DE69734511T2

DE69734511T2 - Antigene modulation von zellen

Info

Publication number: DE69734511T2
Application number: DE69734511T
Authority: DE
Inventors: Si-Myung Byun; John Eaton; Seong-Tae So-gu JEONG; Mark D. Scott
Original assignee: Biomedical Frontiers Inc Minneapolis; Biomedical Frontiers Inc
Current assignee: Biomedical Frontiers Inc Minneapolis; Biomedical Frontiers Inc
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2017-02-04
Also published as: JP4469025B2; EP0901521A1; WO1997028254A1; AU1555297A; CA2279978A1; JP2000505423A; EP0901521B1; DE69734511D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die antigene Modulation von Zellen und insbesondere immunogenfreie zelluläre Zusammensetzungen, umfassend Zellen, modifiziert mit einer immunogenfreien Verbindung, und Verwendungen derartiger immunogenfreier Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Überall in dieser Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen in Bezug genommen, viele in Klammern. Vollständige Zitate für diese Veröffentlichungen werden am Ende der ausführlichen Beschreibung bereitgestellt.
Akute Gewebeabstoßung kann in zwei hauptsächlichen klinischen Situationen beobachtet werden: 1) Bluttransfusionen und 2) Organtransplantation. In beiden Situationen, die nachstehend in größerer Ausführlichkeit beschrieben werden sollen, sind Antikörperbindung und Komplementfixierung die zwei hauptsächlichen Mechanismen, die der Zerstörung des Spendergewebes zugrunde liegen (wobei sich Spendergewebe auf Blut oder Organe bezieht). Frühere Mittel des Versuchs zur Steuerung akuter Abstoßung haben das Anpassen des Gewebes und pharmakologische Interventionen in den Mittelpunkt gestellt. Trotz dieser Maßnahmen kommen weiter eine bedeutende Anzahl von oft lebensbedrohenden akuten Gewebeabstoßungsreaktionen vor.
Bluttransfusionen sind eine entscheidende Komponente in der Behandlung einer Anzahl von akuten und chronischen medizinischen Problemen. Diese reichen von massivem Blutverlust im Anschluß an eine traumatische Verletzung zu chronischen Transfusionen zur Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise Thalassämie und Sichelzellenanämie. Bei den meisten akuten Verletzungen ist einfache Blutgruppenbestimmung (ABO/rh) ausreichend, um geeignete Spender zu identifizieren. Gelegentlich werden jedoch seltene Blutgruppen angetroffen, wo eine geeignete Entsprechung nicht schnell gefunden werden kann, eine Situation, welche lebensbedrohend sein kann. Öfter werden Probleme bei einzelnen Personen, gewöhnlich Minderheiten, angetroffen, die chronische Transfusionen empfangen (z.B. wie bei Sichelzellenanämie und der Thalassämie). Oftmals wird einfache Blutgruppenbestimmung beim Bestimmen einer richtigen Entsprechung unzureichend, weil diese einzelnen Personen Transfusionsreaktionen gegenüber Nebenantigenen roter Blutkörperchen entwickeln. Diese Transfusionsreaktionen gegenüber diesen Nebenantigenen roter Blutkörperchen können es nahezu unmöglich machen, geeignete Blutspender zu identifizieren (Vichinsky et al. 1990).
Bis heute sind die einzigen Lösungen für die vorstehenden Situationen, autologes Blut zu lagern (gefroren oder bei 4°C), ein Blutbankregister potentieller Spender mit seltenen Blutgruppen zu halten und Blutspenden von Minderheiten zu ermutigen. Wenn auch alle von diesen Schritten vernünftig und unterschiedlich wirksam sind, entstehen noch Situationen, wo eine geeignete (oder sogar befriedigende) Blutentsprechung nicht gemacht werden kann. Daher existiert eine Notwendigkeit für Verfahren und Mittel, welche ansonsten immunogene (oder direkt immunologisch erkennbare) rote Blutkörperchen tarnen.
Ähnlich wird die Transplantation von Organen (wie beispielsweise Nieren und Lebern) von einer menschlichen Person zu einer anderen oftmals durch ein Fehlen exakter immunologischer Identifizierung zwischen Spender und Empfänger schwierig gemacht. Manchmal ist das transplantierte Organ Gegenstand direkten Angriffs durch das Immunsystem des Empfängers, noch bevor eine sekundäre immunologische Antwort Zeit gehabt hat zu erfolgen. Diese sogenannte „hyperakute Abstoßung" ist oftmals lebensbedrohend und verhindert offensichtlich die wirksame Integration des Transplantats in den Empfänger. Daher existiert eine Notwendigkeit für Verfahren und Mittel, welche sofortige Erkennung der Endotheloberflächen von Organtransplantaten verhindern können, wodurch der Vorgang akuter Transplantatabstoßung gemäßigt oder gestoppt wird. Bei einer ähnlichen Vene steht die Transplantation von Organen von einer Spezies zu einer anderen („Xenotransplantation") noch ernstzunehmenderen immunologischen Barrieren gegenüber und würde durch Verfahren zum Blockieren immunologischer Erkennung der fremden Endotheloberfläche in großem Maße erleichtert werden.
Proteine sind durch die kovalente Anbindung von löslichen Polymeren wie beispielsweise Polyvinylalkohol, Carboxymethylcellulose (Mitz und Summaria 1961) und Polyvinylpyrrolidon (von Spect et al. 1973) modifiziert worden. Verschiedene gereinigte antigene Proteine sind ebenfalls durch kovalente Anbindung von Polyethylenglycolen (PEGs) modifiziert worden, um die resultierenden Proteine immunogenfrei zu machen. Abuchowski et al. (1977a) offenbaren die Modifizierung von gereinigtem Rinderserumalbumin (BSA) durch kovalente Anbindung von Methoxypolyethylenglycol, die das BSA immunogenfrei macht. Abuchowski et al. (1977b) offenbaren die Modifizierung von gereinigter Rinderleberkatalase durch kovalente Anbindung von Methoxypolyethylenglycol, die die Katalase immunogenfrei macht. Jackson et al. (1987) offenbaren die Modifizierung von gereinigtem Ovalbumin mit Monomethoxypolyethylenglycol unter Verwendung von Cyanurchlorid als Kupplungsmittel. Das resultierende Ovalbumin ist immunogenfrei. Verschiedene Berichte haben auch gezeigt, daß mit Polyethylenglycol (PEG) beschichtete Liposome verbesserte Zirkulationszeit haben (Klivanov et al. 1991; Senior et al. 1991; Maruyama et al. 1992; und Lasic 1992).
Langerhanssche Inseln sind in semipermeablen Membranen mikroeingekapselt worden, um die Immunisierungsstärke implantierter Inseln (Lacy et al. 1991; Lim 1980) zu verringern. Sawhney et al. (1994) beschichteten Ratten-Inseln mit einem Polyethylenglycoltetraarylat-Hydrogel. Wichtig ist, daß PEG nicht direkt in die Inselzellmembrane eingebracht wurde, sondern vielmehr die Zellen von dem PEG-haltigen Hydrogel umgeben wurden.
Zalipsky und Lee (1992) diskutieren die Verwendung funktionalisierter Polyethylenglycole zur Modifizierung von Polypeptiden, während Merrill (1992) und Park und Wan Kim (1992) beide Proteinmodifizierung mit Polyethylenoxid offenbaren.
Die US-Patentschrift 4179337 von Davis et al. offenbart gereinigte Polypeptide, wie beispielsweise Enzyme und Insulin, welche mit Polyethylenglycol oder Polypropylenglycol mit einem Molekulargewicht von 500 bis 20000 Dalton gekuppelt werden, um eine physiologisch aktive immunogenfreie wasserlösliche Polypeptidzusammensetzung bereitzustellen. Das Polyethylenglycol oder Polypropylenglycol schützt das Polypeptid vor dem Verlust von Aktivität und die Zusammensetzung kann im wesentlichen ohne eine immunogene Antwort in das Säugetier-Kreislaufsystem injiziert werden.
Die US-Patentschrift 5006333 von Saifer et al. offenbart ein biologisch persistentes, wasserlösliches, im wesentlichen immunogenfreies, im wesentlichen nicht antigenes Konjugat von Superoxiddismutase, hergestellt durch Kuppeln von gereinigter Superoxiddismutase mit einem bis fünf Strängen eines Polyalkylenglycols, welches Polyethylenglycol oder Polyethylen-Polypropylenglycol-Copolymer ist, wobei das Polyalhylenglycol ein mittleres Molekulargewicht von etwa 35000–1000000 hat.
