JP2001501602A

JP2001501602A - Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼドメイン／ｎｓ４ａ複合体を含む結晶化可能な組成物およびその結晶

Info

Publication number: JP2001501602A
Application number: JP10513899A
Authority: JP
Inventors: キム，ジョゼフ・エル; モーゲンスターン，カート・エイ; リン，チャオ; フォックス，テッド; トムソン，ジョン・エイ
Original assignee: バーテックス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 2001-02-06
Also published as: DE69723485T2; AU736857B2; ATE216400T1; AU4414597A; DE69723485D1; ES2175462T3; PT1118619E; CA2264964A1; DE69736995T2; EP0935609B1; ATE244729T1; HK1038573A1; HK1022700A1; DK0935609T3; DE69712085D1; US6303287B1; ES2202228T3; PT935609E; IL128826A0; EP0935609A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼのそのウイルスコファクターとの複合体の状態での組成物および結晶に関する。本発明は、また類似または同族タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解明するために合成ＮＳ４Ａとの複合体の状態のＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼの構造座標を使用する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼドメイン／ＮＳ４Ａ複合体を含む結晶化可能な組成物およびその結晶本発明の技術分野本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼのそのウイルスコファクターとの複合体の状態での組成物および結晶に関する。本発明は、また類似または同族タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解明するために、合成ＮＳ４Ａとの複合体の状態でのＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼの構造座標を使用する方法にも関する。発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)による感染は、ヒトにおける窮迫した医学的課題である。ＨＣＶは世界的に概算１％のヒト罹患率を持つほとんどの非Ａ型、非Ｂ型肝炎のケースでその原因となる要因である認識されている[Choo，Q.-L．et al. ，“Isolation of a cDNA Clone Derived From a Blood-Borne Non-A，Non-B Vi ral Hepatitis Genome”，Science，244，pp．359-362(1989);Kuo，G．et al.， “An Assay for Circulating Antibodies to a Major Etiologic Virus of Huma n Non-A，Non-B Hepatitis”，Sicence，244，pp．362-364(1989);Purcell，R． H.，“Hepatitis C virus:Historical perspective and current concepts”，F EMS Microbiology Reviews ，14，pp．181-192(1994);Van der Poel，C．L.，“H epatitis C Virus．Epidemiology，Transmission and Prevention in Hepatitis C virus．Current Studies in Hematology and Blood Transfusion”，H．W．R eesink，Ed.，(Basel:Karger)，pp．137-163(1994)]。合衆国単独では４００万人が感染していると言える[Alter，M．J．and Mast，E. E.，“The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States”，Gastro enterol ．Clin．North Am. ，23，pp．437-455(1994)]。ＨＣＶ単独にまず曝された時点で、２０％の感染個体が急性臨床肝炎を発症するのに対し、残りの個体は自然に感染を消散させるようである。しかしながら、多くの場合、ウイルスは、何十年と続く慢性感染を定着させる[Iwarson，S． “The Natural Course of Chronic Hepatitis”，FEMS Microbiology Reviews， 14，pp．201-204(1994)]。通常、これは、再発性で、徐々に悪化する肝臓の炎症をもたらし、肝硬変や肝細胞癌などのより重篤な疾患状態へと進展することもある[Kew，M．C.，“Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma”，FEMS Microb iology Reviews ，14，pp．211-220(1994);Saito，I.，et al．“Hepatitis C Vi rus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carci noma”，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87，pp．6547-6549(1990)]。現在、慢性ＨＣＶの進展を衰弱化する広範囲に有効な処置はない。ＨＣＶゲノムは、３０１０−３０３３アミノ酸のポリタンパク質をコードする（図１）[Choo，Q.-L.，et al．“Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus”，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，88，pp．2451-2455(1991 );Kato，N．et al.，“Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Ge nome From Japanese Patients with Non-A，Non-B Hepatitis”，Proc ．Natl．A cad．Sci．USA ，87，pp．9524-9528(1990);Takamizawa，A．et al.，“Structur e and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human C arriers”，J ．Virol.，65，pp．1105-1113(1991)]。ＨＣＶ非構造(ＮＳ)タンパク質は、ウイルス複製の触媒機構を与える。ＮＳタンパク質は、ポリタンパク質のタンパク質分解切断により得られる[Bartenschlager，R．et al.，“Nonstruc tural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinas e Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions”，J ．Virol.，6 7，pp．3835-3844(1993);Grakoui，A．et al.，“Characterization of the Hep atitis C Virus-Encoded Serine proteinase:Determination of Proteinase-Dep endent Polyprotein Cleavage Sites”，J ．Virol.，67，pp．2832-2843(1993); Grakoui，A．et al.，Expression and Identification of Hepatitis C．Virus Polyprotein Cleavage products”，J ．