DE69827642T2 - Schnelltest zur gleichzeitigen spezifischen bestimmung von hiv-antikörpern - Google Patents

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M. Alan GOLDEN
A. Catherine BRENNAN
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Immuno-Assays und genauer auf einen Immuno-Assay, der nützlich ist zur Detektion und Differenzierung von Antikörpern gegen menschliches Immun-Defizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und menschliches Immun-Defizienz-Virus Typ 1 (HIV-2) in Testproben mit einer schnellen Rundlaufzeit.
  • In Moment gibt es zwei phylogenetische Haupt-Gruppen von HIV-1, bezeichnet als Gruppe „M" und „0". G. Meyers et al., Human Retroviruses and AIDS 1995, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM (1995). HIV-1 Gruppe M Isolate wurden weiter unterteilt in Untergruppen (A bis J), welche phylogenetisch ungefähr gleich weit voneinander entfernt sind. Gruppe M Isolate dominieren weltweit. Die jüngsten Berichte über die Sequenz der HIV-1 Gruppe 0-Viren haben angezeigt, dass diese Viren so nah verwandt sind mit einem Schimpansen-Virus, wie mit anderen HIV-1 Untergruppen. Siehe beispielsweise L. G. Gürtler et al., J. Virology 68: 1581–1585 (1994); M. Vanden Haesevelde et al., J. Virology 68: 1586–1596 (1994); De Leys et al., J. Virology 64: 1207–1216 (1990); De Leys et al., U.S. Patent-Nummer. 5,304,466; L. G. Gürtler et al., Europäische Patent-Veröffentlichungsnummer 0 591 914 A2. Die Gruppe O-Sequenzen sind die sich am meisten unterscheidenden der HIV-1-Sequenzen, welche bisher beschrieben wurden. Obwohl HIV-1 Gruppe O Stämme in West-Zentral-Afrika endemisch sind (Kamerun, Äquatorial-Guinea, Gabun und Nigeria) wurden nun Patienten mit Gruppe O Isolaten in Belgien, Frankreich, Deutschland, Spanien und den Vereinigten Staaten isoliert. Siehe zum Beispiel R. De Leys et al., supra; P. Charneau et al., Virology 205: 247–253 (1994); I. Loussert-Ajaka et al., J. Virology 69: 5640–5649 (1995); H. Hampl et al., Infection 23: 369–370 (1995); A. Mas et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 12: 1647–1649 (1996); M. A. Rayfield et al., Emerging Infectious Diseases 2: 209–212 (1996), und M. Peeters et al., AIDS 11: 493–498 (1997).
  • Die HIV-1 Gruppe M Serologie ist größtenteils gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenzen der exprimierten viralen Proteine (Antigene), insbesondere derjenigen, welche die Kern- und Envelope-(env)Regionen umfassen. Diese Antigene sind strukturell und funktionell ähnlich, haben aber unterschiedliche Aminosäuresequenzen, welche Antikörper-Antworten hervorrufen, die spezifisch sind für das spezielle Antigen.
  • Eines der serologischen Hauptziele für die Detektion einer HIV-1 Infektion ist das 41,000 Molgewicht-Transmembran-Protein (TMP), Glycoprotein (gp) 41. gp41 ist ein hoch-immunogenes Protein, welches eine starke und nachhaltige Antikörper-Antwort in Individuen hervorruft, die als seropositiv für HIV angesehen wurden. Antikörper gegen dieses Protein sind unter den ersten, welche bei einer Serokonversion erscheinen. Die Immun-Antwort auf gp41 bleibt scheinbar relativ stark über den Verlauf der Krankheit hinweg, wie bewiesen durch die nahe universelle Anwesenheit von Anti-gp41-Antikörpern in asymptomatischen ebenso wie in klinischen Stadien von AIDS. Ein signifikanter Anteil der Antikörper-Antwort gegen gp41 richtet sich gegen eine gut charakterisierte immunodominante Region (IDR) innerhalb von gp41.
  • HIV-2 Infektionen wurden in Menschen außerhalb der anfänglichen endemischen Region von Westafrika identifiziert und wurden in Europäern festgestellt, welche in Westafrika gelebt haben oder solchen, welche sexuelle Beziehungen mit Individuen aus dieser Region hatten, in Homosexuellen mit sexuellen Partnern aus der endemischen Region, und anderen. Fälle von AIDS auf Grund von HIV Typ 2 (HIV-2) wurden nun weltweit dokumentiert. Siehe zum Beispiel Saimot et al., Lancet i: 688 (1987); M. A. Rey et al., Lancet i: 388–389 (1987); A. Werner et al., Lancet i: 868–869 (1987); G. Brucker et al., Lancet i: 223 (1987); K. Marquart et al., AIDS 2: 141 (1988); CDC, MMWR 37: 33–35 (1987); Anonym, Nature 332: 295 (1988).
  • Serologische Studien zeigen an, dass, während HIV-1 und HIV-2 vielfache gemeinsame Epitope in ihren Kern-Antigenen teilen, die Envelope-Glycoproteine dieser zwei Viren viel weniger kreuzreaktiv sind. F. Clavel, AIDS 1: 135–140 (1987). Diese beschränkte Kreuz-Reaktivität der Envelope-Antigene erklärt scheinbar, warum derzeit erhältliche serologische Assays für HIV-1 nicht mit bestimmten Seren aus Individuen mit Antikörpern gegen HIV-2 reagieren. F. Denis et al., J. Clin. Micro. 26: 1000–1004 (1988). Das in jüngster Zeit veröffentlichte US-Patent Nummer 5,055,391 kartographiert das HIV-2 Genom und stellt Assays bereit, um den Virus zu detektieren.
  • Befürchtungen sind aufgetreten in Bezug auf die Fähigkeit der derzeit erhältlichen Immuno-Assays für die Detektion von Antikörpern gegen HIV-1 (Gruppe 0) und/oder HIV-2, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-1 Gruppe 0 zu detektieren. I. Loussert-Ajaka et al., Lancet 343: 1393–1394 (1994); C. A. Schable et al., Lancet 344: 1333–1334 (1994); L. Gürtler et al., J. Virol. Methods 51: 177–184 (1995). Zusammenfassend ist das Problem des Analysierens, ob diese Immuno-Assays in der Lage sind, Gruppe 0 zu detektieren, die eingeschränkte Verfügbarkeit von Serum-Proben von Patienten, die infiziert sind mit und/oder Antikörper gegen HIV-1 Gruppe Isolate haben. Bis jetzt wurden wenige Patienten außerhalb von West-Zentral-Afrika mit einer Infektion gegen HIV-1 Gruppe 0 Isolate diagnostiziert, was die Forscher dazu führte, Patienten in West-Zentral-afrikanischen Ländern auf das Virus zu screenen. Die Screening-Verfahren in West-Zentral-Afrika wurden sowohl durch die Zeit, welche notwendig ist, um diese Assays durchzuführen, als auch durch die Ausrüstung, welche erforderlich ist, um dies zu tun, behindert.
  • Übliche Bindungs-Assays, die erhältlich sind zur Detektion von Antikörpern gegen HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2, benötigen üblicherweise ungefähr 2 bis 4 oder mehr Stunden, um ein Ergebnis zu erzielen. Diese Assays schließen weiterhin die Verwendung von Ausrüstungen ein, einschließlich Inkubatoren und Marker-Lese-Vorrichtungen, welche Elektrizität benötigen, um zu funktionieren. Diese Assays schließen spezifische Bindungsglieder ein, üblicherweise Antikörper und Antigen-Immun-Reaktanden, worin ein Glied des spezifischen Bindungspaars mit einer Signal-erzeugenden Verbindung markiert ist (zum Beispiel ein Antikörper markiert mit einem Enzym, einer fluoreszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem radioaktiven Isotop, einem direkten visuellen Marker etc.). Die Testproben, von denen vermutet wird, dass sie den Analyten enthalten, können mit einem markierten Reagenz gemischt werden, zum Beispiel einem markierten Anti-Analyt-Antikörper und für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert werden, die ausreichend sind, dass die Immunreaktion stattfindet. Die Reaktionsmischung wird danach analysiert, um entweder den Marker zu detektieren, der mit dem Analyt/markiertes Reagenz-Komplex zusammenhängt (gebundenes markiertes Reagenz) oder den Marker, der nicht mit dem Analyt komplexiert ist (freies markiertes Reagenz). Die Anwesenheit und/oder Menge eines Analyten wird angezeigt durch die Fähigkeit des Analyten, an ein markiertes Reagenz und Bindungsglied zu binden, welches üblicherweise immobilisiert ist, oder ein unlösliches komplementäres Bindungsglied.
  • Es gibt Situationen und Orte, in welchen der Zeitraum, der üblicherweise erforderlich ist, um diese Assays durchzuführen und Ergebnisse zu bringen, zu lang ist (das heißt, zwei bis vier Stunden) oder die Ausrüstung und/oder die Elektrizität, die notwendig ist, um den Assay durchzuführen, ist nicht verfügbar. In solchen Situationen sollte ein bevorzugter Test nicht teuer sein, wenig oder keine Ausrüstung erfordern und für einen Screening-Assay in einem so geringen Zeitraum wie fünf Minuten ein Ergebnis liefern.
  • Die Verwendung von Reagenz-imprägnierten Teststreifen in spezifischen Bindungs-Assays ist wohl bekannt. Siehe zum Beispiel Deutsch et al., U.S.-Patent Nummer 4,361,537 und Brown III et al., U.S.-Patent Nummer 5,160,701. In solchen Verfahren wird eine Testprobe an einen Teil des Teststreifens aufgebracht und es wird ihr erlaubt zu wandern oder sich durch das Streifenmaterial zu ziehen. Somit läuft der Analyt, der detektiert oder gemessen werden soll, durch oder entlang dem Material, möglicherweise mit Hilfe eines eluierenden Lösungsmittels, welches die Testprobe selbst oder eine separat hinzugefügte Lösung sein kann. Der Analyt wandert in oder durch eine Einfang- oder Detektionszone auf dem Teststreifen, worin ein komplementäres Bindungsglied zu dem Analyt immobilisiert ist. Das Ausmaß, zu welchem der Analyt in der Detektionszone gebunden wird, kann mit der Hilfe des markierten Reagenzes bestimmt werden, welches auch in den Teststreifen eingeschlossen werden kann oder welches separat aufgetragen werden kann.
  • Im Allgemeinen schließen Teststreifen ein Material ein, das in der Lage ist, eine Lösung durch Kapillarwirkung zu transportieren, das heißt, eine durchziehende oder chromatographische Wirkung, wie in Gordon et al., U.S.-Patent Nummer 4,956,302 beispielhaft dargestellt ist. Unterschiedliche Bereiche oder Zonen in dem Teststreifen enthalten die Assay-Reagenzien, die notwendig sind, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, wenn der Analyt zu oder durch solche Zonen transportiert wird. Die Vorrichtung ist sowohl für chemische Assays als auch für Bindungs-Assays geeignet und verwendet eine Entwickler-Lösung, um den Analyten entlang des Streifens zu transportieren. Ebenso, um die Stabilität und die Wirksamkeit der Assay-Reagenzien zu beweisen, die erforderlich sind, um das detektierbare Signal zu erzeugen, erfordern existierende Assays typischerweise mindestens den einen oder mehrere Steifen von jeder Herstellungsmenge, um separat für sowohl positive als auch negative Kontrollen untersucht zu werden.
  • Assay-Systeme, die für die separate oder gleichzeitige Detektion von Antikörpern gegen HIV-1 Gruppe M und/oder HIV-1 Gruppe 0 und/oder HIV-2 entwickelt wurden, müssen daher Reagenzien enthalten, welche nützlich sind für die Bestimmung der spezifischen Anwesenheit von Antikörpern gegen irgendeinen oder alle der Viren in einer Testprobe, wobei zwischen ihnen unterschieden wird. Daher existiert das Bedürfnis nach Reagenzien, die in der Lage sind, nur mit Antikörpern gegen HIV Gruppe M, HIV Gruppe 0 und HIV-2 zu reagieren, wobei die Reagenzien entweder keine Kreuz-Reaktivität oder eine begrenzte Kreuz-Reaktivität miteinander zeigen. Es wäre auch nützlich, eine wegwerfbare Assay-Vorrichtung bereitzustellen, die diese Reagenzien einschließt und die für das Screening von Einzelpersonen verwendet werden kann, und welche Ergebnisse in einem kurzen Zeitraum liefert.
  • Zusammenfassen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit für die gleichzeitige Detektion und Differenzierung zwischen Analyten, die Antikörper gegen HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 in einer Testprobe umfassen. Das Verfahren umfasst (a) das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einer analytischen Vorrichtung, welche einen Streifen hat, mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende, worin die Testprobe von dem proximalen Ende bis ungefähr zu dem distalen Ende durch Kapillarwirkung wandert, und worin der Streifen mindestens ein immobilisiertes Einfang-Reagenz pro Analyt enthält, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um durch die Bindung des Analyten und des Einfang-Reagenzes Einfang-Reagenz/Analyt-Komplexe zu bilden; und (b) das Bestimmen der Anwesenheit des/der Analyte(n) durch Detektieren einer sichtbaren Farbänderung bei der Einfang-Reagenz-Stellen auf dem Streifen, worin das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe 0 ein Polypeptid umfasst, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr. 58, und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe M ein Polypeptid der Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst, und das Einfang-Reagenz für HIV-2 ein Polypeptid der Sequenzidentifikationsnr. 55 umfasst. Vorzugsweise wird das Polypeptid-Einfang-Reagenz durch rekombinante Technologie hergestellt, obwohl in Erwägung gezogen wird, dass ein gereinigtes Protein (Polypeptid) oder ein synthetisches Peptid verwendet werden kann. Das immobilisierte Einfang-Reagenz kann als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol ausgestaltet sein. Desweiteren umfasst das Verfahren ein Indikator-Reagenz, das innerhalb des Streifens in einer Stelle zwischen dem proximalen Ende und dem immobilisierten Patienten-Einfang-Reagenz enthalten ist. Das Indikator-Reagenz umfasst eine Signal-erzeugende Verbindung, wobei die Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromogen, einem Katalysator, einer lumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem radioaktiven Element und einem direkten visuellen Marker. Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz einen direkten visuellen Marker, gewählt aus der Gruppe bestehend aus kolloidalen Metall-Partikeln, kolloidalen nicht-Metall-Partikeln, gefärbten oder kolorierten Partikeln und Liposomen. Das Indikator-Reagenz umfasst weiter Selen als einen nicht metallischen Partikel. Die Testprobe ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit. Die Körperflüssigkeit ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin und Speichel.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine analytische Vorrichtung bereit für die gleichzeitige Detektion und Differenzierung zwischen HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 in einer Testprobe, welche einen Streifen umfasst, mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende, worin die Testprobe in der Lage ist, von dem proximalen Ende bis zu ungefähr dem distalen Ende durch Kapillarwirkung zu wandern, und worin der Streifen mindestens ein immobilisiertes Einfang-Reagenz pro Analyt enthält für die Bindung des Analyten und des Einfang-Reagenzes; und worin das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe 0 eine Polypeptid-Sequenz umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr. 58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe M, Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst und wobei das Einfang-Reagenz für HIV-2 Sequenzidentifikationsnr. 55 umfasst. Das Polypeptid wird vorzugsweise durch rekombinante Technologie hergestellt, obwohl in Erwägung gezogen wird, dass ein gereinigtes Protein (Polypeptid) und synthetische Peptide verwendet werden können. Die analytische Vorrichtung umfasst weiterhin ein immobilisiertes Einfang-Reagenz, das als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol ausgestaltet ist. Weiterhin umfasst die analytische Vorrichtung ein Indikator-Reagenz, das innerhalb des Streifens an einer Stelle zwischen dem proximalen Ende und dem immobilisierten Patienten-Einfang-Reagenz enthalten ist. Das Indikator-Reagenz umfasst eine Signal-erzeugende Verbindung, wobei die Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromogen, einem Katalysator, einer lumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem radioaktiven Element und einem direkten visuellen Marker. Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz einen direkten visuellen Marker, gewählt aus der Gruppe bestehend aus kolloidalen metallischen Partikeln, kolloidalen nicht-metallischen Partikeln, gefärbten oder kolorierten Partikeln und Liposomen. Die Testprobe ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit. Die Körperflüssigkeit ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin und Speichel.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung einen Testkit für die Verwendung in spezifischen Bindungs-Assays bereit. Der Testkit umfasst eine analytische Vorrichtung für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge von HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 spezifischen Antikörpern in einer Testprobe und umfasst weiterhin einen Streifen, der ein proximales Ende und ein distales Ende hat, worin die Testprobe in der Lage ist, von dem proximalen Ende bis ungefähr zu dem distalen Ende durch Kapillarwirkung zu wandern und worin der Streifen ein immobilisiertes Einfang-Reagenz enthält, das an ein Glied bindet, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Analyten, einem hilfsweisen spezifischen Bindungsglied und einem Indikator-Reagenz. Das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe 0 umfasst ein Polypeptid, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr. 58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe M Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst und wobei das Einfang- Reagenz für HIV-2 Sequenzidentifikationsnr. 55 umfasst. Das Polypeptid wird vorzugsweise durch rekombinante Technologie hergestellt. Es wird in Erwägung gezogen, dass ein gereinigtes Protein oder ein synthetisches Peptid auch verwendet werden kann. Das Indikator-Reagenz umfasst eine Signal-erzeugende Verbindung, wobei die Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromogen, einem Katalysator, einer lumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem radioaktiven Element und einem direkten visuellen Marker. Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz einen direkten visuellen Marker, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kolloidalen metallischen Partikeln, kolloidalen nicht-metallischen Partikeln, gefärbten oder kolorierten Partikeln und Liposomen. Der Testkit umfasst weiterhin eine positive Reagenz-Kontrolle und eine negative Reagenz-Kontrolle.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des env Proteins von dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM 112 (Sequenzidentifikationsnr. 61).