Die US-Patentschrift 5013556 von Woodle et al. offenbart eine Liposomzusammensetzung, welche zwischen 1–20 Molprozent eines amphipathischen Lipids, derivatisiert mit einem Polyalkylether, enthält, wie beispielhaft durch Phosphatidylethanolamin, derivatisiert mit Polyethylenglycol, veranschaulicht wird.
Die US-Patentschrift 5214131 von Sano et al. offenbartt ein Polyethylenglycoldervat, ein gereinigtes Peptid, modifiziert durch das Polyethylenglycolderivat, und ein Verfahren zur Herstellung derselben. Das Polyethylenglycolderivat ist fähig, die Guanidingruppen in Peptiden zu modifizieren. Die Peptide, modifiziert durch das Polyethylenglycolderivat, sind extrem stabil, sind in der biologischen Clearance beträchtlich verzögert und behalten ihre physiologischen Aktivitäten über einen langen Zeitraum.
Ein Bedarf existiert weiterhin für Verfahren zum Immunogenfreimachen, im Gegensatz zu gereinigten Proteinen oder Peptiden, von ganzen Zellen und Geweben und Organen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Modulieren der Antigenität und Aggregation von Säugetier-, vorzugsweise Menschen-, Zellen bereit. Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung die kovalente Bindung einer immunogenfreien Verbindung an intakte Zellen bereit. Zu Zellen, die wirksam gemäß der Erfindung modifiziert werden können, gehören kernlose Zellen (Blutplättchen und rote Blutkörperchen) und kernhaltige Zellen (Epithelzellen, Endothelzellen und Lymphozyten). Die immunogenfreie Verbindung kann ein beliebiges nichttoxisches oder physiologisch verträgliches polymeres Material sein, welches kovalent mit der Zelle verbunden werden kann, um die Zelle antigen stumm zu machen. Die immunogenfreie Verbindung oder das Material kann direkt oder durch Verknüpfungskomponenten mit den Antigen-Bestimmungsmitteln verbunden sein oder kann die Antigen-Bestimmungsmittel einfach maskieren, ohne durch die Antigen-Bestimmungsmittel mit der Zellenoberfläche verbunden zu sein, oder ein Anteil der immunogenfreien Verbindung kann direkt oder durch Verknüpfungskomponenten mit den Antigen-Bestimmungsmitteln verbunden sein und ein anderer Anteil davon kann direkt oder durch Verknüpfungskomponenten mit der Zellenoberfläche verbunden sein, ohne durch die Antigen-Bestimmungsmittel mit der Zellenoberfläche verbunden zu sein. In einer Ausführungsform ist die immunogenfreie Verbindung Polyethylenglycol (PEG) oder ein Derivat davon.
Zu potentiellen Anwendungen für PEG-Modifizierung von Zellen gehören: 1) PEG-derivatisierte rote Blutkörperchen (RBC) zur Verminderung von aus fehlangepaßtem Blut entstehenden Transfusionsreaktionen, einschließlich Transfusionen in Personen, die schwierig anzupassen sind (weil sie bereits existierende Antikörper für Nebenblutgruppen haben) oder Sensibilisierung für Nebenblutgruppenantigene aufgrund chronischer Transfusionen; 2) PEG-Derivatisierung des vaskulären Endothels von Spendergeweben vor der Transplatation zur Verhinderung/Verminderung von akuter Gewebeabstoßung; 3) Implantation von PEG-derivatisierten Zellen zur Korrektur von Enzymmängeln, anderen angeborenen Fehlern des Stoffwechsels oder anderen Typen von unzulänglichen Zellfunktionen, 4) Transfusion von derivatisierten RBC in Malaria-infizierte Personen zur Korrektur der begleitenden akuten Anämie und Verhinderung der Infektion der transfundierten Zellen und 5) Transfusionen in Personen mit unbekannten Blutgruppen, die sich sogar in hauptsächlichen (z.B. ABO) Blutgruppen von dem Spender unterscheiden können. Unerwarteterweise haben durch PEG modifizierte rote Blutkörperchen, wenn mit Kontrollzellen verglichen, normales Überleben in vitro und in vivo.
Kovalente Verknüpfung von immunogenfreien Verbindungen (z.B. PEG oder PEG-Derivate, wie beispielsweise Methoxypolyethylenglycol, oder PEG-ähnliche Verbindungen wie beispielsweise Polyethylenoxid) direkt oder indirekt mit Membranproteinen von Zellen verringert die Antigenerkennung dieser Zellen. Einige der verfügbaren Reaktionen und Reagenzien, um dies zu bewerkstelligen, sind in 1 zusammengefaßt. Ähnlich kann Einfügung von PEG-modifizierten Phospholipiden/freien Fettsäuren in die Zellmembran einem ähnlichen Zweck dienen. Die nachstehenden Beispiele demonstrieren, daß unerwarteterweise (1) es möglich ist, normale rote Blutkörperchen und andere Zellen mit PEG ohne Lyse zu derivatisieren, (2) daß die derivatisierten roten Blutkörperchen intakt bleiben und normale Morphologie zeigen, (3) daß PEG-Modifizierung der Zellenoberfläche in der Tat Antigen-Bestimmungsmittel, wie beispielsweise ABO-Blutgruppen, Epithelzellen-spezifische Antigene (ESA) und die MHC-Antigene, welche der Gewebe-/Organabstoßung zugrundeliegen, „verbirgt". (4) daß die derivatisierten Zellen normalerweise in der Zirkulation von Versuchstieren überleben, und (5) daß PEG-derivatisierte rote Blutkörperchen von einer Spezies ungemein verbessertes Überleben in der Zirkulation eines Lebewesens von einer anderen Spezies haben.
Wie vorstehend skizziert stellen Transfusionsreaktionen (gegenüber sowohl Haupt- als auch Nebenantigenen von roten Blutkörperchen) ein bedeutsames klinisches Problem dar. In den meisten Fällen resultieren diese Transfusionsreaktionen tatsächlich aus Nebenoberflächenantigenen, die durch Blutbanken nicht routinemäßig gemessen werden. In Situationen, wo entweder eine geeignete Blutgruppenentsprechung nicht ausfindig gemacht werden kann oder, häufiger, wenn Sensibilisierung gegenüber Nebenantigenen roter Blutkörperchen erfolgt ist, können PEG-modifizierte rote Blutkörperchen angewendet werden, um die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln für rote Blutkörperchen zu vermindern/zu verhindern. Die Anwendung dieser Erfindung kann auch zu Verfahrensweisen für Modifizierung von tierischen roten Blutkörperchen führen, welche dann zur Transfusion in Menschen oder in Tiere der gleichen oder einer anderen Spezies verwendet werden können. Die Anwendung dieser Erfindung kann weiterhin zu Verfahrensweisen für Modifizierung von roten Blutkörperchen führen, um Malariainvasion oder Opsonisation durch Faktoren wie beispielsweise Komplement zu verhindern.
Zusätzlich erweitert sich, basierend auf den in dieser Offenbarung enthaltenen Daten, der Umfang dieser Erfindung beträchtlich über das Blutbanking hinaus auf andere Gebiete, wo fremde Gewebe manipuliert oder in vitro oder in vivo eingebracht werden. Ein Gebiet primären Interesses ist die Verwendung von PEG-modifizierten Geweben (speziell kovalente Modifizierung des vaskulären Endothels) zur Gewebetransplantation. Trotz geeigneter HLA-Entsprechungen mißlingen viele Organtransplantierungen infolge sofortiger Gewebeabstoßung. Diese Abstoßungsreaktion erfolgt in erster Linie auf dem Niveau des vaskulären Endothels und führt zu Gefäßverschluß, Gewebehypoxie/Ischämie und letztlichem Verlust des Organtransplantats. Basierend auf der Chemie von hier offenbarter PEG-Zellderivatisierung ist es möglich, das Gefäßsystem des Gewebes mit einer Lösung von aktiviertem PEG zu perfundieren. Diese modifiziert die Gefäßwände (d.h. Endothelzellen), welche die vorstehend erwähnte sofortige Gewebeabstoßung verhindern oder vermindern. Diese Technologie kann so die Rate erfolgreicher Gewebeverpflanzung verbessern.
