DE69735633T2

DE69735633T2 - Metabolisch veränderte milchsäurebakterien und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69735633T2
Application number: DE69735633T
Authority: DE
Inventors: Dan Nilsson
Original assignee: HANSENS LAB; Chr Hansen AS
Current assignee: HANSENS LAB; Chr Hansen AS
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1997-08-20
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-08-21
Also published as: EP0928333A1; DE69735633T3; US7465575B2; US20040086955A1; EP0928333B2; US6645754B1; EP0928333B1; DK0928333T4; BR9711341A; WO1998007843A1; AU723153B2; US20090155411A1; AU3847597A; DK0928333T3; US8043843B2; DE69735633D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Milchsäurebakterien-Starterkulturen und insbesondere sind Mittel vorgesehen, um solche Bakterien metabolisch zu entwickeln, um Mutanten oder Varianten davon zu erhalten, die, wenn sie bei der Herstellung von gegorenen Lebensmitteln verwendet werden, größere Mengen von wünschenswerten Metaboliten oder geringere Mengen von weniger wünschenswerten Metaboliten erbringen.
Technischer Hintergrund und Stand der Technik
Milchsäurebakterien werden umfassend als Starterkulturen in der Nahrungsmittelindustrie bei der Herstellung von gegorenen Produkten einschließlich Milchprodukten wie zum Beispiel Joghurt und Käse, Fleischwaren, Bäckereiprodukten, Wein und Gemüseprodukten verwendet. Lactococcus-Arten einschließlich Lactococcus lactis gehören zu den meistverwendeten Milchsäurebakterien in Molkerei-Starterkulturen. Jedoch, mehrere andere Milchsäurebakterien wie zum Beispiel Leuconostoc-Arten, Pediococcus-Arten, Lactobacillus-Arten und Streptokokken-Arten. Arten von Bifidobacterium, eine Gruppe von streng anaeroben Bakterien, werden ebenfalls gemeinhin in Lebensmittel-Starterkulturen verwendet, alleine oder in Kombination mit Milchsäurebakterienarten.
Wenn eine Milchsäurebakterienstarterkultur zu Milch oder jeglichem anderen Lebensmittel-Ausgangsprodukt unter angemessenen Bedingungen hinzugefügt wird, wachsen die Bakterien schnell mit gleichzeitiger Umwandlung von Zitrat, Milchzucker oder anderen Zuckerverbindungen in Milchsäure/Laktat und möglicherweise andere Säuren einschließlich Azetat, was zu einer pH-Abnahme führt. Zusätzlich werden mehrere andere Metaboliten während des Wachstums von Milchsäurebakterien erzeugt. Diese Metaboliten umfassen Ethanol, Formiat, Azetaldehyd, α-acetolactate, Acetoin, Diazetyl, und 2,3 Butylenglykol (Butanediol). Unter diesen Metaboliten ist Diazetyl ein wesentlicher Aromastoff, der während der Gärung von Zitrat benutzenden Arten von z.B. Lactococcus, Leuconostoc und Lactobacillus gebildet wird. Diazetyl wird durch eine oxidative Decarboxylierung (1) von α-Acetolactat gebildet, das durch die Wirkung der α-acetolactate-Synthetase (Als) aus zwei Pyruvatmolekülen gebildet wird. Pyruvat ist ein wichtiges Zwischenprodukt bei mehreren Milchsäurebakterien-Stoffwechselwegen einschließlich des Zitratsstoffwechsels und der Zersetzung von Milchzucker oder Traubenzucker zu Laktat. Die Menge an Pyruvat in den Zellen ist entscheidend für den Fluss durch den Stoffwechselweg, der zu Diazetyl, Acetoin und 2,3 Butylenglykol (Butanediol) führt, über die Zwischenverbindung α-Acetolactat aufgrund der niedrigen Affinität der α-Acetolactat-Synthetase zu Pyruvat.
Pyruvat wird zu Formiat und Azetylkoferment A (Azetyl CoA) umgewandelt (1), durch die Wirkung von Pyruvat Format Lyase (Pfl). Diese Umwandlung findet nur unter anaeroben Bedingungen (Frey et al. 1994) statt. Pfl wird sogar bei niedrigen Sauerstoffniveaus deaktiviert, und ein Wechsel von anaerobem zu aerobischen Bedingungen führt zu signifikante Veränderungen bei den Eigenschaften der Stoffwechsel-Endprodukte bei Milchsäurebakterien, mit komplettem Verschwinden von Ethanol und Formiat (Hugenholtz, 1993).
Ein anderer Faktor, der die Aktivität von Pfl regelt, ist der pH-Wert. Der optimale pH-Wert von Pfl ist etwa 7 (Hugenholtz, 1993).
Ein alternativer Weg zur Bildung von Azetyl CoA aus Pyruvat (1) in einer Milchsäurenbakterie ist der durch die Aktivität des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes (PDC). Im Gegensatz zu Pfl hat PDC eine sehr niedrige Aktivität unter anaeroben Bedingungen aufgrund der aufhaltenden Wirkung von NADH auf dieses Enzym (Snoep et al. 1992). Dieses Enzym benötigt das Vorhandensein von Liponsäure als Kofaktor, um aktiv zu sein.
Zusätzlich kann Azetyl CoA in Milchsäurebakterien aus dem Azetat unter aerobischen sowie unter anaeroben Bedingungen hergestellt werden.
Dementsprechend ist vorstellbar, dass die Menge an Pyruvat unter anaeroben Bedingungen ansteigt, wenn es dem Milchsäurebakterienstamm an Enzymsystemen mangelt, die am Pyruvat-Verbrauch beteiligt sind, einschließlich Pfl. Wie oben erwähnt, kann eine erhöhte Menge an Pyruvat zu einen erhöhten Fluss von Pyruvat zu Acetoin und Diazetyl – oder andere Metaboliten – führen, die von dem α-Acetolactat stammen. Daher kann man damit rechnen, dass gegorene Lebensmittel, die durch Verwendung einer Milchsäurebakterienstarterkultur mit verringerter Pfl-Aktivität hergestellt werden oder ganz ohne solche Aktivität, eine erhöhte Menge an Acetoin oder eines anderen der obengenannten Metaboliten enthalten. Umgekehrt können solche Starterkulturen geringere Mengen an anderen Metaboliten erzeugen, einschließlich Ethanol und Azetat und möglicherweise Azetaldehyd.
Neue Studien haben gezeigt, dass, wenn L. lactis fehlt, die Laktatdehydrogenase (Ldh), die an dem wichtigsten Pyruvat verbrauchenden Weg beteiligt ist, der zu Laktat führt, mehr Pyruvat zu Acetoin und Butanediol über – Acetolactat gerichtet ist, was möglicherweise zu erhöhter Bildung des Zwischenprodukts Diazetyl führt (Platteeuw et al., 1995; Gasson et al., 1996).
Die Überproduktion von -Acetolactatsynthetase bei Lactococcus lactis als ein anderer Ansatz, um metabolisch Milchsäurebakterien zu entwickeln, um größere Diazetylmengen herzustellen, wurde von Platteeuw et al.. 1995 offenbart.
Das Potential der Verwendung von L. lactis-Stämmen mit verringerter Aktivität von Pyruvat Format Lyase als Mittel zur Erhöhung der Diazetylbildung wird von Hugenholtz erwähnt, 1993. Von diesem Autor wird vorgeschlagen, dass die Kombination von drei Strategien: 1) Ldh-Desaktivierung durch Mutation/Genmanipulation, 2) Pfl-Desaktivierung durch Anreicherung mit Sauerstoff und/oder niedriger pH und 3) Acetolactatdecarboxylase (ALD)-Deaktivierung durch Mutation/Genmanipulation eine hohe Produktion von α-acetolactat aus Milchzucker ergeben könnte.
Jedoch ist die vorgeschlagene Deaktivierung der Pfl-Aktivität durch Anreicherung mit Sauerstoff und/oder niedrigen pH in der industriellen Produktion von durch Milchsäurebakterien gegorenen Molkereiprodukten oder anderen gegorenen Lebensmitteln nicht durchführbar oder möglich, da die Produktion hierbei im allgemeinen unter im wesentlichen anaeroben Bedingungen stattfindet. Darüberhinaus beträgt der pH-Wert der Ausgangsmaterialien einschließlich Milch üblicherweise etwa 7, und es ist im allgemeinen nicht wünschenswert, den pH-Wert des zu gärenden Lebensmittelmaterials zu senken.
Während es vorgeschlagen wurde, die Pfl-Aktivität von Milchsäurebakterien zur Veränderung ihrer Produktion von Metaboliten durch Manipulation der Wachstumsbedingungen in eine wünschenswerte Richtung abzuändern, gab es nach dem bisherigen Stand der Technik keine Anregungen, um metabolisch veränderte Milchsäurebakterien mit veränderter Pfl-Aktivität unter für die Industrie geeigneten und durchführbaren Kulturbedingungen zu verwenden.
Ein Verfahren, das die Isolierung von Mutanten von gran-negativen Bakterien mit Pfl-Defekt-Aktivität erlaubt, wurde von PASCAL et al offenbart., 1975. Dieses Verfahren umfasst die Auswahl von Mutanten mit Pfl-Defekt von E. coli und Salmonella typhmurium auf der Grundlage ihrer mangelnden Fähigkeit H₂ und CO₂ unter Ausschluss von Formiat zu erzeugen, wenn sie unter anaeroben Bedingungen in Medien inkubiert werden, die Traubenzucker oder Pyruvat enthalten. Jedoch kann ein solches Auswahlverfahren nicht zur Auswahl von Mutanten mit Pfl-Defekt von Milchsäurebakterien verwendet werden, da diesen Organismen das Enzym fehlt, das die Bildung von H₂ und CO₂ aus Formiat katalysiert.
Dementsprechend enthält der Stand der Technik keine Anleitung zum Entwurf eines durchführbaren Verfahrens zum Isolieren eines Milchsäurebakterien-Mutanten mit Pfl-Defekt (Pfl^–).
Experimente, die von dem Erfinder mit dem Minimalmedium BA (Clark und Maaløe, 1967) für E. coli durchgeführt wurden, zeigten, dass dieses Mittel das aerobische Wachstum von Milchsäurebakterien nicht unterstützte. Jedoch, wenn es in diesem Mittel zusammen mit E. coli kultiviert wurde, wurde das Wachstum von Milchsäurebakterien unterstützt, was bedeutet, dass E. coli einen Faktor produziert, der für das Wachstum der Milchsäurebakterien benötigt wird. Später wurde herausgefunden, dass dieser Wachstumsfaktor Azetat ist, was zu der Entwicklung des DN-Mittels führte (Dickely et al., 1995).
Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden dass Wildtypstämme von Milchsäurebakterien wie zum Beispiel Stämme von Lactococcus und Streptococcus mit als Beispielen Stämmen von Lactococcus lactis und Streptococcus thermophilus unter anaeroben Bedingungen gut auf dem DN-Mittel wachsen (Dickely et al., 1995), ohne Azetat. Diese unerwarteten Ergebnisse ermöglichten es, ein neues und einfaches Verfahren zur Isolierung von Milchsäurebakterienmutanten mit Pfl-Defekt zu entwickeln, basierend auf der Erkenntnis dass solche Mutanten, im Gegensatz zu den phänotypischen Pfl⁺-Wildtypstämmen, nicht in der Lage sind, unter anaeroben Bedingungen auf DN-Mittel unter Ausschluss von Azetat zu wachsen.
Zusätzlich hat dieses Verfahren, das die Auswahl vorhandener Milchsäurebakterienmutanten mit Pfl-Defekt erlaubt, es ermöglicht, weitere mutierte Zellen vorzusehen. die nicht nur Pfl^– sind, sondern auch in eines oder mehrere Gene mutiert werden, die an den Zitrat/Zucker-Stoffwechselwegen beteiligt sind, wie zum Beispiel das ldh-Gen, das für Laktatdehydrogenase (Ldh) kodiert, so dass eine Reihe von metabolisch veränderten Milchsäurebakterien mit höchst wünschenswerten verbesserten Merkmalen in bezug auf die Metabolit (Gärungsendprodukt)-Produktion entstehen.
Die obigen Ergebnisse haben daher einen neuen Ansatz zur Bereitstellung nützlicher metabolisch veränderter Milchsäurebakterien-Starterkulturen eröffnet, der auf verhältnismäßig einfachen klassischen zufälligen Mutagenesemethoden oder der Auswahl spontan vorkommender Mutanten basiert und keine in vitro Genmanipulation umfasst. Aus praktisch-technologischer Sicht ist dies vorteilhaft, da in die meisten Länder die Verwendung von genetisch veränderten Lebensmittel-Starterkulturen noch von behördlicher Genehmigung abhängt.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend sieht die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Isolieren einer Milchsäurenbakterie mit Pyruvat Format Lyase-Defekt (Pfl) vor, das die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellung eines Wildtyp-Milchsäurebakterienstamms, der unter aerobischen Bedingungen nicht fähig ist, unter Ausschluss von Azetat in einem nicht Liponsäure enthaltenden Mittel zu wachsen, aber in diesem Mittel unter anaeroben Bedingungen wachsen kann, und
(ii) Auswahl eines Mutanten aus besagtem Wildtypstamm, der unter anaeroben Bedingungen nicht unter Ausschluss von Azetat wächst.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl-Defekt, die durch das obige Verfahren erhältlich ist und in bezug auf den Wildtypstamm, aus dem sie gewonnen ist, mindestens eines der folgenden Merkmale aufweist:

(i) dieselbe Wachstumsrate, wenn sie unter aerobischen Bedingungen in einem M17-Medium kultiviert wird,
(ii) eine verringerte Wachstumsrate oder verringerte Säureproduktionsrate, wenn sie unter anaeroben Bedingungen in einem M17-Medium oder in rekonstituierter entrahmter Milch (RSM) kultiviert wird,
(iii) keine Formiatproduktion unter den anaeroben Bedingungen von (ii),
(iv) eine verringerte Produktion von Ethanol oder Azetat unter obigen anaeroben Bedingungen, und/oder
(vi) eine erhöhte Produktion von mindestens einem aus α-Acetolactat gewonnenen Metabolit, wenn sie unter anaeroben Bedingungen in RSM kultiviert wird.

In einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren zum Isolieren einer Milchsäurebakterie mit Pfl- und Laktatdehydrogenase (Ldh)-Defekt vorgesehen, die nicht fähig ist, unter anaeroben Bedingungen bei Vorhandensein von Azetat zu wachsen, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst: zunächst Auswahl einer Milchsäurebakterie mit Pfl-Defekt in Übereinstimmung mit dem obigen Verfahren, und
(ii) Auswahl eines Stammes aus besagter Milchsäurebakterie mit Pfl-Defekt, der unfähig ist, unter anaerober Bedingung in einem Azetat enthaltenden Mittel zu wachsen.
Die Erfindung betrifft in einem anderen Aspekt eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl- und Ldh-Defekt, die nicht fähig ist, unter anaeroben Bedingungen bei Vorhandensein von Azetat zu wachsen, wobei besagte Bakterie durch das obige Verfahren zum Isolieren einer Milchsäurebakterie mit Pfl- und Laktatdehydrogenase (Ldh)- Defekt erhältlich ist, und mit, in bezug auf eine Wildtypmilchsäurebakterie oder ihren Elternstamm mit Pfl-Defekt, mindestens einem der folgenden Merkmale:

(i) dieselbe Wachstumsrate wenn sie unter aerobischen Bedingungen in einem M17-Medium kultiviert wird,
(ii) eine verringerte Fähigkeit des Umwandelns von Milchzucker in Laktat,
(iii) eine erhöhte Produktion von α-acetolactat, und/oder
(iv) eine erhöhte Produktion eines aus α-Acetolactat gewonnenen Metabolits.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl- und Ldh-Defekt, die unter anaeroben Bedingungen bei Vorhandensein von Azetat wachsen kann, wobei besagte Bakterie durch folgendes Verfahren erhältlich ist: (i) zunächst Auswahl einer Milchsäurebakterie mit Pfl- und Ldh-Defekt in Übereinstimmung mit dem obigen Verfahren, und (ii) Auswahl eines Stammes aus besagter Milchsäurebakterie mit Pfl- und Ldh-Defekt, der unter anaeroben Bedingungen in einem Azetat enthaltenden Mittel wachsen kann. In weiteren Aspekten be zieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, wobei zu den Lebensmittel-Ausgangsmaterialien eine Kultur von jeder beliebigen der obigen Milchsäurebakterien hinzugefügt wird, und ein Verfahren zur Herstellung eines Milchsäurebakterienmetabolits, mit Kultivierung jeder beliebiger der obigen Milchsäurebakterien unter Bedingungen, bei denen der Metabolit entsteht, und Isolierung des Metabolits von der Kultur.
Es ist auch eine Milchsäurebakterien-Starterkultur-Zusammensetzung mit jeder beliebigen von den obigen Milchsäurebakterien vorgesehen.
Ausführliche Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Isolieren einer Mutantmilchsäurebakterie mit Pyruvat Format Lyase-Defekt (Pfl) vor. In diesem Text bedeutet der Ausdruck "mit Pyruvat Format Lyase-Defekt", dass der Milchsäurebakterienmutant im Vergleich zu dem Wildtyp-Elternstamm eine verringerte Pfl-Aktivität hat oder dass die Pfl-Aktivität unbeschadet der Wachstumsbedingungen fehlt, wobei die Plf-Aktivität hier in Bezug auf die Formiatproduktion ausgedrückt wird. Ein solcher Mutantenstamm wird hier auch als Stamm mit Pfl-Phänotyp bezeichnet.
In diesem Text bezeichnet der Ausdruck "Milchsäurebakterie" grampositive, mikroaerophile oder anaerobe Bakterien, die Zucker unter Erzeugung von Säuren gären, einschließlich Milchsäure als die vorwiegend hergestellte Säure, Essigsäure, Ameisensäure und Propionsäure. Die industriell nützlichsten Milchsäurebakterien sind Lactococcus-Arten, Streptokokken-Arten, Lactobacillus-Arten, Pediococcus-Arten und Brevibacterium-Arten. Auch die strengen Anaerobier des Genus Bifidobacterium sind im allgemeinen in der Gruppe der Milchsäurebakterien inbegriffen.
Ein Milchsäurebakterienmutant nach der obigen Definition kann gewonnen werden, indem man einen spontan vorkommenden Mutanten eines Wildtypstamms einer Milchsäurebakterie auswählt, der das Merkmal hat, dass er, wenn er unter aerobischen Bedingungen in einem Mittel kultiviert wird, das nicht Liponsäure enthält, ein Wachstumsbedürfnis nach Azetat hat, der aber unter anaeroben Bedingungen in einem solchen Mittel unter Ausschluss von Azetat wachsen kann. Alternativ kann der Mutant des Wildtyp-Milchsäurebakterienstamms bereitgestellt werden, indem man den Stamm vor der Auswahl eines Mutanten mit den obigen Merkmalen des Stammes mit Pfl-Defekt einer Mutagenisierungsbehandlung unterzieht.
Es wird angenommen, dass dieser verschiedene Bedarf nach Azetat unter den obigen aerobischen und anaeroben Bedingungen, durch die Tatsache hervorgerufen wird, dass unter aerobischen Bedingungen ungenügende Mengen an Azetyl CoA von der Milchsäurebakterie gebildet wird, aufgrund von mindestens zwei Umständen: (i) unter Ausschluss von Liponsäure, ein wesentlicher Kofaktor für die Aktivität des Azetyl CoA erzeugenden Pyruvatdehydrogenase-Komplexes (PDC), dieser Enzymkomplex erzeugt nicht Azetyl CoA und (ii) das andere wichtige Azetyl CoA erzeugende Enzym, Pyruvat Format Lyase (Pfl) wird bei Vorhandensein von Sauerstoff deaktiviert. Daher benötigt unter solchen aerobischen Bedingungen die Wildtyp-Milchsäurebakterie Azetat als alternative Azetyl CoA-Quelle. Dagegen wird unter anaeroben Bedingungen die Pfl aktiviert und liefert wahrscheinlich Azetyl CoA in ausreichender Menge für das Wachstum der Bakterie. Wie oben erwähnt, waren diese Beobachtungen der Ansatzpunkt, um das vorliegende Verfahren zum Isolieren eines Mutanten mit Pfl-Defekt einer Milchsäurebakterie wie beschrieben hier zu entwerfen sowie dessen Verwendung als Zwischenprodukt zur Bereitstellung von weiteren modifizierten Stämmen von Milchsäurebakterien.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung sieht dieses Verfahren in einer ersten Phase die Bereitstellung einer Wildtyp-Milchsäurebakterie mit den obigen Azetatbedarfmerkmalen vor, gefolgt von einer Mutagenisierungsbehandlung der Bakterie. In Übereinstimmung mit der Erfindung schließen passende Mutagene konventionelle chemische Mutagene und UV-Licht ein. Daher, als Beispiele, kann ein chemisches Mutagen ausgewählt werden aus: (i) einem Mutagen, das mit DNA assoziiert oder in DNA eingebaut ist wie zum Beispiel ein Basenanalog, z.B. 2-amino-purin oder ein Interchelatbildner wie zum Beispiel ICR 191, (ii) ein Mutagen, das mit der DNA reagiert, einschließlich alkylierter Wirkstoffe wie zum Beispiel Nitrosoguanidin oder Hydroxylamin oder Äthanmethylsulfonat (EMS).
Obwohl der Milchsäurebakterienmutant bereitgestellt werden kann, indem man einen Elternstamm einer chemischen Mutagenisierungsbehandlung unterzieht, gefolgt von der Auswahl eines Pfl Mutanten, versteht sich, dass es auch möglich wäre, den Mutanten durch Auswahl eines spontan vorkommenden Mutanten in Übereinstimmung mit dem Auswahlverfahren wie hier beschrieben bereitzustellen. Als Alternative zu einem derzeit vorgezogenen Verfahren zum Bereitstellen des Mutanten durch zufällige Mutagenese ist es auch möglich, einen solchen Mutanten durch ortsspezifische Mutagenese bereitzustellen, z.B. durch Verwendung passend gestalteter PCR-Techniken oder durch Verwendung eines umlagerbaren Elements, das in Milchsäurebakterienreplikons integrierbar ist.
Wenn eine Mutagenisierungsphase inbegriffen ist, wird der mutagenisierte Stamm, nach der Mutagenisierungsbehandlung, unter anaeroben Bedingungen in einem nicht Lipon säure enthaltenden definierten Mittel mit oder ohne Azetat kultiviert, und ein Mutantenstamm, der im Gegensatz zu dem Wildtyp-Elternstamm nicht unter diesen Bedingungen unter Ausschluss von Azetat wächst, wird ausgewählt. Es wird angenommen, dass ein solcher Mutantenstamm einen Defekt in dem Gen hat, das für das Pfl-Polypeptid kodiert, was bedeutet, dass die Produktion des Enzyms zumindest teilweise blockiert ist, oder dass das Enzym in einer zumindest teilweise inaktiven Form hergestellt wird. Diese Annahme kann bestätigt werden, indem man den ausgewählten Mutanten auf Mangel an Formiatproduktion testet oder alternativ auf eine verringerte Aktivität von Pyruvat Format Lyase.
Wenn der Mutant als spontan vorkommender Mutant bereitgestellt wird, wird der obige Wildtypstamm der Auswahlphase ohne jede vorhergehende Mutagenisierungsbehandlung ausgesetzt. Der Milchsäurebakterien-Wildtyp-Elternstamm kann aus jeder industriell passenden Milchsäurebakterienart ausgewählt werden, d. h. aus der Gruppe bestehend aus einer Lactococcus-Art sein, einer Lactobacillus-Art, einer Pediococcus-Art, einer Streptokokken-Art und einer Bifidobaccerium-Art. In besonders nützlichen Ausführungsformen ist die Milchsäurebakterie ein Lactococcus lactis oder ein Streptococcus thermophilus. Beispiele von derzeit vorgezogenen Milchsäurebakterien sind Lactococcus lactis Unterart lactis und Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis.
Eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl-Defekt (Pfl^–-Phänotyp), die durch das obige Verfahren erhalten werden kann, hat in bezug auf den Wildtyp-Elternstamm eines oder mehrere phänotypisch erkennbare Merkmale, die es von dem Elternstamm unterscheiden. Daher kann der Pfl^–-Mutantenstamm bei Kultivierung unter aerobischen Bedingungen in einem M17-Medium dieselbe Wachstumsrate haben, aber eine verringerte Wachstumsrate oder eine verringerte Säureproduktion bei Kultivierung unter anaeroben Bedingungen in konventionellen Medien wie zum Beispiel dem M17-Medium oder rekonstituierter entrahmter Milch (RSM), keine Formiatproduktion, eine verringerte Produktion von Ethanol oder Azetat unter obigen anaeroben Bedingungen und/oder eine erhöhte Produktion von mindestens einem aus α-Acetolactat gewonnenen Metabolit bei Kultivierung unter anaeroben Bedingungen, z.B. in RSM.
Mehrere dieser Merkmale können für spezifische Ziele wünschenswert sein. Bei der Produktion eines Lebensmittels kann es daher vorteilhaft sein, dass der Stamm geringere Mengen an Säuren, Formiat, Azetat oder Ethanol produziert, während eine vermehrte Produktion von aus α-Acetolactat gewonnenen Aroma- oder Geschmacksverbindungen höchst wünschenswert sein kann, insbesondere bei der Produktion von Molkereiprodukten. Solche wünschenswerten Verbindungen umfassen Acetoin, Diazetyl und 2,3 Butylenglykol. In nützlichen Ausführungsformen ist die Produktion von solchen Metaboliten wie zum Beispiel Acetoin um mindestens 50% erhöht, besonders bevorzugt um mindestens 100 und insbesondere um mindestens 200%. Er ist nicht nur nützlich bei der Herstellung eines Lebensmittels, sondern ein Mutantenstamm, der aus α-Acetolactat gewonnene Metaboliten überproduziert, kann auch bei der Gewinnung der Metaboliten als solche verwendet werden.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Mutantenstamm mit Pfl-Defekt (Pfl^–) ausgewählt aus einer Lactococcus-Art, einer Lactobacillus-Art, einer Pediococcus-Art, einer Streptokokken-Art und einer Bifidobacterium-Art. In diesem Kontext ist eine bevorzugte Art Lactococcus lactis einschließlich Lactococcus lactis Unterart lactis und Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis, z.B. der Lactococcus lactis-Unterart lactis-Stamm DN221, der unter der Zugangsnummer DSM 11034 angemeldet wurde, oder ein Mutantenstamm von DSM MD34 mit weiteren Enzymdefekten, oder der Lactococcus lactis-Unterart lactis-biovar diacetylactis-Stamm DN227, der unter der Zugangsnummer 11040 angemeldet wurde, oder ein Mutantenstamm von DSM 11040 mit weiteren Enzymdefekten.
