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Hintergrund
der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Immuno-Assays und genauer auf einen Immuno-Assay,
der nützlich
ist zur Detektion und Differenzierung von Antikörpern gegen menschliches Immun-Defizienz-Virus
Typ 1 (HIV-1) Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und menschliches Immun-Defizienz-Virus
Typ 1 (HIV-2) in Testproben mit einer schnellen Rundlaufzeit.
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In
Moment gibt es zwei phylogenetische Haupt-Gruppen von HIV-1, bezeichnet
als Gruppe „M" und „0". G. Meyers et al.,
Human Retroviruses and AIDS 1995, Los Alamos National Laboratory,
Los Alamos, NM (1995). HIV-1 Gruppe M Isolate wurden weiter unterteilt
in Untergruppen (A bis J), welche phylogenetisch ungefähr gleich
weit voneinander entfernt sind. Gruppe M Isolate dominieren weltweit.
Die jüngsten
Berichte über die
Sequenz der HIV-1 Gruppe 0-Viren haben angezeigt, dass diese Viren
so nah verwandt sind mit einem Schimpansen-Virus, wie mit anderen
HIV-1 Untergruppen. Siehe beispielsweise L. G. Gürtler et al., J. Virology 68:
1581–1585
(1994); M. Vanden Haesevelde et al., J. Virology 68: 1586–1596 (1994);
De Leys et al., J. Virology 64: 1207–1216 (1990); De Leys et al.,
U.S. Patent-Nummer. 5,304,466; L. G. Gürtler et al., Europäische Patent-Veröffentlichungsnummer
0 591 914 A2. Die Gruppe O-Sequenzen
sind die sich am meisten unterscheidenden der HIV-1-Sequenzen, welche
bisher beschrieben wurden. Obwohl HIV-1 Gruppe O Stämme in West-Zentral-Afrika
endemisch sind (Kamerun, Äquatorial-Guinea,
Gabun und Nigeria) wurden nun Patienten mit Gruppe O Isolaten in
Belgien, Frankreich, Deutschland, Spanien und den Vereinigten Staaten
isoliert. Siehe zum Beispiel R. De Leys et al., supra; P. Charneau
et al., Virology 205: 247–253
(1994); I. Loussert-Ajaka et al., J. Virology 69: 5640–5649 (1995);
H. Hampl et al., Infection 23: 369–370 (1995); A. Mas et al.,
AIDS Res. Hum. Retroviruses 12: 1647–1649 (1996); M. A. Rayfield
et al., Emerging Infectious Diseases 2: 209–212 (1996), und M. Peeters
et al., AIDS 11: 493–498
(1997).
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Die
HIV-1 Gruppe M Serologie ist größtenteils
gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenzen
der exprimierten viralen Proteine (Antigene), insbesondere derjenigen,
welche die Kern- und Envelope-(env)Regionen umfassen. Diese Antigene
sind strukturell und funktionell ähnlich, haben aber unterschiedliche
Aminosäuresequenzen,
welche Antikörper-Antworten
hervorrufen, die spezifisch sind für das spezielle Antigen.
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Eines
der serologischen Hauptziele für
die Detektion einer HIV-1 Infektion ist das 41,000 Molgewicht-Transmembran-Protein
(TMP), Glycoprotein (gp) 41. gp41 ist ein hoch-immunogenes Protein,
welches eine starke und nachhaltige Antikörper-Antwort in Individuen
hervorruft, die als seropositiv für HIV angesehen wurden. Antikörper gegen
dieses Protein sind unter den ersten, welche bei einer Serokonversion
erscheinen. Die Immun-Antwort auf gp41 bleibt scheinbar relativ
stark über
den Verlauf der Krankheit hinweg, wie bewiesen durch die nahe universelle
Anwesenheit von Anti-gp41-Antikörpern
in asymptomatischen ebenso wie in klinischen Stadien von AIDS. Ein
signifikanter Anteil der Antikörper-Antwort
gegen gp41 richtet sich gegen eine gut charakterisierte immunodominante
Region (IDR) innerhalb von gp41.
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HIV-2
Infektionen wurden in Menschen außerhalb der anfänglichen
endemischen Region von Westafrika identifiziert und wurden in Europäern festgestellt,
welche in Westafrika gelebt haben oder solchen, welche sexuelle
Beziehungen mit Individuen aus dieser Region hatten, in Homosexuellen
mit sexuellen Partnern aus der endemischen Region, und anderen.
Fälle von
AIDS auf Grund von HIV Typ 2 (HIV-2) wurden nun weltweit dokumentiert.
Siehe zum Beispiel Saimot et al., Lancet i: 688 (1987); M. A. Rey
et al., Lancet i: 388–389
(1987); A. Werner et al., Lancet i: 868–869 (1987); G. Brucker et
al., Lancet i: 223 (1987); K. Marquart et al., AIDS 2: 141 (1988);
CDC, MMWR 37: 33–35
(1987); Anonym, Nature 332: 295 (1988).
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Serologische
Studien zeigen an, dass, während
HIV-1 und HIV-2 vielfache gemeinsame Epitope in ihren Kern-Antigenen
teilen, die Envelope-Glycoproteine dieser zwei Viren viel weniger
kreuzreaktiv sind. F. Clavel, AIDS 1: 135–140 (1987). Diese beschränkte Kreuz-Reaktivität der Envelope-Antigene
erklärt
scheinbar, warum derzeit erhältliche
serologische Assays für
HIV-1 nicht mit bestimmten Seren aus Individuen mit Antikörpern gegen
HIV-2 reagieren. F. Denis et al., J. Clin. Micro. 26: 1000–1004 (1988).
Das in jüngster
Zeit veröffentlichte
US-Patent Nummer 5,055,391 kartographiert das HIV-2 Genom und stellt
Assays bereit, um den Virus zu detektieren.
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Befürchtungen
sind aufgetreten in Bezug auf die Fähigkeit der derzeit erhältlichen
Immuno-Assays für die
Detektion von Antikörpern
gegen HIV-1 (Gruppe 0) und/oder HIV-2, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen
HIV-1 Gruppe 0 zu detektieren. I. Loussert-Ajaka et al., Lancet
343: 1393–1394
(1994); C. A. Schable et al., Lancet 344: 1333–1334 (1994); L. Gürtler et
al., J. Virol. Methods 51: 177–184
(1995). Zusammenfassend ist das Problem des Analysierens, ob diese
Immuno-Assays in der Lage sind, Gruppe 0 zu detektieren, die eingeschränkte Verfügbarkeit
von Serum-Proben von Patienten, die infiziert sind mit und/oder
Antikörper gegen
HIV-1 Gruppe Isolate haben. Bis jetzt wurden wenige Patienten außerhalb
von West-Zentral-Afrika mit einer Infektion gegen HIV-1 Gruppe 0
Isolate diagnostiziert, was die Forscher dazu führte, Patienten in West-Zentral-afrikanischen
Ländern
auf das Virus zu screenen. Die Screening-Verfahren in West-Zentral-Afrika
wurden sowohl durch die Zeit, welche notwendig ist, um diese Assays
durchzuführen,
als auch durch die Ausrüstung,
welche erforderlich ist, um dies zu tun, behindert.
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Übliche Bindungs-Assays,
die erhältlich
sind zur Detektion von Antikörpern
gegen HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2, benötigen üblicherweise
ungefähr
2 bis 4 oder mehr Stunden, um ein Ergebnis zu erzielen. Diese Assays
schließen
weiterhin die Verwendung von Ausrüstungen ein, einschließlich Inkubatoren und
Marker-Lese-Vorrichtungen, welche Elektrizität benötigen, um zu funktionieren.
Diese Assays schließen spezifische
Bindungsglieder ein, üblicherweise
Antikörper
und Antigen-Immun-Reaktanden,
worin ein Glied des spezifischen Bindungspaars mit einer Signal-erzeugenden
Verbindung markiert ist (zum Beispiel ein Antikörper markiert mit einem Enzym,
einer fluoreszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung,
einem radioaktiven Isotop, einem direkten visuellen Marker etc.).
Die Testproben, von denen vermutet wird, dass sie den Analyten enthalten,
können
mit einem markierten Reagenz gemischt werden, zum Beispiel einem
markierten Anti-Analyt-Antikörper
und für
einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert werden, die ausreichend
sind, dass die Immunreaktion stattfindet. Die Reaktionsmischung
wird danach analysiert, um entweder den Marker zu detektieren, der
mit dem Analyt/markiertes Reagenz-Komplex zusammenhängt (gebundenes
markiertes Reagenz) oder den Marker, der nicht mit dem Analyt komplexiert
ist (freies markiertes Reagenz). Die Anwesenheit und/oder Menge
eines Analyten wird angezeigt durch die Fähigkeit des Analyten, an ein
markiertes Reagenz und Bindungsglied zu binden, welches üblicherweise
immobilisiert ist, oder ein unlösliches
komplementäres
Bindungsglied.
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Es
gibt Situationen und Orte, in welchen der Zeitraum, der üblicherweise
erforderlich ist, um diese Assays durchzuführen und Ergebnisse zu bringen,
zu lang ist (das heißt,
zwei bis vier Stunden) oder die Ausrüstung und/oder die Elektrizität, die notwendig
ist, um den Assay durchzuführen,
ist nicht verfügbar.
In solchen Situationen sollte ein bevorzugter Test nicht teuer sein,
wenig oder keine Ausrüstung
erfordern und für
einen Screening-Assay in einem so geringen Zeitraum wie fünf Minuten
ein Ergebnis liefern.
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Die
Verwendung von Reagenz-imprägnierten
Teststreifen in spezifischen Bindungs-Assays ist wohl bekannt. Siehe
zum Beispiel Deutsch et al., U.S.-Patent Nummer 4,361,537 und Brown
III et al., U.S.-Patent Nummer 5,160,701. In solchen Verfahren wird
eine Testprobe an einen Teil des Teststreifens aufgebracht und es
wird ihr erlaubt zu wandern oder sich durch das Streifenmaterial
zu ziehen. Somit läuft
der Analyt, der detektiert oder gemessen werden soll, durch oder
entlang dem Material, möglicherweise
mit Hilfe eines eluierenden Lösungsmittels,
welches die Testprobe selbst oder eine separat hinzugefügte Lösung sein
kann. Der Analyt wandert in oder durch eine Einfang- oder Detektionszone
auf dem Teststreifen, worin ein komplementäres Bindungsglied zu dem Analyt
immobilisiert ist. Das Ausmaß,
zu welchem der Analyt in der Detektionszone gebunden wird, kann
mit der Hilfe des markierten Reagenzes bestimmt werden, welches
auch in den Teststreifen eingeschlossen werden kann oder welches
separat aufgetragen werden kann.
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Im
Allgemeinen schließen
Teststreifen ein Material ein, das in der Lage ist, eine Lösung durch
Kapillarwirkung zu transportieren, das heißt, eine durchziehende oder
chromatographische Wirkung, wie in Gordon et al., U.S.-Patent Nummer
4,956,302 beispielhaft dargestellt ist. Unterschiedliche Bereiche
oder Zonen in dem Teststreifen enthalten die Assay-Reagenzien, die notwendig
sind, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, wenn der Analyt
zu oder durch solche Zonen transportiert wird. Die Vorrichtung ist
sowohl für
chemische Assays als auch für
Bindungs-Assays geeignet und verwendet eine Entwickler-Lösung, um
den Analyten entlang des Streifens zu transportieren. Ebenso, um
die Stabilität
und die Wirksamkeit der Assay-Reagenzien zu beweisen, die erforderlich
sind, um das detektierbare Signal zu erzeugen, erfordern existierende
Assays typischerweise mindestens den einen oder mehrere Steifen
von jeder Herstellungsmenge, um separat für sowohl positive als auch
negative Kontrollen untersucht zu werden.
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Assay-Systeme,
die für
die separate oder gleichzeitige Detektion von Antikörpern gegen
HIV-1 Gruppe M und/oder HIV-1 Gruppe 0 und/oder HIV-2 entwickelt
wurden, müssen
daher Reagenzien enthalten, welche nützlich sind für die Bestimmung
der spezifischen Anwesenheit von Antikörpern gegen irgendeinen oder
alle der Viren in einer Testprobe, wobei zwischen ihnen unterschieden
wird. Daher existiert das Bedürfnis
nach Reagenzien, die in der Lage sind, nur mit Antikörpern gegen
HIV Gruppe M, HIV Gruppe 0 und HIV-2 zu reagieren, wobei die Reagenzien
entweder keine Kreuz-Reaktivität
oder eine begrenzte Kreuz-Reaktivität miteinander zeigen. Es wäre auch
nützlich,
eine wegwerfbare Assay-Vorrichtung bereitzustellen, die diese Reagenzien einschließt und die
für das
Screening von Einzelpersonen verwendet werden kann, und welche Ergebnisse
in einem kurzen Zeitraum liefert.
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Zusammenfassen
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit für die gleichzeitige
Detektion und Differenzierung zwischen Analyten, die Antikörper gegen
HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M und HIV-2 in einer Testprobe umfassen.
Das Verfahren umfasst (a) das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit
einer analytischen Vorrichtung, welche einen Streifen hat, mit einem
proximalen Ende und einem distalen Ende, worin die Testprobe von
dem proximalen Ende bis ungefähr
zu dem distalen Ende durch Kapillarwirkung wandert, und worin der
Streifen mindestens ein immobilisiertes Einfang-Reagenz pro Analyt
enthält,
für einen
Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um durch die
Bindung des Analyten und des Einfang-Reagenzes Einfang-Reagenz/Analyt-Komplexe
zu bilden; und (b) das Bestimmen der Anwesenheit des/der Analyte(n)
durch Detektieren einer sichtbaren Farbänderung bei der Einfang-Reagenz-Stellen
auf dem Streifen, worin das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe 0 ein Polypeptid
umfasst, das gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr.
50, Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54,
Sequenzidentifikationsnr. 58, und Sequenzidentifikationsnr. 60,
wobei das Einfang-Reagenz für
HIV-1 Gruppe M ein Polypeptid der Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst,
und das Einfang-Reagenz für
HIV-2 ein Polypeptid der Sequenzidentifikationsnr. 55 umfasst. Vorzugsweise
wird das Polypeptid-Einfang-Reagenz durch rekombinante Technologie
hergestellt, obwohl in Erwägung
gezogen wird, dass ein gereinigtes Protein (Polypeptid) oder ein
synthetisches Peptid verwendet werden kann. Das immobilisierte Einfang-Reagenz
kann als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol
ausgestaltet sein. Desweiteren umfasst das Verfahren ein Indikator-Reagenz,
das innerhalb des Streifens in einer Stelle zwischen dem proximalen
Ende und dem immobilisierten Patienten-Einfang-Reagenz enthalten
ist. Das Indikator-Reagenz umfasst eine Signal-erzeugende Verbindung,
wobei die Verbindung gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chromogen, einem Katalysator,
einer lumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung,
einem radioaktiven Element und einem direkten visuellen Marker.
Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz einen direkten visuellen
Marker, gewählt
aus der Gruppe bestehend aus kolloidalen Metall-Partikeln, kolloidalen nicht-Metall-Partikeln, gefärbten oder
kolorierten Partikeln und Liposomen. Das Indikator-Reagenz umfasst weiter
Selen als einen nicht metallischen Partikel. Die Testprobe ist vorzugsweise
eine Körperflüssigkeit.
Die Körperflüssigkeit
ist gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin und Speichel.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine analytische Vorrichtung
bereit für
die gleichzeitige Detektion und Differenzierung zwischen HIV-1 Gruppe
0, HIV-1 Gruppe M und HIV-2
in einer Testprobe, welche einen Streifen umfasst, mit einem proximalen
Ende und einem distalen Ende, worin die Testprobe in der Lage ist,
von dem proximalen Ende bis zu ungefähr dem distalen Ende durch
Kapillarwirkung zu wandern, und worin der Streifen mindestens ein
immobilisiertes Einfang-Reagenz pro Analyt enthält für die Bindung des Analyten und
des Einfang-Reagenzes;
und worin das Einfang-Reagenz für
HIV-1 Gruppe 0 eine Polypeptid-Sequenz umfasst, die gewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50,
Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr.
58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV-1 Gruppe M, Sequenzidentifikationsnr.
56 umfasst und wobei das Einfang-Reagenz für HIV-2 Sequenzidentifikationsnr.
55 umfasst. Das Polypeptid wird vorzugsweise durch rekombinante
Technologie hergestellt, obwohl in Erwägung gezogen wird, dass ein
gereinigtes Protein (Polypeptid) und synthetische Peptide verwendet
werden können.
Die analytische Vorrichtung umfasst weiterhin ein immobilisiertes
Einfang-Reagenz, das als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm
oder ein Symbol ausgestaltet ist. Weiterhin umfasst die analytische
Vorrichtung ein Indikator-Reagenz, das innerhalb des Streifens an
einer Stelle zwischen dem proximalen Ende und dem immobilisierten
Patienten-Einfang-Reagenz enthalten ist. Das Indikator-Reagenz umfasst
eine Signal-erzeugende Verbindung, wobei die Verbindung gewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus einem Chromogen, einem Katalysator,
einer lumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung,
einem radioaktiven Element und einem direkten visuellen Marker.
Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz einen direkten visuellen
Marker, gewählt
aus der Gruppe bestehend aus kolloidalen metallischen Partikeln,
kolloidalen nicht-metallischen Partikeln, gefärbten oder kolorierten Partikeln
und Liposomen. Die Testprobe ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit.
Die Körperflüssigkeit
ist gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin und Speichel.