Virol.，67，pp．1385-1395(1993);Tome i，L．et al.，“NS3 is a serine protease required for processing of hepa titis C virus polyprotein”，J ．Virol.，67，pp．4017-4026(1993)]。ＨＣＶＮＳタンパク質３(ＮＳ３)は、大多数のウイルス酵素のプロセッシングを助長するセリンプロテアーゼ活性を含有し、よって、ウイルス複製および感染能のために必須であると考えられている。黄熱病ウイルスＮＳ３プロテアーゼの変異がウイルス感染能を低下させることは知られている[Chambers，T．J．et al.，“Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specif ic Cleavages in the Viral Polyprotein”，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87 ，pp．8898-8902(1990)]。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸(ウイルスポリタンパク質の１０２７−１２０７残基)は、ＨＣＶポリタンパク質の４つの下流部位全てをプロセッシングするＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含有することが示されている（図１）[C．Lin et al.，“Hepatitis C Virus NS3 Serine Prote inase:Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”，J ．Virol.， 68，pp．8147-8157(1994)]。ＮＳ３には、コファクターＮＳ４Ａが随伴する。ＮＳ４ＡはＮＳ３の活性にとって重要であるらしく、全ての切断部位でＮＳ３のタンパク質分解作用を増強する。ＮＳ４Ａは、５４残基の両親媒性ペプチドであり、疎水性Ｎ−末端と親水性Ｃ−末端を持つ[Failla，C．et al.，“Both NS3 and NS4A are Required for P roteolytic Processing of Hepatitis C Virus Nonstructural Proteins”，J ． Virol. ，68，pp．3753-3760(1994)]。その機能は、複雑であり、恐らく、ＮＳ３およびその他のウイルスレプリカーゼ成分の膜局在化に関与すると思われる[Lin ，C．et al.，“A Central Region in the Hepatitis C Virus NS4A Protein Al lows Formation of an Active NS3-NS4A Serine Proteinase Complex In Vivo a nd In Vitro”，J ．Virol.，69，pp．4373-4380(1995b);Shimizu，Y．et al.， “Identification of the Sequence on NS4A Required for Enhanced Cleavage of the NS5A/5B Site by Hepatitis C Virus NS3 Protease”，J ．Virol.，70， pp．127-132(1996);Tanji，Y．et al.，“Hepatitis C Virus-Encoded Nonstruc tural Protein NS4A has Versatile Functions in Viral Protein Processing” ，J ．Virol.，69，pp．1575-1581(1995)]が、その最も特徴的な機能は、ＮＳ３プロテアーゼのコファクターとしての機能である。ＨＣＶに関する現行の理解は、ＨＣＶ感染に対する十分な処置を導くには至っていない。効果的な抗ＨＣＶワクチンに対する期待は、不確定なままである。唯一確立されているＨＣＶ疾患治療は、インターフェロン処置である。しかしながら、インターフェロンは、重大な副作用を持ち[Janssen，H．L．A．，et al．“ Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepati tis”，J ．Hepatol.，21，pp．241-243(1994);Renault，P．F．and Hoofnagle， J．H.，“Side effects of alpha interferon.”Seminars in Liver Disease 9 ，273-277．(1989)]、ほんの一部(〜２５％)のケースでしか長期弛緩を誘導していない[Weiland，O．“Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Inf ection”，FEMS Microbiol ．Rev.，14，pp．279-288(1994)]。よって、より有効な抗ＨＣＶ治療に対する要望がある。ＮＳ３プロテアーゼは、抗ウイルス剤の潜在的な標的であると考えられる。しかしながら、ＮＳ３やそのＮＳ４Ａとの複合体についての構造情報の不足から、ＮＳ３タンパク質に対する薬剤発見努力が妨害されてきた。このような構造情報があれば、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ阻害因子の発見において価値ある情報となるであろう。しかしながら、十分量の純粋な活性酵素の入手が困難なため、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの構造決定のための努力が妨害されてきた[Steinkuhle r，C．et al.，“In Vitro Activity of Hepatitis C Virus Protease NS3 Purl fied from Recombinant Baculovirus-Infected Sf9 Cells”，J ．Biol．Chem.， pp．637-6273(1996)]。ＮＳ３またはＮＳ３プロテアーゼドメインタンパク質についての結晶は何も報告されていない。そのため、このようなタンパク質のＸ線結晶学的解析は可能でなかった。発明の概要出願人は、初めて、ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＣ型肝炎ウイルス( ＨＣＶ)ＮＳ３プロテアーゼ様ポリペプチドを含む組成物およびかかる組成物の製法を提供することにより、この課題を解決した。本発明は、また、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド複合体の結晶およびかかる結晶の製法を提供する。本発明は、また、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド複合体の構造座標を提供する。本発明は、また、ＨＣＶＮＳ３セリンプロテアーゼドメインと構造的に類似する特徴の少なくとも幾つかを含有する分子または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を測定する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ＨＣＶポリタンパク質プロセッシングを示す。ＨＣＶの構造および非構造タンパク質の位置は、３０１１アミノ酸ポリペプチドの図にマークしている。細胞シグナルペプチダーゼによる構造タンパク質間の切断部位は、星印でマークしている。ＮＳ２およびＮＳ３間の切断は、ＮＳ２/ＮＳ３メタロプロテアーゼにより媒介される。ＮＳ３セリンプロテアーゼは、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａ、そしてＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ間の切断を担う。図２は、ＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体のステレオリボン図を示す。この図は、酵素から切断した活性部位内である。活性部位残基His−１０８３、Asp−１１０７およびSer−１１６５の側鎖は、Ｚｎ⁺⁺リガンドCys−１１２３、Cys−１１２５およびCys−１１７１と共に、棒球(ボール・アンド・スティック)モデルで表示する。Ｚｎ⁺⁺、そのＨ₂ＯリガンドおよびＮＳ４Ａにより形成されるβ鎖も示す。