JP2001516027A

JP2001516027A - Ｈｉｖ抗体の同時検出および識別のための迅速アッセイ

Info

Publication number: JP2001516027A
Application number: JP2000510023A
Authority: JP
Inventors: バラリ，アナドルゼラ・エス; ハケツト，ジヨン・アール，ジユニア; ヒツクマン，ロバート・ケイ; バリテツク，ビンセント，ジユニア; ネクローズ，エリザベス・シー; ゴールデン，アラン・エム; ブレナン，キヤサリン・エイ; デビア，スシル・ジー
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: DE69827642D1; WO1999009410A9; CA2300374A1; DE69827642T2; JP3278652B2; ES2234143T3; EP1004023B1; US5922533A; WO1999009410A3; EP1004023A2; ATE282828T1; CA2300374C; WO1999009410A2

Abstract

(57)【要約】Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の分析物を同時に検出して識別するための迅速なアッセイを、捕捉試薬として各分析物の配列特異的ペプチドを用いて行う方法。これらの捕捉試薬を含む分析デバイスもまた、この方法を行うために提供される。分析デバイスを含み、陽性対照および陰性対照をさらに含み得る試験キットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、全般に、免疫アッセイに関し、より詳細には、短い処理時間で、試
験サンプルにおける１型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）のＭ群、ＨＩＶ
−１のＯ群、および２型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−２）に対する抗体を
検出して識別するために有用な免疫アッセイに関する。

【０００２】現在、ＨＩＶ−１の２つの主要な系統発生的な群は「Ｍ」群および「Ｏ」群と
名付けられている。Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ他、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅ
ｓａｎｄＡＩＤＳ１９９５、ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬｏｓＡｌａｍｏｓ、ＮＭ（１９９５）。単離された
Ｍ群ＨＩＶ−１は、互いに系統発生的にはほぼ等しい距離にある亜群（Ａ〜Ｊ）
にさらに分けられている。主として、Ｍ群が世界各地で単離されている。Ｏ群Ｈ
ＩＶ−１ウイルスの配列に関する最も初期の報告により、このウイルスは、他の
ＨＩＶ−１亜群と同様にチンパンジーのウイルスに密接に関連していることが示
された。例えば、Ｌ．Ｇ．Ｇｕｒｔｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８：１
５８１〜１５８５（１９９４）；Ｍ．ＶａｎｄｅｎＨａｅｓｅｖｅｌｄｅ他、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８：１５８６〜１５９６（１９９４）；ＤｅＬｅｙｓ
他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６４：１２０７〜１２１６（１９９０）；ＤｅＬｅ
ｙｓ他、米国特許第５，３０４，４６６号；Ｌ．Ｇ．Ｇｕｒｔｌｅｒ他、欧州特
許公開第０５９１９１４Ａ２号を参照のこと。Ｏ群の配列は、今日までに明らか
にされたＨＩＶ−１配列の中で最も大きく異なっている。Ｏ群ＨＩＶ−１株は、
西部中央アフリカ（カメルーン、赤道ギニア、ガボンおよびナイジェリア）に固
有であるが、Ｏ群ウイルスの感染患者は、現在、ベルギー、フランス、ドイツ、
スペインおよび米国において確認されている。例えば、Ｒ．ＤｅＬｅｙｓ他（上
記）；Ｐ．Ｃｈａｒｎｅａｕ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０５：２４７〜２５３（
１９９４）；Ｉ．Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６
９：５６４０〜５６４９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｍｐｌｅ他、Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ２３：３６９〜３７０（１９９５）；Ａ．Ｍａｓ他、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈ
ｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１２：１６４７〜１６４９（１９９６）；Ｍ
．Ａ．Ｒａｙｆｉｅｌｄ他、ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ
ｅａｓｅｓ２：２０９〜２１２（１９９６）、およびＭ．Ｐｅｅｔｅｒｓ他、
ＡＩＤＳ１１：４９３〜４９８（１９９７）を参照のこと。

【０００３】Ｍ群ＨＩＶ−１の血清型は、大部分は、発現したウイルスタンパク質（抗原）
のアミノ酸配列によって、特に、コア領域およびエンベロープ（ｅｎｖ）領域を
含むウイルスタンパク質によって特徴づけられている。これらの抗原は、構造的
および機能的に類似しているが、特定の抗原に関して特異な抗体応答を誘発する
多様なアミノ酸配列を有する。

【０００４】ＨＩＶ−１感染を検出するための重要な血清学的標的の１つは、４１，０００
の分子量を有する膜貫通タンパク質（ＴＭＰ）の糖タンパク質（ｇｐ）４１であ
る。ｇｐ４１は、ＨＩＶに関して血清陽性であると考えられる個体において持続
した強い抗体応答を誘発する高免疫原性タンパク質である。このタンパク質に対
する抗体は、特に、血清変換時に最初に現れるものである。ｇｐ４１に対する免
疫応答は、ＡＩＤＳの臨床的段階と同様に、無症候時において、抗ｇｐ４１抗体
がほぼ全般的に存在することによって明らかにされているように、疾患の全期間
を通して比較的強く残っているようである。ｇｐ４１に対する抗体応答の大部分
は、ｇｐ４１内において十分に特徴付けられた免疫支配領域（ＩＤＲ）に対する
ものである。

【０００５】ＨＩＶ−２感染者は、西アフリカの最初の固有地域以外のヒトにおいて認めら
れており、そして西アフリカに住んだことがある欧州人またはこの地域の出身者
との性的な関係を有した人々、およびこの固有地域出身の性的パートナーとの同
性愛者などにおいて報告されている。２型ＨＩＶ（ＨＩＶ−２）によるＡＩＤＳ
の治療が、現在、世界中で報告されている。例えば、Ａ．Ｇ．Ｓａｉｍｏｔ他、
Ｌａｎｃｅｔｉ：６８８（１９８７）；Ｍ．Ａ．Ｒｅｙ他、Ｌａｎｃｅｔｉ
：３８８〜３８９（１９８７）；Ａ．Ｗｅｒｎｅｒ他、Ｌａｎｃｅｔｉ：８６
８〜８６９（１９８７）；Ｇ．Ｂｒｕｃｋｅｒ他、Ｌａｎｃｅｔｉ：２２３（
１９８７）；Ｋ．Ｍａｒｑｕａｒｔ他、ＡＩＤＳ２：１４１（１９８８）；Ｃ
ＤＣ、ＭＭＷＲ３７：３３〜３５（１９８７）；Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ、Ｎａｔ
ｕｒｅ３３２：２９５（１９８８）を参照のこと。

【０００６】血清学的研究により、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２はそれらのコア抗原におい
て多数の共通したエピトープを有する一方で、これらの２つのウイルスのエンベ
ロープ糖タンパク質は交差反応性がほとんどないことが示されている。Ｆ．Ｃｌ
ａｖｅｌ他、ＡＩＤＳ１：１３５〜１４０（１９８７）。エンベロープ抗原の
このような限られた交差反応性は、ＨＩＶ−１に関する現在利用可能な血清学的
アッセイが、ＨＩＶ−２に対する抗体を有するヒト血清のいくつかと反応しない
ことがある理由を説明するものであると考えられている。Ｆ．Ｄｅｎｉｓ他、Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：１０００〜１００４（１９８８）。最近発行さ
れた米国特許第５，０５５，３９１号は、ＨＩＶ−２ゲノムの遺伝子地図を明ら
かにし、そしてこのウイルスを検出するためのアッセイを提供している。

【０００７】Ｏ群ＨＩＶ−１に対する抗体の存在を検出するために、ＨＩＶ−１（Ｍ群）お
よび／またはＨＩＶ−２に対する抗体の検出に必要な現在利用可能な免疫アッセ
イの能力に関する関心が高まりつつある。Ｉ．Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａ他
、Ｌａｎｃｅｔ３４３：１３９３〜１３９４（１９９４）；Ｃ．Ａ．Ｓｃｈａ
ｂｌｅ他、Ｌａｎｃｅｔ３４４：１３３３〜１３３４（１９９４）；Ｌ．Ｇｕ
ｒｔｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５１：１７７〜１８４（１９
９５）。これらの免疫アッセイによりＯ群が検出され得るかどうかを分析すると
いう問題を大きくしているのは、Ｏ群ＨＩＶ−１単離体に感染し、かつ／または
それに対する抗体を有する患者の血清サンプルの入手が限られていることである
。今日までのところ、西部中央アフリカ以外では、Ｏ群ＨＩＶ−１単離体に感染
していると診断された患者はほとんどおらず、このため、研究者は、このウイル
スに関して、西部中央アフリカ諸国の患者をスクリーニングしなければならない
。西部中央アフリカでのスクリーニング手順は、このようなアッセイを行うため
に必要な時間ならびにそのために必要とされる装置の両方によって妨げられてい
る。

【０００８】Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体を検出するた
めに利用可能な従来の結合アッセイは、通常、結果を得るために約２時間から４
時間またはそれ以上の時間を必要とする。このようなアッセイはさらに、操作す
るために電気を必要とするインキュベーターおよび標識読み取り装置を含む様々
な装置を利用することを含む。このようなアッセイは、特異的な結合メンバーの
免疫反応物、通常は抗体および抗原の免疫反応物を含む：この場合、この特異的
な結合対の一方は、シグナル発生化合物により標識される（例えば、抗体は、酵
素、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位体、直接目で確認できる標識など
で標識される）。分析物の含有が疑われる試験サンプルは、標識された試薬（例
えば、標識された抗分析物抗体）と混合して、免疫反応が起こるのに十分な時間
および条件下でインキュベーションすることができる。反応混合物は、続いて、
この分析物／標識された試薬の複合体と会合する標識（結合した標識化試薬）、
あるいは分析物との複合体を形成しなかった標識（遊離状態の標識化試薬）のい
ずれかを検出するために分析される。分析物の存在および／または量は、通常、
固定化されている標識された試薬および結合メンバーに結合する分析物の容量、
あるいは不溶性の相補的な結合メンバーによって示される。

【０００９】このようなアッセイを行い、そして結果を得るために通常必要とされる時間が
長すぎる（すなわち、２時間〜４時間である）か、あるいはアッセイを行うため
に必要な装置および／または電気が得られない状況および場所が存在する。その
ような状況では、好ましい試験は、安価でなければならず、装置をほとんどまた
は全く必要としないことが望ましく、そして５分もの少ない時間でスクリーニン
グアッセイの結果が得られることが望ましい。

【００１０】試薬を含浸させた試験ストリップを特異的な結合アッセイにおいて使用するこ
とはよく知られている。例えば、米国特許第４，３６１，５３７号（Ｄｅｕｔｓ
ｃｈ他）および米国特許第５，１６０，７０１号（ＢｒｏｗｎＩＩＩ他）を参
照のこと。そのような手順において、試験サンプルが試験ストリップの一部分に
加えられ、そして試験ストリップ材の中を移動する、すなわち、毛管作用で移動
する。従って、検出または測定され得る分析物は、おそらくは、試験サンプル自
身、または別に添加された溶液であり得る溶出溶媒の助けによって試験ストリッ
プ材の中またはそれに沿って通過する。分析物は、分析物に対する相補的な結合
メンバーが固定化されている試験ストリップ上の捕獲帯域または検出帯域の内部
にまで移動し、あるいはそのような帯域を通り抜ける。分析物が検出帯域で結合
する程度は、試験ストリップ内に同様に取り込まれ得る標識された試薬、または
別に加えることができる標識された試薬の助けにより測定することができる。

【００１１】一般に、試験ストリップは、毛管作用（すなわち、米国特許第４，９５６，３
０２号（Ｇｏｒｄｏｎ他）において例示されているような毛管作用による移動作
用またはクロマトグラフィー的作用）によって溶液を移動させることができる物
質を含む。試験ストリップにおける異なる領域または帯域は、分析物がそのよう
な帯域に輸送されるか、またはそのような帯域を通過したときに、検出可能なシ
グナルを生成させるために必要なアッセイ試薬を含有する。そのようなデバイス
は化学アッセイおよび結合アッセイの両方に好適であり、そして展開溶液を使用
して、分析物を試験ストリップに沿って移動させる。さらに、これまでのアッセ
イは、検出可能なシグナルを生成させるために必要なアッセイ試薬の安定性およ
び効率を確認するために、典型的には、各製造ロットからの１つまたは複数のス
トリップを陽性および陰性の両方の対照について別途アッセイすることが少なく
とも必要である。

【００１２】従って、Ｍ群ＨＩＶ−１および／またはＯ群ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ
−２に対する抗体の分離または同時検出を行うために開発されたアッセイシステ
ムは、試験サンプル中のウイルスのどれかまたはそのすべてに対する抗体の特異
的な存在を検出し、その一方でそれらを識別するために有用な試薬を含有しなけ
ればならない。従って、ＨＩＶのＭ群、ＨＩＶのＯ群およびＨＩＶ−２に対する
抗体のみと反応し得る試薬が必要である：ただし、このような試薬は互いに交差
反応を全く示さないか、あるいは限られた交差反応を示す。このような試薬を取
り込むことができ、そして個体をスクリーニングして、短時間で結果を得るため
に使用することができる廃棄可能なアッセイデバイスを提供することはまた有益
である。

【００１３】（発明の要旨）本発明は、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およびＨＩ
Ｖ−２に対する抗体を含む分析物を同時に検出して識別するための方法を提供す
る。この方法は、（ａ）試験サンプルを、近位端および遠位端を有し、分析サン
プルを毛管作用によって近位端から遠位端の近くにまで移動させ、そして分析物
に対する少なくとも１つの固定化された捕捉試薬を含有するストリップを有する
分析デバイスと、分析物および捕捉試薬の結合による捕捉試薬／分析物複合体が
形成されるのに十分な時間および条件下で接触させること；および（ｂ）ストリ
ップ上の捕捉試薬部位での可視的な色の変化を検出することによって、分析物（
１つまたは複数）の存在を決定することを含み、Ｏ群ＨＩＶ−１のための捕捉試
薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２および配列番号５４、配列番
号５８および配列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群
ＨＩＶ−１のための捕捉試薬は配列番号５６のポリペプチドを含み、そしてＨＩ
Ｖ−２のための捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含む。好ましくは、上
記のポリペプチド捕捉試薬は組換え技術により製造されるが、精製タンパク質（
ポリペプチド）または合成ペプチドが利用され得ることも包含される。固定化さ
れた捕捉試薬は、文字、数字、アイコン、または記号として配置することができ
る。さらに、この方法は、近位端および固定化された患者捕捉試薬の間の位置に
おいてストリップに含有される表示用試薬を含む。この表示用試薬はシグナル発
生化合物を含む。このような化合物は、発色体、触媒、発光性化合物、化学発光
性化合物、放射性元素、および直接的な可視標識からなる群より選択される。好
ましくは、表示用試薬は、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、染色粒
子または着色粒子、およびリポソームからなる群より選択される直接的な可視試
薬を含む。表示用試薬は、非金属粒子としてセレンをさらに含む。試験サンプル
は、好ましくは体液である。このような体液は、全血、血漿、血清、尿および唾
液からなる群より選択される。