Es versteht sich, dass der Milchsäurebakterienmutant mit Pfl-Defekt als Wirt für das Klonen eines Pfl-Gens durch Komplementierung des defekten Gens verwendet werden kann.
Wichtig ist, dass der Plf^–-Stamm auch als Elternstamm zum Isolieren von Mutanten mit weiteren nützlichen Enzymdefekten verwendet werden kann, wie im folgenden beschrieben wird.
Laktatdehydrogenase (Ldh) ist, wie in 1 gezeigt, ein weiteres Enzym, das in Milchsäurebakterien zum Aufbrauchen der Pyruvate beiträgt, wobei die Aktivität des Enzyms vorwiegend zu der Produktion von Laktat führt. Es wurde vermutet, dass der metabolische Fluss zu α-Acetolactat und Metaboliten, die aus diesem Zwischenprodukt gewonnen werden, weiter durch einen Mutantenstamm erhöht werden könnten, der zusätzlich zu einem Mangel in der Pfl-Aktivität auch Ldh ermangelt.
Daher wurde eine Strategie zum Isolieren und Auswählen einer Milchsäurebakterie entwickelt, die zusätzlich zu einem Pfl-Defekt auch einen Ldh- (Ldh^–)-Defekt aufweist, d. h. die Pfl^– Ldh-Phänotypen aufweist, auf der Grundlage von den folgenden Betrachtungen: Während des anaeroben Wachstums von Wildtyp-Milchsäurebakterien wird das NADH, das in der Glykolyse gebildet wird, während der Produktion von Laktat und in gewissen. Grade während der Produktion von Ethanol in NAD⁺ umgewandelt. Dementsprechend wurde angenommen, dass ein doppelter Mutant mit dem Pfl^–-Ldh-Phänotyp nicht in der Lage wäre, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen, d. h. ein solcher Stamm hätte den zusätzlichen Phänotyp Ang (Unvermögen, anärobisch zu wachsen). Diese Hypothese basierte auf der Annahme, dass ein solcher doppelte Mutant nicht in der Lage wäre, NAD⁺ aus NADH unter anaeroben Bedingungen zu regenerieren, da Pfl durch eine Mutation blockiert wäre (während unter aerobischen Bedingungen NADH durch NADH-Oxidase in NAD⁺ umgewandelt werden kann), PDC wäre aufgrund einer Hemmung durch NADH blockiert und Ldh wäre durch Mutation blockiert. Es wurde daher angenommen, dass ein doppelter Pfl^–-Ldh^–-Mutant unter aerobischen Bedingungen wachsen könnte, aber nicht unter anaeroben Bedingungen.
Auf der Grundlage der obigen Betrachtungen wurde ein Verfahren zum Isolieren einer Milchsäurebakterie mit Pfl- und Laktatdehydrogenase (Ldh)-Defekt entwickelt, die nicht fähig ist, unter anaeroben Bedingungen bei Vorhandensein von Azetat zu wachsen, d. h. ein Pfl Ldh Ang-Phänotyp. Das Verfahren umfasst als ersten Schritt die Auswahl einer Milchsäurebakterie mit Pfl-Defekt in Übereinstimmung mit dem obigen Verfahren, gefolgt von der Auswahl eines Stammes aus dieser Bakterie mit Pfl-Defekt, der unfähig ist, unter anaeroben Bedingungen in einem Azetat enthaltenden Medium zu wachsen.
In einer derzeit vorgezogenen Ausführungsform umfasst dieses Verfahren, vor Auswahl eines Stammes, der unfähig ist, unter anaeroben Bedingungen in einem Azetat enthaltenden Medium zu wachsen, eine Mutagenisierungsbehandlung der Milchsäurebakterie mit Pfl-Defekt und anschließend die Auswahl eines Mutanten, der unter besagten Bedingungen unter besagten anaeroben Bedingungen nicht wächst.
Das obige Verfahren zum Isolieren des Mutanten mit Plf- und Ldh-Defekt führt zu einem Stamm mit Ldh- spezifischer Aktivität, die in bezug auf die seines Eltern-(mit Pfl-Defekt)-Stamms verringert wird. Vorzugsweise hat der so ausgewählte Mutant eine Ldh-spezifische Aktivität, die weniger als 10 Einheiten/mg Protein eines zellfreien Extrakts der Bakterie beträgt.
Üblicherweise entspricht die so verringerte Ldh-spezifische Aktivität höchstens 50% der Aktivität in bezug auf den Wildtyp oder Pfl-Elternstamm, wie zum Beispiel höchstens 250% oder vorzugsweise, höchstens 10% Aktivität, wie zum Beispiel höchstens 5% in bezug auf die Elternstämme. Es wird besonders bevorzugt, dass der Mutantenstamm im wesentlichen ohne Ldh-Aktivität ist.
Die Mutagenisierungsphase, wodurch der Pfl Ldh^– Ang^– Mutant aus dem Pfl^– Mutanten hergestellt wird, kann entsprechend den Methoden wie oben beschrieben zur Mutagenisierung des Wildtypsstamms ausgeführt werden. Aus der obigen Beschreibung dieser anfänglicher Phase der Bereitstellung des Pfl^–-Mutanten ergibt sich, dass nützliche Stämme aus der Gruppe ausgewählt werden können, die aus einer Lactococcus-Art, einer Lactobacillus-Art, einer Pediococcus-Art, einer Streptokokken-Art und einer Bifidobacterium-Art besteht. Eine derzeit vorgezogene Milchsäurebakterie ist Lactococcus lactis einschließlich Lactococcus lactis Unterart lactis und Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis.
In Übereinstimmung mit der Erfindung ist auch eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl- und Ldh-Defekt vorgesehen, die durch das obige Verfahren erhältlich ist. Zusätzlich zu seinen Pfl^– Ldh Ang^–Phänotypen kann ein solcher Mutantenstamm von einer Wildtyp-Milchsäurebakterie oder seinem Elternstamm mit Pfl-Defekt durch ein oder mehrere weitere Merkmale unterschieden werden. Daher kann der Mutantenstamm dieselbe Wachstumsrate bei Kultivierung unter aerobischen Bedingungen in einem M17-Medium haben, eine verringerte Fähigkeit des Umwandelns von Milchzucker in Milchsäure/Laktat, eine erhöhte Produktion von α-acetolactate und/oder eine erhöhte Produktion eines aus α-Acetolactat gewonnenen Metabolits. Überraschenderweise war die Produktion von α-Acetolactat und/oder Metaboliten, die aus α-Acetolactat gewonnen werden, nicht nur unter aerobischen Bedingungen erhöht, bei denen der Mutantenstamm wachsen kann, sondern auch unter anaeroben Bedingungen, wo kein Wachstum geschah.
Wie in den Beispielen unten dargestellt, war der Produktionsanstieg von α-Acetolactat und daraus gewonnenen Metaboliten von signifikanter Höhe. Daher haben erfindungsgemäße Pfl^– Ldh^– Ang^–-Milchsäurebakterien vorzugsweise eine Produktion von α-acetolactat und/oder daraus gewonnenen Metaboliten, die, in bezug auf einen Wildtypstamm derselben Art, um mindestens 50% erhöht ist, wie zum Beispiel um mindestens 100%. Es wird noch mehr bevorzugt, dass die Produktion um mindestens 200 erhöht ist, wie zum Beispiel mindestens 1000%.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die Pfl^– Ldh^– Ang^–-Milchsäurebakterie von jeder Art sein, ausgewählt aus einer Lactococcus-Art, einer Lactobacillus-Art, einer Pediococcus-Art, einer Streptokokken-Art und einer Bifidobacterium-Art. Eine bevorzugte Art ist Lactococcus lactis einschließlich Lactococcus lactis Unterart lactis wie zum Beispiel der Stamm DN223, der im folgenden beschrieben wird und der unter der Zugangsnummer DSM 11036 angemeldet ist, oder ein Mutant oder eine Variante von DSM 11036, erzeugt, indem man DSM 11036 einer weiteren Mutagenisierungsbehandlung unterzieht, sowie Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis.
Infolge der Enzymdefekte des vorliegenden Pfl^– LdhAng^–-Milchsäurebakterienmutanten kann eine solche Bakterie einen großen Teil der intrazellulären Menge an Pyruvat in α-Acetolactat und weiter in einen oder mehrere der Metaboliten umwandeln, die von dieser Zwischenverbindung gebildet werden können, einschließlich Acetoin, Butanediol und/oder Diazetyl, wobei letztere Verbindung durch chemisch oxidierendes α-Acetolactat gebildet werden kann. Daher kann in einer Vorzugslösung die PflLdh^– Ang^–-Milchsäurebakterie mindestens 15% des Pyruvat umwandeln, das zu Acetoin abgebaut wird, besonders bevorzugt mindestens 30%. In weiteren Vorzugslösungen liegt diese Umwandlung bei mindestens 40%, wie zum Beispiel mindestens 50% oder sogar mindestens 60%.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Milchsäurebakterie mit Mutant mit Pfl- und Ldh-Defekt der obengenannten Milchsäurebakterie mit Pfl^– Ldh^– Ang^– -Mutant, die anärobisch bei Vorhandensein von Azetat wachsen kann.
Ein solcher Mutanten- oder Variantenstamm kann bereitgestellt werden durch Auswahl eines spontanen Mutanten der obengenannten Mutantenbakterie, wobei der Mutanten- oder Variantenstamm anärobisch in einem Azetat enthaltenden Medium wachsen kann.
Alternativ kann der Mutanten- oder Variantenstamm erzeugt werden, indem man den Pfl^– Ldh^– Ang^– -Mutanten einer weiteren Mutagenisierungsbehandlung in Übereinstimmung mit einem Verfahren wie oben beschrieben unterzieht, und durch Auswahl eines Stammes, der fähig ist, anärobisch in einem Azetat enthaltenden Medium zu wachsen. Man vermutet dass solche Mutanten oder Varianten die Fähigkeit wiedergewonnen haben, NADH in NAD⁺ unter anaeroben Bedingungen umzuwandeln, entweder durch Mutationen in Systemen sekundär zu Ldh oder Pfl, oder durch Umkehrung des Pfl^– Phänotyps zum Pfl⁺ Phänotyp. In Wildtyp-Milchsäurebakterien ist das NADH-Niveau hoch und kann mittels Laktat- und/oder Ethanolproduktion oxidiert werden, d. h. mittels des Pyruvatstoffwechsels. Die Folgerung daraus ist, dass Milchsäurebakterien verhältnismäßig viel Laktat und/oder Ethanol im Vergleich zu aerobischen Bedingungen herstellen. Daraus folgt auch, dass die Metaboliten mit einer Aromawirkung (Diazetyl, Acetoin) nur in relativ geringem Umfang erzeugt werden.
Man hat herausgefunden, dass dieses allgemeine Bild noch in dem vorhandenen Ang⁺-Mutanten oder in der Variante des Pfl^– Ldh^– Ang^– -Mutanten gefunden wurde. Jedoch wurde überraschenderweise herausgefunden, dass ein solcher Mutant/Variante in bezug auf seinen Elternstamm und den Wildtypstamm, eine signifikant veränderte Produktion von Aromaverbindungen unter anaeroben Wachstumsbedingungen hat. Daher kann der obige Ang⁺-Mutant/Variante einer sein, der eine Azetaldehydproduktion hat, die in bezug auf den ursprünglichen Wildtypstamm mindestens 2-fach erhöht ist, wie zum Beispiel mindestens 5-fach oder sogar mindestens 8-fach. Die Mutantvariante kann auch eine Produktion des Diazetylvorläufers α-Acetolactat haben, die, auch in bezug auf den Wildtypstamm, mindestens 5-fach erhöht ist. wie zum Beispiel mindestens 10-fach.