Die Erfindung stellt somit eine imunogenfreie zelluläre Zusammensetzung bereit, aufweisend: eine Zelle mit einer Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche; und eine immunogenfreie Verbindung, die mit der Zellenoberfläche kovalent direkt oder mittels der Verknüpfungskomponente verbunden ist, welche Verknüpfungskomponente von einem Verknüpfungsmolekül, wie nachstehend diskutiert, abgeleitet sein kann. Die immunogenfreie Verbindung wirkt, indem sie die Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche blockiert. In einer Ausführungsform ist die Verknüpfungskomponente kovalent direkt mit dem Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche verbunden. In einer alternativen Ausführungsform kann die Verknüpfungskomponente kovalent mit einer nicht antigenen Stelle auf der Zellenoberfläche verbunden sein, ist die antigene Stelle auf der Zellenoberfläche auf Grund der langen Kettenlänge der immunogenfreien Verbindung getarnt oder maskiert.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung einer immunogenfreien Zelle bereit. Das Verfahren weist auf: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung direkt mit der Oberfläche der Zelle oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so daß die immunogenfreie Verbindung die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche blockiert, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen. Eine durch dieses Verfahren erzeugte immunogenfreie Zelle wird durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Das Konzept der vorliegenden Erfindung kann auch ein Verfahren zum Verringern von Phagozytose oder komplementvermittelter Zerstörung oder zellenvermittelter Zerstörung einer Zelle bereitstellen. Dieses Verfahren weist auf Auswählen einer Zelle zum Einbau in eine Versuchsperson, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden einer Menge einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so daß die gebundene immunogenfreie Verbindung die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche blockiert, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen; und Einbringen der immunogenfreien Zellen in eine Versuchsperson, wobei, verglichen mit Phagozytose oder komplementvermittelter Zerstörung oder zellenvermittelter Zerstörung der Zelle vor der Modifizierung, Phagozytose oder komplementvermittelte Zerstörung oder zellenvermittelte Zerstörung der immunogenfreien Zelle verringert wird.
Zerstörung von Zellen kann aus Phagozytose folgen oder kann aus der Verbindung spezieller Immunoglobuline mit den Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zelle, gefolgt von einer komplementvermittelten Lyse ohne die Teilnahme von phagozytischen Zellen folgen. Durch Blockieren von Antikörperbindung durch die kovalente Bindung der immunogenfreien Verbindung oder der Materialien wird nicht nur Phagozytose blockiert, sondern auch komplementvermittelte Lyse oder andere Typen von zellenvermittelten Zerstörungen.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Verringern einer ungünstigen Reaktion auf eine Transfusion bereitgestellt, wobei das Verfahren aufweist: Auswählen eines roten Blutkörperchens zur Transfusion in eine Versuchsperson, wobei das rote Blutkörperchen Zellenoberfläche und Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung, fähig zum Blockieren der Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche, mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, um ein immunogenfreies rotes Blutkörperchen zu erzeugen; und Transfundieren einer Versuchsperson mit dem immunogenfreien rotes Blutkörperchen, wobei, verglichen mit der Transfusion des roten Blutkörperchens vor der Modifizierung, ungünstige Reaktion auf die Transfusion des immunogenfreien roten Blutkörperchens verringert wird.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Verringerung der Abstoßung einer transplantierten Zelle, wobei das Verfahren aufweist: Auswählen einer Zelle zur Transplantation in eine Versuchsperson, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung, fähig zum Blockieren der Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche, mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen; und Transplantieren der immunogenfreien Zelle in eine Versuchsperson, wobei Abstoßung der transplantierten Zelle, verglichen mit der Abstoßung der Zelle vor der Modifizierung, verringert wird.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verringerung der Aggregation von kernhaltigen und kernlosen Zellen, wie beispielsweise die durch Antikörper oder durch andere Zell:Zell-Wechselwirkungen induzierte, bereit. Das Verfahren umfaßt: kovalentes Verbinden immunogenfreier Verbindungen, fähig zum Blockieren der Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf einer Zellenoberfläche, mit der Zellenoberfläche von jeder von einer Mehrzahl von Zellen direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, um nicht aggregierende Zellen herzustellen, wobei Antikörper-induzierte Aggregation der nicht aggregierenden Zellen, verglichen mit Antikörper-induzierter Aggregation der Zellen vor der Modifizierung, verringert wird.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „Verknüpfungskomponente" oder „Verknüpfer" eine mindestens zweiwertige organische Gruppe, die kovalent oder durch Komplexbildung oder Chelatbildung sich an sowohl das immunogenfreie Molekül als auch die Zellenoberfläche bindet, um mindestens eine immunogenfreie Verbindung mit mindestens einer funktionellen Gruppe oder Struktur auf der Zellenoberfläche zu verbinden. Die Verknüpfungskomponenten können von reaktiven Verknüpfungsmolekülen abgeleitet sein, wie nachstehend beschrieben ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform offensichtlich, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, in welchen:
1 eine schematische Darstellung der Herstellung bestimmter Ausführungsformen der immunogenfreien zellulären Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der immunogenfreien zellulären Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist. In dieser Ausführungsform ist die immunogenfreie Verbindung Polyethylenglycol oder ein Derivat davon und ist das aktivierte PEG (PEG-Verknüpfer) kovalent mit Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche (direkte Blockierung antigener Stellen) verbunden und ebenfalls kovalent mit nicht antigenen Stellen auf der Zellenoberfläche verbunden (indirekte Blockierung antigener Stellen, zurückzuführen auf ihre lange Kettenlänge);
3 eine graphische Darstellung ist, die zeigt, daß Monomethoxypoly(ethylenglycol)-(mPEG)-Modifizierung von roten Blutkörperchen eine dosisabhängige Hemmung von anti-A-Antikörper-induzierter RBC-Aggregation, turbidimetrisch definiert, verursacht;
4 ein Balkendiagramm ist, das zeigt, daß mPEG-Modifizierung von roten Blutkörperchen die Lyse roter Blutkörperchen nur leicht vergrößert;
5 eine graphische Darstellung ist, die zeigt, daß die mPEG-Modifizierung von roten Blutkörperchen keine Wirkung auf die osmotische Fragilität roter Blutkörperchen hat;
6 ein Balkendiagramm ist, das zeigt, daß mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen vom Typ A signifikant weniger anti-A-Antikörper binden;
7 ein Balkendiagramm ist, das zeigt, daß mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen vom Schaf signifikant weniger anfällig für Phagozytose durch Monozyten von menschlichem peripheren Blut sind;
8 eine graphische Darstellung ist, die keine signifikanten Unterschiede in dem in-vivo-Überleben von roten Blutkörperchen von Kontrollmäusen und roten Blutkörperchen von Mäusen, modifiziert mit aktiviertem PEG, zeigt; und
9 eine graphische Darstellung ist, die demonstriert, daß rote Blutkörperchen vom Schaf (ausgefüllte Symbole) in das Zirkulationssystem einer Maus eintreten und darin überleben, während unmodifizierte rote Blutkörperchen vom Schaf (offene Symbole) es nicht tun.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Response von Spender-A-PBMC (einkernige Zellen von peripherem Blut) auf antigen fremde Spender-B-PBMC (Tafel A) und die Response von Spender-B-PBMC auf Spender A (Tafel B) in der MLC-Analyse von Kontroll- und mPEG-derivatisierten PBMC darstellt.
11 ist eine graphische Darstellung, die demonstriert, daß Plättchenaggregation durch die kovalente Modifizierung von Plättchenoberflächen mit mPEG verhindert wird.
12 ist ein Balkendiagramm, das demonstriert, daß mPEG-Modifizierung von Epithelzellen Antikörpererkennung von Oberflächenantigenen blockiert.
13 ist eine graphische Darstellung, die Sauerstoffdissoziationskurven von unmodifizierten roten Blutkörperchen und mit mPEG modifizierten roten Blutkörperchen zeigt.
Die 14 bis 16 sind graphische Darstellungen, die die Auswirkungen von funktionalisierten Polyethylenglycolen oder Derivaten davon auf die Typisierung von Seren-induzierter Erythrozytenaggregation zeigen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine immunogenfreie zelluläre Zusammensetzung bereit, aufweisend: eine Zelle mit einer Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche; eine Verknüpfungskomponente, kovalent verbunden mit der Zellenoberfläche; und eine immunogenfreie Verbindung, kovalent verbunden mit der Verknüpfungskomponente und fähig, der Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche zu blockieren. Alternativ kann die immunogenfreie Verbindung direkt an die Zellenoberfläche gebunden werden, wenn sie Gruppen wie beispielsweise Carbonsäuren, Aldehyde, Ketale oder Acetale umfaßt, die reaktiv mit NH₂- oder SH-Gruppen auf der Zellenoberfläche sind.