【００１４】本発明はさらに、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およ
びＨＩＶ−２に対する抗体を含む分析物を同時に検出して識別するための分析デ
バイスを提供する。このデバイスは、近位端および遠位端を有し、分析サンプル
を毛管作用によって近位端から遠位端の近くにまで移動させることができ、そし
て分析物に対する少なくとも１つの固定化された捕捉試薬を、分析物および捕捉
試薬を結合させるために含有するストリップを含み、そしてＯ群ＨＩＶ−１のた
めの捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２および配列番号５
４、配列番号５８および配列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを
含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５６のポリペプチドを含
み、そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含
む。このポリペプチドは、好ましくは、組換え技術により製造されるが、精製タ
ンパク質（ポリペプチド）および合成ペプチドが使用され得ることも包含される
。分析デバイスは、文字、数字、アイコン、または記号として配置されている固
定化された捕捉試薬をさらに含む。さらに、分析デバイスは、近位端および固定
化された患者捕捉試薬の間の位置においてストリップに含有される表示用試薬を
含む。この表示用試薬はシグナル発生化合物を含み、このような化合物は、発色
体、触媒、発光性化合物、化学発光性化合物、放射性元素、および直接的な可視
標識からなる群より選択される。好ましくは、表示用試薬は、コロイド状金属粒
子、コロイド状非金属粒子、染色粒子または着色粒子、およびリポソームからな
る群より選択される直接的な可視試薬を含む。試験サンプルは、好ましくは体液
である。このような体液は、全血、血漿、血清、尿および唾液からなる群より選
択される。

【００１５】さらに、本発明は、特異的な結合アッセイにおいて使用される試験キットを提
供する。この試験キットは、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２に特異的な抗体の存在または量を決定するための分析デバ
イスを含み、そして近位端および遠位端を有するストリップをさらに含む：ただ
し、試験サンプルは毛管作用によって近位端から遠位端の近くにまで移動するこ
とができ、そしてストリップは、分析物、補助的な特異的結合メンバー、および
表示用試薬からなる群より選択される選択される要素に結合する固定化された捕
捉試薬を含有する。Ｏ群ＨＩＶ−１のための捕捉試薬は、配列番号４８、配列番
号５０、配列番号５２および配列番号５４、配列番号５８および配列番号６０か
らなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉
試薬は配列番号５６のポリペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉
試薬は配列番号５５のポリペプチドを含む。このポリペプチドは、好ましくは、
組換え技術により製造される。精製タンパク質または合成ペプチドもまた使用す
ることができることが包含される。表示用試薬はシグナル発生化合物を含み、こ
のような化合物は、発色体、触媒、発光性化合物、化学発光性化合物、放射性元
素、および直接的な可視標識からなる群より選択される。好ましくは、表示用試
薬は、コロイド状金属粒子、コロイド状非金属粒子、染色粒子または着色粒子、
およびリポソームからなる群より選択される直接的な可視試薬を含む。試験キッ
トは、陽性の試薬対照および陰性の試薬対照をさらに含む。

【００１６】（発明の詳細な説明）従来のアッセイよりも短い時間でＭ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩ
Ｖ−２に関するスクリーニングができることが、迅速な結果が患者のカウンセリ
ングおよび治療のために必要な状況で求められている特徴である。そのようなス
クリーニングアッセイは、従来のスクリーニングアッセイと同じような程度の感
度および特異性が、さらに一層短い時間で得ることができなければならない。本
発明はそのようなアッセイを提供し、そして以下に本発明を説明する。

【００１７】下記の用語は、別途示されていない限り、下記の意味を有する。

【００１８】用語「試験サンプル」は、分析物（目的の抗体または目的の抗原など）の供給
源である個体の身体成分をいう。このような成分はこの分野では周知である。試
験サンプルは、供給源から得られたように直接的に、あるいはその性質を改変す
るような前処理を行った後で使用することができる。このような試験サンプルに
は、本明細書中において記載されている方法により試験することができる生物学
的サンプルが含まれ、そして全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、なら
びに呼吸器管、腸管および生殖泌尿管の様々な外分泌物、涙、唾液、乳汁、白血
球、ミエローマなどのヒトおよび動物の体液；および細胞培養上清などの生物学
的液；固定された組織標本；および固定された細胞標本が含まれる。試験サンプ
ルは、血液からの血漿の調製、粘性液の希釈などの前処理を使用前に調製できる
；処理方法には、抽出、ろ過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活性化、および試薬の
添加が含まれ得る。そのような前処理はまた、液体媒体を得るために、あるいは
分析物を放出するために、分析物の含有が疑われる固体材料を改変することを含
むこともできる。

【００１９】本明細書中で使用されている「分析物」は、試験サンプルに存在し得る検出さ
れ得る物質である。分析物は、天然に存在するその特異的な結合メンバー（抗体
など）が存在するか、または特異的な結合メンバーをそれに関して調製すること
ができる任意の物質であり得る。従って、分析物は、アッセイにおいて１つまた
は複数の特異的な結合メンバーに結合し得る物質である。「分析物」にはまた、
任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、およびその組合せが含まれる。特異的な結
合対の成分として、分析物は、天然に存在する特異的な結合性パートナー（対）
によって、例えば、ビタミンＢ１２を測定するための特異的な結合対の成分とし
ての固有因子タンパク質の使用、葉酸を測定するための葉酸結合性タンパク質の
使用、または炭水化物を決定するための特異的な結合対の成分としてのレクチン
の使用によって検出することができるが、これらに限定されない。分析物には、
タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的など、ハプテン、抗体、高
分子、およびその組合せなどの任意の抗原性物質が含まれるが、これらに限定さ
れない。

【００２０】「分析物類似体」は、分析物に特異的な結合メンバーと交差反応する物質をい
うが、分析物自身が交差反応するよりも大きい程度で、あるいは小さい程度で交
差反応し得る。分析物類似体は、分析物類似体が目的の分析物と共通した少なく
とも１つのエピトープ部位を有する限り、改変された分析物、ならびに分析物分
子のフラグメントまたは合成された部分を含むことができる。分析物類似体の例
は、分析物分子全体の少なくとも１つのエピトープと同じものを有し、その結果
、分析物類似体が分析物に特異的な結合メンバーに結合し得る合成されたペプチ
ド配列である。

【００２１】本発明は、特異的な結合メンバーを利用するアッセイを提供する。本明細書中
で使用されている「特異的な結合メンバー」は、特異的な結合対の一方の成分で
ある。すなわち、そのような分子の一方が化学的または物理的な手段により第２
の分子に特異的に結合する２つの異なる分子である。従って、一般的な免疫アッ
セイの抗原および抗体の特異的な結合対に加えて、他の特異的な結合対には、例
えば、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド
配列、エフェクター分子およびレセプター分子、補酵素および酵素、酵素阻害剤
および酵素などが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、他の特異的な
結合対には、例えば、相補的なペプチド配列、ペプチド配列およびその配列また
はタンパク質全体に特異的な抗体、ポリマー状の酸および塩基、色素およびタン
パク質結合体、ペプチドおよび特異的なタンパク質結合体（例えば、リボヌクレ
アーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ−タンパク質）が含まれるが、
これらに限定されない。さらに、特異的な結合対には、元の特異的な結合メンバ
ーの類似体である成分（例えば、分析物類似体）が含まれ得る。特異的な結合対
成分には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的などが含まれ得
る。免疫反応性の特異的な結合メンバーには、抗原、抗原フラグメント、抗体お
よび抗体フラグメント（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）
、ならびにその複合体（組換えＤＮＡ分子によって形成される複合体を含む）、
葉酸を測定するための葉酸結合タンパク質、または炭水化物を決定するための特
異的な結合対の成分としてのレクチンの使用が含まれる。

【００２２】本明細書中で使用されている用語「ハプテン」は、抗体に結合することができ
るが、キャリアタンパク質に結合されない限り、抗体生成を誘発することができ
ない部分的な抗原または非タンパク質結合メンバーをいう。

【００２３】「標識された試薬」としてもまた示される「表示用試薬」は、ＨＩＶの特異的
な結合メンバーに結合させた（結びつけた）外部の手段によって検出できる測定
可能なシグナルを発生し得るか、またはそのようなシグナルを発生する「シグナ
ル発生化合物」（「標識」）を含む。表示用試薬はまた、ＨＩＶの特異的な結合
対の抗体成分であることに加えて、任意の特異的な結合対のメンバーであり得る
。これには、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物ま
たはレクチン、相補性ヌクレオチド配列、エフェクター分子またはレセプター分
子、酵素補因子または酵素、酵素阻害剤または酵素などのハプテン−抗ハプテン
系のいずれか一方が含まれる。免疫反応性の特異的な結合メンバーは、抗体、抗
原、あるいはサンドイッチアッセイの場合のようにＨＩＶに、競合アッセイの場
合のように捕捉試薬に、または間接的なアッセイの場合のように補助的な特異的
結合メンバーに結合し得る抗体／抗原複合体であり得る。シグナル発生化合物と
特異的な結合メンバーとの結合は共有結合または非共有結合であり得るが、その
結合方法は本発明には重要ではない。標識により、表示用試薬は、試験サンプル
中の分析物の量に直接的または間接的に関連する検出可能なシグナルを生成する
ことができる。表示用試薬の特異的な結合対成分は、分析物に直接結合するよう
に、あるいは補助的な特異的結合メンバーによって分析物に間接的に結合するよ
うに選択される。標識された試薬は、試験デバイスに組み込むことができ、ある
いは試験溶液を得るために、試験サンプルと一緒にすることができ、あるいは試
験サンプルとは別にデバイスに加えることができ、あるいは捕獲部位で再度沈澱
させるか、または可逆的に固定化することができる。さらに、結合メンバーは、
適切な結合方法によって、アッセイの前あるいはその間に標識することができる
。

【００２４】包含される様々な「シグナル発生化合物」（「標識」）には、発色体、酵素な
どの触媒、フルオレセインおよびローダミンなどの発光化合物、ジオキセタン類
、アクリジニウム類、フェナントリジウム類およびルミノールなどの化学発光化
合物、放射性元素、および直接的な可視標識が含まれる。酵素の例には、アルカ
リホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが
含まれる。直接的な可視標識の例には、金などのコロイド状金属粒子、セレンな
どのコロイド状非金属粒子、染色されたプラスチックまたは染色された微生物な
どの染色粒子または着色粒子、着色または着色可能な有機ポリマーラテックス粒
子（Ｄｕｒａｃｙｔｅ（登録商標）、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、ＩＬ）から入手可能な誘導体化された赤血球）、リ
ポソーム、または直接的な可視物質を含有する他のベシクルなどが含まれる。特
定の標識を選択することは重要ではない。標識は、それ自身によるシグナル（可
視的に検出可能な着色された有機ポリマーラテックス粒子など）、あるいは装置
により測定可能なシグナル（発光化合物または放射能標識元素など）、あるいは
酵素／基質シグナル生成システムなどの１つまたは複数のさらなる物質と組み合
わせて検出可能なシグナルを生成させることができる。様々な異なる標識された
試薬は、標識、または標識された試薬の特異的な結合メンバーの成分を変えるこ
とによって得ることができる。その選択には、所望の検出手段によって検出され
得る分析物の検討が含まれることは当業者により理解されている。

【００２５】セレン、着色粒子またはブラックラテックスなどの可視的に検出可能な粒子を
標識として使用する場合、標識された試薬の結合メンバー（１つまたは複数）は
、粒子に結合させることができる。あるいは、そのような結合メンバー（１つま
たは複数）は異なるバッチの粒子に結合させることができ、そしてその後、粒子
は混合することができる。

【００２６】「シグナル生成成分」は、別のアッセイ試薬と反応し、あるいは分析物と反応
して、分析物の存在を示し、かつ／またはいくつかのアッセイ特性が満たされて
いることを示すために役立つ反応生成物またはシグナルを生成し得る任意の物質
をいう。シグナル生成成分は、可視的手段または装置的手段によって検出するこ
とができる。本明細書中で使用されている「シグナル生成システム」は、所望の
反応生成物またはシグナルを得るために必要なアッセイ試薬の集団をいう。従っ
て、１つまたは複数のシグナル生成成分は、検出可能なシグナルを発生させるた
めに、標識と反応させることができる。例えば、標識が酵素である場合、検出可
能なシグナルは、検出可能な反応生成物を得るために、酵素を１つまたは複数の
基質と反応させることによって、あるいはさらなる酵素および基質と反応させる
ことによって増幅される。

【００２７】本発明の好ましい実施形態において、可視的に検出可能な標識は、標識された
試薬の標識成分として使用され、それによって試験サンプル中の分析物の存在ま
たは量が、検出部位におけるさらなるシグナル生成成分を必要とすることなく、
直接可視的に、あるいは装置により読み取られる。使用するために適切な物質に
は、金などのコロイド状金属、および着色粒子、ならびにコロイド状のセレン粒
子、テルル粒子およびイオウ粒子などの非金属コロイドが含まれる。

【００２８】「固定化（された）捕捉試薬」は、１つまたは複数の「捕獲部位」を形成する
ために、固相支持体またはクロマトグラフィーストリップの一部に、またはその
表面に取り付けられている１つまたは複数の特異的な結合メンバーをいう。その
ような捕獲部位において、分析物、陽性の対照試薬および／または標識された試
薬がストリップの表面に固定化されるか、あるいは固定化された試薬は、ストリ
ップを通り抜ける分析物および／または標識された試薬の移動を示す。その取り
付け方法は、本発明には重要ではない。固定化された捕捉試薬は、未結合のアッ
セイ試薬および試験サンプルの残り成分から分析物および／または標識された試
薬を実質的に分離することによって検出可能なシグナルの観測を容易にする。さ
らに、固定化試薬は、任意の適切な結合方法によって、アッセイを行う前に、あ
るいはアッセイを行っている間に固相に固定化することができる。

【００２９】典型的には、本発明の捕獲部位は、固定化された捕捉試薬と分析物との間の特
異的な結合反応が生じるように固相支持体の定められた部分または規定された部
分である。これにより、固相支持体の他の部分とは対照的に、１つまたは複数の
捕獲部位で固定化されている標識の検出が容易になる。この規定された部位は、
典型的には固相支持体の５０％未満であり、好ましくは固相支持体の１０％未満
である。固定化された試薬は、浸漬することによって、ペンで刻むことによって
、毛細管または試薬ジェットプリンティングもしくはバイオドッティングの使用
による分注を行うことによって、あるいは任意の他の分注技術によって固相材に
加えることができる。さらに、捕獲部位は、例えば、標識がそのような部位に固
定化されていない場合でも、固相材上での捕獲部位の位置が可視的にまたは装置
により決定され得るように色素で印を付けることができる。好ましくは、固定化
された試薬は、捕獲部位が試験サンプルと直接接触しないようにストリップに配
置される。すなわち、試験サンプルは、固定化された試薬と接触する前に、スト
リップの少なくとも一部を通過する毛管作用によって移動しなければならない。