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Zusätzlich stellt
die vorliegende Erfindung einen Testkit für die Verwendung in spezifischen
Bindungs-Assays bereit. Der Testkit umfasst eine analytische Vorrichtung
für die
Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge von HIV-1 Gruppe 0, HIV-1
Gruppe M und HIV-2 spezifischen Antikörpern in einer Testprobe und
umfasst weiterhin einen Streifen, der ein proximales Ende und ein
distales Ende hat, worin die Testprobe in der Lage ist, von dem
proximalen Ende bis ungefähr
zu dem distalen Ende durch Kapillarwirkung zu wandern und worin
der Streifen ein immobilisiertes Einfang-Reagenz enthält, das
an ein Glied bindet, das gewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus dem Analyten, einem hilfsweisen spezifischen
Bindungsglied und einem Indikator-Reagenz. Das Einfang-Reagenz für HIV-1
Gruppe 0 umfasst ein Polypeptid, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr. 50,
Sequenzidentifikationsnr. 52 und Sequenzidentifikationsnr. 54, Sequenzidentifikationsnr.
58 und Sequenzidentifikationsnr. 60, wobei das Einfang-Reagenz für HIV-1
Gruppe M Sequenzidentifikationsnr. 56 umfasst und wobei das Einfang- Reagenz für HIV-2
Sequenzidentifikationsnr. 55 umfasst. Das Polypeptid wird vorzugsweise
durch rekombinante Technologie hergestellt. Es wird in Erwägung gezogen,
dass ein gereinigtes Protein oder ein synthetisches Peptid auch
verwendet werden kann. Das Indikator-Reagenz umfasst eine Signal-erzeugende
Verbindung, wobei die Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus einem Chromogen, einem Katalysator, einer lumineszierenden Verbindung,
einer chemilumineszierenden Verbindung, einem radioaktiven Element
und einem direkten visuellen Marker. Vorzugsweise umfasst das Indikator-Reagenz
einen direkten visuellen Marker, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus kolloidalen metallischen Partikeln, kolloidalen nicht-metallischen
Partikeln, gefärbten
oder kolorierten Partikeln und Liposomen. Der Testkit umfasst weiterhin
eine positive Reagenz-Kontrolle und eine negative Reagenz-Kontrolle.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die abgeleitete Aminosäuresequenz
des env Proteins von dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM 112 (Sequenzidentifikationsnr.
61).
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2 veranschaulicht
die Strategie, die verwendet wurde, um synthetische HIV-1 Gruppe
0 env gp 120/gp41 Gen-Konstrukte zu erzeugen, worin das pGO-8-Insert
= Osyn-5' bis Osyn-P3' ist; pGO-9-Insert
= Osyn-5' bis Osyn-03'; pGO-11-Insert =
Osyn-5' bis Osyn-M;
und worin H = die hydrophobe Region der HIV-1 Gruppe 0 ist, gestrichen
wie gezeigt.
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3A bis 3D zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-9PL/DH5α und
pGO-9CKS/XL1 involviert
sind.
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4A bis 4G zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-11PL/DH5α und
pGO11CKS/XL1 involviert sind.
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5 zeigt
die Aminosäuresequenz
des pGO-8PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 58).
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6 zeigt
die Aminosäuresequenz
des pGO-8CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 60).
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7 zeigt
die Aminosäuresequenz
des pGO-9PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 48).
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8 zeigt
die Aminosäuresequenz
des pGO-9CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 50).
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9 zeigt
die Aminosäuresequenz
des pGO-11PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 52).
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10 zeigt die Aminosäuresequenz des pGO-11CKS rekombinanten
Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 54).
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11 zeigt die Aminosäuresequenz des pHIV-210 rekombinanten
Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 55).
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12 ist ein Vorder-Grundriß der Test-Vorrichtung, die
für die
vorliegende Erfindung verwendet wurde.
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13 ist eine Querschnitts-Ansicht der Test-Vorrichtung, die
in 12 gezeigt ist, aufgenommen entlang der Linien 20 bis 22 von 12.
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14 ist eine Aufnahme der Ergebnisse, die in vier
Test-Vorrichtungen von (von links nach rechts) zwei negativen Serum-Proben
(zwei Test-Vorrichtungen links) und zwei negativen Vollblut-Testproben
(zwei Test-Vorrichtungen rechts) erhalten wurden, versehen mit einer
negativen Kontrolle in dem Assay der Erfindung.
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15 ist eine Aufnahme von 10 Test-Vorrichtungen
und zeigt die Ergebnisse, die durch die Untersuchung von (von links
nach rechts) fünf
HIV-1 Gruppe M Seren (fünf
Test-Vorrichtungen links) und fünf
Vollblut-Proben (fünf
Test-Vorrichtungen rechts) erhalten wurden, versehen mit den HIV-1
Gruppe M positiven Seren.
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16 ist eine Aufnahme von vier Test-Vorrichtungen,
welche die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden, wenn (von links
nach rechts) zwei bestätigte
positive HIV-1 Gruppe 0 Seren (zwei Test-Vorrichtungen links) und
zwei Vollblut-Testproben versehen mit HIV-1 Gruppe 0 Seren (zwei
Test-Vorrichtungen rechts) getestet wurden.
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17 ist eine Aufnahme von 10 Test-Vorrichtungen,
die die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden mit (von links nach
rechts) fünf
HIV-2 bestätigten
positiven Seren (fünf
Test-Vorrichtungen
links) und Vollblut versehen mit HIV-2 Seren (fünf Test-Vorrichtungen rechts).
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18 ist eine Aufnahme von vier Test-Vorrichtungen,
in denen (von links nach rechts) eine negative Testprobe, eine HIV-1 Gruppe M positive
Testprobe, eine HIV-1 Gruppe 0 positive Testprobe und eine HIV-2 positive
Testprobe einzeln getestet wurden.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
Fähigkeit,
auf HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in weniger Zeit als
in üblichen
Assays zu screenen, ist ein erforderliches Merkmal in Situationen,
in welchen schnelle Ergebnisse für
die Patienten-Beratung und Behandlung notwendig sind. Ein solcher
Screening-Assay muss in der Lage sein, einen ähnlichen Grad an Empfindlichkeit
und Spezifität
bereitzustellen, wie die konventionellen Screening-Assays, aber in
einer viel kürzeren
Zeitspanne. Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen Assay
bereit und wird hiernach beschrieben.
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Die
folgenden Ausdrücke
haben die folgenden Bedeutungen, solange nicht anderweitig angegeben:
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Der
Ausdruck "Testprobe" bezieht sich auf
eine Komponente eines Körpers
einer Person, die die Quelle für
den Analyten ist (wie zum Beispiel Antikörper von Interesse oder Antigene
von Interesse). Diese Komponenten sind im Fachgebiet wohl bekannt.
Die Testprobe kann direkt, wie aus der Quelle erhalten, oder nach einer
Vorbehandlung, um ihren Charakter zu modifizieren, verwendet werden.
Diese Testproben schließen
biologische Proben ein, welche durch die Verfahren, die hierin beschrieben
sind, getestet werden können,
und sie schließen
menschliche und tierische Körperflüssigkeiten
ein, wie zum Beispiel Vollblut, Serum, Plasma, Cerebrospinal-Flüssigkeit,
Urin, Lymph-Flüssigkeiten
und verschiedene externe Sekrete des Respirations-, Intestinal-
und Urogenital-Trakts, Tränen,
Speichel, Milch, weiße
Blutkörperchen,
Myelome und dergleichen; und biologische Flüssigkeiten, wie zum Beispiel
Zellkultur-Überstände; fixierte
Gewebeproben; und fixierte Zellproben. Die Testprobe kann vor der
Verwendung vorbehandelt werden, wie zum Beispiel die Herstellung
von Plasma aus Blut, die Verdünnung
von viskosen Flüssigkeiten
oder dergleichen; Behandlungs-Verfahren können die Extraktion, Filtration,
Destillation, Konzentrierung, Inaktivierung von störenden Verbindungen
und die Zugabe von Reagenzien einschließen. Eine solche Vorbehandlung
kann auch die Modifikation eines festen Materials einschließen, von
dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, um ein flüssiges Medium
zu bilden oder um den Analyten freizusetzen.
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"Analyt", wie hierin verwendet,
ist die zu detektierende Substanz, welche in der Testprobe vorhanden sein
kann. Der Analyt kann jede Substanz sein, für welche es ein natürlich vorkommendes
spezifisches Bindungsglied gibt (wie zum Beispiel ein Antikörper) oder
für welche
ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Somit ist
ein Analyt eine Substanz, die an ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder
in einem Assay binden kann. "Analyt" schließt ebenfalls
irgendwelche antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon
ein. Als ein Glied eines spezifischen Bindungspaars kann der Analyt
durch natürlich
vorkommende spezifische Bindungspartner (Paare) detektiert werden,
zum Beispiel, aber nicht beschränkt
auf, die Verwendung von intrinsischem Faktor Protein als einem Glied
eines spezifischen Bindungspaars für die Bestimmung von Vitamin
B12, die Verwendung von Folat-bindendem Protein, um Folsäure zu bestimmen
oder die Verwendung eines Lectins als ein Glied eines spezifischen
Bindungspaars für
die Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt schließt jegliche
antigenen Substanzen ein, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, ein
Protein, ein Peptid, eine Aminosäure,
ein Nukleotid-Ziel und dergleichen, Haptene, Antikörper, Makromoleküle und Kombinationen
davon.
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"Analyt-Analog" bezieht sich auf
eine Substanz, welche mit dem Analyt-spezifischen Bindungsglied kreuzreagiert,
obwohl sie dies zu einem größeren oder
geringeren Ausmaß als
der Analyt selbst tun kann. Das Analyt-Analog kann einen modifizierten
Analyten einschließen,
ebenso wie einen fragmentierten oder synthetischen Anteil des Analyt-Moleküls, solange
das Analyt-Analog
mindestens eine Epitop-Stelle gemeinsam mit dem Analyten von Interesse
hat. Ein Beispiel eines Analyt-Analogs ist eine synthetische Peptid-Sequenz,
welche mindestens ein Epitop des gesamten Molekül-Analyten kopiert, so dass
das Analyt-Analog an das Analyt-spezifische Bindungsglied binden
kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, welche spezifische Bindungsglieder
verwenden. Ein "spezifisches
Bindungsglied",
wie hierin verwendet, ist ein Glied eines spezifischen Bindungspaars.
Das heißt, zwei
unterschiedliche Moleküle,
worin eines der Moleküle
durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite
Molekül
bindet. Deshalb können,
zusätzlich
zu Antigen- und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren
von üblichen
Immuno-Assays, andere spezifische Bindungspaare beispielsweise ohne
Einschränkung
Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotid-Sequenzen,
Effektor- und Rezeptor-Moleküle,
Cofaktoren und Enzyme, Enzym-Inhibitoren und Enzyme und dergleichen
einschließen. Zusätzlich schließen andere
spezifische Bindungspaare, als Beispiele ohne Einschränkung, komplementäre Peptid-Sequenzen,
eine Peptid-Sequenz und einen Antikörper, der spezifisch ist für die Sequenz
oder das gesamte Protein, polymere Säuren und Basen, Farbstoffe
und Protein-Bindemittel, Peptide und spezifische Protein-Bindemittel
(zum Beispiel Ribonuklease, S-Peptid und Ribonuklease S-Protein)
ein. Desweiteren können spezifische
Bindungspaare Glieder einschließen,
die Analoge der ursprünglichen
spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analyt-Analog.
Das spezifische Bindungspaarglied kann ein Protein, ein Peptid,
eine Aminosäure,
ein Nukleotidziel und dergleichen einschließen. Immunoreaktive spezifische
Bindungsglieder schließen
Antigene, Antigen-Fragmente, Antikörper und Antikörper-Fragmente
ein, sowohl monoklonal als auch polyklonal, und Komplexe davon,
einschließlich
derjenigen, die durch rekombinante DNA-Moleküle gebildet werden, Folat-bindendes
Protein, um Folsäure
zu bestimmen oder die Verwendung eines Lectins als ein Glied eines
spezifischen Bindungspaares für
die Bestimmung eines Kohlenhydrates.
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Der
Ausdruck "Hapten", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein partielles Antigen oder nicht-Protein-Bindungsglied,
das in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, aber welches
nicht in der Lage ist, eine Antikörper-Bildung hervorzurufen,
solange es nicht an ein Träger-Protein
gekoppelt ist.
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Das "Indikator-Reagenz", das auch als ein "markiertes Reagenz" bezeichnet wird,
umfasst eine "Signal-erzeugende
Verbindung" ("Marker"), die in der Lage
ist zu erzeugen und die ein messbares Signal erzeugt, das durch
externe Mittel detektierbar ist, die an ein spezifisches Bindungsglied
für HIV
konjugiert (angeheftet) sind. Zusätzlich dazu, dass es ein Antikörper-Glied
eines spezifischen Bindungspaares für HIV ist, kann das Indikator-Reagenz
auch ein Glied von irgendeinen spezifischen Bindungspaar sein, einschließlich entweder Hapten-Anti-Hapten-Systemen,
wie zum Beispiel Biotin oder Anti-Biotin, Avidin oder Biotin, ein
Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotid-Sequenz, ein Effektor-
oder ein Rezeptor-Molekül,
ein Enzym-Cofaktor und ein Enzym, ein Enzym-Inhibitor oder ein Enzym und dergleichen.
Ein Immuno-reaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper, ein
Antigen oder ein Antikörper/Antigen-Komplex
sein, der in der Lage ist, entweder an HIV, wie in einem Sandwich-Assay
zu binden, an das Einfang-Reagenz, wie in einem kompetitiven Assay
oder an das hilfsweise spezifische Bindungsglied, wie in einem indirekten
Assay. Die Anheftung der Signal-erzeugenden Verbindung und des spezifischen
Bindungsglieds kann durch kovalente oder nicht kovalente Bindung
erfolgen, aber das Verfahren der Anheftung ist nicht entscheidend
für die
vorliegende Erfindung. Der Marker erlaubt es dem Indikator-Reagenz,
ein detektierbares Signal zu erzeugen, das direkt oder indirekt
mit der Menge an Analyt in der Testprobe in Zusammenhang steht.
Die spezifische Bindungspaarglied-Komponente des Indikator-Reagenzes
ist gewählt,
um direkt an den Analyten oder indirekt an den Analyten durch ein
hilfsweises spezifisches Bindungsglied zu binden. Das markierte
Reagenz kann in die Testvorrichtung eingeschlossen werden, es kann
mit der Testprobe kombiniert werden, um eine Testlösung zu
bilden, es kann getrennt von der Testprobe zu der Vorrichtung hinzugefügt werden
oder es kann vorgelegt oder reversibel an der Einfang-Stelle immobilisiert
werden. Zusätzlich
kann das Bindungsglied vorher oder während der Durchführung des
Assays markiert werden, durch ein geeignetes Anhäftungs-Verfahren.
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Die
verschiedenen "Signal-erzeugenden
Verbindungen" ("Marker"), die in Erwägung gezogen
werden, schließen
Chromogene, Katalysatoren, wie zum Beispiel Enzyme, lumineszierende
Verbindungen, wie zum Beispiel Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszierende
Verbindungen wie zum Beispiel Dioxetane, Acridiniums, Phenanthridiniums
und Luminol, radioaktive Elemente und direkte visuelle Marker ein.
Beispiele für
Enzyme schließen
alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Beta-Galactosidase und dergleichen
ein. Beispiele für
direkte visuelle Marker schließen
kolloidale metallische Partikel, wie zum Beispiel Gold, kolloidale nicht-metallische
Partikel wie zum Beispiel Selen, gefärbte oder kolorierte Partikel,
wie zum Beispiel ein gefärbtes
Plastik oder einen eingefärbten
Mikro-Organismus, kolorierte oder kolorierbare organische Polymer-Latex-Partikel,
Durazyten® (derivatisierte
rote Blutzellen, erhältlich
von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), Liposome oder andere
Vesikel, die direkt sichtbare Substanzen enthalten, und dergleichen
ein. Die Auswahl eines speziellen Markers ist nicht entscheidend.
Der Marker wird in der Lage sein, ein Signal zu erzeugen, entweder
durch sich selbst (wie zum Beispiel ein visuell detektierbarer kolorierter
organischer Polymer-Latex-Partikel) oder er wird durch Instrumente
detektierbar sein (wie zum Beispiel eine lumineszierende Verbindung
oder ein radiomarkiertes Element) oder er wird in Zusammenhang mit
einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen
detektierbar sein, wie zum Beispiel ein Enzym/Substrat Signal-erzeugendes
System. Eine Vielzahl von unterschiedlich markierten Reagenzien
kann gebildet werden durch Variieren von entweder dem Marker oder
der spezifischen Bindungsglied-Komponente des markierten Reagenzes;
es wird durch jemanden, der im Fachgebiet bewandert ist, anerkannt
werden, dass die Auswahl die Berücksichtigung
des zu detektierenden Analyten mit dem gewünschten Detektionsmittel einschließt.
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Wenn
ein visuell detektierbarer Partikel als der Marker verwendet wird,
wie zum Beispiel Selen, gefärbte
Partikel oder schwarzer Latex, kann das markierte Reagenz-Bindungsglied(er)
an die Partikel angeheftet werden. Alternativ kann das/die Bindungsglied(er)
an separate Mengen von Partikeln angeheftet werden und danach können die
Partikel gemischt werden.
