung in einem Individuum reduziert ist. Das kann z. B. dadurch erreicht werden, dass CYP2A Inhibierung genutzt wird um die Aktivierung von „Prokarzinogenen”, die in einem Individuum vorhanden sind, zu inhibieren. Wie in dieser Beschreibung durchwegs verwendet, soll der Begriff „Prokarzinogen” bedeuten, jegliche Substanz, welche wenigstens eine von procytotoxischen, promutagenen oder progenotoxischen Substanzen ist, einzubeziehen („pro” bedeutet, dass der Metabolit stärker aktiv ist als die Stammverbindung).
In einem Aspekt, der nicht Teil der Erfindung ist, jedoch für das Verständnis der Erfindung hilfreich ist, ist ein Verfahren zur Vorbeugung gegen Krebs in einem Individuum vorgesehen, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge von einer oder mehreren Substanzen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) Substanzen, welche CYP2A Aktivität inhibieren; (ii) Substanzen, welche Transkription, Translation des CYP2A kodierenden Gens oder beides inhibieren; (iii) Substanzen, welche das Gesamte oder einen Teil des CYP2A kodierenden Gens entfernen. Bevorzugt ist das CYP2A CYP2A6.
Die Begriffe „Krebsprävention” und „Vorbeugen gegen Krebs” wie sie in dieser Beschreibung durchwegs verwendet werden, sollen bedeuten, dass die Wahrscheinlichkeit des Beginns eines Krebs in einem derzeit krebsfreien Individuum (d. h. einer Person die niemals Krebs hatte oder deren Krebs in Remission ist) wesentlich verringert wird.
Die Begriffe „Inhibitor” und „Inhibierung” in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sollen eine breite Meinung haben und Substanzen umfassen, welche direkt oder indirekt (d. h. über reaktive Zwischenverbindungen, Metaboliten und dergleichen) auf CYP2A6 einwirken, um die Fähigkeit von CYP2A6, den Metabolismus eines Substrats zu katalysieren, zu inhibieren oder anders zu regulieren. Andere Substanzen welche indirekt auf CYP2A6 einwirken, schließen solche Substanzen ein, welche die Transkription und/oder Translation des CYP2A6 kodierenden Gens inhibieren. Insbesondere sollen die Begriffe „CYP2A6 Inhibierung” und „CYP2A6 Inhibitor” eine breite Meinung haben und jegliche Substanzen umfassen, welche (i) CYP2A6 Aktivität inhibieren; (ii) Transkription und/oder Translation des CYP2A6 kodierenden Gens inhibieren; oder (iii) CYP2A6 kodierendes Gen deletieren oder entfernen. Besonders bevorzugte Substanzen sind solche, welche die Kinetik der Metabolismen von Nikotin zu Cotinin ändern, das Rauchverhalten ändern, die Wahrscheinlichkeit der Abhängigkeit von Rauchen in einer Population von Nichtrauchern verändern oder die Kinetik der Bildung von Karzinogenen ändern, deren Bildung aus prokarzinogenen Substanzen durch CYP2A6 katalysiert wird und insbesondere einen biologischen Änderungseffekt zeigen ohne andere biologische Wirkungen zu signifikanten Spiegeln zu produzieren.
Eine Substanz wird „selektiv” CYP2A6 Aktivität inhibieren, wenn die Substanz die Kinetik des Metabolismus von Nikotin zu Cotinin ändern kann, das Rauchverhalten ändern kann, die Wahrscheinlichkeit von Abhängigkeit von Rauchen in einer Population von Nichtrauchern ändern kann oder die Kinetiken der Bildung von Karzinogenen ändern kann, deren Bildung aus Prokarzinogenen durch CYP2A6 katalysiert wird, und zwar grundsätzlich auf einem Dosisniveau, welches niedriger ist als die Dosis der Substanz, welche für die Bildung von anderen biologischen Wirkungen wirksam ist. Zum Beispiel ist weiter unten gezeigt, dass die Verabreichung von Methoxsalen dahingehen wirkt, die Plasmaspiegel von Nikotin anzuheben und den Wunsch zu rauchen in einem abhängigen Raucher verringert und zwar bei Spiegeln, die ein Viertel der therapeutischen Dosis zur Behandlung von Psoriasis durch Methoxsalen liegt.
Der Begriff „wirksame Menge”, wie hierin verwendet, meint eine Menge, die wirksam ist und bei Dosen und für Zeiträume, notwendig, um die gewünschten Resultat zu erhalten; das kann Begrenzen der Dosen bedeuten, wo das gewünschte Resultat selektive Inhibition ist, und Selektivität durch differentielle Inhibierung von CYP2A6 erreicht wird.
CYP2A6 Inhibitoren
Wie bereits weiter oben erwähnt bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem ihrer Aspekte auf die Regulierung des Nikotinmetabolismus zu Cotinin in einem Individuum, umfassend selektive Inhibierung von CYP2A6. Inhibierung von CYP2A6 kann erreicht werden durch Verwendung von Substanzen, welche CYP2A6 Aktivität inhibieren.
Substanzen, welche CYP2A6 Aktivität inhibieren, schließen Substanzen ein, welche spezifisch an CYP2A6 binden und dadurch dessen Aktivität inhibieren. Bevorzugte Inhibitoren von CYP2A6 schließen Tranylcypromin, Esculetinund Selegilin ein.
Siehe 2A bis 2D für die chemischen Strukturen von diesen Inhibitoren. Selektive und nicht-selektive Monoamin-Oxidase Inhibitoren (z. B. Selegilin) sind besonders bevorzugt. Verschiedene Isomere der oben genannten Verbindungen, von welchen gezeigt werden kann, dass sie CYP2A6 inhibieren, wie unten beschrieben, liegen innerhalb der Erwägungen dieser Erfindung.
Derivate und Analoga dieser Substanzen können ebenfalls bei der von der Erfindung verwendet werden. Derivate und Analoga umfassen Verbindungen, die strukturmäßig zu den hierin beschrieben Verbindungen ähnlich sind und die an die aktive Stelle des CYP2A6 binden können. Zum Beispiel schließen Derivate von Tranylcypromin pharmazeutisch akzeptable Salze, Ester und Komplexe von Tranylcypromin einschließlich Kalium- und Natriumsalze und Aminosäuren, Kohlenhydrate und Fettsäurekomplexe ein.
Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass natürliche Produkte und Extrakte von natürlichen Produkten die CYP2A6 Aktivität sowohl in menschlichen Leber-Mikrosomen und in reinen vollständigen menschlichen cDNA exprimierten Cytochromen inhibieren. Dementsprechend umfassen CYP2A6 Inhibitoren der vorliegenden Erfindung natürliche Produkte oder Extrakte von natürlichen Produkten, welche zur Hinderung von CYP2A6 in der Lage sind, wie beispielsweise Hypericum oder ein Hypericumextrakt.
Der Begriff „Hypericum”, wie hierein verwendet, wie synonym zu Hypericum perforatum, St. John's Kraut, Ziegenkraut und Johanniskraut. Die Bezeichnung „Hypericum oder ein Extrakt von Hypericum” wie hierin verwendet umfasst die ganze Pflanze Hypericum perforatum oder ein Deriviat, einen Extrakt, ein Isolat oder eine gereinigte Komponenten davon, die CYP2A6 Aktivität inhibieren kann. Die schließt natürliche Komponenten der Pflanzen und synthetische Analoga ein. Ein bevorzugter Extrakt von Hypericum ist ein Methanolextrakt.
Derivate von Hypericum, die bei dem Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung Verwendung finden können, umfassen Hypericin, Pseudohypericin, Quercetin, Hyperosid, Quercitrin, Isoquercitrin, Rutin, Campherol, Luteolin, 13-118-Biopigenin, 1,3,6,7-Tetrahydroxyxanthon, Procyanidine, Hyperforin, ätherisches Öl, Phenolcarbonsäuren (z. B. Chlorogensäure), Xanthon, Phenylpropane, Flavonolderivate, Biflavone, Proanthocyanidine, Xanthon, Phloroglucinole, Naphthodianthrone und essentielle(s) Öl-Bestandteile. Ebenfalls miteingeschlossen sind die pharmazeutisch akzeptablen Salze, Ester und Komplexe der Derivate, einschließlich Kalium- und Natriumsalze, und Aminosäure, Kohlenhydrat und Fettsäurekomplexe. Geeignete Derivate von Hypericum können ausgewählt werden aufgrund ihrer Fähigkeit, CYP2A6, mit mehr als 50% Inhibierung und/oder einem Ki von weniger als 300 μM zu inhibieren.
Die Fähigkeit einer Substanz selektiv CYP2A6 zu inhibieren und damit den Nikotinmetabolismus zu Cotinin zu regulieren, kann unter Verwendung der Methoden, wie hier für das Screening eines Inhibitors beschrieben, bestätigt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung, ist der CYP2A6 Inhibitor zumindest ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Tranylcypromin, Derivate davon und Analoga davon (siehe 2A).
CYP2B6 Inhibitoren
CYP2B6 Inhibitoren können auch in Kombination mit Inhibitoren von CYP2A6 verwendet werden, um eine verstärkte inhibitorische Wirkung zu erzielen. Inhibitoren von CYP2B6 schließen eine oder mehrere der Folgenden ein (i) Substanzen, welche CYP2B6 Aktivität inhibieren; oder (ii) Substanzen, welche Transkription und/oder Translation des CYP2B6 kodierenden Gens inhibieren. CYP2B6 Inhibitoren können auch alleine genützt werden, um den Nikotinstoffwechsel in einem Individuum zu inhibieren.
Substanzen, welche CYP2B6 Aktivität inhibieren, beinhalten Substanzen, welche spezifisch an CYP2B6 binden und dabei dessen Aktivität inhibieren. Beispiele von solchen Substanzen beinhalten Antikörper, welche spezifisch für CYP2B6 sind, einschließlich beispielsweise gewerblich erhältliche Antikörper, wie Anti-CYP2B6, der von Gentest Corporation, Woburn, Mass., U. S. A. verkauft wird.
Substanzen, welche CYP2B6 Aktivität inhibieren, schließen auch Substanzen ein, die ausgewählt sind aus Phenylethylaminen, Diphenylbarbituraten, Diethyl-substituierte Barbiturate und Hydantoine. Insbesondere Diphenhydramin und seine Derivate, einschließlich Orphenadrin (Der Merck Index, Nr. 6831), und Derivate oder Analoga von Orphenadrin und andere Antihistamininka, anticholinerge Substanzen, wie Choline und Analoga und Derivate davon, können als CYP2B6 Inhibitoren in verschiedenen Ausführungsformen der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Antikörper, wie polyklonale CYP2B1/2, polyklonale CYP2B1 und polyklona les CYP2B6, wie sie von Gentest Corporation, Woburn, Mass., USA verkauft werden, binden ebenfalls spezifisch an CYP2B6 sodass sie ebenfalls die Aktivität von CYP2B6 inhibieren.
Derivate von Orphenadrin, welche bei den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, schließen pharmazeutisch-akzeptable Salze, Ester und Komplexe von Orphenadrin, einschließlich Kalium- und Natriumsalze, und Aminosäure, Kohlenhydrate und Fettsäuren-Komplexe ein. In einer Ausführungsform können passende Analoga von Orphenadrin basierend auf ihrer funktionellen Ähnlichkeit zu Orphenadrin ausgewählt werden, einschließlich der Fähigkeit CYP2B6 zu inhibieren. Analoga von Orphenadrin können auch aufgrund ihrer dreidimensionalen Strukturähnlichkeit zu Orphenadrin ausgewählt werden.
Substanzen, welche Transkription und/oder Translation des CYP2B6 kodierenden Gens inhibieren, schließen eine Nukleinsäuresequenz ein, welche das CYP2B6 Gen kodiert (siehe 2B, GenBank Zugangsnummer HSP452B6 für die mRNA Sequenz von CYP2B6) oder Teile davon (z. B. der Bereich, welcher auf jeder Seite des Nukleotids 9 (ATG) ist, und die Stellen 111, 274, 424, 585, 762, 904, 1092 und 1234 nt), die relativ zur ihrer normalen Ausrichtung für die Transkription umgekehrt sind, dass heißt Antisense CYP2B6 Nukleinsäuremoleküle. Solche Antisense-Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie hierin beschrieben, hergestellt und in Zellen eingeführt werden.
CYP2B6 kann in einem Aspekt der Erfindung durch Interferenz mit der Transkription des CYP2B6 kodierenden Gens unter Verwendung von herkömmlichen Gentransferverfahren, wie hierin beschrieben, auch selektiv inhibiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der verwendete CYP2B6 Inhibitor Orphenadrin und Derivate oder Analoga von Orphenadrin.
Ein Inhibitor von CYP2A6 oder CYP2B6 kann durch Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für ein Epitop des Enzyms sind, auf das Enzym zielgerichtet sein. Zum Beispiel können bispezifische Antikörper verwendet werden, um dem Inhibitor eine Zielrichtung zu geben. Die bispezifischen Antikörper enthalten eine variable Region eines Antikörpers, der zumindest für ein Epitop von CYP2A6 oder CYP2B6 spezifisch ist, und eine variable Region eines zweiten Antikörpers, welcher in der Lage ist, an einen Inhibitor zu binden. Die bispezifischen Antikörper können durch die Bildung von Hybrid-Hybridomen hergestellt werden und zwar unter Verwendung von Verfahrensweisen, die im Stand der Technik bekannt sind, wie jene die in Staerz, et al. („Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(5): 1453–7 (1986)) und Staerz et al. (Immunology Today, 7:241 (1986)) offenbart sind. Bispezifische Antikörper können auch durch chemische Mittel hergestellt werden und zwar unter Verwendung von herkömmlichen Methoden, wie jene wie sie durch Staerz et al („Hybrid antibodies can target sites for a attack by T cells”, Nature, 314(6012): 628–31 (1995). und Perez, et al. („Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to antitarget cell antibody,” Nature, 316(6026): 354–6 (1985)) beschrieben sind, oder durch Expression von rekombinanten Immunglobulingenkonstrukten.
