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TECHNISCHES
GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Kristalle der
Protease vom Hepatitis C-Virus im Komplex mit seinem viralen Cofaktor.
Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Strukturkoordinaten
der Protease vom Hepatitis C-Virus im Komplex mit einem synthetischen
NS4A, um die Struktur ähnlicher
oder homologer Proteine oder Proteinkomplexe zu lösen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Infektion mit dem Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein drängendes
Problem der Humanmedizin. HCV ist als Erreger für die meisten Fälle von
nicht-A, nicht-B-Hepatitis
bekannt mit einer geschätzten
Verbreitung im menschlichen Serum von 1 weltweit [Choo, Q.-L. et
al., „Isolation
of a cDNA Clone Derived From a Blood-Borne Non-A, Non-B Viral Hepatitis
Genome", Science,
244, S. 359–362
(1989); Kuo, G. et al., „An
Assay for Circulating Antibodies to a Major Etiologic Virus of Human
Non-A, Non-B Hepatitis",
Science, 244, S. 362–364
(1989); Purcell, R. H., „Hepatitis
C Virus: Historical perspective and current concepts", FEMS Microbiology
Reviews, 14, S. 181–192
(1994); Van der Poel, C. L. „Hepatitis
C Virus. Epidemiology, Transmission and Prevention in Hepatitis
C Virus. Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, H.
W. Reesink, Hrsg., (Basel: Karger), S. 137–163 (1994)]. Vier Millionen
Individuen können
allein in den USA infiziert sein [Alter, M. J. and Mast, E. E.,
The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol.
Clin. North Am., 23, S. 437–455
(1994)].
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Beim
ersten Kontakt mit HCV entwickeln nur etwa 20% der infizierten Individuen
akute, klinische Hepatitis, während
bei anderen die Infektion spontan abzuklingen scheint. In den meisten
Fällen
jedoch etabliert das Virus eine chronische Infektion, die über Jahrzehnte
fortdauert [Iwarson, S. „The
Natural Course of Chronic Hepatitis", FEMS Microbiology Reviews, 14, S.
201–204
(1994)]. Dies resultiert üblicherweise
in wiederholter und sich zunehmend verschlechternder Leberentzündung, die
oft zu ernsthafteren Krankheitszuständen führt, wie Zirrhose und hepatozellulären Karzinomen
[Kew, M. C., „Hepatitis
C and Hepatocellular Carcinoma", FEMS
Microbiology Reviews, 14, S. 211–220 (1994); Saito, I., et
al., „Hepatitis
C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular
Carcinoma", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, S. 6547–6549 (1990)]. Gegenwärtig gibt
es keine breit wirksamen Behandlungen für die schwächende Progression von chronischem HCV.
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Das
HCV-Genom codiert ein Polyprotein von 3010–3033 Aminosäuren (1)
[Choo, Q.-L., et al., „Genetic
Organisation and Diversity of the Hepatitis C Virus", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88, S. 2451–2455 (1991);
Kato, N. et al., Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus
Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, S.
9524–9528
(1990); Takamizawa, A. et al., „Structure and Organization
of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers", J. Virol., 65,
S. 1105–1113
(1991)]. Die nicht strukturellen (NS) Proteine von HCV stellen die
katalytische Maschinerie für
die virale Replikation dar. Die NS-Proteine werden durch proteolytische
Spaltung des Polyproteins erhalten [Bartenschlager, R. et al., „Nonstructural
Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase
Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions", J. Virol., 67,
S. 3835–3844
(1993); Grakoui, A. et al., „Characterization
of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination
of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites", J. Virol., 67,
S. 2832–2843
(1993); Grakoui, A. et al., „Expression
and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products", J. Virol., 67,
S. 1385–1395
(1993); Tomei, L. et al., "NS3
is a serine protease required for processing of hepatitis C virus
polyprotein", J.
Virol., 67, S. 4017–4026 (1993)].
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Das
HCV-NS-Protein3 (NS3) enthält
eine Serin-Protease-Aktivität,
die hilft, die Mehrzahl der viralen Enzyme zu prozessieren und die
deshalb als essentiell für
die virale Replikation und Infektiosität angesehen wird. Es ist bekannt,
dass Mutationen in der NS3-Protease des Gelbfiebervirus die virale
Infektiosität
vermindern [Chambers, T. J. et al., „Evidence that the N-terminal
Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a
Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral
Polyprotein", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, S. 8898–8902 (1990)]. Von den ersten
181 Aminosäuren
von NS3 (Reste 1027–1207
des viralen Polyproteins) ist gezeigt worden, dass sie die Serin-Proteasedomäne von NS3
enthalten, die alle vier Stellen stromabwärts des HCV-Polyproteins prozessiert
(1) [C. Lin et al., „Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase:
Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics", J. Virol., 68,
S. 8147–8157
(1994)].
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NS3
ist assoziiert mit einem Cofaktor, NS4A. NS4A scheint für die Aktivität von NS3
entscheidend zu sein, indem es die proteolytische Effizienz von
NS3 an allen Spaltstellen erhöht.
NS4A ist ein amphipatisches Peptid mit 54 Resten, mit einem hydrophoben
N-Terminus und einem hydrophilen C-Terminus [Failla, C. et al., „Both NS3
and NS4A are Required for Proteolytic Processing of Hepatitis C
Virus Nonstructural Proteins",
J. Virol., 68, S. 3753–3760
(1994)]. Seine Funktion erscheint komplex, möglicherweise als Unterstützung bei
der Membran-Lokalisierung von NS3 und anderen Komponenten der viralen
Replikase [Lin, C. et al., „A
Central Region in the Hepatitis C Virus NS4A Protein Allows Formation
of an Active NS3-NS4A Serine Proteinase Complex In Vivo and In Vitro", J. Virol., 69,
S. 4373–4380
(1995b); Shimizu, Y. et al., „Identification
of the Sequence on NS4A Required for Enhanced Cleavage of the NS5A/5B
Site by Hepatitis C Virus NS3 Protease", J. Virol., 70, pp. 127–132 (1996);
Tanji, Y. et al., „Hepatitis
C Virus-Encoded Nonstructural Protein NS4A has Versatile Functions
in Viral Protein Processing",
J. Virol., 69, S. 1575–1581
(1995)], aber seine am besten charakterisierte Funktion ist die
eines Cofaktors für
die NS3-Protease.
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Das
gegenwärtige
Verständnis
von HCV hat nicht zu zufriedenstellenden Behandlungen von HCV-Infektionen
geführt.
Die Aussichten für
wirksame Anti-HCV-Impfstoffe
bleiben ungewiss. Die einzige etablierte Therapie für die HCV-Erkrankung
ist die Behandlung mit Interferon. Interferone haben jedoch beträchtliche
Nebenwirkungen [Janssen, H. L. A. et al., „Suicide Associated with Alpha-Interferon
Therapy for Chronic Viral Hepatitis", J. Hepatol., 21, S. 241–243 (1994);
Renault, P. F. und Hoofnagle, J. H., „Side effects of alpha interferon. Seminars
in Liver Disease 9, 273–277
(1989)] und induzieren eine Langzeitremission nur bei einem Teil (~25%)
der Fälle
[Weiland, O., „Interferon
Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection", FEMS Microbiol. Rev., 14, S. 279–288 (1994)].