  • 2 veranschaulicht die Strategie, die verwendet wurde, um synthetische HIV-1 Gruppe 0 env gp 120/gp41 Gen-Konstrukte zu erzeugen, worin das pGO-8-Insert = Osyn-5' bis Osyn-P3' ist; pGO-9-Insert = Osyn-5' bis Osyn-03'; pGO-11-Insert = Osyn-5' bis Osyn-M; und worin H = die hydrophobe Region der HIV-1 Gruppe 0 ist, gestrichen wie gezeigt.
  • 3A bis 3D zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-9PL/DH5α und pGO-9CKS/XL1 involviert sind.
  • 4A bis 4G zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-11PL/DH5α und pGO11CKS/XL1 involviert sind.
  • 5 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-8PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 58).
  • 6 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-8CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 60).
  • 7 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-9PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 48).
  • 8 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-9CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 50).
  • 9 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-11PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 52).
  • 10 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-11CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 54).
  • 11 zeigt die Aminosäuresequenz des pHIV-210 rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 55).
  • 12 ist ein Vorder-Grundriß der Test-Vorrichtung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wurde.
  • 13 ist eine Querschnitts-Ansicht der Test-Vorrichtung, die in 12 gezeigt ist, aufgenommen entlang der Linien 20 bis 22 von 12.
  • 14 ist eine Aufnahme der Ergebnisse, die in vier Test-Vorrichtungen von (von links nach rechts) zwei negativen Serum-Proben (zwei Test-Vorrichtungen links) und zwei negativen Vollblut-Testproben (zwei Test-Vorrichtungen rechts) erhalten wurden, versehen mit einer negativen Kontrolle in dem Assay der Erfindung.
  • 15 ist eine Aufnahme von 10 Test-Vorrichtungen und zeigt die Ergebnisse, die durch die Untersuchung von (von links nach rechts) fünf HIV-1 Gruppe M Seren (fünf Test-Vorrichtungen links) und fünf Vollblut-Proben (fünf Test-Vorrichtungen rechts) erhalten wurden, versehen mit den HIV-1 Gruppe M positiven Seren.
  • 16 ist eine Aufnahme von vier Test-Vorrichtungen, welche die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden, wenn (von links nach rechts) zwei bestätigte positive HIV-1 Gruppe 0 Seren (zwei Test-Vorrichtungen links) und zwei Vollblut-Testproben versehen mit HIV-1 Gruppe 0 Seren (zwei Test-Vorrichtungen rechts) getestet wurden.
  • 17 ist eine Aufnahme von 10 Test-Vorrichtungen, die die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden mit (von links nach rechts) fünf HIV-2 bestätigten positiven Seren (fünf Test-Vorrichtungen links) und Vollblut versehen mit HIV-2 Seren (fünf Test-Vorrichtungen rechts).
  • 18 ist eine Aufnahme von vier Test-Vorrichtungen, in denen (von links nach rechts) eine negative Testprobe, eine HIV-1 Gruppe M positive Testprobe, eine HIV-1 Gruppe 0 positive Testprobe und eine HIV-2 positive Testprobe einzeln getestet wurden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Fähigkeit, auf HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in weniger Zeit als in üblichen Assays zu screenen, ist ein erforderliches Merkmal in Situationen, in welchen schnelle Ergebnisse für die Patienten-Beratung und Behandlung notwendig sind. Ein solcher Screening-Assay muss in der Lage sein, einen ähnlichen Grad an Empfindlichkeit und Spezifität bereitzustellen, wie die konventionellen Screening-Assays, aber in einer viel kürzeren Zeitspanne. Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen Assay bereit und wird hiernach beschrieben.
  • Die folgenden Ausdrücke haben die folgenden Bedeutungen, solange nicht anderweitig angegeben:
  • Der Ausdruck "Testprobe" bezieht sich auf eine Komponente eines Körpers einer Person, die die Quelle für den Analyten ist (wie zum Beispiel Antikörper von Interesse oder Antigene von Interesse). Diese Komponenten sind im Fachgebiet wohl bekannt. Die Testprobe kann direkt, wie aus der Quelle erhalten, oder nach einer Vorbehandlung, um ihren Charakter zu modifizieren, verwendet werden. Diese Testproben schließen biologische Proben ein, welche durch die Verfahren, die hierin beschrieben sind, getestet werden können, und sie schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie zum Beispiel Vollblut, Serum, Plasma, Cerebrospinal-Flüssigkeit, Urin, Lymph-Flüssigkeiten und verschiedene externe Sekrete des Respirations-, Intestinal- und Urogenital-Trakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Myelome und dergleichen; und biologische Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Zellkultur-Überstände; fixierte Gewebeproben; und fixierte Zellproben. Die Testprobe kann vor der Verwendung vorbehandelt werden, wie zum Beispiel die Herstellung von Plasma aus Blut, die Verdünnung von viskosen Flüssigkeiten oder dergleichen; Behandlungs-Verfahren können die Extraktion, Filtration, Destillation, Konzentrierung, Inaktivierung von störenden Verbindungen und die Zugabe von Reagenzien einschließen. Eine solche Vorbehandlung kann auch die Modifikation eines festen Materials einschließen, von dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, um ein flüssiges Medium zu bilden oder um den Analyten freizusetzen.
  • "Analyt", wie hierin verwendet, ist die zu detektierende Substanz, welche in der Testprobe vorhanden sein kann. Der Analyt kann jede Substanz sein, für welche es ein natürlich vorkommendes spezifisches Bindungsglied gibt (wie zum Beispiel ein Antikörper) oder für welche ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Somit ist ein Analyt eine Substanz, die an ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder in einem Assay binden kann. "Analyt" schließt ebenfalls irgendwelche antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon ein. Als ein Glied eines spezifischen Bindungspaars kann der Analyt durch natürlich vorkommende spezifische Bindungspartner (Paare) detektiert werden, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, die Verwendung von intrinsischem Faktor Protein als einem Glied eines spezifischen Bindungspaars für die Bestimmung von Vitamin B12, die Verwendung von Folat-bindendem Protein, um Folsäure zu bestimmen oder die Verwendung eines Lectins als ein Glied eines spezifischen Bindungspaars für die Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt schließt jegliche antigenen Substanzen ein, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Nukleotid-Ziel und dergleichen, Haptene, Antikörper, Makromoleküle und Kombinationen davon.
  • "Analyt-Analog" bezieht sich auf eine Substanz, welche mit dem Analyt-spezifischen Bindungsglied kreuzreagiert, obwohl sie dies zu einem größeren oder geringeren Ausmaß als der Analyt selbst tun kann. Das Analyt-Analog kann einen modifizierten Analyten einschließen, ebenso wie einen fragmentierten oder synthetischen Anteil des Analyt-Moleküls, solange das Analyt-Analog mindestens eine Epitop-Stelle gemeinsam mit dem Analyten von Interesse hat. Ein Beispiel eines Analyt-Analogs ist eine synthetische Peptid-Sequenz, welche mindestens ein Epitop des gesamten Molekül-Analyten kopiert, so dass das Analyt-Analog an das Analyt-spezifische Bindungsglied binden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, welche spezifische Bindungsglieder verwenden. Ein "spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, ist ein Glied eines spezifischen Bindungspaars. Das heißt, zwei unterschiedliche Moleküle, worin eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Deshalb können, zusätzlich zu Antigen- und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren von üblichen Immuno-Assays, andere spezifische Bindungspaare beispielsweise ohne Einschränkung Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotid-Sequenzen, Effektor- und Rezeptor-Moleküle, Cofaktoren und Enzyme, Enzym-Inhibitoren und Enzyme und dergleichen einschließen. Zusätzlich schließen andere spezifische Bindungspaare, als Beispiele ohne Einschränkung, komplementäre Peptid-Sequenzen, eine Peptid-Sequenz und einen Antikörper, der spezifisch ist für die Sequenz oder das gesamte Protein, polymere Säuren und Basen, Farbstoffe und Protein-Bindemittel, Peptide und spezifische Protein-Bindemittel (zum Beispiel Ribonuklease, S-Peptid und Ribonuklease S-Protein) ein. Desweiteren können spezifische Bindungspaare Glieder einschließen, die Analoge der ursprünglichen spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analyt-Analog. Das spezifische Bindungspaarglied kann ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Nukleotidziel und dergleichen einschließen. Immunoreaktive spezifische Bindungsglieder schließen Antigene, Antigen-Fragmente, Antikörper und Antikörper-Fragmente ein, sowohl monoklonal als auch polyklonal, und Komplexe davon, einschließlich derjenigen, die durch rekombinante DNA-Moleküle gebildet werden, Folat-bindendes Protein, um Folsäure zu bestimmen oder die Verwendung eines Lectins als ein Glied eines spezifischen Bindungspaares für die Bestimmung eines Kohlenhydrates.
  • Der Ausdruck "Hapten", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein partielles Antigen oder nicht-Protein-Bindungsglied, das in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, aber welches nicht in der Lage ist, eine Antikörper-Bildung hervorzurufen, solange es nicht an ein Träger-Protein gekoppelt ist.
  • Das "Indikator-Reagenz", das auch als ein "markiertes Reagenz" bezeichnet wird, umfasst eine "Signal-erzeugende Verbindung" ("Marker"), die in der Lage ist zu erzeugen und die ein messbares Signal erzeugt, das durch externe Mittel detektierbar ist, die an ein spezifisches Bindungsglied für HIV konjugiert (angeheftet) sind. Zusätzlich dazu, dass es ein Antikörper-Glied eines spezifischen Bindungspaares für HIV ist, kann das Indikator-Reagenz auch ein Glied von irgendeinen spezifischen Bindungspaar sein, einschließlich entweder Hapten-Anti-Hapten-Systemen, wie zum Beispiel Biotin oder Anti-Biotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotid-Sequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptor-Molekül, ein Enzym-Cofaktor und ein Enzym, ein Enzym-Inhibitor oder ein Enzym und dergleichen. Ein Immuno-reaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper, ein Antigen oder ein Antikörper/Antigen-Komplex sein, der in der Lage ist, entweder an HIV, wie in einem Sandwich-Assay zu binden, an das Einfang-Reagenz, wie in einem kompetitiven Assay oder an das hilfsweise spezifische Bindungsglied, wie in einem indirekten Assay. Die Anheftung der Signal-erzeugenden Verbindung und des spezifischen Bindungsglieds kann durch kovalente oder nicht kovalente Bindung erfolgen, aber das Verfahren der Anheftung ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Der Marker erlaubt es dem Indikator-Reagenz, ein detektierbares Signal zu erzeugen, das direkt oder indirekt mit der Menge an Analyt in der Testprobe in Zusammenhang steht. Die spezifische Bindungspaarglied-Komponente des Indikator-Reagenzes ist gewählt, um direkt an den Analyten oder indirekt an den Analyten durch ein hilfsweises spezifisches Bindungsglied zu binden. Das markierte Reagenz kann in die Testvorrichtung eingeschlossen werden, es kann mit der Testprobe kombiniert werden, um eine Testlösung zu bilden, es kann getrennt von der Testprobe zu der Vorrichtung hinzugefügt werden oder es kann vorgelegt oder reversibel an der Einfang-Stelle immobilisiert werden. Zusätzlich kann das Bindungsglied vorher oder während der Durchführung des Assays markiert werden, durch ein geeignetes Anhäftungs-Verfahren.
  • Die verschiedenen "Signal-erzeugenden Verbindungen" ("Marker"), die in Erwägung gezogen werden, schließen Chromogene, Katalysatoren, wie zum Beispiel Enzyme, lumineszierende Verbindungen, wie zum Beispiel Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszierende Verbindungen wie zum Beispiel Dioxetane, Acridiniums, Phenanthridiniums und Luminol, radioaktive Elemente und direkte visuelle Marker ein. Beispiele für Enzyme schließen alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Beta-Galactosidase und dergleichen ein. Beispiele für direkte visuelle Marker schließen kolloidale metallische Partikel, wie zum Beispiel Gold, kolloidale nicht-metallische Partikel wie zum Beispiel Selen, gefärbte oder kolorierte Partikel, wie zum Beispiel ein gefärbtes Plastik oder einen eingefärbten Mikro-Organismus, kolorierte oder kolorierbare organische Polymer-Latex-Partikel, Durazyten® (derivatisierte rote Blutzellen, erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), Liposome oder andere Vesikel, die direkt sichtbare Substanzen enthalten, und dergleichen ein. Die Auswahl eines speziellen Markers ist nicht entscheidend. Der Marker wird in der Lage sein, ein Signal zu erzeugen, entweder durch sich selbst (wie zum Beispiel ein visuell detektierbarer kolorierter organischer Polymer-Latex-Partikel) oder er wird durch Instrumente detektierbar sein (wie zum Beispiel eine lumineszierende Verbindung oder ein radiomarkiertes Element) oder er wird in Zusammenhang mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen detektierbar sein, wie zum Beispiel ein Enzym/Substrat Signal-erzeugendes System. Eine Vielzahl von unterschiedlich markierten Reagenzien kann gebildet werden durch Variieren von entweder dem Marker oder der spezifischen Bindungsglied-Komponente des markierten Reagenzes; es wird durch jemanden, der im Fachgebiet bewandert ist, anerkannt werden, dass die Auswahl die Berücksichtigung des zu detektierenden Analyten mit dem gewünschten Detektionsmittel einschließt.
  • Wenn ein visuell detektierbarer Partikel als der Marker verwendet wird, wie zum Beispiel Selen, gefärbte Partikel oder schwarzer Latex, kann das markierte Reagenz-Bindungsglied(er) an die Partikel angeheftet werden. Alternativ kann das/die Bindungsglied(er) an separate Mengen von Partikeln angeheftet werden und danach können die Partikel gemischt werden.
  • "Signal-erzeugende Komponente" bezieht sich auf irgendeine Substanz, die in der Lage ist, mit einem anderen Assay-Reagenz oder mit dem Analyten zu reagieren, um ein Reaktions-Produkt oder ein Signal zu erzeugen, das die Anwesenheit des Analyten anzeigt und/oder dazu dient, anzuzeigen, dass bestimmte Assay-Charakteristika erfüllt wurden. Die Signal-erzeugende Komponente ist durch visuelle oder instrumentelle Mittel detektierbar. "Signal-Erzeugungs-System", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Gruppe von Assay-Reagenzien, die benötigt werden, um das gewünschte Reaktions-Produkt oder Signal zu erzeugen. Somit können eine oder mehrere Signal-erzeugende Komponenten mit dem Marker reagiert werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel, wenn der Marker ein Enzym ist, wird die Verstärkung des detektierbaren Signals erhalten durch Reagieren des Enzyms mit einem oder mehreren Substraten oder zusätzlichen Enzymen und Substraten, um ein detektierbares Reaktions-Produkt herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein visuell detektierbarer Marker als die Marker-Komponente des markierten Reagenzes verwendet, wodurch ein direktes visuelles oder instrumentelles Ablesen der Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe bereitgestellt wird, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Signal-erzeugende Verbindungen an den Detektions-Stellen. Geeignete Materialien für die Verwendung schließen kolloidale Metalle, wie zum Beispiel Gold und Farbstoff-Partikel, ebenso wie nicht metallische Kolloide, wie zum Beispiel kolloidales Selen, Tellur und Schwefel-Partikel ein.