Nikotinersatztherapie
Eine orale Nikotinersatztherapie, die nur Nikotin allein enthält, würde unwirksam sein und zwar wegen des extensiven Metabolismus von Nikotin in der Leber, welches signifikant die systemische Verfügbarkeit von Nikotin herabsetzt. Allerdings würde die Verabreichung von Nikotin mit einem CYP2A6 Inhibitor die Bioverfügbarkeit und die Wirksamkeit der oralen Nikotintherapie erhöhen.
Wie hierin verwendet bedeutet „gleichzeitige Verabreichung” von zwei Substanzen an ein Individuum das jede der beiden Substanzen so bereitgestellt wird, dass sie beide in dem Individuum zur gleichen Zeit biologisch aktiv sind. Die exakten Details der Verabreichung werden von den Pharmakokinetiken der beiden Substanzen in gegenseitiger Gegenwart abhängig sein und können das Verabreichen der beiden Substanzen innerhalb einiger Stunden voneinander beabstandet oder sogar das Verabreichen einer Substanz innerhalb von 24 Stunden von Verabreichung der anderen Substanzen beinhalten, wenn die Pharmakokinetiken passend sind. Die Konzeption der passenden Dosierungsregeln sind Routine für jeden Fachmann, im Hinblick auf die Details, die hierin bezüglich der biologischen Aktivitäten der CYP2A6 Substrate und Inhibitoren dargelegt sind. In speziellen Ausführungsformen werden zwei Substanzen im Wesentlichen gleichzeitig verabreicht werden, das heißt innerhalb weniger Minuten vom jeweils anderen oder in einer einzigen Zusammensetzung, die beide Substanzen beinhaltet. Andererseits könnte ein CYP2A6 Inhibitor, welcher durch Deletieren oder Entfernung des CYP2A6 kodierenden Gens wirkt, Monate oder sogar Jahre vor der Verabreichung von Nikotin oder einem Prokarzinogen verabreicht werden, was sonst in ein Karzinogen durch CYP2A6 umgewandelt werden würde und die Wirkungen aufgrund der beiden Verabreichung können nach wie vor gleichzeitig sein.
Zusammensetzungen
Substanzen, welche CYP2A6 Aktivität inhibieren, hierin im Detail beschrieben, können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebaut werden. Deshalb beschreibt die Beschreibung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung zum Behandeln eines Zustandes, der eine Verringerung der Aktivität eines CYP2A6 Enzyms erfordert, welche eine wirksame Menge von einer oder mehreren Substanzen, die selektiv CYP2A6 inhibieren, Nikotin und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten aufweist. In einer ihrer Aspekte beschreibt die Beschreibung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung zum Vorbeugen gegen Rauchen, der Behandlung von Rauchen, der Steuerung von Rauchen, der Steuerung der Karzinogenbildung, Krebsprävention und/oder Krebsbehandlung. Weiters können die Zusammensetzungen auch zusammen mit anderen Wirkstoffen verwendet werden, einschließlich solcher anderer Wirkstoffe, welche für den CYP2A6-vermittelten Metabolismus anfällig sind, was zu einer Inhibierung oder Verringerung der Wirksamkeit der anderen Wirkstoffe führt.
Bedingungen, die die Steuerung des Nikotinmetabolismus zu Cotinin erfordern, beinhalten Nikotingebrauchserkrankungen – d. h. abhängige oder nicht abhängige Tabakgebrauch und Nikotin induzierte Krankheiten – d. h. Absetzung. Die Zustände können sich mit der Verwendung von allen Formen von Tabak (z. B. Zigaretten, Kautabak, Schnupftabak, Pfeifen und Zigarren) und mit re zeptpflichtigen Medikationen (z. B. Nikotingummi, Nikotinpflaster, Spray, pulmonale Inhalation oder andere Formen) entwickeln. Insbesondere können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren der Erfindung verwendet werden, um den Wunsch eines Probanden zu rauchen zu verringern und dadurch das Rauchverhalten verändern. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung können ebenfalls zusammen mit anderen zentral aktiven pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die das Rauchverhalten modifizieren (z. B. Bupropion (auch bekannt als Wellbutrin^®) in seinen verschiedenen Formulierungen), um die Dosis der zentralaktiven Zusammensetzung zu reduzieren oder um ihre Wirksamkeit in der Behandlung der Tabakabhängigkeit zu erhöhen.
Die Zusammensetzungen und Verwendungen durch Regulieren des Nikotinmetabolismus in einem Individuum sind sehr wirksam. Die Verwendungen und Zusammensetzungen behalten die Verhaltenskomponenten von Rauchen bei und modifizieren diese durch das Reduzieren des Nikotinmetabolismus zu Cotinin. Ein Individuum mit reduziertem Nikotinmetabolismus in Anschluss an die Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, wird das Rauchverhalten und die Rauchexposition aufgrund der Modifikation des Nikotinbedarfs ändern. Die Verwendungen und Zusammensetzungen der Erfindung zeigen Muster von Verringerung, einer länger anhaltenden Abstinenz, und einer niederen Tabakrauchexposition, als erhalten mit Verfahren des Standes der Technik, insbesondere jenen unter Verwendung von Nikotinentzug.
Die Verhaltenskomponente von Rauchen ist besonders in einigen Gruppen von Individuen wichtig, und so können die Verwendungen von Zusammensetzungen der Erfindung beim Modifizieren und Bewahren von Verhaltenskomponenten beim Reduzieren des Rauchens in solchen Individuen besonders nützlich sein. Es wurde zum Beispiel gefunden, dass Verhaltenskomponenten bei dem Tabakgebrauch durch Frauen signifikant sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Entwicklung von Verhaltenslehren auf einer individuellen/oder Gruppenbasis.
Die Zusammensetzungen und Verwendungen sind ebenfalls besonders geeignet, um den Nikotinmetabolismus in Individuen oder Populationen mit hohen Konzentrationen an CYP2A6 zu regulieren. Zum Beispiel haben Kaukasier in Nordamerika hohe Konzentrationen an CYP2A6. Ein Individuum oder eine Population mit einer hohen Konzentration an CYP2A6 kann unter Verwendung unserer Verfahren zum Messen von CYP2A6 identifiziert werden.
Die Zusammensetzungen und Verwendungen haben ebenfalls den Vorteil einer Individualisierung und Flexibilität der Behandlungsdauer. Die Zusammensetzungen und Verwendungen sind besonders geeignet für schwer abhängige Individuen, bisherige Behandlungsversagen, Individuen, die nicht in der Lage sind, den derzeitigen Ansatz des vollständigen Aufhörens zu akzeptieren, Behandlung/Vorbeugung von Rückfall, oder gleichzeitige Behandlung mit anderen Verwendungen wie das Nikotinpflaster. Es wird erwartet, dass die Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung die Dosen des Nikotinpflasters und alle anderen Formen der Nikotinersatztherapie, die benötigt werden, verringern werden und die Dauer der Wirkung der Therapie verlängern werden und/oder ihre Wirksamkeit bei der Behandlung der Tabakabhängigkeit verstärken werden.
Die Verwendungen und Zusammensetzungen beim Behandeln von Individuen mit Nikotingebrauchserkrankungen und Nikotin-induzierten Erkrankungen sind ebenfalls bei der Behandlung von Krankheiten oder Zuständen nützlich, einschließlich Nikotin-bedingter Krankheiten, wie Opioid-bedingter Krankheiten, kognitiver, neurologischer oder mentaler Krankheiten; und anderer Drogenabhängigkeiten in den Individuen. Zu Beispielen von solchen zugrunde liegenden Krankheiten oder Bedingungen zählen maligne Krankheit, Psychose, Schizophrenie, Parkinson-Krankheit, Angst, Depression, Alkoholismus, Opiat-Abhängigkeit, Merkfahigkeitsstörung, Colitus ulcerosa, cholinerge Defizite, und dergleichen.
Die Verwendungen und Zusammensetzungen können auch in der Behandlung von Individuen mit einem Zustand, der eine Reduktion von CYP2A6 oder CYP2B6 erfordert, nützlich sein. Zum Beispiel ist CYP2A6 bekannt, mehrere Prokarzinogene, wie NNK zu metabolisieren (Crespi CL, et al., „A tabacco smoke-derived nitrosamine, 4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, is activated by multiple human cytochrome P450s including the polymorphic human cytochrome P4502D6”, Carcinogenesis, 12(7): 1197–201 (1991)), Aflaxtoxin B1 (Yun CH, et al., „Purification and characterization of human liver microsomal cytochrome P-450 2A6, ”Molec. Pharmacol., 40(5): 679–85 (1991)); Hexamethylphosphoramid (Ding X, et al., ”Mossbauer studies an the metal-thiolate cluster formation in Fe(II)-metallothionein”, Eur. J. Biochem. 171 (3): 711–4 (1988)), und Nitrosodimethylamin (Davies RL, et al., ”Development of a human cell line by selection and drug-metabolizing gene transfection with increased capacity to activate promutagens,” Carcinogenesis, 10: 865–891 (1989); Fernandes-Salguero, et al., (1995)). Deshalb können Inhibitoren von CYP2A6 bei der Prophylaxe (z. B., Inhibierung von CYP2A6 Substraten, dadurch Verringern der Genotoxizität, Cytotoxizität und/oder Mutagenität) und Behandlung von malignen Krankheiten, und, ohne Einschränkung, den oben erwähnten Zuständen und Erkrankungen nützlich sein.
Formulierung und Dosierung
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten im Detail hierin beschriebene Substanzen, welche CYP2A6 inhibieren, oder Substanzen, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifiziert wurden. Die aktiven Substanzen können allein verabreicht werden, werden jedoch im Allgemeinen mit einem pharmazeutischen Träger, etc (siehe unten) verabreicht, ausgewählt auf der Basis des gewählten Verabreichungsweges und Standard pharmazeutischer Praxis.
Die verabreichte Dosierung wird in Abhängigkeit der Verwendung und bekannten Faktoren, wie den pharmakodynamischen Charakteristika der jeweiligen Substanz, und ihrer Verabreichungsart und -weg; dem Alter, Gesundheitszustand, und dem Gewicht des individuellen Empfängers; der Natur und dem Ausmaß der Symptome, Art der gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung, und der gewünschten Wirkung variieren.
In einigen Beispielen kann, anstelle des Erhöhen der Dosierung einer Verbindung, die Inhibierungskinetik, die durch bestimmte chemische Verbindungen verursacht wird, durch Hinzufügen zu dem Behandlungsprotokoll eines zweiten Inhibitors zu einer Substanz (z. B. Enzym), der in der Lage ist, den Metabolismus des CYP2A6 Inhibitor zu inhibieren, verändert oder verstärkt werden. Durch Hinzufügen eines solchen zweiten Inhibitors, wird die Menge des CYP2A6 Inhibitors aufrechterhalten, wodurch die vorteilhafte Wirkung des Aufrechterhaltens einer erhöhten Plasma-Nikotinkonzentration verlängert wird. Die Verwendung eines solchen zweiten Inhibitors ist sehr vorteilhaft, da es die Behandlung von Individuen durch Aufrechterhalten von im Wesentlichen konstanten Nikotinkonzentrationen und das lokale Wirken auf die Kinetik des CYP2A6 Inhibitors, erleichtert. Durch Verwenden dieses Ansatzes können hohe Dosierungen an zentral-aktiven Verbindungen vermieden werden.
Ähnlicherweise kann die Präexposition eines Individuums zu einer inhibitorischen Substanz manchmal zu einer inhibitorischen Wirkung führen, die die Gegenwart des Arzneimittels im Plasma überleben wird oder die eine persistente Wirkung in dem Individuum trotz der Halbwertszeit des Inhibitors in dem Plasma haben wird. Dieses durch die Präinkubation oder Präexposition einer inhibitorischen Substanz hervorgerufene Phänomen kann beim Erhöhen des Dosisintervalls, bei welchem eine Dosierung der Substanz verabreicht werden muss, beim Verringern der chronischen Dosis oder Verstärken der CYP2A6 Inhibierung helfen. Weiters kann die Präexposition eines Individuums zu einer inhibitorischen Substanz, die benötigte Dosis, eines zweiten Inhibitors anschließend verringern.
Die geeignete Dosierung einer Substanz, die CYP2A6 selektiv inhibiert, ist von der Menge an CYP2A6 abhängig, die in dem Körper eines Individuums vorhanden ist. Diese Menge ist wiederum davon abhängig, ob das Individuum zwei mutante Allele, ein mutantes Allel oder kein mutantes Allel an dem CYP2A6 Genlocus enthält. In Beispiel 1 bestätigten wir, dass solche Variationen in dem genetischen Material einer Population existieren können. In einem Aspekt, der kein Teil dieser Erfindung ist, jedoch für das Verständnis der Erfindung nützlich ist, ist deshalb ein Verfahren zum Bestimmen der CYP2A6 Aktivität in einem Individuum, welches zwei mutante Allele, ein mutantes Allel oder kein mutantes Allel an dem Genlocus für das CYP2A6 Gen enthält, bereitgestellt; das Verfahren weist die Schritte auf:

(a) Untersuchen einer Körperprobe, welche Desoxyribonukleinsäure enthält (d. h. eine „DNA-enthaltende Körperprobe”), des Individuums, um zu bestimmen, ob das Individuum zwei mutante Allele, ein mutantes Allel oder kein mutantes Allel an dem CYP2A6 Genlocus enthält;
(b) Bestimmen der Menge an CYP2A6, die in dem Individuum vorhanden ist; und
(c) Korrelieren der Ergebnisse des Untersuchens im Schritt (a) und der Menge von CYP2A6 im Schritt (b), um eine geeignete Dosierung für dieses Individuum einer Substanz zu bestimmen, die (i) die CYP2A6 Aktivität selektiv inhibiert, oder (ii) die Transkription und/oder Translation des CYP2A6 kodierenden Gens selektiv inhibiert.

Der individuelle Empfänger kann jede Art von Säugetier sein, ist jedoch vorzugsweise ein Mensch. Im Allgemeinen ist der Empfänger ein Individuum mit einem CYP2A6 Gentyp, der mit einer aktiven Form des Enzyms assoziiert ist. Der CYP2A6 Genotyp eines Individuums und die Existenz eines aktiven CYP2A6 Enzyms in einem Individuum kann unter Verwendung von hierin beschriebenen Protokollen bestimmt werden. Zum Beispiel wurde die Cumarin 7-Hydroxylierung verwendet, um die CYP2A6 Aktivität zu messen (Cholerton, et al. (1992); und Rautio, et al., (1992)).
Wie oben diskutiert ist, können die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise in Individuen oder Populationen mit hohen CYP2A6 Konzentrationen, oder in Individuen, in welchen die Verhaltenskomponenten des Rauchens signifikant sind, verwendet werden.
Für die Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, die eine Regulierung des Nikotinmetabolismus zu Cotinin erfordern, kann als allgemeine Anleitung eine tägliche orale Dosis eines aktiven Wirkstoffs, wie Cumarin oder Methoxsalen, etwa 0,01 bis 80 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,01 bis 20, noch mehr bevorzugt von 0,05 bis 3 mg/kg Körpergewicht sein. Für gewöhnlich ist eine Dosis von 0,03 bis 50 mg/kg Cumarin, Methoxsalen oder Tranylcypromin pro Tag in geteilten Dosen, einmal bis mehrere Male täglich, vorzugsweise bis zu vier Mal pro Tag, oder in einer verzögerten Freisetzungsform effektiv, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. In Übereinstimmung mit einer bestimmten Therapie wird Cumarin oder Methoxsalen oder Tranylcypromin einmal bis vier Mal täglich, so lang wie notwendig, verabreicht. Während die Standardintervalldosis-Verabreichung verwendet werden kann, können die Zusammensetzungen der Erfindung mit Unterbrechungen vor den Zeiten eines hohen Risikos des Rauchens, d. h. am Beginn des Tags und vor dem Ende des Arbeitstages, verabreicht werden.
Mehr als eine im Detail hierin beschriebene oder unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifizierte Substanz kann verwendet werden, um den Metabolismus von Nikotin zu Cotinin zu regulieren. In solchen Fällen können die Substanzen durch jedes konventionelle Mittel, welches für die Verwendung in Verbindung mit Pharmazeutika verfügbar ist, entweder als individuelle, getrennte Dosierungseinheiten, die simultan oder gleichzeitig verabreicht werden, oder in einer physischen Kombination von jedem Teil des therapeutischen Wirkstoffs in einer einzelnen oder kombinierten Dosierungseinheit, verabreicht werden. Die Wirkstoffe können allein verabreicht werden, werden allerdings im Allgemeinen mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, ausgewählt auf Basis des gewählten Verabreichungswegs und der pharmazeutischen Standardpraxis, wie hierin beschrieben.
Die Substanzen für die vorliegende Erfindung können für die orale, topische, rektale, parenterale, lokale, inhalierende oder intrazerebrale Verwendung verabreicht werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Substanzen in intranasaler Form über die topische Verwendung von geeigneten intranasalen Vehikeln, oder über transdermale Wege, unter Verwendung von Formen von transdermalen Hautflicken, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, verabreicht. Um in der Form eines transdermalen Abgabesystems verabreicht zu werden, wird die Dosierungsverabreichung eher kontinuierlich als intermittierend während des gesamten Dosierungstherapieschemas sein. Die Substanzen können ebenfalls durch kontrollierte oder langsame Freisetzungskapselsysteme und anderer Arzneimittelabgabetechnologien verabreicht werden.
Zum Beispiel können für die orale Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel, die aktiven Substanzen mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch-akzeptablen, inerten Träger, wie Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Methylcellulose, Magnesiumstearat, Dikalziumphosphat, Kalziumsulfat, Mannitol, Sorbitol und dergleichen kombiniert werden; für die orale Verabreichung in flüssiger Form, können die oralen aktiven Substanzen mit jedem oralen, nicht-toxischen, phar mazeutisch-akzeptablen inerten Träger, wie Ethanol, Glycerol, Wasser und dergleichen kombiniert werden. Geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Sprengmittel, und Farbstoffe können ebenfalls in die Dosierungsform inkorporiert werden, falls gewünscht oder notwendig ist. Zu geeigneten Bindemitteln zählen Stärke, Gelantine, natürliche Zucker, wie Glucose, oder Beta-Lactose, Mais-Süßstoffe, natürliche und synthetische Gummi, wie Akazie, Tragant, oder Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Polyethylenglycol, Wachse, und dergleichen. Zu geeigneten, in diesen Dosierungsformen verwendeten Gleitmitteln zählen Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, und dergleichen. Zu Beispielen von Sprengmitteln zählen Stärke, Methylzellulose, Agar, Bentonit, Xanthan-Gummi, und dergleichen.
Gelantine-Kapseln können den Wirkstoff und gepulverte Träger, wie Lactose, Stärke, Cellulose-Derivate, Magnesiumstearat, und Stearinsäure, und dergleichen enthalten. Ähnliche Träger und Verdünnungsmittel können verwendet werden, um Presstabletten herzustellen. Tabletten und Kapseln können als verzögerte Freisetzungsprodukte hergestellt werden, um eine kontinuierliche Freisetzung der Wirkstoffe über eine Zeitperiode vorzusehen. Presstabletten können mit Zucker überzogen oder mit einem Film überzogen sein, um jeden unangenehmen Geschmack zu maskieren und die Tablette vor der Atmosphäre zu schützen, oder für die selektive Auflösung in dem gastrointestinalen Trakt enterisch überzogen sein. Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können Färb- und Geschmackstoffe enthalten, um die Akzeptanz durch Patienten zu erhöhen.
Wasser, ein geeignetes Öl, Salzlösung, wässrige Dextrose, und verwandte Zuckerlösungen und Glykole, wie Propylenglycol oder Polyethylenglycole, können als Träger für parenterale Lösungen verwendet werden. Solche Lösungen enthalten vorzugsweise auch ein Wasser-lösliches Salz des Wirkstoffes, geeignete Stabilisatoren, und wenn notwendig, Puffersubstanzen. Zu geeigneten Stabilisatoren zählen Antioxidantien, wie Natriumbisulfat, Natriumsulfat, oder Ascorbinsäure, entweder allein oder kombiniert, Zitronensäure und ihre Salze und Natrium-EDTA. Parenterale Lösungen können auch Konservierungsmittel enthalten, wie Benzalkoniumchlorid, Methyl- oder Propylparaben, und Chlorbutanol.
Die hierin in Detail beschriebenen und unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifizierten Substanzen können auch in der Form von Liposomen-Abgabesystemen, wie kleine unilamellare Vesikel, große unilamellare Vesikel, und multilamellare Vesikel verabreicht werden. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie Cholesterol, Stearylamin, oder Phosphatidylcholinen gebildet werden.
Hierin in Detail beschriebene und unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifizierte Substanzen können ebenfalls mit löslichen Polymeren gekoppelt werden, welches auf ein Ziel richtbare Arzneimittelträger sind. Zu Beispielen von solchen Polymeren zählen Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol, oder Polyethylenoxidpolylysin, welches mit Palmitoyl-Resten substituiert ist. Die Substanzen können mit biologisch abbaubaren Polymeren gekoppelt werden, die für das Erreichen einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneimittels nützlich sind. Zu geeigneten Polymeren zählen Poly milchsäure, Polyglykolsäure, Copolymere aus Polymilch- und Polyglykolsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacylate, und vernetzte oder amphipatische Block-Copolymere von Hydrogelen. Die Substanzen können ebenfalls an starren Polymeren und andere Strukturen wie Fullerenen oder oder Buckybällen („Buckeyballs”) befestigt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verabreichung geeignet sind, enthalten etwa 1 Milligramm bis 1500 Milligramm Wirkstoff pro Einheit. In diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff für gewöhnlich in einer Menge von etwa 0,5–95 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung vorhanden sein.
Geeignete pharmazeutische Träger und Verfahren zum Herstellen von pharmazeutischen Dosierungsformen sind im Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, einem Standardreferenzbuch auf diesem Gebiet, beschrieben.
Co-Verabreichung mit oralem Nikotin
Es wurde in einer bestimmten Ausführungsform gefunden, dass spezifische Inhibitoren von CYP2A6, vorzugsweise Tranylcypromin, besonders effektive Inhibitoren von CYP2A6 und des Metabolismus einer oralen Formulierung von Nikotin sind, und als solches die Wirkung von oralen Nikotinersatztherapien verstärken. In anderen Worten, es wurde gefunden, dass diese Inhibitoren beim Inhibieren des Nikotinmetabolismus wirksam sind und dadurch die Plasma-Nikotinkonzentrationen erhöhen, insbesondere, wenn das Nikotin oral eingenommen wird, wodurch die Nikotinersatztherapien verstärkt werden.
Somit beschreibt diese Beschreibung eine Zusammensetzung zum Verstärken der Wirkung einer oralen Nikotinersatztherapie, welche einen Inhibitor von CYP2A6 und Nikotin, welches für die orale Einnahme formuliert ist, enthält. Die hierin in Detail beschriebenen Substanzen, zusammen mit Nikotin, bilden den aktiven Wirkstoff, und werden üblicherweise in einer Beimengung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten, oder Trägern, die in Bezug auf die beabsichtigte Verabreichungsform, d. h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe, und dergleichen, entsprechend ausgewählt sind, verabreicht, was mit den herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken übereinstimmt.
Fachleute werden erkennen, dass eine orale Formulierung innerhalb der Erfindung sein kann, und zwar in der Form von: (i) einer einzelnen Zusammensetzung, welche sowohl den CYP2A6 Inhibitor als auch Nikotin umfasst, oder (ii) einem Ausrüstungssatz („kit”), welcher unabhängig verabreichte Zusammensetzungen umfasst, die den CYP2A6 Inhibitor bzw. Nikotin umfassen. Für unabhängig verabreichte Zusammensetzungen ist die Verabreichung vorzugsweise im Wesentlichen gleichzeitig. Wenn der bevorzugte CYP2A6 Inhibitor Tranylcypromin mit oraler Formulierung von Nikotin verabreicht werden, haben sich die Plasma-Nikotinkonzentrationen über die Plasmakonzentrationen, wenn Nikotin oral ohne Verabreichen des(r) CYP2A6 Inhibitor(en) eingenommen wird, erhöht.
Kombination von Inhibitoren
Die Kombination eines CYP2A6 Inhibitors und eines CYP2B6 Inhibitors (z. B. Orphenadrin) verstärkt die Inhibierung des Nikotinmetabolismus zu Cotinin. Somit bietet eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines CYP2A6 Inhibitors und einer wirksamen Menge eines CYP2B6 Inhibitors, um den Nikotinmetabolismus zu Cotinin selektiv zu inhibieren, bei der Herstellung eines Medikamentes für die gleichzeitige Verwendung mit Nikotin zum Behandeln von Zuständen, die die Regulation des Nikotinmetabolismus zu Cotinin erfordern. Die Inhibitoren können gleichzeitig, getrennt oder sequentiell verabreicht werden. Vorzugsweise ist die Verabreichung der Inhibitoren im Wesentlichen gleichzeitig. Die Dosen des CYP2A6 Inhibitors und des CYP2B6 Inhibitors werden jeweils so ausgewählt, dass jeder Inhibitor allein keine volle Wirkung zeigen würde. Die wirksamen Dosen sind jene, welche etwa die Minimaldosen sind, die für verstärkte Inhibierung des Nikotinmetabolismus zu Cotinin angemessen sind. Die Kombination von Inhibitoren wird mit Wesentlichen gleichzeitig mit einer Nikotinquelle, vorzugsweise für die orale Verabreichung formuliertes Nikotin, verabreicht. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Kombinationen von CYP2A6 und CYP2B6 Inhibitoren enthalten, können wie hierin für die Zusammensetzungen, die CYP2A6 Inhibitoren enthalten, beschrieben hergestellt und verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise Methoxsalen oder ein Analogon oder Derivat davon, und Orphenadrin, oder ein Analogon oder Derivat davon, in Konzentrationen von 1 bis 1500 mg bzw. 25 bis 400 mg.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele illustriert.
Beispiele
Beispiel 1
Epidemiologie-Studie
Wir haben die Prävalenz von CYP2A6 Genmutationen in 126 tabakabhängigen kaukasischen Rauchern und 143 kaukasischen Individuen, die das Rauchen probiert haben, jedoch niemals tabakabhängige Raucher wurden (z. B. Expositionskontrolle) untersucht. Die Ziele waren zweifach. Das Erste war die Inzidenz von Individuen, die defizient in der CYP2A6 Aktivität waren (z. B. homozygot für Null CYP2A6 Allele), zu bestimmen. Das Zweite war zu bestimmen, ob ein langsamerer CYP2A6 vermittelter Metabolismus, aufgrund von Null CYP2A6 Allelen, die Wahrscheinlichkeit ein Tabak-abhängiger Raucher zu werden, verringert.
In diesem Beispiel wurde eine Studie durchgeführt, um den CYP2A6 Gentyp in einer Gruppe von Individuen und die Wirkung von CYP2A6 auf das Rauchverhalten der Individuen zu beurteilen.