Deshalb sind wirksamere Anti-HCV-Therapien
notwendig.
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Die
NS3-Protease wird als potentielles Ziel für antivirale Mittel betrachtet.
Bemühungen
zur Entdeckung von Wirkstoffen, die gegen das NS3-Protein gerichtet sind,
wurden jedoch behindert durch das Fehlen von Information über die
Struktur von NS3 und seinen Komplex mit NS4A. Solche Strukturinformation
würde nützliche
Information bei der Entdeckung von HCV-NS3-Proteaseinhibitoren bereitstellen.
Bemühungen
zur Bestimmung der Struktur der HCV NS3-Protease wurden jedoch behindert
durch Schwierigkeiten bei der Bereitstellung ausreichender Mengen
von reinem, aktivem Enzym [Steinkuhler, C. et al., „In Vitro
Activity of Hepatitis C Virus Protease NS3 Purified from Recombinant
Baculovirus-Infected Sf9 Cells",
J. Biol. Chem. S. 637–6237
(1996)]. Es wurde über
keine Kristalle von irgendeinem NS3- oder NS3-Proteasedomäne-Protein berichtet.
Daher war eine Röntgenkristallographische
Analyse solcher Proteine nicht möglich.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Anmelder haben dieses Problem gelöst durch erstmalige Bereitstellung
von Zusammensetzungen, die ein Hepatitis C-Virus (HCV)-NS3-Protease-ähnliches
Polypeptid umfassen, das mit einem NS4A-ähnlichen Peptid komplexiert
ist, und Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen. Daher
betrifft die vorliegende Patentanmeldung die Verwendung eines Rechners
zur Erzeugung einer drei-dimensionalen Darstellung eines HCV-NS3-Protease-ähnlichen
Polypeptids.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
die Prozessierung des HCV-Polyproteins. Die Lagen der strukturellen
und nicht-strukturellen Proteine von HCV sind auf einem Diagramm
des Polypeptids mit 3011 Aminosäuren
markiert. Die Spaltstellen zwischen den strukturellen Proteinen
durch zelluläre
Signalpeptidasen sind mit Sternen markiert. Die Spaltung zwischen
NS2 und NS3 wird durch die NS2/NS3-Metalloprotease bewirkt. Die
NS3-Serinprotease
ist verantwortlich für
Spaltungen zwischen NS3 und NS4A, NS4A und NS4B, NS4B und NS5A und
NS5A und NS5B.
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2 zeigt
ein Stereo-Banddiagramm des NS3/NS4A-Komplexes. Der Blick geht in
die Spalte des aktiven Zentrums des Enzyms. Die Seitenketten der
Reste des aktiven Zentrums His-1083, Asp-1107 und Ser-1165 zusammen
mit den Zn++-Liganden Cys-1123, Cys-1125 und
Cys-1171 sind in einer Kugel-und-Stab-Darstellung gezeigt. Zn++, sein H2O-Ligand
und der β-Strang,
der von NS4A gebildet wird, werden ebenfalls gezeigt.
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3 listet
die Koordinaten der atomaren Struktur für rekombinantes, verkürztes, nicht-strukturelles Protein
3 von Hepatitis C-Virus (nachstehend als tNS3 bezeichnet) im Komplex
mit einem synthetischen Peptid der zentralen Region des nicht-strukturellen Proteins
4A (nachstehend als sNS4A bezeichnet), abgeleitet aus der Röntgenbeugung
von Kristallen dieses Komplexes (nachstehend als tNS3/sNS4A bezeichnet)
auf. Die Herstellung des Komplexes wird in Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Die folgenden Abkürzungen
werden in 3 verwendet:
„Atomtyp" bezieht sich auf
das Element, dessen Koordinaten bestimmt wurden. Elemente werden
durch den ersten Buchstaben in der Spalte definiert mit der Ausnahme
von Zink, welches durch die Buchstaben „Zn" definiert wird.
„X, Y,
Z" definieren kristallographisch
die atomare Position, die für
jedes Atom bestimmt wurde.
„B" ist ein thermischer Faktor, der die
Bewegung des Atoms um sein atomares Zentrum misst.
„Occ" ist ein Besetzungsfaktor,
der sich auf den Anteil der Moleküle bezieht, in denen jedes
Atom die Position einnimmt, die durch die Koordinaten gekennzeichnet
wird. Ein Wert von „1" zeigt an, dass jedes
Atom dieselbe Konformation, d.h. dieselbe Position, in allen Molekülen des
Kristalls hat.
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4 zeigt
ein Diagramm eines Systems, das verwendet wurde, um die Vorschriften
durchzuführen, die
durch das Speichermedium der 5 und 6 codiert
werden.
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5 zeigt
einen Querschnitt eines magnetischen Speichermediums.
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6 zeigt
einen Querschnitt eines optisch lesbaren Datenspeichermediums.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
folgenden Abkürzungen
werden in dieser Anmeldung durchgängig verwendet:
| A =
Ala = Alanin | T
= Thr = Threonin |
| V =
Val = Valin | C
= Cys = Cystein |
| L =
Leu = Leucin | Y
= Tyr = Tyrosin |
| I =
Ile = Isoleucin | N
= Asn = Asparagin |
| P =
Pro = Prolin | Q
= Gln = Glutamin |
| F =
Phe = Phenylalanin | D
= Asp = Asparaginsäure |
| W =
Trp = Tryptophan | E
= Glu = Glutaminsäure |
| M =
Met = Methionin | K
= Lys = Lysin |
| G =
Gly = Glycin | R
= Arg = Arginin |
| S =
Ser = Serin | H
= His = Histidin |
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HCV = Hepatitis C-Virus
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Zusätzliche
Definitionen werden gegebenenfalls in der Beschreibung erläutert.
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Damit
die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann,
wird die folgende, ausführliche
Beschreibung dargelegt.
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Die
Anmelder haben die vorstehenden Probleme durch erstmalige Bereitstellung
einer kristallsierbaren Zusammensetzung gelöst, die ein HCV-NS3-Proteaseähnliches
Polypeptid im Komplex mit einem NS4A-ähnlichen Peptid umfasst.
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Deshalb
wird in einer Ausführungsform
der Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein NS3-ähnliches
Polypeptid des Hepatitis C-Virus im Komplex mit einem NS4A-ähnlichen
Peptid umfasst.
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Der
HCV-NS3-ähnliche
Polypeptidanteil des Komplexes ist jedes Polypeptid, das die Serin-Protease-Aktivität der natürlich vorkommenden
HCV-NS3A-Protease hat, insbesondere die Fähigkeit, das HCV-Polyprotein
zu spalten. Dies umfasst HCV-NS3, -NS3-Proteasedomäne-Polypeptide
und -NS3-Proteasedomäne-ähnliche
Polypeptide.
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Wie
hier verwendet bedeuten die Ausdrücke „HCV-NS3" und „NS3" das nicht strukturelle Protein 3 des Hepatitis
C-Virus, wie definiert in Lin, C. et al., „Hepatitis C Virus NS3 Serine
Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics", J. Virol., 68,
S. 8147–8157
(1994).