【００３０】固定化された捕捉試薬は、固相材の表面またはその内部において、１つの捕獲
部位または検出部位に、あるいは多数の部位に提供され得る。本発明の好ましい
実施形態により、固定化された患者捕捉試薬（１つまたは複数）および固定化さ
れた手順上の捕捉試薬が提供される。固定化された捕捉試薬はまた、異なる検出
様式または測定様式を得るために様々な形態で提供され得る。例えば、固定化さ
れた捕捉試薬は、文字、数字、アイコンまたは記号、またはその任意の組合せと
して配置することができる。文字として配置される場合、固定化された捕捉試薬
は、１個の文字であり得るか、あるいは「ＰＯＳ」、「ＮＥＧ」または「ＯＫ」
などの単語または省略語を形成する文字の組合せであり得る。あるいは、固定化
された捕捉試薬は、１つの記号として、あるいはまたは記号の組合せとして配置
することができる：例えば、プラス、マイナス、チェックマーク、縞、ひし形、
三角形、長方形、円、楕円、正方形、矢印、線分、またはその任意の組合せなど
。固定化された捕捉試薬は、固相材の表面またはその内部において、離れた捕獲
部位として、あるいは試薬の「バンド」として提供され得る。あるいは、固定化
された試薬は、捕獲部位を形成するために、実質的に均一であるように固相材の
大部分にわたって分布し得る。患者捕獲部位におけるシグナル生成の程度は、試
験サンプル中の分析物の量に関係する。陽性対照を使用する場合、陽性対照の捕
獲部位におけるシグナル生成の程度は、所望する場合には、ストリップに加えら
れた陽性の対照試薬の量に関係する。

【００３１】用語「陰性対照」または用語「陰性の対照試薬」と交換可能に使用することが
できる「陰性の結合性試薬」は、任意の標識された試薬の非特異的な結合または
凝集の存在を決定するために使用される任意の物質をいう。陰性の対照試薬は、
例えば、抗原、抗体または抗体フラグメントなどの特異的な結合メンバーを含む
物質であり得る。さらに、陰性の対照試薬は、試験ストリップ上のそれ以外の試
薬と同じ種または異なる種から、あるいは２つ以上の種の組合せから得ることが
できる。試験ストリップ上の陰性の対照試薬から得られる検出可能なシグナルの
存在は、無効な試験であったことを示す。

【００３２】「補助的な特異的結合メンバー」は、表示用試薬または固定化された捕捉試薬
の特異的な結合メンバーに加えて、アッセイにおいて使用される特異的な結合対
の任意の成分をいう。１つまたは複数の補助的な特異的結合メンバーをアッセイ
において使用することができる。例えば、補助的な特異的結合メンバーは、例え
ば、分析物自身が表示用試薬に直接結合できない場合に、表示用試薬を目的の分
析物に結合させることができる。あるいは、補助的な特異的結合メンバーは、例
えば、分析物自身が固定化捕捉試薬に直接結合できない場合に、固定化された捕
捉試薬を目的の分析物に結合させることができる。このような補助的な結合メン
バーは、アッセイデバイスに組み込むことができ、あるいは別個の試薬溶液とし
てデバイスに加えることができる。

【００３３】「固相支持体」または「クロマトグラフィー材」または「ストリップ」は、デ
バイスの反応部位を含み、そして分析物または試験サンプルが毛管作用により輸
送され得る任意の適切な多孔性、吸着性、吸収性、等方性または毛細作用性の物
質をいう。多数の材料が互いに流動流的に接触しており、それによって試験サン
プルがそのような物質の間を通過することができる限り、ストリップは単一の材
料または複数の材料から作製できることが理解される（例えば、それぞれの帯域
、部分、層、領域または部位は、異なる材料から作製することができる）。流動
流的な接触は、試験サンプルの少なくともいくつかの成分（例えば、分析物）が
多孔性材料の帯域の間を通過することを可能にし、そして好ましくは、異なる帯
域の間の接触境界に沿って一様である。

【００３４】従って、合成的に改変された天然の物質、合成された物質、または天然に存在
する物質は、固相支持体として使用することができ、紙、セルロースならびに酢
酸セルロースおよびニトロセルロースなどのセルロース物質の紙（繊維状）また
は膜（微孔性）；ガラス繊維；織物（天然に存在する織物（例えば、綿）および
合成織物（例えば、ナイロン）の両方）などを含む。多孔性物質は、検出可能な
シグナルの生成を妨害してはならない。クロマトグラフィー材は固有の強度を有
し得るか、あるいは強度は補強剤によって提供され得る。

【００３５】ストリップ材の個々の大きさは、関与する試験サンプルの大きさ、アッセイプ
ロトコル、シグナルの検出手段および測定手段などに依存して便宜的なものであ
る。例えば、大きさは、クロマトグラフィー材によって吸収され得る試験サンプ
ルの量と同様に、流体の移動速度を調節するために選ぶことができる。

【００３６】適する場合には、１つのアッセイデバイスにおける多数のストリップの組合せ
を可能にするストリップの大きさを選ぶ必要がある。試験溶液、浸透溶液または
シグナル生成成分と接触したときに色が変化することによって結合アッセイの完
了（すなわち、アッセイ標示物の終わり）を示す試薬をクロマトグラフィー材の
遠位端に有することもまたは本発明の範囲に含まれる。水を含有する試験溶液と
接触したときに色が変化する試薬は、ＣｕＳＯ_４、Ｃｏ（ＮＯ_３）_２などの脱水
した遷移金属塩である。緩衝化された浸透溶液のｐＨに応答するｐＨ表示用色素
もまた選択することができる。例えば、フェノールフタレインは、８．０〜１０
．０の間のｐＨを有する浸透溶液と接触したときに、透明（すなわち、無色）か
ら鮮やかなピンク色に変化する。

【００３７】捕捉試薬は、それらがそれぞれのその標識された試薬の流動経路内に位置する
ならば、１つまたは複数の経路において試験ストリップに沿って任意のところに
設置することができる。流体がストリップを移動しているとき、流動の十字流が
ほとんどないことが当業者により理解されている。従って、流体流に接触するす
べての移動し得る試薬もまた、流動流の方向に移動する。すなわち、試薬は、実
質的には、ストリップを横切るようには移動しない。

【００３８】本発明はさらに、結合アッセイを行うためのキットを提供する。例えば、本発
明によるキットは、図１２に示されている試験ストリップなどの試験ストリップ
を含むことができ、あるいは上記に記載されているような試薬ならびに輸送溶液
および／または試験サンプル前処理試薬が組み込まれた櫛形またはカード型のデ
バイスを含むことができる。当業者に知られている他のアッセイ成分には、緩衝
液、安定化剤、界面活性剤、細菌阻害剤などが含まれ、これらもまた、アッセイ
デバイスまたは別個の試薬溶液に存在し得る。

【００３９】本発明は、任意に、デバイスの周囲に非反応性のカバー（これはまた、エンク
ロージャーまたはケーシングと呼ばれる）を含む。好ましくは、このようなカバ
ーは、少なくとも、捕獲部位との接触および捕獲部位の汚染を防止するためにス
トリップを包む。カバーはまた、一定量の試験サンプルおよび／または浸透溶液
の収容および／または含有を容易にする適用パッドに隣接する隆起した領域を含
むことができる。あるいは、カバーは、文字、数字、アイコンまたは記号あるい
はその任意の組合せの形態で切り取られた１つまたは複数の領域を含むことがで
きる。このような実施形態において、切り取られた１つまたは複数の領域は、ス
トリップが完全に包み込まれたときに、１つまたは複数の特定の捕獲部位に必要
な構造を形成している。加えられた試験サンプルが、ストリップの一部を最初に
通過することなく、ストリップの十分な部分が捕獲部位と接触しないように包み
込まれることが好ましい。

【００４０】デバイスの別の構成要素は、付加的な特徴であり得るが、試験サンプル適用パ
ッドである。この適用パッドは、試験サンプルが適用パッドからストリップに通
過または移動し得るようにストリップ物質の一方の端（これは近位端と呼ばれる
）と流動流的に接触している。流動流的な接触には、クロマトグラフィー材に対
する適用パッドの物理的な接触、ならびに流体が依然としてパッドとストリップ
との間を通過することができる途中の空間またはさらなる物質によるパッドのス
トリップからの分離が含まれる。適用パッドの実質的に全体は、試験サンプルが
適用パッドの実質的に任意の部分を通してストリップの近位端に通過することを
可能にするクロマトグラフィー材を覆うことができる。あるいは、適用パッドの
一部のみが、クロマトグラフィー材と流動流的に接触していてもよい。適用パッ
ドは、試験サンプルをクロマトグラフィー材に移動させることができ、そしてク
ロマトグラフィー材の総容量に等しいか、あるいはそれよりも多い量の試験サン
プルを吸収することができる任意の物質であり得る。

【００４１】適用パッドにおける使用に好ましい物質には、ニトロセルロース、多孔性ポリ
エチレン製のフリットまたはパッド、およびガラス繊維ろ紙が含まれる。そのよ
うな物質はまた、分析物およびアッセイ試薬と適合性し得るように選択しなけれ
ばならない。

【００４２】さらに、適用パッドは、典型的には、それに拡散し得るように、あるいは拡散
し得ないように取り付けられた１つまたは複数のアッセイ試薬を含有する。適用
パッドに含有され得る試薬には、検出可能なシグナルを生成するために必要な標
識された試薬、補助的な特異的な結合メンバーおよびシグナル生成システムの成
分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、結合アッセイにおいて、標識
された試薬は適用パッドに含有されることが好ましい。標識された試薬は、試験
サンプルが加えられることによってパッドからストリップに放出され、それによ
ってデバイスを使用する前に試験サンプルおよび標識された試薬を一緒にしなけ
ればならないことが省略される。適用パッドにおけるアッセイ試薬の単離はまた
、反応性試薬を別々にし、そして製造プロセスを容易にする。

【００４３】いくつかの場合によって、適用パッドはまた、試験サンプルおよび試薬に関す
る最初の混合部位および反応部位として機能する。好ましい実施形態において、
適用パッド物質は、ストリップ物質単独によって達成される速度よりも早い速度
で試験サンプルを吸収するように選択される。典型的には、パッド物質はストリ
ップ物質よりも２倍〜５倍早く流体を吸収するように選択される。好ましくは、
パッドはストリップ物質よりも４倍〜５倍早く流体を吸収する。

【００４４】本発明の必要に応じて行われる実施形態において、ゼラチンが、適用パッドの
すべてまたは一部を包み込むために使用される。典型的には、そのような封じ込
めは、魚のゼラチンで適用パッドの表面をコーティングすることによって得られ
る。このようなコーティングの効果は、適用パッドに含有される試薬の安定性を
大きくすることである。試験サンプルをコーティングされた適用パッドに加える
ことによって、ゼラチンは溶解し、それによって試薬の溶解が可能になる。本発
明の別の実施形態において、試薬を含有する適用パッドは、デバイスの保管寿命
を大きくするために乾燥または凍結乾燥される。凍結乾燥された適用パッドは、
風乾された適用パッドよりも強いシグナルが得られることが見出されている。さ
らに、凍結乾燥された適用パッドは、安定性がより長い期間維持されることが見
出されている。適用パッドに含有される試薬は、試験サンプルをパッドに加える
ことによって再水和される。

【００４５】本発明はまた、ろ過手段を加えることによって改変することができる。このよ
うなろ過手段は、適用パッドの上部に、あるいは適用パッドとストリップ物質と
の間に置かれた別個の物質であり得る。あるいは適用パッド自体の物質を、その
ろ過能力に関して選ぶことができる。ろ過手段には、試験サンプルから一定の大
きさを超える粒子を除くために使用される任意のフィルターまたは捕捉デバイス
が含まれ得る。例えば、血漿が適用パッドによって収容され、そしてクロマトグ
ラフィー材に移される流体であるように、フィルター手段を使用して、赤血球を
全血サンプルから除くことができる。

【００４６】本発明のさらに別の実施形態は、適用パッドとクロマトグラフィー材との間に
置かれているか、あるいは適用パッドを覆っている多孔性物質の１つまたは複数
のさらなる層の使用を包含する。そのようなさらなるパッドまたは層は、適用パ
ッドからストリップへの試験サンプルの流速を制御する手段として役立ち得る。
そのような流速調節は、試験サンプルおよび試薬（１つまたは複数）の適用パッ
ドにおける反応のために長いインキュベーション時間が望ましい場合には好まし
い。あるいは、そのような層は、試験サンプルが加えられるまでは適用パッドの
試薬（１つまたは複数）から分離されていることが好ましいさらなるアッセイ試
薬（１つまたは複数）を含有することができる。あるいは、そのような層は、未
反応のアッセイ試薬がクロマトグラフィー材へ通過することを防ぐために役立つ
得る。

【００４７】少量の非水性または粘性の試験サンプルが適用パッドに加えられた場合、試薬
（１つまたは複数）および試験サンプルを適用パッドから移動させ、そしてスト
リップを通過させるために、緩衝化された溶液が好ましい浸透溶液または輸送溶
液を用いらなければならないことがある。水性の試験サンプルが使用される場合
、輸送溶液は、一般に必ずしも必要ではないが、デバイスを通過する流動特性を
改善するために、あるいは試験サンプルのｐＨを調節するために使用することが
できる。輸送溶液は、典型的には、約５．５〜約１０．５の範囲のｐＨを有し、
より好ましくは約６．５〜約９．５の範囲のｐＨを有する。ｐＨは、結合アッセ
イにおいて、特異的な結合メンバーの間で大きなレベルの結合親和性が維持され
るように選択される。しかし、表示用試薬の標識成分が酵素である場合、ｐＨは
また、酵素的なシグナル生成システムにおける発色に必要な大きな酵素活性が維
持されるように選択しなければならない。例示的な緩衝液には、リン酸塩、炭酸
塩、バルビタール、ジエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン
（Ｔｒｉｓ）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール
などが含まれる。輸送溶液および試験サンプルは、適用パッドと接触させる前に
一緒にすることができる。あるいはそれらは、続けて適用パッドに接触させるこ
とができる。

【００４８】所定量のシグナル生成成分および補助的な試薬をデバイスに組み込むことがで
き、それによって、さらなるプロトコル工程または試薬の添加を行わなければな
らないことが避けられる。従って、固定化され得る２つ以上の試薬が適用パッド
および／またはストリップ物質に提供されることもまた本発明の範囲内である。

【００４９】本発明によりアッセイデバイスおよび方法が提供されるが、この場合、デバイ
スは、患者サンプルでの１回のアッセイを行うために、あるいは患者サンプルで
多数のアッセイを行うために液体を輸送し得るクロマトグラフィー材のストリッ
プを使用する。そのようなデバイスには、ストリップと流動流的に接触している
試験サンプル適用パッドであって、クロマトグラフィー材への試験サンプルの流
れを調節するために、試験サンプルをろ過するために、そしてアッセイ試薬の送
達および／または混合を行うために機能する試験サンプル適用パッドが含まれる
。アッセイ試薬は、適用パッドならびにクロマトグラフィー材に組み込むことが
できる。デバイスでの試薬含有部位の構造を変えることによって、アッセイの定
性的表示および定量的表示を得ることができる。好ましくは、試薬は、アッセイ
を実質的に自己完結性にするように、そしてアッセイ結果の検出および定量を容
易にするようにデバイスに配置される。この場合、試薬含有部位および／または
結合アッセイでの反応から生じる１つまたは複数の検出可能なシグナルを、装置
によって、あるいは直接可視的な観察によって検出することができる。