Die Probanden waren nicht-verwandte gesunde Individuen, wobei jedes 4 kaukasische Großeltern hatte, und wurden in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe enthielt nur Tabak-abhängige (TD, DSM-IV („DSM” = Diagnostic Statistician Manual of the American Psychiatric Association) Probanden, die 76 Männer mit Alter von 19 bis 52 Jahren (Mittelwert (SD): 31,1 Jahre alt (8,5 Jahre)), und 57 Frauen im Alter von 20 bis 70 Jahren (Mittelwert (SD): 31,4 Jahre alt (10,2)) einschließen. Die zweite Gruppe enthielt Alkohol- und Tabak-abhängige (AT, DSM-IV) Probanden, einschließlich 60 Männer mit Alter von 17 bis 61 Jahren (Mittelwert (SD): 37,2 Jahre alt (9,94 Jahre)), und 10 Frauen im Alter von 19 bis 66 Jahren (Mittelwert (SD): 41,4 Jahre alt (11,89 Jahre)). Die dritte Gruppe war eine Expositionskontrollgruppe, die aus niemals Tabak-abhängigen (NTD (Probanden, die das Rauchen vorher probiert haben, jedoch niemals abhängig wurden) besteht. Die Gruppe enthielt 86 Männer im Alter von 19 bis 59 Jahren (Mittelwert (SD): 29,2 Jahre alt (8,6 Jahre)), und 77 Frauen im Alter von 19 bis 58 Jahren (Mittelwert (SD): 27,4 Jahre alt (8,4 Jahre). Alle Probanden füllten einen Arzneimitttelfragebogen und ein Tabak-Modul aus (Heatherton et al., „The Fagerstrom Test for nicotine Dependence: a revision of the Fagerstrom Tolerance Questionnaire”, Br. J. Addict. 86(9): 1119–1127 (1991)). Alle Probanden hatten keine anderen psychoaktiven Arzneimittelabhängigkeiten, einschließlich Alkohol (mit Ausnahme, natürlich, der AT Gruppe).
Die CYP2A6 Gentypisierung von jedem Probanden wurde an genomischer DNA, die von peripheren Leukozyten, wie in Fernandez-Salguero, e al. (1995) beschrieben, isoliert wurde, durchgeführt. In Kürze, die Untersuchung bestand aus einer CYP2A6 Gen-spezifischen verschachtelten PCR-Amplifikation, gefolgt durch eine RFLP-Analyse.
Materialien und Verfahren:
Die für die PCR-Genotypisierungsuntersuchungen verwendeten Primer: Tabelle 2
CYP2A6 Gentyp
DNA wird aus Blutproben extrahiert und unter Verwendung von Routineextraktionsprozeduren quantifiziert. Der CYP2A6 Gentyp wurde unter Verwendung der verschachtelten PCR und RFLP, wie in Fernandes-Salguero, et al. (1995) beschrieben, bestimmt. Die erste Amplifikation, welche CYP2A6 Gen-spezifisch war, wurde verwendet, um die Spezifität für das CYP2A6 Gen (im Vergleich zu anderen CYP2A Genen) zu erhöhen. Exon 3 wurde in der zweiten Amplifikation verwendet, da sowohl die CYP2A6*2 als auch CYP2A6*3 mutanten Allele Nukleotidänderungen enthalten, die zu Aminosäureänderungen in dieser Region des CYP2A6 Gens führen.
Die erste Amplifikation wurde unter Verwendung des XL-PCR-Satzes (Perkin-Elmer Co. Norwalk, Connecticut) durchgeführt. Eine 100 μl Reaktionsmischung von 0,2 μM Primer F4 und R4, 200 μM dNTPs, 0,8 mM Magnesiumacetat, und 2U rTth1 DNA Polymerase und 400 bis 600 ng genomischer DNA verwendet. Die Amplifikation wurde in einer MJ DNA Engine (MJ Research, Inc. Watertown, Massachusetts) bei 93°C für 1 Minute, 66°C für 6 Minuten und 30 Sekunden für 31 Zyklen durchgeführt.
Die zweite Amplifikation wurde in einer Reaktionsmischung, die 0,5 μM Primer E3F und E3R, 200 μM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 U Taq DNA Polymerase (Gibco BRL, Life Technologies, Burlington, Ontario), und 2,5 μl des ersten Amplifikationsproduktes, welches die Matrize für die Reaktion war, enthält, durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie Folgt: 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 31 Zyklen von 94°C für 1 Minute, 60°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute.
Die zweite Amplifikation ergab ein PCR Produkt mit einer Länge von 201 bp, welches mit Xcm I (New England Biolabs) und Dde I (New England Biolabs und Pharmacia Biotech) verdaut wurde, um die CYP2A6*2 bzw. CYP2A6*3 Mutationen zu detektieren (das Schneiden weist auf das Vorhandensein der Mutation hin). Die Konzentrationen von Enzymen und PCR Produkt, Gesamtvolumen und Verdauzeit wurden empirisch bestimmt, um die Schneidwirksamkeit mit einer minimalen Menge an Zeit und Enzym zu optimieren. Die Xcm I Verdau-Reaktionen wurde bei 37°C für 2 Stunden in einer 30 μl Reaktionsmischung, welche IX NE-Puffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT pH 7,9, bei 25°C), dH₂O, und 2U Xcm I enthält, ausgeführt. Dde I Verdaue wurden bei 37°C für 2 Stunden in einer 30 μl Reaktionsmischung, die One-Phor-All (OPA) Puffer (Pharmacia Biotech) und 2 U Dde I enthält, durchgeführt. Die Verdau-Produkte wurden auf Ethidium-gefärbten 3% Agarosegelen analysiert.
Die Blutproben wurden unter Einwilligung von allen Probanden erhalten. Die Positivkontrollen wurden von Drs. P Femandes-Salguero und H. Raunio gespendet. Die Negativkontrollen verwendeten Wasser anstelle von genomischer DNA. Jede Genotypisierungsreaktion trug vier zufällig ausgewählte Proben von einer früheren Reaktion, um auf Reproduzierbarkeit zu prüfen.
Chi-Quadrat-Tests („Chi-Square tests”) wurden zum Vergleichen der Verteilung der CYP2A6 Gentypen und Allelen zwischen den Gruppen (SAS) durchgeführt. F-Tests (Prüfen auf ungleiche Varianz [SAS]), gefolgt von einem Zwei-Proben-t-Test (SAS) wurden beim Vergleichen der Muster des Rauchens innerhalb der Raucher verwendet. Die Signifikanz war bei 5%.
Es wurde postuliert, dass Individuen mit einem beeinträchtigten Nikotinmetabolismus (d. h. Träger von zumindest einem CYP2A6 defekten oder mutanten Allel) aufgrund höherer Nikotinkonzentrationen höhere aversive Wirkungen erfahren und keine Raucher werden würden oder zu einem verringerten Grad Rauchen würden, im Vergleich zu Individuen mit einem aktiven Nikotinmetabolismus (d. h. Individuen mit einem CYP2A6*1/CYP2A6*1 Gentyp). Es wurde speziell hypothetisiert, dass es eine Unterrepräsentanz von Individuen, die defekte CYP2A6 Allele tragen, in einer Tabak-abhängigen Population gibt.
Unter Bezugnahme auf die Ergebnisse der Studie, war, unter allen abhängigen Rauchern (TD + AT), die Häufigkeit von Individuen, die 1 oder 2 der CYP2A6 defekten Allele tragen, geringer, als in der Expositionskontrollgruppe (NTD): 13,3% gegenüber 20,2%, p = 0,076, χ-Square; relativen Chancen (Odds ratio) von 1,66, C. I. 0,95–2,89 – siehe 5. Weiters waren sowohl die CYP2A6*2 als auch die CYP2A6*3 Allelhäufigkeiten in den abhängigen Rauchern (TD und AT) geringer als in der Expositionskontrollgruppe (NTD): CYP2A6*2:3,0% versus 3,1% und CYP2A6*3:4,4% versus 7,7% – siehe 5.
Wir postulierten weiters, dass innerhalb der Gruppe von jenen, die rauchen, jene mit defizientem Nikotinmetabolismus (d. h. Träger von zumindest einem CYP2A6 defekten oder mutanten Allel) weniger Zigaretten rauchen würden.
Unter weiterer Bezugnahme auf die Ergebnisse der Studie, rauchten, innerhalb der TD Gruppe, jene Probanden, welche für CYP2A6 aktive Allele homozygot waren, signifikant mehr Zigaretten pro Tag und pro Woche als im Vergleich zu Rauchern, welche heterozygot ein einzelnes CYP2A6 defektes Allel (d. h. eines oder beide von CYP2A6*2 und CYP2A6*3) tragen: 23 versus 19 Zigaretten pro Tag, t-Test P = 0,02, 125 versus 161 Zigaretten pro Woche, t-Test P = 0,009 – siehe 6.
Wie oben diskutiert, ist Nikotin beim Etablieren und Aufrechterhalten der Tabakabhängigkeit wichtig; die Variabilität der Nikotin-Pharmakokinetik könnte einen profunden Einfluss, ob Individuen zu Rauchern werden, haben. Die in dieser Studie erzeugten Daten demonstrieren eine Unterrepräsentanz von Individuen, die 1 oder 2 der CYP2A6 defekten Allele tragen, in einer Tabak-abhängigen Population (TD + AT) im Vergleich zu einer niemals Tabak-abhängigen (NTD) Kontrollpopulation. Während nicht erwünscht ist, an eine bestimmte Theorie oder Wirkungsweise gebunden zu sein, kann dies verursacht werden, wenn Individuen, die CYP2A6 defekte Allele tragen, beim Rauchen, höhere Nikotinkonzentrationen und höhere aversive Wirkungen zu dem Nikotin erfahren. Demzufolge kann das Individuum zu Rauchen aufhören und weniger wahrscheinlich sein, Tabak-abhängig zu werden. Deshalb zeigen die in dieser Studie erzeugten Daten an, dass Individuen, die 1 oder 2 der CYP2A6 defekten oder mutanten Allele tragen und probieren zu rauchen, einem geringeren Risiko ausgesetzt sind, Tabak-abhängig zu werden, als Individuen, die zwei aktive CYP2A6 Allele aufweisen.
Es ist weiters, wie oben diskutiert, bekannt, dass abhängige Raucher ihr Rauchverhalten anpassen, um Blut und Hirn-Nikotinkonzentrationen aufrechtzuerhalten, und somit könnte ein variabler Nikotinmetabolismus eine Rolle beim Ändern des Rauchverhaltens spielen. Die Beobachtung, dass abhängige Raucher, die ein einzelnes defektes CYP2A6 Allel tragen, signifikant weniger Zigaretten rauchen, im Vergleich zu homozygoten Wildtyp-Rauchern, weist darauf hin, dass der Nikotinmetabolismus, wie durch CYP2A6 vermittelt, eine signifikante Bestimmungsgröße der Anzahl ist, die abhängige Raucher rauchen. In anderen Worten, die Heterozygotie in einem einzelnen Gen, nämlich dem CYP2A6 Gen, beeinflusst dieses komplexe Drogenkonsumverhalten.
Die klinischen Implikationen des CYP2A6 Gentyps auf die Tabak-Abhängigkeit und das Rauchverhalten, wie hierin offenbart, sind weit verbreitet. Individuen, die CYP2A6 defekte Allele tragen, können ein verringertes Risiko der Krebsentwicklung haben, da sie ein verringertes Risiko aufweisen, Tabak-abhängige Raucher zu werden. Falls sie abhängige Raucher werden, demonstrieren die in dieser Studie erzeugten Daten, dass sie weniger rauchen würden, als jene, die für aktive CYP2A6 Allele homozygot sind. Es gibt einen eindeutigen Hinweis, dass die Menge an gerauchtem Tabak direkt mit einem erhöhten Risiko für Lungenkrebs in Verbindung steht (Law, et al., 1997)) – siehe 6.
Zusätzlich enthält Tabakrauch eine Vielzahl von tabakspezifischen prokarzinogenen Nitrosaminen, wie N-Nitrosodialkylaminen – z. B. N-Nitrosodiethylamin (Der Merck Index, Nr. 6557), N-Nitrosodimethylamin (Der Merck Index, Nr. 6558) und 4-Methylnitrosamino)-1-)3-pyridyl)-1-butanon (Crespi, et al., 1990; Yamazaki, et al. 1992). Da diese Prokarzinogene durch CYP2A6 aktiviert werden können, werden Individuen, die CYP2A6 defekte Allele tragen, beim Bioaktivieren von Tabakrauch-Prokarzinogenen in Karzinogene vorteilhafterweise ineffizient sein.
Somit demonstrieren die in dieser Studie dieses Beispieles erzeugten Daten zusammengefasst, dass ein einzelnes genetisch polymorphes Gen, das CYP2A6 Gen, im Zusammenhang steht, ob ein Individuum ein Raucher wird, und ist in einigen Fällen für dieses vorhersagend. Zusätzlich, wenn ein Individuum einzig von Tabak abhängig wird, verändern die CYP2A6 Genvarianten die Anzahl von Zigaretten, die er/sie raucht. Dementsprechend beeinflusst der CYP2A6 Gentyp direkt das Risiko für die Tabak-Abhängigkeit, verändert die Menge des konsumierten Tabaks, und spielt eine Rolle bei der Tabak-bedingten Krebsanfälligkeit.
Eine vorgesehene Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die genetische Identifikation des Risikos eines Individuums für das Rauchen und damit in Verbindung stehenden Krebsen. Die Identifikation von Individuen mit hohem und geringem Risiko wird die gezielte Prävention, Behandlung und Aufklärung ermöglichen. Insbesondere wird dies, die Identifikation eines Individuums mit einem hohen und niedrigen Risiko für: (i) Raucher zu werden (wenn das Individuum ein Nicht-Raucher ist), (ii) einen höheren Tabak-Konsum (wenn das Individuum ein Raucher ist), und (iii) CYP2A6-bedingte Krebse beinhalten.
Beispiel 2
Cumarin Phänotypisierungstest und CYP2A6 Genotypisierungstest
A. Cumarin-Test
Cumarin ist ein selektives und spezifisches Substrat für humanes CYP2A6 und kann verwendet werden: (1) um Individuen, die potentielle therapeutische Ausschlüsse für die Verwendung von CYP2A6 Inhibitoren sind, zu identifizieren; (2) für die Dosierungsverfeinerung, basierend auf dem anfänglichen Niveau der Aktivität von CYP2A6; und (3) für die Risikofaktor-Beurteilung beim Identifizieren von Individuen, die nicht von der Behandlung profitieren werden oder die gegen Toxizität von Mitteln gefährdet sind, die Inhibitoren und an sich selbst Substrate von CYP2A6 sind. Der Cumarintest existiert in zwei Formen:
(1) Cumarin-Test, wenn nur Urin verfügbar ist
Cumarin 5 mg, als eine Kapsel oder eine andere Dosisform formuliert, wird oral an nüchterne Individuen nach dem Entleeren des restlichen Blasenurins verabreicht. Urin wird für die ersten zwei Stunden und für die nachfolgenden 6 Stunden gesammelt. Die Menge an Harnausscheidung des Cu marin-Metaboliten 7-Hydroxycumarin (frei und konjugiert) wird durch Bestimmen der Konzentration von diesen Metaboliten im Urin unter Verwendung einer HPLC Untersuchung, wie in einem früheren Beispiel beschrieben, bestimmt. Die relative Aktivität von CYP2A6 wird in den Gesamtmengen an 7-Hydroxycumarin, das in dem Probenahmen-Zeitraum ausgeschieden wird, getrennt und kombiniert, widergespiegelt und die Aktivität kann als das Verhältnis der prozentuellen Cumarin-Ausscheidung ausgedrückt werden (Menge, die in den ersten 2 Stunden ausgeschieden wird/Menge, die in 8 Stunden ausgeschieden wird) × 100. Diese prozentuelle Ausscheidung reicht von Werten von weniger als 20% in Individuen ohne CYP2A6 Aktivität bis > 80% in Individuen mit hoher Aktivität. Dieser Test kann ebenso wirksam und zuverlässig auf Raucher und Nicht-Raucher angewendet werden und kann zu jeder Tages/Nachtzeit ohne offensichtliche Wirkung des Zustandes des Rauchens oder Tages/Nachtzeit auf die Ergebnisse verwendet werden. Der Test demonstriert eine hohe Innerprobanden-Reproduzierbarkeit mit einem linearen r von > 0,9. Siehe 3 für die Ergebnisse einer Studie, in welcher Rauchern und Nicht-Rauchern Cumarin am Morgen und am Nachmittag an jedem von 2 getrennten Tagen gegeben wurde. Eine hohe Innerprobanden-Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit wird demonstriert.
(2) Cumarin Test, wenn Plasmaproben genommen werden können
In einigen klinischen Situationen können Plasmaproben leicht genommen werden oder sind als Teil von anderen klinischen Tests notwendig. In dieser Situation wurde ein Plasma-basierender Test der CYP2A6 Aktivität entwickelt und auf Individuen mit bekanntem Gentyp angewendet. Individuen nehmen Cumarin 5,0 mg oral ein und 45 Minuten später wird eine Blutprobe in einem heparinisierten (oder anderem Antikoagulans-enthaltenden) Röhrchen genommen. Die Probe wird zentrifugiert und das Plasma getrennt. Das Plasma wird durch HPLC analysiert, um 7-Hydroxycumarin (gesamt, nach der Dekonjugierung mit Beta-Glucuronidase-Inkubation) zu quantifizieren. Eine hohe analytische Sensitivität wird benötigt, um 5,0 mg Cumarin zu verwenden. Wenn eine solche Sensitivität nicht verfügbar ist, kann die Cumarin-Dosis bis auf 50 mg erhöht werden.
