DE69816835T2

DE69816835T2 - Inhibitoren der nuklearen lokalisierung von hiv

Info

Publication number: DE69816835T2
Application number: DE69816835T
Authority: DE
Inventors: Senliang Pan; Michael Bukrinsky; K. Omar HAFFAR
Original assignee: Picower Institute for Medical Research
Current assignee: Picower Institute for Medical Research
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: ATE245983T1; EP1012146A4; JP2001515069A; AU8905498A; EP1012146B1; CA2300424A1; AU758464B2; DE69816835D1; EP1012146A1; CA2300424C; JP4475487B2; US5808068A; WO1999009014A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Gattung von Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die eine anti-infektiöse therapeutische Wirkung gegen HIV aufweisen und die die Kernlokalisation ("Nuclear Localization") des HIV-Präintegrationskomplexes hemmen.
Allgemeiner Stand der Technik
Im vergangenen Jahrzehnt haben Infektionen mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) pandemische Ausmaße angenommen. Es wurde nicht nur ein überwältigender Anstieg der Anzahl der mit HIV-1 infizierten Menschen in Afrika südlich der Sahara beobachtet, sondern auch in Europa und Nordamerika hat die Anzahl der neuen Infektionen signifikant zugenommen. Ebenfalls Besorgnis erregend ist die Emergenz von HIV-1 in südostasiatischen Ländern, wie z. B. Thailand und Malaysia. Ausgehend von der derzeitigen Infektionsrate wird erwartet, dass Südostasien in naher Zukunft Afrika als Krisenherd der Welt noch übertreffen kann. HIV-1-Infektionen und die Entwicklung von AIDS schreiten daher unvermindert voran. Mangels eines Impfstoffs zum Schutz gegen eine Infektion ist die Therapie im Anschluss an eine Infektion das einzige Behandlungsmittel, das den Gesundheitsfürsorgern zur Verfügung steht.
Die Identifikation der sog. "Long-Term Non-Progressors" (LTNP; auf Langzeit nicht progrediente Patienten) hat eindringlich nahe gelegt, dass die Behandlung einer HIV-I-Infektion den Ausbruch der Krankheit nach einer Infektion hinauszögern kann. Bis jetzt waren die primären Angriffspunkte bei einer HIV-1-Therapie die viralen Enzyme, Reverse Transkriptase (RT) und Protease, die für den Lebenszyklus des Virus wichtig sind. Hemmer für einen dieser Enzyme haben die Viruslast (Virus Load) bei Patienten erfolgreich herabgesetzt und zu einer Erhöhung der CD4⁺ T Lymphozyten-Subsets geführt, was zur Folge hatte, dass sie zu im Handel erhältlichen Medikamenten zur Behandlung der HIV-Infektion avancierten. Für beide dieser Endpunkte wurde der Nachweis geführt dass sie gut mit einer positiven Prognose korrelieren. Ganz wichtig ist, dass Kombinationstherapien, die RT Hemmer zusammen mit Proteasehemmern in verschiedenen Behandlungsplänen einsetzen, eine Reduktion des zirkulierenden Virus im Blut auf Niveaus, die unter der Nachweisgrenze lagen, zur Folge hatten. Diese klinischen Prüfungen haben gezeigt, dass eine Erhaltungstherapie für HIV-1-Infektion und AIDS erreichbar ist.
Es wird jedoch vorausgesagt, dass das Auftreten von Virusisolaten, die gegen die angewandten Anti-Virus-Medikamente resistent sind, sowie das Auftreten von Kreuzresistenzen gegen mehrere Medikamente innerhalb einer Klasse von Hemmern die Anwendung von Kombinationstherapien einschränken wird. Diese Ergebnisse haben die Notwendigkeit der fortgesetzten Entwicklung neuer Medikamente und die fortgesetzte Ermittlung neuer therapeutischer Angriffspunkte, neben den Virusenzymen, eindringlich aufgezeigt.