Die Zelle kann eine beliebige geeignete Zelle mit zugänglichen Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Oberfläche der Zelle sein. Zu geeigneten Zellen gehören kernlose Zellen, zum Beispiel hämatopoetische Zellen, d.h. rote Blutkörperchen oder Plättchen, oder kernhaltige Zellen, zum Beispiel vaskuläre Endothelzellen, PBMCs, Leberzellen, Neuronalzellen, Pankreaszellen oder Epithelzellen.
Die Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche können auf die Anwesenheit von antigenen Proteinen, antigenen Kohlenhydraten, antigenen Zuckern, antigenen Lipiden, antigenen Glycolipiden, antigenen Glycoproteinen usw. zurückzuführen sein. „Antigen"-Bestimmungsmittel können auch an Malariainvasion einer Zelle oder Opsonisation einer Zelle beteiligt sein. Zum Beispiel haben rote Blutkörperchen Antigene auf ihrer Oberfläche, welche die ABO/rh-Blutgruppen bestimmen. Diese Antigene werden oft als Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel bezeichnet. Diese Antigene werden durch einen inkompatiblen Wirt erkannt und die Spenderzelle wird schnell zerstört. Dies kann die Erhöhung natürlicher Immunität (durch Phagozyten, wie beispielsweise Makrophagen, Neutrophile und natürliche Killerzellen) oder die Stimulation spezifischer oder erworbener Immunität (einschließlich humoraler Immunität durch Antikörper und zellenvermittelter Immunität durch T-Lymphozyten) beinhalten. In jedem Fall wird die Zelle als fremd erkannt und löst eine Immunantwort aus.
Um diese Immunantwort daran zu hindern, die Zelle zu zerstören, beinhaltet die vorliegende Erfindung die Modifizierung der Antigenität der Zelle. Diese Modifizierung wird bewerkstelligt, indem eine immunogenfreie Verbindung mit der Zelle verbunden wird. Geeignete immunogenfreie Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind immunogenfreie Verbindungen, die fähig sind, die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche zu blockieren. Die Verbindungen sind im allgemeinen langkettige Verbindungen, wobei die lange Kette die Antigen-Bestimmungsmittel sterisch blockieren kann. Zu derartigen immunogenfreien Verbindungen gehören Polyalkylenglycole wie beispielsweise Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, gemischte Polypropylen-Polyethylenglycole oder Derivate davon (einschließlich Methoxypolyethylenglycol), bestimmte Polysaccharide wie beispielsweise Dextrane, Cellulosen, Ficoll und Arabinogalactan und nichttoxische, hydrophile, synthetische Polymere einschließlich Polyurethanen. Verwendbare Molekulargewichte dieser Verbindungen können von etwa 100–500 bis 100000–200000 oder darüber reichen.
Die gegenwärtig bevorzugte immunogenfreie Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist Polyethylenglycol oder ein Derivat davon. Das Polyethylenglycol oder Derivat davon ist ein Molekül mit einer sehr langen Kettenlänge. Die immunogenfreie Verbindung (z.B. Polyethylenglycol oder ein Derivat davon) kann direkt mit einer antigenen Stelle (z.B. ein Antigen-Bestimmungsmittel) auf einer Zellenoberfläche über eine Verknüpfungskomponente verbunden sein (direkte Modifizierung der Antigenität) (siehe 1 und 2) oder kann mit einer nicht antigenen Stelle auf der Zellenoberfläche über eine Verknüpfungskomponente verbunden sein. In beiden Fällen blockiert die lange Kette der immunogenfreien Verbindung (z.B. Polyethylenglycol oder ein Derivat davon) wirksam antigene Stellen auf der Zellenoberfläche (indirekte Modifizierung der Antigenität) (siehe 2). In jeder Ausführugsform ist die immunogenfreie Verbindung (z.B. Polyethylenglycol oder ein Derivat davon) mit der Zellenoberfläche durch eine Verknüpfungskomponente verbunden, welche von einem Verknüpfungsmolekül abgeleitet ist, das mit dem PEG reagieren kann. Die Kombination eines Polyethylenglycols oder Derivats davon und des Verknüpfungsmoleküls wird im allgemeinen als „aktiviertes" Polyethylenglycol oder Derivat davon bezeichnet.
Polyethylenglycole (PEG) und Derivate davon sind auf dem Fachgebiet bekannt. Polyethylenglycol hat die Formel H(OCH₂CH₂)_nOH wobei n größer als oder gleich 4 ist, mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 20000 Dalton. Jedoch sind Polyethylenglycol und Derivate davon mit Molekulargewichten bis zu etwa 200000 Dalton oder mehr erhältlich und sind auch in der praktischen Ausführung der Erfindung allein oder in Kombination mit Materialien mit niedrigerem MW verwendbar. Verschiedene Derivate von Polyethylenglycol umfassen Substitute für die H- und OH-Endgruppen, wobei zum Beispiel Polyethylenglycolether (wie beispielsweise PEG-O-R; PEG-O-CH₃; CH₃-PEG-OH oder „mPEG"), 2,4-Dinitrophenylether von PEG), Polyethylenglycolester (wie beispielsweise PEG-O₂C(CH₂)₁₄CH₃; PEG-O₂CCH₂CH₂CO₂-Atropin), Polyethylenglycolamide (wie beispielsweise PEG-O₂C(CH₂)₇CONHR; mPEG-O₂CCH₂CH₂CONH(CH₃)CHCH₂C₆H₅: PEG-O₂CCH₂CH₂CONHCH₂CH₂-NAD⁺), Polyethylenglycolamine (wie beispielsweise PEG-NH₂; PEG-NH(CH₂)₆NH₂; PEG-OCH₂CH₂NH₂; mPEG-NH₂), Polyethylenglycolsäuren (wie beispielsweise PEG-O₂C(CH₂)₂CO₂H; PEG-OCH₂CO₂H; PEG-O₂C(CH₂)₇-CO₂H), Polyethylenglycolaldehyde (PEG-O-CH₂-CHO) und elektrophile Derivate (wie beispielsweise PEG-Br; PET-OSO₂CH₃; PEG-OTs) erzeugt werden. Verschiedenartige Phenyleinheiten können ebenfalls für das H oder OH von PEG substituiert sein, wie beispielsweise der vorstehend erwähnte 2,4-Dinitrophenylether von PEG). Methoxypolyethylenglycol (MW 2000–8000) ist ein bevorzugtes PEG-Derivat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Für eine vollständige Diskussion von Polyethylenglycol und aktivierten Derivaten davon, einschließlich der Synthese der Derivate, siehe die folgenden Druckschriften: Harris et al. 1984; Harris 1985; Zalipsky und Lee 1992; Park und Kim 1992; Merrill 1992; und die US-Patentschriften 4179337 und 5214131, wobei der Inhalt von jedem von diesen hier durch Bezugnahme einbezogen ist. Die speziellen immunogenfreien Verbindungen, einschließlich der Polyethylenglycolderivate, die vorstehend aufgeführt sind, sind nur exemplarisch und die Erfindung soll nicht auf diese speziellen Beispiele begrenzt sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind diese immunogenfreien Verbindungen (z.B. Polyethylenglycolmoleküle oder Derivate davon) mittels einer Verknüpfungskomponente kovalent mit der Zellenoberfläche verbunden. Diese Verknüpfungskomponenten können durch Umsetzung des Polyethylenglycols oder Derivats davon mit geeigneten Verknüpfungsmolekülen, die ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt sind und zum Beispiel Cyanurchlorid, Imidazolylformiat, Succinimidylsuccinat, Succinimidylglutarat, N-Hydroxysuccinimid, 4-Nitrophenol und 2,4,5-Trichlorphenol einschließen, hergestellt werden. Diese Verknüpfungsmoleküle „aktivieren" das PEG, ein Begriff, der ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt ist. Für eine Beschreibung der Aktivierung von PEG mit Beispielen bekannter Verknüpfungskomponenten und -moleküle siehe Harris 1985. Die vorstehend aufgeführten Verknüpfungsmoleküle sind nur exemplarisch und die Erfindung soll nicht auf diese speziellen Beispiele begrenzt sein. Wie durch den Fachmann erkannt wird, reagieren die Verknüpfungsmoleküle, vorstehend und in 1 offenbart, mit einer reaktiven Gruppe wie beispielsweise einem Hydroxy der immunogenfreien Verbindung, z.B. dem PEG oder MPEG, und reagieren auch mit einer NH₂- oder, in einigen Fällen, SH-Gruppe eines Peptidyl- oder anderen Aminosäurerestes auf der Zellenoberfläche, um sich kovalent mit ihnen zu verbinden, wodurch das Verknüpfungsmolekül in einem oder mehreren Schritten in die zweiwertige Verknüpfungskomponente umgewandelt wird, wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt ist.