図３は、非構造タンパク質４Ａの中心領域の合成ペプチド(以下、ｓＮＳ４Ａと呼ぶ)との複合体の状態でのＣ型肝炎ウイルスの組換え切形非構造タンパク質３(以下、ｔＮＳ３と呼ぶ)の原子構造座標を列挙しており、その複合体(以下、ｔＮＳ３／ｓＮＳ４Ａと呼ぶ)の結晶からのＸ線回折により得られたものである。複合体の製造は、実施例１および２に説明する。図３では下記の略語を用いる： “原子種”は、その座標が決定されている元素を表す。元素は、“Ｚｎ”の文字で定義した亜鉛以外は、文字列の最初の文字で定義する。 “Ｘ、Ｙ、Ｚ”は、各原子について測定した原子位置を結晶学的に定めるものである。 “Ｂ”は、その原子中心周辺の原子の動きを測定する熱ファクターである。 “Occ”は、占有ファクターであり、各原子が座標によって特定される位置を占有しているその分子の部分を表す。値“１”は、各原子が結晶の全ての分子において同じコンフォーメーション、即ち、同じ位置を持つことを示す。図４は、図５および６の記憶媒体によりコードされる命令を実施するのに使用するシステムの図を示す。図５は、磁気記憶媒体の断面を示す。図６は、光学式読取りデータ記憶媒体の断面を示す。発明の詳細な説明本出願を通して、下記の略語を用いる：Ａ＝Ala＝アラニンＴ＝Thr＝トレオニンＶ＝Val＝バリンＣ＝Cys＝システインＬ＝Leu＝ロイシンＹ＝Tyr＝チロシンＩ＝Ile＝イソロイシンＮ＝Asn＝アスパラギンＰ＝Pro＝プロリンＱ＝Gln＝グルタミンＦ＝Phe＝フェニルアラニンＤ＝Asp＝アスパラギン酸Ｗ＝Trp＝トリプトファンＥ＝Glu＝グルタミン酸Ｍ＝Met＝メチオニンＫ＝Lys＝リジンＧ＝Gly＝グリシンＲ＝Arg＝アルギニンＳ＝Ser＝セリンＨ＝His＝ヒスチジンＨＣＶ＝Ｃ型肝炎その他の定義は、必要に応じて明細書中に記載する。本明細書に記載の発明がより十分に理解されるために、以下に詳細な説明を記載する。出願人は、初めて、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ様ポリペプチドをＮＳ４Ａ様ペプチドとの複合体の状態で含む結晶化可能な組成物を提供することにより上記の課題を解決した。従って、本発明の一実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３様ポリペプチドをＮＳ４Ａ様ペプチドとの複合体の状態で含む組成物を提供する。複合体のＨＣＶＮＳ３様ポリペプチド部分は、天然のＨＣＶＮＳ３Ａプロテアーゼのセリンプロテアーゼ活性、特に、ＨＣＶポリタンパク質を切断する能力を有するあらゆるポリペプチドである。それは、ＨＣＶＮＳ３、ＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドおよびＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドを含む。本明細書で使用した“ＨＣＶＮＳ３”および“ＮＳ３”の用語は、Lin，C．e t al.，“Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase:Trans-Cleavage Requirem ents and processing Kinetics”，J ．Virol.，68，pp．8147-8157(1994)に定義されるＣ型肝炎ウイルス非構造３タンパク質を表す。 “ＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチド”の用語は、[Bartenschlager，R ．et al.，“Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a S erine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junct ions”，J ．Virol.，67，pp．3835-3844(1993);Grakoui，A．et al．“Characte rization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase:Determinatio n of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites”，J ．Virol.，67，p p．2832-2843(1993);Grakoui，A．et al.，Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products”，J ．Virol.，67，pp．13 85-1395(1993);Tomei，L．et al.，“NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein”，J ．Virol.，67，pp．4017-4 026(1993)]に定義のＮＳ３の切形セリンプロテアーゼ部分を表す。これらの文献それぞれの開示内容は、出典明示により本明細書の一部とする。 “ＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチド”の用語は、アミノ酸欠失、置換および付加を有する点でＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドとは異なるが、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性は保持するポリペプチドを表す。好ましくは、本発明の組成物におけるＮＳ３様ポリペプチドは、ｔＮＳ３、即ち、本明細書に記載のとおり調製される組換え的に生産されたＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼドメインタンパク質である。本発明の組成物のＮＳ４Ａ様ペプチド部分は、ＮＳ３に対するＮＳ４Ａコファクターとして作用できるあらゆるペプチドまたはペプチド模擬体である。これらは、ＮＳ４Ａ、そのペプチドフラグメントおよび、アミノ酸欠失、置換および付加を有する点でＮＳ４Ａとは異なるが、上記の活性は保持しているその他のペプチドを含む。本明細書で使用した“ＮＳ４Ａ”の用語は、ＮＳ３プロテアーゼに対するコファクターとして作用するＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質４Ａを表す[Failla ，C．et al.，“Both NS3 and NS4A are Required for Proteolytic Processing of Hepatitis C Virus Nonstructural Proteins”J ．Virol. 68，pp．3753-376 0(1994);Lin，C．et al.，“Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase:Trans- Cleavage Requirements and Processing Kinetics”J ．Virol. 68，pp．8147-81 57(1994b)]。好ましくは、ＮＳ４Ａ様ペプチドは、ｓＮＳ４Ａ、即ち、合成ペプチドＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである。このペプチドは、ＮＳ４Ａの必須ＮＳ３プロテアーゼドメイン残基を包含する。ＮＳ３様ポリペプチドとＮＳ４Ａ様ペプチドは両方とも、固相、液相および固相/液相併用合成などの合成法；所望により部位指向性突然変異誘発法と併用したｃＤＮＡクローニングを含む組換えＤＮＡ法；および/または所望により天然ＮＳ３およびＮＳ４Ａのフラグメントを製造するための酵素的切断法と併用した天然物の精製を含むよく知られた方法で製造できる。好ましい実施態様によれば、本発明の組成物は結晶化可能である。この好ましい実施態様では、ＮＳ３様ポリペプチドおよびＮＳ４Ａ様ペプチドに対して好ましく選択したものの全てが上記のものと同一である。有利なことに、本発明により提供される結晶化可能な組成物は、Ｘ線結晶学に基づいて分析できる。よって、本発明は、またＨＣＶＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド複合体、特にＨＣＶｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の解像力２. ５Åでの３次元構造も提供する。これにより、初めて、ＮＳ３プロテアーゼドメインの形状および構造についての情報を提供したことは非常に重要である。