  • "Immobilisiertes Einfang-Reagenz" bezieht sich auf eines oder mehrere spezifische Bindungsglieder, die innerhalb oder auf einem Teil des festen Phasenträgers oder des chromatographischen Streifens angeheftet sind, um eine oder mehrere "Einfang- Stellen" zu bilden, worin der Analyt, das positive Kontroll-Reagenz und/oder das markierte Reagenz auf dem Streifen immobilisiert werden oder worin das immobilisierte Reagenz die Wanderung des Analyten und/oder des markierten Reagenzes durch den Streifen verlangsamt. Das Verfahren der Anheftung ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Das immobilisierte Einfang-Reagenz erleichtert die Beobachtung des detektierbaren Signals durch im Wesentlichen Abtrennen des Analyten und/oder des markierten Reagenzes von ungebundenen Assay-Reagenzien und den verbleibenden Komponenten der Testprobe. Zusätzlich kann das immobilisierte Reagenz auf der festen Phase immobilisiert werden, vor oder während der Durchführung des Assays, durch irgendein geeignetes Anheftungs-Verfahren.
  • Typischerweise ist eine Einfang-Stelle der vorliegenden Erfindung ein abgegrenzter oder definierter Teil eines festen Phase-Trägers, sodass die spezifische Bindungs-Reaktion zwischen dem immobilisierten Einfang-Reagenz und dem Analyten ist. Dies erleichtert die Detektion des Markers, der an der Einfang-Stelle oder -Stellen immobilisiert ist, im Gegensatz zu anderen Teilen des festen Phase-Trägers. Die abgegrenzte Stelle ist typischerweise weniger als 50% des festen Phase-Trägers und vorzugsweise weniger als 10% des festen Phase-Trägers. Das immobilisierte Reagenz kann auf das feste Phase-Material aufgebracht werden durch Eintauchen, Hineinschreiben mit einem Stift, Verteilen durch ein Kapillar-Röhrchen oder durch die Verwendung von Reagenz-Jet-Printing oder Biodotting oder irgendwelchen anderen geeigneten Verteilungs-Techniken. Zusätzlich kann die Einfang-Stelle markiert werden, zum Beispiel mit einem Farbstoff, sodass die Position der Einfang-Stelle auf dem festen Phase-Material visuell oder instrumentell bestimmt werden kann, sogar wenn kein Marker an der Stelle immobilisiert ist. Vorzugsweise ist das immobilisierte Reagenz auf dem Streifen derart positioniert, dass die Einfang-Stelle nicht direkt mit der Testprobe in Kontakt steht, das heißt, die Testprobe muss durch Kapillar-Wirkung durch mindestens einen Teil des Streifens vor dem In-Kontakt-bringen mit dem immobilisierten Reagenz wandern.
  • Das immobilisierte Einfang-Reagenz kann in einer einzelnen Einfang- oder Detektions-Stelle oder in mehreren Stellen auf oder dem festen Phase-Material bereitgestellt werden. Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein immobilisiertes Patienten-Einfang-Reagenz(ien) und ein immobilisiertes Verfahrens-Einfang-Reagenz bereit. Die immobilisierten Einfang-Reagenzien können auch in einer Vielzahl von Konfigurationen bereitgestellt werden, um verschiedene Detektions- oder Mess-Formate zu erzeugen. Zum Beispiel kann das immobilisierte Einfang-Reagenz als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol oder irgendeine Kombination davon ausgestaltet sein. Wenn es als ein Buchstabe ausgestaltet ist, kann das immobilisierte Einfang-Reagenz entweder ein einzelner Buchstabe oder eine Kombination von Buchstaben sein, die Worte bildet oder abgekürzte Worte, wie zum Beispiel "POS", "NEG" oder "OK". Alternativ kann das immobilisierte Einfang-Reagenz als ein Symbol oder eine Kombination von Symbolen ausgestaltet sein, wie zum Beispiel ein Plus, ein Minus, ein Häkchen, ein Strich, eine Raute, ein Dreieck, ein Rechteck, ein Kreis, ein Oval, ein Quadrat, ein Pfeil, eine Linie oder irgendeine Kombination davon. Das immobilisierte Einfang-Reagenz kann als eine diskrete Einfang-Stelle oder als ein "Band" von Reagenz auf oder in dem festen Phase-Material bereitgestellt sein. Alternativ kann das immobilisierte Reagenz über einen großen Teil des festen Phase-Materials in einer im Wesentlichen gleichförmigen Art und Weise verteilt werden, um die Einfang-Stelle zu bilden. Das Ausmaß der Signal-Erzeugung in der Patienten-Einfang-Stelle hängt mit der Menge an Analyt in der Testprobe zusammen. Wenn eine positive Kontrolle verwendet wird, hängt das Ausmaß der Signal-Erzeugung in einer positiven Kontroll-Einfang-Stelle, wenn gewünscht, mit der Menge an positiven Kontroll-Reagenz zusammen, das auf den Streifen aufgebracht wurde.
  • "Negatives Bindungs-Reagenz", was wechselweise mit den Begriffen "negative Kontrolle" oder "negatives Kontroll-Reagenz" verwendet wird, bezieht sich auf jede Substanz, welche verwendet wird, um die Anwesenheit von nicht-spezifischer Bindung oder Aggregation von irgendeinem markierten Reagenz zu bestimmen. Das negative Kontroll-Reagenz kann beispielsweise eine Substanz sein, welche spezifische Bindungsglieder umfasst, wie zum Beispiel Antigene, Antikörper oder Antikörper-Fragmente. Zusätzlich kann das negative Kontroll-Reagenz abgeleitet sein von derselben oder einer unterschiedlichen Spezies wie die anderen Reagenzien auf dem Test-Streifen, oder von einer Kombination von zwei oder mehr Spezies. Die Anwesenheit eines detektierbaren Signals von dem negativen Kontroll-Reagenz auf dem Test-Streifen zeigt einen ungültigen Test an.
  • "Hilfsweise spezifisches Bindungsglied" bezieht sich auf irgendein Glied eines spezifischen Bindungspaares, welches in dem Assay zusätzlich zu den spezifischen Bindungsgliedern des Indikator-Reagenzes oder des immobilisierten Einfang-Reagenzes verwendet wird. Eines oder mehrere hilfsweise spezifische Bindungsglieder können in dem Assay verwendet werden. Beispielsweise kann ein hilfsweise spezifisches Bindungsglied in der Lage sein, das Indikator-Reagenz an den Analyten von Interesse zu binden, in Fällen, wo der Analyt selbst nicht direkt an das Indikator-Reagenz anheften kann. Alternativ kann ein hilfsweise spezifisches Bindungsglied in der Lage sein, das immobilisierte Einfang-Reagenz an den Analyten von Interesse zu binden, in Fällen, wo der Analyt selbst nicht direkt an das immobilisierte Einfang-Reagenz binden kann. Das hilfsweise spezifische Bindungsglied kann in die Assay-Vorrichtung eingeschlossen werden oder es kann zu der Vorrichtung als eine separate Reagenzlösung hinzugefügt werden.
  • Der "feste Phase-Träger" oder das "chromatographische Material" oder der "Streifen" bezieht sich auf jedes geeignete poröse, absorbierende, saugfähige, isotrope oder Kapillar-Material, welches die Reaktions-Stelle der Vorrichtung einschließt und durch welches der Analyt oder die Testprobe durch eine Kapillar- oder Saugwirkung transportiert werden kann. Es wird anerkannt werden, dass der Streifen aus einem einzelnen Material oder aus mehr als einem Material gemacht sein kann (zum Beispiel können unterschiedliche Zonen, Abschnitte, Schichten, Bereiche oder Stellen aus unterschiedlichen Materialien gemacht sein), solange wie die vielfältigen Materialien in Fluid-Fließ- Kontakt miteinander stehen, wobei der Durchtritt der Testprobe zwischen den Materialien erlaubt wird. Fluid-Fließ-Kontakt erlaubt den Durchtritt von mindestens einigen Komponenten der Testprobe, zum Beispiel dem Analyten, zwischen den Zonen des porösen Materials, und er ist vorzugsweise gleichförmig entlang der Kontakt-Schnittstelle zwischen den unterschiedlichen Zonen.
  • Somit können natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch modifiziert sind, als fester Phase-Träger verwendet werden und sie schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf folgende: Papiere (faserige) oder Membranen (Mikro-poröse) von Zellulose-Materialien wie zum Beispiel Papier, Zellulose und Zellulose-Derivate wie zum Beispiel Zellulose-Acetat und Nitro-Zellulose; Glaswolle; Gewebe, sowohl natürlich vorkommend (zum Beispiel Baumwolle) als auch synthetisch (zum Beispiel Nylon); poröse Gele; und dergleichen. Das poröse Material sollte die Erzeugung eines detektierbaren Signals nicht beeinflussen. Das chromatographische Material kann eine eigene Stärke haben oder die Stärke kann durch einen zusätzlichen Träger bereitgestellt werden.
  • Die besonderen Ausmaße des Streifen-Materials sind eine Frage der Bequemlichkeit, abhängig von der Größe der Testprobe, die eingeschlossen ist, von dem Assay-Protokoll, dem Mittel zur Detektion und Messung des Signals und dergleichen. Zum Beispiel können die Ausmaße gewählt werden, um die Geschwindigkeit der Fluid-Migration ebenso wie die Menge der Testprobe, die durch das chromatographische Material aufgesogen werden soll, zu regulieren.
  • Wenn geeignet, ist es notwendig, Streifen-Ausmaße zu wählen, welche die Kombination von vielfältigen Streifen in einer einzelnen Assay-Vorrichtung erlauben. Es liegt ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung an dem distalen Ende des chromatographischen Materials ein Reagenz zu haben, welches die Vervollständigung eines Bindungs-Assays anzeigt (das heißt, ein Indikator für das Ende des Assays), durch Wechseln der Farbe nach Kontakt mit der Testlösung, Einsaug-Lösung oder einer Signal-erzeugenden Komponente. Reagenzien, welche die Farbe ändern würden nach Kontakt mit einer Testlösung, die Wasser enthält, sind die dehydrierten Übergangs-Metall-Salze, wie zum Beispiel CuSO4, Co(NO3)2 und dergleichen. pH-Indikator-Farbstoffe können auch ausgewählt werden, um auf den pH der gepufferten Einsaug-Lösung zu antworten. Beispielsweise wechselt Phenolphthalein von klar (das heißt farblos) zu intensivem Pink nach Kontakt mit einer Einsaug-Lösung, die einen pH im Bereich zwischen 8,0 bis 10,0 hat.
  • Einfang-Reagenzien können irgendwo entlang des Test-Streifens in einzelnen oder mehreren Wegen lokalisiert sein, unter der Voraussetzung, dass sie in dem Fluid-Fluss-Weg ihrer entsprechend markierten Reagenzien lokalisiert sind. Es wird von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, verstanden, dass, wenn Fluid durch den Streifen wandert, es wenig Querströmung von Fluid gibt. Somit wandern alle mobilen Reagenzien, die mit dem Fluid in Kontakt kommen, auch in die Richtung des Fluid-Flusses, das heißt, es gibt keine wesentliche Wanderung von Reagenzien quer zu dem Streifen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Kits für das Ausführen von Bindungs-Assays bereit. Beispielsweise kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung einen Test-Streifen umfassen wie zum Beispiel den Test-Streifen, der in 12 gezeigt ist, oder er kann alternativ die Kamm-artige oder Karten-artige Vorrichtung umfassen mit ihren eingeschlossenen Reagenzien, ebenso wie mit einer Transport-Lösung und/oder einem Testproben-Vorbehandlungs-Reagenz, wie oben beschrieben. Andere Assay-Komponenten, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, schließen Puffer, Stabilisatoren, Wasch-Substanzen, Bakterien-hemmende Mittel und dergleichen ein, welche ebenso in der Assay-Vorrichtung oder in einer separaten Reagenz-Lösung vorhanden sein können.
  • Die vorliegende Erfindung schließt wahlweise eine nicht reaktive Bedeckung (auch bezeichnet als Einschließung oder Umhüllung) um die Vorrichtung herum ein. Vorzugsweise schließt die Bedeckung mindestens den Streifen ein, um Kontakt und Kontamination der Einfang-Stellen zu vermeiden. Die Umhüllung kann auch einen erhöhten Bereich einschließen, der angrenzend an das Applikations-Kissen ist, um das Aufnehmen und/oder das Enthalten eines bestimmten Volumens an Testprobe und/oder Einsaug-Lösung zu erleichtern. Zusätzlich kann die Bedeckung einen Ausschnitt-Bereich oder -Bereiche in der Form eines Buchstabens, einer Zahl, eines Piktogramms oder eines Symbols oder irgendeiner Kombination davon einschließen. In dieser Ausführungsform bilden der Ausschnitts-Bereich oder die -Bereiche die Ausgestaltung für eine spezielle Einfang-Stelle oder Stellen, wenn der Streifen vollständig eingeschlossen ist. Es wird bevorzugt, dass ein ausreichender Anteil des Streifens eingeschlossen ist, um zu verhindern, dass aufgebrachte Testprobe mit den Einfang-Stellen in Kontakt kommt, ohne zuerst durch einen Teil des Streifens gewandert zu sein.
  • Eine andere Vorrichtungs-Komponente ist ein Testproben-Applikations-Kissen, das ein optionales Merkmal sein kann. Das Applikations-Kissen ist in Fluid-Fluss-Kontakt mit einem Ende des Streifen-Materials, was als das proximale Ende bezeichnet wird, so dass die Testprobe von dem Applikations-Kissen zu dem Streifen passieren oder wandern kann. Der Fluid-Fluss-Kontakt kann einen physikalischen Kontakt des Applikations-Kissens mit dem chromatographischen Material einschließen, ebenso wie die Abtrennung des Kissens von dem Streifen durch einen dazwischen liegenden Raum oder ein zusätzliches Material, welches dennoch erlaubt, dass Fluid zwischen dem Kissen und dem Streifen passiert. Im Wesentlichen kann das gesamte Applikations-Kissen das chromatographische Material überlappen, um der Testprobe zu ermöglichen, durch im Wesentlichen irgendeinen Teil des Applikations-Kissens zu dem proximalen Ende des Streifens zu passieren. Alternativ könnte nur ein Teil des Applikations-Kissens in Fluid-Fluss-Kontakt mit dem chromatographischen Material stehen. Das Applikations-Kissen kann irgendein Material sein, welches die Testprobe zu dem chromatographischen Material überführen kann und welches ein Volumen der Testprobe absorbieren kann, das gleich oder größer ist als die Gesamt-Volumen-Kapazität des chromatographischen Materials.
  • Materialien, die für die Verwendung in dem Applikations-Kissen bevorzugt sind, schließen Nitro-Zellulose, poröse Polyethylen-Fritten oder -Kissen und Glasfaser-Filterpapier ein. Das Material muss auch auf seine Kompatibilität mit dem Analyten und den Assay-Reagenzien hin ausgewählt werden.
  • Zusätzlich enthält das Applikations-Kissen typischerweise eine oder mehrere Assay-Reagenzien, entweder diffus oder nicht diffus daran angeheftet. Reagenzien, welche in dem Applikations-Kissen enthalten sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf markierte Reagenzien, hilfsweise spezifische Bindungs-Glieder und Signal-erzeugende System-Komponenten, die benötigt werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel wird in einem Bindungs-Assay bevorzugt, dass das markierte Reagenz in dem Applikations-Kissen enthalten ist. Das markierte Reagenz wird aus dem Kissen zu dem Streifen mit der Applikation der Testprobe freigesetzt, wodurch die Notwendigkeit, die Testprobe und das markierte Reagenz vor der Verwendung der Vorrichtung zu kombinieren, beseitigt wird. Die Isolation von Assay-Reagenzien in dem Applikations-Kissen hält ebenso die interaktiven Reagenzien voneinander getrennt und erleichtert den Herstellungsprozess.