TABELLE 1 Verknüpfungskomponente
Eine Anzahl von „aktivierten" Methoxypolyethylenglycolen ist im Handel erhältlich, in welchen mPEG (MW 5000) sich an dem Hydroxylende an ein Verknüpfungsmolekül gebunden hat. Zu diesen gehören Methoxypolyethylenglycol-(mPEG)-para-nitrophenylcarbonat, mPEG-Cyanurchlorid, mPEG-Succinimidylsuccinat, mPEG-Tresylat und mPEG-Imidazolylcarbonyl. Zum Beispiel siehe I. Jackson et al., Anal. Biochem., 565, 114 (1987); A. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578 (1977); F. M. Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11, 141 (1985), C. Delgado et al., Biotech. Appl. Biochem. 12, 119 (1990); C. O. Veavchemp et al., Anal. Biochem., 131, 25 (1983).
Die Chemie, die an der kovalenten Verbindung der immunogenfreien Verbindung (wie beispielsweise PEG oder ein Derivat davon) mit reaktiven Gruppen wie beispielsweise Proteinen und Peptiden auf der Zellenoberfläche (so kovalente Verbindung der immunogenfreien Verbindung mit einer Zellenoberfläche) mittels Verknüpfungskomponenten beteiligt ist, ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird ausführlich bei Harris 1985; Harris et al. 1984; und Zalipsky und Lee 1992 diskutiert.
Vorzugsweise wurde für die chemische Modifizierung der roten Blutkörperchen die freie Hydroxylgruppe an einem Ende des mPEG mit Cyanurchlorid aktiviert und mit Hämoglobin umgesetzt, um die Aktivierung zu bestätigen. Danach wurden von Menschen oder Tieren stammende rote Blutkörperchen mit 0,9%iger wässeriger NaCl-Lösung verdünnt, vorzugsweise auf ungefähr 2% (Vol./Vol.), und eine NaOH-Lösung wurde langsam unter Verwendung von pH-Titrimetrie hinzugegeben, wobei der pH bei etwa 9 bis 10, vorzugsweise bei 9,2, gehalten wurde. 1 mM bis 10 mM mPEG, akriviert wie vorstehend offenbart, wurde zu der 2%igen (Vol./Vol.) Lösung von roten Blutkörperchen hinzugegeben, welche dann unter Umgebungstemperaturen umgesetzt wurde, während langsam gemischt wurde. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden die roten Blutkörperchen in einer Zentrifuge ausgefällt, mit PBS (Phosphar-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) suspendiert und wiederum zentrifugiert. Die finalen roten Blutkörperchen wurden durch Wiederholen dieses Prozesses von Ausfällung und Suspendierung erhalten. Dieses Verfahren kann mit vom Menschen oder Tier stammenden roten Blutkörperchen, sogar denjenigen mit einem abgelaufenen Lagerungszeitraum, verwendet werden. Auch wurde der pH-9,2-Boratpuffer, verwendet in herkömmlicher chemischer mPEG-Modifizierung, nicht verwendet. Stattdessen wurde pH-Titrimetrie verwendet, um den pH der Lösung der roten Blutkörperchen, verdünnt mit einer wässerigen Lösung von 0,9% NaCl, einzustellen.
Ein Objektträgertest der Blutgruppenantigen-Antikörper-Reaktion und ein Mikrovertiefungsausfällungstest wurden durchgeführt, um zu verifizieren, ob in dieser Weise chemisch modifizierte rote Blutkörperchen ungeachtet der Blutgruppe für Transfusion verwendet werden können. Der Objektträgertest ist ein Verfahren, das allgemein verwendet wird, um vor der Transfusion die Blutgruppe zu verifizieren. Bei diesem Verfahren werden rote Blutkörperchen und anti-A-, anti-B- und anti-D-(Rh)-Antikörper, die Blutgruppenantikörper der roten Blutkörperchen, auf einem Objektträger gemischt und auf Agglutination beobachtet. Als Ergebnis der Anwendung dieses Verfahrens wurde bei roten Blutkörperchen, chemisch modifiziert mit mPEG, eine Verringerung von Agglutinierbarkeit beobachtet.
Außerdem wurde Agglutination von roten Blutkörperchen auf Mikrovertiefungsplatten und Bindung mit Blutgruppenantikörpern getestet, um quantifizierbar die Verringerung von Agglutination zu verifizieren. Wenn jede Vertiefung auf einer Mikrovertiefungsplatte mit einer unterschiedlichen Konzentration von Blutgruppenantikörpern und einer fixierten Konzentration von chemisch modifizierten roten Blutkörperchen gefüllt wird, reagieren die roten Blutkörperchen mit den Blutgruppenantikörpern, wobei sie sie allmählich ausfällen. Der Grad der Agglutination der roten Blutkörperchen wurde quantitativ als finale Konzentration von Blutgruppenantikörpern bestimmt, die keine Aggregation von roten Blutkörperchen im Zentrum der Vertiefungen zeigen. Rote Blutkörperchen, behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von mPEG, wurden am Anfang mit Blutgruppenantigenen umgesetzt, dann zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Diese wurde dann mit roten Blutkörperchen umgesetzt, die nicht chemisch modifiziert worden waren, und die Anzahl von in der überstehenden Flüssigkeit verbliebenen Blutgruppenantikörpern wurde quantitativ bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß chemisch modifizierte rote Blutkörperchen verringerte Agglutinierbarkeit zeigten und daß Bindung mit Blutgruppenantikörpern unterdrückt wurde.
Aus den vorstehenden Ergebnissen, die eine Verbindung zwischen Blutgruppenantikörperbindung und Verringerung der Agglutinierbarkeit zeigen, wurde gefunden, daß die Agglutination von roten Blutkörperchen durch mPEG verringert wird, welches die Bindung von Blutgruppenantikörpern mit roten Blutkörperchen versperrt. Um zu bestimmen, wie diese Verringerung der Agglutinierbarkeit auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen ausgelöst wird, wurden die Membrane von chemisch modifizierten roten Blutkörperchen abgetrennt und 12% SDS-PAGE unterworfen und mit Coomassie-Blau oder Periodsäure angefärbt. Das Membranprotein der ABH-Antigengruppen, Bande 3, 4,5, PAS-1 und PAS-2 wurden analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, daß, wenn die Konzentration von verarbeitetem PEG zunahm, die Banden 3 und 4,5 und die Banden PAS-1 und PAS-2 allmählich verschwanden, wobei sie allmähliche Ablagerung in den oberen Anteilen des Gels zeigten. Diese Verschiebung von Banden ist ein Ergebnis der direkten Bindung von mPEG mit dem Membranprotein von roten Blutkörperchen. Es kann daher gesehen werden, daß mPEG die Agglutinierbarkeit von Antigenen roter Blutkörperchen reduziert, indem der Zugang von Antikörpern durch ihre kovalente Bindung an die Antigenanteile dieser Membranproteine oder die Bereiche um sie herum versperrt wird.
Um zu verifizieren, ob chemisch modifizierte rote Blutkörperchen Sauerstofftransportaktivität haben, die ausreichend für ihre Verwendung in Transfusionen ist, wurde eine Sauerstoffdissoziationskurve berechnet, wobei der Grad von Hämoglobinbindung mit Sauerstoff in den roten Blutkörperchen basierend auf dem Sauerstoffpartialdruck analysiert wurde. Chemisch modifizierte rote Blutkörperchen zeigten eine Form der Sauerstoffdissoziationskurve, Sauerstoffaffinität, einen P₅₀-Wert, einen n-Wert (wobei der Hill-Koeffizient kooperative Wirkung anzeigt) und Sauerstofftransport zu Geweben, die ähnlich denjenigen von unmodifizierten roten Blutkörperchen waren. Es wurde daher gefunden, daß Bindung von mPEG an rote Blutkörperchen keine Veränderung in der Sauerstofftransportaktivität verursacht.
Rote Blutkörperchen, chemisch modifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, können daher ungeachtet der Blutgruppe verwendet werden und haben ausreichende Sauerstofftransportaktivität. Folglich können sie auf allen medizinischen Gebieten, auf welchen rote Blutkörperchen verwendet werden, für solche Zwecke wie Notfallbluttransfusion und Transplantatorganlagerung verwendet werden. Das Verfahren der Herstellung von roten Blutkörperchen, chemisch modifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, kann ungeachtet der Blutgruppe auf alle Blutgruppenantigene angewendet werden. Das Verfahren ist sehr einfach und ökonomisch, was es in der Zukunft sehr vorteilhaft für die Gestaltung von Reaktoren zur Massenproduktion macht.