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"Signal-erzeugende
Komponente" bezieht
sich auf irgendeine Substanz, die in der Lage ist, mit einem anderen
Assay-Reagenz oder mit dem Analyten zu reagieren, um ein Reaktions-Produkt
oder ein Signal zu erzeugen, das die Anwesenheit des Analyten anzeigt
und/oder dazu dient, anzuzeigen, dass bestimmte Assay-Charakteristika erfüllt wurden.
Die Signal-erzeugende Komponente ist durch visuelle oder instrumentelle Mittel
detektierbar. "Signal-Erzeugungs-System", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf die Gruppe von Assay-Reagenzien, die benötigt werden,
um das gewünschte
Reaktions-Produkt oder Signal zu erzeugen. Somit können eine
oder mehrere Signal-erzeugende Komponenten mit dem Marker reagiert
werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel,
wenn der Marker ein Enzym ist, wird die Verstärkung des detektierbaren Signals
erhalten durch Reagieren des Enzyms mit einem oder mehreren Substraten
oder zusätzlichen
Enzymen und Substraten, um ein detektierbares Reaktions-Produkt
herzustellen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein visuell detektierbarer Marker
als die Marker-Komponente
des markierten Reagenzes verwendet, wodurch ein direktes visuelles
oder instrumentelles Ablesen der Anwesenheit oder Menge des Analyten
in der Testprobe bereitgestellt wird, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche
Signal-erzeugende Verbindungen an den Detektions-Stellen. Geeignete
Materialien für
die Verwendung schließen
kolloidale Metalle, wie zum Beispiel Gold und Farbstoff-Partikel,
ebenso wie nicht metallische Kolloide, wie zum Beispiel kolloidales
Selen, Tellur und Schwefel-Partikel ein.
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"Immobilisiertes Einfang-Reagenz" bezieht sich auf
eines oder mehrere spezifische Bindungsglieder, die innerhalb oder
auf einem Teil des festen Phasenträgers oder des chromatographischen
Streifens angeheftet sind, um eine oder mehrere "Einfang- Stellen" zu bilden, worin der Analyt, das positive
Kontroll-Reagenz und/oder
das markierte Reagenz auf dem Streifen immobilisiert werden oder
worin das immobilisierte Reagenz die Wanderung des Analyten und/oder
des markierten Reagenzes durch den Streifen verlangsamt. Das Verfahren
der Anheftung ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung.
Das immobilisierte Einfang-Reagenz erleichtert die Beobachtung des
detektierbaren Signals durch im Wesentlichen Abtrennen des Analyten und/oder
des markierten Reagenzes von ungebundenen Assay-Reagenzien und den
verbleibenden Komponenten der Testprobe. Zusätzlich kann das immobilisierte
Reagenz auf der festen Phase immobilisiert werden, vor oder während der
Durchführung
des Assays, durch irgendein geeignetes Anheftungs-Verfahren.
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Typischerweise
ist eine Einfang-Stelle der vorliegenden Erfindung ein abgegrenzter
oder definierter Teil eines festen Phase-Trägers, sodass die spezifische
Bindungs-Reaktion zwischen dem immobilisierten Einfang-Reagenz und
dem Analyten ist. Dies erleichtert die Detektion des Markers, der
an der Einfang-Stelle oder -Stellen immobilisiert ist, im Gegensatz
zu anderen Teilen des festen Phase-Trägers. Die abgegrenzte Stelle ist
typischerweise weniger als 50% des festen Phase-Trägers und
vorzugsweise weniger als 10% des festen Phase-Trägers. Das immobilisierte Reagenz
kann auf das feste Phase-Material aufgebracht werden durch Eintauchen,
Hineinschreiben mit einem Stift, Verteilen durch ein Kapillar-Röhrchen oder
durch die Verwendung von Reagenz-Jet-Printing oder Biodotting oder
irgendwelchen anderen geeigneten Verteilungs-Techniken. Zusätzlich kann
die Einfang-Stelle markiert werden, zum Beispiel mit einem Farbstoff,
sodass die Position der Einfang-Stelle auf dem festen Phase-Material
visuell oder instrumentell bestimmt werden kann, sogar wenn kein
Marker an der Stelle immobilisiert ist. Vorzugsweise ist das immobilisierte
Reagenz auf dem Streifen derart positioniert, dass die Einfang-Stelle
nicht direkt mit der Testprobe in Kontakt steht, das heißt, die
Testprobe muss durch Kapillar-Wirkung durch mindestens einen Teil
des Streifens vor dem In-Kontakt-bringen mit dem immobilisierten
Reagenz wandern.
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Das
immobilisierte Einfang-Reagenz kann in einer einzelnen Einfang-
oder Detektions-Stelle oder in mehreren Stellen auf oder dem festen
Phase-Material bereitgestellt werden. Die bevorzugte Ausführungsform der
Erfindung stellt ein immobilisiertes Patienten-Einfang-Reagenz(ien)
und ein immobilisiertes Verfahrens-Einfang-Reagenz bereit. Die immobilisierten
Einfang-Reagenzien können
auch in einer Vielzahl von Konfigurationen bereitgestellt werden,
um verschiedene Detektions- oder Mess-Formate zu erzeugen. Zum Beispiel
kann das immobilisierte Einfang-Reagenz als ein Buchstabe, eine
Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol oder irgendeine Kombination
davon ausgestaltet sein. Wenn es als ein Buchstabe ausgestaltet
ist, kann das immobilisierte Einfang-Reagenz entweder ein einzelner
Buchstabe oder eine Kombination von Buchstaben sein, die Worte bildet
oder abgekürzte
Worte, wie zum Beispiel "POS", "NEG" oder "OK". Alternativ kann
das immobilisierte Einfang-Reagenz als ein Symbol oder eine Kombination
von Symbolen ausgestaltet sein, wie zum Beispiel ein Plus, ein Minus,
ein Häkchen,
ein Strich, eine Raute, ein Dreieck, ein Rechteck, ein Kreis, ein Oval,
ein Quadrat, ein Pfeil, eine Linie oder irgendeine Kombination davon.
Das immobilisierte Einfang-Reagenz kann als eine diskrete Einfang-Stelle
oder als ein "Band" von Reagenz auf
oder in dem festen Phase-Material bereitgestellt sein. Alternativ
kann das immobilisierte Reagenz über
einen großen
Teil des festen Phase-Materials
in einer im Wesentlichen gleichförmigen
Art und Weise verteilt werden, um die Einfang-Stelle zu bilden.
Das Ausmaß der
Signal-Erzeugung in der Patienten-Einfang-Stelle hängt mit
der Menge an Analyt in der Testprobe zusammen. Wenn eine positive
Kontrolle verwendet wird, hängt
das Ausmaß der
Signal-Erzeugung in einer positiven Kontroll-Einfang-Stelle, wenn
gewünscht,
mit der Menge an positiven Kontroll-Reagenz zusammen, das auf den
Streifen aufgebracht wurde.
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"Negatives Bindungs-Reagenz", was wechselweise
mit den Begriffen "negative
Kontrolle" oder "negatives Kontroll-Reagenz" verwendet wird,
bezieht sich auf jede Substanz, welche verwendet wird, um die Anwesenheit
von nicht-spezifischer Bindung oder Aggregation von irgendeinem
markierten Reagenz zu bestimmen. Das negative Kontroll-Reagenz kann
beispielsweise eine Substanz sein, welche spezifische Bindungsglieder
umfasst, wie zum Beispiel Antigene, Antikörper oder Antikörper-Fragmente.
Zusätzlich
kann das negative Kontroll-Reagenz abgeleitet sein von derselben
oder einer unterschiedlichen Spezies wie die anderen Reagenzien
auf dem Test-Streifen, oder von einer Kombination von zwei oder
mehr Spezies. Die Anwesenheit eines detektierbaren Signals von dem
negativen Kontroll-Reagenz auf dem Test-Streifen zeigt einen ungültigen Test
an.
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"Hilfsweise spezifisches
Bindungsglied" bezieht
sich auf irgendein Glied eines spezifischen Bindungspaares, welches
in dem Assay zusätzlich
zu den spezifischen Bindungsgliedern des Indikator-Reagenzes oder des
immobilisierten Einfang-Reagenzes verwendet wird. Eines oder mehrere
hilfsweise spezifische Bindungsglieder können in dem Assay verwendet
werden. Beispielsweise kann ein hilfsweise spezifisches Bindungsglied
in der Lage sein, das Indikator-Reagenz an den Analyten von Interesse
zu binden, in Fällen,
wo der Analyt selbst nicht direkt an das Indikator-Reagenz anheften
kann. Alternativ kann ein hilfsweise spezifisches Bindungsglied
in der Lage sein, das immobilisierte Einfang-Reagenz an den Analyten
von Interesse zu binden, in Fällen,
wo der Analyt selbst nicht direkt an das immobilisierte Einfang-Reagenz
binden kann. Das hilfsweise spezifische Bindungsglied kann in die
Assay-Vorrichtung eingeschlossen werden oder es kann zu der Vorrichtung
als eine separate Reagenzlösung
hinzugefügt
werden.
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Der "feste Phase-Träger" oder das "chromatographische
Material" oder der "Streifen" bezieht sich auf jedes
geeignete poröse,
absorbierende, saugfähige,
isotrope oder Kapillar-Material,
welches die Reaktions-Stelle der Vorrichtung einschließt und durch
welches der Analyt oder die Testprobe durch eine Kapillar- oder
Saugwirkung transportiert werden kann. Es wird anerkannt werden,
dass der Streifen aus einem einzelnen Material oder aus mehr als
einem Material gemacht sein kann (zum Beispiel können unterschiedliche Zonen,
Abschnitte, Schichten, Bereiche oder Stellen aus unterschiedlichen
Materialien gemacht sein), solange wie die vielfältigen Materialien in Fluid-Fließ- Kontakt miteinander
stehen, wobei der Durchtritt der Testprobe zwischen den Materialien
erlaubt wird. Fluid-Fließ-Kontakt
erlaubt den Durchtritt von mindestens einigen Komponenten der Testprobe,
zum Beispiel dem Analyten, zwischen den Zonen des porösen Materials,
und er ist vorzugsweise gleichförmig
entlang der Kontakt-Schnittstelle zwischen den unterschiedlichen
Zonen.
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Somit
können
natürliche,
synthetische oder natürlich
vorkommende Materialien, die synthetisch modifiziert sind, als fester
Phase-Träger
verwendet werden und sie schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf folgende: Papiere (faserige) oder Membranen (Mikro-poröse) von
Zellulose-Materialien wie zum Beispiel Papier, Zellulose und Zellulose-Derivate
wie zum Beispiel Zellulose-Acetat und Nitro-Zellulose; Glaswolle;
Gewebe, sowohl natürlich
vorkommend (zum Beispiel Baumwolle) als auch synthetisch (zum Beispiel
Nylon); poröse Gele;
und dergleichen. Das poröse
Material sollte die Erzeugung eines detektierbaren Signals nicht
beeinflussen. Das chromatographische Material kann eine eigene Stärke haben
oder die Stärke
kann durch einen zusätzlichen
Träger
bereitgestellt werden.
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Die
besonderen Ausmaße
des Streifen-Materials sind eine Frage der Bequemlichkeit, abhängig von der
Größe der Testprobe,
die eingeschlossen ist, von dem Assay-Protokoll, dem Mittel zur
Detektion und Messung des Signals und dergleichen. Zum Beispiel
können
die Ausmaße
gewählt
werden, um die Geschwindigkeit der Fluid-Migration ebenso wie die
Menge der Testprobe, die durch das chromatographische Material aufgesogen
werden soll, zu regulieren.
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Wenn
geeignet, ist es notwendig, Streifen-Ausmaße zu wählen, welche die Kombination
von vielfältigen
Streifen in einer einzelnen Assay-Vorrichtung erlauben. Es liegt
ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung an dem distalen
Ende des chromatographischen Materials ein Reagenz zu haben, welches die
Vervollständigung
eines Bindungs-Assays anzeigt (das heißt, ein Indikator für das Ende
des Assays), durch Wechseln der Farbe nach Kontakt mit der Testlösung, Einsaug-Lösung oder
einer Signal-erzeugenden Komponente. Reagenzien, welche die Farbe ändern würden nach
Kontakt mit einer Testlösung,
die Wasser enthält, sind
die dehydrierten Übergangs-Metall-Salze,
wie zum Beispiel CuSO4, Co(NO3)2 und dergleichen. pH-Indikator-Farbstoffe können auch
ausgewählt
werden, um auf den pH der gepufferten Einsaug-Lösung zu antworten. Beispielsweise
wechselt Phenolphthalein von klar (das heißt farblos) zu intensivem Pink
nach Kontakt mit einer Einsaug-Lösung,
die einen pH im Bereich zwischen 8,0 bis 10,0 hat.
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Einfang-Reagenzien
können
irgendwo entlang des Test-Streifens
in einzelnen oder mehreren Wegen lokalisiert sein, unter der Voraussetzung,
dass sie in dem Fluid-Fluss-Weg ihrer entsprechend markierten Reagenzien
lokalisiert sind. Es wird von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert
sind, verstanden, dass, wenn Fluid durch den Streifen wandert, es
wenig Querströmung
von Fluid gibt. Somit wandern alle mobilen Reagenzien, die mit dem
Fluid in Kontakt kommen, auch in die Richtung des Fluid-Flusses,
das heißt,
es gibt keine wesentliche Wanderung von Reagenzien quer zu dem Streifen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Kits für das Ausführen von Bindungs-Assays bereit.
Beispielsweise kann ein Kit gemäß der vorliegenden
Erfindung einen Test-Streifen umfassen wie zum Beispiel den Test-Streifen,
der in 12 gezeigt ist, oder er kann
alternativ die Kamm-artige oder Karten-artige Vorrichtung umfassen
mit ihren eingeschlossenen Reagenzien, ebenso wie mit einer Transport-Lösung und/oder
einem Testproben-Vorbehandlungs-Reagenz, wie oben beschrieben. Andere
Assay-Komponenten, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind,
bekannt sind, schließen
Puffer, Stabilisatoren, Wasch-Substanzen,
Bakterien-hemmende Mittel und dergleichen ein, welche ebenso in
der Assay-Vorrichtung oder in einer separaten Reagenz-Lösung vorhanden
sein können.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
wahlweise eine nicht reaktive Bedeckung (auch bezeichnet als Einschließung oder
Umhüllung)
um die Vorrichtung herum ein. Vorzugsweise schließt die Bedeckung
mindestens den Streifen ein, um Kontakt und Kontamination der Einfang-Stellen
zu vermeiden. Die Umhüllung
kann auch einen erhöhten
Bereich einschließen,
der angrenzend an das Applikations-Kissen ist, um das Aufnehmen und/oder
das Enthalten eines bestimmten Volumens an Testprobe und/oder Einsaug-Lösung zu
erleichtern. Zusätzlich
kann die Bedeckung einen Ausschnitt-Bereich oder -Bereiche in der
Form eines Buchstabens, einer Zahl, eines Piktogramms oder eines
Symbols oder irgendeiner Kombination davon einschließen. In
dieser Ausführungsform
bilden der Ausschnitts-Bereich oder die -Bereiche die Ausgestaltung
für eine
spezielle Einfang-Stelle oder Stellen, wenn der Streifen vollständig eingeschlossen
ist. Es wird bevorzugt, dass ein ausreichender Anteil des Streifens
eingeschlossen ist, um zu verhindern, dass aufgebrachte Testprobe
mit den Einfang-Stellen in Kontakt kommt, ohne zuerst durch einen
Teil des Streifens gewandert zu sein.
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Eine
andere Vorrichtungs-Komponente ist ein Testproben-Applikations-Kissen,
das ein optionales Merkmal sein kann. Das Applikations-Kissen ist
in Fluid-Fluss-Kontakt mit einem Ende des Streifen-Materials, was
als das proximale Ende bezeichnet wird, so dass die Testprobe von
dem Applikations-Kissen zu dem Streifen passieren oder wandern kann.
Der Fluid-Fluss-Kontakt kann einen physikalischen Kontakt des Applikations-Kissens
mit dem chromatographischen Material einschließen, ebenso wie die Abtrennung
des Kissens von dem Streifen durch einen dazwischen liegenden Raum
oder ein zusätzliches
Material, welches dennoch erlaubt, dass Fluid zwischen dem Kissen
und dem Streifen passiert. Im Wesentlichen kann das gesamte Applikations-Kissen
das chromatographische Material überlappen,
um der Testprobe zu ermöglichen,
durch im Wesentlichen irgendeinen Teil des Applikations-Kissens
zu dem proximalen Ende des Streifens zu passieren. Alternativ könnte nur
ein Teil des Applikations-Kissens
in Fluid-Fluss-Kontakt mit dem chromatographischen Material stehen.
Das Applikations-Kissen kann irgendein Material sein, welches die
Testprobe zu dem chromatographischen Material überführen kann und welches ein Volumen
der Testprobe absorbieren kann, das gleich oder größer ist
als die Gesamt-Volumen-Kapazität des chromatographischen
Materials.
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Materialien,
die für
die Verwendung in dem Applikations-Kissen bevorzugt sind, schließen Nitro-Zellulose,
poröse Polyethylen-Fritten
oder -Kissen und Glasfaser-Filterpapier ein. Das Material muss auch
auf seine Kompatibilität
mit dem Analyten und den Assay-Reagenzien hin ausgewählt werden.