Der humane Immundefizienzvirus Typ 1 und andere Lentiviren infizieren sich nicht teilende, terminal differenzierte Zellen, wie z. B. primäre Makrophagen (Gendelman et al., J. Virol. 58: 67–74, 1986; Gartner et al., Science 233: 215–219, 1986), primäre denritische Zellen (Langhoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 998–8002, 1991) sowie epidermale Langerhansche Zellen (Ramazzotti et al., Immunology 85: 94–98, 1995). Dies wird durch den aktiven Import des HIV-1 Präintegrationskomplexes (PIC; pre-integration complex), der das Virusgenom enthält, über die intakte Kernhülle (Nuclear Envelope) der sich nicht teilenden Zelle gefördert (Bukrinsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6580–6584, 1992; Bukrinsky et al., Nature 365: 666–669, 1993; und von Schwedler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6992–6996, 1994). Außerdem kann HIV-1 eine produktive Infektion in aktivierten primären T Zellen in allen Phasen des Zellzyklus, vor und einschließlich der M-Phase, wo die Auflösung der Kernhülle stattfindet, herbeiführen. Der aktive Zellkernimport verhindert daher die Bedingung für die Zellteilung und ermöglicht damit HIV-1, sowohl nicht proliferierende Zellen als auch proliferierende Zellen (Lewis et al., EMBO J. 11: 3053–3058, 1992), die normalen Angriffziele von Retroviren (Roe et al., EMBO J. 12: 2099–2108, 1993; und Lewis und Emerman, J. Virol. 68: 510–516, l 994) zu infizieren.
Zusätzlich zur viralen genomischen RNA besteht der PIC-Komplex aus dem von gruppenspezifischen Antigenen (gag) abgeleiteten Matrix-Antigenprotein (MA), Nukleokapsid-Protein (NC), Reverse Transkriptase (RT), Integrase (IN) und dem viralen vpr-Gen ("Viral Protein R"). Die reverse Transkription und Produktion der naszierenden cDNA werden im Zusammenhang des PIC-Komplexes im Zellplasma der infizierten Zielzelle, d.h. vor dem Kerneintritt, abgeschlossen. Vor kurzem wurde aufgezeigt (Gallay et al., J. Virol. 70: 1027–1032, 1996; und Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: l 1859–11864, 1996), dass sich der PIC-Komplex von HIV-1 mit Karyopherinen, den an dem aktiven Zellimport beteiligten Zellproteinen (rezensiert in Adam, Trends Cell Biol. 5: 189–191, 1995), verbindet. Karyopherin α wird an Zielproteine über ihre Kernlokalisationssequenz (NLS; nuclear localization sequence) gebunden, während Karyopherin β das Docking des Karyopherin-α-Zielproteinkomplexes an Kernporenstrukturen vermittelt (Radu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1769–1773, 1995; Moroianu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 2008–2011, 1995; Görlich et al., Nature (London) 377: 246-248, 1995; Adam und Gerace, Cell 66: 837–847, 1991; Görlich Mattaj, Science 271: 1513–1518, 1996; und Hurt, Cell. 84: 509–515, 1996).
Das HIV-1-Matrix-Antigenprotein enthält ein definiertes (K²⁶KKYK) und ein putatives (K¹¹⁰SKKK) NLS und stellt eine wichtige karyophile Struktur innerhalb des PIC-Komplexes dar (Bukrinsky et al., Nature 365: 666–669, 1993; von Schwedler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6992–6996, 1994; Gallay et al., J. Virol. 70: 1027–1032, 1996; und Bukrinsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6125–6129, 1993). Synthetische Peptide, die eine der beiden MA NLS ("Nuclear Localization Sequence") umfassen, banden sich an beide identifizierte humane Karyopherine α, die in B-Zell- und T Zell-Lysaten vorhanden sind (Nadler et al., J. Biol. Chem. 272, 4310–4315, 1997). Mutationen im KKKYK NLS von MA, allein oder in Verbindung mit der Deletion von vpr, reduzieren den Kernimport des HIV-1 PIC und hemmten die Infektion von primären Makrophagen-Kulturen (von Schwedler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6992-6996, 1994; Heizinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7311–7315, 1992) sowie die wachstumsarretierten T-Zellen (Bukrinsky et al., Nature 365: 666–669, 1993) und CD4+ -HeLa-Zellstrukturen (Emerman et al., Nature (London) 369: 107–108, 1994). Einfache Aminosäuresubstitutionen innerhalb des KKKYK NLS reduzierten ebenfalls die Bindung des HIV 1 PIC an Hefe-Karyopherin a in vitro (Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11859–11864, 1996) und stellten somit eine Verknüpfung der Bindung des PIC an Karyopherin α, des Kernimports und der viralen Replikation in sich nicht teilenden Zellen dar.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung mit der Formel 1 bereit:
die dadurch gekennzeichnet ist, dass A unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes C_1-6-Alkyl, ein geradkettiges oder verzweigtes C_2-6-Alkenyl oder ein C_1-6-Alkoxyl ist; dass Y -S-A ist, wobei A unabhängig wie oben definiert ist; und dass Z und X unabhängig N, -(CH₂)_n-NH₂ sind, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, eine geradkettige oder verzweigte C_1-6Alkyl-, eine geradkettige oder verzweigte C_2-6 Alkenyl- oder ein C_1-6 Alkoxyl ist. Vorzugsweise ist A ein Methyl, X ist -NH₂ und Z ist H oder Amino. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung nach Formel I in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthält.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Synthetisierung einer Verbindung gemäß der Formel I bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung einer Acetylchloridlösung in einem kurzkettigen ("shortchain") Alkohol;
(b) Zugabe eines substituierten 6-Halogen-Methylmercaptopyrimidins und eines 3,5-Dialkylanilins zu der Lösung zur Bildung einer Mischung;
(c) Rückflusskochen der Mischung, um das Anilinderivat an der Position 6 des Pyrimidinderivats anzufügen; und
(d) Trocknen der Mischung, um ein festes Endprodukt gemäß der Formel I zu erhalten.