Die Erfindung stellt somit weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer immunogenfreien Zelle bereit. Das Verfahren weist auf: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung, fähig, die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf einer Zellenoberfläche zu blockieren, mit einer Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen. Wenn die Zelle ein rotes Blutkörperchen ist, kann das Verfahren weiterhin Transfundieren einer Versuchsperson mit der immunogenfreien Zelle aufweisen. Da die Antigen-Bestimmungsmittel wie beispielsweise die Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel auf dem roten Blutkörperchen durch die immunogenfreie Verbindung blockiert werden, wird das transfundierte immunogenfreie rote Blutkörperchen keine Immunantwort auslösen. Wie vorstehend diskutiert, kann dieses Verfahren sehr nützlich sein, wenn rote Blutkörperchen schnell ohne die Verfügbarkeit vollständiger Blutgruppenbestimmung oder Kreuzprobendurchführung, oder wenn nur unangepaßtes Blut von einer Versuchsperson verfügbar ist, transfundiert werden müssen.
Wenn die Zelle Teil eines Gewebes oder Organs ist, kann das Verfahren weiterhin Transplantieren des immunogenfreien Gewebes oder Organs in eine Versuchsperson umfassen. Da die Antigen-Bestimmungsmittel auf dem Gewebe oder Organ, wie beispielsweise die vaskulären Endothelzellen, welche eine freiliegende Antigen-Oberfläche des Gewebes oder Organs bilden, durch die immunogenfreie Verbindung blockiert werden, wird das transplantierte immunogenfreie Gewebe oder Organ keine Immunantwort auslösen. Wie vorstehend diskutiert, ist dieses Verfahren sehr nützlich, um schwere Abstoßungsreaktionen oder Graft-versus-Host-Disease (Transplantat-Wirt-Krankheit) zu vermeiden, wenn Organe oder Gewebe transplantiert werden.
Die Erfindung stellt weiterhin eine immunogenfreie Zelle, erzeugt durch das vorstehende Verfahren, bereit.
Das Konzept der vorliegenden Erfindung kann auch ein Verfahren zur Verringerung von Phagozytose einer Zelle bereitstellen. Dieses Verfahren weist auf: Einbringen der immunogenfreien Zelle in eine Versuchsperson, wobei Phagozytose der immunogenfreien Zelle, verglichen mit Phagozytose der Zelle vor der Modifizierung, verringert wird. Die immunogenfreie Zelle kann durch ein Verfahren hergestellt werden, aufweisend: Auswählen einer Zelle zum Einbau in eine Versuchsperson, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden mit der Zellenoberfläche, direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, einer immunogenfreien Verbindung, die Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche blockiert, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen. In dem Fall, wo die Zelle ein rotes Blutkörperchen ist, kann dieses Verfahren Phagozytose des „fremden" roten Blutkörperchens verhindern, indem das rote Blutkörperchen immunogenfrei gemacht wird. Das „fremde" rote Blutkörperchen kann von einer anderen menschlichen Person sein oder kann von einem anderen nichtmenschlichen Versuchswesen sein. In jedem Fall würde die Antwort des Körpers sein, zu versuchen, das „fremde" rote Blutkörperchen, einschließlich durch Phagozytose, zu eliminieren.
Weiterhin wird ein Verfahren zur Verringerung einer ungünstigen Reaktion auf eine Transfusion bereitgestellt, wobei das Verfahren aufweist: Transfundieren einer Versuchsperson mit dem immunogenfreien roten Blutkörperchen, wobei, verglichen mit der Transfusion des immunogenfreien roten Blutkörperchens vor der Modifizierung, ungünstige Reaktion auf die Transfusion des immunogenfreien roten Blutkörperchens verringert wird. Die immunogenfreien roten Blutkörperchen werden hergestellt durch Auswählen eines roten Blutkörperchens zur Transfusion in eine Versuchsperson, wobei das rote Blutkörperchen eine Zellenoberfläche und Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche in einer Menge, fähig, die Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche zu blockieren; wobei die Verbindung kovalent mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verküpfungskomponente verbunden wird, um ein immunogenfreies rotes Blutkörperchen zu erzeugen. Wie vorstehend diskutiert könnte das rote Blutkörperchen von einer anderen menschlichen Person oder einem nicht menschlichen Säugetier sein.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Verringerung der Abstoßung einer transplantierten Zelle, wobei das Verfahren aufweist: Transplantieren einer immunogenfreien modifizierten Zelle in eine Versuchsperson, wobei Abstoßung der transplantierten modifizierten Zelle, verglichen mit der Abstoßung der Zelle vor der Modifizierung, verringert wird. Die Zelle wird durch ein Verfahren hergestellt, das aufweist: Auswählen einer Zelle zur Transplantation in eine Versuchsperson, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist; kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so daß die immunogenfreie Verbindung die Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche blockiert, um eine immunogenfreie Zelle zu erzeugen. Wo die Zelle Teil eines Gewebes oder Organs ist, welches in eine Versuchsperson transplantiert werden soll, ist es ein bevorzugtes Verfahren zur Ausführung der kovalenten Anbindung, das Gewebe oder Organ mit einer Lösung eines aktivierten Polyethylenglycols oder Derivats davon zu perfundieren (d.h., das Polyethylenglycol oder Derivat davon wird zuerst mit dem Verknüpfungsmolekül verbunden, wobei ein aktiviertes PEG erzeugt wird, welches dann über das Gewebe oder Organ perfundiert wird). Während der Perfusion verbindet sich das aktivierte PEG über eine Verknüpfungskomponente kovalent mit der Zellenoberfläche.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verringerung von Antikörper-induzierter Aggregation von Zellen bereit, wobei das Verfahren aufweist: kovalentes Verbinden immunogenfreier Verbindungen, fähig zum Blockieren der Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche, mit der Zellenoberfläche; wobei die Verbindungen kovalent mit der Zellenoberfläche von jeder von einer Mehrzahl von Zellen, direkt oder durch Verknüpfungskomponenten, verbunden werden, um nicht aggregierende Zellen zu erzeugen, wobei Antikörper-induzierte Aggregation der nicht aggregierenden Zellen, verglichen mit Antikörper-induzierter Aggregation der Zellen vor der Anbindung der Verbindungen, verringert wird. Dieses Verfahren ist besonders anwendbar, wo die Zellen rote Blutkörperchen sind und wo die Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche Blutgruppenantigen-Bestimmungsmittel umfassen.
In jedem von den vorstehend beschriebenen Verfahren kann ein Verknüpfungsmolekül zuerst mit der immunogenfreien Verbindung umgesetzt werden (wobei eine „aktivierte" Verbindung erzeugt wird) und kann dann das Verknüpfungsmolekül mit der Zellenoberfläche umgesetzt werden. Die Reihenfolge dieser Schritte kann umgekehrt werden und jede Bezugnahme auf die beiden Schritte soll die beiden Schritte in jeder Reihenfolge abdecken. Dementsprechend kann das Verknüpfungsmolekül auch mit der Zellenoberfläche verbunden werden, kann dann die immunogenfreie Verbindung mit dem Verknüpfungsmolekül umgesetzt werden, um es an die Zellenoberfläche über eine so erzeugte Verknüpfungskomponente gemäß den Ansprüchen und der Offenbarung hier zu binden.
In den Beispielen, welche folgen, „verbirgt" PEG-Modifizierung des externen Aspekts der Membran des roten Blutkörperchens wirksam Hauptantigen-Bestimmungsmittel wie beispielsweise ABO-Blutgruppensubstanzen. Dies ist in (1) dem Fehlen von starker Antikörper-induzierter Agglutination, (2) signifikant verringerter Antikörper-induzierter Aggregation und (3) verminderter Phagozytose durch heterologe Makrophagen ersichtlich. Behandelte rote Blutkörperchen bleiben intakt, wobei sie nur geringfügige spontane Hämolyse zeigen, und demonstrieren normale osmotische Fragilität über mindestens 48 Stunden in-vitro-Inkubation. Die „normale" Natur des modifizierten roten Blutkörperchens der Maus wird weiterhin durch normales Überleben in vivo demonstriert.
Die Verfahrensweise der PEG-Modifizierung wird von den Zellen überraschend gut toleriert, wobei ein Produkt geliefert wird, welches normalerweise in der Zirkulation überlebt. Die derivatisierten Zellen sind antigen getarnt und werden durch Blutgruppenantikörper oder durch Phagozyten nicht erkannt. Vielleicht am meisten überraschend ist, daß behandelte rote Blutkörperchen von einer Spezies viel länger überleben, als es unbehandelte rote Blutkörperchen in der Zirkulation einer anderen Spezies tun.