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Der
Ausdruck „NS3-Proteasedomäne-Polypeptid" bezieht sich auf
einen verkürzten
Serin-Protease-Teil von NS3, wie definiert in [Bartenschlager, R.
et al., „Nonstructural
Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase
Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions", J. Virol., 67,
S. 3835–3844
(1993); Grakoui, A, et al., „Characterization
of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination
of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites, J. Virol., 67,
S. 2832–2843
(1993); Grakoui, A, et al., „Expression
and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products", J. Virol., 67, S.
1385–1395
(1993); Tomei, L. et al., "NS3
is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol., 67,
S. 4017–4026
(1993)]. Die Offenbarung jedes dieser Dokumente ist durch Bezugnahme
mit eingeschlossen.
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Der
Ausdruck „NS3-Proteasedomäne-ähnliche
Polypeptide" bezieht
sich auf Polypeptide, die sich von NS3-Proteasedomäne-Polypeptiden
dadurch unterscheiden, dass sie Aminosäuredeletionen, -substitutionen und
-additionen haben, aber die Serin-Protease-Aktivität von NS3
behalten.
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Vorzugsweise
ist das NS3-ähnliche
Polypeptid in den kristallisierbaren Zusammensetzungen dieser Erfindung
tNS3, ein rekombinant hergestelltes Hepatitis C-Virus-Proteasedomäne-Protein,
das wie hier beschrieben hergestellt wird.
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Der
NS4A-ähnliche
Peptidteil der Zusammensetzungen dieser Erfindung ist jedes Peptid
oder jeder Peptidnachahmer, das oder der in der Lage ist, als ein
NS4A-Cofaktor für NS3 zu
wirken. Diese umfassen NS4A, Peptidfragmente davon und andere Peptide,
die sich von NS4A dadurch unterscheiden, dass sie Aminosäuredeletionen,
-substitutionen und -additionen haben, wobei sie die vorstehend
beschriebene Aktivität
behalten.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „NS4A" auf das nicht strukturelle Protein
4A des Hepatitis C-Virus, das als ein Cofaktor für die NS3-Protease wirkt [Failla,
C. et al., „Both
NS3 and NS4A are Required for Proteolytic Processing of Hepatitis
C Virus Nonstructural Proteins",
J. Virol., 68, S. 3753–3760
(1994); Lin, C. et al., „Hepatitis
C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing
Kinetics", J. Virol.
68, S. 8147–8157
(1994b)]. Vorzugsweise ist das NS4A- ähnliche
Peptid sNS4A, das synthetische Peptid H-KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK-OH. Dieses Peptid
umfasst die essentiellen NS3-Proteasedomänereste von NS4A.
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Sowohl
das NS3-ähnliche
Polypeptid als auch das NS4A-ähnliche
Peptid können
mittels jedes wohlbekannten Verfahrens hergestellt werden, einschließlich synthetischer
Verfahren wie Festphasen-, Flüssigphasen-
und Kombinationen aus Festphasen-/Flüssigphasensynthesen; rekombinanten
DNA-Verfahren einschließlich
cDNA-Clonierung, optional kombiniert mit ortsspezifischer Mutagenese;
und/oder Reinigung des natürlichen
Produkts, optional kombiniert mit enzymatischen Spaltverfahren zur
Herstellung von Fragmenten von natürlich vorkommendem NS3 und
NS4A.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung kristallisierbar. In
dieser bevorzugten Ausführungsform
ist die bevorzugte Auswahl für
das NS3-ähnliche
Polypeptid und das NS4A-ähnliche
Peptid mit der vorstehend angegebenen Auswahl identisch.
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Vorteilhafterweise
sind die kristallisierbaren Zusammensetzungen, die von dieser Erfindung
bereitgestellt werden, der Röntgenkristallographie
zugänglich.
Daher stellt diese Erfindung auch die dreidimensionale Struktur
eines HCV-NS3-ähnlichen
Polypeptid/NS4A-ähnlichen
Peptid-Komplexes bereit, spezifisch eines HCV-tNS3/sNS4A-Komplexes, mit einer Auflösung von
2,5 Å.
Es ist wichtig, dass hier zum ersten Mal Informationen über die
Form und Struktur der NS3-Proteasedomäne bereitgestellt wurden.
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Die
dreidimensionale Struktur des HCV tNS3/sNS4A-Komplexes dieser Erfindung
ist durch einen Satz von Strukturkoordinaten definiert, die in 3 dargestellt
sind. Der Ausdruck „Strukturkoordinaten" bezieht sich auf
die Cartesischen Koordinaten, die aus mathematischen Gleichungen
abgeleitet sind, die sich auf die Muster beziehen, die durch Beugung
eines monochromatischen Röntgenstrahls
durch die Atome (Streuzentrum) eines tNS3/sNS4A-Komplexes in kristalliner
Form entstehen. Die Beugungsdaten werden verwendet, um eine Elektronendichtekarte
der sich wiederholenden Einheit des Kristalls zu berechnen. Die
Elektronendichtekarten werden dann verwendet, um die Position der
einzelnen Atome des tNS3/sNS4A-Enzyms
oder Enzymkomplexes festzulegen.
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Fachleute
auf dem Gebiet werden verstehen, dass ein Satz von Strukturkoordinaten
für ein
Enzym oder einen Enzymkomplex oder einen Teil davon ein relativer
Satz an Punkten ist, die eine Form in drei Dimensionen definieren.
Es ist daher möglich,
dass ein völlig
anderer Satz von Koordinaten eine ähnliche oder identische Form
definieren könnte.
Darüber
hinaus werden geringfügige
Veränderungen
bei den einzelnen Koordinaten nur eine geringfügige Auswirkung auf die Gesamtform
haben.
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Die
vorstehend diskutierten Veränderungen
von Koordinaten können
mittels mathematischer Manipulationen der Strukturkoordinaten erzeugt
werden. Zum Beispiel könnten
die in 3 dargestellten Strukturkoordinaten durch kristallographische
Permutation der Strukturkoordinaten, durch Fraktionierung der Strukturkoordinaten,
durch Addition oder Subtraktion ganzer Zahlen zu den Sätzen von
Strukturkoordinaten, durch Inversion der Strukturkoordinaten oder
durch jede Kombination der vorstehenden Manipulationen manipuliert
werden.
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Alternativ
könnten
auch Modifikationen in der Kristallstruktur wegen Mutationen, Additionen,
Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren oder anderer Veränderungen
bei irgendeiner der Komponenten, die den Kristall aufbauen, verantwortlich
sein für
Veränderungen
bei den Strukturkoordinaten. Wenn solche Veränderungen im Vergleich mit
den Originalkoordinaten innerhalb eines akzeptablen Standardfehlerbereichs liegen,
wird die resultierende dreidimensionale Form als dieselbe betrachtet.
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Verschiedene
Computeranalysen sind daher notwendig, um zu bestimmen, ob ein Molekül oder ein Molekülkomplex
oder ein Teil davon ausreichend ähnlich
ist zu der gesamten oder einem Teil der vorstehend beschriebenen
NS3-ähnlichen
Polypeptid/NS4A-ähnlichen
Peptid-Struktur, um als dieselbe betrachtet zu werden. Solche Analysen
können
durchgeführt
werden mittels gängiger
Software-Anwendungen
wie die Molekulare Ähnlichkeits-Anwendung
von QUANTA (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA), Version
4.1 und wie in dem begleitenden Benutzerhandbuch beschrieben.