HPLC-Analyse von 7-Hydroxycumarin in Urin und Plasma:
(1) Probenvorbereitung:
Urin oder Plasmaproben (0,5 ml) werden mit 0,2 ml β-Giucuronidase-Acetat-Pufferlösung (15 mg/ml Acetatpuffer, 0,2 M, pH 5,0) bei 37°C für 30 Minuten hydrolysiert. Die Extraktion wird gefolgt mit 2 ml Ether durch Vortexen für 5 Minuten und Zentrifugieren bei 3000 U/min für 10 Minuten. Der Etherextrakt (1,2 ml) wird in ein anderes sauberes Röhrchen überführt und unter Stickstoffgas getrocknet. Der Rückstand wird in der HPLC mobilen Phase (siehe unten) rekonstituiert und in die HPLC injiziert.
(2) HPLC Analyse:
Das HPLC System besteht aus einen Hewlett Packard 1050 HPLC System (Pumpe, Autosampler, und UV Detektor) und HP3396II Integrator. Die chromatographische Trennung wurde mit einer HP Spherisorb-ODS2-Säule (125 × 4 mm I. D. 5 μm) durchgeführt. Die Proben wurden mit einer mobilen Phase aus Acetonitril:Wasser:Essigsäure von 150:850:2 (Vol/Vol/Vol) bei einer Flussrate von 1,0 ml/min eluiert und durch eine UV Detektor bei einer Wellenlänge von 324 nm für 7-Hydroxycumarin und 280 nm für Cumarin überwacht. Die Proben wurden durch ein Verfahren mit externen Standards quantitativ bestimmt.
Die CYP2A6 Aktivität wird als die Konzentration von 7-Hydroxycumarin in dem Plasma zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. 20, 30, 45 und 75 Minuten) oder als das Verhältnis von Cumarin/7-Hydroxycumarin im Plasma zu diesem Zeitpunkt ausgedrückt.
Die bevorzugte Verwendungsart ist eine einfache Plasmaprobe bei 20 oder 30 Minuten nach der oralen Verabreichung von Cumarin, in welcher sowohl Cumarin als auch 7-Hydroxycumarin quantifiziert werden und in welcher das Verhältnis Cumarin zu 7-Hydroxycumarin als der Index der CYP2A6 Aktivität verwendet wird.
Ergebnisse:
Urin- oder Plasma-Blindproben zeigten keinen störenden Peak für 7-Hydroxycumarin oder Cumarin. Die Sensitivität dieses Verfahrens ist 1 ng/ml Urin oder Plasma. Die Innertages- und Zwischentagesvariationen sind geringer als 10%. Diese Analyse ist von 1 ng bis 4000 ng/ml linear.
4 ist ein Diagramm, welches einen zeitlichen Verlauf der gesamten 7-Hydroxycumarin-Konzentration, die im Plasma von Probanden, denen Cumarin gegeben wurde, detektiert wurde, zeigt. 4 illustriert verschiedene zeitliche Verläufe, basierend auf den entsprechenden Gentypen für CYP2A6.
B. CYP2A6 Genotypisierungstest
Wie für den CYP2A6 Genotypisierungstest, können mutante Allele, welche die CYP2A6 Aktivität in einem Individuum verringern, in einer DNA Probe unter Verwendung der Materialien und Screening-Verfahren, die in Beispiel 1 beschrieben sind, gescreent werden.
Beispiel 3
In vivo Phänotyp-Untersuchung
Die Plasmakinetiken von Nikotin und Cumarin wurden nach der oralen Verabreichung in 10 Rauchern und 9 Nicht-Rauchern (12 Männer, 7 Frauen) mit bekanntem CYP2A6 Genotyp verglichen. Die Dosis von Nikotin war 4,0 mg (ausgedrückt als Base) und die Dosis von Cumarin war 50 mg. Die Plasmakonzentration von Nikotin, Cotinin, Cumarin und 7-OH-Cumarin wurde wie oben beschrieben gemessen.
Die optimale Trennung von *1/*1 (Wildtyp-Homozygoten, n = 13) und Heterozygoten (*1/*2; *1/*3, n = 4) und Homozygoten (*2/*2, n = 2) wurde bei 45 Minuten mit Cumarin durch Messen seines Metaboliten 7-OH-Cumarin (7-OH-Cumarin [μM] *1/*1 = 5,6 ± 2,9; *1/*2 oder *1/*3–3,8 ± 1,1, p = 0,04) gefunden. Die optimale Trennung wurde bei 90 Minuten mit Nikotin (Nikotin [nM] *1/*1 = 24 ± 15; *1/*2 oder *1/*3 = 29 ± 12; *2/*2 = 52 ± 3; *2/*2 gegenüber *1/*2 oder *1/*3, p = 0,01; 2/*2 gegenüber *1/*1, p = 0,0001) gefunden. Die Verwendung des Cumarin/7-OH-Cumarin oder Nikotin/Continin-Verhältnises verbesserte die Trennung nicht.
Cotinin (Nikotinmetabolit) wurde anfänglich signifikant langsamer erzeugt in *1/*2 oder *1/*3, war aber später in der Probenahme in *1/*2 oder *1/*3 tatsächlich höher, was auf eine Rolle von CYP2A6 im Cotinin-Metabolismus hinweist. Der Anstieg der Kurve für das Auftreten gegenüber der Zeit war für 7-OH-Cumarin signifikant geringer und für Nikotin höher in *1/*2 oder *1/*3 im Vergleich zu *1/*1, wie auch die Flächen unter den Kurven, was auf Unterschiede in der Bioverfügbarkeit, Absorptionsraten und Metabolismus hinweist. Die Fläche der Kurven für 7-OH-Cumarin und für Nikotin waren umgekehrt korreliert (p = 0,08 (Spearman-Rang, „Spearman rank”), n = 18). Ein *1/*1 Individuum mit 4-fach höherer 7-OH-Cumarin-Produktion und ein *2/*2 Individuum mit hohem Cumarin- und niedrigem Nikotinmetabolismus wurden identifiziert, was darauf hinweist, dass CYP2A6 Genvarianten, die mit derzeitigen PCR Prozeduren nicht detektiert werden, existieren.
Diese Daten weisen darauf hin, dass der CYP2A6 Gentyp eine wichtige Bestimmungsgröße des Zeitverlaufes der Nikotin-Disposition in vivo ist. Diese Daten weisen ebenfalls daraufhin, dass eine in vivo Untersuchung von CYP2A6 den Phänotyp des Individuums widerspiegelt und dass die phänotypische Bestimmung Informationen über den Gentyp dieses Individuums bereitstellt.
Beispiel 4
Gewebelokalisierung der CYP2A6 Expression
Es wurde bestimmt, ob das CYP2A6 Enzym in Geweben exprimiert wurde, in welchen Tabak-bedingte Krebse auftreten (z. B. Lunge und Blase). Um zu bestimmen, ob CYP2A6 in Geweben exprimiert wurde, welche Tabak-bedingten Krebsen unterliegen, wurde die Gewebeverteilung der CYP2A6-mRNA in verschiedenen menschlichen Geweben unter Verwendung der Northern Blot-Analyse untersucht. In Kürze, mRNA von zahlreichen Geweben wurde auf Gele geladen und durch Elektrophorese getrennt. Die mRNA wurde dann auf Membranen transferiert und mit radioaktiven CYP2A6 cDNA Sonden sondiert. Hinweise für die Expression von CYP2A6 wurden in der Gebärmutter, Eierstöcken, Kolon, Dünndarm, Hoden, Blase, Herz, Magen, Prostata, Skelettmuskel, Pankreas, und Lunge gefunden. Diese Daten weisen daraufhin, dass, zusätzlich zu der Möglichkeit, dass CYP2A6-aktivierte Karzinogene von der Leber Krebs in verschiedenen Geweben hervorrufen könnten, es auch eine in situ Aktivierung der Prokarzinogene in einer Anzahl von menschlichen Geweben geben könnte.
Beispiel 5
Epidemologische Studie über das Krebsrisiko
Zusätzlich zu der Rolle, die Null CYP2A6 Allele beim Reduzieren der Rate der Nikotin-Abhängigkeit haben und der gerauchten Menge, wenn jemand abhängig wird, können im Tabak-Rauch gefundene Prokarzinogene durch CYP2A6 aktiviert werden. Um zu bestimmen, ob es einen signifikanten Beitrag zu den Krebsraten aufgrund der Aktivierung der Prokarzinogene durch CYP2A6 gibt, wurde, unabhängig von seiner Rolle beim Rauchen, eine Studie von Individuen mit Tabak-bedingtem Krebs, die Nicht-Raucher waren, durchgeführt. Diese Individuen waren passiv Tabak-Rauch-Prokarzinogenen ausgesetzt, wodurch sie eine Gruppe bereitstellen, in welcher die Rolle der CYP2A6 Nullallele in der Aktivierung von Prokarzinogenen getestet werden konnte, unabhängig von der Rolle dieses Enzyms auf das Rauchverhalten. Es wurde gefunden, dass 14,3% der Nicht-Raucher, die Blasenkrebs (einen Tabak-bedingten Krebs) hatten, ein Nullallel für CYP2A6 trugen. Im Gegensatz dazu, war in der Kontrollpopulation, die Nicht-Raucherwaren und keinen Blasenkrebs hatten, die Häufigkeit der Nullallel-Träger 24,1%. Dies demonstriert, dass Individuen, die Nullallele für CYP2A6 tragen, aufgrund ihrer verringerten Aktivierung von Prokarzinogen zu krebsverursachenden Karzinogenen, weniger wahrscheinlich einen Tabak-bedingten Krebs bekommen.
Beispiel 6
Wirkung von Methoxsalen, einem CYP2A6 Inhibitor, auf die Aktivierung von NNK, einem Prokarzinogen, zu seinen Methaboliten NNAL und NNAL Glucuronid
Die Wirkung von Methoxsalen, CYP2A6 Inhibitor, auf den Nikotin-Metabolismus und die NNAL Produktion wurde in elf (n = 6 Frauen, 5 Männer) Tabak-abhängigen Rauchern studiert. Probanden wurden nur rekrutiert, wenn sie zumindest 15 Zigaretten pro Tag rauchen, und wurden aufgefordert, dieselbe Anzahl von Zigaretten jeden Tag, an allen vier Studientagen zu rauchen. Während der Beurteilung, wurden Blutproben genommen, um auf Nikotin- und Continin-Konzentrationen im Plasma, sowie auf die CYP2A6 Genotypisierung analysiert zu werden. Atemluft-Kohlenmonoxid wurde ebenfalls gemessen.
Die vier Testtage wurden in einen Placebo-Tag (kein Arzneimittel verabreicht) (Tag 1) und drei Methoxsalen (10 mg t.i.d. p. o.) Behandlungstage (Tage 2, 3, 4) aufgeteilt, so dass die Medikation jeden Tag um 8:00 Uhr, 15:00 Uhr und 22:00 Uhr genommen wurde. Während jedem Studientag wurde ein Rauch-Protokoll vervollständigt. Dieses Protokoll verlangte von den Probanden, die Anzahl der von 8:00 Uhr bis 15:00 Uhr bis 22:00 Uhr und von 22:00 Uhr bis 08:00 Uhr gerauchten Zigaretten zu dokumentieren. Die Studientage 1 und 2 konnten getrennt sein, die Tage 2, 3 und 4 mussten jedoch hintereinander sein.
An beiden Studientagen 1 (Placebo) und 4 (Behandlung) wurde eine 24 Stunden Urinsammlung nach dem Wachwerden initiiert. Um 14:00 wurde eine Blutprobe genommen für die Nikotin- und Cotininanalyse und Atemluft-Kohlenmonoxid wurde gemessen. Am Tag 4 wurde eine zweite Blutprobe für die Methoxsalen-Analyse genommen. Urinproben können für 24 h NNAL, NNAL-Glucuronid, Creatinin und Cotinin analysiert werden.
Methoxsalen erhöhte das Plasmanikotin um 17% (23,0 auf 27 ng/ml), verringerte das Atemluft-CO um 11% (22,5 auf 20,5 ppm) und erhöhte das Verhältnis von Plasmanikotin zu Atemluft CO (ein Index der Tabak-Rauch Exposition) um 30% (1,1 zu 1,43, p = 0,033). Die größere Abnahme des Indexes der Rauchexposition weist darauf hin: 1) der Raucher verringerten die Intensität ihres Rauchefs aufgrund der Inhibierung von CYP2A6 und verlangsamten die Nikotineliminierung, obwohl ihnen gesagt wurde, dass sie ihr Rauchen nicht ändern sollen; 2) Methoxsalen in diesen Dosen ist ein wirksamer Inhibitor von CYP2A6; und 3) Methoxsalen und andere CYP2A6 Inhibitoren werden die Produktion von NNAL oder verwandten Substanzen und die Aktivierung von anderen Karzinogenen in vivo verringern.
Beispiel 7
Einfluss der CYP2A6 Nullallele auf die Tabak-Rauch Exposition, die zu Lungenkrebs führt.
Die Wirkung der CYP2A6 Nullallele auf die Aktivierung von Prokarzinogenen wurde in einer epidemiologischen Studie von Lungenkrebs untersucht. Die Allelhäufigkeit in DNA-Proben von 227 Individuen mit Lungenkrebs wurde untersucht. Im Anschluss an die Diagnose von Lungenkrebs und die Resektion des Tumors und des umgebenden Lungengewebes, wurde die DNA extrahiert und für CYP2A6 genotypisiert. Die Population war grundsätzlich Raucher oder Exraucher. Unter jenen, von denen detaillierte Rauchhistorien verfügbar waren, waren wir in der Lage, die Anzahl von Raucher-Packungsjahren, vor dem Detektieren des Lungenkrebs als einen Messwert der Prokarzinogenexposition zu beurteilen (20 Zigaretten pro Tag für ein Jahr = 1 Packungsjahr). Diese Individuen, die wt/wt CYP2A6 Aktivität hatten, benötigten im Durchschnitt nur 45 Packjahre vor der Lungenkrebsdetektion. Im Gegensatz dazu benötigten jene Individuen mit einem CYP2A6 Nullallel, die weniger Prokarzinogenen aktivieren, beträchtlich mehr Prokarzinogenexposition vor dem Detektieren des Lungenkrebs (z. B. 54 Packungsjahre). Jene Individuen mit verringerter CYP2A6 Aktivität aktivieren somit weniger der Tabakrauchkarzinogene und erfordern eine höhere Exposition, bevor der Lungenkrebs detektiert wird.
Es war ebenfalls beobachtbar, dass die Anzahl der Individuen mit dem CYP2A6 V1 Allel in der Lungenkrebspopulation in Bezug auf eine Nicht-Lungenkrebs-Kontrollpopulation verringert war, was übereinstimmend ist mit dem relativen Schutz gegen Krebs, der durch eine verringerte Prokarzinogenaktivierung geboten wird. Dies wurde sowohl in Nichtrauchern als auch Rauchern mit Lungenkrebs in Bezug auf ihre entsprechenden Kontrollen beobachtet.
Zusätzlich waren alle der Individuen, die ras-Oncogenmutationen in den Tumorgeweben hatten, CYP2A6 Wild-Typ mit voller Aktivität, was auf ein verringertes Risiko für Onkogenmutationen in jenen Individuen mit verringerter CYP2A6 Aktivität (z. B. Träger der CYP2A6 Nullallele) hinweist. Ras-Oncogenmutationen sind für ein schlechteres Behandlungsergebnis und schneller wachsende Tumore in Bezug auf jene Tumore ohne ras-Oncogenmutationen prädiktiv. Dies weist darauf hin, dass Individuen mit CYP2A6 Nullallelen weniger wahrscheinlich mutierte ras-Oncogene aufweisen und wahrscheinlicher eine bessere Behandlungsprognose haben.
Diese Daten deuten den Nutzen beim Beurteilen der CYP2A6 Allele für das Schätzen des Krebsrisikos (Nullalele sind mit einem verringertem Risiko für Lungenkrebs assoziiert) an und dass die Inhibierung von CYP2A6 die Prokarzinomaktivierung verringern wird, was das Krebsrisiko verringert.
Beispiel 8
Wirkung von CYP2A6 Inhibierung auf die Bioverfügbarkeit von oralem Nikotin
Eine in-vivo-Studie wurde unternommen, um die Wirkung der CYP2A6 Inhibierung auf die Bioverfügbarkeit von oralem Nikotin zu bestimmen. Insbesondere verglich die Studie die kinetischen Wirkung der Nikotin-Cobehandlung mit Methoxsalen 30 mg, Tranylcypromin 10 mg und Placebo (d. h., nur Nikotin) p. o. auf die Bioverfügbarkeit von Nikotin 4 mg p. o. (ausgedrückt als Base; tatsächlich wurde Nikotin-Bitartratsalz verabreicht), und die akute Sicherheit und Akzeptanz der drei Cobehandlungen. Zusätzlich wurden vorläufige Informationen über die Auswirkungen auf das Nikotinverlangen im Anschluss an diese Cobehandlungen erhalten.
Die Untersuchungsobjekte für diese Studie waren Raucher im Anschluss and einen speziellen Abstinenzplan, wie oben dargelegt ist. Es gab 12 Probanden.
Die Raucher erhielten Placebo p. o. und zwei getrennte Cobehandlungen 30 (Methoxsalen 30 mg und Tranylcypromin 10 mg) die Nikotin 4 mg p. o. begleiten. Während einer 4-Stunden-Testsitzung wurden Blut und Urinproben für kinetische Messwerte gesammelt, und physiologische und subjektive Messwerte wurden gesammelt. Die Behandlungsreihenfolge wurde randomisiert und ausgeglichen und die Arzneimittelpräsentation war einfach blind („single blind”), nämlich die Probanden waren sich nicht bewusst, welches Arzneimittel sie einnahmen.
Alle der Probanden hatten die folgenden Charakteristika:

(a) Alter zumindest 21;
(b) derzeitiger Konsum von zumindest 25 Zigaretten pro Tag;
(c) DSM IV aktuelle Tabakabhängigkeit;
(d) die Nikotinabhängigkeit wie durch einen Wert von zumindest 3 auf dem Fagerström Test für Nikotinabhängigkeit (FIND) angedeutet ist;
(e) keine regelmäßige Verwendung von Tabak in jeder Form außer Zigaretten;
(f) Fähigkeit auf das Rauchen von Zigaretten und auf Koffein für bis zu 12 Stunden zu verzichten;
(g) Zustimmung und Fähigkeit, die Verwendung von jedem therapeutischen Arzneimittel auf einem konsistenten Plan über die Studientage aufrecht zu erhalten.

Alle der Probanden hatten keine der folgenden Charakteristika:

(a) bekannte Sensitivität zu Methoxsalen oder chemisch ähnlichen Verbindungen;
(b) bekannte exzessive Fotosensitivität;
(c) aktuelle Verwendung von jeglichen Antidepressiva, Sympathomimetika, CNS-Beruhigungsmitteln, hypotensiven Wirkstoffen, oder Anti-Parkinsonarzneimitteln (aufgrund möglicher nachteiliger Tranylcypromin-Interaktionen);
(d) Körpergewicht < 51 kg (30 mg Methoxsalen wird nicht empfohlen für die Verwendung unter diesem Körpergewicht);
(e) Schwangerschaft oder Stillzeit;
(f) ein Risiko einer Schwangerschaft (Frauen, die mit männlichen Partnern sexuell aktiv sind, und keine hochwirksamen Empfängnisverhütungsvorkehrungen, definiert als chirurgische Sterilisierung von einem der beiden Partner, orale Verhütungsmittel, Barriere und Spermizid, oder Kondom und Spermizid, verwenden);
(g) Leberschaden, Blut Dyscrasie (Kontraindikationen für Tranylcypromin);
(h) Symptome die auf Herzkrankheiten oder Hypertension hinweisen;
(i) jeder andere medizinische oder psychiatrische Zustand, der weitere Untersuchung oder Behandlung erfordert, oder der eine Kontraindikation für eine beliebige der vorgeschlagenen Studien-Arzneimittel sind;
(j) aktueller Wunsch oder Versuch, mit dem Rauchen aufzuhören innerhalb der erwarteten Dauer der Studienreihe; und
(k) jeder andere Zustand, der wahrscheinlich mit der Einhaltung des Studienplanes oder dem erfolgreichen Sammeln der Studien-Messwerte interferiert.

Es gab zwei getrennte Studienpläne für Probanden, die am Morgen und am Nachmittag untersucht wurden. Bei beiden Plänen war jeder Proband von Tabak, Nahrung, Getränken (d. h. außer Wasser) und jedem unvereinbar genommenen Arzneimittel beginnend von Mitternacht vor jedem Studientag abstinent, setzte jedoch die Einnahme von jedem regelmäßig geplanten Arzneimittel, welche durch das Protokoll erlaubt sind (z. B. orale Verhütungsmittel, tägliche Vitamine), fort.
Probanden des Morgenplanes setzten ihre Abstinenz bis zur Ankunft an der Teststelle um etwa 8 Uhr fort. Probanden des Nachmittagplans aßen ein normalgroßes Frühstück, einschließlich höchstens einer Tasse eines koffeinierten Getränkes und einer Zigarette vor 9 Uhr. Von 9 Uhr bis etwa 13 Uhr nahmen die Probanden der Nachmittagssitzung den Abstinenzplan bis zur Ankunft an die Teststelle wieder auf.
Bevor die Grundlinienmessung genommen wurde, wurde eine Atem-CO-Probe (Ecolyzer) genommen, um die Einhaltung der Rauchabstinenz (< 10 ppm erwartet) zu bewerten. Der nachfolgende tägliche Plan ist in Tabelle 3 dargelegt. Alle Messungen waren hinsichtlich einer Zeit Null bei 9 Uhr oder 14 Uhr, bei welcher Zeit eine Nikotinkapsel um ein Cobehandlung p. o. genommen werden.

Jeder SMS-Zyklus bestand aus der Herzrate, dem Blutdruck, und subjektiven Messwerten. Ein Standardfrühstück oder Mittagessen, (jedoch ohne Koffein) wurde nach der Blutprobe bei + 1 Stunde serviert. TABELLE 3

vergangene Zeit	Ereignis
–00:45	Vorbereiten des Probanden
–00:30	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 1
–00:15	SMS Zyklus Nr. 1
00:00	Alle Kapseln p. o.
00:30	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 2
00:50	SMS Zyklus Nr. 2
01:00	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 3
01:30	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 4
01:50	SMS Zyklus Nr. 3
02:00	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 5
02:50	SMS Zyklus Nr. 4
03:00	Blutprobe (8 mL) genommen – Nr. 6

Probanden wurden für die Entlassung nicht früher als + 2.00 Stunden medizinisch beurteilt und wurden, nachdem alle Messwerte bei + 3.00 Stunden vollständig waren, entlassen. Den Probanden wurde nicht erlaubt zu rauchen, bis nach ihrer Entlassung. Der Plan war in bestimmten Umständen bis zu 20 Minuten verzögert, welches über die vier Tage konsistent war, um zu ermöglichen, dass drei Probanden am selben Tag getestet werden.
Jeder Proband wurde an zwei nicht aufeinander folgenden Tage in einer Woche für drei getrennte Wochen getestet und hielt konsistent in einem Morgen- oder Nachmittagsplan ein.
Sterile Nikotin-Bitartrate wurden durch das Pharma Zentrum von Sigma-Chemical erhalten. Die berichtete Reinheit war > 99,5%, welches durch HPLC bestätigt wurde. Das Nikotin-Bitartratpulver wurde auf einer Präzisionswaage, die innerhalb 1 μg genau ist, gemessen, und in Portionen, die 4 mg Nikotinbase enthält gemessen, und dann eingekapselt. Die Kapseln wurden gefüllt auf eine Toleranz von +2% ihrer nominalen Masse des Nikotinpulvers.
Methoxsalen wird in Kanada in zwei Former vermarktet, eine von relativ niederer Bioverfügbarkeit (Markenname Oxsoralen^®) und zwei mit etwa der doppelten Bioverfügbarkeit (Oxsoralen-Ultra^® und Ultra MOP^®). Die Packungsbeilage für Ultra MOP^® (Canderm Pharmacal Ltd.) empfiehlt eine tägliche Dosis von 30 mg bis 50 mg für jeden Patienten mit einem Gewicht von 51 kg oder mehr. Probanden wurden auf ein minimales Körpergewicht von 51 kg eingeschränkt, um die Verwendung einer fixen 30 mg Dosis für alle Probanden zu ermöglichen; die Dosis wurde für größere Probanden nicht angepasst.
Kapseln von Methoxsalen 10 mg und Tabletten von Tranylcypromin 10 mg (Parmate^®) wurden in ihren vermarkteten Formen verwendet. Da es eine randomisierte, jedoch einfachblinde Studie war, waren die Probanden in der Lage zu erkennen, dass die Kapselformen und die Anzahl von Tag zu Tag variierten. Sie wussten jedoch nicht, welche Form welches Arzneimittel darstellt.
Laktosetabletten wurden als Placebo verwendet.
Für die ersten vier Tage bestand der Arzneimittelvorrat für jeden Tag aus einer oder drei Kapseln, wie in Tabelle 4 dargelegt ist, zusätzlich zu Nikotin 4 mg. Die Untersucher waren in Unkenntnis der Verteilung, um die zufällige Zuordnung zu bewahren.
Die Nikotin- und andere Kapseln wurden gleichzeitig eingenommen.
Eine getrennte, gedruckte, Referenzkopie von dem Behandlungs-Randomisierungscodes von jedem Probanden wurden den Untersuchern, nachdem die Arzneimittel verabreicht wurden, bereitgestellt. TABELLE 4

