DE69831113T2

DE69831113T2 - 2- oder 3-dimensionale geometrische struktur aus peptidnukleinsäuren

Info

Publication number: DE69831113T2
Application number: DE69831113T
Authority: DE
Inventors: Dr. Hans-Geor Batz; Dr. Troels Koch; Henrik Frydenlund Hansen
Original assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Current assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-05-27
Also published as: DE69831113D1; JP2009100762A; EP0881228A3; US6521744B1; EP0881228B1; JPH1149797A; EP0881228A2; DK0881228T3; ATE301669T1; US6310179B1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Konstruieren einer 2- oder 3-dimensionalen, zuvor festgelegten, polymeren geometrischen Struktur aus oligomeren Elementen, die Verwendung dieser geometrischen Strukturen als auch von Nukleinsäure-Analoga für das Zusammensetzen von supramolekularen Strukturen einer definierten Form.
Lebende Organismen setzen sich aus Biomolekülen, insbesondere durch einen definieren Selbstzusammenbau von Biomolekülen wie Lipiden, Proteinkomplexen und DNA-Doppelhelices zusammen. Diese in lebenden Organismen vorkommenden supramolekularen Strukturen sind außerhalb dieser Organismen relativ instabil, da die Biomoleküle nur eine begrenzte Affinität aufweisen und biologisch abbaubar sind.
Lehn (Science 260, 1762–1763, 1993) beschreibt die Verwendung von künstlich selbstzusammengesetzten Komplexen aus niedermolekularen organischen Molekülen und Metallionen.
Es ist weiterhin bekannt, dass in Longmuir-Blodget-Schichten während der Klusterbildung Löcher geschaffen werden können. Diese künstlichen Systeme basieren auf der Verbindung von gleichförmigen Molekülen ohne oder mit geringen Unterschiedlichkeiten.
In der Natur setzen sich komplexe Strukturen aus Makromolekülen unterschiedlicher tertiärer Strukturen, ausgehend von gleichförmigen Grundstrukturen wie Aminosäuren und Nukleotiden, zusammen. Nukleinsäuren einer komplementären Sequenz bilden helikale Ketten, die später in vivo spezielle Strukturen und Netzwerke ausbilden können.
In Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 37, 7, 635–739 ist eine supramolekulare Struktur auf der Grundlage von Makrozyklen beschrieben. In J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 852–853 ist die Kontrolle der Stereochemie in einer supramolekularen Architektur beschrieben.
In J. Vac. Sci. Technol. A 12(4), 1895–1903 ist der Selbstzusammenbau von DNA-Molekülen zur Bildung eines 2-dimensionalen Gitters beschrieben. Diese Gitter werden unter Verwendung von DNA-Molekülen gebildet, deren Nukleotidsequenz so gewählt ist, dass vier oder mehr dieser DNA-Moleküle eine bevorzugte Anordnung aufweisen, um eine Junction (Kreuzung) zu bilden. In diesem Dokument findet sich eine ausführliche Erläuterung darüber, wie die Sequenzen der beteiligten DNA-Moleküle zu wählen sind. Weiterhin findet sich eine zumindest theoretische Beschreibung darüber, wie ein 3-dimensionaler Gegenstand wie ein Würfel aus 6 cyclischen DNA-Molekülen gebildet werden kann. Auch hier werden die Sequenzen der DNA-Moleküle so gewählt, dass die Struktur durch die Bildung einer doppelsträngigen DNA entlang der Kanten des Würfels stabilisiert und definiert wird.
In Nature 1983, 305:829–831 wird die Konstruktion und Synthese einer immobilen Nukleinsäure-Junction beschrieben, die sich aus vier Hexadecanukleotiden zusammensetzt. In Science 1991, 254:1497–1500 ist ein PNA-1/doppelsträngige DNA-Strangverdrängungskomplex beschrieben.
In DE-A-3924454 und US-A-5.561.071 ist die Verwendung von selbstzusammensetzenden doppelsträngigen DNAs zur Bildung von Leiterelementen, wie zum Beispiel in elektronischen Chips verwendeten Elementen, beschrieben.
Die durch Selbstzusammenbau von DNA hergestellten supramolekularen Strukturen sind nun unter in vitro-Bedingungen als derart instabil befunden worden, dass beispielsweise elektronische Chips, die aus ihnen hergestellt sind, nicht zuverlässig sind.
In WO 92/20702 sind rein synthetische oligomere Moleküle beschrieben, die zur Bindung an komplementäre Nukleinsäuren mit sehr hoher Affinität fähig sind. Dies kann entweder in der Therapie innerhalb des menschlichen Körpers oder in der Diagnose von Nukleinsäuren in vivo oder in vitro ausgenutzt werden. Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), wie in dieser Literatur beschrieben, sind durch ihr nicht-natürlich vorkommendes Rückgrat mit angelagerten Nukleobasen an definierten Positionen charakterisiert, so dass diese Nukleobasen eine Wasserstoffbrückenbindung mit den komplementären Basen auf einem DNA-Strang eingehen können, wodurch sie einen doppel- oder dreisträngigen Komplex bilden.
Daher bestand eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von supramolekularen Strukturen mit einem hohen Molekulargewicht in einer Weise, die sie zuverlässiger macht.
Eine alternative oder zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung stabilerer supramolekularer Strukturen mit hohem Molekulargewicht in einer voraussehbaren Weise.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung neuer Materialien, die auf supramolekularen Strukturen basieren, in einer angestrebten Weise, die in Computerchips, in der Roboterkonstruktion, zum Beispiel als Roboterarme im Nanometer-Maßstab, in neuen Materialien/Polymeren mit Leitfähigkeit und/oder Isoliervermögen, verwendet werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Konstruieren einer 2- oder 3-dimensionalen, zuvor festgelegten, polymeren geometrischen Struktur, umfassend mindestens zwei oligomere Elemente, wobei die Elemente unabhängig ein Peptidbindung-enthaltendes Rückgrat umfassen, welches Verfahren das Kombinieren eines ersten oligomeren Elements mit gebundenen Erkennungselementen mit einem zweiten oligomeren Element mit gebundenen Erkennungselementen umfasst, die zum Erkennen der Erkennungselemente des ersten oligomeren Elements unter Bindungsbedingungen fähig sind, wodurch die Erkennungselemente an das Rückgrat an beabstandeten und zuvor festgelegten Lokalisationen des Peptidbindung-enthaltenden Rückgrat gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungselemente heterocyclische Komponenten sind, die andere Erkennungselemente über Wasser stoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Interaktion, π-Stapelung oder Wasserausschluss erkennen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind diese polymeren geometrischen Strukturen.