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Die
Molekulare Ähnlichkeits-Anwendung
erlaubt Vergleiche zwischen verschiedenen Strukturen, verschiedenen
Konformationen derselben Struktur und verschiedenen Teilen derselben
Struktur. Das Verfahren, das bei der Molekularen Ähnlichkeits-Anwendung verwendet
wird, um Strukturen zu vergleichen, ist in vier Schritte aufgeteilt:
1) Laden der zu vergleichenden Strukturen; 2) Definition der Atom-Äquivalenzen in diesen Strukturen;
3) Durchführung
einer Anpassungsoperation; und 4) Analyse der Ergebnisse.
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Jede
Struktur wird durch einen Namen identifiziert. Eine Struktur wird
als Ziel definiert (d.h. die fixierte Struktur); alle verbleibenden
Strukturen sind Arbeitsstrukturen (d.h. bewegliche Strukturen).
Da Atom-Äquivalenz
bei QUANTA durch Anwendereingabe definiert wird, werden wir für den Zweck
dieser Erfindung äquivalente
Atome als Protein-Gerüstatome
(N, Cα,
C und O) für
alle konservierten Reste zwischen den beiden zu vergleichenden Strukturen
definieren. Wir werden auch nur genau festgelegte Anpassungsoperationen
in Betracht ziehen.
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Wenn
ein genau festgelegtes Anpassungsverfahren verwendet wird, wird
die Arbeitsstruktur translatiert und rotiert, um eine optimale Anpassung
mit der Zielstruktur zu erhalten. Die Anpassungsoperation verwendet
einen Algorithmus, der die optimale, auf die bewegliche Struktur
anzuwendende Translation und Rotation berechnet, so dass die Wurzel
aus dem Quadrat der mittleren Abweichung der Anpassung über die
spezifizierten Paare von äquivalenten
Atomen ein absolutes Minimum ist. Diese Zahl, in Angström angegeben, wird
durch QUANTA angegeben.
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Zum
Zwecke dieser Erfindung wird jedes Molekül oder jeder Molekülkomplex,
das/der bei Überlagerung über die
relevanten Gerüstatome,
die durch die in 3 angegebenen Strukturkoordinaten
beschrieben werden, eine Wurzel aus dem Quadrat der mittleren Abweichung
der konservierten Gerüstatome
(N, Cα,
C, O) von weniger als 1,5 Å hat,
als identisch betrachtet. Vorzugsweise ist die Wurzel aus dem Quadrat
der mittleren Abweichung weniger als 1,0 Å.
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Der
Ausdruck „Wurzel
aus dem Quadrat der mittleren Abweichung" bedeutet die Quadratwurzel des arithmetrischen
Mittelwerts der Quadrate der Abweichungen vom Mittelwert. Es ist
ein Weg, um die Abweichung oder Variation von einem Trend oder einem
Objekt darzustellen. Zum Zwecke dieser Erfindung definiert die „Wurzel
aus dem Quadrat der mittleren Abweichung" die Variation im Gerüst eines
Proteins oder eines Proteinkomplexes von den relevanten Teilen des
Gerüsts
des NS3-ähnlichen
Polypeptidteils des Komplexes, der durch die hier beschriebenen
Strukturkoordinaten definiert ist.
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Nachdem
die Strukturkoordinaten eines Proteinkristalls bestimmt worden sind,
sind sie von Nutzen bei der Analyse der Strukturen anderer Kristalle.
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Deshalb
werden in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung die Strukturkoordinaten des NS3-ähnlichen
Polypeptid/NS4A-ähnlichen
Peptid-Komplexes
und insbesondere des tNS3/sNS4A-Komplexes und von Teilen davon in einem
maschinenlesbaren Speichermedium gespeichert. Solche Daten können für eine Vielzahl
von Zwecken verwendet werden, wie Wirkstoffentdeckung und Röntgenkristallographische Analyse
von Proteinkristallen.
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Entsprechend
wird in einer Ausführungsform
der Erfindung ein maschinenlesbares Datenspeichermedium bereitgestellt,
das ein Datenspeichermaterial umfasst, auf den die in 3 dargestellten
Strukturkoordinaten kodiert sind.
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4 zeigt
eine Version dieser Ausführungsformen.
Das System 10 beinhaltet einen Rechner 11, umfassend
eine zentrale Verarbeitungseinheit („CPU") 20, einen Arbeitsspeicher 22,
der z. B. ein RAM (random-access memory) oder ein „Kern"speicher sein kann,
einen Massenspeicher 24 (wie ein oder mehrere Diskettenlaufwerke
oder CD-ROM-Laufwerke), ein oder mehrere Kathodenstrahlenröhren(„CRT")-Bildschirmterminals 26,
eine oder mehrere Tastaturen 28, eine oder mehrere Eingabeverbindungen 30 und
eine oder mehrere Ausgabeverbindungen 40, die alle sind
mittels eines konventionellen bidirektionalen Systembus 50 miteinander
verbunden sind.
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Die
Eingabe-Hardware 36, die mittels der Eingabeverbindungen 30 mit
dem Rechner 11 gekoppelt ist, kann auf eine Vielzahl von
Wegen ausgeführt
werden. Die maschinenlesbaren Daten dieser Erfindung können unter
Verwendung eines oder mehrerer mittels einer Telefonleitung oder
einer speziellen Datenverbindung 34 verbundenen(r) Modems 32 eingegeben
werden. Alternativ oder zusätzlich
kann die Eingabe-Hardware 36 CD-ROM- oder Diskettenlaufwerke 24 umfassen.
In Verbindung mit dem Bildschirmterminal 26 kann auch die Tastatur 28 als
Eingabevorrichtung verwendet werden.
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In ähnlicher
Weise kann die Ausgabe-Hardware 46, die mittels der Ausgabeverbindungen 40 mit
dem Rechner 11 gekoppelt ist, mit konventionellen Vorrichtungen
ausgeführt
werden. Beispielsweise kann die Ausgabe-Hardware 46 ein
CRT-Bildschirmterminal 26 zum Aufzeigen einer graphischen
Darstellung einer Bindungstasche dieser Erfindung unter Verwendung
eines hier beschriebenen Programms wie QUANTA umfassen. Die Ausgabe-Hardware
kann auch einen Drucker 42 umfassen, so dass eine gedruckte
Ausgabe hergestellt werden kann, oder ein Diskettenlaufwerk 24,
um die Systemausgabe für
die spätere
Verwendung zu speichern.
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Während der
Arbeit koordiniert CPU 20 die Verwendung der verschiedenen
Eingabe- und Ausgabevorrichtungen 36, 46,
koordiniert den Datenzugang vom Massenspeicher 24 und den
Zugang vom und zum Arbeitsspeicher 22 und bestimmt die
Abfolge der Datenverarbeitungsschritte. Eine Anzahl an Programmen kann
zur Verarbeitung der maschinenlesbaren Daten dieser Erfindung verwendet
werden. Solche Programme werden in Bezug auf die Computerverfahren
zur Wirkstoffentdeckung, wie hier beschrieben, diskutiert. Spezifische
Bezugnahmen zu den Komponenten des Hardware-Systems 10 werden,
wo es angebracht ist, während der
folgenden Beschreibung des Datenspeichermediums eingeschlossen.
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5 zeigt
einen Querschnitt eines magnetischen Datenspeichermediums 100,
auf dem maschinenlesbare Daten kodiert werden können, die mit einem System
wie System 10 von 4 ausgeführt werden
können.