Die Erfindung stellt somit bereit (1) Derivatisierung von menschlichen roten Blutkörperchen, um Transfusionen in Personen zu gestatten, die schwierig anzupassen sind (weil sie bereits existierende Antikörper für Nebenblutgruppen haben); (2) Derivatisierung von menschlichen roten Blutkörperchen, um Transfusionen in Personen mit unbekannten Blutgruppen zu gestatten, die sich sogar in hauptsächlichen (z.B. ABO) Blutgruppen von dem Spender unterscheiden können; (3) Derivatisierung – durch Perfusion von Lösungen von aktiviertem mPEG – von menschlichen Organverpflanzungen, um unerwartete hyperakute Abstoßungsepisoden zu verhindern; (4) Derivatisierung – durch Perfusion von Lösungen von aktiviertem mPEG – von Organen von nichtmenschlichen Lebewesen, um hyperakute Abstoßung zu verhindern und um die Chancen letztlich erfolgreicher Transplantation in Menschen zu verbessern.
BEISPIEL I
Hemmung der Agglutination von roten Blutkörperchen:
Normale menschliche rote Blutkörperchen (Erythrozyten) wurden 3× in isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Eine Suspension roter Blutkörperchen mit einem Hämatokrit von etwa 12% wird in isotonischem alkalischen Phosphatpuffer (PBS; 50 mM K₂HPO₄ und 105 mM NaCl, pH etwa 9,2) hergestellt. Cyanurchlorid-aktiviertes Methoxypolyethylenglycol (Sigma Chemical Co.) wird hinzugegeben, und die roten Blutkörperchen werden für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Zellderivatisierung kann auch unter anderen pH- und Temperaturbedingungen mit zu den dargestellten vergleichbaren Ergebnissen ausgeführt werden. Zum Beispiel demonstrierten rote Blutkörperchen, derivatisiert bei pH 8,0 für 60 Minuten bei 22°C, praktisch identische charakteristische Eigenschaften zu denjenigen, die bei pH 9,2 für 30 Minuten bei 4°C derivatisiert wurden. Der extreme Bereich von pH- und Temperaturbedingungen macht diese Verfahrensweise auf einen weiten Bereich von Zellen und Geweben in breitem Maße anwendbar. Der vorgeschlagene Mechanismus kovalenter Reaktion mit externen Proteinen und anderen Membrankomponenten ist nachstehend dargestellt. Typische Konzentrationen von aktiviertem mPEG verwendeten einen Bereich von 0 bis 8 mg pro ml der Suspension von roten Blutkörperchen. Die typische Konzentration von aktiviertem mPEG, die auf anderen kernlosen (d.h. Plättchen) und verschiedenen kernhaltigen Zellen (z.B. vaskuläre Endothel-, Leber-, hämatopoetische, Neuronal-, Pankreaszellen, Epithelzellen usw.) zu verwenden ist, kann angesichts der Lehren hier leicht bestimmt werden.
Wie in 3 gezeigt wird, verhindert die kovalente Bindung von mPEG an die Membranproteine von intakten roten Blutkörperchen die Agglutination der roten Blutkörperchen. Dies ist mit dem groben Niveau unter Verwendung von Agglutination, induziert durch ABO-Antikörper, und mit einem feineren Niveau unter Verwendung eines Plättchen-Aggregometers, modifiziert zum Messen der Aggregation roter Blutkörperchen (3), ersichtlich. Rote Blutkörperchen vom Typ A wurden mit 0, 3 oder 6 mg Cyanurchlorid-aktiviertem mPEG (MW 5000) pro ml Blut behandelt und bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden 3 mal mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und zu einem 40%-Hämatokrit in Kochsalzlösung resuspendiert.
Für starke Agglutination wurden gleiches Volumen von einer RBC-Suspension mit einem Hämatokrit von 40% und einem im Handel erhältlichen anti-A Blutgruppenbestimmungsantikörper (Carolina Biological Supply) gemischt und photographiert. Zunehmende Mengen von gebundenem mPEG hemmten wirksam die Agglutinationsreaktion. In Abwesenheit von Derivatisierung wurde eine typische Blutgruppenbestimmungsantwort beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde mit zunehmenden Mengen von kovalent gebundenem mPEG eine dosisabhängige Verringerung in der Seren-induzierten Agglutination von RBC beobachtet. In der Tat wurde bei 6 mg mPEG/ml RBC im groben Niveau keine nachweisbare Agglutination beobachtet.
3 zeigt Mikroaggregation von roten Blutkörperchen, wie sie bei 37°C in einem Plättchen-Aggregometer gemessen wird. Wie gezeigt verursachte mPEG-Modifizierung eine dosisabhängige Hemmung von durch anti-A-Antikörper induzierter Aggregation roter Blutkörperchen.
Weiteres Testen von angepaßten Kontroll- und mPEG-derivatisierten RBC von ausgewählten Neben-RBC-Antigenen demonstrierte ebenfalls eine signifikante Abnahme in der Antigenität der mPEG-modifizierten RBC (Tabelle 2).
TABELLE 2 Nachweis von ausgewählten Rh- und MNS-PBS-Antigenen bei Kontroll- und derivatisierten RBC
Die Agglutinationsantwort wird makroskopisch gemessen, wobei eine 4⁺ Bewertung die stärkste Agglutinationsantwort ist und 1^+w die schwächste ist. Wie angegeben setzte in allen Fällen, wo ein Neben-RBC-Antigen nachgewiesen wurde, mPEG-Modifizierung seinen Nachweis praktisch außer Kraft (z.B. 4⁺ bis 1^+w). Wichtig ist, daß der Grad von Derivatisierung mit aktiviertem mPEG, der in dieser Untersuchung verwendet wurde, relativ niedrig (6 mg/ml) im Vergleich zu den Niveaus war, welche verwendet werden können (bis zu ungefähr 30 mg mPEG/ml RBC), während keine ungünstigen Auswirkungen auf die RBC gezeigt werden. In der Tat ist es, basierend auf der mPEG-Dosisabhängigkeit, aufgezeichnet in 3, sehr wahrscheinlich, daß höhere Derivatisierungsgrade den Antigennachweis wahrscheinlich weiter unterdrücken.
BEISPIEL II
Auswirkung auf die Stabilität des roten Blutkörperchens:
Wenn auch mPEG-Modifizierung von roten Blutkörperchen die Lyse von roten Blutkörperchen leicht vergrößert, beträgt diese Lyse weniger als 5% der Gesamtmasse von roten Blutkörperchen (4). Weiterhin wurde gefunden, daß mPEG-Anbindung keine Auswirkung auf die osmotische Fragilität von roten Blutkörperchen hat (5). Die Stabilität von roten Blutkörperchen wurde durch die kovalente Anbindung von mPEG minimal modifiziert. Wie in 4 gezeigt wurde die Lyse von roten Blutkörperchen durch die Anbindung von mPEG leicht vergrößert. Jedoch betrug die Lyse von roten Blutkörperchen der RBC während der mPEG-Modifizierung und nachfolgender 24-Stunden-Lagerung bei 4°C oder nach Inkubation bei 37°C weniger als 5%. Wie in 5 gezeigt war die osmotische Fragilität der mPEG-behandelten roten Blutkörperchen ebenfalls unbeeinflußt. Gezeigt werden die Profile osmotischer Fragilität von Kontroll- und mPEG-modifizierten (3 und 6 mg/ml) roten Blutkörperchen nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C. Wiederum wurden, wenn auch eine sehr unbedeutende Zunahme in spontaner Lyse beobachtet wurde, keine Unterschiede von Signifikanz in den Profilen osmotischer Lyse gesehen. Elektronenmkroskopische Analyse von Kontroll- und mPEG-derivatisierten RBC demonstriert ebenfalls keine offensichtlichen Strukturveränderungen.
BEISPIEL III
Hemmung von Antikörperbindung:
mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen binden signifikant weniger anti-A-Antikörper (6). Wie in 6 gezeigt demonstriert ein ELISA-Assay von mPEG-behandelten menschlichen roten Blutkörperchen der Blutgruppe A signifikant weniger Antikörperbindung durch mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen. Die Kontroll- und mPEG-roten-Blutkörperchen wurden mit einem IgG-anti-A-Antikörper gemischt, für 30 Minuten inkubiert. Die Proben wurden ausgiebig gewaschen und ein sekundärer Antikörper (Antihuman-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase) wurde hinzugegeben, um gebundenen anti-Blutgruppe-A-Antikörper quantitativ zu bestimmen.