1 zeigt die Struktur einer selbstzusammengebauten 2-dimensionalen geometrischen Struktur, die durch Selbstzusammensetzung dreier unterschiedlicher Peptid-Nukleinsäuren gebildet wird.
Eine zuvor festgelegte geometrische Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in einer Struktur mit einer definierten Ausdehnung, die schematisch dargestellt werden kann. Beispiele solcher zuvor festgelegter geometrischer Strukturen sind Gitter, Junctions, Würfel und verzweigte Moleküle, wie bei dem oben beschriebenen Stand der Technik beschrieben. Daher kann die Erfindung in der Nanotechnologie zur Schaffung angestrebter Strukturen Anwendung finden. Während nach dem Stand der Technik DNA zur Herstellung der Strukturen beschrieben wird, richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung oligomerer Elemente, die ein Rückgrat mit einer peptidartigen Bindung umfassen. Die geometrischen Strukturen enthalten vorzugsweise mindestens einen Verzweigungspunkt. Ein Verzweigungspunkt ist als die Lokalisation definiert, an der sich drei oder mehr Arme treffen. Mindestens einer dieser Arme umfasst ein Segment, in welchem ein Strang dieses Arms an einen Strang eines weiteren oligomeren Elements gebunden ist. Die oligo- oder polymere geometrische Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens zwei oligomere Elemente. Bevorzugt ist jedoch, dass solch eine Struktur 6 oder mehr, vorzugsweise zwischen 8 und 1 Million oligomere Elemente enthält. In dieser Definition enthalten die oligomeren Strukturen 2 bis 20 und polymeren Strukturen mehr als 21 oligomere Elemente. Diese oligomeren Elemente können von derselben Art sein und beispielsweise lediglich in der Sequenz der Erkennungselemente voneinander abweichen, wobei die oligomeren Elemente jedoch vorzugsweise von unterschiedlicher Art sind, die beispielsweise hinsichtlich der Sequenz und der Molekularstruktur abweichen, wobei zum Beispiel einige weiter modifiziert sind oder auf unterschiedlichen Rückgraten oder angelagerten Komponenten basieren.
Ein oligomeres Element gemäß der Erfindung ist so definiert, dass es Affinitätskompo nenten wie Alkyl-, Aryl-, aromatische und/oder heterocyclische Komponenten enthält, die andere heterocyclische Moleküle über Van-der-Waals-Interaktion, π-Stapelung, Wasserausschluss oder Wasserstoffbrückenbindung erkennen. Diese Affinitätskomponenten sind an beabstandete, definierte Lokalisationen eines Polyamid-Rückgrats gebunden. Das Rückgrat ist allgemein ein nicht-natürlich vorkommendes Rückgrat. Das Rückgrat enthält vorzugsweise sich wiederholende monomere Untereinheiten, welche Untereinheiten kovalent aneinander gebunden sind, vorzugsweise unter Ausbildung von Amidbindungen. Zwar ist die Verwendung lediglich einer Art von monomerer Untereinheit im Rückgrat stark bevorzugt, doch ist die Verwendung unterschiedlicher Untereinheiten und/oder unterschiedlicher Bindungen innerhalb des Rückgrats in entweder individueller Mischung oder als Strecken, die mehrere identische Untereinheiten enthalten, möglich, wie beschrieben in WO 95/14706, EP 700928 , EP 646595 und EP 672677 .
Oligomere Elemente, die sowohl ein nicht-natürliches Rückgrat als auch ein erweiterbares Oligonukleotid enthalten, können zur nachträglichen Modifikation der geometrischen Struktur nach dem Zusammenbau verwendet werden. So ist die Anbindung weiterer Mononukleotid-Einheiten an das Ende der Oligomereinheit möglich, wie zum Beispiel beschrieben in EP 720615 .
Bevorzugte oligomere Elemente, wie etwa Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), sind beschrieben in WO 92/20702. Diese Verbindungen umfassen ein Polyamid-enthaltendes Rückgrat, das eine Vielzahl von heterocyclischen Komponenten trägt, die einzeln an innerhalb des Rückgrats lokalisierten Aminatomen gebunden sind.
Eine immobile Nukleinsäure-Junction, die sich aus vier Hexadecanukleotiden zusammensetzt, ist beschrieben in Nature 1983, 305:829–831. Ein PNA-1/doppelsträngige DNA-Strangverdrängungskomplex ist beschrieben in Science 1991, 254:1497–1500.
Bevorzugte Peptid-Nukleinsäuren sind in Formel I gezeigt:
Formel I worin
n eine ganze Zahl von mindestens 3 ist;
x eine ganze Zahl von 2 bis n-1 ist,
jedes von L¹–Lⁿ ein Ligand ist, der unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C₁-C₄)Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Komponenten, DNA-Interkalatoren, Nukleobase-Bindungsgruppen, heterocyclischen Komponenten, Reporterliganden und chelatbildenden Komponenten, wobei mindestens eines von L¹–Lⁿ eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthält;
jedes von C¹–Cⁿ ist (CR⁶R⁷)_y (vorzugsweise CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CR⁶R⁷CH₂), worin R⁶ Wasserstoff ist und R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren, oder R⁶ und R⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C₁-C₆)Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C₁-C₆)Alkoxy, (C₁-C₆)Alkylthio, NR³R⁴ und SR⁵, worin R³ und R⁴ wie nachstehend definiert sind, und R⁵ Wasserstoff, (C₁-C₆)Alkyl, Hydroxy, (C₁-C₆)Alkoxy oder (C₁-C₆)Alkylthio-substituiertes (C₁-C₆)Alkyl ist oder R⁶ und R⁷ zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen; oder C¹–Cⁿ ist CO, CS, CNR³;
jedes von D¹–Dⁿ ist (CR⁶R⁷)_z (vorzugsweise CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CH₂CR⁶R⁷), worin R⁶ und R⁷ wie oben definiert sind;
jedes von y und z Null ist oder eine ganze Zahl von 1 bis 10, wobei die Summe y + z mindestens 2 ist, vorzugsweise größer als 2, doch nicht mehr als 10;
jedes von G¹–G^n-1 ist -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO₂-, in jeglicher Orientierung, worin R³ wie nachstehend definiert ist;
jedes von A¹–Aⁿ und B¹–Bⁿ so ausgewählt ist, dass:

(a) A¹–Aⁿ eine Gruppe der Formel (I/A), (I/B), (I/C) oder (I/D) ist, und B¹–Bⁿ N oder R³N⁺ ist; oder
(b) A¹–Aⁿ eine Gruppe der Formel (I/D) ist und B¹–Bⁿ CH ist;

³

₂

₃

₂

⁴

¹

²

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

³

⁴

₁

₄

₁

₄

₁

₆

₁

₆

₂

₁

₆

₁

₆

Die bevorzugtesten Nukleinsäure-bindenden Komponenten umfassen mindestens eine monomere Untereinheit der allgemeinen Formel II:
worin
L ein Ligand ist wie oben für L¹–Lⁿ definiert,
k, l und m unabhängig Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind,
p Null oder 1 ist, und
R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren.
Bevorzugte Erkennungselemente sind Nukleobasen, zum Beispiel natürlich vorkommende Nukleobasen wie A, G, C, T und U, seltene Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin oder Thiouracil, als auch jegliche nicht-natürlich vorkommende Analoga wie 7-Deaza-dGTP, Bromthymin und Azaadenine. Diese Erkennungselemente sind zur Erkennung entsprechender Erkennungselemente auf einem anderen oligomeren Element fähig, wie im Fachgebiet bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt daher die Möglichkeit zur Schaffung angestrebter Strukturen mit hoher Spezifität, die zum Beispiel auf den Sequenzen der Erkennungselemente basieren, bereit.
Wasserstoffbrückenbindung ist eine Art von Bindung, wie sie insbesondere zwischen zwei Strängen einer Nukleinsäure vorkommt, einschließlich der Watson-Crick-Basenpaarung und der Hoogsteen-Basenpaarung.
Die Erkennungselemente werden an spezifizierte und konstante Lokalisationen am Rückgrat gebunden, wobei sie vorzugsweise durch 4 bis 8 dazwischenliegende Atome getrennt sind. Das bevorzugte Atom zur Anlagerung ist ein Stickstoffatom.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten oligomeren Elemente können mittels Methoden hergestellt werden, wie in den obigen Dokumenten beschrieben. Die Verwendung von Peptid-artigen Bindungen innerhalb des Rückgrats bietet eine gute Möglichkeit für eine einfache Synthese unter Verwendung von DNA- oder Peptid-Synthetisierern. Nach der Herstellung können die oligomeren Elemente an andere Komponenten gekoppelt werden, die in die geometrische Struktur der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden sollen, wie etwa Erkennungskomponenten, Komponenten, die erkannt werden können, katalytisch aktive Komponenten, Markierungen oder chemisch reaktive oder aktivierbare Komponenten. Erkennungskomponenten und Komponenten, die erkannt werden können, stellen Komponenten dar, die eine andere Komponente erkennen und vorzugsweise daran binden können. Beispiele sind immunologisch reaktive Verbindungen, Antikörper, Antigene und vorzugsweise Peptidepitope, die Komponenten wie Polyhaptene oder cyclische Peptide enthalten. Diese Komponenten können auch oligomere Elemente verbinden; so kann zum Beispiel ein Ende eines cyclischen Peptids an ein erstes oligomeres Element geknüpft werden und das andere Ende an ein zweites oligomeres Element geknüpft werden. Dies kann erreicht werden, indem diese Konjugate synthetisiert und erst dann in die polymere Struktur, zum Beispiel in einem Peptid-Synthetisierer, eingeführt werden.
Katalytisch aktive Komponenten sind Enzyme, vorzugsweise polymere Enzyme, zum Beispiel Aggregate einer großen Anzahl von Enzymen, die kovalent aneinander gebunden sind. Eine Vielzahl von Markierungen kann an das oligomere Element konjugiert werden, zum Beispiel Fluoreszenzmarkierungen, Farbstoffe oder sogar Metalle oder andere feste Partikel. Bevorzugt sind reaktive Gruppen.
Für die vorliegende Erfindung nützliche reaktive Gruppen sind Gruppen, die kovalent an andere Gruppen binden können, z.B. Erkennungskomponenten, wie oben definiert, vorzugsweise Gruppen, die zur Vernetzung von oligomeren Elementen oder zur Bindung jeglicher weiterer Komponenten an die oligomeren Elemente vor oder nach dem Zusammenbau der polymeren Struktur verwendet werden können. Solche vernetzenden Komponenten sind zum Beispiel Arylazid, Acylazid, Diazirine, Ketone, Chinone und Psoralene. Die Herstellung von für die vorliegende Erfindung nützlichen oligomeren Elementen ist ausführlich beschrieben in WO 92/20702 und US-A-5.539.082.
Wie oben erwähnt, bietet die Verwendung chimärer Elemente die Möglichkeit, kürzere oligomere Elemente zum Beispiel durch enzymatische Extensionsreaktionen unter Verwendung von Mononukleotiden zu verlängern. Ein weiteres Beispiel für eine Verlängerung ist die chemische Ligation von oligomeren Untereinheiten durch Reaktion eines Thioesters auf einem Oligomer mit einer Thiolgruppe auf einem anderen Oligomer, das außerdem eine Aminogruppe nahe der Thiolgruppe enthält. Der Thioester-Austausch wird die beiden Oligomere miteinander verknüpfen. Daraufhin wird die Aminogruppe auf dem zweiten Oligomer den neu gebildeten Thioester zur Bildung einer Amidbindung ersetzen (Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 5891–5896). Ein anderes Beispiel einer chemischen Ligation ist die Kombination einer aktivierten Gruppe auf einer Oligomer-Untereinheit mit einer funktionellen Gruppe auf derselben oder einer anderen Oligomer-Untereinheit. Diese Reaktion kann durch ein aktiviertes Carbonsäure-Derivat auf einem Oligomer und eine Aminogruppe auf demselben oder einem anderen Oligomer vollzogen werden.