本発明のＨＣＶｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の３次元構造は、図３に記載の構造座標セットによって定義される。“構造座標”の用語は、結晶形態のｔＮＳ３ /ｓＮＳ４Ａ複合体の各原子(散乱中心)によるＸ線の単色性ビームの回折で得られたパターンに関連する数学的方程式から導かれたデカルト座標を表す。この回折データを用いて、結晶の繰り返し単位の電子密度地図を算定する。次いで、この電子密度地図を用いて、ｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ酵素または酵素複合体の個々の原子の位置を確定する。当業者ならば、酵素または酵素複合体またはその一部についての構造座標セットが、３次元の形状を定める各点の関連セットであることが理解できる。そのため、全体的に異なる座標セットは類似のまたは同一の形状を定めることも可能である。更に、個々の座標のわずかな変化は、全体の形状にはほとんど影響しない。上記座標は、構造座標の数学的操作により変化させることもできる。例えば、図３に記載した構造座標は、構造座標の結晶学的置換(permutations)、構造座標の分割、構造座標セットへの整数付加または控除、構造座標の反転またはこれらの任意の組み合わせにより操作してもよい。あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換および/または欠失による結晶構造の修飾、またはその他の任意の結晶構成成分の変化もまた、構造座標の変化として計上することができる。このような変化は、元々の座標と比較して許容できる標準誤差内であり、得られた３次元形状は、同じであると考えられる。そのため、分子または分子複合体またはその一部が、同じであると考えられる上記ＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド構造の全てまたは部分に十分類似しているかどうかを測定するためには、様々なコンピューター分析が必要である。このような分析は、現存のソフトウェアアプリケーション、例えば、QUANTA のモレキュラー・シミラリティー・アプリケーション(Molecular Simulations I nc.，San Diego，CA)、バージョン４.１にて、付随のユーザーガイドに記載のとおり、実行できる。モレキュラー・シミラリティー・アプリケーションにより、異なる構造、同じ構造の異なるコンフォーメーション、および同一構造の異なる部分を比較できる。構造を比較するためのモレキュラー・シミラリティーで用いられる操作は、４段階に分割される：１)比較すべき構造をロードし；２)これらの構造の原子当量を定め；３)フィッティング操作(fitting operation)を実施し；そして４)結果を分析する。各構造には名称を付けて区別する。１つの構造を標的(即ち、固定構造)とすれば、残りの構造は全て、活動構造(即ち、移動構造)である。QUANTA内の原子当量は、ユーザーが入力して定めるので、本発明の目的には、比較する２つの構造間の全ての保存残基についてタンパク質主鎖原子(Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ)に等価な原子を定める。我々は、単に厳密なフィッティング操作についても検討するものである。厳密なフィッティング法を用いる場合、活動構造を並進および回転させて、標的構造と最適にフィットさせる。このフィッティング操作は、移動構造に適用する最適な並進および回転をコンピューターで見積もるアルゴリズムを使用し、等価な原子の特定対を超えるフィットの平方自乗平均差が絶対最小であるようにする。オングストロームで与えたこの数は、QUANTAにより記録される。本発明の目的には、図３に列挙した構造座標により記載した関連主鎖原子上に重ねた場合、保存残基主鎖原子(Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ)の平方自乗平均偏差が１.５ Å以下である、あらゆる分子または分子複合体は同一であるとみなす。より好ましくは、平方自乗平均偏差は１.０Å以下である。 “平方自乗平均偏差(root mean square deviation)”という用語は、平均からの偏差値の二乗の演算平均の平方根を意味する。これは傾向または対象からの偏差またはバリエーションを現す方法である。本発明の目的の場合、“平方自乗平均偏差”は、本明細書に記載した構造座標により定義した複合体のＮＳ３様ポリペプチド部分の主鎖の関連部分からのタンパク質またはタンパク質複合体の主鎖におけるバリエーションを定めるものである。一旦、タンパク質結晶の構造座標が決まると、それらは、他の結晶の構造を解明するのに有用である。よって、本発明によれば、ＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド複合体、特にｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体およびそれらの部分の構造座標は、機械読取り可能記憶媒体に記憶させる。このようなデータは、薬剤開発やＸ線結晶学的分析またはタンパク質結晶などの様々な目的に使用できる。従って、本発明の一実施態様では、図３に記載の構造座標を用いてコードしたデータ記憶材を含む機械読取り可能データ記憶媒体を提供する。図４は、これらの実施態様の１バージョンを示す。システム１０は、中央処理装置(“ＣＰＵ”)２０、ＲＡＭ(ランダム・アクセス・メモリー)または“コア” メモリーなどの作業用メモリー２２、大容量記憶メモリー２４(１以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブなど)を含むコンピューター１１、１以上の陰極線管(“ＣＲＴ”)ディスプレイ端末２６、１以上のキイボード２８、１以上の入力ライン３０および１以上の出力ライン４０で構成されており、これらは全て、常用の双方向システムバス５０により相互接続されている。入力ライン３０でコンピューター１１につなげた入力ハードウェア３６は、様々な方法で実現(インプリメンテーション)できる。本発明の機械読取り可能データは、電話線または専用データ回線３４につなげた１つのまたは複数のモデム３２の使用を経て入力できる。あるいは、または更には、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ２４を含むこともできる。ディスプレイ端末２６に関連して、キイボード２８も入力機構として使用できる。出力ライン４０によりコンピューター１１につなげた出力ハードウェア４６も同様に常用の装置により実現(インプリメンテーション)できる。一例として、出力ハードウェア４６には、本明細書に記載のQUANTAなどのプログラムを用いて本発明の結合ポケットをグラフィック表示するために、ＣＲＴディスプレイ端末２６を組込むことができる。出力ハードウェアには、プリンター４２を組込むこともできるので、ハードコピー出力をとることもでき、またディスクドライブ２４を組込めば、後の使用のためにシステム出力を記憶させることもできる。作業中、ＣＰＵ２０は、様々な入力および出力機構３６、４６の使用を調整し、大容量記憶装置２４からのデータアクセスおよび作業用メモリー２２へのアクセスおよびそのメモリーからのアクセスを統合し、そして、データ処理ステップの順序を決める。本発明の機械読取り可能データを処理するには、多くのプログラムが使用できる。このようなプログラムは、本明細書に記載したコンピューター的薬剤開発法に関して検討されている。ハードウェアシステム１０の構成要素についての具体的な言及は、データ記憶媒体についての下記説明全体に適切なものとして含まれている。図５は、図４のシステム１０のようなあるシステムにより実行され得る機械読取り可能データでコードできる磁気データ記憶媒体１００の断面を示す。媒体１００は、常用されている適切な基板１０１と片面または両面に常用されている適切なコーティング１０２を持ち、その極性またはオリエンテーション(orientati on)が磁気的に変化し得る磁気ドメイン(見えない)を含有する、常用のフロッピーディスクまたはハードディスクであり得る。媒体１００は、ディスクドライブまたはその他のデータ記憶装置２４のスピンドルを受ける開口部(図示せず)を持つこともある。媒体１００のコーティング１０２の磁気ドメインは、図４のシステム１０のようなシステムにより実行させる目的で本明細書に記載したような常用の機械読取り可能データのような手法でコードできるように、極性化または指向化されいる。