【００５０】本発明は、試験サンプルにおけるＭ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩ
Ｖ−２に対する抗体を同時に検出して識別するためのアッセイ、およびこのよう
な検出および識別を同時に行うための分析デバイスを提供する。サンドイッチア
ッセイ形式において、分析物（例えば、Ｍ群ＨＩＶ−１に対する抗体）の含有が
疑われる試験サンプルを所定量の表示用試薬（この場合、標識化された抗種抗体
［Ａｂ^＊］）と接触させて、分析物／表示用試薬の複合体（Ａｂ−Ａｂ^＊）を含
有する反応混合物を形成させる。表示用試薬（Ａｂ^＊）は、試験デバイスとは別
であってもよく、あるいは好ましくは試験デバイスに組み込まれていてもよい。
次いで、得られる反応混合物は試験ストリップの中を移動する。反応混合物は、
個別に固定化された分析物に特異的な結合メンバー（［│−Ａｇ］）を含有する
捕捉試薬部位（Ｍ群ＨＩＶ−１に対する部位、Ｏ群ＨＩＶ−１に対する部位、お
よびＨＩＶ−２に対する部位）と接触し、表示用試薬から離れて分析物での部位
で結合する。従って、捕捉試薬は、Ａｂ−Ａｂ^＊複合体に結合して、捕獲部位で
検出され得る固定化された│−Ａｂ−Ａｇ−Ａｂ^＊複合体を形成することができ
る。さらに、反応混合物はまた、試験ストリップの中をさらに移動して、アッセ
イ表示用部位の終端に存在する試薬と反応し得る。

【００５１】図１３を参照すると、アッセイに必要な試験デバイス（１８）は、離れた別個
の捕獲領域において、Ｍ群ＨＩＶ−１（２６）、Ｏ群ＨＩＶ−１（２８）および
ＨＩＶ−２のｇｐ４１（３０）に由来する選択された特異的な高度に精製された
組換え抗原のそれぞれ領域が設置され、そして乾燥されたニトロセルロース膜ス
トリップ（２４）を含む。試験デバイス（１８）はさらに結合パッド（３２）を
含む。このパッドは、ニトロセルロースをブロッキングするためのタンパク質を
含有する流体に懸濁された抗種抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ）との感受性を
有するセレンコロイドを提示するガラス繊維フィルター（３４）を含み、このフ
ィルターは、組み立ての前に乾燥され、そしてニトロセルロース膜（２４）の遠
位端（２０）に固定されている。デバイス（１８）の全体は、ニトロセルロース
膜（２４）の上面と接触して、結合パッド（２０）に取り付けられている接着性
表面（３８）を有する上部の透明な積層材（３６）、およびニトロセルロース膜
（２４）の底面（４８）と接触している接着性表面（３８）を有する底部の積層
材（４８）によって所定の位置に固定的に保持されている。試験流体は、遠位端
（２０）から近位端（２２）に流れて、３つの離れた別個の捕獲領域のそれぞれ
と接触する。デバイスはまた、抗種（すなわち、抗ヒト）結合体が置かれている
試験サンプルパッドで反応性帯域（４０）を有する。デバイスはまた、好ましく
は、デバイスにおける何らかの残留流体を吸収するためのブロッター（４４）を
有し、そしてアッセイの完了を示すための部位（４６）を有する。（捕獲領域お
よび／または試験サンプル反応性帯域での）読み取りは、実験室装置の助けを借
りることなく可視的に直接読み取ることができ、あるいは装置によって自動的に
行うことができる。さらに、試験デバイスは、成型されたプラスチックまたは他
の適切な材料のケーシング（４２）の中に包み込むことができる。

【００５２】アッセイは下記のように行われる。ヒト血清などの試験サンプルを、好ましく
は緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．４）、１％ｗ／ｖの固体ウシ血清アル
ブミン［ＢＳＡ］、０．４％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（登録商標）、
１．５％ｗ／ｖのカゼイン、３％ｗ／ｖのウシＩｇＧ、４％ｗ／ｖの大腸菌溶解
物からなる溶出緩衝液、ｐＨ８．２；１μｌの血清を１００μｌの溶出緩衝液で
希釈する）で前もって希釈し、試験デバイスの遠位端（２０）で抗ＩｇＧコロイ
ド結合体と接触させる。試験サンプル中のＩｇＧを抗ＩｇＧコロイドによって結
合させ、複合体は、吸収パッド（好ましくは、ニトロセルロース膜）の長さ方向
に沿ってクロマトグラフィー的に分離される。複合体が流れるに従って、複合体
は、ＨＩＶ組換え抗原が前もって加えられている離れた帯域（図１３、３０、２
６および２８の各部位）を通り抜ける。複合体が組換え抗原に特異的な抗体を含
有する場合、離れた帯域のいずれかで反応が起こり、そして赤色帯が適切な帯域
（１つまたは複数）で現れる。多数の特異性を同時に決定することができる。さ
らに、試験される３つのすべての抗原に関して陽性で、まとめた試験サンプルか
らなる陽性対照は、この３つの帯域のすべてで陽性に反応し得る。あるいは、試
験における抗原のそれぞれと反応し得る陽性の対照サンプルは、抗体がアッセイ
されているそれぞれの分析物に関して別々に流すことができる。

【００５３】Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体分析物は、こ
のようなアッセイにおいて、本明細書中に記載されているポリペプチド（アミノ
酸）配列の全体または一部を含む合成ポリペプチド、組換えポリペプチドまたは
精製ポリペプチドを捕獲捕捉試薬として使用することによって検出可能であり得
ることも意図され、そして本発明の範囲に含まれる。「精製タンパク質」（また
は「精製ポリペプチド」）は、目的のポリペプチドが天然に会合している細胞成
分を実質的に含まない、すなわち、そのような細胞成分の約５０％未満、好まし
くは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含む目的のポリペプチドまた
はそのフラグメントを意味する。精製方法はこの分野では知られている。本明細
書中において交換可能に使用されている「組換えポリペプチド」または「組換え
タンパク質」または「組換え技術により製造されたポリペプチド」は、その起源
または操作に基づいて、実際に会合し、かつ／または実際に結合しているポリペ
プチド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドのすべてまたは一部と会
合していないポリペプチドを表す。組換えまたはコードされるポリペプチドまた
はタンパク質は、示されている核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。
そのようなポリペプチドまたはタンパク質はまた、化学合成または組換え発現シ
ステムの発現を含む任意の方法で得ることができる。さらに、本明細書中で使用
されている用語「合成（された）ペプチド」は、当業者にはよく知られている方
法によって化学合成することができる任意の長さを有するアミノ酸のポリマー形
態を意味する。このような合成ペプチドは様々な適用において有用である。

【００５４】Ｏ群ＨＩＶ−１に好ましい捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番
号５２および配列番号５４、配列番号５８および配列番号６０からなる群より選
択されるポリペプチド配列を含む。Ｍ群ＨＩＶ−１に関する捕捉試薬は配列番号
５６を含む。ＨＩＶ−２に関する捕捉試薬は配列番号５５を含む。これらのポリ
ペプチドは組換え技術によって製造されることが好ましい。

【００５５】次に、本発明を実施例によって説明するが、実施例は、本発明の精神および範
囲を例示するものであり、本発明の精神および範囲を限定するものではない。

【００５６】実施例実施例１．クローニング遺伝子の構築および配列決定に必要なオリゴヌクレオチドを、Ａｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＯｌｉｇｏＥｔｃ．（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ、Ｃ
Ａ）で合成した。ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＵｌＴｍａＤ
ＮＡポリメラーゼを含むすべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬をＰｅｒ
ｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ
）から購入し、そして別途示されていない限り、製造者の仕様に従って使用した
。ＰＣＲ増幅をＧｅｎｅＡｍｐ９６００サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）で行った。別途示されていない限り、制限酵素をＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入し、そして消化を製造
者の指示に従って行った。クローニングのために使用したＤＮＡフラグメントは
、別途示されていない限り、アガロース（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ゲルで単離した。

【００５７】所望のフラグメントを切り出し、そしてＤＮＡを、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出
キットまたはＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．、Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って抽出した。ＤＮＡをＨ _２ＯまたはＴＥ［１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０；ＢＲ
ＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０；ＢＲＬＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］に再懸濁した。連結を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
のＤＮＡ連結キット（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ
、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して製造者の指示に従って行った。連結は１
６℃で一晩のインキュベーションにより行った。

【００５８】細菌の形質転換は、ＭＡＸＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹＤＨ５αコンピテント細
胞（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥｐｉｃｕｒｉａｎ
ＣｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造者のプロトコルに従って
行った。別途示されていない限り、形質転換体および細菌の再度の画線接種は、
示されているように、１５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｍ１０９０；Ｍｉｃｒｏ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌｏｍｂａｒｄ、ＩＬ）を含むＬＢ寒天（Ｌｅｎｎｏ
ｘ）平板、またはグルコースを２０ｍＭの最終濃度に補充したＬＢ寒天＋アンピ
シリン平板に播種した。すべての細菌のインキュベーション（平板および一晩の
培養）は３７℃で一晩（約１６時間）行った。

【００５９】所望のクローンを同定するための形質転換体のスクリーニングは、ミニプレッ
プＤＮＡの配列決定および／またはコロニーＰＣＲによって行った。ミニプレッ
プＤＮＡは、別途示されていない限り、ＱｉａｇｅｎＴｉｐ２０Ｐｌａｓ
ｍｉｄＰｒｅｐＫｉｔまたはＱｉａｇｅｎＱＩＡｗｅｌｌ８Ｐｌａｓ
ｍｉｄＰｒｅｐＫｉｔを用いて製造者の仕様に従って行った。コロニーＰＣ
Ｒによるスクリーニングに関しては、個々のコロニーを形質転換平板から拾い、
１００μｌの滅菌Ｈ_２Ｏを含有する滅菌された平底の９６ウエルプレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ、ＭＡ）のウエルに移した。１／３の量を別のプ
レートに移して４℃で保存した。元の９６ウエルプレートを５分間電子レンジで
処理して、細胞を破壊した。次いで、１μｌ量をテンプレートとしてＰＣＲチュ
ーブに移した。１μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液、１μｌの２ｍＭの各ｄＮＴＰ、
１μｌ（１０ｐｍｏｌ）のセンスプライマー、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）のアンチ
センスプライマー、０．０８μｌのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（０
．４ユニット）、および４．２μｌのＨ_２Ｏを含有する９μｌのＰＣＲマスター
混合物をＰＣＲチューブに加えた。反応物を、一般に、９４℃で３０秒間、（プ
ライマーのアニーリング温度に依存して）５０℃〜６０℃で３０秒間、および７
２℃で６０秒間の２０サイクル〜２５サイクルで増幅する。プライマーは挿入物
に依存し、サイクル条件を、プライマーのアニーリング温度および予想される生
成物の長さに基づいて変更した。ＰＣＲサイクルを行った後、反応量の約１／３
をアガロースゲルに負荷して分析した。所望のクローンを含有するコロニーを転
写平板から拡大培養した。

【００６０】別途示されていない限り、ＤＮＡの配列決定は、自動化されたＡＢＩＭｏｄ
ｅｌ３７３ＳｔｒｅｔｃｈＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ）で行った。配列決定反応液を、ＦＳＴＡＣＳＤｙｅＴｅｒｍＲｅａ
ｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の試薬および２
５０ｎｇ〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて製造者の仕様に従って調製し
た。反応液をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラム（ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａ
ｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）で処理し、その後、配列決定装置に
かけた。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ３．０（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）およびＧｅｎｅＷｏｒｋ
ｓ２．４５（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）を使用して分析した。

【００６１】実施例２．Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２のｅｎｖ配列の決定ウイルスＲＮＡを、ＨＡＭ１１２（Ｈ．Ｈａｍｐｌ他、上記）と名付けられた
Ｏ群ＨＩＶ−１単離体を感染させたヒト末梢血単核細胞の培養上清から、ＱＩＡ
ａｍｐＢｌｏｏｄＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）および製造者の指示する手順を使
用して抽出した。ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない５０μｌ量の水（５Ｐｒｉ
ｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）で溶出して、−７０℃
で保存した。ｅｎｖ領域配列を得るための方法には、４つの重複するｅｎｖ遺伝
子フラグメントのｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ（ネステッド）増幅が含まれる。増
幅産物を、直接、自動化されたＡＢＩＭｏｄｅｌ３７３Ｓｔｒｅｔｃｈ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで配列決定した。増幅反応を、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰ
ＣＲＫｉｔおよびＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＫｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ）を用いて製造者の指示に従って行った。オリゴヌクレオチドプライマーの位
置は、ＨＩＶ−１ＡＮＴ７０ｅｎｖ配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓ他編、上記）に対
応する。ｅｎｖ１０Ｒ（ヌクレオチド（ｎｔ）７９１〜７７２；配列番号６２）
、ｅｎｖ１５Ｒ（ｎｔ１５９２〜１５７４；配列番号６３）、ｅｎｖ２２Ｒ（ｎ
ｔ２３２１〜２３０２；配列番号６４）、ｅｎｖ２６Ｒ（ｎｔ２５０〜２３２、
ｅｎｖの３’；配列番号６５）のプライマーを使用して、フラグメント１〜４の
ｃＤＮＡをそれぞれ合成した。逆転写反応液を、４２℃で３０分間、次いで９９
℃で５分間インキュベーションした。最初のＰＣＲ増幅は、９５℃で３０秒間、
５２℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３０サイクルからなり、ｅｎｖ１Ｆ
（ｎｔ１８４〜１６６、ｅｎｖの５’；配列番号６６）およびｅｎｖ１０Ｒ（配
列番号６２）、ｅｎｖ７Ｆ（ｎｔ５６４〜５８６；配列番号６７）およびｅｎｖ
１５Ｒ（配列番号６３）、ｅｎｖ１２Ｆ（ｎｔ１２８９〜１３０８；配列番号６
８）およびｅｎｖ２２Ｒ（配列番号６４）、ｅｎｖ１９Ｆ（ｎｔ２０２０〜２０
４０；配列番号６９）およびｅｎｖ２６Ｒ（配列番号６５）のプライマーの組合
せを、それぞれ、フラグメント１〜４のために使用した。第２回目のＰＣＲ増幅
（ネステッドＰＣＲ）に関しては、最初のＰＣＲ反応液の５μｌをそれぞれテン
プレートとして、ｅｎｖ２Ｆ（ｎｔ３７〜１５、ｅｎｖの５’；配列番号７０）
およびｅｎｖ９Ｒ（ｎｔ７４０〜７２１；配列番号７１）、ｅｎｖ８Ｆ（ｎｔ６
３１〜６５０；配列番号７２）およびｅｎｖ１４Ｒ（ｎｔ１４３７〜１４１６；
配列番号７３）、ｅｎｖ１３Ｆ（ｎｔ１３３３〜１３５４；配列番号７４）およ
びｅｎｖ２１Ｒ（ｎｔ２２８２〜２２６５；配列番号７５）、ｅｎｖ２０Ｆ（ｎ
ｔ２１２２〜２１４１；配列番号７６）およびｅｎｖ２５Ｒ（ｎｔ１１１〜９４
、ｅｎｖの３’；配列番号７７）のプライマーの組合せとともに、それぞれ、フ
ラグメント１〜４のために使用した。２回目の増幅条件は、第１回目に使用した
条件と同一であった。フラグメントをアガロースゲルで精製して、Ｑｉａｇｅｎ
社のＱＩＡＥＸＩＩＧＥＬＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて抽出し
た。フラグメントの直接的な配列決定を、ネステッドＰＣＲに使用したプライマ
ーと、フラグメント１に関してはｅｎｖ４Ｆ（配列番号７８）およびｅｎｖ５Ｒ
（配列番号７９）のプライマーとともに、フラグメント２に関してはｅｎｖ１０
Ｆ（配列番号８０）、ｅｎｖ１１Ｆ（配列番号８１）、ｅｎｖ１１Ｒ（配列番号
８２）、ｅｎｖ１２Ｆ（配列番号６８）およびＡＧ１（配列番号８７）のプライ
マーとともに、フラグメント３に関してはｅｎｖ１５Ｆ（配列番号８３）および
ｅｎｖ１９Ｒ（配列番号８４）のプライマーとともに、フラグメント４に関して
はｅｎｖ２２Ｆ（配列番号８５）およびｅｎｖ２４Ｒ（配列番号８６）のプライ
マーとともに使用して行った。Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２に由来するｅ
ｎｖの推定アミノ酸配列を図１に示す。