Medium 100 kann eine konventionelle Diskette oder eine
Festplatte sein, die ein geeignetes Substrat 101, das herkömmlich sein
kann, und eine geeignete Beschichtung 102 hat, die herkömmlich und
auf einer oder beiden Seiten sein kann und die magnetische Bereiche
enthält
(nicht sichtbar), deren Polarität
oder Orientierung magnetisch geändert
werden kann. Das Medium 100 kann auch eine Öffnung (nicht
gezeigt) zur Einführung
der Welle eines Laufwerks oder einer anderen Datenspeichervorrichtung 24 haben.
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Die
magnetischen Bereiche der Beschichtung 102 von Medium 100 sind
so polarisiert oder orientiert, dass auf ihnen auf eine Weise, die
herkömmlich
sein kann, maschinenlesbare Daten wie die hier beschriebenen zur
Verarbeitung durch ein System wie System 10 von 4 kodiert
werden.
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6 zeigt
einen Querschnitt eines optisch lesbaren Datenspeichermediums 110,
auf dem ebenfalls solche maschinenlesbaren Daten oder ein Satz an
Vorschriften kodiert werden können,
die von einem System wie System 10 von 4 ausgeführt werden
können.
Medium 110 kann eine konventionelle compact disk read only
memory (CD-ROM) oder ein wiederbeschreibbares Medium wie eine magnetooptische
Diskette sein, die optisch lesbar und magneto-optisch beschreibbar
ist. Das Medium 110 hat vorzugsweise ein geeignetes Substrat 111,
das herkömmlich
sein kann, und eine geeignete Beschichtung 112, die herkömmlich sein
kann, üblicherweise
auf einer Seite von Substrat 111.
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Im
Falle einer CD-ROM ist die Beschichtung 112, wie wohlbekannt
ist, reflektierend und mit einer Vielzahl von Pits 113 belegt,
die die maschinenlesbaren Daten kodieren. Die Anordnung der Pits
wird durch Reflektion von Laser-Licht an der Oberfläche der
Beschichtung 112 gelesen. Eine vorzugsweise im Wesentlichen transparente
Schutzschicht 114 wird auf der Beschichtung 112 aufgebracht.
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Im
Falle einer magneto-optischen Diskette hat die Beschichtung 112,
wie wohlbekannt ist, keine Pits 113, sondern eine Vielzahl
an magnetischen Bereichen, deren Polarität oder Orientierung magnetisch
geändert
werden kann, wenn sie über
eine gewisse Temperatur erhitzt werden, wie mit einem Laser (nicht
gezeigt). Die Orientierung der Bereiche kann durch die Messung der
Polarisation von Laser-Licht, das von der Beschichtung 112 reflektiert
wird, gelesen werden. Die Anordnung der Bereiche kodiert die vorstehend
beschriebenen Daten.
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Erstmalig
erlaubt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verfahren zur
auf der Struktur beruhenden oder gedanklichen Wirkstoffplanung bei
der Planung, Selektion und Synthese von chemischen Einheiten, einschließlich inhibitorischer
Verbindungen, die in der Lage sind, an HCV-NS3, -NS4A, -NS3/NS4A-Komplex
oder jeden Teil davon zu binden.
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Ein
besonders nützliches
Verfahren zur Wirkstoffplanung, das durch diese Erfindung ermöglicht wird, ist
die iterative Wirkstoffplanung. Die iterative Wirkstoffplanung ist
ein Verfahren zur Optimierung der Assoziation zwischen einem Protein
und einer Verbindung durch Bestimmung und Auswertung der dreidimensionalen Strukturen
von aufeinanderfolgenden Sätzen
von Protein/Verbindungs-Komplexen.
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Fachleute
auf dem Gebiet werden erkennen, dass die Assoziation von natürlichen
Liganden oder Substraten mit der Bindungstasche ihrer entsprechenden
Rezeptoren oder Enzyme die Grundlage vieler biologischer Wirkmechanismen
ist. Der Ausdruck „Bindungstasche", wie hier verwendet,
bezieht sich auf das Gebiet eines Moleküls oder eines Molekülkomplexes,
das als Ergebnis seiner Form bevorzugt mit einer anderen chemischen
Einheit oder Verbindung assoziiert. In ähnlicher Weise üben viele
Wirkstoffe ihre biologischen Wirkungen durch Assoziation mit den
Bindungstaschen von Rezeptoren und Enzymen aus. Solche Assoziationen können mit
allen oder irgendwelchen Anteilen der Bindungstaschen stattfinden.
Ein Verständnis
solcher Assoziationen wird bei der Planung von Wirkstoffen helfen,
die günstigere
Assoziationen mit ihrem Zielrezeptor oder -enzym und daher verbesserte
biologische Wirkungen haben. Deshalb ist diese Information von Wert
bei der Planung von potentiellen Liganden oder Inhibitoren von Rezeptoren
oder Enzymen wie Inhibitoren von HCV-NS3-ähnlichen Polypeptiden oder
noch wichtiger von HCV NS3.
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Der
Ausdruck „Assoziation
mit" bezieht sich
auf die Bedingung der Nähe
zwischen chemischen Einheiten oder Verbindungen oder Teilen davon.
Die Assoziation kann nicht-kovalent sein – wobei die Aneinanderlagerung
durch Wasserstoffbindung oder van der Waals- oder elektrostatische
Wechselwirkungen energetisch begünstigt
ist –,
oder sie kann kovalent sein.
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Bei
der iterativen Wirkstoffplanung werden Kristalle einer Serie von
Protein/Verbindungs-Komplexen erhalten, und dann werden die dreidimensionalen
Strukturen von jedem Komplex bestimmt. Ein solches Vorgehen stellt
Einblick in die Assoziation zwischen den Proteinen und Verbindungen
jedes Komplexes bereit. Dies wird erreicht durch die Auswahl von
Verbindungen mit inhibitorischer Aktivität, die Bereitstellung von Kristallen
dieser neuen Protein/Verbindungs-Komplexe, die Analyse der dreidimensionalen
Struktur des Komplexes und einen Vergleich der Assoziation zwischen
dem neuen Protein/Verbindungs-Komplex und zuvor aufgeklärten Protein/Verbindungs-Komplexen.
Durch die Beobachtung, wie Veränderungen
bei der Verbindung die Protein/Verbindungs-Assoziationen beeinflussten,
können
diese Assoziationen optimiert werden.
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In
einigen Fällen
wird die iterative Wirkstoffplanung durch die Bildung aufeinanderfolgender
Protein/Verbindungs-Komplexe und anschließende Kristallation jedes neuen
Komplexes durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform
kann ein vorgebildeter Proteinkristall in der Gegenwart eines Inhibitors
eingeweicht werden, wobei sich der Protein/Verbindungs-Komplex bildet
und sich die Notwendigkeit der Kristallisation jedes einzelnen Protein/Verbindungs-Komplexes
erübrigt.
Vorteilhaft können
die HCV-NS3-ähnlichen
Polypeptid/NS4A-ähnlichen
Peptid-Kristalle und insbesondere die tNS3/sNS4A-Kristalle, die
von dieser Erfindung bereitgestellt werden, in der Gegenwart einer
Verbindung oder von Verbindungen, wie NS3-Proteaseinhibitoren, eingeweicht werden,
um NS3-ähnliche
Polypeptid/NS4A-ähnliche
Peptid/Verbindungs-Kristallkomplexe zu ergeben.