Die kovalente Bindung zweier Segmente kann auch unter Verwendung von Duplexen/Triplexen mit überhängenden Enden erreicht werden. Das überhängende Ende eines Duplex kann dann mit dem überhängenden Ende des anderen Duplex/Triplex hybridisiert werden, wodurch ein Duplex von doppelter Länge gebildet wird. Durch Verwendung einer Erkennungskomponente, die eine Vernetzung bewirken kann (siehe oben), kann die überhängende Reaktion kovalent gebunden werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei oligomere Elemente unter Bedingungen kombiniert, die zur Verknüpfung der oligomeren Elemente durch eine Wasserstoffbrückenbindung über die Erkennungselemente geeignet sind. Geeignete Bedingungen für Peptid-Nukleinsäuren sind beschrieben in WO 92/20703 und Science 1991, 254: 1497–1500. Einer der größten Vorteile der Verwendung von PNAs bei der vorliegenden Erfindung ist, dass sie über Basenpaarung an Nukleinsäuren oder andere PNA-Oligomere in nichtphysiologischen Medien, zum Beispiel in Wasser ohne oder mit einem sehr geringen Gehalt an Salz, binden können.
PNAs, die chelatbildende Komponenten gebunden haben, sind beschrieben in WO 95/14708. Diese PNA-Oligomere bieten weiterhin die Möglichkeit zur Bindung von Metallionen (wodurch die geometrische Struktur mit Metallionen dotiert wird), um die elektrische Leitfähigkeit innerhalb solcher oligo/polymerer Strukturen zu erhöhen. PNAs mit angelagerten Peptid-Komponenten sind beschrieben in WO 95/16202. Diese Verbindungen bieten die Möglichkeit zur Funktionalisierung der geometrischen Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung durch nachträgliche Modifikation, zum Beispiel enzymatische Modifikation, oder zum Aufbauen neuer oder zusätzlicher Assoziationsstrukturen, z.B. der Verwendung von Antikörpern zur Bindung an Peptid-Antigene durch Erzeugen einer "Brücken"-Struktur.
Im Gegensatz zur Erkennung zwischen Nukleinsäuren sind die Abstände der Affinitätskomponenten in der Sequenz freier wählbar, da es, insbesondere in dem Fall, bei dem die ersten und zweiten oligomeren Elemente dieselbe Art von Rückgrat aufweisen, nicht erforderlich ist, dass sie Nukleinsäuren erkennen, wie dies bei Methoden für die Nukleinsäure-Bestimmung der Fall ist. Daher bietet die vorliegende Erfindung eine viel flexiblere Art und Weise der Konstruktion von geometrischen Strukturen als bei Strukturen, die unter Verwendung natürlich vorkommender DNA hergestellt werden, möglich.
Es mag jedoch bevorzugt sein, dass die Abstände zwischen den Erkennungselementen innerhalb der Segmente jedes oligomeren Elements, und vorzugsweise innerhalb der Segmente von oligomeren Elementen, die zur Bindung über Wasserstoffbrückenbindung entworfen sind, zumindest vergleichbar oder ähnlich sind, wobei die Abstände zwischen den Erkennungselementen solche sind, dass eine π-Stapelung und/oder Wasserausschluss der Erkennungselemente nach wie vor möglich ist. Eine günstige Wechselwirkung zwischen den Strängen lässt sich ohne weiteres durch Bestimmung der Schmelztemperaturen (T_m) des doppel/dreisträngigen Produkts bestimmen, das von dem ersten und zweiten oligomeren Element erzeugt wird. Je höher die T_m, umso höher die Affinität zwischen den Strängen.
Eine 1-dimensionale Struktur ist eine Struktur ohne Verzweigungspunkte, d.h. eine lineare Struktur.
Ein 2-dimensionale Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel eine Struktur mit linearen Strukturen, die in einer Schicht orientiert sind, wobei diese linearen Strukturen vorzugsweise miteinander an Verzweigungspunkten verbunden sind. Eine 2-dimensionale Struktur kann gerade, gekrümmt oder ringförmig sein. Ringe können miteinander verknüpft sein wie in einer Kette oder Verknüpfung.
Eine 3-dimensionale Struktur kann als aus 2-dimensionalen Strukturen bestehend definiert werden, die sich in mehr als eine Schicht erstrecken oder die mehr als einen Verzweigungspunkt enthalten. Ein Beispiel einer 3-dimensionalen Struktur ist ein Würfel, ein Rohr oder eine spiralförmige Struktur.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruierten geometrischen Strukturen sind für die Herstellung von Nanostrukturen und die Nanotechnologie von hohem Interesse. Die Entwicklung von Nanostrukturen ist von Interesse aufgrund des geringen Raumbedarfs, was für weiterentwickelte Instrumente erforderlich ist, und des geringen Materialmengenbedarfs im Vergleich zu makroskopischen Strukturen. Die Entwicklung zu Nanostrukturen lässt sich am besten im Bereich der Computer erläutern. Während die ersten Computer viel Raum erforderten, da die zugrundeliegende Hardware umfangreiche Dimensionen aufwies, machte die Entwicklung der Halbleitertechnologie die Schaffung von Computern von sehr hoher Kapazität, doch lediglich begrenzt verfügbarem Raum möglich. Es ist heutzutage erkannt, dass die derzeit angewendeten photolithographischen Methoden zur Herstellung von Computerchips eine weitere Maßstabsverkleinerung der Chips einschränkt. Nanostrukturen, wie durch die vorliegende Erfindung hergestellt, ermöglichen nun diese kleineren Dimensionen, die für die Konstruktion selbst von maßstabsverkleinerten Computerchips erforderlich sind.
Diese Möglichkeit erlaubt nun die Konstruktion von Drähten oder Leiterelementen von solch kleinem Durchmesser wie doppelsträngige Nukleinsäure-Analoga, deren Dimensionen sich etwa im selben Bereich wie doppelsträngige Nukleinsäuren bewegen. Durch Aufnahme von einzelsträngigen Segmenten in die geometrische Struktur ist jedoch eine Maßstabsverkleinerung der Leiter auf die Stärke von einzelsträngigen Nukleinsäure-Analoga oder selbst einfachen organischen Molekülen, zum Beispiel Kohlehydraten, möglich.
Die geometrischen Strukturen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Kombinieren zweier oder mehrerer oligomerer Elemente (entweder verlängert oder nicht verlängert) unter Bedingungen hergestellt werden, bei denen sie in einer spezifischen oder nicht-spezifischen Weise unter Verwendung der Erkennungselemente binden können. Wird eine spezifische Bindung angestrebt, so können natürliche oder nicht-natürliche Nukleobasen verwendet werden, die zur Basenpaarung fähig sind (ein allgemein als Hybridisation bezeichneter Prozess). Wird eine nicht-spezifische Bindung angestrebt, so findet die Duplexbildung vorzugsweise durch Interstrang-π-Stapelung und/oder Wasserausschluss statt.