【００６２】実施例３．Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４１の合成遺伝子の構築図２は、Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４１の合成遺伝子構築体
を作製するために使用した方法を示す。ｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４１配列は、
Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２（配列番号６１）（Ｈ．Ｈａｍｐｌｅ他）に
基づいた。ＨＡＭ１１２のｅｎｖ配列の決定は、上記の実施例２に概略が示され
ている。ｅｎｖｇｐ１２０のＣ末端の４５アミノ酸およびｅｎｖｇｐ４１の
３２７アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを設計した（ヌクレオチド＃１
は、合成遺伝子におけるｇｐ１２０の最初のコドンの最初の塩基である）。合成
遺伝子は、天然のＨＡＭ１１２のｇｐ４１に対して、ｇｐ４１の大きな疎水性（
Ｈ）領域（膜貫通領域）を含む２６アミノ酸（ヌクレオチド６４３〜７２０）の
欠失を有する。従って、構築された合成ｇｐ４１遺伝子の全長は３２７アミノ酸
である。

【００６３】合成オリゴヌクレオチドにおいて、天然のＨＩＶ−１のコドンを、大腸菌にお
ける組換えタンパク質の発現レベルを増大させるために、大腸菌のコドン使用偏
りに適合するように変更した。例えば、Ｍ．ＧｏｕｙおよびＣ．Ｇａｕｔｉｅｒ
、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１０：７０５５（１９８２
）；Ｈ．ＧｒｏｓｊｅａｎおよびＷ．Ｆｉｅｒｓ、Ｇｅｎｅ１８：１９９（１
９８２）；Ｊ．Ｗａｔｓｏｎ他（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、第４版、ＢｅｎｊａｍｉｎＫｕｍｍｉｎｇＰｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、４４０頁（１９８７）を参照のこと。遺伝子の構築方
法には、相補性末端を有する一連の重複するオリゴヌクレオチドの合成が含まれ
る（Ｏｓｙｎ−ＡからＯｓｙｎ−Ｌ、Ａ〜Ｌとして表される）。アニーリングさ
せたとき、末端は、相補鎖を伸長させるためのプライマーとして役立った。

【００６４】次いで、フラグメントをＰＣＲにより増幅した。このプロセス（オリゴヌクレ
オチドの「ＰＣＲ再編成（ｋｎｉｔｔｉｎｇ）」）を繰り返して、遺伝子フラグ
メントを順次大きくした。オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−５’は、ｐＬベクター
ｐＫＲＲ８２６へのクローニングのために設計された。発現ベクターｐＫＲＲ８
２６は、米国特許出願第０８／３１４，５７０号（これは参考として本明細書中
に援用される）に記載されているλｐＬプロモーターベクターｐＳＤＫ８１６の
改変体である。ｐＫＲＲ８２６は、温度感受性のｃＩリプレッサー（抑制）遺伝
子（Ｂｅｎａｒｄ他、Ｇｅｎｅ５：５９［１９７９］）を含有するｐＢＲ３２
２の高コピー数型誘導体である。しかし、ｐＫＲＲ８２６は、翻訳ターミネータ
ーｒｒｎＢｔ１を有しておらず、そして、ｐＳＤＫ８１６に対して、逆方向でλ
ｐＬプロモーターおよびλｐＲプロモーターを有する。ｐＫＲＲ８２６のポリリ
ンカー領域は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位を含有し、ＡＴＧの
開始コドンを有していない。最適な発現は、（Ｎ末端のメチオニンを含む）遺伝
子挿入物の５’端をＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたときに得られる。Ｏｓｙ
ｎ−５’は、クローニングするためのＥｃｏＲＩ制限部位、および組換えタンパ
ク質の適正な翻訳を開始させるためのＡＴＧコドン（メチオニン）を含有するよ
うに設計された。アンチセンスのオリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｏ３’（配列番
号１５）、Ｏｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）およびＯｓｙｎ−Ｍ（Ｍ）（配列
番号１４）はそれぞれ、２つの連続した翻訳終了コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ）およ
びＢａｍＨＩ制限部位を含有する。外側のプライマーであるＯｓｙｎ−５’（配
列番号１１）およびＯｓｙｎ−Ｍ（Ｍ）（配列番号１４）を使用した場合、全長
のｇｐ４１（３２７アミノ酸）遺伝子が合成された（ｐＧＯ−１１ＰＬ；配列番
号５２）。外側のオリゴヌクレオチドであるＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）お
よびＯｓｙｎ−３’（配列番号１５）は、１９９アミノ酸の切形ｇｐ４１産物が
得られた（ｐＧＯ−９ＰＬ；配列番号４８）。あるいは、外側のオリゴヌクレオ
チドであるＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）およびＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号
１６）は、長さが１６９アミノ酸の切形ｇｐ４１産物が得られた（ｐＧＯ−８Ｐ
Ｌ；配列番号５８）。

【００６５】合成遺伝子はまた、ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）融合タンパク質と
して発現させた。合成遺伝子のｐＫＲＲ８２６からｐＪＯ２００（これは米国特
許出願第５７２，８２２号に記載されており、参考として本明細書中に援用され
る）へのＰＣＲ媒介による移動を、代わりの外側のセンスオリゴヌクレオチドＰ
ＣＲプライマー（５’末端）、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番号２５）を用いて
行った。Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳはＥｃｏＲＩ制限部位を含有し、そして発現ベク
ターｐＪＯ２００においてＣＫＳに対して合成遺伝子挿入物の読み枠が合った融
合体が生じた。３’の外側のプライマー（アンチセンス）Ｏｓｙｎ−Ｍ（配列番
号１４）、Ｏｓｙｎ−Ｏ３’（配列番号１５）およびＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番
号１６）をＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番号２５）と組み合わせて使用して、ｐ
ＧＯ−１１ＣＫＳ（配列番号５４）、ｐＧＯ−９ＣＫＳ（配列番号５０）および
ｐＧＯ−８ＣＫＳ（配列番号６０）をそれぞれ作製した。これらの工程を下記に
詳しく示す。

【００６６】Ａ．合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再編成３つのＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を下記のように調製した：（１）反応１Ｂ：ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）および
１Ｘ緩衝液、ならびに４０μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰお
よびｄＴＴＰ）、そして２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ａ（配
列番号３）およびＯｓｙｎ−Ｄ（配列番号５）、そして０．２５ｐｍｏｌの各オ
リゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｂ（配列番号１７）およびＯｓｙｎ−Ｃ（配列番号
４）；（２）反応２Ａ：ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液
、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各
オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｅ（配列番号６）およびＯｓｙｎ−Ｈ（配列番号
９）、そして０．２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｆ（配列番号
７）およびＯｓｙｎ−Ｇ（配列番号８）；および（３）反応３Ｂ：ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液
、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各
オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｉ（配列番号１０）およびＯｓｙｎ−Ｌ（配列番
号１３）、そして０．２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｊ（配列
番号１８）およびＯｓｙｎ−Ｋ（配列番号１２）。

【００６７】増幅は、９７℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の２
０サイクルからなった。次いで、反応液を７２℃で７分間インキュベーションし
、そして４℃で保った。ＰＣＲにより得られた生成物１Ｂ、２Ａおよび３Ｂを１
％ゲルアガロースゲルでゲル単離した。

【００６８】Ｂ．反応１Ｂおよび反応２Ａから得られたＰＣＲ産物のＰＣＲ再編成ＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液
、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２４．４ｐｍｏｌ
のオリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）および２５ｐｍｏｌのオ
リゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）、そして上記の実施例３の
セクション１Ａから得られた約１０ｎｇのゲル単離した１Ｂおよび２Ａの生成物
を用いて調製した。サイクル条件は、実施例３のセクション１Ａの場合と同じで
あった。２回目の増幅を行って、より多くの所望する産物を作製した。これは、
４９ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｐ
３’（配列番号１６）、およびテンプレートとして最初のＰＣＲから得られた５
μｌのＰＣＲ産物を用いて上記のＵｌＴｍａ混合物（１００μｌの反応容量）を
作製することによって行われた。これらの反応液を９４℃で９０秒間インキュベ
ーションし、次いで上記（セクション３Ａ）のＰＣＲサイクルを行った。Ｏｓｙ
ｎ−５’／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物を上記のようにゲル単離した。

【００６９】Ｃ．Ｏｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物のクローニングＯｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩの制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで
消化して、ゲル単離したベクターｐＫＲＲ８２６（上記）に連結した。連結産物
を使用して、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。所望のクローンを、ｐ
ＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列番号３８）およびｐＫＲＲＢａｍＨＩリバー
ス（配列番号３９）のオリゴヌクレオチドを使用するコロニーＰＣＲによって同
定した。ミニプレップＤＮＡをｐＧＯ−８候補クローンＡ２の一晩培養物から調
製して、Ｏｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’プラスミド挿入物を、ｐＫＲＲＥｃ
ｏＲＩフォワード（配列番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配列番号３
９）、４１ｓｙ−１（配列番号４４）および４１ｓｙ−２（配列番号４１）のオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。

【００７０】Ｄ．ｐＧＯ−８候補クローンＡ２の改変１００μｌ容量のＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）
および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、
５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−５’−ｒｅｐａｉｒ（配列番号２
４）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）、およびテンプレート
Ａ２として、（上記の反応から得られた）約１ｎｇのｐＧＯ−８候補クローンミ
ニプレップＤＮＡを用いて調製した。反応液を９４℃で９０秒間インキュベーシ
ョンし、次いで９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間
の２０サイクルで増幅した。次いで、Ｏｓｙｎ−５’−ｒｅｐａｉｒ／Ｏｓｙｎ
−Ｐ３’のＰＣＲ産物をゲル単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
した。消化した産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＫＲＲ８２６
ベクターに連結した。連結産物を使用して、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転
換した。所望のクローンを、ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列番号３８）お
よびｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配列番号３９）のオリゴヌクレオチドを使用
するコロニーＰＣＲによって同定した。ｐＧＯ−８候補クローン６を一晩培養し
て、ミニプレップＤＮＡを調製した。Ｏｓｙｎ−５’−ｒｅｐａｉｒ／Ｏｓｙｎ
−Ｐ３’プラスミド挿入物の配列決定を、ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列
番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配列番号３９）、４１ｓｙ−１（配
列番号４４）および４１ｓｙ−２（配列番号４１）のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて行った。配列決定の結果に基づいて、ｐＧＯ−８候補クローン＃６
をｐＧＯ−８ＰＬ／ＤＨ５αと名付けた。配列番号５７はコード領域のヌクレオ
チド配列を示す。図５は、ｐＧＯ−８ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配
列番号５８）を示す。ｐＧＯ−８ＰＬ組換えタンパク質は、Ｎ末端メチオニン、
４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）お
よび１６９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体
）からなる。

【００７１】Ｅ．ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１の構築ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１（配列番号５９はコード領域のヌクレオチド配列を
示す）は、組換えタンパク質ｐＧＯ−８ＣＫＳをコードする。図６は、ｐＧＯ−
８ＣＫＳのアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。このタンパク質は、２４６ア
ミノ酸のＣＫＳ／ポリリンカー、４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩ
Ｖ−１、ＨＡＭ１１２単離体）および１６９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群
ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
を下記のように行った。

【００７２】ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ
）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ
、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番号２５）、５０ｐｍｏｌのＯｓ
ｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）、および約１ｎｇのｐＧＯ−８ＰＬクローン＃６
ミニプレップＤＮＡを用いて調製した。反応液を９４℃で９０秒間インキュベー
ションし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒
間の２５サイクルで増幅した。次いで、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｐ３
’のＰＣＲ産物をゲル単離した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより、Ｏｓｙｎ
−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物およびベクターｐＪＯ２００を消
化した。消化したｐＪＯ２００ベクターをゲル単離して、消化したＯｓｙｎ−５
’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物に連結した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパ
ーコンピテント細胞を連結物で形質転換して、２０ｍＭグルコースを補充したＬ
Ｂ＋アンピシリン平板に播種した。コロニーを同じタイプの平板に再度画線培養
して単離した。ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１のクローンを、ＬＢブロス＋１００μ
ｇ／ｍｌカルベニシリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）＋２０ｍＭ
グルコース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）で一晩培養して増殖させ
た。凍結保存物（０．５ｍＬの一晩培養物＋０．５ｍＬグリセロール）を作製し
、そしてＤＮＡを配列分析のために調製した。下記のオリゴヌクレオチドを配列
決定プライマーとして使用した：ＣＫＳ−１（配列番号３０）、ＣＫＳ−２（配
列番号３１）、ＣＫＳ−３（配列番号３２）、ＣＫＳ−４（配列番号３３）、４
３４６１（配列番号２）、４３２８５（配列番号１）、４１ｓｙ−１Ｂ（配列番
号２９）、４１ｓｙ−２Ｂ（配列番号３４）、ＣＫＳ１７６．１（配列番号１９
）、およびＣＫＳ３５８３（配列番号２０）。

【００７３】Ｆ．ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築図３Ａ〜図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築に含まれる工程の概略図
を示す。ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αは、組換えタンパク質ｐＧＯ−９ＰＬをコー
ドする。配列番号４７は、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αのコード領域のヌクレオチ
ド配列を示す。図７は、ｐＧＯ−９ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号４８）を例示する。このタンパク質は、Ｎ末端メチオニン、４５アミノ酸の
ｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）および１９９アミ
ノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。ｐ
ＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築は下記のように行った。