Aktives Arzneimittel, Kapselform Verabreichte Dosierung

Placebo 1 × Cumaringröße Placebo

Methoxsalen, 30 mg 3 × Methoxsalen, 10 mg

Tranylcypromin, 10 mg 1 × Tranylcypromin, 10 mg
Unter Verwendung eines Dauer-Venen-Katheters, wurden 8 mL Blutproben nachdem in Tabelle 3 angegebenen verstrichenen Zeiten gesammelt. Diese Proben wurden auf Nikotin-, Kotinin- und Inhibitorkonzentration analysiert.
Zwei getrennte Urinproben wurden gesammelt, eine Basislinie gerade vor den Kapseln und eine 3 Stunden zusammengeführte Probe. Jede Urinprobe wurde auf Nikotin und Continingehalt analysiert.
Plasma und Urinnkotin und Cotinin (und ebenfalls die Konjugate in Urin) wurden unter Verwendung eines HPLC-Verfahrens mit einem UV-Detektor bestimmt. Im speziellen wurden 1 mL Probe, 50 μL (2 μg/mL) interner Standard (N-Ethylnomicotin) und 1 mL Trichloressigsäure (10%) in jedes Röhrchen (12 mL) pipettiert. Das Röhrchen wurde verschlossen, mittels Vortex für einige Sekunden gemischt, und dann bei 30.000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein zweites Röhrchen dekantiert. Zu diesem proteinfreien Plasmaextrakt wurde 0,5 mL einer 5 M Kaliumhydroxidlösung und 6 mL Methylenchlorid hinzugefügt. Das zweite Röhrchen wurde dann verschlossen, für 30 Minuten in einem horizontalen Schüttler agitiert und dann zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wässrige Phase, (die oberste Schicht) wurde abgesaugt, und 3,0 mL 0,5 N Salzsäure-Lösung wurden zu der organischen Phase hinzu gegeben und für 30 Sekunden mittels Vortex gemischt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt, und die wässrige Phase wurde in ein sauberes Röhrchen mit 0,5 mL 5 M Kaliumhydroxidlösung überführt, gefolgt von der Zugabe von 5 mL Methylenchlorid und für 30 Sekunden mittels Vortex gemischt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt, die wässrige (obere) Schicht wurde abgesaugt, und 200 μL methanolische Salzsäure (10 mmol HCl in Methanol) wurde zu der verbleibenden Lösung hinzu gegeben und behutsam gemischt. Das organische Lösungsmittel wurde dann unter Stickstoff in einem Wasserbad bei 40°C eingedampft. Die Seiten des Röhrchens wurden mit 200 μL methanolischer Salzsäure gewaschen und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 μL 30% Methanol rekonstituiert und 90 μL davon wurden in die HPLC-Säule injiziert.
Die chromatographische Trennung wurde mit einer Supelco^TM 5-8347 LC-8-DB (150 × 4,6 mm, 5 μm) durchgeführt. Die Probe wurde mit einer mobilen Phase von 0,34 M Zitronensäurepuffer: Acetonitril, 800:45 (Vol/Vol) welche 0,34 M KH₂PO₄, 1-Heptansulfonat (671 mg) und Triethylamin (5 mL) enthält, mit einer Flussrate von 1,3 ml/min, eluiert und durch einen UV-Detektor bei λ = 260 nm überwacht.
Die Sensitivität der Nikotinuntersuchung ist < 1 ng/mL und jene von Kotinin ist < 5 ng/mL. Die Konjugate in Urin wurden nach der Hydrolyse mit β-Glucuronidase, wenn angemessen, bestimmt.
Die Plasma-Nikotinkonzentrationen wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Untersuchung bestimmt, und die Ergebnisse sind in 7 als die Mittelwerte für alle Probanden dargestellt.
Kardiovaskuläre Messgrößen, die durch einen Hewlett/Packard 78352C Adult Patient Monitor aufgenommen wurden und direkt auf einen Computer aufgezeichnet wurden, beinhalteten Herzrate und Blutdruck (im Sitzen).
Unter Verwendung einer visuellen analogen Skala wurde jeder Proband gefragt, auf einer Skala von 0 bis 100, sein/ihr derzeitiges Verlangen zu rauchen bei verschiedenen Zeitpunkten, sowohl vor- als auch nach der Arzneimittelverabreichung (Anhang A) zu evaluieren.
Für die Zwecke zum Etablieren von klinischen, kinetischen Unterschieden und zum Beschreiben von kinetischen Parametern war die primäre abhängige Variable das 3-Stunden trapezoide Regel Nikotin AUC.
7 illustriert die mittleren Plasmanikotinkonzentrationen, die genau vor der oralen Arzneimittelverabreichung und für drei Stunden danach (während welchen kein Rauchen erlaubt war) gemessen wurden. Wie illustriert ist, induzieren sowohl die kombinierten Methoxsalen/Nikotin und Tranylcypromin/Nikotinbehandlungen eine Erhöhung der mittleren Plasma-Nikotinkonzentration, die zumindest vier Mal so groß ist wie jene, die durch Placebo/Nikotinkombination induziert wird.
8 illustriert die selbstbewertete „derzeitiger Wunsch zu rauchen” Evaluierung unter Verwendung einer visuellen analogen Skala von 0 bis 100. Wie dargestellt ist, reduzierten sowohl die Methoxsalen/Nikotin als auch die Tranylcypromin/Nikotinkombination den Wunsch zu rauchen wesentlich mehr als es die Placebo/Nikotinkombination tut.
Beispiel 9
Wirkungen von metabolisch-verstärkten oralen Nikotinersatztherapie auf das Kurzzeit-Rauchverhalten
Eine Studie wurde unternommen, um die Wirkungen der metabolisch-verstärkten oralen Nikotinersatztherapie auf das Kurzzeit-Rauchverhalten zu bestimmen.
Da Nikotin das suchterzeugende Mittel einer Tabakabhängigkeit ist, und Raucher ihr Hirnnikotin innerhalb eines relativ schmalen individuellen Konzentrationsbandes regulieren, sollte jegliches wirksame Nichtraucherverfahren der Nikotinabgabe zu einer Verringerung des Rauchens führen, indem dem Raucher ermöglicht wird, Plasma-Nikotin aufrechtzuerhalten ohne auf das Rauchen zurückzugreifen, und sollte in einigen Fällen die sekundäre Verstärkung des Rauchverhaltens reduzieren als eine Komponente, um eventuell mit dem Rauchen aufzuhören. Diese Wirksamkeit kann nur verstärkt werden, wenn der Mechanismus zum Sicherstellen einer wirksamen Abgabe auch die Klärung von Plasma-Nikotin nach dem Absorptionsstadium verzögert. Ein Modell zum Testen der akuten Verhaltenswirkungen dieser Behandlungsstrategie wird in einer früheren Studie über die Wirksamkeit von Nikotingummi bereitgestellt (Nemeth-Coslett R, et al., „Nicotine gum: dose-related effects an cigarette smoking and subject ratings,” Psychopharmacology, 92 (4): 424–30 (1987)), in welcher das Rauchen in einer 90-minütigen Testperiode signifikant durch den Nikotingehalt des Gummis beeinflusst wurde.
In diesem Beispiel wurden alle vier Kombinationen von Placebo/Methoxsalen und Placebo/Nikotin untersucht (d. h. (i) Placebo Methoxsalen und Nikotin; (ii) Methoxsalen und Nikotin, (iii) Methoxsalen und Placebo Nikotin; und (iv) Placebo Methoxsalen und Placebo Nikotin).
Dieses Beispiel demonstriert: Die kinetische Wirksamkeit von Methoxsalen-verstärkter orale Nikotinersatztherapie in seit kurzem abstinenten Rauchern; und die Verhaltenswirksamkeit von Methoxsalen-verstärkter oraler Nikotinersatztherapie in seit kurzem abstinenten Rauchern.
Es gab 11 Probanden. Die Probanden Einschluss- und Ausschlusskriterien, die in Beispiel 8 verwendet wurden, wurden auch in diesem Beispiel verwendet.
Jeder der Probanden machte vier getrennte Sitzungen von 90 Minuten Abstinenz von Rauchen, gefolgt von 90 Minuten von Rauchen nach Belieben durch, wobei die folgenden vier Behandlungen, einmal während der ersten vier Studientage, in randomisierter, ausgeglichener Reihenfolge während der Abstinenzperiode jeweils als Doppelblindprobe dargeboten wurde: (i) Placebo Methoxsalen mit Placebo Nikotin, (ii) Placebo Methoxsalen mit 4 mg Nikotin, (iii) Methoxsalen 30 mg mit Placebo Nikotin, und (iv) Methoxsalen 30 mg mit 4 mg Nikotin. Methoxsalen 10 mg Kapseln wurden verwendet, wie in Beispiel 1, und Gelee-Royal-Kapseln wurden als Placebo verwendet. Die Kapseln wurden in einer opaken Viole abgegeben und weder die Probanden noch die Untersuchenden haben die Kapseln gesehen, bevor die Probanden die Kapseln direkt in ihren Mund platziert haben.
Die Nikotin 4 mg Kapseln wurden wie in Beispiel 8 hergestellt und die entsprechenden Gelee-Royal-Kapseln Placebos, die nur Laktose enthielten, wurden ebenfalls hergestellt. Die Probanden nahmen die drei Methoxsalen/Placebokapseln und eine Nikotin/Placebokapsel entweder alle auf einmal oder nacheinander ein.
Die Behandlungsreihenfolge war über die zwei Geschlechter und die zwei Tageszeiten im Rahmen des möglichen ausgeglichen. Die Reihenfolge der Behandlungen wurde durch ein computerunterstütztes Randomisierungsprogramm bestimmt. Die Behandlung war doppelblind.

Wie in Beispiel 8 gab es einen Morgen- und Nachmittagsplan. Die Studiensitzungen waren zweimal täglich geplant, wobei drei Probanden gleichzeitig geführt werden, beginnen bei 8:30/8:40/8:50 und bei 13:00/13:10/13:20 Uhr. Die Sitzungen dauerten etwa 4 Stunden. Vor jeder Sitzung war es dem Probanden erlaubt, nach ihrem belieben zu rauchen, essen und Koffein zu trinken bis 90 min. vor jeder Sitzung, zu welcher Zeit sie aufhörten zu essen und zu trinken (abgesehen von Wasser). Jede Sitzung begann 60 Minuten bevor ein Arzneimittel/Placebo/Nikotin eingenommen wurde. Der genaue Zeitplan ist in Tabelle 5 dargelegt. TABELLE 5

Vergangene Zeit	Ereignis
–00:40	Prä-Abstinenz-Zigarette
–00:30	Abstinenz beginnt
–00:10	1. Blutprobe (8 ml) genommen – Nr. 1 2. CO gemessen 3. Fragen 1–9 im Anhang C
00:00	1. CO gemessen 2. Alle Kapseln p. o.
00:50	1. Blutprobe (8 ml) genommen – Nr. 2 2. CO gemessen 3. Fragen 1–12 im Anhang C
00:59	1. CO gemessen 2. Video-Kamera einschalten
01:00	1. Abstinenz endet 2. Freies Rauchen beginnt
02:30	1. Video-Kamera ausschalten 2. Freies Rauchen endet 3. Blutprobe (8 ml) genommen – Nr. 3 4. CO gemessen 5. Fragen 1–17 im Anhang 6. Abstinenz wiederaufnehmen
02:40	CO gemessen
02:50	CO gemessen
03:00	CO gemessen