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Zusätzlich enthält das Applikations-Kissen
typischerweise eine oder mehrere Assay-Reagenzien, entweder diffus
oder nicht diffus daran angeheftet. Reagenzien, welche in dem Applikations-Kissen enthalten
sein können,
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf markierte Reagenzien, hilfsweise spezifische Bindungs-Glieder
und Signal-erzeugende System-Komponenten, die benötigt werden,
um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Zum Beispiel wird in einem
Bindungs-Assay bevorzugt, dass das markierte Reagenz in dem Applikations-Kissen
enthalten ist. Das markierte Reagenz wird aus dem Kissen zu dem
Streifen mit der Applikation der Testprobe freigesetzt, wodurch
die Notwendigkeit, die Testprobe und das markierte Reagenz vor der Verwendung
der Vorrichtung zu kombinieren, beseitigt wird. Die Isolation von
Assay-Reagenzien in dem Applikations-Kissen hält ebenso die interaktiven
Reagenzien voneinander getrennt und erleichtert den Herstellungsprozess.
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In
einigen Fällen
dient das Applikations-Kissen auch als eine anfängliche Misch-Stelle und eine
Reaktions-Stelle für
die Testprobe und das Reagenz. In bevorzugten Ausführungsformen
wird das Applikations-Kissen-Material gewählt, um die Testprobe bei einer
Geschwindigkeit zu absorbieren, die schneller ist, als diejenige,
die durch das Streifen-Material allein erzielt wird. Typischerweise
wird das Kissen-Material gewählt,
um Fluide zwei bis fünf-mal
schneller zu absorbieren als das Streifen-Material. Vorzugsweise
wird das Kissen Fluide vier bis fünf-mal schneller absorbieren
als es das Streifen-Material tun würde.
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In
einer wahlweisen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird Gelatine verwendet, um das gesamte
oder einen Teil des Applikations-Kissens zu umfassen. Typischerweise
wird eine solche Einkapselung hergestellt durch Überschichten des Applikations-Kissens
mit Fisch-Gelatine. Der Effekt dieser Überschichtung ist, die Stabilität des Reagenzes
zu erhöhen,
das durch das Applikations-Kissen enthalten ist. Die Aufbringung
der Testprobe auf das überschichtete
Applikations-Kissen bewirkt, dass die Gelatine sich auflöst und dabei
die Auflösung
des Reagenzes ermöglicht.
In einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Reagenz-enthaltende Applikations-Kissen
getrocknet oder lyophilisiert, um die Lagerfähigkeit der Vorrichtung zu
erhöhen. Über lyophilisierte
Applikations-Kissen wurde herausgefunden, dass sie stärkere. Signale
erzeugen als luftgetrocknete Applikations-Kissen und über die
lyophilisierten Applikations-Kissen wurde herausgefunden, dass sie
die Stabilität
für längere Zeiträume aufrecht
erhalten. Die Reagenzien, die in dem Applikations-Kissen enthalten
sind, werden mit der Zugabe von Testprobe auf das Kissen rehydriert.
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Die
vorliegende Erfindung kann auch durch die Zugabe eines Filtrationsmittels
modifiziert werden. Das Filtrationsmittel kann ein separates Material
sein, das oberhalb des Applikations-Kissens oder zwischen dem Applikations-Kissen
und dem Streifen-Material
platziert wird, oder das Material des Applikations-Kissens selbst kann
nach seinen Filtrations-Fähigkeiten
ausgewählt
werden. Das Filtrationsmittel kann jeglichen Filter oder Auffang-Vorrichtung
einschließen,
die verwendet wird, um Partikel oberhalb einer bestimmten Größe aus der Testprobe
zu entfernen. Beispielsweise kann das Filtermittel verwendet werden,
um rote Blutkörperchen
von einer Probe von Vollblut zu entfernen, so dass Plasma das Fluid
ist, das von dem Applikations-Kissen empfangen wird und durch das
chromatographische Material transportiert wird.
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Wiederum
eine andere Modifikation der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung
einer zusätzlichen
Schicht oder Schichten von porösem
Material ein, das zwischen dem Applikations-Kissen und dem chromatographischen
Material oder über
dem Applikations-Kissen platziert ist. Ein solches zusätzliches
Kissen oder Schicht kann als ein Mittel dienen, um die Geschwindigkeit
des Flusses der Testprobe von dem Applikations-Kissen zu dem Streifen
zu kontrollieren. Eine solche Fluss-Regulierung wird bevorzugt,
wenn eine ausgedehnte Inkubationszeit für die Reaktion der Testprobe
und der Reagenzien in dem Applikations-Kissen gewünscht ist.
Alternativ kann eine solche Schicht zusätzliche Assay-Reagenzien enthalten,
welche vorzugsweise von den Applikations-Kissen-Reagenzien isoliert
werden, bis die Testprobe hinzugefügt wird oder sie kann dazu
dienen, unreagierte Assay-Reagenzien am Durchtritt zu dem chromatographischen
Material zu hindern.
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Wenn
kleine Mengen von nicht wässerigen
oder viskosen Testproben auf das Applikations-Kissen aufgebracht
werden, kann es notwendig sein, eine Einsaug- oder Transport-Lösung zu
verwenden, vorzugsweise eine gepufferte Lösung, um die Reagenzien und
die Testprobe von dem Applikations-Kissen und durch den Streifen
zu tragen. Wenn eine wässerige
Testprobe verwendet wird, ist eine Transport-Lösung im Allgemeinen nicht notwendig,
kann aber verwendet werden, um die Fließ-Charakteristika durch die Vorrichtung
zu verbessern oder um den pH-Wert der Testprobe einzustellen. Die
Transport-Lösung
hat typischerweise einen pH-Bereich von ungefähr 5,5 bis ungefähr 10,5
und bevorzugter von ungefähr
6,5 bis ungefähr
9,5. Der pH wird ausgewählt,
um einen signifikanten Spiegel an Bindungs-Affinität zwischen den spezifischen
Bindungsgliedern in einem Bindungs-Assay aufrecht zu erhalten. Wenn
die Marker-Komponente des Indikator-Reagenzes ein Enzym ist, muss
jedoch der pH auch ausgewählt
werden, um eine signifikante Enzym-Aktivität für die Farbentwicklung in enzymatischen
Signal-Erzeugungs-Systemen aufrecht zu erhalten. Veranschaulichende
Puffer schließen
Phosphat, Carbonat, Barbital, Diethylamin, tris(Hydromethyl)aminomethan(Tris),
Bis-Tris, 2-Amino-2-methyl-1-propanol und dergleichen ein. Die Transport-Lösung und
die Testprobe können
vor dem In-Kontakt-bringen des Applikations-Kissens kombiniert werden
oder sie können
nacheinander mit dem Applikations-Kissen in Kontakt gebracht werden.
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Vorbestimmte
Mengen an Signal-erzeugenden Komponenten und Hilfs-Reagenzien können innerhalb der
Vorrichtung eingeschlossen werden, wodurch die Notwendigkeit von
zusätzlichen
Protokoll-Schritten
oder Reagenz-Hinzufügungen
vermieden wird. Somit liegt es auch innerhalb des Schutzumfangs
dieser Erfindung, mehr als ein Reagenz bereit zu stellen, das innerhalb
des Applikations-Kissens
und/oder des Streifen-Materials immobilisiert wird.
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Diese
Erfindung stellt Assay-Vorrichtungen und Verfahren bereit, worin
die Vorrichtungen Streifen von chromatographischem Material verwenden,
das in der Lage ist, Flüssigkeiten
für die
Durchführung
eines Assays an einer Patienten-Probe oder für die Durchführung eines
multiplen Assays an einer Patienten-Probe zu transportieren. Die
Vorrichtung kann Testproben-Applikations-Kissen in Fluid-Flüssigkeits-Kontakt mit dem Streifen
einschließen,
welche derart funktionieren, dass sie den Fluss von Testprobe zu
dem chromatographischen Material regulieren, dass sie die Testproben
filtern und dass sie Assay-Reagenzien zuführen und/oder mischen. Assay-Reagenzien
können
innerhalb des Applikations-Kissens ebenso wie in dem chromatographischen
Material eingeschlossen sein. Durch Variieren der Konfiguration
von Reagenz-enthaltenden Stellen auf der Vorrichtung können qualitative
und quantitative Anzeigen von Assay-Ergebnissen erhalten werden.
Vorzugsweise sind die Reagenzien in den Vorrichtungen angeordnet,
in einer solchen Weise, dass sie den Assay im Wesentlichen selbst-durchführend machen
und um die Detektion und die Quantifizierung der Assay-Ergebnisse
zu erleichtern. Eines oder mehrere detektierbare Signale, welche
aus den Reaktionen an den Reagenz-enthaltenden Stellen resultieren
und/oder dem Bindungs-Assay können
dann durch Instrumentierung oder direkte visuelle Beobachtung detektiert
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt einen Assay bereit für die gleichzeitige
Detektion und Differenzierung von Antikörpern gegen HIV-1 Gruppe M,
HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in einer Testprobe, und eine analytische Vorrichtung,
mit welcher diese gleichzeitige Detektion und Differenzierung durchgeführt werden
kann. In einem Sandwich-Assay-Format wird die Testprobe, von der
vermutet wird, dass sie den Analyten enthält (zum Beispiel Antikörper gegen
HIV-1 Gruppe M) mit einer vorbestimmten Menge an Indikatior-Reagenz
in Kontakt gebracht (in diesem Beispiel markierte Anti-Spezies-Antikörper [Ab*]),
um eine Reaktionsmischung zu bilden, welche einen Analyt/Indikator-Reagenz-Komplex enthält (Ab-Ab*).
Das Indikator-Reagenz (Ab*) kann getrennt sein von oder vorzugsweise
innerhalb der Test- Vorrichtung
eingeschlossen sein. Die resultierende Reaktionsmischung wandert
dann durch den Teststreifen. Die Reaktionsmischung kommt in Kontakt
mit den Einfang-Reagenz-Stellen
(eine für
HIV-1 Gruppe M, eine für
HIV-1 Gruppe 0 und eine für
HIV-2), welche ein separat immobilisiertes Analyt-spezifisches Bindungsglied
([I-Ag]) enthalten, das an eine Stelle auf dem Analyten bindet, die
unterschiedlich ist von dem Indikator-Reagenz. Das Einfang-Reagenz
ist daher in der Lage, an den Ab-Ab*-Komplex zu binden, um einen
immobilisierten I-Ab-Ag-Ab*-Komplex
zu bilden, der an der Einfang-Reagenz-Stelle detektierbar ist. Desweiteren
kann die Reaktionsmischung auch weiter durch den Teststreifen wandern
und mit Reagenz reagieren, das in dem Ende der Assay-Indikator-Stelle
vorhanden ist.
-
Bezugnehmend
auf 13 umfasst die Test-Vorrichtung
(18) für
den Assay einen Nitro-Zellulose-Membran-Streifen (24),
auf welchen ausgewählte
spezifische und hoch-gereinigte rekombinante Antigene, die von der
jeweiligen gp41 Region von HIV-1 Gruppe M (26), HIV-1 Gruppe
0 (28) und HIV-2 (30) abgeleitet sind, platziert
werden und in getrennten unterschiedlichen Einfang-Bereichen trocknen
gelassen werden. Die Test-Vorrichtung (18) umfasst weiterhin
ein Konjugat-Kissen (32), das einen Glasfaser-Filter (34)
umfasst, der ein Selen-Kolloid vorlegt, das mit einem Anti-Spezies-Antikörper empfindlich
gemacht wurde (zum Beispiel Ziegen-anti-Human IgG), der in einem
Fluid suspendiert ist, das Nitro-Zellulose blockierende Proteine
enthält, das
vor dem Zusammenbau getrocknet wurde und an das distale Ende (20)
der Nitro-Zellulose-Membran (24) fixiert wurde. Die gesamte
Vorrichtung (18) wird andauernd am Platz gehalten durch
ein oben klares laminierendes Material (36), das eine klebende
Oberfläche
(38) trägt
in Kontakt mit der oberen Oberfläche
der Nitro-Zellulose-Membran
(24) und an das Konjugat-Kissen (20) angeheftet,
und ein laminierendes Boden-Material (48), das eine klebende
Oberfläche
(38) in Kontakt mit der unteren Oberfläche (48) der Nitro-Zellulose-Membran
(24) trägt.
Das Test-Fluid fließt
von dem distalen Ende (20) zu dem proximalen Ende (22)
und kommt in Kontakt mit jeder der drei separaten unterschiedlichen
Einfang-Bereiche. Die Vorrichtung kann auch ein Testproben-Kissen
und eine Reaktivitäts-Zone
(40) haben, auf welche Anti-Spezies (das heißt anti-menschliches)
Konjugat platziert wird. Die Vorrichtung hat auch vorzugsweise einen
Löscher
(„blotter", 44), um
irgendwelches zurückbleibendes
Fluid in der Vorrichtung zu absorbieren, und hat eine Stelle für das Anzeigen
der Vervollständigung
des Assays (46). Die Anzeige (in den Einfang-Bereichen
und/oder in der Testproben-Reaktivitäts-Zone) kann entweder eine direkte visuelle
Anzeige ohne die Hilfe von Labor-Ausrüstung oder durch eine Instrument
automatisiert sein. Des weiteren kann die Test-Vorrichtung in einem
Gehäuse
(42) aus Form-gepresstem Plastik oder einem anderen geeigneten
Material eingeschlossen sein.
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Der
Assay wird wie folgt durchgeführt.
Testprobe, wie zum Beispiel menschliches Serum, vorzugsweise davor
in Puffer verdünnt
(Elutions-Puffer, bestehend aus 50 mM TRIS (pH 8,4), 1% m/v festes
Rinder-Serum-Albumin [BSA], 0,4% v/v Triton X-405®, 1,5%
m/v Casein, 3% m/v Rinder-IgG, 4% m/v E. coli-Lysat, pH 8,2; Verdünnung bei
1 μl Serum
auf 100 μl
Elutions-Puffer), wird mit dem Anti-IgG-Kolloit-Konjugat an dem
distalen Ende (20) der Test-Vorrichtung in Kontakt gebracht.
IgG in der Testprobe wird durch das Anti-IgG-Kolloid gebunden und
die Komplexe werden entlang der Länge des Absorptions-Kissens
chromatographiert (vorzugsweise Nitro-Zellulose-Membran). Wenn die
Komplexe fließen, überqueren
sie die einzelnen Zonen (13, Stellen 30, 26 und 28),
in welchen die HIV-rekombinanten Antigene zuvor aufgebracht wurden.
Wenn die Komplexe spezifische Antikörper zu den rekombinanten Antigenen
in irgendeiner der einzelnen Zonen enthalten, findet eine Reaktion
statt und es erscheinen rote Farbzonen in der/den geeigneten Zone(n).
Vielfache Spezifitäten
können
gleichzeitig bestimmt werden. Zusätzlich sollte eine positive
Kontrolle, die aus einer gepoolten Testprobe besteht, die für alle drei
getesteten Antigene positiv ist, positiv in allen drei Zonen reagieren.
Alternativ kann eine positive Kontroll-Probe, die mit jedem der
Antigene in dem Test reaktiv ist, separat für jeden Analyten laufen gelassen
werden, für
welchen Antikörper
untersucht werden.
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Es
wird in Erwägung
gezogen und es liegt innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden
Erfindung, dass Antikörper-Analyte gegen HIV-1
Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2 in diesen Assays detektierbar
sind durch die Verwendung eines synthetischen rekombinanten oder
gereinigten Polypeptids, das die gesamte oder einen Teil der Polypeptid(aminosäure)Sequenzen
umfasst, die hierin beschrieben sind, als das Einfang-Reagenz. "Gereinigtes Protein" (oder "gereinigtes Polypeptid") bedeutet ein Polypeptid
von Interesse oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen frei
ist, das heißt
weniger als ungefähr
50%, vorzugsweise weniger als ungefähr 70% und am meisten bevorzugt
weniger als ungefähr
90% von Zell-Komponenten enthält,
mit welchen das Polypeptid von Interesse natürlicherweise assoziiert ist.
Verfahren zur Reinigung sind im Fachgebiet bekannt. Ein "rekombinantes Polypeptid" oder "rekombinantes Protein" oder "Polypeptid, hergestellt
durch rekombinante Techniken",
welche Begriffe hierin miteinander austauschbar verwendet werden,
beschreibt ein Polypeptid, das durch seinen Ursprung oder durch
Manipulation nicht mit allen oder einem Teil des Polypeptids assoziiert
ist, mit welchem es natürlicherweise
assoziiert ist und/oder ist an einen Polypeptid geknüpft, das
anders ist als das, an welches es natürlicherweise gebunden ist.
Ein rekombinantes oder kodiertes Polypeptid oder Protein wird nicht
notwendigerweise von einer bestimmten Nukleinsäure-Sequenz translatiert. Es
kann auch in irgendeiner Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer
Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressions-Systems.
Des weiteren bedeutet der Ausdruck "synthetisches Peptid", wie hierin verwendet, eine polymere
Form von Aminosäuren
jeglicher Länge,
welche chemisch synthetisiert werden kann durch Verfahren, die einem
Fachmann wohl bekannt sind. Diese synthetischen Peptide sind in
zahlreichen Anwendungen nützlich.
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Das
bevorzugte Einfang-Reagenz für
HIV-1 Gruppe 0 umfasst eine Polypeptid-Sequenz, die gewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnr. 48, Sequenzidentifikationsnr.
50, Sequenzidentifikationsnr. 52, und Sequenzidentifikationsnr.
54; Sequenzidentifikationsnr. 58, und Sequenzidentifikationsnr. 60,
wobei das Einfang-Reagenz für
HIV- 1 Gruppe M Sequenzidentifikationsnr.