【００７４】工程１．１００μｌのＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３
Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴ
Ｐ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ
−Ｈ（配列番号９）、およびテンプレートとして、（上記の実施例３のセクショ
ンＤから得られた）約２ｎｇのｐＧＯ−８候補クローン６ミニプレップＤＮＡを
用いて調製した。反応液を９４℃で１２０秒間インキュベーションし、次いで９
４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の８サイクルで増
幅した。

【００７５】工程２．１００μｌのＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３
Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴ
Ｐ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ
−Ｏ３’（配列番号１５）、およびテンプレートとして、工程１の１０μｌのＰ
ＣＲ反応液を用いて調製した。反応液を９４℃で１２０秒間インキュベーション
し、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の１
８サイクルで増幅し、その後、７２℃で５分間インキュベーションした。

【００７６】次いで、Ｏｓｙｎ−５’／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産物をゲル単離し、そし
てＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化したｐＫＲＲ８２６ベクターに連結した。次に、連結産
物を使用して、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ｐＧＯ−９ＰＬの候
補クローン３を一晩培養して、ミニプレップＤＮＡを調製した。Ｏｓｙｎ−５’
／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のプラスミド挿入物を、プライマーとして下記のオリゴヌク
レオチドを用いて配列決定した：ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列番号３８
）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配列番号３９）、４１ｓｙ−１Ｃ（配列番号
４０）、４１ｓｙ−２（配列番号４１）、４１ｓｙ−３（配列番号４２）および
４１ｓｙ−４（配列番号２３）。次いで、ｐＧＯ−９ＰＬクローン＃３を再度画
線培養して単離した。単離したコロニーを拾い、それを一晩培養して増殖させ、
そして凍結保存物（０．５ｍｌグリセロール＋０．５ｍｌの一晩培養物）を作製
した。保存物は−８０℃で保存した。その配列を、上記のプライマーを使用して
確認した。このクローンをｐＧＰ−９ＰＬ／ＤＨ５αと名付けた（配列番号４７
はコード領域のヌクレオチド配列を表し、配列番号４８はコード領域のアミノ酸
配列を表す）。ｐＧＰ−９ＰＬ／ＤＨ５αを再度画線し、一晩培養して増殖させ
て、ミニプレップＤＮＡを調製した（この調製物をＨ５とした）。

【００７７】Ｇ．ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築図３Ａ〜図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築に含まれる工程の概略図
を示す。ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１は、組換えタンパク質ｐＧＯ−９ＣＫＳをコ
ードする。図８は、ｐＧＯ−９ＣＫＳ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番
号５０）を示す。このタンパク質は、２４６アミノ酸のＣＫＳおよびポリリンカ
ー、それに続く４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１
１２単離体）および１９９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡ
Ｍ１１２単離体）からなる。ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築は下記のように行
った。

【００７８】２つのＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ
（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄ
ＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番号２５）、５０ｐｍｏｌ
のＯｓｙｎ−Ｏ３’（配列番号１５）、および（上記の実施例３のセクションＦ
から得られた）１ｎｇのｐＧＯ−９ＰＬ候補クローン３ミニプレップＤＮＡを用
いて調製した。各反応液を９４℃で１２０秒間インキュベーションし、次いで９
４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で１２０秒間の２４サイクル
で増幅し、その後、７２℃で５分間インキュベーションした。次いで、Ｏｓｙｎ
−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産物をゲル単離した。次いで、Ｏｓｙ
ｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産物をおよびベクターｐＪＯ２００
をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化したｐＪＯ２００ベクターをゲ
ル単離し、そして消化したＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産
物に連結した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を連結物で形質転換して、２
０ｍＭグルコースを補充したＬＢ＋アンピシリン平板に播種した。コロニーを同
じタイプの平板で再度画線培養して単離した。クローンｐＧＯ−９ＣＫＳの候補
クローン４を、ＬＢブロス＋１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ＳｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）＋２０ｍＭグルコース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．）で一晩培養して増殖させた。凍結保存物（０．５ｍｌの一晩培養物
＋０．５ｍｌグリセロール）を作製し、そして配列決定分析のためにＤＮＡを調
製した。下記のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使用した：ＣＫ
Ｓ−１（配列番号３０）、ＣＫＳ−２（配列番号３１）、ＣＫＳ−３（配列番号
３２）、ＣＫＳ−４（配列番号３３）、４３４６１（配列番号２）、４３２８５
（配列番号１）４１ｓｙ−１Ｂ（配列番号２９）、４１ｓｙ−２Ｂ（配列番号３
４）、４１ｓｙ−３Ｂ（配列番号３５）、ＣＫＳ１７６．１（配列番号１９）、
ＣＫＳ３５８３（配列番号２０）およびｐＴＢ−Ｓ８（配列番号２８）。クロー
ンｐＧＯ−９ＣＫＳの候補クローン４をｐＧＰ−９ＣＫＳ／ＸＬ１と名付けた（
配列番号４９はコード領域のヌクレオチド配列を表し、配列番号５０はコード領
域のアミノ酸配列を表す）。

【００７９】Ｈ．ＯｓｙｎＩ−Ｍフラグメントの構築ＯｓｙｎＩ−Ｍフラグメントを下記のように構築した。１００μｌのＰＣＲ反
応液を、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝液、５
０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ（配列番号２６）、５０ｐｍｏ
ｌのＯｓｙｎ−Ｍ（配列番号１４）、および１０μｇのゲル単離したＰＣＲフラ
グメント３Ａ（上記の実施例３、セクションＡ）を使用して調製した。反応液を
９５℃で１０５秒間インキュベーションし、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃
で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の１５サイクルで増幅し、次いで７２℃で
７分間保持した。ＯｓｙｎＩ−Ｍと名付けたＰＣＲ産物をゲル単離し、そしてＰ
ＣＲＩＩベクター（ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、
ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）に、製造者が指示する手順に従ってクローニングし
た。得られた連結産物を使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。プ
ラスミドのミニプレップＤＮＡをクローンＩＭ−６の一晩培養物から作製して、
遺伝子挿入物の配列決定を、５６７５９（配列番号４５）および５５８４８（配
列番号４６）のオリゴヌクレオチドを用いて行った。

【００８０】Ｉ．ＰＣＲフラグメントＩ／６ＲおよびＩＭ−６Ｆの合成および再編成これらは下記の手順で行った。

【００８１】工程１．下記のＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を調製した：（ａ）Ｉ／６Ｒ
ならびにＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝液、５
０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ（配列番号２６）、５０ｐｍｏ
ｌのＩＭ−６Ｒ（配列番号２２）、およびテンプレートとして、（実施例３のセ
クションＨから得られた）２８１ｎｇのクローンＩＭ−６；（ｂ）６Ｆ／Ｍなら
びにＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝液、５０μ
Ｍの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩＭ−６Ｆ（配列番号２１）、５０ｐｍｏｌの
Ｍ−ＰＣＲ（配列番号２７）、およびテンプレートとして、（実施例３のセクシ
ョンＨから得られた）２８１ｎｇのクローンＩＭ−６。

【００８２】反応液を９５℃で１０５秒間インキュベーションし、次いで、９４℃で１５秒
間、６０℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の２０サイクルで増幅し、次い
で７２℃で７分間保持した。次に、ＰＣＲ産物のＩ／６Ｒおよび６Ｆ／Ｍを、上
記の手順に従ってゲル単離した。

【００８３】工程２．ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラー
ゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各
ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ（配列番号２６）、５０ｐｍｏｌのＭ−Ｐ
ＣＲ（配列番号２７）、約５０ｎｇのＩ／６Ｒ、および約２０ｎｇの６Ｆ／Ｍを
用いて調製した。反応液を９５℃で１０５秒間インキュベーションし、次いで、
９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の２０サイクル
で増幅し、次いで７２℃で７分間保持した。ＰＣＲ産物を製造者の指示に従って
Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｅｐカラム（ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）
で処理した。

【００８４】Ｊ．ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αの構築図４Ａ〜図４Ｆは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αの構築に含まれる工程の概略
図を示す。ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αは組換えタンパク質ｐＧＯ−１１ＰＬを
コードする。図９は、ｐＧＯ−１１ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号５２）を示す。このタンパク質は、Ｎ末端メチオニン、４５アミノ酸のｅｎ
ｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）および３２７アミノ酸
のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。ｐＧＯ
−１１ＰＬ／ＤＨ５αの構築は下記のように行った。

【００８５】実施例３のセクションＩから得られた最終ＰＣＲ産物およびｐＧＯ−９ＰＬベ
クター（実施例３のセクションＦのミニプレップＨ５）を、ＡｇｅＩおよびＢａ
ｍＨＩで続いて消化した。次いで、消化したｐＧＯ−９ＰＬを、子ウシ小腸アル
カリホスファターゼ（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて
３７℃で１５分間処理して、フェノール／クロロホルム抽出を行い、そしてＮａ
ＯＡｃおよびＥｔＯＨを用いて沈澱させた。ベクター（ｐＧＯ−９ＰＬ）を続い
てゲル単離した。消化したｐＧＯ−９ＰＬおよび消化したＰＣＲ産物を連結した
。連結産物を使用して、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。コロニーを
再度画線培養して単離した。次いで、クローンｐＧＯ１１−４を同定して、再度
画線培養して単離した。凍結保存物の作製および配列決定用ミニプレップＤＮＡ
の調製を行うために、ｐＧＯ１１−４の一晩培養物を調製した。クローンｐＧＯ
１１−４の配列決定を、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った：
ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース
（配列番号３９）、４１ｓｙ−１Ｃ（配列番号４０）、４１ｓｙ−２（配列番号
４１）、４１ｓｙ−３（配列番号４２）、４１ｓｙ−４（配列番号２３）、４１
ｓｙ−５Ｂ（配列番号４３）、４１ｓｙ−５Ｃ（配列番号３６）および４１ｓｙ
−６Ｂ（配列番号３７）。配列決定の結果に基づいて、このクローンをｐＧＰ−
１１ＰＬ／ＤＨ５αと名付けた（配列番号５１はコード領域のヌクレオチド配列
を表し、配列番号５２はコード領域のアミノ酸配列を表す）。

【００８６】Ｋ．ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築図４Ａ〜図４Ｇは、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築に含まれる工程の概略
図を示す。ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１は組換えタンパク質ｐＧＯ−１１ＣＫＳ
をコードする。図１０は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ組換えタンパク質のアミノ酸配列
（配列番号５４）を示す。このタンパク質は、２４６アミノ酸のＣＫＳおよびポ
リリンカー、それに続く４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、
ＨＡＭ１１２単離体）および３２７アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−
１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築は下記
のように行った。

【００８７】ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ
）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ
、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番号２５）、５０ｐｍｏｌのＯｓ
ｙｎ−Ｍ（配列番号１４）、およびテンプレートとして、（実施例３のセクショ
ンＪから得られた）１ｎｇのｐＧＯ１１−４を用いて調製した。反応液を９４℃
で１０５秒間インキュベーションし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒
間、そして７２℃で１２０秒間の２０サイクルで増幅し、その後、７２℃で５分
間インキュベーションした。Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−ＭのＰＣＲ産物
をゲル単離した。次いで、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−ＭのＰＣＲ産物お
よびベクターｐＪＯ２００をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化した
ｐＪＯ２００ベクターをゲル単離した。一晩（１６℃）の連結を、消化したＰＣ
Ｒ産物を用いて行った。ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞を連結物で
形質転換して、２０ｍＭグルコースを補充したＬＢ＋アンピシリン平板に播種し
た。コロニーを同じ平板で再度画線培養して単離した。次いで、クローンｐＧＯ
−１１ＣＫＳの候補クローン２を一晩培養した（ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍｌカ
ルベニシリン＋２０ｍＭグルコース）。凍結保存物（０．５ｍｌの８０％グリセ
ロール＋０．５ｍｌの一晩培養物）を作製し、そして配列決定分析のためにミニ
プレップＤＮＡを調製した。下記のオリゴヌクレオチドを配列決定分析プライマ
ーとして使用した：ＣＫＳ−１（配列番号３０）、ＣＫＳ−２（配列番号３１）
、ＣＫＳ−３（配列番号３２）、ＣＫＳ−４（配列番号３３）、４３４６１（配
列番号２）、４３２８５（配列番号１）４１ｓｙ−１Ｂ（配列番号２９）、４１
ｓｙ−２Ｂ（配列番号３４）、４１ｓｙ−３Ｂ（配列番号３５）、４１ｓｙ−４
（配列番号２３）、４１ｓｙ−５Ｃ（配列番号３６）、４１ｓｙ−６Ｂ（配列番
号３７）、ＣＫＳ１７６．１（配列番号１９）、ＣＫＳ３５８３（配列番号２０
）およびｐＴＢ−Ｓ８（配列番号２８）。ｐＧＯ−１１ＣＫＳクローン＃２をｐ
ＧＰ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１と名付けた。配列番号５３は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／
ＸＬ１のコード領域のヌクレオチド配列を表す。配列番号５４は、ｐＧＯ−１１
ＣＫＳ／ＸＬ１のコード領域のアミノ酸配列を表す。

【００８８】実施例４．ｐＨＩＶ２１０／ＸＬ１−Ｂｌｕｅの構築図１１は、ｐＨＩＶ−２１０組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５５
）を示す。このタンパク質は、２４７アミノ酸のＣＫＳ／ポリリンカー配列、ｅ
ｎｖｇｐ１２０（＃４３２〜４９１；ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９４．１０）に由
来する６０アミノ酸、および１５９アミノ酸のｅｎｖｇｐ３６（＃４９２〜６
５０；ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９４．１０）からなる。ｐＨＩＶ２１０／ＸＬ１−
Ｂｌｕｅの構築は下記のように行った。