図６は、かかる機械読取り可能データまたは図４のシステム１０などのシステムにより実行できる命令セットでコードすることもできる光学式読取り可能データ記憶媒体１１０の断面を示す。媒体１１０は、常用のコンパクトディスク読出し専用メモリー(ＣＤ−ＲＯＭ)または光学式に読取り可能でかつ光磁気的に書込み可能な光磁気ディスクなどの再書込み可能媒体であり得る。媒体１００は、好ましくは、常用されている適切な基板１１１と、通常、基板１１１の片面に常用されている適切なコーティング１１２を持つ。ＣＤ−ＲＯＭの場合、よく知られているように、コーティング１１２は、反射性であり、機械読取り可能データをコードするために多数のピット１１３が設けられている。コーティング１１２の表面からレーザー光を反射させることによりピットの配列を読む。コーティング１１２の表面には保護コーティング１１４、好ましくは実質的に透明である、が施されている。光磁気ディスクの場合、よく知られているように、コーティング１１２はピット１１３を持たないが、レーザー(図示せず)などによりある温度以上に加熱するとその極性または指向が磁気的に変化し得る多数の磁気ドメインを持つ。このドメインの指向は、コーティング１１２から反射されたレーザー光の極性を測定することにより読むことができる。ドメインの配列は、上記のデータをコードしている。本発明は、ＨＣＶＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体またはそれらの任意の部分に結合できる阻害性化合物を含む化学的事物を設計、選択、および合成するための構造ベースの、または合理的な薬剤デザイン技術の使用を初めて可能にするものである。本発明により可能になった特に有用な薬剤デザイン技術の１つは、反復(itera tive)薬剤デザインである。反復薬剤デザインは、連続セットのタンパク質/化合物複合体の３次元構造を測定および評価することにより、タンパク質と化合物との会合を最適化する方法である。当業者ならば、天然リガンドまたは基質とそれらに対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合が、多くの生物学的作用機構の基礎であることが認識できるであろう。本明細書で使用する“結合ポケット”という用語は、その形状の結果として、その他の化学的事物または化合物と有利に会合する、分子または分子複合体のある領域を意味する。同様に、多くの薬剤は、レセプターおよび酵素の結合ポケットとの会合によりその生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケットのあらゆる部分で起こり得る。このような会合について理解することは、その標的レセプターまたは酵素とより有利に会合し、それにより生物学的効果の向上した薬剤のデザインを導くのに役立つ。従って、この情報は、レセプターまたは酵素の潜在的リガンドまたは阻害因子、例えば、ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドの、より重要にはＨＣＶＮＳ３の阻害因子を設計するのに価値がある。 “と会合する”という用語は化学的事物または化合物またはそれらの部分間の近接状態を表す。会合は、水素結合またはファン・デル・ワールスまたは静電相互作用によって、近接した並置がエネルギー的に好まれるような場合は非共有結合であってもよく、または、共有結合であってもよい。反復薬剤デザインでは、一連のタンパク質/化合物複合体の結晶を入手し、次いで、各複合体の３次元構造を解明する。このようなアプローチにより、各複合体のタンパク質と化合物間の会合を洞察できる。これは、阻害性活性を持つ化合物を選択し、この新規タンパク質/化合物複合体の結晶を入手し、複合体の３次元構造を解明し、新規タンパク質/化合物複合体と既に解明されているタンパク質/化合物複合体との会合を比較することにより、達成される。タンパク質/化合物会合に影響を及ぼす化合物における変化の様子を観測することにより、これらの会合を最適化できる。ある場合では、反復薬剤デザインは、連続的なタンパク質−化合物複合体を形成させ、次いで、各新規複合体を結晶化することにより実施する。あるいは、予め形成させたタンパク質結晶を阻害因子の存在下で浸漬し、それによってタンパク質/化合物複合体を形成させ、個々のタンパク質/化合物複合体それぞれを結晶化する必要性を事前に除去する。有利には、本発明により提供したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチド／ＮＳ４Ａ様ペプチド結晶、特にｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ結晶を、ＮＳ３プロテアーゼ阻害因子などの１つの化合物または複数化合物の存在下で浸漬して、ＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド/化合物結晶複合体を提供できる。本明細書で使用した“浸漬”という用語は、対象の化合物を含有する溶液に結晶を移す処理を意味する。本発明のその他の実施態様では、実施例１および２に記載の工程からなる、ＮＳ３様ポリペプチドタンパク質を含む組成物の製法を提供する。好ましくは、この組成物は、ＮＳ３様ポリペプチドをＮＳ４Ａ様ペプチドとの複合体の状態で含む。図３に記載した構造座標を使用して、その他の結晶化分子または分子複合体についての構造情報を得るのに役立てることもできる。このことは、分子置換を含む多数のよく知られた技術のどれによっても達成できる。図３に記載した構造座標は、また、ＨＣＶＮＳ３と構造的に類似の少なくとも幾つかの特徴を含有する分子または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を測定するために使用することもできる。特に、その他の結晶化分子または分子複合体についての構造情報が入手できる。このことは、分子置換を含む多数のよく知られた技術のどれによっても達成できる。よって、その他の実施態様では、本発明は、構造が未知である結晶化分子または分子複合体についての構造情報を得るための分子置換利用法を提供し、その方法は：ａ)該結晶化分子または分子複合体からＸ線回折パターンを作成し、ｂ)図３に記載の構造座標の少なくとも一部をＸ線回折パターンに適用して、構造が未知である分子または分子複合体の３次元電子密度地図を作るという工程を含んでなる。好ましくは、結晶化分子または分子複合体は、ＮＳ３様ポリペプチドおよびＮＳ４Ａ様ペプチドを含む。より好ましくは、結晶化分子または分子複合体は、本発明の結晶を溶液に浸漬することにより得られる。分子置換を使用することによって、本発明により提供される(および図３に記載した)ｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の構造座標の全てまたは部分を用いて、未知構造の結晶化分子または分子複合体の構造を、最初からかかる情報の測定を試みるよりも迅速かつ効果的に決定することができる。分子置換は、未知構造に対するフェーズの正確な予測を提供する。フェーズは、直接測定できない結晶構造を解明するために使用する方程式の１ファクターである。分子置換以外の方法により、フェーズについての正確な値を得ることは、近似化(approximations)と純化(refinements)の反復サイクルを伴う時間のかかる操作であり、結晶構造の解明を大きく妨げる。しかしながら、少なくとも同族部分を含有するタンパク質の結晶構造が解明されれば、既知構造のフェーズから、未知構造のフェーズを十分に予測することができる。よって、この方法は、未知の分子または分子複合体の結晶の単位格子内に図３に従ってｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の関連部分を配置し、かつ位置付けして、観測された未知構造の分子または分子複合体の結晶のＸ線回折パターンを十分に検討することにより、その構造座標が未知である分子または分子複合体の予備的モデルを作成することを含む。その後、このモデルからフェーズを算出し、観測されたＸ線回折パターン振幅と組み合わせて、座標が未知である構造の電子密度地図を作成できる。それから、これをよく知られた任意のモデル構築および構造精巧技術にかけ、最後に未知の結晶化分子または分子複合体の正確な構造を提供できる[E．Lattman，“Use of the Rotation and Translation Functions”，in Meth ．Enzymol.，115，pp．55-77(1985);M．G．Rossmann，et.，“The Molecul ar Replacement Method”，Int ．Sci．