56 umfasst und das Einfang-Reagenz
für HIV-2
umfasst Sequenzidentifikationsnr. 55. Es wird bevorzugt, dass diese
Polypeptide durch rekombinante Technologie hergestellt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden,
welche dazu gedacht sind, den Geist und den Schutzumfang der Erfindung
zu veranschaulichen aber nicht einzuschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1. Klonierung
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Oligonukleotide
für die
Gen-Konstruktion und Sequenzierung wurden bei Abbott Laboratories,
Synthetic Genetics (San Diego, CA) oder Oligo Etc. (Wilsonville,
CA) synthetisiert. Alle Polymerase-Ketten-Reaktions-(PCR)-Reagenzien,
einschließlich
AmpliTaq DNA Polymerase und UITma DNA Polymerase, wurden von Perkin-Elmer
Corporation (Forster City, CA) erworben und entsprechend den Hersteller-Angaben
verwendet, solange nichts anderes angegeben ist. Die PCR-Amplifikationen
wurden auf einem GeneAmp 9600 thermal cycler (Perkin-Elmer) durchgeführt. Solange
nicht anders angegeben, wurden die Restriktions-Enzyme von New England
BioLabs (Beverly, MA) erworben und die Verdauungen wurden wie vom
Hersteller empfohlen durchgeführt.
DNA-Fragmente, die für
die Klonierung verwendet wurden, wurden auf Agarose(Life Technologies,
Gaithersburg, MD)-Gelen isoliert, solange nicht anders angegeben.
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Die
gewünschten
Fragmente wurden entfernt und die DNA wurde mit einem QIAEX II Gel-Extraktions-Kit
oder dem QIAquick Gel-Extraktions-Kit
extrahiert (Qiagen Inc., Chatsworth, CA), wie vom Hersteller empfohlen.
Die DNA wurde in H2O oder TE [1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA;
pH 8,0; BRL Life Technologies), 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid
(Tris-HCl; pH 8,0; BRL Life Technologies)] resuspendiert. Die Ligationen
wurden unter Verwendung eines Stratagene DNA-Ligations-Kits durchgeführt (Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, CA), wie vom Hersteller empfohlen. Die
Ligationen wurden bei 16°C über Nacht
inkubiert.
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Die
bakteriellen Transformationen wurden durchgeführt unter Verwendung von MAX
EFFICIENCY DH5α kompetenten
Zellen (BRL Life Technologies) oder Epicurian Coli XL1-Blue super-kompetenten
Zellen (Stratagene Cloning Systems) gemäß den Protokollen des Herstellers.
Solange nicht anders angegeben, wurden die Transformationen und
die bakteriellen Ausstreifungen geschichtet auf LB Agar-(Lennox)-Platten
mit 150 μg/ml
Ampicillin (M1090; MicroDiagnostics, Lombard, IL) oder auf LB Agar
+ Ampicillin-Platten,
ergänzt mit
Glucose auf eine Endkonzentration von 20 mM, wie angegeben. Alle
bakteriellen Inkubationen (Platten und Über-Nacht-Kulturen) wurden über Nacht
(~16 Stunden) bei 37°C
durchgeführt.
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Das
Screening von Transformanden, um gewünschte Klone zu identifizieren,
wurde durch die Sequenzierung von Miniprep DNA und/oder durch Kolonie-PCR
erzielt. Miniprep DNA wurde hergestellt mit einem Qiagen Tip 20
Plasmid Prep-Kit oder einem Qiagen QIAwell 8 Plasmid Prep-Kit, gemäß den Ausführungen
des Herstellers, solange nicht anders angegeben. Für das Kolonie-PCR-Screening wurden
einzelne Kolonien aus den Transformations-Platten herausgenommen und in eine Auskerbung
in einer sterilen Flach-Boden 96-Auskerbungs-Platte überführt (Costar,
Cambridge, MA), welche 100 μl
steriles H2O enthielt. Ein Drittel des Volumens
wurde auf eine zweite Platte überführt und
bei 4°C
gelagert. Die ursprüngliche
96-Auskerbungen-Platte wurde für
5 Minuten in die Mikrowelle gegeben, um die Zellen zu zerreißen. 1 μl Volumen
wurde dann auf ein PCR-Röhrchen
als Matrize überführt. 9 μl einer PCR-Master-Mischung,
die 1 μl
10 × PCR-Puffer, 1 μl 2 mM dNTPs,
1 ml (10 pmol)-Sense-Primer, 1 μl
(10 pmol)-Anti-Sense-Primer, 0,08 μl AmpliTaq DNA Polymerase (0,4
Einheiten) und 4,2 μl
H2O enthielt, wurde zu dem PCR-Röhrchen hinzugefügt. Die
Reaktionen wurden im Allgemeinen für 20 bis 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden,
50 bis 60°C
(abhängig
von den Primer-Annealing-Temperaturen) für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden
amplifiziert. Die Primer waren abhängig von den Insert- und Zyklus-Bedingungen,
wurden modifiziert basierend auf den Primer-Annealing-Temperaturen und
der Länge
des erwarteten Produkts. Nach der Zyklisierung wurde ungefähr ein Drittel
des Reaktions-Volumens auf ein Agarose-Gel für die Analyse geladen. Kolonien,
welche die gewünschten
Klone enthielten, wurden von der Transfer-Platte vermehrt.
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Solange
nicht anderweitig angegeben, wurde die DNA-Sequenzierung auf einem automatisierten ABI-Modell
373 Stretch Sequencer (Perkin-Elmer) durchgeführt. Die Sequenzierungs-Reaktionen wurden
mit Reagenzien von einem FS TACS Dye Term Ready Reaction-Kit (Perkin-Elmer)
und 250 bis 500 ng Plasmid-DNA,
entsprechend den Ausführungen
des Herstellers aufgestellt. Die Reaktionen wurden auf Centri-Sep-Säulen verarbeitet
(Princeton Separations, Adelphia, NJ), bevor sie auf den Sequencer
geladen wurden. Die Sequenz-Daten wurden analysiert unter Verwendung
des Sequencher 3,0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) und GeneWorks
2,45 (Oxford Molecular Group, Inc., Campbell, CA).
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Beispiel 2. Bestimmung
der env-Sequenz des HIV-I Gruppe 0 Isolats HAM112
-
Virale
RNA wurde extrahiert aus Kultur-Überständen von
menschlichen peripheren mononuklearen Blut-Zellen, die mit dem HIV-1
Gruppe 0 Isolat infiziert wurden, bezeichnet als HAM112 (H. Hampl
et al., supra), unter Verwendung eines QIAamp Blut-Kits (Qiagen) und
dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Die RNA wurde in einem
50 μl Volumen
von Nuklease-freiem Wasser (5Prime-3Prime, Inc., Boulder, CO) eluiert
und bei –70°C gelagert.
Die Strategie zum Erhalten der env-Region-Sequenz schloss die cDNA-Synthese
und die PCR (nested) Amplifikation von vier überlappenden env-Gen-Fragmenten
ein. Die amplifizierten Produkte wurden direkt auf einem automatisierten
ABI-Modell 373 Stretch-Sequencer sequenziert. Die Amplifikations-Reaktionen
wurden mit GeneAmp RNA-PCR und GeneAmp PCR-Kits (Perkin-Elmer) ausgeführt, wie
vom Hersteller angegeben. Oligonukleotid-Primer-Positionen entsprechen der HIV-1 ANT70
env-Sequenz (G. Myers et al., Hrsg., supra). Die Primer env10R [Nukleotid
(nt) 791–772;
Sequenzidentifikationsnr. 62], env15R (nt 1592–1574; Sequenzidentifikationsnr.
63), env22R (nt 2321–2302;
Sequenzidentifikationsnr. 64), env26R (nt 250–232 3' von env; Sequenzidentifikationsnr.
65) wurden jeweils für
die cDNA-Synthese
von Fragmenten 1–4 verwendet.
Reverse Transkriptions-Reaktionen
wurden bei 42°C
für 30
Minuten, dann bei 99°C
für 5 Minuten inkubiert.
Die erste Runde PCR-Amplifikationen bestand aus 30 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden,
52°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 1 Minute,
unter Verwendung der Primer-Kombinationen: env1F (nt 184–166 5' von env; Sequenzidentifikationsnr.
66) und env10R (Sequenzidentifikationsnr. 62), env7F (nt 564–586; Sequenzidentifikationsnr.
67) und env15R (Sequenzidentifikationsnr. 63), env12F (nt 1289–1308; Sequenzidentifikationsnr.
68) und env22R (Sequenzidentifikationsnr. 64), env19F (nt 2020–2040; Sequenzidentifikationsnr.
69) und env26R (Sequenzidentifikationsnr. 65) jeweils für Fragmente
1 bis 4. Für
die zweite Runde der Amplifikation (nested PCR) wurden 5 μl der entsprechenden
PCR-Reaktionen der ersten Runde als Matrize verwendet, zusammen
mit den Primer-Kombinationen env2F (nt 37–15 5' von env; Sequenzidentifikationsnr.
70) und env9R (nt 740–721;
Sequenzidentifikationsnr. 71), env8F (nt 631–650; Sequenzidentifikationsnr.
72) und env14R (nt 1437–1416;
Sequenzidentifikationsnr. 73), env13F (nt 1333–1354; Sequenzidentifikationsnr.
74) und env21R (nt 2282–2265;
Sequenzidentifikationsnr. 75), env20F (nt 2122–2141; Sequenzidentifikationsnr. 76)
und env25R (nt 111–94
3' von env; Sequenzidentifikationsnr.
77) jeweils für
Fragmente 1 bis 4. Die Bedingungen der zweiten Runde Amplifikation
waren identisch mit denjenigen, die für die erste Runde verwendet wurden.
Fragmente wurden Agarose-Gel gereinigt und mit einem Qiagen QIAEX
II Gel-Extraktions-Kit
extrahiert. Die Fragmente wurden direkt mit den Primern sequenziert,
die für
die nested PCR verwendet wurden, zusammen mit Primern env4F (Sequenzidentifikationsnr.
78) und env5R (Sequenzidentifikationsnr. 79) für Fragment 1; Primer env10F
(Sequenzidentifikationsnr. 80), env11F (Sequenzidentifikationsnr.
81), env11r (Sequenzidentifikationsnr. 82), env12F (Sequenzidentifikationsnr.
68) und AG1 (Sequenzidentifikationsnr. 87) für Fragment 2; Primer env15F
(Sequenzidentifikationsnr. 83) und env19R (Sequenzidentifikationsnr.
84) für
Fragment 3; Primer env22F (Sequenzidentifikationsnr. 85) und env24R
(Sequenzidentifikationsnr. 86) für
Fragment 4. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von env aus dem
HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM112 (Sequenzidentifikationsnr. 61) ist
in 1 gezeigt.
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Beispiel 3. Konstruktion
von synthetischen HIV-1 Gruppe 0 env gp120/gp41 Genen
-
2 zeigt
die Strategie, die verwendet wurde, um synthetische HIV-1 Gruppe
0 env gp120/gp41 Gen-Konstrukte zu erzeugen. Die env gp120/gp41
Sequenzen basierten auf dem HIV-1 Gruppe 0 Isolat HAM112 (Sequenzidentifikationsnr.
61) (H. Hampl et al.). Die Bestimmung der env-Sequenz von HAM112
wird in Beispiel 2 hierin oben gezeigt. Oligonukleotide wurden entwickelt,
welche die C-terminalen 45 Aminosäuren der env gp120 und 327
Aminosäuren
von env gp41 kodieren (Nukleotid #1 ist die erste Base des ersten
Kodons von gp120 in dem synthetischen Gen). Das synthetische Gen
hat eine 26 Aminosäure-Deletion
(Nukleotide 643 bis 720), relativ zu dem nativen HAM112 gp41, das
eine hochgradig hydrophobe (H) Region (Transmembran-Region) von
gp41 umfasst. Somit hat das synthetische Gesamtlängen-gp41-Gen, das konstruiert wurde, 327 Aminosäuren.
-
In
den synthetischen Oligonukleotiden wurden die nativen HIV-1 Kodons
verändert,
um mit der E. coli Kodon-Neigung übereinzustimmen in dem Versuch,
die Expressions-Spiegel des rekombinanten Proteins in E. coli zu
erhöhen.
Siehe zum Beispiel M. Gouy und C. Gautier, Nucleic Acids Research
10: 7055 (1982); H. Grosjean und W. Fiers, Gene 18: 199 (1982);
J. Watson et al. (Hrsg.), Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe,
Benjamin Kumming Publishing Co., Seiten 440 (1987). Die Gen-Konstruktions-Strategie
schloss die Synthese einer Serie von überlappenden Oligonukleotiden
mit komplementären
Enden (Osyn-A bis Osyn-L, dargestellt als A bis L) ein. Wenn annealed,
dienten die Enden als Primer für
die Verlängerung
des komplementären Strangs.
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Die
Fragmente wurden dann durch PCR amplifiziert. Dieses Verfahren ("PCR-Knitting" Verknüpfung von
Oligonukleotiden) wurde wiederholt, um nach und nach das Gen-Fragment
zu vergrößern. Oligonukleotid Osyn-5' wurde für die Klonierung
in den pL-Vektor pKRR826 entwickelt. Der Expressions-Vektor pKRR826
ist eine modifizierte Form des Lambda pL-Promotor-Vektors pSDKR816,
beschrieben in dem US-Patent 5,859,193. pKRR826 ist ein Derivat
mit einer hohen Kopie-Anzahl von pBR322, das das Temperatur-empfindliche
cI-Repressor-Gen enthält
(Benard et al., Gene 5: 59 [1979]). Jedoch fehlt dem pKRR826 der
translationale Terminator rrnBtJ und es hat die Lambda pL- und Lambda
pR-Promotoren in
der umgekehrten Richtung relativ zu pSDKR816. Die Polylinker-Region
von pKRR826 enthält
EcoRi und BamHI-Restriktions-Enzym-Stellen
und ihr fehlt ein ATG-Start-Kodon. Eine optimale Expression wird
erhalten, wenn das 5'-Ende
des Gen-Inserts (einschließlich
eines N-terminalen Methionins) in die EcoRi-Stelle kloniert wird.
Osyn-5' wurde entwickelt, um
eine EcoRi-Restriktions-Stelle für
die Klonierung und ein ATG-Kodon
(Methionin) zu enthalten, um eine geeignete translationale Initiierung
des rekombinanten Proteins bereit zu stellen. Die Anti-Sense Oligonukleotide Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr.
15), Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) und Osyn-M (M) (Sequenzidentifikationsnr. 14) enthalten jeweils
zwei sequenzielle translationale Terminations-Kodons (TAA, TAG)
und eine BamHI-Restriktions-Stelle. Wenn die außerhalb-Primer Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11) und Osyn-M
(M) (Sequenzidentifikationsnr. 14) verwendet wurden, wurde ein Gesamtlängen-gp41(327
Aminosäuren)-Gen
synthetisiert (pGO-11PL; Sequenzidentifikationsnr. 52). Die außerhalb-Oligonukleotide
Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr.
11) und Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr.
15) resultierten in einem abgestumpften gp41-Produkt von 199 Aminosäuren (pGO-9PL;
Sequenzidentifikationsnr. 48). Alternativ resultierten die außerhalb-Oligonukleotide
Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr.
11) und Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) in einem abgestumpften gp41-Produkt mit 169 Aminosäuren in
der Länge (pGO-8PL;
Sequenzidentifikationsnr. 58).
-
Die
synthetischen Gene wurden auch als CMP-KDO-Synthetase(CKS)-Fusions-Proteine
exprimiert. Der PCR-vermittelte Transfer der synthetischen Gene
von pKRR826 in pJO200, beschrieben in
EP
0 472 207 , wurde erreicht mit einem alternativen außerhalb-Sense-Oligonukleotid-PCR-Primer
(5'-Ende), Osyn-5'CKS (Sequenzidentifikationsnr.
25). Osyn-5'CKS
enthielt eine EcoRI-Restriktions-Stelle
und resultierte in der In-Frame-Fusion des synthetischen Gen-Inserts
in CKS in dem Expressions-Vektor pJO200. Die 3'-außerhalb-Primer
(Anti-Sense) Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr. 14), Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr.
15) und Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) wurden in Kombination mit Osyn-5'CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 25) verwendet, um pGO-11CKS (Sequenzidentifikationsnr.
54), pGO-9CKS (Sequenzidentifikationsnr. 50) beziehungsweise pGO-8CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 60) zu erzeugen. Diese Schritte sind
im Detail hierin unten beschrieben.
-
A. PCR-Knitting(-Verknüpfung) von
synthetischen Oligonukleotiden
-
Drei
PCR-Reaktionen (100 μl
Volumen) wurden wie folgt erstellt:
- (1) Reaktion
1B: AmpliTaq DNA Polymerase (2,5 U) und 1 × Puffer, zusammen mit 40 μM von jedem
dNTP (dAPT, dCTP, dGTP und dTTP), 25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden
Osyn-A (Sequenzidentifikationsnr. 3) und Osyn-D (Sequenzidentifikationsnr.
5) und 0,25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-B (Sequenzidentifikationsnr.
17) und Osyn-C (Sequenzidentifikationsnr.
4);
- (2) Reaktion 2A: UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer,
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 25 pmol von jedem der Oligonukleotide Osyn-E (Sequenzidentifikationsnr.
6) und Osyn-H (Sequenzidentifikationsnr. 9) und 0,25 pmol jeweils
von den Oligonukleotiden Osyn-F (Sequenzidentifikationsnr. 7) und
Osyn-G (Sequenzidentifikationsnr. 8); und
- (3) Reaktion 3B: UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer,
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 25 pmol jeweils von den Oligonukleotiden Osyn-I (Sequenzidentifikationsnr.