Die erste Abstinenzperiode nach den Zigaretten dauerte 90 Minuten, von denen die letzten 60 Minuten nach der Verabreichung des Placebos/Arzneimittels/Nikotins waren. Die zweite Abstinenzperiode wurde eingeschlossen, um wiederholte Messungen des Atemkohlenmonoxids (CO) nach dem Rauchen zu erleichtern. An den drei Anlässen, an denen Blutproben gesammelt wurden, beantworteten die Probanden ebenfalls einen kurzen Fragebogen über mögliche Studien-Arzneimittelsymptome und Wirkungen und über den Wunsch zu rauchen. Bei dem dritten Anlass gab es zusätzlich auch Fragen über das Empfinden der während der Periode des freien Rauchens gerauchten Zigaretten. Dieser Fragebogen (siehe Anhang A) basiert auf jenem, der in der Nikotingummistudie verwendet wurde (Nemeth-Coslett, et al., (1987)).
Während der Periode des freien Rauchens war es den Probanden erlaubt nach ihren Wünschen zu rauchen, nur vorausgesetzt, dass sie innerhalb der Fläche des Raumes blieben, die für die Videokamera sichtbar war, und leichte Imbisse zu essen und koffeinfreie Getränke zu trinken.
Die primäre gemessene abhängige Variable war die Änderung in dem Atemluft CO während der Periode des freien Rauchens, die als der Mittelwert der drei Proben 10, 20 und 30 Minuten nach dem Rauchen minus dem Mittelwert der zwei Proben 10 Minuten und 0 Minuten vor dem Rauchen ge messen wurde. Andere gemessene anhängige Variablen waren die Änderung des Plasmanikotins zwischen 0 und 150 Minuten nach der Arzneimittelabgabe, die Reaktionen auf Symptome und Beurteilungsskalen, der Konsum von Tabak in der Periode des freien Rauchens (gemessen als das Gewicht von restlichen Stummeln minus dem Gewicht der gleichen Anzahl von ungerauchten Zigaretten), und der Zugzeiteinteilung und -Anzahl von der Analyse der Videobänder.
Die angängigen Variablen wurden in einer Varianzanalyse, mit der Behandlungsarzneimittelkombination als die primäre unabhängige Variable von Interesse, mit Geschlecht, Morgen-/Nachmittagsplan, und Behandlungsreihenfolge als zusätzliche erklärende Variablen, die von dem Fehlerausdruck entfernt wurden, evaluiert.
Die Ergebnisse der Studie von Beispiel 10 werden nun unter Bezugnahme auf die 9–14 diskutiert.
9 illustriert die mittlere Atemluft-Kohlenmonoxidkonzentration, die gerade vor der oralen Arzneimittelverabreichung, 60 Minuten später (kein Rauchen erlaubt) und nach der 90-minütigen Periode des freien Rauchens gemessen wurde. Wie illustriert ist, führte die kombinierte Methoxsalen-/Nikotinbehandlung zu einer signifikanten und großen Reduktion in dem erhöhten Atemluft Kohlenmonoxid während der Phase des Rauchens. Die Kohlenmonoxidkonzentrationen erhöhten sich in der kombinierten Methoxsalen-/Nikotinbehandlungsgruppe um nur 30% von jener, die in den anderen Bedingungen gesehen wurden, was eine große Reduktion des Rauchens und der Rauchexposition widerspiegelt. Diese Reduktion kann auf Grund jeder Kombination von weniger Zügen, flacheren Zügen und/oder Zügen, die für eine kürzere Dauer vor der Ausatmung gehalten werden, zugeordnet sein.
10 illustriert das Verhältnis der erhöhten Plasma/Nikotinkonzentration zu der erhöhten Atemluft-Kohlenmonoxidkonzentration über die 90 Minuten Periode des freien Rauchens. In anderen Worten illustriert diese Figur den Messwert der potentiellen Reduktion der Rauchexposition, die auftreten könnte, während abhängige Raucher ihren systemischen Plasma-Nikotingehalt wieder auffüllen. Wie illustriert ist, steht die Methoxsalen/Nikotinbehandlung abseits von allen drei der anderen Behandlungen und von ihren Mittelwerten wurde der Zuwachs des Nikotins pro Anstiegseinheit der Atemluft Kohlenmonoxidkonzentration mehr als verdoppelt.
11 illustriert die häufig verwendeten Messgrößen für Rauchen: die mittlere Anzahl der während der 90-minütigen Periode gerauchten Zigaretten. Wie illustriert ist, ist die kombinierte Methoxsalen/Nikotinbehandlung mit dem wenigsten Rauchen assoziiert, jedoch ist die Anzahl der konsumierten Zigaretten ein nicht sensitiver Messwert der Rauchexposition und Rauchverhalten, im Vergleich zu der Atemluft Kohlenmonoxidkonzentration.
12 illustriert die mittlere kumulative Anzahl von Zügen, die am Ende von jeder 10 Minutenperiode während der 90-minütigen Periode des freien Rauchens genommen wurden, und die Daten sind durch die Fläche unter dieser Kurve zusammengefasst. Diese Fläche würde sich erhöhen, wenn sich entweder die Gesamtzahl der Züge erhöhte oder wenn die gleiche Anzahl früher konsumiert wurde, wodurch die Kurve nach links verschoben wird. Wie illustriert ist, ist die Methoxsalen/Nikotinbehandlung mit der kleinsten kumulativen Zahl von Zigarettenzügen assoziiert.
13 illustriert, dass die Anzahl der Gramme von verbranntem Tabak signifikant geringer ist in der Methoxsalen/Nikotinbehandlungsgruppe. Wiederum ist diese Messgröße weniger sensitiv, als die direkten Messgrößen des Rauchverhaltens und der Rauchexposition (z. B. Atemluft/-Kohlenmonoxidkonzentration, und Nikotin/Atemluft-Kohlenmonoxidkonzentration).
14 illustriert, dass die Inhibierung des CYP2A6 Metabolismus von Nikotin eine Reduktion des Atemluft-Kohlenmonoxid durch Verändern des Nikotin-Regulierten Rauchverhaltens erreicht. Die Wartezeit zwischen Zigaretten ist signifikant verlängert durch die kombinierte Metoxalen/Nikotinbehandlung.
Zusammengefasst zeigen die in den 9–14 illustrierten Ergebnisse eine Modifikation des Rauchverhaltens durch Probanden, die mit einer Kombination von Methoxsalen und Nikotin behandelt wurden. Insbesondere waren objektive Schlüsselindikatoren („key objektive indicators”), wie Plasma-Nikotinkonzentration und Atemluftkohlenmonoxid, signifikant reduziert im Vergleich zu den anderen Behandlungsplänen.
CYP2A6 metabolisiert ungefähr 75% des Nikotins in vivo. Tabakabhängige Raucher regulieren ihr Rauchen, um Nikotinkonzentrationen aufrecht zu erhalten; die CYP2A6 Inhibierung sollte den Nikotinmetabolismus verringern, was das Rauchen und die Rauchexposition verringert (z. B. Atemluft CO). Über Nacht Nikotin-abstinente abhängige Raucher (6 Männer, 5 Frauen) rauchten eine Zigarette, gefolgt von einer von vier oralen Arzneimittelkombinationen in übergreifender, ausgeglichener Reihenfolge: Methoxsalen 30 mg (CYP2A6 Inhibitor K_i = 0,2 μM oder Placebo mit entweder Nikotin 4,0 mg oder Placebo. 60 Minuten später begannen die Probanden eine 90-minütige Periode des freien Rauchens. Die Probanden, die Methoxsalen mit oralem Nikotin empfingen, rauchten weniger als in der Placebo/Placebo (z. B. Atemluft CO 50% geringerer Anstieg; Wartezeit bis zu der zweiten Zigarette um 83% erhöht, Anzahl der gerauchten Zigaretten um 24% verringert; verbrannter Tabak (Gramm) um 24% verringert, Gesamtanzahl von genommenen Zügen, um 25% verringert [alle p < 0,05]). Zusätzlich war mit mehreren Messgrößen (z. B. Wartezeit zu der zweiten Zigarette) die Rangfolge der Reaktionen Methoxsalen/Nikotin > Methoxsalen/Placebo > Placebo/Nikotin > Placebo/Placebo, was auf eine Methoxsalenwirkung auf die systemische Klärung von Nikotin hinweist. Die CYP2A6 Inhibierung allein oder kombiniert mit oralem Nikotin verringert das Rauchen und könnte eine Rolle beim Aufhören mit dem Tabakrauchen, bei der Expositionsverringerung oder bei Rückfallpräventionsstrategien haben.
Beispiel 10
Inhibitoren des Nikotinmetabiismus: Potenzielle neue Behandlungen für Tabakabhängigkeit
Nikotin wird durch CYP2A6 zu Cotinin inaktiviert. Da die Nikotinbioverfügbarkeit gering ist (20–35%), ist ein oraler Nikotinersatz durchführbar. Die in vitro Inhibierung des Nikotinmetabolismus wurde in exprimiertem CYP2A6 unter Verwendung von Tranylcypromin, Methoxsalen, und als Inhibitoren (K_i = 0,05–6 μM) untersucht. In abhängigen Rauchern erhöhte Methoxsalen, 30–50 mg oral 30 Minuten vor Nikotin 31 μg/kg Subkutan (3 Dosen stündlich), den 8 Stunden-Mittelwert des Plasma-Nikotins um 49% (p < 0,01), während Cumarin (225 mg stündlich × 6) es um 15% (p < 0,05) im Vergleich zu Placebo erhöhte. Unter Verwendung der oben beschriebenen Methodologie, erhöhten Studien, durchgeführt in regelmäßigen Rauchern (n = 7–12), die Nikotin (4,0 mg p. o.) allein oder gleichzeitig mit Placebo, Methoxsalen (3 mg, 10 mg oder 30 mg) oder Tranylcypromin (2,5 mg oder 10 mg) erhielten, signifikant das Plasma-Nikotin im Vergleich zu Placebo (siehe 15). Insbesondere erzeugten Methoxsalen 10 und 30 mg (M10 und M30, 15) und Tranylcypromin 2,5 und 10 mg (T2,5 und T10, 15) etwa 100% Anstiege des Plasma-Nikotins (p < 0,01). Zusätzlich waren diese Anstiege in der oralen Nikotin-Bioverfügbarkeit mit einer signifikanten (p < 0,05) Abnahme des Wunsches zu rauchen für M10 und M30 und T2,5 (p = 0,17) assoziiert (siehe 15, durchgezogene Kreise).
Aus diesen Studien ist es offensichtlich, dass Methoxsalen und Tranylcypromin in Dosen 1/4 bzw. 1/8 ihrer derzeitigen, für die Behandlung von Psoriasis bzw. Depression verwendeten therapeutischen Dosen verwendet werden können, um Nikotin First-Pass-Metabolismus und systemischen Metabolismus zu inhibieren. Es kann von anderen CYP2A6 Inhibitoren und ihren isomeren Formen erwartet werden, das gleiche zu tun.
Beispiel 11
Extraktion von Hypericum
Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um ein Extrakt von Hypericum perforatum herzustellen:
Eine Extraktionsmischung von 10 Hypericumkapseln (0,3% Hypericin) und 50 ml 80% Methanol (Wasser 20%, Vol/Vol) wurde in einem Becher (125 ml) platziert. In einem Protokoll wurde die Extraktion unter Verwendung von kaltem Methanol durchgeführt. In einem zweiten Protokoll wurde die Extraktionsmischung in einem Wasserbad platziert und bis zum Kochen (etwa 80°C) erwärmt. Die Mischung wurde für 30 Minuten gekocht, wobei das Volumen durch Hinzufügen von Methanol bei 50 ml gehalten wird, dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und bei 3000 g für 5 min. zentrifugiert. Der resultierende Extrakt wurde dann zur Trockenheit geblasen und in Trispuffer pH 7,4 resuspendiert.
Beispiel 12
Wirkung von Hypericumextrakten auf die CYP2A6 Aktivität

Der Nikotinmetabolismus wurde in vitro überwacht. Die Inhibitorbeurteilung wurde durch Vergleichen der Untersuchung einschließlich 50 μL Trispuffer mit den Extrakten, die in Beispiel 11 (50 μL, verdünnt in Trispuffer) hergestellt wurden, durchgeführt. Humane Lebermikrosomen oder CYP2A6 Mikrosome wurden verwendet. Die Konzentration des Inhibitors im Hypericum wurde auf der Basis eines scheinbaren Molekulargewichtes des Inhibitors von 504 und einer Konzentration von 0,3% aktiven Materials in dem pflanzlichen Material, wenn verdünnt, um Konzentrationen von 20, 10, 5, 1, 0,1 und 0,01 und 0,01 μM zu ergeben, berechnet.

Inkubationsmischung:
	Substrat 80 μM (50 μl Trispuffer)
	NADPH1 mM (50 μl Trispuffer)
	Mikrosome 80 μg (30 μl Trispuffer)
	Cytosol (Ratten) 20 μl (Trispuffer)
	Trispuffer 50 μl (pH 7,4)
	Endvolumen 200 μl

Inkubationsverfahren:

Die Inkubation wurde bei 37°C für 30 Minuten durchgeführt. Ein interner Standard (50 μl Koffein, 0,05 mg/ml) wurde zu der Inkubationsmischung hinzugefügt, gefolgt durch DCM (1 ml). Die Mischung wurde für 10 min geschüttelt und für 5 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Die oberste Schicht wurde abgesaugt. HCl (0,01 N, 100 μL) wurde hinzugefügt, gefolgt von Schütteln für 1 Minute, dann Zentrifugieren für 5 Minuten bei 3000 g. 30 μl der HCl-Schicht wurde für die HPLC injiziert.

HPLC-Bedingungen:
Säule:	Supelco; 5-8347; LC-8-DB; 150 × 4,6 mm;
	5 μm
	λ: 260 nm
Flussrate:	1,3 ml/min
Mobile Phase:	1000/120 (Zitronensäurepuffer/Acetonitril, Vol/Vol)
Zitronensäurepuffer:	Zitronensäure 7,14 g (0,34 M)
	KH₂PO₄ 4,627 g (0,34 M)
	1-Heptansulphonat 670 mg
	Triethylamin 5 ml
	Endvolumen 1000 ml
	Eingestellt auf pH 4,40 mit 5 N KOH
Retentionszeiten (min):
	2,2 (Nikotiniminiumion)
	2,7 (Nikotin)
	3,4 (Cotinin)
	3,9 (Koffein) (interner Standard)

16 demonstriert die Inhibierung des Nikotinmetabolismus mit (1) kaltem Methanolextrakt von Hypericum; (2) einem heißen Methanolextrakt von Hypericum; (3) gereinigten Hypericin; und (4) einer negativen Kontrolle. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass beide Methanolextrakte von Hypericum CYP2A6 Aktivität inhibieren können.
Beispiel 13
Wirkung von Johanniskraut auf den Nikotinmetabolismus
12 Probanden empfingen Placebo oder 3 Johanniskrautkapseln 300 mg plus orales Nikotin 4,0 mg als Base oral. Blutproben wurden zu bestimmen Zeiten über 3 Stunden genommen.
Die in 18 und 19 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass Johanniskraut die Bioverfügbarkeit von Nikotin in vivo erhöht. Die mittleren Plasma-Nikotinkonzentrationen waren 64% höher nach Johanniskraut.
Beispiel 14
Wirkung von Esculetin auf CYP2A6 Aktivität Esculetin, eine Verbindung die in Cichorium intybus und Bougainvllra spectabilis gefunden wird, wurde auf ihre Fähigkeit getestet, den Nikotinmetabolismus durch CYP2A6 unter Verwendung der in Beispiel 12 dargelegten Verfahren zu inhibieren.
Die Ergebnisse, die in 19 gezeigt sind, demonstrieren, dass Esculetin ein wirksamer Inhibitor von CYP2A6 ist. Tabelle 1

Claims

Verwendung eines CYP2A6-Inhibitors zur Zubereitung eines Medikamentes zur gleichzeitigen Verwendung mit Nikotin bei der Behandlung eines Zustandes, der eine Regelung des Nikotinstoffwechsels in einem Individuum mit einem CYP2A6-Genotyp, der mit einer aktiven Form des CYP2A6-Enzyms assoziiert ist, erfordert, wobei das Medikament eine wirksame Menge von einer oder mehreren Substanzen umfasst, die CYP2A6-Aktivität hemmen, und die ausgewählt sind aus Tranylcypromin, Esculetin, Selegilin oder einem Naturprodukt ausgewählt aus Hypericum oder Extrakten davon.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zustand Rauchen ist und das Hemmen des CYP2A6-Enzyms die Umwandlung von Nikotin zu Cotinin hemmt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Medikament für eine orale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament in einer Einzelzusammensetzung formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Tranylcypromin in einer Menge von 0,1 mg bis 80 mg vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche ferner das Verabreichen eines Inhibitors von CYP2B6 an das Individuum, gleichzeitig mit der einen oder den mehreren Substanzen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Zustand Krebs ist und die Hemmung des CYP2A6-Enzyms den Stoffwechsel eines Procarcinogens zu einem Carcinogen hemmt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Procarcinogen ein N-Nitrosodialkylamin ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N-Nitrosodiethylamin, N-Nitrodimethylamin und 4-(Methylnitrosamin)-1-(3-pyridyl)-1-butanon besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Zustand ausgewählt ist aus (i) Tabaksucht, (ii) dem Risiko, eine Tabaksucht zu entwickeln, (iii) dem Risiko eine mit dem Rauchen in Zusammenhang stehende Krebserkrankung zu entwickeln und (iv) der Exposition gegenüber einer oder mehrerer Verbindungen, die durch CYP2A6 in Carcinogene umgewandelt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Medikament als anhaltend freisetzende Tabletten oder Kapseln formuliert wird.
Zusammensetzung, welche (a) Nikotin und (b) eine oder mehrere Substanzen, die CYP2A6-Aktivität hemmen und ausgewählt sind aus Tranylcypromin, Esculetin oder Selegilin, umfasst, um die Wirksamkeit einer oralen Nikotinersatztherapie in einem Individuum mit einem CYP2A6-Genotyp, der mit einer aktiven Form des Enzyms assoziiert ist, zu stärken.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, die als kontrolliert oder langsam freisetzendes Kapselsystem formuliert ist.