  • In einigen Fällen dient das Applikations-Kissen auch als eine anfängliche Misch-Stelle und eine Reaktions-Stelle für die Testprobe und das Reagenz. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Applikations-Kissen-Material gewählt, um die Testprobe bei einer Geschwindigkeit zu absorbieren, die schneller ist, als diejenige, die durch das Streifen-Material allein erzielt wird. Typischerweise wird das Kissen-Material gewählt, um Fluide zwei bis fünf-mal schneller zu absorbieren als das Streifen-Material. Vorzugsweise wird das Kissen Fluide vier bis fünf-mal schneller absorbieren als es das Streifen-Material tun würde.
  • In einer wahlweisen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Gelatine verwendet, um das gesamte oder einen Teil des Applikations-Kissens zu umfassen. Typischerweise wird eine solche Einkapselung hergestellt durch Überschichten des Applikations-Kissens mit Fisch-Gelatine. Der Effekt dieser Überschichtung ist, die Stabilität des Reagenzes zu erhöhen, das durch das Applikations-Kissen enthalten ist. Die Aufbringung der Testprobe auf das überschichtete Applikations-Kissen bewirkt, dass die Gelatine sich auflöst und dabei die Auflösung des Reagenzes ermöglicht. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reagenz-enthaltende Applikations-Kissen getrocknet oder lyophilisiert, um die Lagerfähigkeit der Vorrichtung zu erhöhen. Über lyophilisierte Applikations-Kissen wurde herausgefunden, dass sie stärkere. Signale erzeugen als luftgetrocknete Applikations-Kissen und über die lyophilisierten Applikations-Kissen wurde herausgefunden, dass sie die Stabilität für längere Zeiträume aufrecht erhalten. Die Reagenzien, die in dem Applikations-Kissen enthalten sind, werden mit der Zugabe von Testprobe auf das Kissen rehydriert.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch durch die Zugabe eines Filtrationsmittels modifiziert werden. Das Filtrationsmittel kann ein separates Material sein, das oberhalb des Applikations-Kissens oder zwischen dem Applikations-Kissen und dem Streifen-Material platziert wird, oder das Material des Applikations-Kissens selbst kann nach seinen Filtrations-Fähigkeiten ausgewählt werden. Das Filtrationsmittel kann jeglichen Filter oder Auffang-Vorrichtung einschließen, die verwendet wird, um Partikel oberhalb einer bestimmten Größe aus der Testprobe zu entfernen. Beispielsweise kann das Filtermittel verwendet werden, um rote Blutkörperchen von einer Probe von Vollblut zu entfernen, so dass Plasma das Fluid ist, das von dem Applikations-Kissen empfangen wird und durch das chromatographische Material transportiert wird.
  • Wiederum eine andere Modifikation der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung einer zusätzlichen Schicht oder Schichten von porösem Material ein, das zwischen dem Applikations-Kissen und dem chromatographischen Material oder über dem Applikations-Kissen platziert ist. Ein solches zusätzliches Kissen oder Schicht kann als ein Mittel dienen, um die Geschwindigkeit des Flusses der Testprobe von dem Applikations-Kissen zu dem Streifen zu kontrollieren. Eine solche Fluss-Regulierung wird bevorzugt, wenn eine ausgedehnte Inkubationszeit für die Reaktion der Testprobe und der Reagenzien in dem Applikations-Kissen gewünscht ist. Alternativ kann eine solche Schicht zusätzliche Assay-Reagenzien enthalten, welche vorzugsweise von den Applikations-Kissen-Reagenzien isoliert werden, bis die Testprobe hinzugefügt wird oder sie kann dazu dienen, unreagierte Assay-Reagenzien am Durchtritt zu dem chromatographischen Material zu hindern.
  • Wenn kleine Mengen von nicht wässerigen oder viskosen Testproben auf das Applikations-Kissen aufgebracht werden, kann es notwendig sein, eine Einsaug- oder Transport-Lösung zu verwenden, vorzugsweise eine gepufferte Lösung, um die Reagenzien und die Testprobe von dem Applikations-Kissen und durch den Streifen zu tragen. Wenn eine wässerige Testprobe verwendet wird, ist eine Transport-Lösung im Allgemeinen nicht notwendig, kann aber verwendet werden, um die Fließ-Charakteristika durch die Vorrichtung zu verbessern oder um den pH-Wert der Testprobe einzustellen. Die Transport-Lösung hat typischerweise einen pH-Bereich von ungefähr 5,5 bis ungefähr 10,5 und bevorzugter von ungefähr 6,5 bis ungefähr 9,5. Der pH wird ausgewählt, um einen signifikanten Spiegel an Bindungs-Affinität zwischen den spezifischen Bindungsgliedern in einem Bindungs-Assay aufrecht zu erhalten. Wenn die Marker-Komponente des Indikator-Reagenzes ein Enzym ist, muss jedoch der pH auch ausgewählt werden, um eine signifikante Enzym-Aktivität für die Farbentwicklung in enzymatischen Signal-Erzeugungs-Systemen aufrecht zu erhalten. Veranschaulichende Puffer schließen Phosphat, Carbonat, Barbital, Diethylamin, tris(Hydromethyl)aminomethan(Tris), Bis-Tris, 2-Amino-2-methyl-1-propanol und dergleichen ein. Die Transport-Lösung und die Testprobe können vor dem In-Kontakt-bringen des Applikations-Kissens kombiniert werden oder sie können nacheinander mit dem Applikations-Kissen in Kontakt gebracht werden.
  • Vorbestimmte Mengen an Signal-erzeugenden Komponenten und Hilfs-Reagenzien können innerhalb der Vorrichtung eingeschlossen werden, wodurch die Notwendigkeit von zusätzlichen Protokoll-Schritten oder Reagenz-Hinzufügungen vermieden wird. Somit liegt es auch innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, mehr als ein Reagenz bereit zu stellen, das innerhalb des Applikations-Kissens und/oder des Streifen-Materials immobilisiert wird.
  • Diese Erfindung stellt Assay-Vorrichtungen und Verfahren bereit, worin die Vorrichtungen Streifen von chromatographischem Material verwenden, das in der Lage ist, Flüssigkeiten für die Durchführung eines Assays an einer Patienten-Probe oder für die Durchführung eines multiplen Assays an einer Patienten-Probe zu transportieren. Die Vorrichtung kann Testproben-Applikations-Kissen in Fluid-Flüssigkeits-Kontakt mit dem Streifen einschließen, welche derart funktionieren, dass sie den Fluss von Testprobe zu dem chromatographischen Material regulieren, dass sie die Testproben filtern und dass sie Assay-Reagenzien zuführen und/oder mischen. Assay-Reagenzien können innerhalb des Applikations-Kissens ebenso wie in dem chromatographischen Material eingeschlossen sein. Durch Variieren der Konfiguration von Reagenz-enthaltenden Stellen auf der Vorrichtung können qualitative und quantitative Anzeigen von Assay-Ergebnissen erhalten werden. Vorzugsweise sind die Reagenzien in den Vorrichtungen angeordnet, in einer solchen Weise, dass sie den Assay im Wesentlichen selbst-durchführend machen und um die Detektion und die Quantifizierung der Assay-Ergebnisse zu erleichtern. Eines oder mehrere detektierbare Signale, welche aus den Reaktionen an den Reagenz-enthaltenden Stellen resultieren und/oder dem Bindungs-Assay können dann durch Instrumentierung oder direkte visuelle Beobachtung detektiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Assay bereit für die gleichzeitige Detektion und Differenzierung von Antikörpern gegen HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in einer Testprobe, und eine analytische Vorrichtung, mit welcher diese gleichzeitige Detektion und Differenzierung durchgeführt werden kann. In einem Sandwich-Assay-Format wird die Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält (zum Beispiel Antikörper gegen HIV-1 Gruppe M) mit einer vorbestimmten Menge an Indikatior-Reagenz in Kontakt gebracht (in diesem Beispiel markierte Anti-Spezies-Antikörper [Ab*]), um eine Reaktionsmischung zu bilden, welche einen Analyt/Indikator-Reagenz-Komplex enthält (Ab-Ab*). Das Indikator-Reagenz (Ab*) kann getrennt sein von oder vorzugsweise innerhalb der Test- Vorrichtung eingeschlossen sein. Die resultierende Reaktionsmischung wandert dann durch den Teststreifen. Die Reaktionsmischung kommt in Kontakt mit den Einfang-Reagenz-Stellen (eine für HIV-1 Gruppe M, eine für HIV-1 Gruppe 0 und eine für HIV-2), welche ein separat immobilisiertes Analyt-spezifisches Bindungsglied ([I-Ag]) enthalten, das an eine Stelle auf dem Analyten bindet, die unterschiedlich ist von dem Indikator-Reagenz. Das Einfang-Reagenz ist daher in der Lage, an den Ab-Ab*-Komplex zu binden, um einen immobilisierten I-Ab-Ag-Ab*-Komplex zu bilden, der an der Einfang-Reagenz-Stelle detektierbar ist. Desweiteren kann die Reaktionsmischung auch weiter durch den Teststreifen wandern und mit Reagenz reagieren, das in dem Ende der Assay-Indikator-Stelle vorhanden ist.
  • Bezugnehmend auf 13 umfasst die Test-Vorrichtung (18) für den Assay einen Nitro-Zellulose-Membran-Streifen (24), auf welchen ausgewählte spezifische und hoch-gereinigte rekombinante Antigene, die von der jeweiligen gp41 Region von HIV-1 Gruppe M (26), HIV-1 Gruppe 0 (28) und HIV-2 (30) abgeleitet sind, platziert werden und in getrennten unterschiedlichen Einfang-Bereichen trocknen gelassen werden. Die Test-Vorrichtung (18) umfasst weiterhin ein Konjugat-Kissen (32), das einen Glasfaser-Filter (34) umfasst, der ein Selen-Kolloid vorlegt, das mit einem Anti-Spezies-Antikörper empfindlich gemacht wurde (zum Beispiel Ziegen-anti-Human IgG), der in einem Fluid suspendiert ist, das Nitro-Zellulose blockierende Proteine enthält, das vor dem Zusammenbau getrocknet wurde und an das distale Ende (20) der Nitro-Zellulose-Membran (24) fixiert wurde. Die gesamte Vorrichtung (18) wird andauernd am Platz gehalten durch ein oben klares laminierendes Material (36), das eine klebende Oberfläche (38) trägt in Kontakt mit der oberen Oberfläche der Nitro-Zellulose-Membran (24) und an das Konjugat-Kissen (20) angeheftet, und ein laminierendes Boden-Material (48), das eine klebende Oberfläche (38) in Kontakt mit der unteren Oberfläche (48) der Nitro-Zellulose-Membran (24) trägt. Das Test-Fluid fließt von dem distalen Ende (20) zu dem proximalen Ende (22) und kommt in Kontakt mit jeder der drei separaten unterschiedlichen Einfang-Bereiche. Die Vorrichtung kann auch ein Testproben-Kissen und eine Reaktivitäts-Zone (40) haben, auf welche Anti-Spezies (das heißt anti-menschliches) Konjugat platziert wird. Die Vorrichtung hat auch vorzugsweise einen Löscher („blotter", 44), um irgendwelches zurückbleibendes Fluid in der Vorrichtung zu absorbieren, und hat eine Stelle für das Anzeigen der Vervollständigung des Assays (46). Die Anzeige (in den Einfang-Bereichen und/oder in der Testproben-Reaktivitäts-Zone) kann entweder eine direkte visuelle Anzeige ohne die Hilfe von Labor-Ausrüstung oder durch eine Instrument automatisiert sein. Des weiteren kann die Test-Vorrichtung in einem Gehäuse (42) aus Form-gepresstem Plastik oder einem anderen geeigneten Material eingeschlossen sein.
  • Der Assay wird wie folgt durchgeführt. Testprobe, wie zum Beispiel menschliches Serum, vorzugsweise davor in Puffer verdünnt (Elutions-Puffer, bestehend aus 50 mM TRIS (pH 8,4), 1% m/v festes Rinder-Serum-Albumin [BSA], 0,4% v/v Triton X-405®, 1,5% m/v Casein, 3% m/v Rinder-IgG, 4% m/v E. coli-Lysat, pH 8,2; Verdünnung bei 1 μl Serum auf 100 μl Elutions-Puffer), wird mit dem Anti-IgG-Kolloit-Konjugat an dem distalen Ende (20) der Test-Vorrichtung in Kontakt gebracht. IgG in der Testprobe wird durch das Anti-IgG-Kolloid gebunden und die Komplexe werden entlang der Länge des Absorptions-Kissens chromatographiert (vorzugsweise Nitro-Zellulose-Membran). Wenn die Komplexe fließen, überqueren sie die einzelnen Zonen (13, Stellen 30, 26 und 28), in welchen die HIV-rekombinanten Antigene zuvor aufgebracht wurden. Wenn die Komplexe spezifische Antikörper zu den rekombinanten Antigenen in irgendeiner der einzelnen Zonen enthalten, findet eine Reaktion statt und es erscheinen rote Farbzonen in der/den geeigneten Zone(n). Vielfache Spezifitäten können gleichzeitig bestimmt werden. Zusätzlich sollte eine positive Kontrolle, die aus einer gepoolten Testprobe besteht, die für alle drei getesteten Antigene positiv ist, positiv in allen drei Zonen reagieren. Alternativ kann eine positive Kontroll-Probe, die mit jedem der Antigene in dem Test reaktiv ist, separat für jeden Analyten laufen gelassen werden, für welchen Antikörper untersucht werden.
  • Es wird in Erwägung gezogen und es liegt innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, dass Antikörper-Analyte gegen HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in diesen Assays detektierbar sind durch die Verwendung eines synthetischen rekombinanten oder gereinigten Polypeptids, das die gesamte oder einen Teil der Polypeptid(aminosäure)Sequenzen umfasst, die hierin beschrieben sind, als das Einfang-Reagenz. "Gereinigtes Protein" (oder "gereinigtes Polypeptid") bedeutet ein Polypeptid von Interesse oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen frei ist, das heißt weniger als ungefähr 50%, vorzugsweise weniger als ungefähr 70% und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 90% von Zell-Komponenten enthält, mit welchen das Polypeptid von Interesse natürlicherweise assoziiert ist. Verfahren zur Reinigung sind im Fachgebiet bekannt. Ein "rekombinantes Polypeptid" oder "rekombinantes Protein" oder "Polypeptid, hergestellt durch rekombinante Techniken", welche Begriffe hierin miteinander austauschbar verwendet werden, beschreibt ein Polypeptid, das durch seinen Ursprung oder durch Manipulation nicht mit allen oder einem Teil des Polypeptids assoziiert ist, mit welchem es natürlicherweise assoziiert ist und/oder ist an einen Polypeptid geknüpft, das anders ist als das, an welches es natürlicherweise gebunden ist. Ein rekombinantes oder kodiertes Polypeptid oder Protein wird nicht notwendigerweise von einer bestimmten Nukleinsäure-Sequenz translatiert. Es kann auch in irgendeiner Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressions-Systems. Des weiteren bedeutet der Ausdruck "synthetisches Peptid", wie hierin verwendet, eine polymere Form von Aminosäuren jeglicher Länge, welche chemisch synthetisiert werden kann durch Verfahren, die einem Fachmann wohl bekannt sind. Diese synthetischen Peptide sind in zahlreichen Anwendungen nützlich.
  • Das bevorzugte Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe 0 umfasst eine Polypeptid-Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52, und Sequenzidentifikationsnr. 54; Sequenzidentifikationsnr. 58, und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV- 1 Gruppe M Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst und das Einfang-Reagenz für HIV-2 umfasst Sequenzidentifikationsnr. 55. Es wird bevorzugt, dass diese Polypeptide durch rekombinante Technologie hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden, welche dazu gedacht sind, den Geist und den Schutzumfang der Erfindung zu veranschaulichen aber nicht einzuschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1. Klonierung
  • Oligonukleotide für die Gen-Konstruktion und Sequenzierung wurden bei Abbott Laboratories, Synthetic Genetics (San Diego, CA) oder Oligo Etc. (Wilsonville, CA) synthetisiert. Alle Polymerase-Ketten-Reaktions-(PCR)-Reagenzien, einschließlich AmpliTaq DNA Polymerase und UITma DNA Polymerase, wurden von Perkin-Elmer Corporation (Forster City, CA) erworben und entsprechend den Hersteller-Angaben verwendet, solange nichts anderes angegeben ist. Die PCR-Amplifikationen wurden auf einem GeneAmp 9600 thermal cycler (Perkin-Elmer) durchgeführt. Solange nicht anders angegeben, wurden die Restriktions-Enzyme von New England BioLabs (Beverly, MA) erworben und die Verdauungen wurden wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. DNA-Fragmente, die für die Klonierung verwendet wurden, wurden auf Agarose(Life Technologies, Gaithersburg, MD)-Gelen isoliert, solange nicht anders angegeben.