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Wie
hier verwendet bezieht sich der Ausdruck „eingeweicht" auf ein Verfahren,
bei dem der Kristall in eine Lösung übertragen
wird, die die Verbindung von Interesse enthält.
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In
einer anderen Ausführungsform
dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung
bereitgestellt, die ein NS3-ähnliches Polypeptidprotein
gemäß den in
den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Schritten umfasst. Vorzugsweise
umfasst die Zusammensetzung ein NS3-ähnliches Polypeptid im Komplex
mit einem NS4A-ähnlichen
Peptid.
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Die
in 3 dargestellten Strukturkoordinaten können auch
verwendet werden, um bei dem Erwerb von Strukturinformation bei
einem anderen kristallisierten Molekül oder Molekülkomplex
zu helfen. Das kann durch jedes beliebige wohlbekannte Verfahren
erreicht werden, einschließlich
des molekularen Ersatzes.
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Die
in 3 dargestellten Strukturkoordinaten können auch
zur Bestimmung zumindest eines Teils der dreidimensionalen Struktur
von Molekülen
oder Molekülkomplexen
verwendet werden, die zumindest einige Eigenschaften enthalten,
die HCV-NS3 strukturell ähnlich
sind. Insbesondere kann Strukturinformation über ein anderes kristallisiertes
Molekül
oder einen anderen kristallisierten Molekülkomplex erhalten werden. Das kann
durch jedes wohlbekannte Verfahren erreicht werden, einschließlich des
molekularen Ersatzes.
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Deshalb
stellt diese Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur
Verwendung des molekularen Ersatzes zum Erwerb von Strukturinformation
bei einem kristallisierten Molekül
oder Molekülkomplex
bereit, dessen Struktur unbekannt ist, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Erzeugen eines Röntgenbeugungsmusters von dem
kristallisierten Molekül
oder Molekülkomplex;
und
- b) Anwendung zumindest eines Teils der in 3 dargestellten
Strukturkoordinaten auf das Röntgenbeugungsmuster,
um eine dreidimensionale Elektronendichtekarte des Moleküls oder
Molekülkomplexes,
dessen Struktur unbekannt ist, zu erzeugen.
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Vorzugsweise
umfasst das kristallisierte Molekül oder der kristallisierte
Molekülkomplex
ein NS3-ähnliches
Polypeptid und ein NS4A-ähnliches
Peptid. Noch mehr bevorzugt wird das kristallisierte Molekül oder der
kristallisierte Molekülkomplex
durch Einweichen eines Kristalls dieser Erfindung in einer Lösung erhalten.
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Bei
Verwendung des molekularen Ersatzes können alle oder ein Teil der
durch diese Erfindung bereitgestellten (und in 3 dargestellten)
Strukturkoordinaten des tNS3/sNS4A-Komplexes verwendet werden, um
die Struktur eines kristallisierten Moleküls oder Molekülkomplexes,
dessen Struktur unbekannt ist, schneller und effizienter zu bestimmen
als durch die Ermittlung einer solchen Information ab initio. Der
molekulare Ersatz stellt eine genaue Bestimmung der Phasen für eine unbekannte
Struktur bereit. Phasen sind Faktoren in Gleichungen, die zur Lösung von
Kristallstrukturen verwendet werden, die nicht direkt bestimmt werden
können.
Das Erhalten von genauen Werten für die Phasen mit anderen Verfahren
als dem molekularen Ersatz ist ein zeitaufwendiges Verfahren, das
iterative Zyklen von Annäherungen
und Verfeinerungen umfasst und die Lösung von Kristallstrukturen
stark behindert. Wenn jedoch die Kristallstruktur eines Proteins
gelöst
wurde, das zumindest einen homologen Anteil enthält, stellen die Phasen der
bekannten Struktur eine zufriedenstellende Abschätzung der Phasen der unbekannten
Struktur bereit.
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Deshalb
umfasst dieses Verfahren die Herstellung eines vorläufigen Modells
eines Moleküls
oder Molekülkomplexes,
dessen Strukturkoordinaten unbekannt sind, durch Ausrichtung und
Positionierung des relevanten Teils des tNS3/sNS4A-Komplexes entsprechend 3 innerhalb
der Einheitszelle des Kristalls des unbekannten Moleküls oder
Molekülkomplexes,
so dass dem beobachteten Röntgenbeugungsmuster
des Kristalls des Moleküls
oder Molekülkomplexes,
dessen Struktur unbekannt ist, am besten Rechnung getragen wird.
Von diesem Modell können
die Phasen berechnet werden und mit den beobachteten Röntgenbeugungsmuster-Amplituden
kombiniert werden, um eine Elektronendichtekarte der Struktur herzustellen,
deren Koordinaten unbekannt sind. Diese wiederum kann jedem wohl
bekannten Modellbau- und Strukturverfeinerungsverfahren unterzogen
werden, um letztlich eine genaue Struktur des unbekannten, kristallisierten
Moleküls oder
Molekülkomplexes
bereitzustellen [E. Lattman, „Use
of the Rotation and Translation Functions", in Meth. Enzymol., 115, S. 55–77 (1985);
M. G. Rossmann, Hrsg., "The
Molecular Replacement Method",
Int. Sci. Rev. Ser., Nr. 13, Gordon & Breach, New York (1972)].
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Die
Struktur jedes Teils jedes kristallisierten Moleküls oder
Molekülkomplexes,
das oder der zu irgendeinem Teil des tNS3/sNS4A-Komplexes ausreichend
homolog ist, kann mittels dieses Verfahrens gelöst werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Verfahren des molekularen Ersatzes verwendet, um Strukturinformationen über ein
Molekül
oder einen Molekülkomplex
zu erhalten, wobei der Komplex ein NS3-ähnliches Polypeptid umfasst.
Vorzugsweise ist das NS3-ähnliche
Polypeptid tNS3 oder ein Homolog davon.
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Die
durch diese Erfindung bereitgestellten Strukturkoordinaten von tNS3/sNS4A
sind insbesondere von Nutzen bei der Aufklärung der Struktur anderer Kristallformen
von NS3-ähnlichem
Polypeptid, vorzugsweise anderer Kristallformen von tNS3; NS3-ähnlichem Polypeptid/NS4A-ähnlichem
Peptid, vorzugsweise tNS3/sNS4A; oder Komplexen, die irgendeines
der vorstehenden umfassen.
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Die
Strukturkoordinaten sind insbesondere auch von Nutzen bei der Lösung der
Struktur von Kristallen von NS3-ähnlichem
Polypeptid/NS4A-ähnlichem
Peptid-Komplexen,
insbesondere tNS3/sNS4A, gleichzeitig komplexiert mit verschiedenen
chemischen Einheiten. Dieser Weg ermöglicht die Bestimmung der optimalen Stellen
für die
Wechselwirkung zwischen den chemischen Einheiten, einschließlich der
Wechselwirkung von möglichen
NS3-Inhibitoren mit NS3 oder dem NS3/NS4A-Komplex. Zum Beispiel erlauben die hochaufgelösten Röntgenbeugungsdaten,
die von Kristallen gewonnen werden, auf die verschiedene Arten von
Lösungsmitteln
eingewirkt haben, die Festlegung, wo jede Art von Lösungsmolekül sitzt.