Rev．Ser.，No．13，Gordon & Breach，N ew York(1972)]。ｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体のどの部分にも十分に同族な結晶化分子または分子複合体の任意の部分の構造は、この方法により解明できる。好ましい実施態様では、分子置換法を利用して、複合体がＮＳ３様ポリペプチドを含んでいる分子または分子複合体についての構造情報を得る。好ましくは、ＮＳ３様ポリペプチドは、ｔＮＳ３またはその同族体である。本発明により提供されるｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａの構造座標は、ＮＳ３様ポリペプチドの他の結晶形、好ましくは、ｔＮＳ３；ＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド、好ましくはｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａの他の結晶形、または上記のものを含む複合体、の構造を解明するのに特に有用である。構造座標は、また、様々な化学的事物と相互複合体形成した(co-complexed)ＮＳ３様ポリペプチド/ＮＳ４Ａ様ペプチド複合体、特にｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａの結晶の構造を解明するのにも特に有用である。このアプローチにより、ＮＳ３阻害因子候補とＮＳ３またはＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体との相互作用を含む化学的事物間の相互作用に対する最適部位の決定が可能になる。例えば、様々な種類の溶媒に曝した結晶から集めた高解像力Ｘ線回折データにより、各種の溶媒分子が存在する場所の測定が可能である。その後、それらの部位に緊密に結合する低分子を設計および合成し、そのＮＳ３阻害活性について試験できる。上記の複合体は全て、よく知られたＸ線回折技術を用いて研究でき、また、Ｘ −ＰＬＯＲなどのコンピューターソフトウェアを用いて約０.２０またはそれ以下のＲ値に対する１.５−３Å解像力Ｘ線データに対して精巧することができる例えば、Blundell & Johnson，前掲;Meth ．Enzymol.，vol．114 & 115，H．W．W yckoff et al.，eds.，Academic Press(1985)参照］。よって、この情報は、既知のＮＳ３阻害因子を最適化し、更に重要には、新規ＮＳ３阻害因子を設計するのに使用することもできる。本発明がより十分に理解されるよう、下記の実施例を記載する。これらの実施例は、単なる例示目的であって、いかにしても本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。実施例１ｔＮＳ３の発現および精製切形ＮＳ３セリンプロテアーゼドメイン(ｔＮＳ３)は、Ｃ型肝炎ウイルスＨ株のｃＤＮＡからクローン化した［Grakoui，A．et al.，“Expression and Ident ification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products”，J ．Virol . ，67，pp．1385-1395(1993)］。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸(ウイルスポリタンパク質の１０２７−１２０７残基)は、ＨＣＶのポリタンパク質の４つの下流部位全てをプロセッシングするＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含有することが示されている［Lin，C.，et al.，“Hepatitis C Virus NS3 Serine Pr oteinase:Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”J．Virol． 68，pp．8147-8157(1994b)］ので、我々は、このｔＮＳ３に基づいて(His)₆−融合タンパク質を発現させた。プラスミドｐＥＴ−ＢＳ(＋)/ＨＣＶ/Ｔ７−ＮＳ３₁₈₁ −Hisは、エピトープタグと新規制限部位を導入するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いてｐＴＭ３/ＨＣＶ/１０２７−１２０７(ＮＳ３₁₈₁)(同上)から得た。Ｔ７バクテリオファージの遺伝子１０タンパク質のＮ末端由来のＴ７−タグ( ＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ)[Tsai，D．E．et al.，“In Vitro Selection of an RNA Epitope Immunologically Cross-Reactive With a Peptide”，Proc ．Natl．Ac ad．Sci．USA ，89，pp．8864-8868(1992)]をｔＮＳ３ドメインのＮ−末端に配置した。２つのリンカー残基(ＧＳ)を、ｔＮＳ３Ｃ末端に、続いて(His)₆−タグに配置した。Ｅ.コリＪＭ１０９(ＤＥ３)細胞をｐＥＴ−ＢＳ(＋)/ＨＣＶ/Ｔ７ −ＮＳ３₁₈₁−Hisプラスミドで新たに形質転換させ、これを１０Ｌ発酵槽(Braun )中１００μｇ/mlアンピシリン補足複合培地にて３７℃で増殖させた。細胞密度が３−４のＯＤ₆₀₀に到達したら、培養温度を３０℃まで迅速に下げ、直ちに１ｍＭＩＰＴＧの添加により導入を開始させた。導入後２時間で細胞を回収し、精製の前に−７０℃で急速冷凍した。ｔＮＳ３は、組換えＥ.コリ溶解物の可溶性フラクションから下記のように精製した。特記しない限り、全ての操作は４℃で実施した。細胞ペースト(７５− １００g)を５０ｍＭＨＥＰＥＳ、０.３ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０. １％β−オクチルグルコシド、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０、１５容量に再懸濁した。細胞は、微小流体化機(microfluidizer)を用いて破壊し、ホモジェネートを１００,０００×gで３０分間遠心により透明化した。懸濁液を５０ｍＭＨＥＰＥＳ、２０ｍＭイミダゾール、０.３ＭＮａＣｌ、２７.５％グリセロール、０.１％β−オクチル−グルコシド、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０に移し、同じ緩衝液で平衡化した７.０mlNi−アガロースアフィニティーカラムに１.０ml/分でかけた。充填後、カラムを１０−１５容量の平衡用緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を０.３５Ｍイミダゾール含有平衡緩衝液で溶出した。次いで、タンパク質をPharmacia製高解像力Ｓ１００樹脂を詰めた一連の２つのカラム(それぞれ２.６cm×９０cm)でサイズ分画し、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、０.３ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０.１％β−オクチルグルコシド、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０で平衡化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定されるｔＮＳ３フラクションを集め、Amicon Centriprep-１０を用いて１mg/mlまで濃縮し、−７０℃で貯蔵した。ｔＮＳ３をゆっくりと氷上で解凍し、ＮＳ４Ａペプチド(サイズ排除クロマトグラフィー緩衝液に溶かした) をｔＮＳ３：ＮＳ４Ａペプチドモル比１：２で加えた。次いで、試料を１５ｍＭＭＥＳ、０.５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６.５で２.５倍に希釈し、超濾過により〜２ml(〜２mg/ml)まで濃縮した。その後、試料をｐＨ６.５緩衝液で２倍に希釈し、再度〜２mlまで濃縮した。この希釈プロセスは、元の緩衝液構成分の＞４０倍希釈になるまで繰り返した。その後、タンパク質試料を１３.０mg/mlまで濃縮し、〜３００,０００×g、４℃で２０分間遠心した。純粋なｔＮＳ３およびｔＮＳ３／４Ａ複合体の濃度はモル吸収係数(Ａ₂₈₀ )１７,７００Ｍ^-1・cm^-1を用いてＵＶ吸収スペクトルにより測定した。