Das substituierte 6-Halogen-Methylmercaptopyrimidin ist vorzugsweise ein 4-Amino-6-Chlor-2-Methylmercaptopyrimidin und das 3,5-Dialkylanilin ist vorzugsweise ein 3,5-Diacetylanilin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
l zeigt ein Diagramm, in dem – in einem Assay von Anti-HIV-Aktivität in Makrophagen-Kulturen – die Anti-HIV-Therapiewirkung der erfindungsgemäßen Verbindung 53 (2-Methylmercapto-4-Amino-6-(3',5'-Diacetylphenyl)Aminopyrimidin) mit einer strukturell ähnlichen Verbindung („cni-h0294") verglichen wird, wobei sich Letztere von der Verbindung 53 der vorliegenden Erfindung dadurch unterscheidet, dass sie eine positive Ladung im Pyrimidin-Anteil aufweist und sie keine vorgegebene Schwefelgruppe hat, die am Pyrimidinanteil substituiert wurde. Der Assay misst die Reverse-Transkriptase-Aktivität in den Überständen aus infizierten Makrophagen-Kulturen als Maß der Virusproduktion. Diese Daten lassen sich direkt mit der Wirksamkeit der Behandlung der HIV Infektion korrelieren. Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäße Verbindung 53 wirksamer war als die strukturell ähnliche Verbindung 2.
2 zeigt ein Diagramm, in dem die Anti-HIV-Therapiewirkung – in einem Assay von Anti-HIV-Aktivität in Makrophagen-Kulturen – der erfindungsgemäßen Verbindung 62 (2-Methylmercapto-6-Amino-6-(3',5'-Diacetylphenyl) Aminopyrimidin) mit einer strukturell ähnlichen Verbindung („cni-h0294") verglichen wird, wobei sich Letztere von der Verbindung 62 der vorliegenden Erfindung dadurch unterscheidet, dass sie eine positive Ladung im Pyrimidinanteil aufweist und sie keine vorgegebene Schwefelgruppe hat, die am Pyrimidinanteil substituiert wurde. Der Test misst die Reverse-Transkriptase-Aktivität in den Überständen aus infizierten Makrophagen-Kulturen als Maß der Virusproduktion. Diese Daten lassen sich direkt mit der Wirksamkeit der Behandlung der HIV-Infektion korrelieren. Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäße Verbindung 62 ein wirksames anti-infektiöses Mittel gegen HIV war.
3 zeigt eine weitere Analyse der therapeutischen Wirksamkeit von Verbindung 62 in aktivierten (anti-CD3- und anti-CD28-monoklonalen Antikörpern) PBMC-Kulturen (PBMC = mononukleäre Zellen aus peripherem Blut), die mit dem HIV-1-Virus infiziert wurden und mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 62 (μM) behandelt wurden. Der Assay misst p24 als ein Index der Virusreplikation und lässt sich direkt mit der Wirksamkeit der Behandlung einer HIV-Infektion korrelieren. Diese Daten zeigen eine antivirale Wirksamkeit von Verbindung 62 anhand der Dosis-Wirkung ("Dose Response") auf.