10) und Osyn-L (Sequenzidentifikationsnr. 13) und 0,25 pmol jeweils
von den Oligonukleotiden Osyn-J (Sequenzidentifikationsnr. 18) und
Osyn-K (Sequenzidentifikationsnr. 12).
-
Die
Amplifikationen bestanden aus 20 Zyklen von 97°C für 30 Sekunden, 52°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 60
Sekunden. Die Reaktionen wurden dann bei 72°C für 7 Minuten inkubiert und bei
4°C gehalten. Die
PCR-abgeleiteten Produkte 1B, 2A und 3B wurden auf einem 1% Agarose-Gel
Gel-isoliert.
-
B. PCR-Knitting(-Verknüpfung) von
PCR-Produkten aus der Reaktion 1B und der Reaktion 2A
-
Eine
PCR-Reaktion wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U)
und 1 × Puffer,
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 24,4 pmol von Oligonukleotid Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr. 11), 25
pmol von Oligonukleotid Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) und ~10 ng jeweils von den Gel-isolierten 1B- und 2A-Produkten
aus Beispiel 3, Abschnitt 1A, hierin oben. Die Zyklisierungsbedingungen waren
dieselben wie in Beispiel 3, Abschnitt 1A. Eine zweite Amplifikations-Runde wurde verwendet,
um mehr von dem gewünschten
Produkt zu erzeugen. Diese wurde durchgeführt durch die Herstellung einer
UITma-Mischung, wie hierin oben beschrieben (100 μl Reaktions-Volumen) mit 49 pmol
Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr.
11), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) und 5 μl
des PCR-Produkts
aus der ersten Runde als Matrize. Diese Reaktionen wurden bei 94°C für 90 Sekunden
inkubiert und dann verwendet, gecycelt wie oben (Abschnitt 3A).
Das Osyn-5'/Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde Gel-isoliert
wie hierin oben beschrieben.
-
C. Klonierung des Osyn-5'-Osyn-P3'-PCR-Produkts
-
Das
Osyn-5'-Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde
mit den Restriktions-Endonukleasen EcoRI + BamHI verdaut und in
den Vektor pKRR826 ligiert (beschrieben hierin oben), welcher mit
EcoRI + BamHI verdaut wurde und Gel-isoliert wurde. Das Ligations-Produkt
wurde verwendet, um DH5α kompetente
Zellen zu transformieren. Der gewünschte Klon wurde durch Kolonie-PCR
identifiziert, unter Verwendung von Oligonukleotiden pKRREcoRI Forward
(Sequenzidentifikationsnr. 38) und pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr.
39). Miniprep DNA wurde hergestellt aus einer Über-Nacht-Kultur von pGO-8
Kandidatklon A2 und das Osyn-5'-Osyn-P3'-Plasmid-Insert wurde
mit den Oligonukleotid-Primern
pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse
(Sequenzidentifikationsnr. 39), 41sy-1 (Sequenzidentifikationsnr.
44) und 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41) sequenziert.
-
D. Modifikation des pGO-8
Kandidatklons A2
-
Eine
100 μl Volumen-PCR-Reaktion
wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Oligonukleotiden Osyn-5'-repair (Sequenzidentifikationsnr.
24), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr.
16) und ~1 ng von pGO-8 Kandidatklon Miniprep DNA als Matrize A2
(erhalten aus den Reaktionen, die hierin oben bekannt gemacht wurden). Die
Reaktion wurde bei 94°C
für 90
Sekunden inkubiert und dann mit 20 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 60
Sekunden amplifiziert. Das Osyn-5'-repair/Osyn-P3'-PCR-Produkt wurde dann Gel-isoliert
und mit EcoRI + BamHI verdaut. Das verdaute Produkt wurde in EcoRI
+ BamHI verdauten pKRR826-Vektor ligiert. Das Ligations-Produkt
wurde verwendet, um DH5α kompetente
Zellen zu transformieren. Der gewünschte Klon wurde identifiziert
durch Kolonie-PCR, unter Verwendung von Oligonukleotiden pKRREcoRI
Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38) und pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr.
39). Eine Über-Nacht-Kultur
des pGO-8 Kandidatklons 6 wurde zusammengestellt und eine Miniprep-DNA
wurde hergestellt. Das Osyn-5'repair/Osyn-P3'-Plasmid-Insert wurde
sequenziert mit den Oligonukleotid-Primern pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr.
38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39) 41sy-1 (Sequenzidentifikationsnr.
44) und 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41). Basierend auf den
Sequenzierungs-Resultaten wurde der pGO-8 Kandidatklon #6 bezeichnet
als pGO-8PL/DH5α.
Sequenzidentifikationsnr. 57 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden
Region. 5 zeigt die Aminosäure-Sequenz
des pGO-8PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 58).
Das pGO-8PL rekombinante Protein besteht aus einem N-terminalen
Methionin, 45 Aminosäuren
von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112-Isolat) und 169 Aminosäuren von
env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112-Isolat).
-
E. Konstruktion von pGO-8CKS/XL1
-
pGO-8CKS/XL1
(Sequenzidentifikationsnr. 59 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden
Region) kodiert das rekombinante Protein pGO-8CKS. 6 zeigt
die Aminosäure-Sequenz von pGO-8CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 60). Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von
CKS/Polylinker, 45 Aminosäuren
von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 169 Aminosäuren von
env gp41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von pGO-8CKS/XL1
wurde wie folgt erreicht.
-
Eine
PCR-Reaktion (100 μl
Volumen) wurde mit UITma DNA-Polymerase
(3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-P3' (Sequenzidentifikationsnr. 16) und
1 ng pGO-8PL Klon #6 Miniprep-DNA versehen. Die Reaktion wurde bei
94°C für 90 Sekunden
inkubiert, dann mit 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden;
72°C für 90 Sekunden
amplifiziert. Dann wurde das Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt Gel-isoliert. EcoRI + BamHI
verdauten das Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt und
den Vektor pJO200. Der verdaute pJO200 Vektor wurde Gel-isoliert
und an verdautes Osyn-5'CKS/Osyn-P3'-PCR-Produkt ligiert.
XL1-Blue superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert
und auf LB + Ampicillin-Platten platziert, welche mit 20 mM Glucose
ergänzt
waren. Kolonien wurden für
die Isolation auf dem selben Typ von Platten wieder ausgestrichen.
Eine Über-Nacht-Kultur
des Klons pGO-8CKS/XL-1 wurde in LB-Brühe + 100 μg/ml Carbenicillin (sigma Chemical
Co.) + 20 mM Glucose (Sigma Chemical Co.) gezüchtet. Gefrorene Vorräte (0,5
ml Über-Nacht-Kultur
+ 0,5 ml Glycerol) wurden hergestellt und die DNA wurde für die Sequenz-Analyse zubereitet.
Die folgenden Oligonukleotide wurden als Sequenzierungs-Primer verwendet:
CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30), CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr.
31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr. 32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr.
33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr. 2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr.
1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr. 29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr.
34), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr. 19) und CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr.
20).
-
F. Konstruktion von pGO-9PL/DH5α
-
3A bis 3D zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-9PL/DH5α involviert
sind. pGO-9PL/DH5α kodiert
das rekombinante Protein pGO-9PL. Sequenzidentifikationsnr. 47 zeigt
die Nukleotid-Sequenz
von der kodierenden Region von pGO-9PL/DH5α. 7 zeigt
die Aminosäure-Sequenz
des pGO-9PL rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 48).
Dieses Protein besteht aus einem N-terminalen Methionin, 45 Aminosäuren von
env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 199 Aminosäuren von
env gp 41 (HIV-1
Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von pGO-9PL/DH5α wurde wie
folgt erzielt.
-
Schritt
1. Eine 100 μl
PCR-Reaktion wurde mit UITma DNA-Polymerase
(3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr.
11), 50 pmol von Osyn-H (Sequenzidentifikationsnr. 9) und ~2 ng
von pGO-8 Kandidatklon 6 Miniprep-DNA (erhalten aus Beispiel 3,
Abschnitt D, hierin oben) als Matrize zusammengestellt. Die Reaktion
wurde bei 94°C
für 120
Sekunden inkubiert und dann mit 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden
und 72°C für 60 Sekunden
amplifiziert.
-
Schritt
2. Eine 100 μl
PCR-Reaktion wurde mit UITma DNA-Polymerase
(3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Osyn-5' (Sequenzidentifikationsnr.
11), 50 pmol Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr.
15) und 10 μl
der PCR-Reaktion aus Schritt 1 als Matrize zusammengestellt. Die
Reaktion wurde bei 94°C
für 120
Sekunden inkubiert, dann mit 18 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden,
72°C für 60 Sekunden
inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten.
-
Das
Osyn-5'/Osyn-O3'-PCR-Produkt wurde
dann Gel-isoliert und mit EcoRI + BamHI verdaut. Das verdaute Produkt
wurde in EcoRI + BamHI verdauten pKRR826-Vektor ligiert. Das nächste Ligations-Produkt
wurde verwendet, um DH5α kompetente
Zellen zu transformieren. Eine Über-Nacht-Kultur
des pGO-9PL Kandidatklons 3 wurde zusammengestellt und eine Miniprep-DNA
wurde hergestellt. Das Osyn-5'/Osyn-O3'-Plasmid-Insert wurde
mit den folgenden Oligonukleotiden als Primer sequenziert: pKRREcoRI
Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI Reverse (Sequenzidentifikationsnr.
39), 41sy-1C (Sequenzidentifikationsnr. 40), 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr.
41, 41sy-3 (Sequenzidentifikationsnr. 42) und 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr.
23). Der pGO-9PL Klon #3 wurde dann wieder für die Isolation ausgestrichen.
Eine isolierte Kolonie wurde aufgenommen, eine Über-Nacht-Kultur davon wurde
gezüchtet
und ein gefrorener Vorrat (0,5 ml Glycerol + 0,5 ml Über-Nacht-Kultur)
wurde hergestellt. Der Vorrat wurde bei –80°C gelagert. Die Sequenz wurde bestätigt unter
Verwendung der Primer, die hierin oben angegeben sind, und dieser
Klon wurde als pGO-9PL/DH5α bezeichnet
(Sequenzidentifikationsnr. 47 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden
Region und Sequenzidentifikationsnr. 48 zeigt die Aminosäure-Sequenz
der kodierenden Region). pGO-9PL/DH5α wurde wieder ausgestrichen,
eine Über-Nacht-Kultur
wurde gezüchtet
und eine Miniprep-DNA wurde hergestellt (diese prep wurde als H5
bezeichnet).
-
G. Konstruktion von pGO-9CKS/XL1
-
3A bis 3D zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-9CKS/XL1 involviert sind. pGO-9CKS/XL1 kodiert das rekombinante
Protein pGO-9CKS. 8 zeigt die Aminosäure-Sequenz
des pGO-9CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 50).
Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von CKS und einem Polylinker,
gefolgt von 45 Aminosäuren
von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 199 Aminosäuren von
env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). Die Konstruktion von
pGO-9CKS/XL1 wurde wie folgt erzielt.
-
Zwei
PCR-Reaktionen (100 μl
Volumen) wurden mit UITma DNA-Polymerase
(3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1,5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-O3' (Sequenzidentifikationsnr. 15) und
einem 1 ng pGO-9PL Kandidatklon 3 Miniprep-DNA (erhalten aus Beispiel
3, Abschnitt F, hierin oben) zusammengestellt. Jede Reaktion wurde
bei 94°C
für 120
Sekunden inkubiert, dann mit 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden,
72°C für 120 Sekunden
inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten. Das Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt wurde dann Gel-isoliert.
Das Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt und
der Vektor pJO200 wurden mit EcoRI + HamHI verdaut. Der verdaute
pJO200-Vektor wurde Gel-isoliert
und an das verdaute Osyn-5'CKS/Osyn-O3'-PCR-Produkt ligiert.
XL-1 Blue superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert
und auf LB + Ampicilin-Platten platziert, die mit 20 mM Glucose
ergänzt
waren. Kolonien wurden für die
Isolation auf dem selben Typ von Platten wieder ausgestrichen. Eine Über-Nacht-Kultur
des Klon pGO-9CKS Kandidatklons 4 wurde in LB-Brühe + 100 mg/ml Carbenicillin
(Sigma Chemical Co.) + 20 mM Glucose (Sigma Chemical Co.) gezüchtet. Es
wurden gefrorene Vorräte
(0,5 ml Über-Nacht-Kultur
+ 0,5 ml Glycerol) hergestellt und die DNA wurde für die Sequenz-Analyse
hergestellt. Die folgenden Oligonukleotide wurden als Sequenzierungs-Primer
verwendet: CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30), CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr.
31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr. 32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr.
33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr. 2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr.
1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr. 29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr.
34), 41sy-3B (Sequenzidentifikationsnr. 35), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr.
19), CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr. 20) und pTB-S8 (Sequenzidentifikationsnr.
28). Der Klon pGO-9CKS Kandidatklon 4 wurde als pGO-9CKS/XL1 bezeichnet
(Sequenzidentifikationsnr. 49 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden
Region und Sequenzidentifikationsnr. 50 zeigt die Aminosäure-Sequenz
der kodierenden Region).
-
H. Konstruktion des Osyn-I-M-Fragments
-
Das
Osyn-O-M-Fragment wurde wie folgt konstruiert. Eine 100 μl PCR Reaktion
wurde zusammengestellt, unter Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase
(2,5 U), 1 × Puffer,
50 μM von
jedem dNTP, 50 pmol I-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol
Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr. 14) und 10 ng von Gel-isoliertem
PCR-Fragment 3A
(Beispiel 3, Abschnitt A, hierin oben). Die Reaktion wurde bei 95°C für 150 Sekunden
inkubiert und dann wurde sie mit 15 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden,
55°C für 30 Sekunden,
72°C für 60 Sekunden
amplifiziert, und dann wurde sie bei 72°C für 7 Minuten gehalten. Das Produkt,
bezeichnet als Osyn-I-M, wurde Gel-isoliert und in den PCR-II-Vektor
(TA Cloning Kit; Invitrogen, San Diego, CA) kloniert, gemäß dem vom
Hersteller empfohlenen Verfahren. Das resultierende Ligations-Produkt
wurde verwendet, um DH5α kompetente
Zellen zu transformieren. Eine Plasmid-Miniprep-DNA wurde aus einer Über-Nacht-Kultur von
Klon IM-6 erzeugt und das Gen-Insert wurde mit den Oligonukleotiden
56759 (Sequenzidentifikationsnr. 45) und 55848 (Sequenzidentifikationsnr.
46) sequenziert.
-
I. Synthese und Verknüpfung (Knitting)
der PCR-Fragmente I/6R und IM-6F
-
Diese
Verfahren wurden wie folgt durchgeführt.
-
Schritt
1. Die folgenden PCR-Reaktionen (100 μl Volumen) wurden folgendermaßen zusammengestellt:
(a) I/6R mit AmpliTaq DNA-Polymerase Polymerase (2,5 U), 1 × Puffer,
50 μM von
jedem dNTP, 50 pmol I-PCR (Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol
IM-6R (Sequenzidentifikationsnr.
22) und 281 ng des Klons IM-6 (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt
H) als Matrize; (b) 6F/M mit AmpliTaq DNA-Polymerase (2,5 U), 1 × Puffer, 50 μM von jedem
dNTP, 50 pmol IM-6F (Sequenzidentifikationsnr. 21), 50 pmol M-PCR
(Sequenzidentifikationsnr. 27) und 281 ng des Klons IM-6 (erhalten
aus Beispiel 3, Abschnitt H) als Matrize.
-
Die
Reaktionen wurden bei 95°C
für 105
Sekunden inkubiert und dann mit 20 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden,
72°C für 60 Sekunden
amplifiziert, dann bei 72°C
für 7 Minuten
inkubiert. Die PCR-Produkte I/6R und 6F/M als nächstes wurden Gel-isoliert,
gemäß den Verfahren
wie hierin oben beschrieben.
-
Schritt
2. Eine PCR-Reaktion (100 μl
Volumen) wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und
1 × Puffer
zusammen mit 1, 5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von I-PCR
(Sequenzidentifikationsnr. 26), 50 pmol M-PCR (Sequenzidentifikationsnr.
27), ~50 ng I/6R und ~20 ng 6F/M. Die Reaktion wurde bei 95°C für 105 Sekunden
inkubiert und dann wurde sie mit 20 Zyklen von 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden,
72°C für 60 Sekunden
amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 7 Minuten. Das
PCR-Produkt wurde auf einer Centri-sep-Säule verarbeitet (Princeton
Separations), gemäß den Anweisungen
des Herstellers.
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J. Konstruktion von pGO-11PL/DH5α
-
4A bis 4F zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-11PL/DH5α involviert
sind. pGO-11PL/DH5α kodiert
das rekombinante Protein pGO-11PL. 9 zeigt die
Aminosäure-Sequenz
von dem pGO-11PL rekombinanten Protein (Sequenzidentifikationsnr.
52). Dieses Protein besteht aus einem N-terminalen Methionin, 45
Aminosäuren
von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 327 Aminosäuren von
env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). pGO-11PL/DH5α wurde wie folgt konstruiert.
-
Das
End-PCR-Produkt aus Beispiel 3, Abschnitt I und pGO-9PL-Vektor (Miniprep
H5 aus Beispiel 3, Abschnitt F) wurden nacheinander mit Age I und
BamHI verdaut. Das verdaute pGO-9PL wurde dann mit intestinaler
alkalischer Kälber-Phosphatase
(BRL Life Technologies) für
15 Minuten bei 37°C
behandelt, Phenol/Chloroform extrahiert und mit NaOAc und EtOH ausgefällt. Der
Vektor (pGO-9PL) wurde darauf Gel-isoliert. Der verdaute pGO-9PL
und das verdaute PCR-Produkt wurden ligiert und das Ligations-Produkt
wurde verwendet, um DH5α kompetente
Zellen zu transformieren. Kolonien wurden für die Isolation wieder ausgestrichen.