  • Die gewünschten Fragmente wurden entfernt und die DNA wurde mit einem QIAEX II Gel-Extraktions-Kit oder dem QIAquick Gel-Extraktions-Kit extrahiert (Qiagen Inc., Chatsworth, CA), wie vom Hersteller empfohlen. Die DNA wurde in H2O oder TE [1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH 8,0; BRL Life Technologies), 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl; pH 8,0; BRL Life Technologies)] resuspendiert. Die Ligationen wurden unter Verwendung eines Stratagene DNA-Ligations-Kits durchgeführt (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), wie vom Hersteller empfohlen. Die Ligationen wurden bei 16°C über Nacht inkubiert.
  • Die bakteriellen Transformationen wurden durchgeführt unter Verwendung von MAX EFFICIENCY DH5α kompetenten Zellen (BRL Life Technologies) oder Epicurian Coli XL1-Blue super-kompetenten Zellen (Stratagene Cloning Systems) gemäß den Protokollen des Herstellers. Solange nicht anders angegeben, wurden die Transformationen und die bakteriellen Ausstreifungen geschichtet auf LB Agar-(Lennox)-Platten mit 150 μg/ml Ampicillin (M1090; MicroDiagnostics, Lombard, IL) oder auf LB Agar + Ampicillin-Platten, ergänzt mit Glucose auf eine Endkonzentration von 20 mM, wie angegeben. Alle bakteriellen Inkubationen (Platten und Über-Nacht-Kulturen) wurden über Nacht (~16 Stunden) bei 37°C durchgeführt.
  • Das Screening von Transformanden, um gewünschte Klone zu identifizieren, wurde durch die Sequenzierung von Miniprep DNA und/oder durch Kolonie-PCR erzielt. Miniprep DNA wurde hergestellt mit einem Qiagen Tip 20 Plasmid Prep-Kit oder einem Qiagen QIAwell 8 Plasmid Prep-Kit, gemäß den Ausführungen des Herstellers, solange nicht anders angegeben. Für das Kolonie-PCR-Screening wurden einzelne Kolonien aus den Transformations-Platten herausgenommen und in eine Auskerbung in einer sterilen Flach-Boden 96-Auskerbungs-Platte überführt (Costar, Cambridge, MA), welche 100 μl steriles H2O enthielt. Ein Drittel des Volumens wurde auf eine zweite Platte überführt und bei 4°C gelagert. Die ursprüngliche 96-Auskerbungen-Platte wurde für 5 Minuten in die Mikrowelle gegeben, um die Zellen zu zerreißen. 1 μl Volumen wurde dann auf ein PCR-Röhrchen als Matrize überführt. 9 μl einer PCR-Master-Mischung, die 1 μl 10 × PCR-Puffer, 1 μl 2 mM dNTPs, 1 ml (10 pmol)-Sense-Primer, 1 μl (10 pmol)-Anti-Sense-Primer, 0,08 μl AmpliTaq DNA Polymerase (0,4 Einheiten) und 4,2 μl H2O enthielt, wurde zu dem PCR-Röhrchen hinzugefügt. Die Reaktionen wurden im Allgemeinen für 20 bis 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 50 bis 60°C (abhängig von den Primer-Annealing-Temperaturen) für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden amplifiziert. Die Primer waren abhängig von den Insert- und Zyklus-Bedingungen, wurden modifiziert basierend auf den Primer-Annealing-Temperaturen und der Länge des erwarteten Produkts. Nach der Zyklisierung wurde ungefähr ein Drittel des Reaktions-Volumens auf ein Agarose-Gel für die Analyse geladen. Kolonien, welche die gewünschten Klone enthielten, wurden von der Transfer-Platte vermehrt.
  • Solange nicht anderweitig angegeben, wurde die DNA-Sequenzierung auf einem automatisierten ABI-Modell 373 Stretch Sequencer (Perkin-Elmer) durchgeführt. Die Sequenzierungs-Reaktionen wurden mit Reagenzien von einem FS TACS Dye Term Ready Reaction-Kit (Perkin-Elmer) und 250 bis 500 ng Plasmid-DNA, entsprechend den Ausführungen des Herstellers aufgestellt. Die Reaktionen wurden auf Centri-Sep-Säulen verarbeitet (Princeton Separations, Adelphia, NJ), bevor sie auf den Sequencer geladen wurden. Die Sequenz-Daten wurden analysiert unter Verwendung des Sequencher 3,0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) und GeneWorks 2,45 (Oxford Molecular Group, Inc., Campbell, CA).
  • Beispiel 2. Bestimmung der env-Sequenz des HIV-I Gruppe 0 Isolats HAM112
  • Virale RNA wurde extrahiert aus Kultur-Überständen von menschlichen peripheren mononuklearen Blut-Zellen, die mit dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat infiziert wurden, bezeichnet als HAM112 (H. Hampl et al., supra), unter Verwendung eines QIAamp Blut-Kits (Qiagen) und dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Die RNA wurde in einem 50 μl Volumen von Nuklease-freiem Wasser (5Prime-3Prime, Inc., Boulder, CO) eluiert und bei –70°C gelagert. Die Strategie zum Erhalten der env-Region-Sequenz schloss die cDNA-Synthese und die PCR (nested) Amplifikation von vier überlappenden env-Gen-Fragmenten ein. Die amplifizierten Produkte wurden direkt auf einem automatisierten ABI-Modell 373 Stretch-Sequencer sequenziert. Die Amplifikations-Reaktionen wurden mit GeneAmp RNA-PCR und GeneAmp PCR-Kits (Perkin-Elmer) ausgeführt, wie vom Hersteller angegeben. Oligonukleotid-Primer-Positionen entsprechen der HIV-1 ANT70 env-Sequenz (G. Myers et al., Hrsg., supra). Die Primer env10R [Nukleotid (nt) 791–772; Sequenzidentifikationsnr. 62], env15R (nt 1592–1574; Sequenzidentifikationsnr. 63), env22R (nt 2321–2302; Sequenzidentifikationsnr. 64), env26R (nt 250–232 3' von env; Sequenzidentifikationsnr. 65) wurden jeweils für die cDNA-Synthese von Fragmenten 1–4 verwendet. Reverse Transkriptions-Reaktionen wurden bei 42°C für 30 Minuten, dann bei 99°C für 5 Minuten inkubiert. Die erste Runde PCR-Amplifikationen bestand aus 30 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 52°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, unter Verwendung der Primer-Kombinationen: env1F (nt 184–166 5' von env; Sequenzidentifikationsnr. 66) und env10R (Sequenzidentifikationsnr. 62), env7F (nt 564–586; Sequenzidentifikationsnr. 67) und env15R (Sequenzidentifikationsnr. 63), env12F (nt 1289–1308; Sequenzidentifikationsnr. 68) und env22R (Sequenzidentifikationsnr. 64), env19F (nt 2020–2040; Sequenzidentifikationsnr. 69) und env26R (Sequenzidentifikationsnr. 65) jeweils für Fragmente 1 bis 4. Für die zweite Runde der Amplifikation (nested PCR) wurden 5 μl der entsprechenden PCR-Reaktionen der ersten Runde als Matrize verwendet, zusammen mit den Primer-Kombinationen env2F (nt 37–15 5' von env; Sequenzidentifikationsnr. 70) und env9R (nt 740–721; Sequenzidentifikationsnr. 71), env8F (nt 631–650; Sequenzidentifikationsnr. 72) und env14R (nt 1437–1416; Sequenzidentifikationsnr. 73), env13F (nt 1333–1354; Sequenzidentifikationsnr. 74) und env21R (nt 2282–2265; Sequenzidentifikationsnr. 75), env20F (nt 2122–2141; Sequenzidentifikationsnr. 76) und env25R (nt 111–94 3' von env; Sequenzidentifikationsnr. 77) jeweils für Fragmente 1 bis 4. Die Bedingungen der zweiten Runde Amplifikation waren identisch mit denjenigen, die für die erste Runde verwendet wurden. Fragmente wurden Agarose-Gel gereinigt und mit einem Qiagen QIAEX II Gel-Extraktions-Kit extrahiert. Die Fragmente wurden direkt mit den Primern sequenziert, die für die nested PCR verwendet wurden, zusammen mit Primern env4F (Sequenzidentifikationsnr. 78) und env5R (Sequenzidentifikationsnr. 79) für Fragment 1; Primer env10F (Sequenzidentifikationsnr. 80), env11F (Sequenzidentifikationsnr. 81), env11r (Sequenzidentifikationsnr. 82), env12F (Sequenzidentifikationsnr. 68) und AG1 (Sequenzidentifikationsnr. 87) für Fragment 2; Primer env15F (Sequenzidentifikationsnr. 83) und env19R (Sequenzidentifikationsnr. 84) für Fragment 3; Primer env22F (Sequenzidentifikationsnr. 85) und env24R (Sequenzidentifikationsnr. 86) für Fragment 4. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von env aus dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM112 (Sequenzidentifikationsnr. 61) ist in 1 gezeigt.
  • Beispiel 3. Konstruktion von synthetischen HIV-1 Gruppe 0 env gp120/gp41 Genen
  • 2 zeigt die Strategie, die verwendet wurde, um synthetische HIV-1 Gruppe 0 env gp120/gp41 Gen-Konstrukte zu erzeugen. Die env gp120/gp41 Sequenzen basierten auf dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM112 (Sequenzidentifikationsnr. 61) (H. Hampl et al.). Die Bestimmung der env-Sequenz von HAM112 wird in Beispiel 2 hierin oben gezeigt. Oligonukleotide wurden entwickelt, welche die C-terminalen 45 Aminosäuren der env gp120 und 327 Aminosäuren von env gp41 kodieren (Nukleotid #1 ist die erste Base des ersten Kodons von gp120 in dem synthetischen Gen). Das synthetische Gen hat eine 26 Aminosäure-Deletion (Nukleotide 643 bis 720), relativ zu dem nativen HAM112 gp41, das eine hochgradig hydrophobe (H) Region (Transmembran-Region) von gp41 umfasst. Somit hat das synthetische Gesamtlängen-gp41-Gen, das konstruiert wurde, 327 Aminosäuren.
  • In den synthetischen Oligonukleotiden wurden die nativen HIV-1 Kodons verändert, um mit der E. coli Kodon-Neigung übereinzustimmen in dem Versuch, die Expressions-Spiegel des rekombinanten Proteins in E. coli zu erhöhen. Siehe zum Beispiel M. Gouy und C. Gautier, Nucleic Acids Research 10: 7055 (1982); H. Grosjean und W. Fiers, Gene 18: 199 (1982); J. Watson et al. (Hrsg.), Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe, Benjamin Kumming Publishing Co., Seiten 440 (1987). Die Gen-Konstruktions-Strategie schloss die Synthese einer Serie von überlappenden Oligonukleotiden mit komplementären Enden (Osyn-A bis Osyn-L, dargestellt als A bis L) ein. Wenn annealed, dienten die Enden als Primer für die Verlängerung des komplementären Strangs.
  • Die Fragmente wurden dann durch PCR amplifiziert. Dieses Verfahren ("PCR-Knitting" Verknüpfung von Oligonukleotiden) wurde wiederholt, um nach und nach das Gen-Fragment zu vergrößern. Oligonukleotid Osyn-5' wurde für die Klonierung in den pL-Vektor pKRR826 entwickelt. Der Expressions-Vektor pKRR826 ist eine modifizierte Form des Lambda pL-Promotor-Vektors pSDKR816, beschrieben in dem US-Patent 5,859,193. pKRR826 ist ein Derivat mit einer hohen Kopie-Anzahl von pBR322, das das Temperatur-empfindliche cI-Repressor-Gen enthält (Benard et al., Gene 5: 59 [1979]). Jedoch fehlt dem pKRR826 der translationale Terminator rrnBtJ und es hat die Lambda pL- und Lambda pR-Promotoren in der umgekehrten Richtung relativ zu pSDKR816. Die Polylinker-Region von pKRR826 enthält EcoRi und BamHI-Restriktions-Enzym-Stellen und ihr fehlt ein ATG-Start-Kodon. Eine optimale Expression wird erhalten, wenn das 5'-Ende des Gen-Inserts (einschließlich eines N-terminalen Methionins) in die EcoRi-Stelle kloniert wird. Osyn-5' wurde entwickelt, um eine EcoRi-Restriktions-Stelle für die Klonierung und ein ATG-Kodon (Methionin) zu enthalten, um eine geeignete translationale Initiierung des rekombinanten Proteins bereit zu stellen. Die Anti-Sense Oligonukleotide Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15), Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und Osyn-M (M) (Sequenzidentifikationsnr. 14) enthalten jeweils zwei sequenzielle translationale Terminations-Kodons (TAA, TAG) und eine BamHI-Restriktions-Stelle. Wenn die außerhalb-Primer Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11) und Osyn-M (M) (Sequenzidentifikationsnr. 14) verwendet wurden, wurde ein Gesamtlängen-gp41(327 Aminosäuren)-Gen synthetisiert (pGO-11PL; Sequenzidentifikationsnr. 52). Die außerhalb-Oligonukleotide Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11) und Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15) resultierten in einem abgestumpften gp41-Produkt von 199 Aminosäuren (pGO-9PL; Sequenzidentifikationsnr. 48). Alternativ resultierten die außerhalb-Oligonukleotide Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11) und Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) in einem abgestumpften gp41-Produkt mit 169 Aminosäuren in der Länge (pGO-8PL; Sequenzidentifikationsnr. 58).
  • Die synthetischen Gene wurden auch als CMP-KDO-Synthetase(CKS)-Fusions-Proteine exprimiert. Der PCR-vermittelte Transfer der synthetischen Gene von pKRR826 in pJO200, beschrieben in EP 0 472 207 , wurde erreicht mit einem alternativen außerhalb-Sense-Oligonukleotid-PCR-Primer (5'-Ende), Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr. 25). Osyn-5'CKS enthielt eine EcoRI-Restriktions-Stelle und resultierte in der In-Frame-Fusion des synthetischen Gen-Inserts in CKS in dem Expressions-Vektor pJO200. Die 3'-außerhalb-Primer (Anti-Sense) Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr. 14), Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15) und Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) wurden in Kombination mit Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr. 25) verwendet, um pGO-11CKS (Sequenzidentifikationsnr. 54), pGO-9CKS (Sequenzidentifikationsnr. 50) beziehungsweise pGO-8CKS (Sequenzidentifikationsnr. 60) zu erzeugen. Diese Schritte sind im Detail hierin unten beschrieben.
  • A. PCR-Knitting(-Verknüpfung) von synthetischen Oligonukleotiden
  • Drei PCR-Reaktionen (100 μl Volumen) wurden wie folgt erstellt:
    • (1) Reaktion 1B: AmpliTaq DNA Polymerase (2,5 U) und 1 × Puffer, zusammen mit 40 μM von jedem dNTP (dAPT, dCTP, dGTP und dTTP), 25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-A (Sequenzidentifikationsnr. 3) und Osyn-D (Sequenzidentifikationsnr. 5) und 0,25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-B (Sequenzidentifikationsnr. 17) und Osyn-C (Sequenzidentifikationsnr. 4);
    • (2) Reaktion 2A: UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer, zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 25 pmol von jedem der Oligonukleotide Osyn-E (Sequenzidentifikationsnr. 6) und Osyn-H (Sequenzidentifikationsnr. 9) und 0,25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-F (Sequenzidentifikationsnr. 7) und Osyn-G (Sequenzidentifikationsnr. 8); und
    • (3) Reaktion 3B: UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer, zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-I (Sequenzidentifikationsnr. 10) und Osyn-L (Sequenzidentifikationsnr. 13) und 0,25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-J (Sequenzidentifikationsnr. 18) und Osyn-K (Sequenzidentifikationsnr. 12).
  • Die Amplifikationen bestanden aus 20 Zyklen von 97°C für 30 Sekunden, 52°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden. Die Reaktionen wurden dann bei 72°C für 7 Minuten inkubiert und bei 4°C gehalten. Die PCR-abgeleiteten Produkte 1B, 2A und 3B wurden auf einem 1% Agarose-Gel Gel-isoliert.