4 zeigt auf, dass die Verbindung 62 auch die Virusreplikation in PBMC von einem mit HIV-1 infizierten Patienten hemmte, wenn die PBMCs in vitro mit Anti-CD3 mAb [monoklonale Antikörper] aktiviert wurden. PBMCs von einem seropositiven Patienten wurden gesammelt und, wie oben beschrieben, einer Depletion der CD8⁺ T Lymphozyten unterzogen. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium suspendiert und mit Anti-CD3 mAb (1 μg/ml) aktiviert. Nach 6 bis 10 Tagen wurde die Virusproduktion evaluiert, indem die p24-Konzentrationen in den Kulturüberständen gemessen und die behandelten Kulturen mit den unbehandelten Kulturen verglichen wurden. 4 zeigt eine Dosis-Wirkung-Beziehung ("Dose-Response Relationship") für Verbindung 62 („cni-h6297") unter den oben dargelegten experimentellen Bedingungen in diesem prädiktiven Test für anti-HIV-infektiöse Eigenschaften.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung mit der Formel 1 bereit:
die dadurch gekennzeichnet ist, dass A unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes C_1-6 Alkyl, ein geradkettiges oder verzweigtes C_2-6 Alkenyl oder ein C_1-6 Alkoxyl ist; dass Y -S-A ist, wobei A unabhängig wie oben definiert ist; und dass Z und X unabhängig H, -(CH₂)_n-NH₂ sind, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, eine geradkettige oder verzweigte C_1-6 Alkyl-, eine geradkettige oder verzweigte C_2-6 Alkenyl- oder ein C_1-6 Alkoxyl ist. Vorzugsweise ist A ein Methyl, X ist -NH₂ und Z ist H oder Amino. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß Formel I in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthält.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Synthetisierung einer Verbindung mit der Formel I bereit, die die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung einer Acetylchloridlösung in einem kurzkettigen ("shortchain") Alkohol;
(b) Zugabe eines substituierten 6-Halogen-Methylmercaptopyrimidins und eines 3,5-Dialkylanilins zu der Lösung zur Bildung einer Mischung;
(c) Rückflusskochen der Mischung, um das Anilinderivat an der Position 6 des Pyrimidinderivats anzufügen; und
(d) Trocknen der Mischung, um ein festes Endprodukt gemäß Formel I zu erhalten.

Das substituierte 6-Halogen-Methylmercaptopyrimidin ist vorzugsweise ein 4-Amino-6-Chlor-2-Methylmercaptopyrimidin und das 3,5-Dialkylanilin ist vorzugsweise ein 3,5-Diacetylanilin.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung im Aufbau kleiner organischer Moleküle bereit, die in der Hemmung einer HIV-Infektion wirksam sind, indem sie einen integralen, Schwefel enthaltenden Substituenten bilden (siehe „Y" in der Formel I). Die Präsenz dieses Substituenten, die in alternativen HIV-Hemmern nicht offenbart oder vorgeschlagen werden, hat Verbindungseigenschaften von verbesserter Zelladsorption und, als Ergebnis davon, eine verbesserte Wirksamkeit, die nicht durch die Strukturen der alternativen HIV-Präintegrationskomplex-Hemmer offenbart oder vorgeschlagen werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen waren wirksam in der Hemmung des rezeptor-vermittelten Kernimports bei der Infektion von PBMC-Kulturen (PBMC = mononukleäre Zellen aus peripherem Blut). Es wird angenommen, dass die Verbindung, cni-h0294, mit dem HIV-1 PIC (Präintegrationskomplex) interagiert, indem sie partielle Schiff Basen mit Lysin-Nachbargruppen in der MA NLS bildet (Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11859–11864, 1996; Dubrovsky et al., Molec. Med. 1: 217–230, 1995). [Die Verbindung] enthält eine positive Ladung in ihrem substituierten Pyrimidinanteil, die möglicherweise dazu dient, ihre zelluläre Bioverfügbarkeit und ihre oralen Resorptionseigenschaften einzuschränken. Es wurde bereits zu einem früheren Zeitpunkt nachgewiesen, dass cni-h0294 die Vereinigung des HIV PIC mit dem Hefe-Karyopherin α behindert (Popov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11859–11864, 1996) und die Infektion der primären Makrophagen-Kulturen mit dem Makrophagentropischen Isolat HIV_ADA (IC₅₀ = 10 nM–50 nM) (Dubrovsky et aL., Molec. Med. 1: 217-230, 1995) wirksam hemmt.