実施例２４Ａペプチド合成および精製ＨＣＶＮＳ４Ａペプチドを、ＮＳ３刺激に必須であると報告されている[Lin ，C．et al．“A Central Region in the Hepatitis C Virus NS4A Protein All ows Formation of an Active NS3-NS4A Serine Proteinase Complex In Vivo an d In Vitro”，J．Virol．69，pp．4373-4380(1995)]必須領域を含むウイルスコファクターの残基Gly２１からPro３９(ＨＣＶポリタンパク質の１６７８から１６９６残基)をスパンするために合成した。リジン残基を末端に付加して、水溶解性を補助し、Cys２２(ＨＣＶＨ株のポリタンパク質の１６７９残基)の代わりにセリン残基を用いた。Ｎ^a−Fmoc、Ｎ^e−Boc−Lys Wang樹脂を用いて始める固相ペプチド合成(Applied Biosystems 433A)によりペプチド(Ｈ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨ・ＴＦＡ塩)を製造した。Ｎ^a− Fmoc−保護アミノ酸は、Ｎ−メチルピロリジノン中、結合剤としてＨＯＢｔ(１ −ヒドロキシベンゾトリアゾールヒドレート)と共にＨＢＴＵ(２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル)１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)を用いて逐次的に加えた。樹脂からの切断と全体的な脱保護は、室温でトリフルオロ酢酸９５％と水５％により１.５時間で達成された(１５ml/g 樹脂)。ペプチドをWaters Delta Pak C18、15μｍ、３００Åカラム(３０mm×３００mm)での分取ＨＰＬＣにより、３５分(流速２２ml/分)にわたり０.１％水性トリフルオロ酢酸中アセトニトリル(１５−４０％)直線勾配で溶出して、精製した。ペプチド純度は、分析用ＨＰＬＣにより確認した。配列は、直接Ｎ−末端配列分析と、正確な(Ｍ＋Ｈ)⁺および(Ｍ＋Ｎａ)⁺分子イオンを示す、マトリクス補助レーザー脱着質量分析(Kratos MALDI I)により確認した。実施例３結晶化およびデータ収集ｔＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体の結晶は、０.１ＭＭＥＳ、１.８ＭＮａＣｌ、０. １Ｍリン酸ナトリウム/カリウム、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６. ５の貯蔵槽上で吊り下げ滴蒸気拡散(hanging-drop vapor diffusion)により育成した。結晶は、２−３週にわたって成長し、最終的に約０.１×０.１×０.２５m mのディメンションになった。この研究に使用した斜方六面体結晶は、単位格子ディメンションａ＝ｂ＝２２５.０Åおよびｃ＝７５.５Åの空間群Ｒ３２に属し、非対称単位当り２つのｔＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体を含有した。データ収集のための統計値、重原子純化および結晶学的純化は、表１に与える。全ての重原子浸漬は、結晶化に使用したのと同じ貯蔵槽上の吊り下げ滴法で行った。結晶を安定化溶液(５０ｍＭＭＥＳ、２.０ＭＮａＣｌ、０.１Ｍリン酸ナトリウム/カリウム、１０ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび２０％グリセロール、ｐＨ６.２)に移し、その後、データ収集のため、乾燥窒素ガス流中、１００Ｋ(Molecular Structure Corp.，Houston，TX)で凍結させた。Rigaku RU200回転陰極ジェネレーター(ＭＳＣ)上に取りつけたRigaku R-AXIS IIC燐イメージングエリア検出器で振幅写真撮影し、５０ｋＶおよび１００ｍＡで操作することによりデータを得た。測定した明暗度は、ＨＫＬソフトウェアパッケージ(Z．Otwino wski and W．Minor)を用いて積分し、スケールし、マージした。実施例４フェージング、モデル構築および純化重原子位置を調べて特定し、様々なフーリエ合成で確認した。重原子パラメーターを純化し、フェーズをプログラムPHASESを用いて３.１Åまでコンピュータ化した[Furey，W．and Swaminathan，S．“PHASES-95:a program package for t he processing and analysis of diffraction data frommacromolecules”，Met h ．Enzymol. ，(1996)]。ＣＣＰ４結晶学的パッケージ(Collaborative Computati on Project，1994)を用いて、ヒストグラム適合［Zhang，K.Y.J．and Main，P. ，“The Use of Sayre’s Equation With Solvent Flattening and Histogram M atching for Phase Extension and Refinement of Protein Structures”，Acta Crystallogr. ，A46，pp．377-381(1990)］と併用した溶媒フラット化(solvent flattening)サイクル［Wang，B．C.，“Resolution of Phase Ambiguity in Mac romolecular Crystallography”，Methods in Enzymol. 115，pp．90-112(198 5)］により、ＭＩＲフェーズを向上させ、２.７Åまで伸ばした。得られた電子密度地図は、タンパク質主鎖に対してほぼ連続的な密度と、強い側鎖密度を示した。およそ８０％のモデルが、明らかにこの地図(QUANTA 4.1，Molecular Simul ations)内に組込まれており、Ｘ-ＰＬＯＲ［Brunger，A．T.，“X-PLOR:A Syste m for X-Ray Crystallography and NMR”，New Haven，Connecticut:Departmen t of Molecular Biophysics and Biochemistry，Yale University(1993)］での１ラウンドの模擬アニーリング純化は、Ｒ−ファクターを２９％にし、遊離Ｒ値を３３％にした[Brunger，A．T.，“Free R Value:A Novel Statistical Quanti ty for Assessing the Accuracy of Crystal Structures”，Nature，355，pp． 472-475(1992)]。残りのモデルは、まず、解像力を２.５Åに拡大し、次いでよく整列させた水分子を加えることにより、数段階で構築および純化した。最終ラウンドの位置的な、および個々の温度ファクター純化により、６.０から２.５Åの間の２６,６５２の反射についてＲ−ファクターを２１.６％(遊離Ｒ値２６.１％)にした(Ｆ＞１ｓＦ)。このモデルは、複合体ＡではｔＮＳ３残基１０５５−１２０６とＮＳ４Ａ残基１６７８−１６９３からなり、(ポリタンパク質番号付け、亜鉛原子２個と水分子１３０個を持つ)複合体ＢではｔＮＳ３残基１０２８−１２０６およびＮＳ４Ａ残基１６７８−１６９６からなる。最終モデルについてのラマチャンドランプロットは、最も好ましい領域では残基９１％を含有し、非許容領域または緩許容領域では０％であった。理論的なｒｍｓ偏差は、結合距離にして０.００７Åおよび結合角にして１.４７°であった。本発明の多くの実施態様を記載したが、これらの基本的な実施例は、変化して本発明の生成物および方法を利用する他の実施態様を提供し得ることは明らかである。よって、本発明の範囲は、実施例として表した特定の実施態様ではなく、添付の請求の範囲により定義されるものと認められる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年４月１４日（１９９８．４．１４）【補正内容】請求の範囲１．ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドを含む、結晶化可能な組成物。２．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドまたはＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。