  • B. PCR-Knitting(-Verknüpfung) von PCR-Produkten aus der Reaktion 1B und der Reaktion 2A
  • Eine PCR-Reaktion wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer, zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 24,4 pmol von Oligonukleotid Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11), 25 pmol von Oligonukleotid Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und ~10 ng jeweils von den Gel-isolierten 1B- und 2A-Produkten aus Beispiel 3, Abschnitt 1A, hierin oben. Die Zyklisierungsbedingungen waren dieselben wie in Beispiel 3, Abschnitt 1A. Eine zweite Amplifikations-Runde wurde verwendet, um mehr von dem gewünschten Produkt zu erzeugen. Diese wurde durchgeführt durch die Herstellung einer UITma-Mischung, wie hierin oben beschrieben (100 μl Reaktions-Volumen) mit 49 pmol Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und 5 μl des PCR-Produkts aus der ersten Runde als Matrize. Diese Reaktionen wurden bei 94°C für 90 Sekunden inkubiert und dann verwendet, gecycelt wie oben (Abschnitt 3A). Das Osyn-5'/Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde Gel-isoliert wie hierin oben beschrieben.
  • C. Klonierung des Osyn-5'-Osyn-P3'-PCR-Produkts
  • Das Osyn-5'-Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde mit den Restriktions-Endonukleasen EcoRI + BamHI verdaut und in den Vektor pKRR826 ligiert (beschrieben hierin oben), welcher mit EcoRI + BamHI verdaut wurde und Gel-isoliert wurde. Das Ligations-Produkt wurde verwendet, um DH5α kompetente Zellen zu transformieren. Der gewünschte Klon wurde durch Kolonie-PCR identifiziert, unter Verwendung von Oligonukleotiden pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38) und pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39). Miniprep DNA wurde hergestellt aus einer Über-Nacht-Kultur von pGO-8 Kandidatklon A2 und das Osyn-5'-Osyn-P3'-Plasmid-Insert wurde mit den Oligonukleotid-Primern pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39), 41sy-1 (Sequenzidentifikationsnr. 44) und 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41) sequenziert.
  • D. Modifikation des pGO-8 Kandidatklons A2
  • Eine 100 μl Volumen-PCR-Reaktion wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Oligonukleotiden Osyn-5'-repair (Sequenzidentifikationsnr. 24), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und ~1 ng von pGO-8 Kandidatklon Miniprep DNA als Matrize A2 (erhalten aus den Reaktionen, die hierin oben bekannt gemacht wurden). Die Reaktion wurde bei 94°C für 90 Sekunden inkubiert und dann mit 20 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden amplifiziert. Das Osyn-5'-repair/Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde dann Gel-isoliert und mit EcoRI + BamHI verdaut. Das verdaute Produkt wurde in EcoRI + BamHI verdauten pKRR826-Vektor ligiert. Das Ligations-Produkt wurde verwendet, um DH5α kompetente Zellen zu transformieren. Der gewünschte Klon wurde identifiziert durch Kolonie-PCR, unter Verwendung von Oligonukleotiden pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38) und pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39). Eine Über-Nacht-Kultur des pGO-8 Kandidatklons 6 wurde zusammengestellt und eine Miniprep-DNA wurde hergestellt. Das Osyn-5'repair/Osyn-P3'-Plasmid-Insert wurde sequenziert mit den Oligonukleotid-Primern pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39) 41sy-1 (Sequenzidentifikationsnr. 44) und 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41). Basierend auf den Sequenzierungs-Resultaten wurde der pGO-8 Kandidatklon #6 bezeichnet als pGO-8PL/DH5α. Sequenzidentifikationsnr. 57 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region. 5 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pGO-8PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 58). Das pGO-8PL rekombinante Protein besteht aus einem N-terminalen Methionin, 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112-Isolat) und 169 Aminosäuren von env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112-Isolat).
  • E. Konstruktion von pGO-8CKS/XL1
  • pGO-8CKS/XL1 (Sequenzidentifikationsnr. 59 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region) kodiert das rekombinante Protein pGO-8CKS. 6 zeigt die Aminosäure-Sequenz von pGO-8CKS (Sequenzidentifikationsnr. 60). Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von CKS/Polylinker, 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 169 Aminosäuren von env gp41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von pGO-8CKS/XL1 wurde wie folgt erreicht.
  • Eine PCR-Reaktion (100 μl Volumen) wurde mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und 1 ng pGO-8PL Klon #6 Miniprep-DNA versehen. Die Reaktion wurde bei 94°C für 90 Sekunden inkubiert, dann mit 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden; 72°C für 90 Sekunden amplifiziert. Dann wurde das Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt Gel-isoliert. EcoRI + BamHI verdauten das Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt und den Vektor pJO200. Der verdaute pJO200 Vektor wurde Gel-isoliert und an verdautes Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt ligiert. XL1-Blue superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert und auf LB + Ampicillin-Platten platziert, welche mit 20 mM Glucose ergänzt waren. Kolonien wurden für die Isolation auf dem selben Typ von Platten wieder ausgestrichen. Eine Über-Nacht-Kultur des Klons pGO-8CKS/XL-1 wurde in LB-Brühe + 100 μg/ml Carbenicillin (sigma Chemical Co.) + 20 mM Glucose (Sigma Chemical Co.) gezüchtet. Gefrorene Vorräte (0,5 ml Über-Nacht-Kultur + 0,5 ml Glycerol) wurden hergestellt und die DNA wurde für die Sequenz-Analyse zubereitet. Die folgenden Oligonukleotide wurden als Sequenzierungs-Primer verwendet: CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30), CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr. 31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr. 32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr. 33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr. 2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr. 1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr. 29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr. 34), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr. 19) und CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr. 20).
  • F. Konstruktion von pGO-9PL/DH5α
  • 3A bis 3D zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-9PL/DH5α involviert sind. pGO-9PL/DH5α kodiert das rekombinante Protein pGO-9PL. Sequenzidentifikationsnr. 47 zeigt die Nukleotid-Sequenz von der kodierenden Region von pGO-9PL/DH5α. 7 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pGO-9PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 48). Dieses Protein besteht aus einem N-terminalen Methionin, 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 199 Aminosäuren von env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von pGO-9PL/DH5α wurde wie folgt erzielt.
  • Schritt 1. Eine 100 μl PCR-Reaktion wurde mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11), 50 pmol von Osyn-H (Sequenzidentifikationsnr. 9) und ~2 ng von pGO-8 Kandidatklon 6 Miniprep-DNA (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt D, hierin oben) als Matrize zusammengestellt. Die Reaktion wurde bei 94°C für 120 Sekunden inkubiert und dann mit 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden amplifiziert.
  • Schritt 2. Eine 100 μl PCR-Reaktion wurde mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11), 50 pmol Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15) und 10 μl der PCR-Reaktion aus Schritt 1 als Matrize zusammengestellt. Die Reaktion wurde bei 94°C für 120 Sekunden inkubiert, dann mit 18 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten.
  • Das Osyn-5'/Osyn-O3'-PCR-Produkt wurde dann Gel-isoliert und mit EcoRI + BamHI verdaut. Das verdaute Produkt wurde in EcoRI + BamHI verdauten pKRR826-Vektor ligiert. Das nächste Ligations-Produkt wurde verwendet, um DH5α kompetente Zellen zu transformieren. Eine Über-Nacht-Kultur des pGO-9PL Kandidatklons 3 wurde zusammengestellt und eine Miniprep-DNA wurde hergestellt. Das Osyn-5'/Osyn-O3'-Plasmid-Insert wurde mit den folgenden Oligonukleotiden als Primer sequenziert: pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39), 41sy-1C (Sequenzidentifikationsnr. 40), 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41, 41sy-3 (Sequenzidentifikationsnr. 42) und 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr. 23). Der pGO-9PL Klon #3 wurde dann wieder für die Isolation ausgestrichen. Eine isolierte Kolonie wurde aufgenommen, eine Über-Nacht-Kultur davon wurde gezüchtet und ein gefrorener Vorrat (0,5 ml Glycerol + 0,5 ml Über-Nacht-Kultur) wurde hergestellt. Der Vorrat wurde bei –80°C gelagert. Die Sequenz wurde bestätigt unter Verwendung der Primer, die hierin oben angegeben sind, und dieser Klon wurde als pGO-9PL/DH5α bezeichnet (Sequenzidentifikationsnr. 47 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region und Sequenzidentifikationsnr. 48 zeigt die Aminosäure-Sequenz der kodierenden Region). pGO-9PL/DH5α wurde wieder ausgestrichen, eine Über-Nacht-Kultur wurde gezüchtet und eine Miniprep-DNA wurde hergestellt (diese prep wurde als H5 bezeichnet).
  • G. Konstruktion von pGO-9CKS/XL1
  • 3A bis 3D zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-9CKS/XL1 involviert sind. pGO-9CKS/XL1 kodiert das rekombinante Protein pGO-9CKS. 8 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pGO-9CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 50). Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von CKS und einem Polylinker, gefolgt von 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 199 Aminosäuren von env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von pGO-9CKS/XL1 wurde wie folgt erzielt.
  • Zwei PCR-Reaktionen (100 μl Volumen) wurden mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15) und einem 1 ng pGO-9PL Kandidatklon 3 Miniprep-DNA (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt F, hierin oben) zusammengestellt. Jede Reaktion wurde bei 94°C für 120 Sekunden inkubiert, dann mit 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 120 Sekunden inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten. Das Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt wurde dann Gel-isoliert. Das Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt und der Vektor pJO200 wurden mit EcoRI + HamHI verdaut. Der verdaute pJO200-Vektor wurde Gel-isoliert und an das verdaute Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt ligiert. XL-1 Blue superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert und auf LB + Ampicilin-Platten platziert, die mit 20 mM Glucose ergänzt waren. Kolonien wurden für die Isolation auf dem selben Typ von Platten wieder ausgestrichen. Eine Über-Nacht-Kultur des Klon pGO-9CKS Kandidatklons 4 wurde in LB-Brühe + 100 mg/ml Carbenicillin (Sigma Chemical Co.) + 20 mM Glucose (Sigma Chemical Co.) gezüchtet. Es wurden gefrorene Vorräte (0,5 ml Über-Nacht-Kultur + 0,5 ml Glycerol) hergestellt und die DNA wurde für die Sequenz-Analyse hergestellt. Die folgenden Oligonukleotide wurden als Sequenzierungs-Primer verwendet: CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30), CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr. 31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr. 32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr. 33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr. 2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr. 1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr. 29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr. 34), 41sy-3B (Sequenzidentifikationsnr. 35), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr. 19), CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr. 20) und pTB-S8 (Sequenzidentifikationsnr. 28). Der Klon pGO-9CKS Kandidatklon 4 wurde als pGO-9CKS/XL1 bezeichnet (Sequenzidentifikationsnr. 49 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region und Sequenzidentifikationsnr. 50 zeigt die Aminosäure-Sequenz der kodierenden Region).
  • H. Konstruktion des Osyn-I-M-Fragments
  • Das Osyn-O-M-Fragment wurde wie folgt konstruiert. Eine 100 μl PCR Reaktion wurde zusammengestellt, unter Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase (2,5 U), 1 × Puffer, 50 μM von jedem dNTP, 50 pmol I-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr. 14) und 10 ng von Gel-isoliertem PCR-Fragment 3A (Beispiel 3, Abschnitt A, hierin oben). Die Reaktion wurde bei 95°C für 150 Sekunden inkubiert und dann wurde sie mit 15 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden amplifiziert, und dann wurde sie bei 72°C für 7 Minuten gehalten. Das Produkt, bezeichnet als Osyn-I-M, wurde Gel-isoliert und in den PCR-II-Vektor (TA Cloning Kit; Invitrogen, San Diego, CA) kloniert, gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Das resultierende Ligations-Produkt wurde verwendet, um DH5α kompetente Zellen zu transformieren. Eine Plasmid-Miniprep-DNA wurde aus einer Über-Nacht-Kultur von Klon IM-6 erzeugt und das Gen-Insert wurde mit den Oligonukleotiden 56759 (Sequenzidentifikationsnr. 45) und 55848 (Sequenzidentifikationsnr. 46) sequenziert.
  • I. Synthese und Verknüpfung (Knitting) der PCR-Fragmente I/6R und IM-6F
  • Diese Verfahren wurden wie folgt durchgeführt.
  • Schritt 1. Die folgenden PCR-Reaktionen (100 μl Volumen) wurden folgendermaßen zusammengestellt: (a) I/6R mit AmpliTaq DNA-Polymerase Polymerase (2,5 U), 1 × Puffer, 50 μM von jedem dNTP, 50 pmol I-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol IM-6R (Sequenzidentifikationsnr. 22) und 281 ng des Klons IM-6 (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt H) als Matrize; (b) 6F/M mit AmpliTaq DNA-Polymerase (2,5 U), 1 × Puffer, 50 μM von jedem dNTP, 50 pmol IM-6F (Sequenzidentifikationsnr. 21), 50 pmol M-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 27) und 281 ng des Klons IM-6 (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt H) als Matrize.
  • Die Reaktionen wurden bei 95°C für 105 Sekunden inkubiert und dann mit 20 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden amplifiziert, dann bei 72°C für 7 Minuten inkubiert. Die PCR-Produkte I/6R und 6F/M als nächstes wurden Gel-isoliert, gemäß den Verfahren wie hierin oben beschrieben.
  • Schritt 2. Eine PCR-Reaktion (100 μl Volumen) wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1, 5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von I-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol M-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 27), ~50 ng I/6R und ~20 ng 6F/M. Die Reaktion wurde bei 95°C für 105 Sekunden inkubiert und dann wurde sie mit 20 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 7 Minuten. Das PCR-Produkt wurde auf einer Centri-sep-Säule verarbeitet (Princeton Separations), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  • J. Konstruktion von pGO-11PL/DH5α
  • 4A bis 4F zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-11PL/DH5α involviert sind. pGO-11PL/DH5α kodiert das rekombinante Protein pGO-11PL. 9 zeigt die Aminosäure-Sequenz von dem pGO-11PL rekombinanten Protein (Sequenzidentifikationsnr. 52). Dieses Protein besteht aus einem N-terminalen Methionin, 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 327 Aminosäuren von env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). pGO-11PL/DH5α wurde wie folgt konstruiert.
  • Das End-PCR-Produkt aus Beispiel 3, Abschnitt I und pGO-9PL-Vektor (Miniprep H5 aus Beispiel 3, Abschnitt F) wurden nacheinander mit Age I und BamHI verdaut. Das verdaute pGO-9PL wurde dann mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase (BRL Life Technologies) für 15 Minuten bei 37°C behandelt, Phenol/Chloroform extrahiert und mit NaOAc und EtOH ausgefällt. Der Vektor (pGO-9PL) wurde darauf Gel-isoliert. Der verdaute pGO-9PL und das verdaute PCR-Produkt wurden ligiert und das Ligations-Produkt wurde verwendet, um DH5α kompetente Zellen zu transformieren. Kolonien wurden für die Isolation wieder ausgestrichen. Der Klon pGO11-4 wurde dann identifiziert und für die Isolation wieder ausgestrichen. Eine Über-Nacht-Kultur von pGO11-4 wurde hergestellt, um gefrorene Vorräte zu erzeugen und eine Miniprep-DNA durchzuführen, für die Sequenzierung. Der Klon pGO11-4 wurde mit den folgenden Oligonukleotid-Primern sequenziert: pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39), 41sy-1C (Sequenzidentifikationsnr. 40), 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41), 41sy-3 (Sequenzidentifikationsnr. 42), 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr. 23), 41sy-5B (Sequenzidentifikationsnr. 43), 41sy-5C (Sequenzidentifikationsnr. 36) und 41sy-6B (Sequenzidentifikationsnr. 37). Basierend auf dem Sequenzierungs-Ergebnissen wurde dieser Klon bezeichnet als pGO-11PL/DH5α (Sequenzidentifikationsnr. 51 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region und Sequenzidentifikationsnr. 52 zeigt die Aminosäure-Sequenz der kodierenden Region).
  • K. Konstruktion von pGO-11CKS/XL1
  • 4A bis 4G zeigen eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion von pGO-11CKS/XL1 involviert sind. pGO-11CKS/XL1 kodiert das rekombinante Protein pGO-11CKS. 10 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pGO-11CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 54). Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von CKS und Polylinker, gefolgt von 45 Aminosäuren von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 327 Aminosäuren von env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). pGO-11CKS/XL1 wurde wie folgt konstruiert.