Es ist anzumerken, dass ein therapeutisches Mittel intrazellulär wirken muss, um als PIC-Hemmer wirksam zu sein. Die Wirksamkeit steht daher in direkter Beziehung zur zellulären Bioverfügbarkeit. Weiterhin ist oral der bevorzugte Verabreichungsweg zur Behandlung einer HIV-Infektion auf Dauer, um die Compliance des Patienten zu verbessern. Daher ist es höchst wünschenswert, dass eine anti-infektiöse Verbindung gegen HIV oral verabreicht werden kann und eine hohe orale Bioverfügbarkeit hat.
Synthese der Verbindung
Die beispielhafte Verbindung, 2-Methylmercapto-4-Amino-6-(3',5'-Diacetylphenyl) Aminopyrimidin (Verbindung 53), wurde synthetisch hergestellt. Es gibt zwei Verfahren zur synthetischen Herstellung der Verbindung 53. Das erste Verfahren beginnt mit der Zugabe von Acetylchlorid (0,8 ml; 11 mmol) zu 60 ml absolutem Ethanol. Diese Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt, so dass sie eine Salzsäure-Ethanol-Lösung ergab. Dann wurden nacheinander l ,75 g (10 mmol) 4-Amino-6-Chlor-2-Methylmercaptopyrimidin (Aldrich) und 3,5-Diacetylanilin (1,8 g; 10 mmol) (Aldrich) hinzugefügt. Diese Reaktionsmischung wurde für einen Zeitraum von 24 Stunden unter Rückfluss gekocht und sie nahm schließlich eine braune Farbe an. Das Ethanol wurde bis zur Trockne eingedampft und 20 ml CHCl₃ wurde dem Rückstand hinzugefügt (ein grauer fester Rückstand) und getrennt. Der graue Feststoff wurde gefiltert und ergab nach der Trocknung 1,7 g Rohprodukt. Eine TLC-Analyse (TLC = Thin-Layer-Chromatography/Dünnschichtchromatographie) ergab, dass das nicht reagierte Ausgangsmaterial in der CHCl₃-Schicht verblieben war. Ca. 0,5 g des Rohproduktes wurde in Methanol wieder auskristallisiert und ergab 370 mg analytische reine Probe (Ausbeute: 39,8%).
Es gibt noch ein zweites Verfahren zur Herstellung der Verbindung 53. In diesem Verfahren wurde HCl (90 μl) einer Mischung hinzugegeben, die 4-Amino-6-Chlor-2-Methylmercaptopyridin (1 mmol) und 3,5-Diacetylanalin in 5 ml H₂O (1,1 mmol) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde l Stunde bei 90–100°C erhitzt und dann im Eisbad abgekühlt. Zur Neutralisierung der Säure wurden 2 ml 1N KOH-Lösung (Kalilauge) hinzugefügt. Diese Mischung wurde 10 Minuten gerührt; es bildete sich ein Niederschlag. Dann wurde der Niederschlag ausgefiltert und es ergab sich 285 mg trockenes, blassbraunes Rohprodukt (Ausbeute: 90%). Eine TLC-Analyse (MeOH : CH₂Cl₂ = 10 : 0.6) ergab nur einen Spot für ein reines Produkt. Die erneute Auskristallisierung aus einer Methoxyethanol-Lösung lieferte 267 mg analytisch reines Produkt (Ausbeute: 84,5%). Das wieder auskristallisierte Produkt wurde im Vakuum bei einem Schmelzpunkt von 264,8°C–268,6°C getrocknet (78°C).