Bei einer ersten Anwendung der geometrischen Struktur der vorliegenden Erfindung wird die Struktur daher als eine Maske zur Schaffung eines definierten Musters zum Beispiel auf einer Oberfläche verwendet. Die Fixierung des Nukleinsäure-Analogons kann durch passive Adsorption an der Oberfläche erfolgen, doch kann auch durch Bildung einer (ionischen oder kovalenten) Bindung zwischen dem Analogon und der Oberfläche vorgenommen werden. Diese Bindung kann durch thermische oder photochemische Methoden erfolgen.
Das auf der Oberfläche geschaffene Muster kann so verwendet werden, dass ein Teil oder alle verbliebenen Teile (zum Beispiel auf jener Oberfläche), die nicht durch diese Struktur bedeckt sind, mit einem Material, zum Beispiel dotiertem Silizium, beispielsweise mittels einer metalloorganischen chemischen Dampfablagerung bedeckt oder beschichtet werden, die geometrische Struktur, die die zusammengesetzten oligomeren Elemente enthält, entfernt wird und dann auf den nun ungeschützten Teil der Oberfläche ein zweites Material aufgebracht wird, zum Beispiel ein Leiter wie dotiertes Galliumarsenid oder dotiertes Silizium. Auf diese Weise kann die geometrische Struktur der vorliegenden Erfindung als ein Netzwerk oder Gitter gestaltet und so die definierte Herstellung eines Chips ermöglicht werden. Ein Teil der konzeptuellen Überlegungen zur Herstellung von Computerchips aus Netzwerken oder Gittern kann analog übernommen werden aus US-A-5.561.071.
Die Verwendung von Nukleinsäure-Analoga und insbesondere Peptid-Nukleinsäuren in diesem Bereich weist beträchtliche Vorteile auf. Nukleinsäure-Analoga sind unter den Bedingungen zur Beschichtung von Oberflächen mit Metallen stabiler als Nukleinsäuren. Dies trifft besonders auf den Bereich der Herstellung von Computerchips zu, bei denen ein Bruch innerhalb der geometrischen Struktur, zum Beispiel ein Bruch in der Glykosid- oder Phosphatbindung in einer der Nukleinsäuren die gravierende Konsequenz hätte, dass der elektrische Strom nicht durch die "Leitung" fließen könnte.
Bei PNAs handelt es sich um Nukleinsäure-Analoga, die in bevorzugten Ausführungsformen keine Glykosid- und/oder Phosphatbindungen enthalten und als solche stabiler sind, was das Risiko von Strangbrüchen im Vergleich zu Nukleinsäuren beträchtlich vermindert. Das macht die unter Verwendung von Nukleinsäure-Analoga hergestellten Chips wesentlich zuverlässiger in der Anwendung. Außerdem können Nukleinsäure-Analoga wie PNAs aufgrund der relativ flexiblen Art und Weise der Einführung von chemisch reaktiven Stellen in flexiblerer Weise modifiziert werden, wie oben beschrieben.
Bei einer zweiten Ausführungsform können die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten supramolekularen geometrischen Strukturen als Scaffold für den Elektronentransfer verwendet werden und leiten daher selbst elektrischen Strom. Es wurde nun festgestellt, dass Doppelstränge, die unter Verwendung der oligomeren Elemente der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden, als ein nanostrukturierter Elektronenleiter wirken können, insbesondere, wenn ein ununterbrochener π-Stapel aus heterocyclischen Komponenten oder anderen aromatischen/konjugierten Systemen innerhalb des Doppelstrangs enthalten ist (siehe zum Beispiel US-A-5.591.578 oder C & EN, 24. Februar 1997, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 7, 735–739 oder J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 852–853). In einer einfachen Anwendung ist es daher möglich, zwei makroskopische Elektroden über ein Elektronentransfer-Scaffold, "Leitung", das sich aus einem Doppelstrang der oligomeren Elemente zusammensetzt, miteinander zu verbinden. Diese Elektroden können in metallischen Oberflächen bestehen, an die eines der oligomeren Elemente der geometrischen Struktur direkt gebunden ist, zum Beispiel kovalent oder indirekt, wie etwa durch Absorbieren der geometrischen Struktur oder eines oligomeren Elements an der Elektrodenoberfläche. Die Immobilisierung von PNA an einer Kohlenstoffelektrode ist beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7667–7670. Der Inhalt dieser Veröffentlichung richtet sich auf die Herstellung eines Nukleinsäure-Analogon, das an eine Elektrode gebunden ist, und die Messung der Potentiogramme der an die Elektrode gebundenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Analoga.
Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung ist das Verbinden zweier Elektroden möglich, von denen jede nach dem Stand der Technik hergestellt worden ist, indem eine geometrische Struktur gemäß der Erfindung zusammengebaut wird. Dies kann in linearer Weise erfolgen, wie oben beschrieben, oder kann mehrere Teilflächen einbeziehen, zum Beispiel separate Elektroden, die in einer gerichteten Weise unter Verwendung spezifischer Sätze von oligomeren Elementen verbunden werden können. Zum Beispiel ist es möglich, eine Oberfläche mit einer Anordnung von Elektroden zu versehen, wobei an jede Elektrode ein spezifisches oligomeres Element oder sogar eine erweiterte polymere Struktur gebunden ist, und daraufhin ausgewählte Elektroden durch Verbinden der oligomeren Elemente miteinander verbunden werden, um eine geometrische Struktur gemäß der Erfindung oder Arme einer erweiterten geometrischen Struktur aus einer Elektrode mit einem oligomeren Element oder einer erweiterten geometrischen Struktur aus einer anderen ausgewählten Elektrode zu schaffen. Auf diese Weise können kundenspezifisch gestaltete Elektroden und Strukturen hergestellt werden. Solche Elemente, die eine Anordnung von Elektroden enthalten, können durch selektives Aufbringen einer oder mehrerer kleiner Tröpfchen einer Lösung, die diese Strukturen oder oligomeren Elemente enthält, auf die Oberfläche jeder Elektrode hergestellt werden. Jeglicher Überschuss an Verbindungen kann weggewaschen werden. Daraufhin können die Verbindungen zwischen den ausgewählten Elektroden wie oben beschrieben hergestellt werden.