Der Klon pGO11-4 wurde dann identifiziert und für die Isolation wieder ausgestrichen.
Eine Über-Nacht-Kultur
von pGO11-4 wurde hergestellt, um gefrorene Vorräte zu erzeugen und eine Miniprep-DNA durchzuführen, für die Sequenzierung.
Der Klon pGO11-4 wurde mit den folgenden Oligonukleotid-Primern
sequenziert: pKRREcoRI Forward (Sequenzidentifikationsnr. 38), pKRRBamHI
Reverse (Sequenzidentifikationsnr. 39), 41sy-1C (Sequenzidentifikationsnr.
40), 41sy-2 (Sequenzidentifikationsnr. 41), 41sy-3 (Sequenzidentifikationsnr.
42), 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr. 23), 41sy-5B (Sequenzidentifikationsnr.
43), 41sy-5C (Sequenzidentifikationsnr. 36) und 41sy-6B (Sequenzidentifikationsnr.
37). Basierend auf dem Sequenzierungs-Ergebnissen wurde dieser Klon
bezeichnet als pGO-11PL/DH5α (Sequenzidentifikationsnr.
51 zeigt die Nukleotid-Sequenz
der kodierenden Region und Sequenzidentifikationsnr. 52 zeigt die
Aminosäure-Sequenz der
kodierenden Region).
-
K. Konstruktion von pGO-11CKS/XL1
-
4A bis 4G zeigen
eine Diagramm-artige Darstellung der Schritte, die in die Konstruktion
von pGO-11CKS/XL1 involviert sind. pGO-11CKS/XL1 kodiert das rekombinante
Protein pGO-11CKS. 10 zeigt die Aminosäure-Sequenz
des pGO-11CKS rekombinanten Proteins (Sequenzidentifikationsnr.
54). Dieses Protein besteht aus 246 Aminosäuren von CKS und Polylinker,
gefolgt von 45 Aminosäuren
von env gp 120 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat) und 327 Aminosäuren von
env gp 41 (HIV-1 Gruppe 0, HAM112 Isolat). pGO-11CKS/XL1 wurde wie
folgt konstruiert.
-
Eine
PCR-Reaktion (100 μl
Volumen) wurde zusammengestellt mit UITma DNA-Polymerase (3 U) und 1 × Puffer
zusammen mit 1, 5 mM MgCl2, 40 μM von jedem
dNTP, 50 pmol von Osyn-5'CKS
(Sequenzidentifikationsnr. 25), 50 pmol Osyn-M (Sequenzidentifikationsnr.
14) und 1 ng pGO11-4 (erhalten aus Beispiel 3, Abschnitt J) als
Matrize. Die Reaktion wurde bei 94°C für 105 Sekunden inkubiert und
dann mit 20 Zyklen von 94°C
für 30
Sekunden, 55°C
für 30
Sekunden, 72°C
für 120
Sekunden amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 7 Minuten.
Das Osyn-5'CKS/Osyn-M-PCR-Produkt
wurde Gel-isoliert. Als nächstes
wurden das Osyn-5'CKS/Osy-M-PCR-Produkt
und der Vektor pJO200 EcoRI + BamHI verdaut. Der verdaute pJO200-Vektor
wurde Gel-isoliert. Über-Nacht-(16°C)Ligationen
wurden mit dem verdauten PCR-Produkt zusammengestellt. XL1-Blue
superkompetente Zellen wurden mit der Ligation transformiert und
auf LB + Ampicillin-Platten, welche mit 20 mM Glucose ergänzt waren,
platziert. Kolonien wurden für
die Isolation wieder ausgestrichen, auf den selben Platten. Eine Über-Nacht-Kultur
(LB-Medium + 100 μg/ml
Carbenicillin + 20 mM Glucose) von dem Klon pGO-11CKS Klon-Kandidat
2 wurde dann zusammengestellt. Gefrorene Vorräte (0,2 ml 80% Glycerol + 0,5
ml Über-Nacht-Kultur) wurden hergestellt,
ebenso wie eine Miniprep-DNA für
die Sequenzierung. Die folgenden Oligonukleotide wurden als Primer
für die
Sequenz-Analyse verwendet: CKS-1 (Sequenzidentifikationsnr. 30),
CKS-2 (Sequenzidentifikationsnr. 31), CKS-3 (Sequenzidentifikationsnr.
32), CKS-4 (Sequenzidentifikationsnr. 33), 43461 (Sequenzidentifikationsnr.
2), 43285 (Sequenzidentifikationsnr. 1), 41sy-1B (Sequenzidentifikationsnr.
29), 41sy-2B (Sequenzidentifikationsnr. 34), 41sy-3b (Sequenzidentifikationsnr.
35), 41sy-4 (Sequenzidentifikationsnr. 23), 41sy-5C (Sequenzidentifikationsnr.
36), 41sy-6B (Sequenzidentifikationsnr. 37), CKS176,1 (Sequenzidentifikationsnr.
19), CKS3583 (Sequenzidentifikationsnr. 20) und pTB-S8 (Sequenzidentifikationsnr.
28). pGO-11CKS Klon #2 wurde als pGO-11CKS/XL1 bezeichnet. Sequenzidentifikationsnr.
53 zeigt die Nukleotid-Sequenz der kodierenden Region von pGO-11CKS/XL1
und Sequenzidentifikationsnr. 54 zeigt die Aminosäure-Sequenz
der kodierenden Region von pGO-11CKS/XL1.
-
Beispiel 4. Konstruktion
von pHIV210/XL1-Blue
-
11 zeigt die Aminosäure-Sequenz des pHIV-210 rekombinanten
Proteins (Sequenzidentifikationsnr. 55). Dieses Protein besteht
aus 247 Aminosäuren
von CKS/Linker-Sequenzen, 60 Aminosäuren von env gp 120 (#432–491; HIV-2
Isolat D194.10), und 159 Aminosäuren
von env gp 36 (#492–650;
HIV-2 Isolat D194.10). Die Konstruktion von pHIV210/XL1-Blue wurde
wir folgt erzielt.
-
Die
genomische DNA von dem HIV-2 Isolat D194.10 [H. Kuhnel et al., Nucleic
Acids Research 18: 6142 (1990)] wurde in den EMBL3 Lambda-klonierenden
Vektor kloniert. Siehe H. Kuhnel et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
86: 2383–2387
(1989) und H. Kuhnel et al., Nucleic Acids Research 18: 6142 (1990).
Der Lambda-Klon, der D194.10 (Lambda A 10) enthielt, wurde von Diagen
Corporation, Düsseldorf,
Deutschland, erhalten. Eine PCR-Reaktion
(100 μl
Volumen) wurde zusammengestellt unter Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase
(3,75 Einheiten), 200 μM
von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,5 μg Primer 3634 (Sequenzidentifikationsnr.
88, annealing an den Positionen 7437–7455 auf dem HIV-2 Isolat
D194.10 (EMBL Zugriff #X52223), 0,5 μg Primer 3636 (Sequenzidentifikationsnr.
89, annealing an den Positionen 8095–8077), 1 × PCR-Puffer und 5 μl von der
Lambda A 10 DNA, verdünnt
1 : 50. Die Reaktion wurde 5 Minuten bei 94°C inkubiert, dann mit 35 Zyklen
von 94°C
für 1 Minute,
45°C für 1 Minute,
72°C für 2 Minuten
amplifiziert, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5 Minuten.
Die PCR-Reaktion wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert (Boehringer
Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) und die DNA wurde mit Ethanol
(AAPER Alcohol & Chemical Company,
Shelbyville, KY) ausgefällt.
Die DNA wurde mit EcoRI + BamHI verdaut und auf einem 1,5% Agarose-Gel
gereinigt (SeaKem GTG Agarose, FMC Corporation, Rockland, Maine).
Das gereinigte Produkt wurde in einen EcoRI + BamHI verdauten pJO200-Vektor
ligiert, unter Verwendung von 800 Einheiten von T4 DNA-Ligase (New
England BioLabs). XL1-Blue superkompetente Zellen (Stratagene) wurden
mit 2 μl
der Ligation transformiert, wie vom Hersteller angegeben und auf
LB-Platten, die mit Ampicillin (Sigma Chemical Company) ergänzt waren,
platziert. Über-Nacht-Kulturen
wurden erstellt, durch Inokulation von einzelnen Kolonien in Superbroth
II Medium (GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin (Sigam) und
20 mM Glucose (Sigma). Gefrorene Vorräte wurden erzeugt, durch Hinzufügen von
0,3 ml von 80% Glycerol zu 0,7 ml der Über-Nacht-Kulturen. Nach dem Mischen wurden die
Vorräte
bei –70°C gelagert.
Eine Miniprep-DNA wurde aus den Über-Nacht-Kulturen
hergestellt, unter Verwendung des alkalischen Lyse-Verfahrens, gefolgt
von einer PEG-Präzipitation.
Sequenz-Reaktionen wurden mit einem 7-deaza-dGTP-Reagenz-Kit mit
Sequenase Version 2,0 durchgeführt
(United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), wie vom
Hersteller angegeben. Die Reaktionen wurden auf 6% Acrylamid-Gelen
durchgeführt
(GIBCO BRL Gel-Mix 6), unter Verwendung des IBI-Gel-Apparats, wie
vom Hersteller empfohlen. Basierend auf den Sequenz-Ergebnissen,
wurde der pHIV-210 Klon #7 bezeichnet als pHIV-210. Die Aminosäure-Sequenz
der pHIV-210 kodierenden Region wird als Sequenzidentifikationsnr.
55 dargestellt.
-
Beispiel 5. Wachstum und
Induktion von E. coli Stämmen
mit HIV-1 Gruppe 0 rekombinantem gp41 Antigen-Konstrukt
-
Über-Nacht-Saatkulturen
von pGO-9CKS/XL1 wurden hergestellt in 500 ml steriler Excell Terrific
Brühe (erhältlich von
Sigma Chemical Corp., St. Louis Mo.), ergänzt mit 100 μg/ml Natrium-Ampicillin, und in
einen Schüttel-Orbital-Inkubator
bei 32°C
oder 37°C
platziert. Einhundert Milliliter (100 μl) Inokuli aus den Saat-Kulturen
wurden in Kolben überführt, welche
einen Liter sterile Excell Terrific Brühe, ergänzt mit 100 μg/ml Natrium-Ampicillin, enthielten.
Kulturen wurden entweder (1) inkubiert bei 37°C bis die Kultur(en) ein mittel-logarithmisches
Wachstum erreichten und dann mit 1 mM ITPG (Isopropylthiogalactosid)
für 3 Stunden
bei 37°C
induziert. Alternativ wurden die PL-Konstrukte bei 32°C inkubiert, bis die Kultur(en)
ein mittel-logarithmisches Wachstum
erreichten und dann für
3 Stunden induziert, durch Verschieben der Temperatur der Kultur(en)
auf 42°C.
Nach der Induktionsperiode wurden die Zellen durch Zentrifugation
pelletiert und gemäß Standard-Verfahren
geerntet. Die pelletierten Zellen wurden bei –70°C gelagert, bis sie weiter verarbeitet
wurden.
-
Beispiel 6. Isolation
und Solubilisierung von HIV-1 Gruppe 0 rekombinanten gp41-Antigen,
hergestellt als unlösliche
Einschluss-Körper
in E. coli
-
Gefrorene
Zellen, die aus Beispiel 5 erhalten wurden, wurden durch Homogenisierung
in kaltem Lyse-Puffer resuspendiert, welcher 50 mM Tris pH 8, 10
mM Na EDTA, 150 mM NaCl, 8% (m/v) Saccharose, 5% Triton X-100® (v/v),
1 mM PMSF und 1 μM
Pepstatin A umfasste. Lysozym wurde zu den Homogenisaten bei einer
Konzentration von 1,3 mg pro Gramm von verarbeiteten Zellen hinzugefügt und die
resultierende Mischung wurde für
30 Minuten auf Eis inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Inklusions-Körper wurden
von löslichen
Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Diese pelletierten Inklusions-Körper wurden
gewaschen und nacheinander in (1) Lyse-Puffer; (2) 10 mM Na EDTA
pH 8, 30% (m/v) Saccharose; und (3) Wasser pelletiert. Die gewaschenen
Inklusions-Körper
wurden in 50 mM Tris pH 8, 10 mM Na EDTA, 150 mM NaCl und 3 M Harnstoff
resuspendiert und auf Eis für
eine Stunde inkubiert. Die Inklusions-Körper wurden dann von den solubilisierten
Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Die pelletierten Inklusions-Körper wurden
vollständig
in 7 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris pH 8, 0,1% (v/v) Beta-mercaptoethanol
(BME) über
Nacht bei 4°C
solubilisiert. Die solubilisierten rekombinanten Antigene wurden
durch Zentrifugation klar gemacht, durch einen 0,2 μm Filter
geführt
und bei ≤ –20°C gelagert,
bis sie durch Zentrifugation gereinigt wurden.
-
Beispiel 7. Reinigung
von rekombinatem HIV-1 Gruppe 0 gp41-Antigen durch Chromatographie
-
Solubilisierte
HIV-1 Gruppe 0 rekombinante gp41-Antigene, erhalten von Beispiel
6, wurden durch ein Zwei-Schritt-Verfahren wie folgt gereinigt.
Guanidin-HCl-Extrakte von unlöslichen
Antigenen wurden durch Größen-Ausschluss-Chromatographie
auf einer Sephacryl S-300 Säule
gereinigt, welche mit 50 mM Tris pH 8,8 M Harnstoff und 0,1% BME
(v/v) ins Gleichgewicht gebracht wurde. SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese wurde
verwendet, um die Fraktionen zu analysieren. Die Fraktionen, welche
das rekombinante gp41-Antigen enthielten, wurden gepoolt und dann
durch Ultra-Filtration konzentriert. Das rekombinante Antigen-Konzentrat wurde
mit 4% SDS (m/v) und 5% BME (m/v) bei Raumtemperatur für 3 Stunden
behandelt. SDS-behandeltes Antigen wurde weiter durch Größen-Ausschluss-Chromatographie
auf einer Sephacryl S-300 Säule
gereinigt, welche mit 25 mM Tris pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% v/v BME,
0,1% SDS (m/v) ins Gleichgewicht gebracht wurde. SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
wurde verwendet, um die Fraktionen zu analysieren. Fraktionen, welche gereinigtes
rekombinantes Antigen enthielten, wurden gepoolt, durch einen 0,2 μm Filter
geführt
und bei –70°C gelagert.
-
Beispiel 8. Herstellung
von HIV-1 Gruppe M-Antigen
-
Zellen,
welche das Plasmid pTB319 enthielten, wurden gezüchtet und induziert wie in
Beispiel 5 beschrieben. Zellen wurden lysiert und Inklusions-Körper wurden
im Wesentlichen wie in Beispiel 5 von U.S.-Patent-Nummer 5,124,255
beschrieben, verarbeitet. Das Pellet-Material wurde später in SDS,
Phosphat, pH 6,8 solubilisiert und dann der Chromatographie auf
einer S-300 Säule unterworfen.
-
Beispiel 9. Herstellung
von HIV-2-Antigen
-
pHIV-210/XL1-Blue
Zellen (Beispiel 4, hierin oben) wurden gezüchtet und induziert, wie in
Beispiel 5 beschrieben. Die Zellen wurden lysiert mit einem Puffer,
der Phosphat, MgCl2, Na EDTA, Triton X-100® pH
7,4 enthielt, ergänzt
mit Benzonase, Lysozym und PMSF. Inklusions-Körper wurden von löslichen
Proteinen durch Zentrifugation abgetrennt. Das Pellet wurde nacheinander
mit folgendem gewaschen: destilliertem H2O;
Triton X-100®,
Desoxycholat, NaCl, Phosphat pH 7,0; 50 mM Phosphat, pH 7,0; Harnstoff,
SDS in Phosphat, pH 7,0 + BME. Proteine wurden in SDS, Phosphat,
pH 7,0 und BME solubilisiert, dann einer Chromatographie auf einer
S300 Säule
unterworfen.
-
Beispiel 10. Ein-Schritt
Immunochromatographischer Assay für die gleichzeitige Detektion
und Differenzierung von HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0 und HIV-2
-
A. Reagenz-Zubereitung
-
- 1. Eine Selen-(Se)Kolloid-Suspension wurde
im Wesentlichen wie folgt hergestellt: SeO2 wurde
in Wasser auf eine Konzentration von 0,0625 g/ml aufgelöst. Ascorbat
wurde dann in Wasser auf eine Konzentration von 0,32 g/ml aufgelöst und in
einem 70°V
Wasserbad für
24 Stunden erhitzt. Die Ascorbat-Lösung wurde dann auf 0,0065
g/ml in Wasser verdünnt.
Die SeO2 Lösung wurde schnell zu der verdünnten Ascorbat-Lösung hinzugefügt und bei
42°C inkubiert.
Die Inkubation wurde nach einem Minimum von 42 Stunden beendet,
wenn das Extinktions-Maximum 30 bei einer Wellenlänge zwischen
542 nm und 588 nm überschritt. Die
Kolloid-Suspension
wurde auf 2–8°C abgekühlt, dann
gelagert. Selen-Kolloid-Suspension
ist erhältlich von
Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Code 25001).