Die analytischen Spezifikationen der Verbindung 53 sind ein Molekulargewicht von 316,4 und C₁₅H₁₆N₄O₂S. Außerdem: ¹HNMR (DMSO-d₆, 270 MHz): δ 2,46 (s, 3H, SMe), 2,6 (s, 6H, 2 COCH₃), 5,52 (s, 1H, C₅-H), 6,52 (br s, 2H, NH₂), 8,01 (s, 1H, Ar-H), 8,45 (s, 2H, Ar-H), 9,41 (s, 1H, NH). Im Zuge der weiteren Analyse des Endproduktes wurde die gemessene Elementaranalyse mit der berechneten Elementaranalyse verglichen:
Die veranschaulichende Verbindung 62 (2-Methylmercapto-6-Amino-6-(3',5'-Diacetylphenyl) Aminopyrimidin) wurde synthetisch hergestellt, indem 803 mg (5 mmol) 2-Methylmercapto-4-Chlorpyrimidin und 886 mg (5 mmol) 3,5-Diacetylanilin in 20 ml Wasser vermischt wurden. Außerdem wurde 0,42 ml konzentrierte Salzsäure hinzugefügt. Diese Reaktionsmischung wurde 4 Stunden bei 90–100°C erhitzt und dann im Eisbad abgekühlt. Der gekühlten Mischung wurde 5 ml 1N KOH hinzugegeben, um den Säure-pH der Salzsäure zu neutralisieren. Die Mischung wurde 10 Minuten im Eisbad gerührt, so dass sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde herausgefiltert und ergab 1,44 g trockenes, blassbraunes Rohprodukt. Eine TLC-Analyse (Thin-Layer-Chromatography; Dünnschichtchromatographie) in Methanol: CH₂Cl₂ (1 : 25) ergab nur einen Spot. Der Rohniederschlag wurde aus dem Methoxyethanol wieder herauskristallisiert und im Vakuum getrocknet, was 1,42 g reines 2-Methylmercapto-4-(3',5'-Diacetylphenyl) Aminopyrimidin (Verbindung 62) mit einer Gesamtausbeute von 94% ergab. Die NMR-Analyse ergab die Formel C₁₅H₁₅N₃O₂S mit einem Molekulargewicht von 301,38.
Pharmazeutische Formulierung
Der erfindungsgemäße pharmazeutische Komplex oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Kombination kann einem Patienten entweder allein (Komplex oder Kombination) oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen es mit geeigneten Trägersubstanzen und Arzneistoffträgern vermischt wird, verabreicht werden. Die erfindungsgemäße Verbindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann parenteral verabreicht werden, z. B. intravenös durch Injektion oder Infusion, intraperitoneale Injektion, subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion. Die erfindungsgemäße Verbindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann oral oder rektal durch eine entsprechende Formulierung mit Trägersubstanzen oder Arzneistoffträgern zur Herstellung von Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirupen, Breis, Suspensionen und ähnlichem verabreicht werden. Die erfindungsgemäße Verbindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann topisch angewendet werden, z. B. mit Haut-Pflaster (Skin Patch), um gleichmäßige systemische Konzentrationen des Wirkstoffes zu erzielen. Die erfindungsgemäße Verbindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung wird in topischen Cremes, Haut- oder Schleimhaut-Pflastern, Flüssigkeiten oder Gels formuliert, die zur topischen Anwendung auf der Haut oder Schleimhautoberflächen geeignet sind. Die erfindungsgemäße Verbindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch mit einem Inhalator zur lokalen oder systemischen Behandlung einer HIV-Infektion über die Atemwege angewandt werden.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann von Fachleuten aufgrund dieser Offenbarung ermittelt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird eine effektive Dosierung (je nach dem Verabreichungsweg und der Pharmakokinetik des Wirkstoffs) der erfindungsgemäßen Verbindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung und der geeigneten pharmazeutischen Trägersubstanzen und Arzneimittelträger enthalten, die für den jeweiligen Verabreichungsweg der Formulierung (d. h. oral, parenteral, topisch oder durch Inhalieren) geeignet sind. Die wirksame Verbindung wird mittels Vermischen, Auflösen, Granulieren, Dragee-Fertigung, Emulgieren, Verkapseln, Einschluss oder Lyophilisierungsverfahren in der pharmazeutischen Formulierung vermischt. Die pharmazeutischen Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen des aktiven Komplexes oder der aktiven Kombination in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen der aktiven Verbindung als ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete li pophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie z. B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, z. B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen können Stoffe enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, z. B. Natriumcarboxymethyl-Cellulose, Sorbitol oder Dextran. Die Suspension kann auch optionale Stabilisatoren oder Wirkstoffe zur Erhöhung der Löslichkeit des Komplexes oder der Kombination enthalten, um konzentriertere Lösungen zu ermöglichen.