Auch die Produktion von Acetoin und/oder Formiat kann bei einem solchen Mutanten/Variante signifikant erhöht sein. Daher, als ein typisches Beispiel, ist der Mutant/Variante einer, der, wenn er anärobisch in rekonstituiertem entrahmtem Milchpulver gewachsen ist, mehr als 1-mM Acetoin produziert.
Ein Mutant oder Variante mit letzterem Merkmal ist wahrscheinlich mit Ldh-Defekt, aber hat die Wildtyp-pfl-Aktivität, d. h. er hat den Phänotyp Pfl⁺ Ldh^– Ang⁺. Ein Beispiel eines derartigen Stammes ist die Lactococcus lactis-Unterart lactis DN224, angemeldet unter der Zugangsnummer DSM 11037, oder ein Lactococcus-lactis-Stamm mit den Merkmalen dieses Stammes. Ein anderes Beispiel des vorliegenden Mutanten oder Variante ist ein Stamm, der mit Pfl-Defekt ist und die Wildtyp-Ldh-Aktivität hat, d. h. den Phänotyp Pfl⁺ Ldh^– Ang⁺.
Der obige Pfl^– Ldh^– Ang^– -Mutant ist nicht nur ein Ausgangsmaterial zur Bereitstellung von weiteren Milchsäurebakterienmutanten oder Varianten, sondern kann als Wirt zum Klonen von Genen verwendet werden, die die Fähigkeit des Mutants wiederherstellen können, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen.
Ein solcher Mutant kann auch, wie oben als Beispiel beschrieben, zur Auswahl weiterer Mutanten verwendet werden, die die Fähigkeit des anärobischen Wachsens wiedergewonnen haben, z.B. aufgrund von Mutationen, durch die eine erhöhte Menge von einer oder mehreren NADH-Oxidoreduktasen hergestellt wird. Solche Oxidoreduktasen umfassen Diazetylreduktase (Dr) und Ldh.
Der Mutant kann auch einer sein, bei dem die Mutation zu Überproduktion und/oder verbesserter Aktivität eines Enzyms führt, dessen Aktivität einschränkend für einen Weg sein kann, in den eine von NADH abhängige Oxidoreduktase einbezogen ist. Eine solche Überproduktion oder verbesserte Aktivität kann z.B. die der α-Acetolactat-Synthetase (Als) sein, deren erhöhte Produktion oder Aktivität zu eine erhöhten Substratproduktion für die Diazetylreduktase führen würde. Alternativ kann die Mutation dazu führen, dass das obige Enzym eine erhöhte Aktivität hat.
Von NADH abhängige Oxidoreduktasen erfordern ein Substrat. So ist, als Beispiel, Acetoin das Substrat für die Oxidoreduktase Diazetyl-Reduktase (siehe 1). Dem entsprechend vermutet man, dass der obige Pfl^– Ldh^– Ang^– -Mutant zur Auswahl eines Mutanten verwendet werden kann, der nicht wächst, auch wenn das Oxidoreduktasensubstrat wie zum Beispiel Acetoin zu dem Medium hinzugefügt wird. Ein solcher Mutant wird wahrscheinlich einen Defekt in einer oder mehreren seiner Oxidoreduktasen, z.B. Diazetylreduktase, haben.
Jeder beliebige der obigen Mutanten oder Varianten ist möglicherweise nützlich bei der Produktion von Nahrungsmitteln und dementsprechend bezieht sich die Erfindung in einem weiteren Aspekt auf ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, wobei das Verfahren umfasst, dass eine Kultur einer Milchsäurebakterie wie hier beschrieben zu den Lebensmittel-Ausgangsmaterialien hinzugefügt wird, die dann unter Bedingungen gehalten wird, die für die Bakterien geeignet sind, um zu wachsen und/oder um metabolisch aktiv zu sein. Das Ziel der Zugabe der Milchsäurebakterien hängt von dem Lebensmittel ab. In einigen Fällen wird eine erfindungsgemäße Milchsäurebakterie dazu benutzt, um eine erhöhte Produktion in dem Lebensmittel zu erreichen, wie zum Beispiel ein Molkereiprodukt, einer besonders wünschenswerten Aromaverbindung, wie zum Beispiel Diazetyl, Acetoin oder Azetaldehyd. Andere Beispiele von Nahrungsmitteln, bei denen die Verwendung der vorliegenden Mutantenstämme vorgesehen ist, umfassen Fleischwaren, Gemüse, Bäckereiprodukte und Wein.
Es leuchtet auch ein, dass die hier vorgesehenen Stämme höchst nützlich sein werden als Produktionsstämme bei der Herstellung von Milchsäurebakterien-Metabolitverbindungen einschließlich der obigen Aromaverbindungen. Dementsprechend umfasst die Erfindung in einem noch weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Milchsäurebakterienmetabolits. Ein solches Verfahren um fasst die Kultivierung einer oder mehrerer Milchsäurebakterien wie hier offenbart in einem passenden Medium unter industriell durchführbaren Bedingungen, wobei der Metabolit hergestellt und, falls erforderlich, von der Kultur isoliert wird. Der Metabolit kann in Übereinstimmung mit jedem passenden konventionellen Verfahren zum Isolieren der besonderen Verbindung(en) von dem Kultivierungsmedium isoliert werden. Es ist auch möglich das Kultivierungsmedium zu verwenden, das die ausgewachsene Kultur von Milchsäurebakterien direkt als Quelle von einem oder mehreren Metaboliten enthält.
Ein spezifisches Beispiel einer derartigen Produktionsverfahrens für einen Milchsäurebakterienmetabolit ist ein Verfahren zur Herstellung dessen, was nach dem Stand der Technik normalerweise als "Starterdestillat" bezeichnet wird, nämlich ein Diacetyl enthaltender Aromastoff, der herkömmlicherweise hergestellt wird, indem man einen konventionellen Wildtyp-Starterkulturstamm einer Milchsäurebakterie kultiviert, die Acetoin und/oder Diazetyl produziert, in einem passenden Medium, und den Metaboliten durch Destillation isoliert, um ein Konzentrat der Metaboliten zu erzeugen. Dieses Produkt wird zum Würzen von Butter, Margarine, Brotaufstrichen, Getreideprodukten und Puffreis benutzt. Man hat herausgefunden, dass durch Verwendung der Stämme DN223 oder DN224 ein Starterdestillat erhalten werden kann, dessen Diazetylinhalt mindestens das 2-fache im Vergleich zu einem konventionellen Starterdestillat ist.
Es ist vorteilhaft die erfindungsgemäße Milchsäurebakterie, sowohl wenn sie als Essenproduktionsstamm benutzt wird als auch als Produktionsstamm für Metaboliten, als eine Milchsäurebakterien-Starterkultur-Zusammensetzung mit der Milchsäurebakterie vorzusehen, die für die spezifische Verwendung ausgewählt worden ist. Üblicherweise enthalten solche Zusammensetzungen die Bakterie in konzentrierter Form, z.B. bei einer Konzentration von lebensfähigen Zellen (Koloniebildungseinheiten, CFUs) die in dem Bereich von 10⁵ bis 10¹³ pro g der Verbindung liegt, wie zum Beispiel in einem Bereich von 10⁶ bis 10¹² pro g. Zusätzlich kann die Starterkultur-Zusammensetzung weitere Bestandteile enthalten wie zum Beispiel bakterielle Nährstoffe, Kryoprotektoren oder andere Substanzen, die die Lebensfähigkeit des bakteriellen Wirkstoffs während der Lagerung steigern. Die Zusammensetzung kann in Form einer gefrorenen oder gefriergetrockneten Zusammensetzung sein.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben sowie in den Zeichnungen, wobei:
1 den Pyruvatstoffwechsel in Milchsäurebakterien veranschaulicht; die gezeigten enzymatischen Wege sind: PFL, Pyruvat Format Lyase; PDC, Pyruvatdehydrogenase-Komplex; Ldh, Laktatdehydrogenase; ALS, Acetolactatsynthetase; ILVB, zweite Acetolactatsynthetase; ALD, Acetolactatdecarboxylase; DR, Diazetylreduktase,
2 veranschaulicht den pH-Wert, die Formiatproduktion (HCOOH), Azetat (HAc) und Ethanol (EtOH) für Lactococcus lactis Unterart lactis CHCC373 und den daraus gewonnenen Mutanten DN221, wenn diese Stämme unter anaeroben Bedingungen in rekonstituierter entrahmter Milch (RSM) kultiviert werden,
3 veranschaulicht OD₆₀₀, Formiatproduktion (HFo), Azetat (HAc) und Ethanol (EtOH) für Lactococcus lactis Unterart lactis CHCC373 und den daraus gewonnenen Mutanten DN221, wenn diese Stämme unter anaeroben Bedingungen in einem M17-Medium kultiviert werden, und
4 zeigt das Wachstum, die Ansäuerung und Acetoinproduktion von Lactococcus lactis Unterart lactis CHCC373 und Mutanten oder Varianten davon (DN221–DN226), wie in den folgenden Beispielen beschrieben.
Die aufgeführten Stämme waren von einzelnen Kolonien der betreffenden Stämme über Nacht in 10 ml M17 Medium aerobisch (+, schraffierte Balken) und anärobisch (–, weiße Balken) gewachsen. Am folgenden Tag wurden OD₆₀₀. pH und Acetoinproduktion gemessen.
Beispiele
Materialien und Methoden
1. Bakterienstämme, Medien und Wachstumsbedingungen
Die folgenden Milchsäurebakterienstämme wurden in den Beispielen verwendet: Lactococcus lactis Unterart lactis-Stämme 1FHCY-1, MG1363 und CHCC373 (Chr. Hansen-Kultur-Sammlung), Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis DB1341 und Streptococcus-thermophilus-Stamm CHCC2134 (Chr. Hansen-Kultur-Sammlung).
Als Wachstumsmedien verwendet wurden: (i) M17 Medium (Terzaghi et al.. 1975); (ii) das definierte phosphatgepufferte DN-Medium (Dickely et al. 1995) mit oder ohne NaAcetat (DN oder DN-Ac). Das DN-Medium enthält nicht Liponsäure, aber wurde mit NaFormat in einer Konzentration von 0.6% ergänzt; und (III) rekonstituierte entrahmte Milch, RSM, die 9,5% schwach erhitztes entrahmtes Milchpulver (Milex 240 lh, MD Foods, Dänemark) enthält.
Die Stämme wurden bei 30°C kultiviert, und das Wachstum wurde überwacht, indem man die optische Dichte (OD) bei 600 nm und/oder den pH-Wert maß. Anaerobe Bedingungen für das Wachstum auf Agarplatten wurden durch Inkubation in einem abgedichteten Container unter Verwendung des Anaerocult^®-A-Systems erhalten (Merck, Darmstadt, Deutschland). Im folgenden bedeutet anaerobe Wachstumsbedingungen für Kulturen in flüssigen Medien Kultivierung oh ne Schütteln, und aerobische Kultivierung bedeutet Wachstum mit Schütteln.
2. Mutagenese von L. lactis
Eine einzelne Kolonie von L. lactis wurde in 10 ml DN-Medium inokuliert und 16 Stunden lang inkubiert unter kräftigem Schütteln. Zu der ausgewachsenen Kultur wurden 150 μl Ethylmethansulfonat (EMS, Sigma) hinzugefügt, und die Mischung wurde unter Schütteln weiter inkubiert. Nach 2 Stunden wurden 10 Reagenzgläser, jedes 2 ml DN-Medium enthaltend, mit je 0.2 ml der mutagenisierten Kultur inokuliert. Die Reagenzgläser wurden bis zum folgendem Tag unter Schütteln für phänotypische Expression inkubiert. Steriles Glycerol wurde zu einer Endkonzentration von 15% (v/v) hinzugefügt und die Kulturen wurden bis zur Verwendung bei 70°C gelagert.