Weiterhin ist eine nachträgliche Modifikation jeglicher gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erzeugten geometrischen Struktur durch Vernetzung oder sogar enzymatische Extension möglich. Die Vernetzung kann durch Bestrahlen einer geometrischen Struktur erfolgen, die eine photochemisch aktive Komponente wie Acridin, Arylazid, Acylazid, Diaziridine, Ketone, Chinone oder Psoralene beinhaltet, mit einem Licht einer geeigneten Wellenlänge zur Aktivierung der Vernetzungsreaktion erfolgen. Die Vernetzung kann auch mittels thermochemischer Methoden, wie etwa bei der Polymerherstellung, durch radikale oder elektrophile Kettenreaktionen unter Verwendung von Doppelbindungen enthaltenden Komponenten wie Acrylaten oder Styrolen, oder durch Aktivierung von funktionellen Gruppen wie Carbonsäuren, die auf eine Aktivierung hin zum Reagieren mit anderen funktionellen Gruppen wie Aminen fähig sind, erfolgen. In dieser Weise können zusätzliche Verzweigungspunkte oder sogar eine Interstrang/-Duplex-Stabilisation der doppelsträngigen Teile erreicht werden. Weiterhin ist eine Dotierung jeglicher negativ geladener Komponenten in der geometrischen Struktur durch Ionen, zum Beispiel Silberionen, analog zu dem Verfahren möglich, das beschrieben ist in Nature, Bd. 391, S. 775, 1998, auf das zur Herstellung und Verwendung dieser dotierten Struktur Bezug genommen wird.
Dreidimensionale Strukturen können in einer konsekutiven Weise durch Aufeinandersetzen von 2-dimensionalen Strukturen hergestellt werden, wodurch eine integrierte viellagige Struktur geschaffen wird.
Die Modifikation der Konformation einer 3-dimensionalen Struktur kann unter Verwendung spezieller photochemischer Gruppen wie Azabenzole, Stilben, vorgenommen werden, welche auf die Bestrahlung hin isomerisieren (z.B. cis/trans-Isomere).
Die 2- oder 3-dimensionalen Strukturen können in Lösung vor dem Aufbringen z.B. auf eine feste Phase vorgeformt werden oder können direkt auf der Oberfläche erzeugt werden, indem zunächst ein Strang eines Duplex an die Oberfläche gebunden wird und dann der komplementäre Strang gebunden wird, so dass der Duplex auf der festen Oberfläche entsteht. Die präzipitierte Struktur kann ihre Struktur wie in Lösung beibehalten, z.B. eine tertiäre Form als einer Helix, oder kann ihre Struktur auf der Oberfläche von einer Helix zu einem Duplex in Form einer Leiter verändern.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von PNA ist der, dass die Moleküle bestimmte Sequenzen zur Bildung stabiler Triplexe (PNA-DNA-PNA oder PNA-PNA-PNA) möglich machen. Dieses Bindungsmotiv ermöglicht die Herstellung wesentlich integrierterer Strukturen als z.B. DNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von Verbindungen, die unter Verwendung einer monomeren Untereinheit hergestellt werden oder diese enthalten der allgemeinen Formel
worin
X eine Amino-Schutzgruppe ist und Y eine Carboxyl-Schutzgruppe ist,
R₇ eine Komponente ist, die eine funktionelle Gruppe mit einer positiven oder negativen Ladung enthält, zum Beispiel eine Carboxylgruppe, Phosphatgruppe oder Ammoniumgruppe, oder eine Komponente ist, die zur Komplexierung oder Chelatierung von Metallionen fähig ist, oder eine reaktive Gruppe, zum Beispiel zur Einführung einer kovalenten Vernetzung, zum Beispiel Mercapto, Maleinimido, Chinon, Nitren oder Carben oder wie oben beschrieben ist, und L eine Affinitätskomponente ist, vorzugsweise eine heterocyclische Komponente oder eine reaktive aromatische Komponente, zum Beispiel ein aromatisches Azid oder Chinon für die Herstellung von supramolekularen Strukturen, wie in Anspruch 7 definiert, insbesondere für die Konstruktion neuer Materialien (z.B. neuer Polymere), die zur Basenpaarung an Nukleobasen, Leiternetzwerken und Computerchips fähig sind, und zur Vernetzung dieser Strukturen, oder Bindung von Erkennungskomponenten an solche Strukturen.
Nukleinsäure-Analoga bieten ein besonders nützliches Werkzeug für die Herstellung von komplexen polymeren Strukturen einer definierten Geometrie, da sie relativ stabil gegenüber den Reaktionsbedingungen für die Herstellung solcher Strukturen sind und die Möglichkeit bieten, reaktive Gruppen einzuführen, was bei gewöhnlichen Nukleinsäuren nicht möglich wäre.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Nukleinsäure-Analoga ist die Möglichkeit, sie mit einer besseren Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln auszustatten, und ihre relativ geringere Löslichkeit in Wasser im Vergleich zu Nukleinsäuren. Weiterhin zeigt die lipophile Natur der Nukleinsäure-Analoga viel höhere Affinitäten für viele Oberflächen.
Im Folgenden wird ein spezifisches Beispiel eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung skizziert.
Beispiel 1
Herstellung von Nukleinsäure-Analoga
Peptid-Nukleinsäure stellt ein Nukleinsäure-Analogon mit einem N-(2-Aminoethyl)-glycin-Rückgrat dar, wobei die Basen an das zentrale N-Atom durch eine 2-Carboxylmethylgruppe geknüpft sind. PNA wird mittels des in WO 92/20702 und US-A-5.539.082 beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die Sequenzen sind in jedem Beispiel angegeben.
Beispiel 2
Zusammenbau einer doppelt gegabelten geometrischen Struktur, die 6 Nukleinsäure-Analoga enthält
Gemäß Beispiel 1 werden die folgenden Peptid-Nukleinsäuremoleküle hergestellt:

1. H-TCA-CGT*-ACC-TAG-TCT*CT-TGC-AT*G-CAT-NH₂
2. H-CGA-TGC-T*AC-TCTCT*-CTA-GGT*-ACG-TGA-NH ₂
3. (H-GTA-GCA-T*CG)²-(ATG-CAT*-GCA)¹-NH₂ (² komplementär zum fettgedruckten Segment in 2, und ¹ komplementär zum fettgedruckten Segment in 1). Die folgenden Peptid-Nukleinsäuremoleküle wurden als Kontrollmoleküle hergestellt.
4. H-CTA-GCT*-ACG-TGA-NH₂ (Komplementär zum unterstrichenen Segment in 1)
5. H-TCA-CGT*-ACC-TAG-NH₂ (Komplementär zum unterstrichenen Segment in 2)
6. H-GTA-GCA-T*CG-NH₂ (Komplementär zum fettgedruckten Segment in 2)
7. H-ATG-CAT*-GCA-NH₂ (Komplementär zum fettgedruckten Segment in 1)

T* zeigt an, dass die T-Monomere an jener Position aus Lysin-enthaltendem Rückgrat zusammengesetzt sind.
Moleküle 1, 2, 3 sind zur Bildung einer oligomeren Struktur gestaltet, die 6 PNA-Moleküle als oligomere Elemente enthält (jedes der drei ist doppelt enthalten). Die Sequenzen werden so gewählt, dass eine spezifische und zuvor festgelegte Bindung an die oligomeren Elemente 1, 2 und 3 erfolgt. Die entstandene geometrische Struktur weist zwei Verzweigungspunkte und vier doppelsträngige Segmente auf.
Kontrollhybridisationen
Die Messung der Schmelztemperatur (T_m) zeigt eine sequenzielle Hybridisation der einzelnen Kontrollteile, was anzeigt, dass alle Segmente zum Hybridisieren fähig sind. Daher ergibt die Hybridisation der 12-mere, Kontrollsegmente 4 und 5, an die komplementären Segmente entweder in 1 oder 2 einen klaren Übergang bei ca. 72°C. Die Hybridisation der 9-mer-Kontrollsegmente (6 und 7) entweder an 1 oder 2 ergibt einen Über gang bei ca. 60°C. Die Hybridisation des Verbindungssegments (3) entweder an 1 oder 2 ergibt einen Übergang bei ca. 65°C. Diese Experimente zeigen, dass der Stamm eine T_m von etwa 73°C (12-mer) und der Gabelteil eine niedrigere T_m von ca. 60°C (9-mere) aufweist.
Bildung der supramolekularen Strukturen
Die Hybridisation von 1 und 2 aneinander (Bildung einer einzelnen Gabel, Verbindung zweier Moleküle) ergibt einen sehr klaren Übergang bei 73°C mit einer großen Δ OD, genau wie ihn auch die Kontrollsegmente zeigten. Das Mischen von 1, 2 und 3 (Bildung der Doppelgabel, Verbindung von 6 Molekülen) ergibt einen klaren Übergang bei 73°C und einen schwachen Übergang um 50–60°C. Die Δ OD dieses Experiments ist die größte gemessene. Dieses Experiment zeigt, dass die beiden hybridisierten Stammteile (Dimere, gebildet durch Duplexbildung) der Struktur durch die überlappende PNA (3) verbunden werden können. Die Gesamtstruktur wird als die angestrebte "Doppelgabel" vermutet. Über die T_m-Messungen hinaus, zeigte die erhöhte Δ OD des Gesamtkomplexes, dass eine größere Struktur gebildet wird.
Die supramolekularen Strukturen können durch AFM (Atomkraftmikroskopie) (Lit. Hansma, H.G. & Hoh, J. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 115–139 (1994); Bustamante, C. & Rivetti, C. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 395–429 (1996); Han, W., Linsay, S.M., Dlakic, M. & Harrington, E.R. Nature, 386, 563) sichtbar gemacht werden. Die Strukturen können z.B. in Lösung hergestellt und dann auf die ablesbare Oberfläche aufgebracht werden, oder können durch aufeinanderfolgendes Aufbringen der Baublöcke auf die Oberfläche hergestellt werden. Weiterhin kann eine Neutronendiffraktion Angaben über die mittlere Größe der supramolekularen Strukturen in Lösung machen.