Pharmazeutische Formulierungen zur oralen Einnahme können durch Kombination der aktiven Verbindung mit festen Arzneistoffträgern, wie z. B. Zuckerarten (z. B. Laktose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol), Cellulosepräparaten (z. B. Stärke, Methylcellulose, Hydroxypropylmethyl-Cellulose und Natrium-Carboxymethyl-Cellulose), Gelatine, Gummi oder Polyvinylpyrrolidon erhalten werden. Außerdem kann ein Zersetzungsmittel hinzugesetzt werden. Auch ein Stabilisator kann hinzugefügt werden.
Dieses Beispiel veranschaulicht mehrere in-vitro-Experimente in prädiktiven Modellen zur Behandlung von HIV-Infektion, um den therapeutischen Nutzwert der erfindungsgemäßen Verbindungen aufzuzeigen. Makrophagen – isoliert und gereinigt, wie von Schumandt-manesalla et al. (Virology, 1997) beschrieben – wurden mit HIV-1 mit einer an den p24-Gehalt angepassten Multiplizität infiziert (10 ng p24 pro 10⁶ Zellen). Die Verbindung (53 in 1 oder 62 in 2) wurde in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Außerdem wurde die positive Kontrollverbindung 2 (in 1 als "CNI-H294" und in 2 als „cni-h0294" bezeichnet) in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Nach einer zweistündigen Inkubation zur viralen Adsorption wurden die überschüssigen Viren weggewaschen und die Zellen wurden vor der Analyse für die weiteren angegebenen Zeiträume inkubiert. Die RT oder Reverse-Transkriptase-Aktivität wurde mit Hilfe von Standardverfahren in 7–11 Tagen gemessen.
1 zeigt ein Diagramm, in dem – in einem Assay von Anti-HIV-Aktivität in H9-Zellkulturen – die Anti-HIV-Therapiewirkung der erfindungsgemäßen Verbindung 53 mit einer strukturell ähnlichen Verbindung ("Verbindung 2") verglichen wird, wobei Letztere eine positive Ladung im Pyrimidinanteil aufweist und sie keine erforderliche Schwefelgruppe hat, die am Pyrimidinanteil substituiert wurde. Der Assay misst die Reverse-Transkriptase-Aktivität in den Überständen aus infizierten Makrophagen-Kulturen als Maß der Virusproduktion. Diese Daten lassen sich direkt mit der Wirksamkeit der Behandlung der HIV-Infektion korrelieren. Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäße Verbindung 53 wirksamer war als die strukturell ähnliche Verbindung 2.
2 zeigt ein Diagramm, in dem die Anti-HIV-Therapiewirkung – in einem Assay von Anti-HIV-Aktivität in Makrophagen-Kulturen – der erfindungsgemäßen Verbindung 62 mit einer strukturell ähnlichen Verbindung ("cni-h0294") verglichen wird, wobei Letztere eine positive Ladung im Pyrimidinanteil aufweist und sie keine erforderliche Schwefelgruppe hat, die am Pyrimidinanteil substituiert wurde. Der Assay misst die Reverse-Transkriptase-Aktivität in den Überständen aus infizierten H9-Zellkulturen als Maß der Virusproduktion. Diese Daten lassen sich direkt mit der Wirksamkeit der Behandlung der HIV-Infektion korrelieren. Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäße Verbindung 62 ein wirksames anti-infektiöses Mittel gegen HIV war.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass die Verbindung 62 die HIV-1-Virusreplikation in akut infizierten PBMC-Kulturen, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-monoklonalen Antikörpern aktiviert wurden, hemmt (3). Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut wurden von einer nicht infizierten Person isoliert und die CD8⁺ T Lymphozyten wurden unter Verwendung eines CD8-spezifischen monoklonalen Antikörpers gemäß dem von Smithgall et al. (J. Immunol. 156: 2324–2330, 1996) beschriebenen Verfahren depletiert. Das Verfahren verwendet, kurz gefasst, Trennung mit Magnetic Beads anstelle der Komplement-vermittelten Lyse von antikörpergebundenen Zellen. Die restlichen PBMC-Anteile wurden in einem RPMI-Kulturmedium suspendiert, das mit 10% hitzeinaktiviertem Humanserum mit einer Rate von 2 × 10⁶ Zellen/200 μl ergänzt wurde. Die Zellen wurden mit Anti-CD3 mAb (1 μg/ml) zusammen mit Anti-CD28 mAb (1 μg/ml) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Verbindung 62 aktiviert. Diese Form der Zellaktivierung zielt speziell auf CD3⁺ T Lymphozyten in der Population ab.