Kleine Moleküle,
die fest an diese Stellen binden, können dann geplant und synthetisiert
werden und auf ihre inhibitorische Wirkung auf NS3 getestet werden.
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Alle
Komplexe, auf die vorstehend Bezug genommen wird, können unter
Verwendung wohlbekannter Röntgenbeugungsverfahren
untersucht werden und können
gegenüber
Röntgendaten
von 1,5–3 Å-Auflösung zu
einem R-Wert von etwa 0,20 oder darunter unter Verwendung von Computer-Software
wie X-PLOR [Yale University, ©1992, verteilt durch
Molecular Simulations, Inc.; vgl. z.B. Blundell & Johnson, vorstehend; Meth. Enzymol.,
Bd. 114 & 115,
H. W. Wyckoff et al., Hrsg., Academic Press (1985)], weiter verfeinert
werden. Diese Information kann daher verwendet werden, um bekannte
NS3-Inhibitoren zu optimieren, und noch wichtiger, um neue NS3-Inhibitoren
zu planen.
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Damit
diese Erfindung vollständiger
verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele dargestellt.
Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollten nicht verwendet
werden, um den Umfang dieser Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
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BEISPIEL 1
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Expression und Reinigung
von tNS3
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Die
verkürzte
NS3-Serinproteasedomäne
(tNS3) wurde aus cDNA vom Hepatitis-Virus-H-Stamm cloniert [Grakoui, A,
et al., „Expression
and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products", J. Virol., 67,
S. 1385–1395
(1993)]. Es ist gezeigt worden, dass die ersten 181 Aminosäuren von
NS3 (Reste 1027–1207
des viralen Polyproteins) die Serinproteasedomäne von NS3 enthalten, die alle
vier stromabwärts liegenden
Stellen des HCV-Polyproteins prozessiert [Lin, C., et al., „Hepatitis
C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing
Kinetics", J. Virol.,
68, S. 8147–8157
(1994b)]; deshalb exprimierten wir ein (His)6-Fusionsprotein,
basierend auf diesem tNS3. Das Plasmid pET-BS (+)/HCV/T7-NS3181-His wurde von pTM3/HCV/1027–1207 (NS3181) (id.) unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion
abgeleitet, um Epitopmarker und neue Spaltstellen einzuführen. Ein
T7-Marker (ASMTGGQQMG) vom N-Terminus des Proteins von Gen 10 des
Bakteriophagen T7 [Tsai, D. E. et al., „In Vitro Selection of an
RNA Epitope Immunologically Cross-Reactive With a Peptide" Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89, S. 8864–8868
(1992)] wurde am Ende des N-Terminus der tNS3-Domäne
platziert. Zwei Linker-Reste (GS) wurden am C-Terminus von tNS3
platziert, gefolgt vom (His)6-Marker. E.coli
JM109 (DE3)-Zellen, frisch transformiert mit dem pET-BS (+)/HCV/T7-NS3181-His-Plasmid, wurden bei 37°C in komplexem
Medium, ergänzt
mit 100 μg/ml
Ampicillin, in einem 10 L-Fermentor (Braun) kultiviert. Als die
Zelldichte eine OD600 von 3–4 erreichte, wurde
die Temperatur der Kultur rasch auf 30°C reduziert, und die Induktion
wurde unmittelbar durch Zugabe von 1 mM IPTG veranlasst. Die Zellen
wurden 2 Std. nach der Induktion geerntet und vor der Aufreinigung
bei –70°C rasch eingefroren.
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Das
tNS3 wurde aus der löslichen
Fraktion des rekombinanten E.coli-Lysats wie folgt gereinigt, wobei alle
Prozeduren bei 4°C
durchgeführt
wurden, außer
es ist anders vermerkt. Die Zellpaste (75–100g) wurde in 15 Volumina
50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 10% Glycerin, 0,1% β-Octylglucosid, 2 mM β-Mercaptoethanol,
pH 8,0 resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Mikroverflüssigers
aufgebrochen, und das Homogenat wurde durch eine 30-minütige Zentrifugation
bei 100 000 × g
geklärt.
Der Überstand
wurde in 50 mM HEPES, 20 mM Imidazol, 0,3 M NaCl, 27,5% Glycerin,
0,1% β-Octylglucosid,
2 mM β-Mercaptoethanol,
pH 8,0 gebracht und mit 1,0 ml/min über eine 7,0 ml-Ni-Agarose-Affinitätssäule, die
mit demselben Puffer äquilibriert war,
gegeben. Nach der Beladung wurde die Säule mit 10–15 Volumina Äquilibrierungspuffer
gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden mit Äquilibrierungspuffer,
der 0,35 M Imidazol enthielt, eluiert. Die Proteine wurden dann
auf zwei Säulen
in Serie (jede 2,6 cm × 90
cm), die mit hochauflösendem
Pharmacia-S100-Harz gepackt
waren und mit 25 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 10% Glycerin, 0,1% β-Octylglucosid,
2 mM β-Mercaptoethanol,
pH 8,0 äquilibriert,
waren größenfraktioniert.
Die tNS3-Fraktionen, identifiziert mittels SDS-PAGE, wurden vereinigt
und mit einer Amicon-Centriprep-10 auf 1 mg/ml konzentriert und
bei –70°C aufgehoben.
Das tNS3 wurde auf Eis langsam aufgetaut, und das NS4A-Peptid (gelöst in dem
Größenausschluss-Chromatographiepuffer)
wurde in einem 1:2-Molverhältnis
von tNS3:NS4A-Peptid zugegeben. Die Probe wurde dann 2,5-fach verdünnt mit
15 mM MES, 0,5 M NaCl, 20 mM β-Mercaptoethanol,
pH 6,5, und mittels Ultrafiltration auf ~2 ml (~2 mg/ml) konzentriert.
Die Probe wurde dann mit dem pH 6,5-Puffer 2-fach verdünnt und
erneut auf ~2 ml konzentriert. Dieser Verdünnungsvorgang wurde wiederholt,
bis sich eine > 40-fache
Verdünnung der
ursprünglichen
Pufferbestandteile ergab. Die Proteinprobe wurde dann auf 13,0 mg/ml
konzentriert und 20 Minuten bei 300 000 × g und 4°C zentrifugiert. Die Konzentrationen
des reinen tNS3 und des tNS3/NS4A-Komplexes wurden mittels UV-Absorptionspektroskopie
unter Verwendung eines molaren Absorptionskoeffizienten (A280) von 17 700 M–1·cm–1 bestimmt.
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BEISPIEL 2
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4A-Peptid-Synthese und
Reinigung
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Das
HCV NS4A-Peptid wurde synthetisiert, um die Reste Gly21 bis Pro39
des viralen Cofaktors (Reste 1678 bis 1696 des HCV-Polyproteins)
zu überspannen,
die die essentielle Region beinhalten, von der berichtet wird, dass
sie für
die NS3-Stimulierung
essentiell ist [Lin, C. et al., „A Central Region in the Hepatitis
C Virus NS4A Protein Allows Formation of an Active NS3-NS4A Serine
Proteinase Complex In Vivo and In Vitro", J. Virol., 69, S. 4373–4380 (1995)].