  • Eine PCR-Reaktion (100 μl Volumen) wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer zusammen mit 1, 5 mM MgCl2, 40 μM von jedem dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr. 14) und 1 ng pGO11-4 (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt J) als Matrize. Die Reaktion wurde bei 94°C für 105 Sekunden inkubiert und dann mit 20 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 120 Sekunden amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 7 Minuten. Das Osyn-5'CKS/Osyn-M-PCR-Produkt wurde Gel-isoliert. Als nächstes wurden das Osyn-5'CKS/Osy-M-PCR-Produkt und der Vektor pJO200 EcoRI + BamHI verdaut. Der verdaute pJO200-Vektor wurde Gel-isoliert. Über-Nacht-(16°C)Ligationen wurden mit dem verdauten PCR-Produkt zusammengestellt. XL1-Blue superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert und auf LB + Ampicillin-Platten, welche mit 20 mM Glucose ergänzt waren, platziert. Kolonien wurden für die Isolation wieder ausgestrichen, auf den selben Platten. Eine Über-Nacht-Kultur (LB-Medium + 100 μg/ml Carbenicillin + 20 mM Glucose) von dem Klon pGO-11CKS Klon-Kandidat 2 wurde dann zusammengestellt. Gefrorene Vorräte (0,2 ml 80% Glycerol + 0,5 ml Über-Nacht-Kultur) wurden hergestellt, ebenso wie eine Miniprep-DNA für die Sequenzierung. Die folgenden Oligonukleotide wurden als Primer für die Sequenz-Analyse verwendet: CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30), CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr. 31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr. 32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr. 33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr. 2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr. 1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr. 29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr. 34), 41sy-3b (Sequenzidentifikationsnr. 35), 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr. 23), 41sy-5C (Sequenzidentifikationsnr. 36), 41sy-6B (Sequenzidentifikationsnr. 37), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr. 19), CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr. 20) und pTB-S8 (Sequenzidentifikationsnr. 28). pGO-11CKS Klon #2 wurde als pGO-11CKS/XL1 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnr. 53 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region von pGO-11CKS/XL1 und Sequenzidentifikationsnr. 54 zeigt die Aminosäure-Sequenz der kodierenden Region von pGO-11CKS/XL1.
  • Beispiel 4. Konstruktion von pHIV210/XL1-Blue
  • 11 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pHIV-210 rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 55). Dieses Protein besteht aus 247 Aminosäuren von CKS/Linker-Sequenzen, 60 Aminosäuren von env gp 120 (#432–491; HIV-2 Isolat D194.10), und 159 Aminosäuren von env gp 36 (#492–650; HIV-2 Isolat D194.10). Die Konstruktion von pHIV210/XL1-Blue wurde wir folgt erzielt.
  • Die genomische DNA von dem HIV-2 Isolat D194.10 [H. Kuhnel et al., Nucleic Acids Research 18: 6142 (1990)] wurde in den EMBL3 Lambda-klonierenden Vektor kloniert. Siehe H. Kuhnel et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 2383–2387 (1989) und H. Kuhnel et al., Nucleic Acids Research 18: 6142 (1990). Der Lambda-Klon, der D194.10 (Lambda A 10) enthielt, wurde von Diagen Corporation, Düsseldorf, Deutschland, erhalten. Eine PCR-Reaktion (100 μl Volumen) wurde zusammengestellt unter Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase (3,75 Einheiten), 200 μM von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,5 μg Primer 3634 (Sequenzidentifikationsnr. 88, annealing an den Positionen 7437–7455 auf dem HIV-2 Isolat D194.10 (EMBL Zugriff #X52223), 0,5 μg Primer 3636 (Sequenzidentifikationsnr. 89, annealing an den Positionen 8095–8077), 1 × PCR-Puffer und 5 μl von der Lambda A 10 DNA, verdünnt 1 : 50. Die Reaktion wurde 5 Minuten bei 94°C inkubiert, dann mit 35 Zyklen von 94°C für 1 Minute, 45°C für 1 Minute, 72°C für 2 Minuten amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten. Die PCR-Reaktion wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) und die DNA wurde mit Ethanol (AAPER Alcohol & Chemical Company, Shelbyville, KY) ausgefällt. Die DNA wurde mit EcoRI + BamHI verdaut und auf einem 1,5% Agarose-Gel gereinigt (SeaKem GTG Agarose, FMC Corporation, Rockland, Maine). Das gereinigte Produkt wurde in einen EcoRI + BamHI verdauten pJO200-Vektor ligiert, unter Verwendung von 800 Einheiten von T4 DNA-Ligase (New England BioLabs). XL1-Blue superkompetente Zellen (Stratagene) wurden mit 2 μl der Ligation transformiert, wie vom Hersteller angegeben und auf LB-Platten, die mit Ampicillin (Sigma Chemical Company) ergänzt waren, platziert. Über-Nacht-Kulturen wurden erstellt, durch Inokulation von einzelnen Kolonien in Superbroth II Medium (GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin (Sigam) und 20 mM Glucose (Sigma). Gefrorene Vorräte wurden erzeugt, durch Hinzufügen von 0,3 ml von 80% Glycerol zu 0,7 ml der Über-Nacht-Kulturen. Nach dem Mischen wurden die Vorräte bei –70°C gelagert. Eine Miniprep-DNA wurde aus den Über-Nacht-Kulturen hergestellt, unter Verwendung des alkalischen Lyse-Verfahrens, gefolgt von einer PEG-Präzipitation. Sequenz-Reaktionen wurden mit einem 7-deaza-dGTP-Reagenz-Kit mit Sequenase Version 2,0 durchgeführt (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), wie vom Hersteller angegeben. Die Reaktionen wurden auf 6% Acrylamid-Gelen durchgeführt (GIBCO BRL Gel-Mix 6), unter Verwendung des IBI-Gel-Apparats, wie vom Hersteller empfohlen. Basierend auf den Sequenz-Ergebnissen, wurde der pHIV-210 Klon #7 bezeichnet als pHIV-210. Die Aminosäure-Sequenz der pHIV-210 kodierenden Region wird als Sequenzidentifikationsnr. 55 dargestellt.
  • Beispiel 5. Wachstum und Induktion von E. coli Stämmen mit HIV-1 Gruppe 0 rekombinantem gp41 Antigen-Konstrukt
  • Über-Nacht-Saatkulturen von pGO-9CKS/XL1 wurden hergestellt in 500 ml steriler Excell Terrific Brühe (erhältlich von Sigma Chemical Corp., St. Louis Mo.), ergänzt mit 100 μg/ml Natrium-Ampicillin, und in einen Schüttel-Orbital-Inkubator bei 32°C oder 37°C platziert. Einhundert Milliliter (100 μl) Inokuli aus den Saat-Kulturen wurden in Kolben überführt, welche einen Liter sterile Excell Terrific Brühe, ergänzt mit 100 μg/ml Natrium-Ampicillin, enthielten. Kulturen wurden entweder (1) inkubiert bei 37°C bis die Kultur(en) ein mittel-logarithmisches Wachstum erreichten und dann mit 1 mM ITPG (Isopropylthiogalactosid) für 3 Stunden bei 37°C induziert. Alternativ wurden die PL-Konstrukte bei 32°C inkubiert, bis die Kultur(en) ein mittel-logarithmisches Wachstum erreichten und dann für 3 Stunden induziert, durch Verschieben der Temperatur der Kultur(en) auf 42°C. Nach der Induktionsperiode wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und gemäß Standard-Verfahren geerntet. Die pelletierten Zellen wurden bei –70°C gelagert, bis sie weiter verarbeitet wurden.
  • Beispiel 6. Isolation und Solubilisierung von HIV-1 Gruppe 0 rekombinanten gp41-Antigen, hergestellt als unlösliche Einschluss-Körper in E. coli
  • Gefrorene Zellen, die aus Beispiel 5 erhalten wurden, wurden durch Homogenisierung in kaltem Lyse-Puffer resuspendiert, welcher 50 mM Tris pH 8, 10 mM Na EDTA, 150 mM NaCl, 8% (m/v) Saccharose, 5% Triton X-100® (v/v), 1 mM PMSF und 1 μM Pepstatin A umfasste. Lysozym wurde zu den Homogenisaten bei einer Konzentration von 1,3 mg pro Gramm von verarbeiteten Zellen hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Inklusions-Körper wurden von löslichen Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Diese pelletierten Inklusions-Körper wurden gewaschen und nacheinander in (1) Lyse-Puffer; (2) 10 mM Na EDTA pH 8, 30% (m/v) Saccharose; und (3) Wasser pelletiert. Die gewaschenen Inklusions-Körper wurden in 50 mM Tris pH 8, 10 mM Na EDTA, 150 mM NaCl und 3 M Harnstoff resuspendiert und auf Eis für eine Stunde inkubiert. Die Inklusions-Körper wurden dann von den solubilisierten Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Die pelletierten Inklusions-Körper wurden vollständig in 7 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris pH 8, 0,1% (v/v) Beta-mercaptoethanol (BME) über Nacht bei 4°C solubilisiert. Die solubilisierten rekombinanten Antigene wurden durch Zentrifugation klar gemacht, durch einen 0,2 μm Filter geführt und bei ≤ –20°C gelagert, bis sie durch Zentrifugation gereinigt wurden.
  • Beispiel 7. Reinigung von rekombinatem HIV-1 Gruppe 0 gp41-Antigen durch Chromatographie
  • Solubilisierte HIV-1 Gruppe 0 rekombinante gp41-Antigene, erhalten von Beispiel 6, wurden durch ein Zwei-Schritt-Verfahren wie folgt gereinigt. Guanidin-HCl-Extrakte von unlöslichen Antigenen wurden durch Größen-Ausschluss-Chromatographie auf einer Sephacryl S-300 Säule gereinigt, welche mit 50 mM Tris pH 8,8 M Harnstoff und 0,1% BME (v/v) ins Gleichgewicht gebracht wurde. SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese wurde verwendet, um die Fraktionen zu analysieren. Die Fraktionen, welche das rekombinante gp41-Antigen enthielten, wurden gepoolt und dann durch Ultra-Filtration konzentriert. Das rekombinante Antigen-Konzentrat wurde mit 4% SDS (m/v) und 5% BME (m/v) bei Raumtemperatur für 3 Stunden behandelt. SDS-behandeltes Antigen wurde weiter durch Größen-Ausschluss-Chromatographie auf einer Sephacryl S-300 Säule gereinigt, welche mit 25 mM Tris pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% v/v BME, 0,1% SDS (m/v) ins Gleichgewicht gebracht wurde. SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese wurde verwendet, um die Fraktionen zu analysieren. Fraktionen, welche gereinigtes rekombinantes Antigen enthielten, wurden gepoolt, durch einen 0,2 μm Filter geführt und bei –70°C gelagert.
  • Beispiel 8. Herstellung von HIV-1 Gruppe M-Antigen
  • Zellen, welche das Plasmid pTB319 enthielten, wurden gezüchtet und induziert wie in Beispiel 5 beschrieben. Zellen wurden lysiert und Inklusions-Körper wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 5 von U.S.-Patent-Nummer 5,124,255 beschrieben, verarbeitet. Das Pellet-Material wurde später in SDS, Phosphat, pH 6,8 solubilisiert und dann der Chromatographie auf einer S-300 Säule unterworfen.
  • Beispiel 9. Herstellung von HIV-2-Antigen
  • pHIV-210/XL1-Blue Zellen (Beispiel 4, hierin oben) wurden gezüchtet und induziert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Zellen wurden lysiert mit einem Puffer, der Phosphat, MgCl2, Na EDTA, Triton X-100® pH 7,4 enthielt, ergänzt mit Benzonase, Lysozym und PMSF. Inklusions-Körper wurden von löslichen Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Das Pellet wurde nacheinander mit folgendem gewaschen: destilliertem H2O; Triton X-100®, Desoxycholat, NaCl, Phosphat pH 7,0; 50 mM Phosphat, pH 7,0; Harnstoff, SDS in Phosphat, pH 7,0 + BME. Proteine wurden in SDS, Phosphat, pH 7,0 und BME solubilisiert, dann einer Chromatographie auf einer S300 Säule unterworfen.
  • Beispiel 10. Ein-Schritt Immunochromatographischer Assay für die gleichzeitige Detektion und Differenzierung von HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2
  • A. Reagenz-Zubereitung
    • 1. Eine Selen-(Se)Kolloid-Suspension wurde im Wesentlichen wie folgt hergestellt: SeO2 wurde in Wasser auf eine Konzentration von 0,0625 g/ml aufgelöst. Ascorbat wurde dann in Wasser auf eine Konzentration von 0,32 g/ml aufgelöst und in einem 70°V Wasserbad für 24 Stunden erhitzt. Die Ascorbat-Lösung wurde dann auf 0,0065 g/ml in Wasser verdünnt. Die SeO2 Lösung wurde schnell zu der verdünnten Ascorbat-Lösung hinzugefügt und bei 42°C inkubiert. Die Inkubation wurde nach einem Minimum von 42 Stunden beendet, wenn das Extinktions-Maximum 30 bei einer Wellenlänge zwischen 542 nm und 588 nm überschritt. Die Kolloid-Suspension wurde auf 2–8°C abgekühlt, dann gelagert. Selen-Kolloid-Suspension ist erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Code 25001).
    • 2. Selen-Kolloid/Antikörper-Konjugate wurden wie folgt hergestellt. Die Selen-Kolloid-Suspension wurde auf eine Extinktion von 25 (OD 500–570) in destilliertem Wasser konzentriert. Dann wurde 1 M MOPS hinzugefügt, bis zu einer End-Konzentration von 10 mM pH 7,2. Ziegen-Antikörper, die spezifisch sind für die humane IgG Fc-Region (oder andere Spezies von Antikörpern, die spezifisch sind für die humane IgG Fc-Region) wurden auf eine Konzentration von 0,75 mg/ml mit 50 mM Phosphat-Puffer verdünnt und die resultierende Antikörper-Zubereitung wurde dann unter Mischen zu der Selen-Kolloid-Suspension hinzugefügt, welche wie hierin oben beschrieben hergestellt wurde, auf eine endgültige Antikörper-Konzentration von 75 μg/ml. Das Rühren wurde für 40 Minuten fortgesetzt. Dann wurde 1% (Gewichtsprozent) Rinder-Serum-Albumin (BSA) zu der Lösung hinzugefügt und die Selen-Kolloid/Antikörper-Konjugat-Lösung wurde für zusätzliche 15 Minuten gerührt und bei 5000 × g für 90 Minuten zentrifugiert. Danach wurden 90% des Überstands entfernt und das Pellet wurde mit dem restlichen Überstand resuspendiert. Unmittelbar vor dem Beschichten dieses Selen-IgG-Konjugats auf ein Glasfaser-Kissen wurde es 1 : 10 mit Konjugat-Verdünner verdünnt (1% [Gewichtsprozent] Kasein, 0,1% [Gewichtsprozent] Triton X-405® und 50 mM Tris, pH 8,2).
    • 3. Verfahrens-Kontroll-Reagenz wurde als eine Mischung aus HIV-1 (Gruppe M), HIV-1 (Gruppe 0) und HIV-2-positiven Seren hergestellt und wurde auf einer separaten Streifen-Vorrichtung als eine positive Kontrolle des Assays verwendet.
    • 4. Negatives Kontroll-Reagenz, das verwendet wurde, war normales menschliches, verwendet auf einer separaten Test-Vorrichtung als eine negative Kontrolle des Assays.
  • B. Herstellung des Applikations-Kissens
  • Das Applikations-Kissen-Material umfasst Harz-gebundenes Glasfaser-Papier (Lydall). Ungefähr 0,1 ml des hergestellten Konjugats (beschrieben im vorhergehenden Absatz 2) wurden auf das Applikations-Kissen aufgebracht.
  • C. Herstellung des chromatographischen Materials
  • Alle Reagenzien wurden auf eine Nitro-Zellulose-Membran aufgebracht, durch Beladungs- und Ablenk-Reagenz-Ausstoßung (charge and deflect reagent jetting). Die Nitro-Zellulose wurde durch eine MYLAR® Membran getragen, welche mit einem druckempfindlichen Klebstoff beschichtet ist.