Die Zellen wurden 2 bis 3 Stunden vor der Hinzugabe des Virusinokulums mit Antikörpern und der Testverbindung vorbehandelt. Der in diesem Experiment verwendete Virus, HIV-1_M1, ist ein von einem Patienten stammendes Isolat und wurde mit einer ungefähren MOI (Multiplicity of Infection) von 5 TCID₅₀ verwendet. Nach 2 Stunden Inkubation zur Virusadsorption wurden die Zellen gewaschen und vom Inokulum befreit und anschließend in 200 ml eines Kulturmediums, das mit-Anti-CD und Anti-CD28 mAb zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 62 (um eine Dosis-Wirkung-Beziehung aufzuzeigen) ergänzt wurde, erneut suspendiert. Die Zellen wurden dann in 4–6 Replikaten zu 1,5 × 10⁵ Zellen/Well in eine 96-Well-Kulturplatte mit u-förmigem Boden gegeben. Die Virusproduktion wurde am Tag 6–10 nach der Infektion unter Verwendung der p24-Produktion als Endpunkt gemessen. Der p24-Antigenerfassungstest wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt.
Die in 3 gezeigten Daten zeigen eine Dosis-Wirkung-Beziehung bei 0, 0,01 μM und 1,0 μM Konzentrationen der Verbindung 62 („CNI-H6297") auf, wenn p24 als ein Maß der Viruskonzentration verwendet wird.
Die Verbindung 62 hemmte ebenfalls die Virusreplikation in PBMC von einem mit HIV-1 infizierten Patienten, wenn die PBMCs in vitro mit Anti-CD3 mAb aktiviert wurden. PBMCs von einer seropositiven Person wurden gesammelt und die CD8⁺ T Lymphozyten wurden, wie oben beschrieben, depletiert. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium suspendiert und mit Anti-CD3 mAb (1 μg/ml) aktiviert. Nach 6–10 Tagen wurde die Virusproduktion evaluiert, indem die p24-Konzentrationen in den Kulturüberständen gemessen und die behandelten Kulturen mit den unbehandelten Kulturen verglichen wurden. 4 zeigt eine Dosis-Wirkung-Beziehung für Verbindung 62 ("CNI-H6297") unter den oben dargelegten experimentellen Bedingungen in diesem prädiktiven Test für HIV-anti-infektiöse Eigenschaften.

Claims

Zusammensetzung nach der Formel I:
wobei A unabhängig ein reines oder verzweigtes C_1-6-Alkyl, ein reines oder verzweigtes C_2-6-Alkenyl oder ein C_1-6-Alkoxyl ist; Y -S-A ist, wobei A unabhängig zuvor definiert ist; und Z und X unabhängig H, -(CH₂)_n-NH₂ sind, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 6, ein reines oder verzweigtes C_1-6-Alkyl, ein reines oder verzweigtes C_2-6-Alkenyl oder ein C_1-6-Alkoxyl ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z H ist.
Zusammensetzung nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z Amino ist.
Pharmazeutische Verbindung umfassend eine Zusammensetzung aus Anspruch t in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.
Pharmazeutische Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z H ist.
Pharmazeutische Verbindung nach Anspruch d, dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z Amino ist.
Verfahren zum Synthetisieren einer Zusammensetzung nach Formel I wie in Anspruch 1 definiert umfassend die Verfahrensschritte: (a) Zurvertügungstellung einer Losung aus Acetylchlorid in einem kurzkettigen Alkohol; (b) Zuführung eines substituierten Halogen-Methylmercaptopyrimidins und eines 3,5-Dialkylanilins zu der Lösung zur Bildung einer Mischung; (e) Erhitzen der Mischung unter Rückfluss zum Zufügen des Anilinderivates zu dem Pyrimidinderivat; und (d) Trocknen der Mischung zum Erhalt eines testen Endprodukts gemäß der Formel I.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das substituierte 6-Halogen-Methylmercaptopyrimidin 4-Amino-6-Chlor-2-Methylmercaptopyrimidin ist und das 3,5-Dialkylanilin 3,5-Diacetylantlin ist.
Verwendung einer Zusammensetzung mit der Formel 1 wie in Anspruch 1 definiert für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z H ist.
Verwendung nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, dass A Methyl ist, X -NH₂ ist und Z Amino ist.