【００８９】ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９４．１０のゲノムＤＮＡ［Ｈ．Ｋｕｈｎｅｌ他、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：６１４２（１９９０）］は
ＥＭＢＬ３λクローニングベクターにクローニングされていた。Ｈ．Ｋｕｈｎｅ
ｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２３８３〜２
３８７（１９８９）、およびＨ．Ｋｕｈｎｅｌ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ１８：６１４２（１９９０）を参照のこと（これらは参考
として本明細書中に援用される）。Ｄ１９４．１０を含むλクローン（λＡ１０
）をＤｉａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）
から受け取った。ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（３．７５ユニット）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．５μｇのプライマー３６３４（配列番号８８；ＨＩ
Ｖ−２単離体Ｄ１９４．１０（ＥＭＢＬアクセス番号Ｘ５２２２３）の７４３７
位〜７４５５位にアニーリングする）、０．５μｇのプライマー３６３６（配列
番号８９；８０９５位〜８０７７位にアニーリングする）、１ＸＰＣＲ緩衝液
、および５μｌのλＡ１０ＤＮＡ（１：５０に希釈）を使用して調製した。反
応液を９４℃で５分間インキュベーションし、次いで、９４℃で１分間、４５℃
で１分間、７２℃で２分間の３５サイクルで増幅し、その後、７２℃で５分間イ
ンキュベーションした。ＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ、ＩＮ）で抽出し、そしてＤＮＡをエタノール（ＡＡＰＥＲＡｌｃｏｈ
ｏｌ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｓｈｅｌｂｙｖｉｌｌｅ、ＫＹ）で
沈澱させた。ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、１．５％アガロ
ースゲル（ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース、ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ）でゲル精製した。精製した産物を、ＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＪＯ２００ベクターに、８００ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を使用して連結
した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を
、２μｌの連結物を用いて、製造者によって概略されているように形質転換し、
そしてアンピシリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）を補充
したＬＢ平板に播種した。一晩の培養を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇ
ｍａ）および２０ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）を補充したＳｕｐｅｒｂｒｏｔ
ｈＩＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）に単一
コロニーを接種することによって行った。凍結保存物を、０．３ｍｌの８０％グ
リセロールを０．７ｍｌの一晩培養物に加えることによって作製した。混合した
後、保存物を−７０℃で保存した。ミニプレップＤＮＡを、アルカリ溶解法、そ
の後のＰＥＧ沈澱を使用して一晩培養物から調製した。配列決定反応を、７−デ
アザ−ｄＧＴＰＲｅａｇｅｎｔＫｉｔおよびＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓ
ｉｏｎ２．０（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて製造者によって概略
されているように行った。反応液を、製造者の推奨に従ってＩＢＩゲル装置を使
用して６％アクリルアミドゲル（ＧＩＢＣＯＢＲＬＧｅｌ−Ｍｉｘ６）で
泳動した。配列決定の結果に基づいて、ｐＨＩＶ−２１０クローン＃７をｐＨＩ
Ｖ−２１０と名付けた。ｐＨＩＶ−２１０のコード領域のアミノ酸配列を配列番
号５５として示す。

【００９０】実施例５．Ｏ群ＨＩＶ−１の組換えｇｐ４１抗原構築体を有する大腸菌株の増殖および誘導ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の一晩培養した種培養物を、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリンナトリウムを補充した５００ｍｌの滅菌したＥｘｃｅｌｌＴｅｒｒｉ
ｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｓ、ＭＯ）から入手可能）で調製して、３２℃または３７℃の振盪回転式イン
キュベーターに置いた。１００μｌの接種物を、種培養物から、１００μｇ／ｍ
ｌアンピシリンナトリウムを補充した１リットルの滅菌したＥｘｃｅｌｌＴｅ
ｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈを含有するフラスコに移した。培養物を、培養物が中
期対数増殖に達するまで３７℃でインキュベーションし、次いで１ｍＭのＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて３７℃で３時間インキュベーショ
ンした。あるいは、ｐＬ構築体を、培養物が中期対数増殖に達するまで３２℃で
インキュベーションし、次いで培養物の温度を４２℃に変えることによって３時
間誘導した。誘導した後、細胞を、標準的な手順に従って、遠心分離によってペ
レット化して集めた。ペレット化された細胞は、さらに処理するまで−７０℃で
保存した。

【００９１】実施例６．大腸菌において不溶性封入体として産生されたＯ群ＨＩＶ−１組換えｇｐ４１抗原の単離および可溶化実施例５から得られた凍結細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭ
のＮａＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）のスクロース、５％
のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）（ｖ／ｖ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、およ
び１μＭのペプスタチンＡを含有する冷溶解緩衝液でホモジネーションすること
によって再懸濁した。リゾチームを、１ｇの処理細胞あたり１．３ｍｇの濃度で
ホモジネートに加えた。得られた混合物を氷上で３０分間インキュベーションし
て、細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。
このようにしてペレット化された封入体を、（１）溶解緩衝液；（２）１０ｍＭ
ＮａＥＤＴＡ（ｐＨ８）、３０％（ｗ／ｖ）スクロース；および（３）水で
、順次、洗浄してペレット化した。洗浄した封入体を５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
８）、１０ｍＭＮａＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌおよび３Ｍ尿素で再懸
濁して、氷上で１時間インキュベーションした。次いで、封入体を可溶化タンパ
ク質から遠心分離によって分離した。ペレット化した封入体を、７Ｍグアニジン
ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ
タノール（ＢＭＥ）において４℃で一晩かけて完全に可溶化した。可溶化した組
換え抗原を遠心分離によって澄明化して、０．２μｍのフィルターに通し、そし
てクロマトグラフィーによる精製を行うまで−２０℃以下で保存した。

【００９２】実施例７．クロマトグラフィーによるＯ群ＨＩＶ−１の組換えｇｐ４１抗原の精製実施例６から得られた可溶化されたＯ群ＨＩＶ−１の組換えｇｐ４１抗原を、
２工程の方法によって下記のように精製した。不溶性抗原のグアニジンＨＣｌ抽
出物を、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、８Ｍ尿素および０．１％ＢＭＥ（ｖ
／ｖ）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００カラムでのサイズ排除クロ
マトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を使用
して、画分を分析した。組換えｇｐ４１抗原を含有する画分をまとめ、次いで、
限外ろ過によって濃縮した。組換え抗原の濃縮物を４％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）およ
び５％ＢＭＥ（ｗ／ｖ）により室温で３時間処理した。ＳＤＳ処理した抗原を
、２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）
ＢＭＥ、０．１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３
００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動を使用して、画分を分析した。精製された組換え
ｇｐ４１抗原を含有する画分をまとめ、０．２μｍのフィルターに通して、−７
０℃で保存した。

【００９３】実施例８．Ｍ群ＨＩＶ−１抗原の調製プラスミドｐＴＢ３１９を含有する細胞を、実施例５に記載されているように
増殖させて誘導した。本質的には米国特許第５，１２４，２５５号（これは参考
として本明細書中に援用される）の実施例５に記載されているように、細胞を溶
解して、封入体を処理した。続いて、ペレット化した物質を、ＳＤＳ、リン酸塩
（ｐＨ６．８）において可溶化し、次いでＳ−３００カラムでのクロマトグラフ
ィーに供した。

【００９４】実施例９．ＨＩＶ−２抗原の調製ｐＨＩＶ−２１０／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（上記の実施例４）を、実施例５に
記載されているように増殖させて誘導した。細胞を、リン酸塩、ＭｇＣｌ_２、Ｎ
ａＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を含有し、ベンゾナーゼ
、リゾチームおよびＰＭＳＦを補充した緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解した。封入
体を遠心分離によって可溶性タンパク質から分離した。ペレットを、蒸留水；Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、デオキシコール酸塩、ＮａＣｌ、リン酸
塩（ｐＨ７．０）；５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）；尿素およびＳＤＳを含む
リン酸塩（ｐＨ７．０）＋ＢＭＥで、順次、洗浄した。タンパク質を、ＳＤＳ、
リン酸塩（ｐＨ７．０）およびＢＭＥにおいて可溶化し、次いでＳ３００カラム
でのクロマトグラフィーに供した。

【００９５】実施例１０．Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を同時に検出して識別するための１工程免疫クロマトグラフィーアッセイＡ．試薬の調製１．セレン（Ｓｅ）コロイド懸濁物を、実質的には下記のように調製した：Ｓ
ｅＯ_２を水に０．０６２５ｇｍ／ｍｌの濃度に溶解した。次いで、アスコルビン
酸塩を水に０．３２ｇｍ／ｍｌの濃度に溶解して、７０℃の水浴で２４時間加熱
した。次いで、アスコルビン酸塩溶液を０．００６５ｇ／ｍｌに水で希釈した。
ＳｅＯ_２溶液を、希釈したアスコルビン酸塩溶液に素早く加えて、４２℃でイン
キュベーションした。インキュベーションを、少なくとも４２時間後で、５４２
ｎｍおよび５８８ｎｍの間の波長における最大吸光度が３０を超えたときに終了
した。コロイド懸濁物を２℃〜８℃に冷却し、その後、保存した。セレン懸濁物
は、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、ＩＬ
；コード２５００１）から入手することができる。

【００９６】２．セレンコロイド／抗体コンジュゲートを下記のように調製した。セレンコ
ロイド懸濁物を、蒸留水における吸光度が２５（ＯＤ５００〜５７０）になるよ
うに濃縮した。次いで、１ＭＭＯＰＳを１０ｍＭ（ｐＨ７．２）の最終濃度に
なるように加えた。ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的なヤギの抗体（あるいはヒト
ＩｇＧのＦｃ領域に特異的な他の種の抗体）を５０ｍＭリン酸塩緩衝液で０．７
５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで、得られた抗体調製物を、上記のようにし
て調製したセレンコロイド懸濁物に、抗体の最終濃度が７５μｇ／ｍｌになるよ
うに加えて混合した。攪拌を４０分間続けた。次いで、１（重量）％のウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）をこの溶液に加えて、セレンコロイド／抗体結合体の溶液
をさらに１５分間攪拌し、そして５０００ｘｇで９０分間遠心分離した。その後
、上清の９０％を除き、ペレットを残った上清で再懸濁した。このセレン−Ｉｇ
Ｇ結合体をガラス繊維パッドにコーティングする直前に、結合希釈液（１重量％
のカゼイン、０．１重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（登録商標）、および５
０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２））で１：１０に希釈した。

【００９７】３．手順上の対照試薬を、ＨＩＶ−１（Ｍ群）、ＨＩＶ−１（Ｏ群）およびＨ
ＩＶ−２の陽性血清の混合物として調製した。これは、アッセイの陽性対照とし
て別個のストリップデバイスで利用される。

【００９８】４．使用した陰性の対照試薬は、アッセイの陰性対照として別個の試験デバイ
スで利用される正常なヒトであった。

【００９９】Ｂ．適用パッドの調製適用パッドの物質は、樹脂結合型のガラス繊維ろ紙（Ｌｙｄａｌｌ）を含む。
（上記のパラグラフ２に記載されている）約０．１ｍｌの調製した結合体を適用
パッドに加える。

【０１００】Ｃ．クロマトグラフィー材の調製すべての試薬を、電荷および偏向による試薬噴射によってニトロセルロース膜
に加える。このニトロセルロースは、感圧性接着剤でコーティングされたＭＹＬ
ＡＲ（登録商標）膜によって支持されている。

【０１０１】試験サンプル捕捉試薬を、（ａ）Ｏ群ＨＩＶ−１捕捉試薬（ｐＧＯ−９／ＣＫ
Ｓ、配列番号５０）に関して、上記のように調製された特異的抗原を０．５ｍｇ
／ｍｌの濃度に噴射用希釈液（１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、ならびに
１重量％スクロース、０．９％ＮａＣｌ、および５μｇ／ｍｌフルオレセイン
）で希釈することによって、（ｂ）Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）捕捉試薬（ｐＴＢ
３１９、配列番号５６）に関して、同様に希釈することによって、そして（ｃ）
ＨＩＶ−２捕捉試薬（ｐＨＩＶ−２１０、配列番号５５）に関して、同様に希釈
することによって調製した。０．０９８μｌの第１の捕捉試薬（Ｍ群ＨＩＶ−１
（Ｂ亜群）試薬；配列番号５６）をストリップの指定された捕獲部位に加えて、
１つの患者捕獲部位を組み立てた。同様に、０．０９８μｌの第２の捕捉試薬（
Ｏ群ＨＩＶ−１試薬；配列番号５０）をストリップの指定された捕獲部位に加え
て、１つの患者捕獲部位を組み立て、そして０．０９８μｌの第３の捕捉試薬（
ＨＩＶ−２試薬；配列番号５５）をストリップの指定された捕獲部位に加えて、
１つの患者捕獲部位を組み立てた。

【０１０２】Ｄ．ＨＩＶに対する抗体の存在に関する迅速アッセイ試験サンプルの血清、全血、唾液および尿のサンプルにおけるＨＩＶに対する
抗体の存在に関する迅速アッセイを下記のように行った。１．５ｍｌのＥｐｐｅ
ｎｄｏｒｆチューブにおいて、５μｌの血清および６００μｌのサンプル溶出緩
衝液（ＳＥＢ）（５０ｍＭＴｒｉｓ、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．４％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−４０５（登録商標）（ｖ／ｖ）、１．５％カゼイン（ｗ／ｖ）
、３％ウシＩｇＧ（ｗ／ｖ）、４％大腸菌溶解物（ｗ／ｖ）［ｐＨ８．２］を
含有する）を混合した。この混合物の４滴をＳＴＡＲ部分のサンプルウエルに加
えた。次いで、１μｌの血清または全血をマイクロタイタープレートのウエルで
１００μｌのＳＥＢに加え、そしてニトロセルロースストリップをウエルに加え
た。その後、１μｌの血清または全血を、本発明のサンプルウエルの試験デバイ
スに直接スポットして、４滴のＳＥＢを加えた。唾液を試験する場合、５０μｌ
または７５μｌの唾液を、マイクロタイタープレートのウエルで、それぞれ、５
０μｌまたは２５μｌのＳＥＢに加え、そしてニトロセルロース試験ストリップ
をウエルに加えた。尿を試験する場合、５０μｌの尿をマイクロタイタープレー
トのウエルで５０μｌのＳＥＢに加え、そしてニトロセルロース試験ストリップ
をウエルに加えた。あるいは、１００μｌの尿をマイクロタイタープレートのウ
エルで使用して、ＳＥＢを使用することなくニトロセルロース試験ストリップを
加えた。

【０１０３】サンプル中のＩｇＧは結合パッド内のセレン−ヤギ抗ヒトＩｇＧコロイドによ
り結合し、そして複合体は、ニトロセルロース膜試験ストリップの長さ方向に沿
ってクロマトグラフィー的に分離された。このストリップには、ｐＧＯ−９ＣＫ
Ｓ（配列番号５０）、ｐＴＢ３１９（Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）、配列番号５６
）およびｐＨＩＶ２１０（ＨＩＶ−２、配列番号５５）の３つの組換え抗原が、
精密な液滴サイズを使用して確実な置き換え分配をもたらすバイオドット装置を
使用して前もって１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられている。次いで、試験デバイス
を室温で２分間インキュベーションして、結果を可視的に読み取った。

【０１０４】Ｅ．混合された全血のアッセイ１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、陽性が確認されたＯ群Ｈ
ＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の全血サンプル、あるいは陰性が確
認されたＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の全血サンプルのい
ずれかに由来する１μｌの血液の等量を、５μｌの陰性が確認されたＯ群ＨＩＶ
−１、Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の血清に１００μｌのＳＥＢと一緒に加
えて混合した。この混合物を本発明の試験デバイスのサンプルウエルに加えた。

【０１０５】サンプル中のＩｇＧは結合パッド内のセレン−ヤギ抗ヒトＩｇＧコロイドによ
り結合し、そして複合体は、ニトロセルロース膜試験ストリップの長さ方向に沿
ってクロマトグラフィー的に分離された。このストリップには、ｐＧＯ−９ＣＫ
Ｓ（配列番号５０）、ｐＴＢ３１９（Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）、配列番号５６
）およびｐＨＩＶ２１０（ＨＩＶ−２、配列番号５５）の３つの組換え抗原が、
精密な液滴サイズを使用して確実な置き換え分配をもたらすバイオドット装置を
使用して前もって１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられている。次いで、試験デバイス
を室温で２分間インキュベーションして、結果を可視的に読み取った。