Lysinreste wurden an den Enden angefügt, um die Löslichkeit
in Wasser zu unterstützen,
und Cys22 wurde durch einen Serinrest ersetzt (Rest 1679 des Polyproteins
des HCV H-Stammes). Das Peptid (H-KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK-OH·TFA-Salz)
wurde mittels Festphasen-Peptidsynthese hergestellt (Applied Biosystems
433A), beginnend mit einem Na-Fmoc, Ne-Boc-Lys Wang-Harz. Na-Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden
sequentiell zugegeben unter Verwendung von HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)1,1,3,3-Tetramethyluronium-Hexafluorphosphat)
mit HOBt (1-Hydroxybenzo-triazolhydrat) als Kupplungsmittel in N-Methylpyrrolidinon.
Die Abspaltung vom Harz und die vollständige Entfernung der Schutzgruppen
wurde mit 95% Trifluoressigsäure
und 5% Wasser nach 1,5 Std. bei Raumtemperatur erreicht (15 ml/g
Harz). Das Peptid wurde mittels präparativer HPLC auf einer Waters
Delta Pak C18, 15 μm,
300 Å Säule (30
mm × 300
mm) bei Elution mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (15–40%) in 0,1%
wässriger Trifluoressigsäure über 35 min
(Fließrate
22 ml/min) gereinigt. Die Reinheit des Peptids wurde mittels analytischer
HPLC bestätigt.
Die Sequenz wurde mittels direkter N-terminaler Sequenzanalyse und
Matrix-unterstützter
Laser-Desorptions-Massenspektrometrie
(Kratos MALDI I) bestätigt,
die die korrekten (M + H)+- und (M + Na)+-Molekülionen
zeigte
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BEISPIEL 3
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Kristallisation
und Datensammlung
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Kristalle
des tNS3/NS4A-Komplexes wurden durch Dampfdiffusion am hängenden
Tropfen über
einem Reservoir von 0,1 M MES, 1,8 M NaCl, 0,1 M Natrium-/Kaliumphosphat,
10 mM β-Mercaptoethanol,
pH 6,5 kultiviert. Die Kristalle wuchsen im Verlauf von 2–3 Wochen
zu einer Endausdehnung von etwa 0,1 × 0,1 × 0,25 mm. Die in dieser Untersuchung
verwendeten rhombohedrischen Kristalle gehörten zu der Raumgruppe R32 mit
Ausmaßen
der Einheitszelle von a = b = 225,0 Å und c = 75,5 Å und enthielten
zwei tNS3/NS4A-Komplexe pro asymetrischer Einheit.
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Die
Statistik für
die Datensammlung, die Verfeinerung für die Schwermetalle und die
kristallographische Verfeinerung sind in Tabelle 1 dargestellt.
Alle Einweichungen mit Schwermetallen wurden am hängenden
Tropfen über
demselben Reservoir gemacht, das für die Kristallisation verwendet
wurde. Die Kristalle wurden in eine Stabilisierungslösung überführt (50
mM MES, 2,0 M NaCl, 0,1 M Natrium-/Kaliumphosphat, 10 mM β-Mercaptoethanol
und 20% Glycerin, pH 6,2) und dann in einem trockenen Stickstoffgasstrom
bei 100 K (Molecular Structure Corp., Houston, TX) für die Datensammlung
eingefroren. Die Daten wurden mittels Oszillationsphotographie auf
einem Rigaku R-AXIS IIC-Phosphor-Bildgebungs-Flächendetektor
gesammelt, der auf einen rotierenden Rigaku RU200-Anodengenerator (MSC)
montiert war, der bei 50kV und 100mA arbeitete. Die gemessenen Intensitäten wurden
unter Verwendung des HKL Software-Pakets (Z. Otwinowski und W. Minor)
integriert, eingeteilt und zusammengeführt.
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BEISPIEL 4
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Phasenbestimmung, Modellbau
und Verfeinerung
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Die
Lagen der schweren Atome wurden durch Betrachtung lokalisiert und
mittels Differenz-Fourier-Synthesen bestätigt. Die Parameter der schweren
Atome wurden verfeinert und die Phasen mit 3,1 Å berechnet unter Verwendung
des Programms PHASES [Furey, W. und Swaminathan, S. „PHASES-95:
a programm package for the processing and analysis of diffraction
data from macromolecules",
Meth. Enzymol., (1996). Die MIR-Phasen wurden verbessert und auf
2,7 Å durch
Zyklen von Lösungsmittel-Flattening
[Wang, B. C., „Resolution
of Phase Ambiguity in Macromolecular Crystallography", Methods in Enzymol.
115, S. 90–112
(1985)], kombiniert mit Histogrammabgleich [Zhang, K. Y. J. und
Main, P., "The Use
of Sayre's Equation With
Solvent Flattening and Histogramm Matching for Phase Extension and
Refinement of Protein Structures", Acta
Crystallogr., A46, S. 377–381
(1990)] unter Verwendung des kristallographischen CCP4-Pakets (Collaborative
Computation Project, 1994) erweitert. Die resultierende Elektronendichtekarte
zeigte eine nahezu kontinuierliche Dichte für das Proteingerüst ebenso
wie hohe Dichte für
die Seitenketten. Ungefähr
80% des Modells konnten zweifelsfrei in diese Karte eingebaut werden
(QUANTA 4,1, Molecular Simulations), und ein einziger Durchgang
einer simulierten Annealing-Verfeinerung in X-PLOR [Brunger, A.
T., „X-PLOR:
A System for X-Ray Crystallography and NMR", New Haven, Connecticut: Department
of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University (1993)]
brachte den R-Faktor
auf 29% und den freien R-Wert auf 33% [Brunger, A. T., „Free R
Value: A Novel Statistical Quantity for Assessing the Accuracy of
Crystal Structures",
Nature, 355, S. 472–475
(1992)]. Der Rest des Modells wurde in mehreren Stufen aufgebaut
und verfeinert, zunächst
durch Erweiterung der Auflösung
auf 2,5 Å und
dann durch Zugabe von wohl geordneten Wassermolekülen. Ein
letzter Durchgang der Verfeinerung des positionsbezogenen und individuellen
Temperaturfaktors brachte den R-Faktor auf 21,6% (freier R-Wert
26,1%) für
26 652 Beugungen zwischen 6,0 und 2,5 Å (F > 1sF). Das gegenwärtige Modell bestand aus den
tNS3-Resten 1055– 1206
und den NS4A-Resten 1678–1693
für den
Komplex A und den tNS3-Resten 1028–1206 und den NS4A-Resten 1678–1696 für den Komplex
B (Polyprotein-Numerierung
mit 2 Zinkatomen und 130 Wassermolekülen). Eine Ramachandran-Darstellung für das Endmodell
enthielt 91% der Reste in den am meisten bevorzugten Bereichen und
0% in nicht erlaubten oder großzügig erlaubten
Bereichen. Die rms-Abweichungen
vom Ideal waren 0,007 Å für die Bindungslängen und
1,47° für die Bindungswinkel.
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Wir
haben eine Reihe von Ausführungsformen
für diese
Erfindung beschrieben. Es sollte jedoch verstanden werden, dass
der Schutzbereich dieser Erfindung eher duch die beigefügten Ansprüche definiert
werden sollte als durch die spezifischen Ausführungsformen, die nur beispielhaft
dargelegt wurden.