- 2. Selen-Kolloid/Antikörper-Konjugate
wurden wie folgt hergestellt. Die Selen-Kolloid-Suspension wurde auf
eine Extinktion von 25 (OD 500–570)
in destilliertem Wasser konzentriert. Dann wurde 1 M MOPS hinzugefügt, bis
zu einer End-Konzentration
von 10 mM pH 7,2. Ziegen-Antikörper,
die spezifisch sind für
die humane IgG Fc-Region (oder andere Spezies von Antikörpern, die
spezifisch sind für
die humane IgG Fc-Region) wurden auf eine Konzentration von 0,75
mg/ml mit 50 mM Phosphat-Puffer verdünnt und die resultierende Antikörper-Zubereitung wurde
dann unter Mischen zu der Selen-Kolloid-Suspension hinzugefügt, welche wie hierin oben
beschrieben hergestellt wurde, auf eine endgültige Antikörper-Konzentration von 75 μg/ml. Das
Rühren
wurde für
40 Minuten fortgesetzt. Dann wurde 1% (Gewichtsprozent) Rinder-Serum-Albumin
(BSA) zu der Lösung
hinzugefügt
und die Selen-Kolloid/Antikörper-Konjugat-Lösung wurde für zusätzliche
15 Minuten gerührt
und bei 5000 × g
für 90
Minuten zentrifugiert. Danach wurden 90% des Überstands entfernt und das
Pellet wurde mit dem restlichen Überstand
resuspendiert. Unmittelbar vor dem Beschichten dieses Selen-IgG-Konjugats auf ein
Glasfaser-Kissen wurde es 1 : 10 mit Konjugat-Verdünner verdünnt (1%
[Gewichtsprozent] Kasein, 0,1% [Gewichtsprozent] Triton X-405® und
50 mM Tris, pH 8,2).
- 3. Verfahrens-Kontroll-Reagenz wurde als eine Mischung aus HIV-1
(Gruppe M), HIV-1 (Gruppe 0) und HIV-2-positiven Seren hergestellt
und wurde auf einer separaten Streifen-Vorrichtung als eine positive
Kontrolle des Assays verwendet.
- 4. Negatives Kontroll-Reagenz, das verwendet wurde, war normales
menschliches, verwendet auf einer separaten Test-Vorrichtung als eine negative Kontrolle
des Assays.
-
B. Herstellung des Applikations-Kissens
-
Das
Applikations-Kissen-Material umfasst Harz-gebundenes Glasfaser-Papier
(Lydall). Ungefähr
0,1 ml des hergestellten Konjugats (beschrieben im vorhergehenden
Absatz 2) wurden auf das Applikations-Kissen aufgebracht.
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C. Herstellung des chromatographischen
Materials
-
Alle
Reagenzien wurden auf eine Nitro-Zellulose-Membran aufgebracht,
durch Beladungs- und Ablenk-Reagenz-Ausstoßung (charge and deflect reagent
jetting). Die Nitro-Zellulose wurde durch eine MYLAR® Membran
getragen, welche mit einem druckempfindlichen Klebstoff beschichtet
ist.
-
Die
Testproben-Einfang-Reagenzien wurden hergestellt durch (a) Verdünnen des
spezifischen Antigens, hergestellt wie hierin oben beschrieben,
auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml in Ausstoßungs(„jetting")-Verdünnungsmittel (100 mM Tris,
pH 7,6 mit 1% Saccharose (Gewichtsprozent), 0,9% NaCl und 5 μg/ml Fluoreszein)
für das
HIV-1 Gruppe 0 Einfang-Reagenz (pGO-9/CKS, Sequenzidentifikationsnr.
50), (b) für HIV-1
Gruppe M, Untergruppe B Einfang-Reagenz (pTB319, Sequenzidentifikationsnr.
56) und (c) für
HIV-2 Einfang-Reagenz (pHIV.210, Sequenzidentifikationsnr. 55).
0,098 μl
eines ersten Einfang-Reagenzes
(Reagenz HIV-1 Gruppe M, Untergruppe B; Sequenzidentifikationsnr.
56) wurde auf den Streifen an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht
und bildete eine Patienten-Einfang-Stelle. In ähnlicher Weise wurden 0,098
ml eines zweiten Einfang-Reagenzes (Reagenz HIV-1 Gruppe 0; Sequenzidentifikationsnr.
50) auf den Streifen an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht
und bildete eine Patienten-Einfang-Stelle, und 0,098 μl eines dritten
Einfang-Reagenzes
(Reagenz HIV-2; Sequenzidentifikationsnr. 55) wurden auf den Streifen
an der bezeichneten Einfang-Stelle aufgebracht und bildete eine
Patienten-Einfang-Stelle.
-
D. Schneller Assay für die Anwesenheit
von Antikörpern
gegen HIV
-
Ein
schneller Assay für
die Anwesenheit von Antikörpern
gegen HIV in Testproben-Serum, Vollblut, Speichel und Urin-Proben wurde wie
folgt durchgeführt.
In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wurden
5 μl Serum
und 600 μl
Proben-Elutions-Puffer (Sample Elution Buffer, SEB) (enthaltend
50 mM Tris, 1% BSA (m/v), 0,4% Triton X-405® (v/v),
1,5% Casein (m/v), 3% Rinder-IgG
(m/v), 4% E. coli-Lysat (v/v), [pH 8,2]) gemischt. Vier Tropfen
dieser Mischung wurden auf die Probenwand des STAR-Gehäuses aufgebracht.
Als nächstes wurde
1 μl Serum
oder Vollblut zu 100 μl
SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platter hinzugefügt und der
Nitro-Zellulose-Streifen wurde in die Wand hinzugefügt. Danach
wurde 1 μl
Serum oder Vollblut in die Test-Vorrichtung
der erfindungsgemäßen Probenwand
direkt aufgetupft und vier Tropfen von SEB wurden hinzugefügt. Wenn
Speichel getestet wurde, wurden 50 oder 75 μl Speichel zu 50 ml bzw. 25
ml SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platte hinzugefügt und der
Nitro-Zellulose-Teststreifen wurde dann zu der Wand hinzugefügt. Wenn Urin
getestet wurde, wurden 50 ml Urin zu 50 μl SEB in einer Wand einer Mikrotiter-Platte
hinzugefügt
und der Nitro-Zellulose-Teststreifen
wurde in der Wand hinzugefügt.
Alternativ wurden 100 ml Urin in der Wand einer Mikrotiter-Platte
verwendet und der Nitro-Zellulose-Teststreifen wurde hinzugefügt, ohne
SEB zu verwenden.
-
Das
IgG in der Probe wurde durch das Selen-Ziegen-Anti-menschliche-IgG-Kolloid
in dem Konjugat-Kissen gebunden und die Komplexe wurden entlang
der Länge
der Nitro-Zellulose-Membran-Teststreifen chromatographiert,
auf welche die drei rekombinanten Antigene pGO-9 CKS (Sequenzidentifikationsnr.
50), pTB319 (HIV-1 Gruppe M (Untergruppe B), Sequenzidentifikationsnr.
56) und pHIV210 (HIV-2, Sequenzidentifikationsnr. 55) zuvor bei
einer Konzentration von 1 mg/ml aufgebracht wurden, unter Verwendung
einer Biodot-Maschine,
welche eine positive Verdrängungs-Verteilung
lieferte, unter Verwendung von genauen Tropfen-Größen. Die
Test-Vorrichtung
wurde dann bei Raumtemperatur für
2 Minuten inkubiert und die Ergebnisse wurden visuell abgelesen.
-
E. Befestigter Vollblut-Assay
-
In
einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen
wurde das Äquivalent
von 1 ml Blut von entweder bestätigtem positiven
HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 oder bestätigtem negativen
für HIV-1 Gruppe
0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Vollblut-Testprobe zu 5 ml eines bestätigten negativen
HIV-1 Gruppe 0, HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Serum zusammen mit 100
ml SEB hinzugefügt
und gemischt. Diese Mischung wurde auf die Probenwand der Test-Vorrichtung
der Erfindung aufgebracht.
-
Das
IgG in der Probe wurde durch das Selen-Ziegen-Anti-menschliche-IgG-Kolloid
in dem Konjugat-Kissen gebunden und die Komplexe wurden entlang
der Länge
der Nitro-Zellulose-Membran-Teststreifen chromatographiert,
auf welche die drei rekombinanten Antigene pGO-9 CKS (Sequenzidentifikationsnr.
50), pTB319 (HIV-1 Gruppe M (Untergruppe B), Sequenzidentifikationsnr.
56) und pHIV210 (HIV-2, Sequenzidentifikationsnr. 55) zuvor bei
einer Konzentration von 1 mg/ml aufgebracht wurden, unter Verwendung
einer Biodot-Maschine,
welche eine positive Verdrängungs-Verteilung
bereit stellte, unter Verwendung von genauen Tropfen-Größen. Die
Test-Vorrichtung
wurde dann bei Raumtemperatur für
2 Minuten inkubiert und die Ergebnisse wurden visuell abgelesen.
-
F. Ergebnisse
-
Wenn
Antikörper
gegen Antigen 1 in der Testprobe anwesend waren, wurde eine sichtbare
Reaktion in dem Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 1 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone
angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 2 oder Antigen 3. Wenn
Antikörper
gegen Antigen 2 in der Testprobe vorhanden waren, wurde eine sichtbare
Reaktion in dem Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 2 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone
angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 1 oder Antigen 3. Wenn
Antikörper
gegen Antigen 3 in der Testprobe vorhanden war, wurde eine sichtbare
Reaktion in den Einfang-Zonen-Gebiet von Antigen 3 und in der Assay-Vervollständigungs-Zone
angezeigt und nicht in den Zonen von Antigen 1 oder Antigen 2. Ebenso
sollte eine negative Kontrolle nicht reaktiv sein (keine sichtbare
Reaktion zeigen) in den Zonen von Antigen 1, Antigen 2 und Antigen
3, aber sollte reaktiv sein in der Assay-Vervollständigungs-Zone.
Eine positive Kontrolle (bekannter reaktiver Antikörper gegen
Antigen 1, 2 und/oder 3) sollte in der Zone des geeigneten Antigens,
an welches es spezifische bindet, in einer Antigen/Antikörper-Reaktion reaktiv
sein. Ein Ergebnis wurde als ungültig
betrachtet, wenn eine positive Reaktion in einer der Antigen-Einfang-Zonen auftrat,
aber nicht in der Assay-Vervollständigungs-Zone
und der Test wurde wiederholt.
-
(i) Durchführung eines
Assays für
Antikörper
in Blut, Urin und Speichel
-
Das
Blut, der Urin und der Speichel von drei Patienten (identifiziert
durch Patienten-Nummern 0109, 4068 und 4475) wurde auf Nitro-Zellulose-Festphasen-Vorrichtungen
der Erfindung, wie hierin beschrieben, getestet und gemäß dem Assay-Protokoll wie hierin
oben aufgeführt.
Jede Blut- und Urin-Testprobe
von jedem Patienten 0109, 4068 und 4475 war reaktiv mit Antigen
1 (pTB319; Sequenzidentifikationsnr. 56). Die Speichel-Testprobe
von Patienten 4068 und 4475 war auch reaktiv mit Antigen 1, während die
Speichel-Testprobe des Patienten 0109 nicht reaktiv in der Test-Vorrichtung
der Erfindung war. Die Speichel-Testprobe des Patienten 0109 wurde
später
wieder getestet, durch einen Standard-EIA und als nicht reaktiv
für die
Antikörper gegen
HIV-1 gp41 bestätigt,
was anzeigte, dass die Ergebnisse, welche für die Speichel-Testprobe des
Patienten 0109 erhalten wurden, gültig waren.
-
(ii) Durchführung eines
Assays für
negative Proben für
HIV-Antikörper
-
14 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen
und zeigt die Ergebnisse, welche erhalten wurden, beim Testen von
zwei negativen Seren und zwei negativen Vollblut-Testproben, jeweils
ausgestattet mit den selben zwei negativen Seren. Die Proben enthielten
keine Antikörper,
die spezifisch waren für
die relevanten Antigene und die Testproben waren negativ nach dem
Assay an dem Test (d. h. keine Reaktivität, wie angezeigt durch keinen
sichtbaren Streifen, der eine Reaktion in entweder Position 0, M
oder 2 bedeutet). Testprobe war anwesend in jeder Test-Vorrichtung,
wie durch den positiven Reaktions-Streifen in der Testproben-Reaktivitäts-Zone
angezeigt.
-
(iii) Durchführung eines
Assays für
HIV-1 Gruppe M Antikörper
-
15 ist eine Darstellung von zehn Test-Vorrichtungen
und zeigt die Ergebnisse, die beim Testen von 5 HIV-1 Gruppe M Seren
und 5 Vollblut-Proben erhalten werden, die mit den HIV-1 Gruppe
M positiven Seren ausgestattet waren. Wie in 15 gesehen
werden kann, enthielten HIV-1 Gruppe M Proben Antikörper, die spezifisch
waren für
HIV-1 Gruppe M Antigen (pTB319: mittlere Zone) und sie entwickelten
eine Reaktions-Linie
an der HIV-1 Gruppe M Antigen-Zone und sichtbare Reaktions-Linien
können
in der Assay-Vervollständigungs-Zone
von neun von zehn Test-Vorrichtungen gesehen werden, die mit "M" markiert ist. Obwohl eine Bande in
einer speziellen Test-Vorrichtung
in der Einfang-Zone für
HIV-1 Gruppe M Antikörper
vorhanden war, ging keine Testprobe bis zu der Assay-Vervollständigungs-Zone
und somit musste der Assay für
diese spezielle Probe wiederholt werden. Es ist zu bemerken, dass
keine Kreuz-Reaktivität
mit den Einfang-Reagenzien für
HIV-Gruppe 0 und
HIV-2 beobachtet wurde.
-
(iv) Durchführung eines
Assays für
HIV-1 Gruppe 0 Antikörper
-
16 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen,
welche die Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden, wenn zwei bestätigte positive
HIV-1 Gruppe 0 Seren und zwei Vollblut-Testproben, die mit HIV-1 Gruppe 0 Seren
ausgestattet waren, getestet wurden. Wie in 16 gesehen
werden kann, enthielten HIV-1 Gruppe 0 Proben Antikörper, die
spezifisch für
HIV-1 Gruppe 0 Antigen waren, wie angezeigt durch das positive Streifen-Ergebnis
in dem HIV-1 Gruppe 0 Antigen-Einfang-Zonen-Bereich (niedrigste Zone, bezeichnet
als "O"), sichtbare Reaktions-Linien
können
in der Assay-Vervollständigungs-Zone
von jeder Vorrichtung gesehen werden und keine Kreuz-Reaktion mit
HIV-1 Gruppe M oder HIV-2 Einfang-Antigenen (kein sichtbarer Streifen) wurde
beobachtet.
-
(v) Durchführung eines
Assays für
HIV-2 Antikörper
-
17 ist eine Darstellung von zehn Test-Vorrichtungen,
welche die Ergebnisse zeigt, die mit fünf HIV-2 bestätigten positiven
Seren erhalten wurden (fünf
Test-Vorrichtungen auf der linken Seite) und Vollblut, das mit fünf HIV-2
Seren ausgestattet war (fünf
Test-Vorrichtungen) auf der rechten Seite). Wie aus 17 gesehen werden kann, enthielten HIV-2 Proben
Antikörper,
die spezifisch für
HIV-2 Antigen waren (pHIV210, obere Zone, bezeichnet durch "2"), wie durch den Reaktions-Streifen
an der HIV-Antigen-Zone gezeigt. Keine Reaktion wurde mit diesen
Testproben und HIV-1 Gruppe 0 Antigen oder HIV-1 Gruppe M Antigen
beobachtet und sichtbare Reaktions-Linien können in der Assay-Vervollständigung-Zone
von jeder Vorrichtung gesehen werden.
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(vi) Durchführung eines
Assays für
HIV-1 Gruppe M, HIV-1 Gruppe 0, HIV-2 und negative Proben
-
18 ist eine Darstellung von vier Test-Vorrichtungen,
in welchen (von links nach rechts) eine negative Testprobe, eine
HIV-1 Gruppe M positive Testprobe, eine HIV-1 Gruppe 0 positive
Testprobe und eine HIV-2 positive Testprobe einzeln getestet wurden.
Wie aus 18 gesehen werden kann, reagierte
das negative Test-Serum nicht mit irgendeinem Antigen in der Antigen-Einfang-Zone,
wohingegen die HIV-1 Gruppe M positive Testprobe nur mit dem HIV-1
Gruppe M Antigen reaktiv war, die HIV-1 Gruppe 0 positive Testprobe war
nur mit dem HIV-1 Gruppe 0 Antigen reaktiv und die HIV-2 positive
Testprobe war nur mit dem HIV-2 Antigen reaktiv, und sichtbare Reaktionslinien
können
in der Assay-Vervollständigungs-Zone
von jeder Vorrichtung gesehen werden.
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Die
fünf HIV-1
Gruppe M und die zwei HIV-1 Gruppe 0 Testproben, die verwendet wurden,
wurden als sero-positive Proben bestätigt, welche zuvor unter Verwendung
von Abbott's 3A77
EIA getestet wurden und welche PCR amplifiziert, sequenziert und
in Untergruppen unterteilt wurden, basierend auf phylogenetischer Analyse.
Die fünf
HIV-2 Proben, die verwendet wurden, waren sero-positiv, unter Verwendung
von Abbott's 3A77
EIA, und sie wurden als HIV-2 Proben durch einen HIV-2 Western Blot-Test
(Sanofi) bestätigt.
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