3. Ermittlung der Laktat-Dehydrogenasen-Aktivität
Eine einzelne Kolonie von L. lactis wurde in 10 ml M17 Medium inokuliert und über Nacht kultiviert. Nach 15 Min. Kühlung auf Eis wurden die Zellen durch Zentrifugierung bei 7000 Drehzahl für 5 Min. bei 4°C geerntet, in 5 ml eiskaltem Ldh Assay-Buffer (50-mM-Tris-Azetat pH 6,0, 0,5-mM-Fructose-1,6-Diphosphat) gewaschen und in 1 ml eiskaltem Ldh Assay-Buffer resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in ein 5 ml-Reagenzglas gefüllt und auf Eis unter Verwendung eines Branson Sonifier 250 bei den folgenden Parametern mit Ultraschall desintegriert: Zeitgeber, 4 Min.; Arbeitszyklus 25%; Ausstoß 4. Nach der Ultraschalldesintegration wurde der Inhalt des Reagenzglases in eine eiskalte Eppendorf-Tube gefüllt und bei 15.000 × g 5 Min. lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in eine neue eiskalte Eppendorf-Tube gefüllt. Die Ldh-spezifische Aktivität des zellfreien Extrakts wurde bei 25°C auf die folgende Weise gemessen: 5 μl zellfreier Extrakt wurde zu 495 μl Ldh Assay-Buffer hinzugefügt, der 0,2 mM NADH und 25-mM-Pyruvat enthielt. Als Kontrolle wurde ein Probe ohne Pyruvat verwendet. Die Umwandlung von NRDH in NAD⁺ wurde spektrophotometrisch über die Zeit bei 340 nm unter Verwendung eines Spectronic^® Genesys 5 Spektrophotometers verfolgt. Eine Einheit entspricht der Umwandlung von 1 μmol NADH min^–1 ml^–1 zellfreiem Extrakt. Die spezifische Aktivität wird in Einheiten/mg Protein ausgedrückt. Um die Proteinkonzentration des zellfreien Extrakts zu messen, wurde die Bicinchoninic-Säure (BCA) Probe (Pierce, Rockford, U.S.A.) mit Albuminstandard (Pierce) als Proteinstandard verwendet.
4. Ermittlung der L. lactis-Gärungsendprodukte
Über-Nacht-Kulturen der L. lactis-Stämme wurden in den betreffenden Medien inokuliert und 24 Stunden lang unter den relevanten Wachstumsbedingungen inkubiert. Probestücke wurden gesammelt und auf HPLC und HS-GC für verschiedene Verbindungen analysiert, die während der Kultivierung entstanden, wie von Houlberg beschrieben (1993, 1995a, 1995b). In bestimmten Experimenten wurde das Acetoin folgendermaßen gemessen: 1 ml Kultur wurde in eine Eppendorf-Tube gefüllt und bei 15.000 × g, 5 min bei 4°C zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde in ein neues Reagenzglas gefüllt und auf Eis gehalten, bis der Acetoingehalt kolorimetrisch unter Verwendung des Verfahrens von Westerfeld (1945) gemessen worden war.
Beispiel 1
Azetatbedarf für das Wachstum von L. lactis
Anfänglich wurden die L. lactis Unterart lactis-Stämme 1FHCY-1 und MG1363 für das Wachstum auf DN-Medium mit (DN) oder ohne (DN-Ac) Azetat getestet.
Die obigen Stämme wurden auf DN bzw. DN-Ac Agarplatten abgestreift. Die Platten wurden 24 Stunden lang unter anaeroben bzw. aerobischen Bedingungen inkubiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: Azetatbedarf von 1FHCY-1 und MG1363
Die getesteten L. lactis-Stämme haben einen absoluten Bedarf an Azetat unter aerobischen Wachstumsbedingungen.
Der Wildtypstamm Lactococcus lactis Unterart lactis CHCC373 wurde aus der Kultursammlung von Chr. Hansen A/S, Hørsholm, Dänemark ausgewählt und auf sein Wachstumsbedürfnis nach Azetat unter aerobischen und anaeroben Bedingungen getestet, durch Abstreifen einer Flüssigkeitskultur des Stammes auf eine Reihe von DN-Medium-Platten, die ansteigende Konzentrationen von NaAcetat in dem Bereich von 0 bis 0.2% (w/v) enthalten.
Unter aerobischen Bedingungen wurde schwaches Wachstum bei 0,01% NaAcetat beobachtet und bei 0.02 volles Wachstum. Kein Wachstum wurde bei Konzentrationen unter 0,005 NaAcetat beobachtet. Unter anaeroben Bedingungen wurde volles Wachstum bei 0–0,2% NaAcetat beobachtet.
In den folgenden Experimenten wurde DN-Medium mit 0,1% NaAcetat (DN) oder ohne NaAcetat (DN-Ac) verwendet.
Beispiel 2
Isolierung von Mutanten mit Pfl-Defekt von Lactococcus lactis Unterart lactis CHCC373 und Lactococcus lactis Unterart lactis biovar diacetylactis DB1341 und ihre Charakterisierung
2.1. Isolierung von Mutanten
Mutagenisierte Vorräte der Stämme CHCC373 und DB1341 wurden wie oben beschrieben vorbereitet und in Verdünnungen auf DN-Medium-Agar-Platten ausplattiert, die 24 bis 48 Stunden lang aerobisch inkubiert wurden. Von diesen Platten wurden 980 Kolonien jedes Stammes ausgewählt und auf DN- bzw. DN-Ac-Agarplatten abgestreift, und diese Platten wurden 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Zwei Stämme, DN220 und DN221, von dem mutagenisierten CHCC373 Stamm und ein Stamm, DN227, von dem mutagenisierten DB1341 Stamm, die nicht in der Lage waren, unter Ausschluss von Azetat unter anaeroben Bedingungen zu wachsen, wurden ausgewählt.
Chromosomale DNA wurde von DN220, DN221 und CHCC373 isoliert und mit EcoRI zersetzt, und die Bruchstückmuster wurden unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese verglichen. Die Bruchstückmuster zeigten, dass sowohl DN220 als auch DN221 aus CHCC373 entstanden. DN221 wurde für weitere Experimente ausgewählt.
Ein Probestück von DN220, DN221 bzw. DN227 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 26. Juni 1996 unter den Zugangsnummern DSM 11033, DSM 11034 und DSM 11040.
2.2. Wachstum von DN221 in einem M17-Medium und RSM
CHCC373 und DN221 wurden in M17 inokuliert und die Kulturen wurden unter aerobischen bzw. anaeroben Bedingungen inkubiert. Unter aerobischen Wachstumsbedingungen wachsen DN221 und CHCC373 gleich gut laut OD600 und dem pH- Wert. Jedoch war die Wachstumsrate von DN221 in M17 unter anaeroben Bedingungen wesentlich niedriger als die von CHCC373, und sie nahm bei einer niedrigeren Zellmasse ab. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Abwesenheit von Azetat in M17 nicht der Grund für die langsamere Wachstumsrate des ausgewählten Mutantenstamms war, sondern dass ein wesentliches Merkmal, das für anaerobes Wachstum notwendig ist, bei DN221 fehlte, anders als bei CHCC373. Diese Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass DN221 einen Defekt in seiner Pfl-Aktivität hat, was zu einem Bedarf an Azetat führt und einer niedrigeren Wachstumsrate unter anaeroben Bedingungen im Vergleich zu CHCC373.
2.3. Analyse von Fermentaten für verschiedene Endprodukte
Einzelne Kolonien von CHCC373 bzw. DN221 wurden in M17 bzw. RSM inokuliert, und diese Kulturen wurden 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Proben wurden genommen und auf den Inhalt von Gärungsendprodukt-Verbindungen entsprechend den obigen Methoden analysiert.
Die Ergebnisse, die in 2 und 3 zusammengefasst sind, zeigen, dass Formiat nicht von DN221 hergestellt wird, aber von CHCC373 in großen Mengen hergestellt wird. Diese bestätigt die Annahme, dass DN221 einen Mangel an Pfl-Aktivität aufweist. Dies wird weiter durch die niedrigen Niveaus von Ethanol und Azetat bestätigt, das durch DN221 hergestellt worden ist im Vergleich zu seinem Elternstamm, CHCC373.
Beispiel 3
Isolierung von Mutanten mit Pfl- und Ldh-Defekt und ihre Charakterisierung
3.1 Isolierung von Mutanten
Ein Vorrat an DN221 wurde wie oben unter Materialien und Methoden beschrieben mutagenisiert, und die mutagenisierten Zellen wurden in Verdünnungen auf DN-Medium-Agar- Platten ausplattiert, die 24–48 Stunden lang aerobisch inkubiert wurden. Von diesen Platten wurden 980 Kolonien ausgewählt und jede Kolonie wurde auf zwei DN-Platten abgestreift und 24 Stunden unter anaeroben bzw. aerobischen Bedingungen inkubiert. Zwei Stämme (DN222 und DN223), die nicht in der Lage waren, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen, wurden ausgewählt.
Chromosomale DNA wurde von DN222, DN223 und CHCC373 isoliert und mit EcoRI zersetzt. Die Bruchstückmuster wurden unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese verglichen. Die Bruchstückmuster zeigten, dass sowohl DN222 als auch DN223 aus CHCC373 entstehen.
Eine Probe von DN222 bzw. DN223 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 26. Juni 1996 unter den betreffenden Zugangsnummern DSM 11035 und DSM 11036.
3.2. Testen auf Laktatdehydrogenase (Ldh)-Aktivität
Die Ldh-Aktivität von DN22, DN222, DN223 und CHCC373 wurde in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren analysiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3.1 unten dargestellt. Tabelle 3.1. Ldh-Aktivität von DN221. DN222. DN223 und CHCC373
Diese Ergebnisse zeigen, dass DN223 einen Defekt in der Ldh-Aktivität hat, nämlich nur 3% der Aktivität von CHCC373, während DN222 eine Ldh-Aktivität ähnlich der von CHCC373 hat. Daraus kann man schließen dass DN223 Pfl- und Ldh-Defekt hat.
3.2. Wachstum in M17 und Bildung von Endprodukten unter aerobischen Bedingungen
Einzeln Kolonien von CHCC373, DN221, DN222 und DN223, bzw. wurden in M17 inokuliert und unter aerobischen Bedingungen inkubiert. Die Ergebnisse von Messungen von OD600 und pH für die ausgewachsenen Kulturen sind in Tabelle 3.2 unten dargestellt. Tabelle 3.2. OD600 und pH von CHCC373, DN221, DN222 und DN223
Unter diesen Bedingungen hatten DN221, DN223 und CHCC373 ähnliche Wachstumsraten laut den OD600-Messungen. Jedoch betrug die OD600 von DN222 nur etwa die Hälfte der OD600 des Wildtypstamms. DN221 und DN222 säuerten das Medium auf denselben pH-Wert, während DN223 das Medium nur leicht säuerte, obwohl das Wachstum laut der OD600 ähnlich dem von CHCC373 war, was bestätigt, dass DN223 einen Ldh-Defekt hat.
Über-Nacht-Kulturen von einzelnen Kolonien von CHCC373, DN221, DN222 und DN223 wurden in M17 und RSM ino kuliert, 24 Stunden lang unter aerobischen Bedingungen inkubiert, und Proben wurden zur Analyse von Endprodukten wie oben beschrieben entnommen. Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 3.3 unten dargestellt. Tabelle 3.3. Endproduktbildung in M17
Abkürzungen:

AA

Azetaldehyd

ALA

Acetolactat

DAc

Diazetyl

EtOH

Ethanol

HAc

Essigsäure

HLac

Milchsäure

HMEK

Acetoin

Lacto

Lactose

CHCC373 produziert fast gleiche Mengen an Azetat und Laktat. Unter aerobischen Bedingungen produziert DN221 ähnliche Mengen an Endprodukten wie CHCC373. DN222 produziert weniger Azetat als und gleiche Mengen an Laktat wie CHCC373. Der Defekt in DN222 ist unbekannt. DN223 produziert sehr kleine Mengen an Laktat im Vergleich zu CHCC373. DN223 wandelte den wichtigsten Teil von Pyruvat zu Acetoin um statt Laktat. Diese Veränderung beim Pyruvatkatabolismus wird auch dadurch reflektiert, dass der Aromastoff Diazetyl im Vergleich zu CHCC373 3–4fach erhöht war, sowie dadurch, dass etwa 55% des abgebauten Pyruvats über α-Acetolactat (ALA) zu Acetoin (HMEK) wurde. Der Anteil ist wahrschein lich höher, da die Butanediolproduktion nicht gemessen wurde.
Beispiel 4
Isolierung und Charakterisierung von spontanen Mutanten von DN223
4.1. Isolierung von Mutanten
Eine flüssige Kultur wurde von einer Kolonie von DN223 angelegt und unter aerobischen Bedingungen über Nacht inkubiert. Ungefähr 10⁸ Zellen wurden auf DN-Medium-Agar-Platten übertragen, die unter anaeroben Bedingungen inkubiert wurden. Drei Stämme, DN224, DN225 und DN226, wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit isoliert, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen. Die drei Stämme sind alle Mutanten oder Varianten von DN223, die die Fähigkeit wiedergewonnen haben, unter anaeroben Bedingungen NADH zu NAD⁺ umzuwandeln, entweder durch Mutationen in sekundären Systemen zu Ldh und Pfl oder durch Umkehrung des Pfl- oder des Ldh-Defekts.
Chromosomale DNA wurde von DN224, DN225, DN226 und CHCC373 isoliert und mit EcoRI zersetzt. Die Bruchstückmuster wurden unter Verwendung der Agarosegel-Elektrophorese verglichen. Die Bruchstückmuster zeigten, dass DN224, DN225 und DN226 alle aus CHCC373 entstehen.
Eine Probe von DN224, DN225 bzw. DN226 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 26. Juni 1996 unter den Zugangsnummern DSM 11037, DSM 11038 und DSM 11039.
4.2. Wachstum in M17 und Acetoinbildung
Einzeln Kolonien von CHCC373, DN221, DN222, DN223, DN224 und DN226. wurden in M17 inokuliert und über Nacht unter anaeroben bzw. aerobischen Bedingungen inkubiert. Die Endwerte von OD₆₀₀ und pH wurden gemessen und Proben wurden gesammelt und auf ihren Acetoingehalt analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Alle getesteten Stämme, außer DN222, wuchsen gut unter aerobischen Bedingungen. Unter anaeroben Bedingungen hatten DN221, DN222 und DN223 schwere Wachstumsmängel, DN223 ist der am meisten am Wachsen gehemmte Stamm. Messungen des pH-Werts reflektierten das Wachstumsmuster der Stämme außer für DN223, DN224 und DN226, die unter aerobischen Bedingungen gewachsen waren. Diese Ergebnisse zeigten, dass DN224 und DN226 eine verringerte Säuerungsfähigkeit verglichen mit CHCC373 haben, möglicherweise hervorgerufen durch einen Defekt beim Ldh.
Unter sowohl aerobischen als auch anaeroben Bedingungen hat DN225 eine Wachstumsrate wie CHCC373, was bedeutet, dass dieser Stamm den Ldh-Defekt verloren hatte.
Unter aerobischen Bedingungen produzierten die Stämme DN223, DN224 und DN226 Acetoin in dem Bereich von 1100–1200 ppm, das ist 4–6mal mehr als die anderen Stämme (etwa 200 ppm). Unter anaeroben Bedingungen stellte DN223 mehr als 10mal soviel Acetoin her wie die Stämme DN222 und CHCC373, obwohl fast kein Wachstum laut dem OD₆₀₀-Wert beobachtet wurde. DN224 und DN226 stellten mehr als 10 ppm Acetoin unter anaeroben Bedingungen her, was beträchtlich mehr ist als die von CHCC373 und DN222 hergestellten 2.5 ppm. Die hohen Konzentrationen von Acetoin, das von den drei Stämmen hergestellt worden ist, zeigen, dass diese Stämme das Potential zum Produzieren hoher Mengen an Diazetyl haben.
Unter den obigen spontanen Mutanten wurde DN224 für weitere Studien zur Gärungsendproduktbildung ausgewählt.
4.3. Wachstum in RSM und Bildung hierin von Endprodukten
Einzeln Kolonien von CHCC373, DN221, DN223 und DN224 wurden in 10 ml M17 inokuliert und über Nacht inkubiert.
Die Endwerte von OD₆₀₀ und pH wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.1 unten dargestellt. Tabelle 4.1. Wachstum (OD600) von CHCC373, DN221, DN223 und DN224 in M17
Anschließend wurden 2 × 200 μl von jeder Kultur in 2 × 10 ml RSM übertragen und über Nacht unter aerobischen bzw. anaeroben Bedingungen inkubiert. Der pH-Wert wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 4.2 unten dargestellt. Tabelle 4.2. Wachstum (pH) von CHCC373.DN221. DN223 und DN224 in RSM
Das Wachstum in RSM unter aerobischen Bedingungen, laut dem pH-Wert, scheint wie in M17 zu zeigen, dass die Säuerungsfähigkeit unabhängig von den verwendeten Medien ist.
Von allen Kulturen wurden Proben zur Analyse der Endprodukte entnommen. Die Ergebnissen sind in Tabelle 4.3 unten dargestellt. Tabelle 4.3. Endproduktbildung in RSM
Abkürzungen:

AA

Azetaldehyd

ALA

Acetolactat

DAc

Diazetyl

EtOH

Ethanol

HAc

Essigsäure

HCit

Zitrat

HLac

Milchsäure

HMEK

Acetoin

Lacto

Lactose

McFo

Formiat

Keiner der Stämme gor Zitrat, wie von einem L. lactis Unterart lactis zu erwarten wäre. Der Wildtypstamm CHCC373, unter aerobischen Bedingungen gewachsen, stellte verhältnismäßig hohe Mengen an Acetoin, Diazetyl, α-Acetolactat, Azetaldehyd und Azetat her, aber verhältnismäßig niedrige Mengen an Ethanol und Laktat im Vergleich zu der Produktion davon unter anaeroben Bedingungen.
An den Ergebnissen von DN224 sieht man, dass die Niveaus der verschiedenen Aromaverbindungen sich während des anaeroben Wachstums signifikant verändert haben. Die Azetaldehydhöhe hat sich etwa verachtfacht, der Diazetylvorläufer Acetolactat hatte sich im Vergleich zu seinem Gehalt in CHCC373 mehr als verzehnfacht.
Jedoch wird angenommen, dass das Potential für die Diazetylproduktion viel höher ist, da die Menge an Acetoin, das von DN224 hergestellt worden ist, signifikant höher ist als die Menge an Acetoin, die von CHCC373 hergestellt worden ist. Der Anstieg der Formiat-, Ethanol- und Azetat-Produktion und die Reduzierung der Laktatproduktion zeigen, dass DN224 den Defekt in Pfl verloren hat, aber noch den Ldh-Defekt hat. Dies wird weiter durch die Tatsache bestätigt, dass DN224 unter anaeroben Bedingungen wächst, was der Stamm mit Pfl- und Ldh-Defekt DN223 nicht tut.
Beispiel 5
Ermittlung des Azetatbedarfs für das Wachstum von Streptococcus thermophilus
Einzelne Kolonien von Streptococcus thermophilus CHCC2134 wurde auf Platten von DN-Agar abgestreift, die Milchzucker (5 g/L) und Na-Formiat (20 mg/L) enthalten, mit und ohne Azetat. Die Platten wurden für 48 Stunden bei 37°C unter aerobischen bzw. anaeroben Bedingungen inkubiert. Das Wachstum erfolgte wie in Tabelle 5.1 unten zusammengefasst: Tabelle 5.1. Azetatbedarf von Streptococcus thermophilus CHCC2134

++: Koloniegröße 0.1–0.5 mm;
+++: Koloniegröße 0.5–2 mm;
–: kein Wachstum nach verlängerter Inkubation