  • Die Testproben-Einfang-Reagenzien wurden hergestellt durch (a) Verdünnen des spezifischen Antigens, hergestellt wie hierin oben beschrieben, auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml in Ausstoßungs(„jetting")-Verdünnungsmittel (100 mM Tris, pH 7,6 mit 1% Saccharose (Gewichtsprozent), 0,9% NaCl und 5 μg/ml Fluoreszein) für das HIV-1 Gruppe 0 Einfang-Reagenz (pGO-9/CKS, Sequenzidentifikationsnr. 50), (b) für HIV-1 Gruppe M, Untergruppe B Einfang-Reagenz (pTB319, Sequenzidentifikationsnr. 56) und (c) für HIV-2 Einfang-Reagenz (pHIV.210, Sequenzidentifikationsnr. 55). 0,098 μl eines ersten Einfang-Reagenzes (Reagenz HIV-1 Gruppe M, Untergruppe B; Sequenzidentifikationsnr. 56) wurde auf den Streifen an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht und bildete eine Patienten-Einfang-Stelle. In ähnlicher Weise wurden 0,098 ml eines zweiten Einfang-Reagenzes (Reagenz HIV-1 Gruppe 0; Sequenzidentifikationsnr. 50) auf den Streifen an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht und bildete eine Patienten-Einfang-Stelle, und 0,098 μl eines dritten Einfang-Reagenzes (Reagenz HIV-2; Sequenzidentifikationsnr. 55) wurden auf den Streifen an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht und bildete eine Patienten-Einfang-Stelle.
  • D. Schneller Assay für die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV
  • Ein schneller Assay für die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV in Testproben-Serum, Vollblut, Speichel und Urin-Proben wurde wie folgt durchgeführt. In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wurden 5 μl Serum und 600 μl Proben-Elutions-Puffer (Sample Elution Buffer, SEB) (enthaltend 50 mM Tris, 1% BSA (m/v), 0,4% Triton X-405® (v/v), 1,5% Casein (m/v), 3% Rinder-IgG (m/v), 4% E. coli-Lysat (v/v), [pH 8,2]) gemischt. Vier Tropfen dieser Mischung wurden auf die Probenwand des STAR-Gehäuses aufgebracht. Als nächstes wurde 1 μl Serum oder Vollblut zu 100 μl SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platter hinzugefügt und der Nitro-Zellulose-Streifen wurde in die Wand hinzugefügt. Danach wurde 1 μl Serum oder Vollblut in die Test-Vorrichtung der erfindungsgemäßen Probenwand direkt aufgetupft und vier Tropfen von SEB wurden hinzugefügt. Wenn Speichel getestet wurde, wurden 50 oder 75 μl Speichel zu 50 ml bzw. 25 ml SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platte hinzugefügt und der Nitro-Zellulose-Teststreifen wurde dann zu der Wand hinzugefügt. Wenn Urin getestet wurde, wurden 50 ml Urin zu 50 μl SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platte hinzugefügt und der Nitro-Zellulose-Teststreifen wurde in der Wand hinzugefügt. Alternativ wurden 100 ml Urin in der Wand einer Mikrotiter-Platte verwendet und der Nitro-Zellulose-Teststreifen wurde hinzugefügt, ohne SEB zu verwenden.
  • Das IgG in der Probe wurde durch das Selen-Ziegen-Anti-menschliche-IgG-Kolloid in dem Konjugat-Kissen gebunden und die Komplexe wurden entlang der Länge der Nitro-Zellulose-Membran-Teststreifen chromatographiert, auf welche die drei rekombinanten Antigene pGO-9 CKS (Sequenzidentifikationsnr. 50), pTB319 (HIV-1 Gruppe M (Untergruppe B), Sequenzidentifikationsnr. 56) und pHIV210 (HIV-2, Sequenzidentifikationsnr. 55) zuvor bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufgebracht wurden, unter Verwendung einer Biodot-Maschine, welche eine positive Verdrängungs-Verteilung lieferte, unter Verwendung von genauen Tropfen-Größen. Die Test-Vorrichtung wurde dann bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert und die Ergebnisse wurden visuell abgelesen.
  • E. Befestigter Vollblut-Assay
  • In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wurde das Äquivalent von 1 ml Blut von entweder bestätigtem positiven HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 oder bestätigtem negativen für HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Vollblut-Testprobe zu 5 ml eines bestätigten negativen HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Serum zusammen mit 100 ml SEB hinzugefügt und gemischt. Diese Mischung wurde auf die Probenwand der Test-Vorrichtung der Erfindung aufgebracht.
  • Das IgG in der Probe wurde durch das Selen-Ziegen-Anti-menschliche-IgG-Kolloid in dem Konjugat-Kissen gebunden und die Komplexe wurden entlang der Länge der Nitro-Zellulose-Membran-Teststreifen chromatographiert, auf welche die drei rekombinanten Antigene pGO-9 CKS (Sequenzidentifikationsnr. 50), pTB319 (HIV-1 Gruppe M (Untergruppe B), Sequenzidentifikationsnr. 56) und pHIV210 (HIV-2, Sequenzidentifikationsnr. 55) zuvor bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufgebracht wurden, unter Verwendung einer Biodot-Maschine, welche eine positive Verdrängungs-Verteilung bereit stellte, unter Verwendung von genauen Tropfen-Größen. Die Test-Vorrichtung wurde dann bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert und die Ergebnisse wurden visuell abgelesen.
  • F. Ergebnisse
  • Wenn Antikörper gegen Antigen 1 in der Testprobe anwesend waren, wurde eine sichtbare Reaktion in dem Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 1 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 2 oder Antigen 3. Wenn Antikörper gegen Antigen 2 in der Testprobe vorhanden waren, wurde eine sichtbare Reaktion in dem Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 2 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 1 oder Antigen 3. Wenn Antikörper gegen Antigen 3 in der Testprobe vorhanden war, wurde eine sichtbare Reaktion in den Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 3 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 1 oder Antigen 2. Ebenso sollte eine negative Kontrolle nicht reaktiv sein (keine sichtbare Reaktion zeigen) in den Zonen von Antigen 1, Antigen 2 und Antigen 3, aber sollte reaktiv sein in der Assay-Vervollständigungs-Zone. Eine positive Kontrolle (bekannter reaktiver Antikörper gegen Antigen 1, 2 und/oder 3) sollte in der Zone des geeigneten Antigens, an welches es spezifische bindet, in einer Antigen/Antikörper-Reaktion reaktiv sein. Ein Ergebnis wurde als ungültig betrachtet, wenn eine positive Reaktion in einer der Antigen-Einfang-Zonen auftrat, aber nicht in der Assay-Vervollständigungs-Zone und der Test wurde wiederholt.
  • (i) Durchführung eines Assays für Antikörper in Blut, Urin und Speichel
  • Das Blut, der Urin und der Speichel von drei Patienten (identifiziert durch Patienten-Nummern 0109, 4068 und 4475) wurde auf Nitro-Zellulose-Festphasen-Vorrichtungen der Erfindung, wie hierin beschrieben, getestet und gemäß dem Assay-Protokoll wie hierin oben aufgeführt. Jede Blut- und Urin-Testprobe von jedem Patienten 0109, 4068 und 4475 war reaktiv mit Antigen 1 (pTB319; Sequenzidentifikationsnr. 56). Die Speichel-Testprobe von Patienten 4068 und 4475 war auch reaktiv mit Antigen 1, während die Speichel-Testprobe des Patienten 0109 nicht reaktiv in der Test-Vorrichtung der Erfindung war. Die Speichel-Testprobe des Patienten 0109 wurde später wieder getestet, durch einen Standard-EIA und als nicht reaktiv für die Antikörper gegen HIV-1 gp41 bestätigt, was anzeigte, dass die Ergebnisse, welche für die Speichel-Testprobe des Patienten 0109 erhalten wurden, gültig waren.
  • (ii) Durchführung eines Assays für negative Proben für HIV-Antikörper
  • 14 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen und zeigt die Ergebnisse, welche erhalten wurden, beim Testen von zwei negativen Seren und zwei negativen Vollblut-Testproben, jeweils ausgestattet mit den selben zwei negativen Seren. Die Proben enthielten keine Antikörper, die spezifisch waren für die relevanten Antigene und die Testproben waren negativ nach dem Assay an dem Test (d. h. keine Reaktivität, wie angezeigt durch keinen sichtbaren Streifen, der eine Reaktion in entweder Position 0, M oder 2 bedeutet). Testprobe war anwesend in jeder Test-Vorrichtung, wie durch den positiven Reaktions-Streifen in der Testproben-Reaktivitäts-Zone angezeigt.
  • (iii) Durchführung eines Assays für HIV-1 Gruppe M Antikörper
  • 15 ist eine Darstellung von zehn Test-Vorrichtungen und zeigt die Ergebnisse, die beim Testen von 5 HIV-1 Gruppe M Seren und 5 Vollblut-Proben erhalten werden, die mit den HIV-1 Gruppe M positiven Seren ausgestattet waren. Wie in 15 gesehen werden kann, enthielten HIV-1 Gruppe M Proben Antikörper, die spezifisch waren für HIV-1 Gruppe M Antigen (pTB319: mittlere Zone) und sie entwickelten eine Reaktions-Linie an der HIV-1 Gruppe M Antigen-Zone und sichtbare Reaktions-Linien können in der Assay-Vervollständigungs-Zone von neun von zehn Test-Vorrichtungen gesehen werden, die mit "M" markiert ist. Obwohl eine Bande in einer speziellen Test-Vorrichtung in der Einfang-Zone für HIV-1 Gruppe M Antikörper vorhanden war, ging keine Testprobe bis zu der Assay-Vervollständigungs-Zone und somit musste der Assay für diese spezielle Probe wiederholt werden. Es ist zu bemerken, dass keine Kreuz-Reaktivität mit den Einfang-Reagenzien für HIV-Gruppe 0 und HIV-2 beobachtet wurde.
  • (iv) Durchführung eines Assays für HIV-1 Gruppe 0 Antikörper
  • 16 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen, welche die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden, wenn zwei bestätigte positive HIV-1 Gruppe 0 Seren und zwei Vollblut-Testproben, die mit HIV-1 Gruppe 0 Seren ausgestattet waren, getestet wurden. Wie in 16 gesehen werden kann, enthielten HIV-1 Gruppe 0 Proben Antikörper, die spezifisch für HIV-1 Gruppe 0 Antigen waren, wie angezeigt durch das positive Streifen-Ergebnis in dem HIV-1 Gruppe 0 Antigen-Einfang-Zonen-Bereich (niedrigste Zone, bezeichnet als "O"), sichtbare Reaktions-Linien können in der Assay-Vervollständigungs-Zone von jeder Vorrichtung gesehen werden und keine Kreuz-Reaktion mit HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Einfang-Antigenen (kein sichtbarer Streifen) wurde beobachtet.
  • (v) Durchführung eines Assays für HIV-2 Antikörper
  • 17 ist eine Darstellung von zehn Test-Vorrichtungen, welche die Ergebnisse zeigt, die mit fünf HIV-2 bestätigten positiven Seren erhalten wurden (fünf Test-Vorrichtungen auf der linken Seite) und Vollblut, das mit fünf HIV-2 Seren ausgestattet war (fünf Test-Vorrichtungen) auf der rechten Seite). Wie aus 17 gesehen werden kann, enthielten HIV-2 Proben Antikörper, die spezifisch für HIV-2 Antigen waren (pHIV210, obere Zone, bezeichnet durch "2"), wie durch den Reaktions-Streifen an der HIV-Antigen-Zone gezeigt. Keine Reaktion wurde mit diesen Testproben und HIV-1 Gruppe 0 Antigen oder HIV-1 Gruppe M Antigen beobachtet und sichtbare Reaktions-Linien können in der Assay-Vervollständigung-Zone von jeder Vorrichtung gesehen werden.
  • (vi) Durchführung eines Assays für HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0, HIV-2 und negative Proben
  • 18 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen, in welchen (von links nach rechts) eine negative Testprobe, eine HIV-1 Gruppe M positive Testprobe, eine HIV-1 Gruppe 0 positive Testprobe und eine HIV-2 positive Testprobe einzeln getestet wurden. Wie aus 18 gesehen werden kann, reagierte das negative Test-Serum nicht mit irgendeinem Antigen in der Antigen-Einfang-Zone, wohingegen die HIV-1 Gruppe M positive Testprobe nur mit dem HIV-1 Gruppe M Antigen reaktiv war, die HIV-1 Gruppe 0 positive Testprobe war nur mit dem HIV-1 Gruppe 0 Antigen reaktiv und die HIV-2 positive Testprobe war nur mit dem HIV-2 Antigen reaktiv, und sichtbare Reaktionslinien können in der Assay-Vervollständigungs-Zone von jeder Vorrichtung gesehen werden.
  • Die fünf HIV-1 Gruppe M und die zwei HIV-1 Gruppe 0 Testproben, die verwendet wurden, wurden als sero-positive Proben bestätigt, welche zuvor unter Verwendung von Abbott's 3A77 EIA getestet wurden und welche PCR amplifiziert, sequenziert und in Untergruppen unterteilt wurden, basierend auf phylogenetischer Analyse. Die fünf HIV-2 Proben, die verwendet wurden, waren sero-positiv, unter Verwendung von Abbott's 3A77 EIA, und sie wurden als HIV-2 Proben durch einen HIV-2 Western Blot-Test (Sanofi) bestätigt.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (16)

  1. Ein Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren und Differenzieren zwischen Analyten, die Antikörper gegen HIV-1 Gruppe O, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 umfassen, in einer Testprobe, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einer analytischen Vorrichtung, die einen Streifen mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende hat, worin sich die Testprobe durch Kapillarwirkung von dem proximalen Ende zu ungefähr dem distalen Ende bewegt, und worin der Streifen mindestens ein immobilisiertes Einfangreagens mit einem visuellen Marker pro Analyt enthält, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um durch das Binden des Analyten und des Einfangreagens Einfangreagens/Analyt-Komplexe zu bilden; und (b) Bestimmen der Anwesenheit des/der Analyt(en) durch Detektieren einer sichtbaren Farbveränderung von den visuellen Marker an der Einfangreagenzstelle auf dem Streifen, worin das Einfangreagens für HIV-1 Gruppe O ein Polypeptid umfaßt, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52, Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr. 58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfangreagens für HIV-1 Gruppe M ein Polypeptid mit der Sequenzidentifikationsnr. 56 umfaßt, und wobei das Einfangreagens für HIV-2 ein Polypeptid mit der Sequenzidentifikationsnr. 55 umfaßt.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das immobilisierte Einfangreagens als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol ausgestaltet ist.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin innerhalb des Streifens ein markiertes Reagens enthalten ist, an einer Stelle zwischen dem proximalen Ende und dem immobilisierten Einfangreagens des Patienten.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Polypeptid-Einfangreagenzien durch rekombinante Technologie hergestellt werden.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das markierte Reagens Selen ist.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Testprobe eine Körperflüssigkeit ist.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die Körperflüssigkeit gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Serum, Plasma, Urin und Speichel.
  8. Eine analytische Vorrichtung für das gleichzeitige Detektieren und Differenzieren zwischen HIV-1 Gruppe O, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 in einer Testprobe, die einen Streifen mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende umfaßt, worin die Testprobe in der Lage ist, sich von dem proximalen Ende zu ungefähr dem distalen Ende durch Kapillarwirkung zu bewegen, und worin der Streifen mindestens ein immobilisiertes Einfangreagens mit einem visuellen Marker pro Analyt enthält, um an ein Glied zu binden, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Analyten, einem spezifischen Hilfsbindungsglied und dem Einfangreagens; und worin das Einfangreagens für HIV-1 Gruppe O ein Polypeptid umfaßt, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50, Sequenzidentifikationsnr. 52, Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr. 58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfangreagens für HIV-1 Gruppe M ein Polypeptid mit der Sequenzidentifikationsnr. 56 umfaßt, und wobei das Einfangreagens für HIV-2 ein Polypeptid mit der Sequenzidentifikationsnr. 55 umfaßt.
  9. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin das immobilisierte Einfangreagens als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol ausgestaltet ist.
  10. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin innerhalb des Streifens ein markiertes Reagens enthalten ist, an einer Stelle zwischen dem proximalen Ende und dem immobilisierten Einfangreagens des Patienten.
  11. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 10, worin das markierte Reagens Selen ist.
  12. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin die Testprobe eine Körperflüssigkeit ist.
  13. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 12, worin die Körperflüssigkeit gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Serum, Plasma, Urin und Speichel.
  14. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin die Polypeptid-Einfangreagenzien durch rekombinante Technologie hergestellt werden.
  15. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, die weiterhin eine positive Reagenskontrolle umfaßt.
  16. Die analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, die weiterhin eine negative Reagenskontrolle umfaßt.
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