【０１０６】Ｆ．結果抗原１に対する抗体が試験サンプル中に存在した場合、可視的な反応が、抗原
１の捕獲帯域領域およびアッセイ完了帯域において示され、そして抗原２または
抗原３の各領域では見られなかった。抗原２に対する抗体が試験サンプル中に存
在した場合、可視的な反応が、抗原２の捕獲帯域領域およびアッセイ完了帯域に
おいて示され、そして抗原１または抗原３の各領域では見られなかった。抗原３
に対する抗体が試験サンプル中に存在した場合、可視的な反応が、抗原３の捕獲
帯域領域およびアッセイ完了帯域において示され、そして抗原１または抗原２の
各領域では見られなかった。さらに、陰性対照は、抗原１、抗原２および抗原３
の各帯域において反応（可視的な反応）を示さなかったが、アッセイ完了帯域に
おいて反応し得る。陽性対照（抗原１、抗原２および／または抗原３に対する既
知の抗体）は、それが抗原／抗体反応で特異的に結合する適切な抗原の帯域で反
応し得る。陽性反応が抗原捕獲帯域の１つで生じているが、アッセイ完了帯域で
生じていない場合には、結果を無効と見なして、試験を繰り返した。

【０１０７】（ｉ）血液、尿および唾液における抗体に関するアッセイ（０１０９、４０
６８および４４７５の患者番号によって同定される）３人の患者の血液、尿およ
び唾液を、本明細書中に記載されている本発明のニトロセルロース固相デバイス
で、上記のアッセイプロトコルに従って試験した。０１０９、４０６８および４
４７５の各患者の血液試験サンプルおよび尿試験サンプルは、それぞれ、抗原１
（ｐＴＢ３１９、配列番号５６）と反応した。４０６８および４４７５の患者の
唾液試験サンプルもまた抗原１と反応したが、患者０１０９の唾液試験サンプル
は本発明の試験デバイスでは反応しなかった。患者０１０９の唾液試験サンプル
を、その後、標準的なＥＩＡによって再試験して、ＨＩＶ−１ｇｐ４１に対する
抗体には反応しないことを確認した。このことは、患者０１０９の唾液試験サン
プルに関して得られた結果は有効であったことを示す。

【０１０８】（ｉｉ）ＨＩＶ抗体に関して陰性サンプルのアッセイ図１４は、４個の試験
デバイスの写真であり、２つの陰性血清試験サンプルおよび２つの陰性全血試験
サンプルを試験して得られた結果を示し、それぞれは同じ２つの陰性血清と混合
された。サンプルは、関連する抗原に特異的な抗体を含有していなかった。試験
サンプルは、Ｏ、Ｍまたは２のいずれかの位置における反応を示す縞が見られな
いことによって示されるように、本試験でアッセイした後に陰性であった（すな
わち、反応しなかった）。試験サンプルは、試験サンプル反応性帯域における陽
性反応の縞によって示されているようにそれぞれの試験デバイスに存在した。

【０１０９】（ｉｉｉ）Ｍ群ＨＩＶ−１の抗体に関するアッセイ図１５は、１０個の試験
デバイスの写真であり、５つのＭ群ＨＩＶ−１血清、およびＭ群ＨＩＶ−１陽性
血清と混合された５つの全血サンプルを試験して得られた結果を示す。図１５に
おいて認められるように、Ｍ群ＨＩＶ−１サンプルは、Ｍ群ＨＩＶ−１抗原（ｐ
ＴＢ３１９、中央の帯域）に特異的な抗体を含有し、そしてＭ群ＨＩＶ−１抗原
帯域において反応線が現れた。そして可視的な反応線を、１０個の試験デバイス
の９個の「Ｍ」と標識されたアッセイ完了帯域で認めることができる。バンドが
Ｍ群ＨＩＶ−１抗体の捕獲帯域において１つの試験デバイスに存在しているが、
試験サンプルはアッセイ完了帯域にまで達していなかった。従って、このサンプ
ルに関してはアッセイを繰り返す必要があった。交差反応性が、Ｏ群ＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２の捕捉試薬について認められなかったことに留意すること。

【０１１０】（ｉｖ）Ｏ群ＨＩＶ−１の抗体に関するアッセイ図１６は、４個の試験デバ
イスの写真であり、２つの陽性と確認されたＯ群ＨＩＶ−１血清、およびＯ群Ｈ
ＩＶ−１血清と混合された２つの全血試験サンプルを試験して得られた結果を示
す。図１６において認められるように、Ｏ群ＨＩＶ−１サンプルは、Ｏ群ＨＩＶ
−１抗原に特異的な抗体を含有した：これは、Ｏ群ＨＩＶ−１抗原捕獲帯域領域
（「Ｏ」として示される最下段の帯域）における陽性の縞の結果によって示され
た。可視的な反応線を、それぞれのデバイスのアッセイ完了帯域で認めることが
できる。Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の捕獲抗原との交差反応は認められな
かった（縞は認められなかった）。

【０１１１】（ｖ）ＨＩＶ−２の抗体に関するアッセイ図１７は、１０個の試験デバイス
の写真であり、５つの陽性と確認されたＨＩＶ−２血清（左側の５個の試験デバ
イス）、および５つのＨＩＶ−２血清と混合された全血（右側の５個の試験デバ
イス）を試験して得られた結果を示す。図１７から認めることができるように、
ＨＩＶ−２サンプルは、ＨＩＶ−２抗原（ｐＨＩＶ２１０、「２」によって示さ
れる上部の帯域）に特異的な抗体を含有した：これはＨＩＶ−２抗原帯域におけ
る反応縞によって示された。これらの試験サンプルおよびＯ群ＨＩＶ−１抗原ま
たはＭ群ＨＩＶ−１抗原に関する反応は認められなかった。可視的な反応線を、
それぞれのデバイスのアッセイ完了帯域で認めることができる。

【０１１２】（ｖｉ）Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２のサンプルおよび陰性サンプルのアッセイ図１８は、（左から右に）陰性試験サンプル、Ｍ群ＨＩＶ
−１陽性試験サンプル、Ｏ群ＨＩＶ−１陽性試験サンプルおよびＨＩＶ−２陽性
試験サンプルを個々に試験した４個の試験デバイスの写真である。図１８から認
めることができるように、陰性の試験血清は抗原捕獲帯域においていずれの抗原
とも反応しなかったが、Ｍ群ＨＩＶ−１陽性試験サンプルはＭ群ＨＩＶ−１抗原
とのみ反応し、Ｏ群ＨＩＶ−１陽性試験サンプルはＯ群ＨＩＶ−１抗原とのみ反
応し、そしてＨＩＶ−２陽性試験サンプルはＨＩＶ−２抗原とのみ反応した。可
視的な反応線を、それぞれのデバイスのアッセイ完了帯域で認めることができる
。

【０１１３】使用した５つのＭ群ＨＩＶ−１試験サンプルおよび２つのＯ群ＨＩＶ−１試験
サンプルは、以前にＡｂｂｏｔｔ社の３Ａ７７ＥＩＡを使用して試験され、そし
てＰＣＲ増幅および配列決定が行われ、そして系統発生的分析に基づいて分類さ
れた血清陽性と確認されたサンプルであった。使用した５つのＨＩＶ−２サンプ
ルは、Ａｂｂｏｔｔ社の３Ａ７７ＥＩＡを使用して血清陽性であり、そしてＨＩ
Ｖ−２ウエスタンブロット試験によってＨＩＶ−２サンプルと確認された（Ｓａ
ｎｏｆｉ）。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２に由来するｅｎｖタンパク質の推
定アミノ酸配列（配列番号６１）を示す。

【図２】図２は、Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４１の合成遺伝子構築体
を作製するために使用した手順を示す：ｐＧＯ−８’挿入物＝Ｏｓｙｎ−５’か
らＯｓｙｎ−Ｐ３’まで；ｐＧＯ−９挿入物＝Ｏｓｙｎ−５’からＯｓｙｎ−０
３’まで；ｐＧＯ−１１挿入物＝Ｏｓｙｎ−５’からＯｓｙｎ−Ｍまで；および
Ｈ＝Ｏ群ＨＩＶ−１の疎水性領域（示されているように欠失される）。

【図３Ａ】図３Ａは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
において含まれる工程の概略図を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
において含まれる工程の概略図を示す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
において含まれる工程の概略図を示す。

【図３Ｄ】図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｅ】図４Ｅは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｆ】図４Ｆは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図４Ｇ】図４Ｇは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよびｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の
構築において含まれる工程の概略図を示す。

【図５】図５は、ｐＧＯ−８ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５８）を
例示する。

【図６】図６は、ｐＧＯ−８ＣＫＳ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６０）
を示す。

【図７】図７は、ｐＧＯ−９ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４８）を
例示する。

【図８】図８は、ｐＧＯ−９ＣＫＳ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５０）
を示す。

【図９】図９は、ｐＧＯ−１１ＰＬ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５２）
を例示する。

【図１０】図１０は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５
４）を示す。

【図１１】図１１は、ｐＨＩＶ−２１０組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５５
）を例示する。

【図１２】図１２は、本発明のために利用される試験デバイスの正平面図である。

【図１３】図１３は、図１２の線（２０）−（２２）に沿って得られる、図１２に示す試
験デバイスの断面図である。

【図１４】図１４は、本発明のアッセイにおいて、（左から右に）２個の陰性血清サンプ
ル（左側の２個の試験デバイス）、および陰性対照と混合された２個の陰性全血
試験サンプル（右側の２個の試験デバイス）の４個の試験デバイスで得られた結
果の写真である。

【図１５】図１５は、１０個の試験デバイスの写真であり、そして（左から右に）５個の
Ｍ群ＨＩＶ−１血清（左側の５個の試験デバイス）、およびＭ群ＨＩＶ−１の陽
性血清と混合された５個の全血試験サンプル（右側の５個の試験デバイス）を試
験して得られた結果を示す。

【図１６】図１６は、（左から右に）４個の陽性と確認されたＯ群ＨＩＶ−１血清（左側
の２個の試験デバイス）、およびＯ群ＨＩＶ−１の血清と混合された２個の全血
（右側の２個の試験デバイス）を試験したときに得られた結果を示す４個の試験
デバイスの写真である。

【図１７】図１７は、（左から右に）５個のＨＩＶ−２と確認された陽性血清（左側の５
個の試験デバイス）、およびＨＩＶ−２血清と混合された全血（右側の５個の試
験デバイス）を用いて得られた結果を示す１０個の試験デバイスの写真である。

【図１８】図１８は、（左から右に）陰性の試験サンプル、Ｍ群ＨＩＶ−１陽性の試験サ
ンプル、Ｏ群ＨＩＶ−１陽性の試験サンプル、およびＨＩＶ−２陽性の試験サン
プルを個々に試験した４個の試験デバイスの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハケツト，ジヨン・アール，ジユニアアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、メリル・コート・306 (72)発明者ヒツクマン，ロバート・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデレイン、サウス・プレイリー・アベニユー・524 (72)発明者バリテツク，ビンセント，ジユニアアメリカ合衆国、イリノイ・60030、ワイルドウツド、ノース・サンセツト・アベニユー・33139 (72)発明者ネクローズ，エリザベス・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、チエロキー・トレイル・ 24323 (72)発明者ゴールデン，アラン・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60091、ウイルメツト、ローレル・レイン・2516 (72)発明者ブレナン，キヤサリン・エイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、イースト・リンカーン・アベニユー・634 (72)発明者デビア，スシル・ジーアメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノースブルツク、フランズワース・レイン・ 2492

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１、お
よびＨＩＶ−２に対する抗体を含む分析物を同時に検出して識別するための方法
であって、（ａ）前記試験サンプルを、近位端および遠位端を有し、前記試験サンプルを
毛管作用によって前記近位端から前記遠位端の近くにまで移動させ、そして分析
物に対する少なくとも１つの固定化された捕捉試薬を含有するストリップを有す
る分析デバイスと、前記分析物および前記捕捉試薬の結合による捕捉試薬／分析
物の複合体を形成させるのに十分な時間および条件下で接触させること；および（ｂ）前記ストリップ上の捕捉試薬部位での可視的な色の変化を検出すること
によって分析物（１つまたは複数）の存在を決定すること；を含み、Ｏ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列
番号５２、配列番号５４、配列番号５８および配列番号６０からなる群より選択
されるポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５
６のポリペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉試薬は配列番号５
５のポリペプチドを含む方法。
【請求項２】前記の固定化された捕捉試薬が、文字、数字、アイコン、ま
たは記号として配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】標識された試薬が、前記近位端と固定化された患者捕捉試薬
との間の位置で前記ストリップに含有される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技術により製造される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記の標識された試薬がセレンである、請求項３に記載の方
法。
【請求項６】前記試験サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記体液が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群よ
り選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およ
びＨＩＶ−２を同時に検出して識別するための分析デバイスであって、近位端お
よび遠位端を有し、そして前記試験サンプルを毛管作用によって前記近位端から
前記遠位端の近くにまで移動させることができ、分析物に対する少なくとも１つ
の固定化された捕捉試薬を、前記分析物と前記捕捉試薬とを結合させるために含
有するストリップを含み；そしてＯ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は、配列
番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８および配
列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のた
めの前記捕捉試薬は配列番号５６のポリペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のた
めの前記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含む分析デバイス。
【請求項９】前記の固定化された捕捉試薬が、文字、数字、アイコン、ま
たは記号として配置される、請求項８に記載の分析デバイス。
【請求項１０】標識された試薬が、前記近位端と固定化された患者捕捉試
薬との間の位置で前記ストリップに含有される、請求項８に記載の分析デバイス
。
【請求項１１】前記の標識された試薬がセレンである、請求項１０に記載
の分析デバイス。
【請求項１２】前記試験サンプルが体液である、請求項８に記載の分析デ
バイス。
【請求項１３】前記体液が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群
より選択される、請求項１２に記載の分析デバイス。
【請求項１４】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技術により製造される
、請求項８に記載の分析デバイス。
【請求項１５】特異的な結合アッセイにおいて使用するためのキットであ
って、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
の存在または量を決定するための分析デバイスを有し、近位端および遠位端を有
するストリップを含み、前記試験サンプルは毛管作用によって前記近位端から前
記遠位端の近くにまで移動することができ、そして前記ストリップは、分析物、
補助的な特異的結合メンバー、および標識された試薬からなる群より選択される
要素に結合する固定化された捕捉試薬を含有し、そしてＯ群ＨＩＶ−１のための
前記捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、
配列番号５８および配列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを含み
、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５６のポリペプチドを含み、
そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含むキ
ット。
【請求項１６】前記の標識された試薬がセレンである、請求項１５に記載
の試験キット。
【請求項１７】陽性対照試薬をさらに含む、請求項１５に記載の試験キッ
ト。
【請求項１８】陰性対照試薬をさらに含む、請求項１５に記載の試験キッ
ト。
【請求項１９】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技術により製造される
、請求項１５に記載の試験キット。