Da Azetat erforderlich für das Wachstum unter aerobischen Bedingungen ist, ist die Grundlage zur Isolierung eines Mutantenstammes von Streptococcus thermophilus vorhanden, der einen Bedarf an Azetat unter anaeroben Bedingungen hat, d. h. ein Pfl^–-Mutant dieser Spezies. Ein solcher Mutantenstamm könnte, in Analogie mit dem obigen, als Ausgangsmaterial bei der Isolierung eines zweiten Mutantenstamms verwendet werden, der unfähig ist, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen, d. h. ein Pfl^–-/Ldh^–-Mutant.
Lieratur

1. Dickely F, Nilsson D, Hansen EB, Johansen E. 1995. Isolation of Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a food-grade cloning vector. Mclec. Microbiol., 15, 839–847.
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ANGABEN BEZÜGLICH EINES HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13bis PCT)

Modulo PCT/RO/134 (luglio 1992)

Angaben mit Bezug auf hinterlegte Mikroorganismen (Regel 13bis PCT)
Zusatzblatt
Zusätzlich zu dem Mikroorganismus, der auf Seite 38 der Beschreibung angegeben ist, wurden die folgenden Mikroorganismen bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Deutschland, an den Daten und unter den Zugangszahlen wie unten angegeben hinterlegt:
Für alle obengenannten hinterlegten Mikroorganismen gelten die folgenden zusätzlichen Angaben:
Was die Patentämter der benannten Staaten betrifft, beantragen die Antragsteller, dass eine Probe der obengenannten hinterlegten Mikroorganismen nur einem vom Antragsteller benannten Experten zur Verfügung gestellt wird bis zum Datum der Patenterteilung oder dem Datum, an dem die Anmeldung abgelehnt oder zurückgezogen wurde oder als zurückgezogen angesehen wird.

Claims

Verfahren zur Isolierung eines Pyruvat-Formiat-Lyase (Pfl)-defekten Milchsäurebakteriums, das folgende Stufen umfasst: (i) Bereitstellung eines Wildtypen-Milchsäurebakterienstamms, der unter aeroben Bedingungen in der Abwesenheit von Acetat in einem Medium, das keine Liponsäure enthält, wachstumsunfähig ist, der aber unter anaeroben Bedingungen in einem solchen Medium wachstumsfähig ist, und (ii) Auswahl eines Mutants aus dem betreffenden Wildtypenstamm, der unter anaeroben Bedingungen in der Abwesenheit von Acetat nicht wächst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wildtypenstamm vor der Auswahl eines Mutants einer Mutagenisierungsbehandlung ausgesetzt wird, und der hierbei mutagenisierte Stamm unter anaeroben Bedingungen im Medium kultiviert wird, das keine Liponsäure enthält, in der Abwesenheit beziehungsweise in der Gegenwart von Acetat, und ein Mutant ausgewählt wird, der unter den betreffenden Bedingungen in der Abwesenheit von Acetat nicht wächst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Milchsäurebakterium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lactococcus-Spezies, einer Lactobacillus-Spezies, einer Pediococcus-Spezies, einer Streptococcus-Spezies und einer Bifidobacterium-Spezies.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Milchsäurebakterium Lactococcus lactis ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Milchsäurebakterium Lactococcus lactis, subsp. lactis, ist.
Pfl-defektes mutantes Milchsäurebakterium, das durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhältlich ist, und das im Verhältnis zum Wildtypenstamm, aus dem es abgeleitet ist, mindestens eins der folgenden Merkmale besitzt: (i) die gleiche Wachstumsgeschwindigkeit bei der Kultivierung unter aeroben Bedingungen in M17-Medium, (ii) reduzierte Wachstumsgeschwindigkeit oder reduzierte Geschwindigkeit der Säureproduktion bei der Kultivierung unter anaeroben Bedingungen in M17-Medium oder in wiederhergestellter Magermilch (RSM), (iii) keine Formiatproduktion unter den anaeroben Bedingungen von (ii), (iv) reduzierte Produktion von Ethanol oder Acetat unter den oben erwähnten anaeroben Bedingungen und/oder (vi) erhöhte Produktion von mindestens einem α-Acetolactatabgeleiteten Metaboliten bei der Kultivierung unter anaeroben Bedingungen in RSM.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 6, das eine Produktion von Acetoin hat, die um mindestens 100 erhöht ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 6, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lactococcus-Spezies, einer Lactobacillus-Spezies, einer Pediococcus-Spezies, einer Streptococcus-Spezies und einer Bifidobacterium-Spezies.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 8, das Lactococcus lactis ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 9, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lactococcus lactis, subsp. lactis, und Lactococcus lactis, subspe. lactis biovar diacetylactis.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 10, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lactococcus lactis, subsp. lactis-Stamm DN221, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 11034, einem mutanten Stamm von DSM 11034, der weitere enzymatische Defekte hat, Lactococcus lactis, subsp. lactis biovar diacetylactis-Stamm DN227, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 11040, und einem mutanten Stamm von DSM 11040, welcher mutante Stamm weitere enzymatische Defekte hat.
Verfahren zur Isolierung eines Pfl- und eines Lactatde hydrogenase (Ldh)-defekten Milchsäurebakteriums, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Acetat wachstumsunfähig ist, welches Verfahren folgende Stufen umfasst: (i) anfängliche Auswahl eines Pfl-defekten Milchsäurebakteriums in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Anspruch 1, und (ii) Auswahl eines Stamms aus dem betreffenden Pfl-defekten Milchsäurebakteriumstamms, der unter einer anaeroben Bedingung in einem acetathaltigen Medium wachstumsunfähig ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Pfl-defekte Milchsäurebakterium vor der Auswahl eines Stamms, der unter einer anaeroben Bedingung in einen acetathaltigen Medium wachstumsunfähig ist, einer Mutagenisierungsbehandlung ausgesetzt wird, und ein Mutant, der unter der genannten Bedingung nicht unter der genannten anaeroben Bedingung wächst, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der ausgewählte Stamm eine Ldh-spezifische Aktivität hat, die im Verhältnis zu dessen Elternstamm reduziert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das ausgewählte Milchsäurebakterium eine Ldh-spezifische Aktivität hat, die weniger als 10 Einheiten/mg Protein eines zellenfreien Extrakts des Bakteriums ist, und/oder die im Verhältnis zum Wildtypenstamm, aus dem sie abgeleitet ist, eine Ldh-spezifische Aktivität hat, die höchstens 50% ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Milchsäurebakterium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lactococcus-Spezies, einer Lactobacillus-Spezies, einer Pediococcus-Spezies, einer Streprococcus-Spezies und einer Bifidobacterium-Spezies.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Milchsäurebakterium Lactococcus lactis ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Milchsäurebakterium Lactococcus lactis, subsp. lactis ist.
Pfl- und Ldh-defektes mutantes Milchsäurebakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Acetat wachstumsunfähig ist, welches Bakterium durch das Verfahren nach Anspruch 12 erhältlich ist, und das im Verhältnis zu einem Wildtypen-Milchsäurebakterium oder dessen Pfl-defekten Eiternstamm mindestens eins der folgenden Merkmale besitzt: (i) die gleiche Wachstumsausbeute wenn kultiviert unter aeroben Bedingungen in M17-Medium, (ii) reduzierte Fähigkeit, Lactose zu Lactat umzuwandeln, (iii) erhöhte Produktion von α-Acetolactat, und/oder (iv) erhöhte Produktion von einem α-Acetolactatabgeleiteten Metaboliten.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 19, das eine α-Acetolactatproduktion hat, die um mindestens 100% erhöht ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 19, das eine α-Acetolactat-abgeleitete Metabolitproduktion hat, die um mindestens 100 erhöht ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 19, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lactococcus-Spezies, einer Lactobacillus-Spezies, einer Pediococcus-Spezies, einer Streptococcus-Spezies und einer Bifidobacterium-Spezies.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 20, welches Milchsäurebakterium Lactococcus lactis ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 23, das Lactococcus lactis, subsp. lactis, ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 19, worin mindestens 15% des Pyruvats, das abgebaut wird, zu Acetoin umgewandelt wird.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 24, das Lactococcus lactis, subsp. lactis DN223, ist, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 11036, oder ein Mutant oder eine Variante von DSM 11036, der/die dadurch hergestellt wird, dass DSM 11036 einer weiteren Mutagenisierungsbehandlung ausgesetzt wird.
Pfl- und Ldh-defektes mutantes Milchsäurebakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Acetat wachstumsfähig ist, welches Bakterium durch das Verfahren, das folgende Stufen umfasst, erhältlich ist: (i) anfängliche Auswahl eines Pfl- und Ldh-defekten Milchsäurebakteriums in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Anspruch 12, und (ii) Auswahl eines Stamms aus dem betreffenden Pfl- und Ldh-defekten Milchsäurebakterium, welcher Stamm unter einer anaeroben Bedingung in einem acetathaltigen Medium wachstumsfähig ist.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 27, das, wenn es in wiederhergestelltem Magermilchpulver anaerobisch gezüchtet wird, mehr als 1 mM Acetoin produziert.
Milchsäurebakterium nach Anspruch 27, das Lactococcus lactis, subsp. lactis DN224, ist, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 11037, oder ein Lactococcus lactis-Stamm ist, der die Merkmale von DSM 11037 hat.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, das die Zugabe einer Kultur eines Milchsäurebakteriums, das aus der Gruppe bestehend aus Milchsäurebakterium nach Anspruch 6, Anspruch 19 und Anspruch 27 ausgewählt ist, zu den Ausgangsmaterialien eines Lebensmittels umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines milchsäurebakteriellen Metaboliten, das die Kultivierung eines Milchsäurebakteriums nach Anspruch 6, 19 oder 27 unter den Bedingungen, bei denen der Metabolit produziert wird, und eventuell die Isolierung des Metaboliten aus der Kultur, umfasst.
Milchsäurebakterielle Starterkulturzusammensetzung umfassend ein Milchsäurebakterium, das aus der Gruppe bestehend aus Milchsäurebakterium nach Anspruch 6, Anspruch 19 und Anspruch 27 ausgewählt ist.