３．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがｔＮＳ３である、請求項１に記載の組成物。４．ＮＳ４Ａ様ペプチドがＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである、請求項１、２または３に記載の組成物。５．ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドを含む、結晶。６．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドまたはＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドである、請求項５に記載の結晶。７．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがｔＮＳ３である、請求項５に記載の結晶。８．ＮＳ４Ａ様ペプチドがＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである、請求項５、６または７に記載の結晶。９．更に、ＨＣＶＮＳ３の阻害因子を含む、請求項５に記載の結晶。１０．ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドを含み、そのＮＳ４Ａ様ペプチドがＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである、組成物。１１．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドまたはＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドである、請求項１０に記載の組成物。１２．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがｔＮＳ３である、請求項１０に記載の組成物。１３．データが図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の構造座標、または、該複合体の同族体であって１.５Åより多くない複合体の主鎖原子からの平方自乗平均偏差を持つ主鎖原子を含む同族体の構造座標で定められている、機械読取り可能なデータでコードしたデータ記憶材を含む機械読取り可能なデータ記憶媒体。１４．該分子または分子複合体が、図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４についての構造座標、または該分子または分子複合体の同族体であって１.５Åより多くない該アミノ酸の主鎖原子からの平方自乗平均偏差を持つ同族体についての構造座標セットにより定められている、請求項１３に記載の機械読取り可能なデータ記憶媒体。１５．図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４についての構造座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含む機械読取り可能データの第１セットでコードしたデータ記憶材を含む機械読取り可能なデータ記憶媒体であって、未知構造の分子または分子複合体のＸ線回折パターンを含む機械読取り可能なデータの第２セットと併用する場合、該第１セットのデータおよび該第２セットのデータを用いるための指示をプログラム化した機械を用いて、機械読取り可能データの第２セットに相当する構造座標の少なくとも一部、該第１セットのデータおよび該第２セットのデータを測定できる、機械読取り可能なデータ記憶媒体。１６．ａ．該結晶化分子または分子複合体からＸ線回折データを作成し；ｂ．図３に記載の構造座標の少なくとも一部を該Ｘ線回折パターンに適用して、分子または分子複合体の少なくとも一部の３次元電子密度地図を作成する；各工程を含んでなる、図３に記載の構造座標を用いた、未知構造の分子または分子複合体についての構造情報を得る方法。１７．未知構造の分子または分子複合体が、ＮＳ４Ａ様ペプチドとの複合体の状態でのＮＳ３様ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、請求項１３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リン，チャオアメリカ合衆国02139マサチューセッツ州ケンブリッジ、ハーバード・ストリート 295番 (72)発明者フォックス，テッドアメリカ合衆国01754マサチューセッツ州メイナード、リーブズ・ロード４番 (72)発明者トムソン，ジョン・エイアメリカ合衆国02178マサチューセッツ州ベルモント、スレイド・ストリート105 番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドを含む、組成物。２．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドまたはＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。３．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがｔＮＳ３である、請求項１に記載の組成物。４．ＮＳ４Ａ様ペプチドがＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである、請求項１ないし３のいずれかに記載の組成物。５．ＮＳ４Ａ様ペプチドと複合体形成したＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドを含む、結晶。６．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがＮＳ３プロテアーゼドメインポリペプチドまたはＮＳ３プロテアーゼドメイン様ポリペプチドである、請求項５に記載の結晶。７．ＨＣＶＮＳ３様ポリペプチドがｔＮＳ３である、請求項５に記載の結晶。８．ＮＳ４Ａ様ペプチドがＨ−ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ−ＯＨである、請求項１ないし３のいずれかに記載の結晶。９．更に、ＨＣＶＮＳ３の阻害因子を含む、請求項５に記載の結晶。１０．データが図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４Ａ複合体の構造座標、または、該複合体の同族体であって１.５Åより多くない複合体の主鎖原子からの平方自乗平均偏差を持つ主鎖原子を含む同族体の構造座標で定められている、機械読取り可能なデータでコードしたデータ記憶材を含む機械読取り可能なデータ記憶媒体。１１．該分子または分子複合体が、図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４についての構造座標、または、該分子または分子複合体の同族体であって１.５Åより多くない該アミノ酸の主鎖原子からの平方自乗平均偏差を持つ同族体についての構造座標セットにより定められている、請求項１０に記載の機械読取り可能なデータ記憶媒体。１２．図３のｔＮＳ３/ｓＮＳ４についての構造座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含む機械読取り可能データの第１セットでコードしたデータ記憶材を含む機械読取り可能なデータ記憶媒体であって、未知構造の分子または分子複合体のＸ線回折パターンを含む機械読取り可能なデータの第２セットと併用する場合、該第１セットのデータおよび該第２セットのデータを用いるための指示をプログラム化した機械を用いて、機械読取り可能データの第２セットに相当する構造座標の少なくとも一部、該第１セットのデータおよび該第２セットのデータを測定できる、機械読取り可能なデータ記憶媒体。１３．ａ．該結晶化分子または分子複合体からＸ線回折データを作成し；ｂ．図３に記載の構造座標の少なくとも一部を該Ｘ線回折パターンに適用して、分子または分子複合体の少なくとも一部の３次元電子密度地図を作成する；各工程を含んでなる、図３に記載の構造座標を用いた、未知構造の分子または分子複合体についての構造情報を得る方法。１４．未知構造の分子または分子複合体が、ＮＳ４Ａ様ペプチドとの複合体の状態でのＮＳ３様ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、請求項１３記載の方法。