Claims

Verfahren zum Konstruieren einer 2- oder 3-dimensionalen, zuvor festgelegten, polymeren geometrischen Struktur, umfassend mindestens zwei oligomere Elemente, wobei die Elemente unabhängig ein Peptidbindung-enthaltendes Rückgrad umfassen, welche Methode das Kombinieren eines ersten oligomeren Elements mit gebundenen Erkennungselementen mit einem zweiten oligomeren Element mit gebundenen Erkennungselementen umfasst, die zum Erkennen der Erkennungselemente des ersten oligomeren Elements unter Bindungsbedingungen fähig sind, wodurch die Erkennungselemente an das Rückgrad an beabstandeten und zuvor festgelegten Lokalisationen des Peptidbindung-enthaltenden Rückgrads gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungselemente heterocyclische Komponenten sind, die andere Erkennungselemente über Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Interaktion, π-Stapelung oder Wasserausschluss erkennen und wobei das erste oligomere Element und das zweite oligomere Element Nukleinsäure-Analoga sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur verzweigt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Struktur ein Netzwerk ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das erste und das zweite oligomere Element eine Peptid-Nukleinsäure ist.
2- oder 3-Dimensionale Struktur von zuvor festgelegter, polymerer Geometrie, umfassend mindestens zwei oligomere Elemente, wobei die Elemente unabhängig ein Peptidbindung-enthaltendes Rückgrad umfassen und unterschiedliche Sequenzen von Erkennungselementen aufweisen, wodurch die Erkennungselemente des ersten oligomeren Elements an Erkennungselemente auf dem zweiten oligomeren Element über Wasserstoffbrückenbindung gebunden werden, und wobei das erste oligomere Element und das zweite oligomere Element Nukleinsäure-Analoga sind.
Struktur nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die geometrische Struktur fünf oder mehr oligomere Elemente enthält.
Verwendung einer Verbindung, die eine monomere Untereinheit enthält der allgemeinen Formel
worin X eine Amino-Schutzgruppe ist, und Y eine Carboxyl-Schutzgruppe ist, R⁷ eine Komponente ist, die eine funktionelle Gruppe mit einer positiven oder negativen Ladung enthält, zum Beispiel eine Carboxylgruppe, Phosphatgruppe oder Ammoniumgruppe, oder eine Komponente ist, die zum Komplexieren oder Chelatieren von Metallionen fähig ist, oder eine reaktive Gruppe ist, zum Beispiel zum Induzieren einer kovalenten Vernetzung, zum Beispiel Mercapto, Maleinimido, Chinon, Nitren oder Carben, und L eine Affinitätskomponente ist, vorzugsweise eine heterocyclische Komponente, oder eine reaktive aromatische Komponente, zum Beispiel ein aromatisches Azid oder Chinon, für die Herstellung einer supramolekularen Struktur von zuvor festgelegter Form ausgehend von Basensequenz-Spezifität, wobei die supramolekulare Struktur mindestens zwei oligomere Elemente umfasst, welche Elemente unabhängig ein Peptidbindung-enthaltendes Rückgrad umfassen und unterschiedliche Sequenzen von Erkennungselementen aufweisen, wodurch die Erkennungselemente des ersten oligomeren Elements an Erkennungselemente auf dem zweiten oligomeren Element über Wasserstoffbrückenbindung gebunden werden, und wobei das erste oligomere Element und das zweite oligomere Element Nukleinsäure-Analoga sind.
Verwendung einer 2- oder 3-dimensionalen, zuvor festgelegten, polymeren geometrischen Struktur, umfassend mindestens zwei oligomere Elemente, wobei die Elemente unabhängig ein Peptidbindung-enthaltendes Rückgrad umfassen und unterschiedliche Sequenzen von Erkennungselementen aufweisen, wodurch die Erkennungselemente des ersten oligomeren Elements an Erkennungselemente auf dem zweiten oligomeren Element über Wasserstoffbrückenbindung gebunden werden, und wobei das erste oligomere Element und das zweite oligomere Element Nukleinsäure-Analoga sind, für die Herstellung der Leiternetzwerke von Computerchips.