BEISPIEL IV
Hemmung von Phagozytose fremder Zellen:
mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen vom Schaf sind signifikant weniger anfällig für Phagozytose durch Monozyten von menschlichem peripheren Blut (7). Wie durch verringerte Antikörperbindung (6) angezeigt werden würde, sind mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen vom Schaf für IgG-vermittelte Phagozytose durch Monozyten von menschlichem peripheren Blut signifikant weniger empfindlich. mPEG-modifizierte rote Blutkörperchen vom Schaf wurden für 30 Minuten mit monozytischen Zellen von peripherem menschlichen Blut inkubiert. Die nicht aufgenommenen roten Blutkörperchen wurden durch hypotonische Lyse entfernt und die Anzahl von Monozyten enthaltenden roten Blutkörperchen vom Schaf ebenso wie die Anzahl von aufgenommenen roten Blutkörperchen vom Schaf wurde mikroskopisch bestimmt.
BEISPIEL V
mPEG-derivatisierte rote Blutkörperchen von der Maus haben normales in-vivo-Überleben:
Wie in 8 gezeigt wurden keine signifikanten Unterschiede im in-vivo-Überleben von roten Blutkörperchen der Kontrolle und roten Blutkörperchen, modifiziert mit entweder 3 oder 6 mg/ml aktiviertem mPEG, bemerkt. In-vivo-Überleben von Kontroll- und mPEG-modifizierten roten Blutkörperchen von der Maus wurden unter Verwendung einer fluoreszenten Fettsäuremarkierung (PKH-26; Sigma Chemical Company) bestimmt. Blut wurde von Spender-BALB/C-Mäusen erhalten, mit 0, 3 oder 6 mg/ml aktiviertem mPEG behandelt und dreimal gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann mit PKH-26 markiert und i.p. in gesunde BALB/C-Mäuse injiziert. Blutproben wurden durch Schwanzschnitte zu den angegebenen Zeitpunkten erhalten und durch FACScan analysiert.
BEISPIEL VI
mPEG-Derivatisierung von roten Blutkörperchen vom Schaf führt zu erhöhtem in-vivo-Überleben bei Mäusen:
Eine vergleichbare Anzahl von mPEG-modifizierten roten Blutkörperchen vom Schaf (mPEG-sRBC) wurde i.p. in BALB/C-Mäuse injiziert. Wie in 9 gezeigt zeigten mPEG-sRBC eine größere Rate des Eintritts in die periphere Zirkulation und demonstrierten längeres in-vivo-Überleben bei Mäusen. In-vivo-Überleben von mPEG-sRBC bei Mäusen wurde unter Verwendung einer fluoreszenten Fettsäuremarkierung (PKH-26; Sigma Chemical Company) bestimmt. Blut wurde von einem Spenderschaf erhalten und mit 0 oder 6 mg/ml aktiviertem mPEG behandelt und dreimal gewaschen. Die gewaschenen roten Blutkörperchen vom Schaf wurden mit PKH-26 markiert und i.p. in gesunde BALB/C-Mäuse injiziert. Blutproben wurden durch Schwanzschnitte zu den angegebenen Zeitpunkten erhalten und durch FACScan analysiert.
BEISPIEL VII
mPEG-modulierte Lymphozyten:
Die gemischte Lymphozytenkultur (MLC) ist ein sehr empfindliches Maß der Histokompatibilität zwischen Spender und Empfänger. In der Tat ist dieser Assay, obwohl zeitaufwendig, vielleicht der beste Indikator der Wahrscheinlichkeit des Überlebens von Gewebetransplantat in dem Organempfänger. In erster Linie mißt die MLC die Antigen-Varianz zwischen dem HLA-Komplex (die primären Antigene, verantwortlich für Gewebekompatibilität in Transplantaten) zwischen zwei Personen. Wie in 10 gezeigt führt kovalente Modifizierung mit mPEG von Lymphozyten von jedem Spender zu einer praktisch vollständigen Hemmung der Erkennung der antigen fremden Lymphozyten. Gezeigt wird die Proliferation, gemessen durch ³H-Thymidin-Einbringung in DNA, von Responder-Zellen in Response auf eine fixierte Konzentration (2,5 × 10⁵ PBMC) von Stimulator (d.h. Zellen, bestrahlt, um Zellreplikation zu verhindern). Tafel A demonstriert Response der PBMC von Spender A auf antigen fremde Spender-B-PBMC. Tafel B demonstriert die Response von Spender B auf Spender A. Im Gegensatz dazu expandiert die Population der Responder-(d.h. nicht bestrahlten)-Zelle in Response auf die unbestrahlten PBMC (einkernige Zellen von peripherem Blut) der Kontrolle in ungeheurem Maße.
Diese Ergebnisse werden weiter durch Mikrophotographien der gemischten Lymphozytenkulturen bestätigt. Extensive Proliferation, Zellausbreitung und ausdehnungsfähige Herde von Responder-Zellen werden in Response auf Stimulatorzellen der Kontrolle gesehen. Im Gegensatz dazu versagt die gleiche Population von Responder-Zellen dabei, m-PEG-behandelte Stimulator-Zellen zu erkennen, bleibt morphologisch unaktiviert und versagt dabei zu proliferieren.
BEISPIEL VIII
Modifizierung von Plättchen:
Andere Blutkörperchen sind ebenfalls für mPEG-Modifizierung zugänglich. Plättchen wurden bei pH 8,0 für 60 Minuten bei Raumtemperatur durch die Verfahrensweise von Beispiel 1 modifiziert. Die gestrichelte Linie stellt Plättchen-reiches Plasma (PRP) in Abwesenheit von ADP (d.h. unaktivierte Plättchen der Kontrolle) dar. Wie in 12 demonstriert wird, aggregieren mPEG-derivatisierte Plättchen in Response auf Aktivierung durch ADP (5 μM) nicht. Während Kontrollplättchen innerhalb von ungefähr 2 Minuten vollständig aggregiert sind, bleiben mPEG-modifizierte Plättchen sogar nach 7 Minuten Einwirkung von ADP unaggregiert. Der Verlust von Aggregation wird durch Zerreißung von Zell:Zell-Wechselwirkung (d.h. Verhinderung der Plättchenwechselwirkung und Mikroaggregatbildung) vermittelt. In der Tat ist die Veränderung in der Zell:Zell-Wechselwirkung ein primäres Ereignis, zurückzuführen auf die kovalente Modifizierung von Zellenoberflächen mit immunogenfreien Materialien.
Um zu bestimmen, ob nichthämatologische Zellen durch mPEG-Derivatisierung antigen modifiziert werden könnten, wurde eine Brustkrebs-Epithelzell-Linie (MCF7) untersucht. Ein monoklonaler Mäuse-Antikörper, gerichtet auf spezifisches Epithel-Antigen (ESA; ein 40 kD-Glycoprotein) wurde ausgewählt. Anti-humane Mäuse-ESA-Bindung wurde quantitativ unter Verwendung eines BD-FACScan bestimmt. FITC-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper wurde verwendet, um gebundenes ESA zu bestimmen. Die Epithelzellenkonzentration betrug 5 × 10⁵ Zellen/ml mit einem 1:6000-Titer von anti-ESA-Antikörper. Epithelzellen wurden unter Verwendung einer Modifizierung des RBC-Derivatisierungs-Protokolls derivatisiert. Speziell wurden zusammenfließende Monoschichten von MCF7-Zellen von Gewebekulturflaschen abgekratzt und in RPMI-Medien suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von aktiviertem mPEG bei pH 8,0 inkubiert und bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann vor dem Antikörperbindungsassay 3× mit Kulturmedien gewaschen.
Wie in 12 gezeigt, wurde eine mPEG-Dosis-abhängige Verringerung der ESA-spezifischen Antikörperbindung beobachtet. Bei der höchsten verwendeten mPEG-Dosierung (8 mg/ml Zellen) wurde eine > 70%-Abnahme in der anti-ESA-Bindung beobachtet.
BEISPIEL IX
Trennung von roten Blutkörperchen von menschlichem und tierischem Blut:
Schafsblut (Korea Medical, Republic of Korea), der Typ, von welchem nicht vom menschlichem Blut Typ AB (Korea National Red Cross, Republic of Korea) unterschieden wurde, wurde gesammelt und für fünf Minuten mit 1100 × g zentrifugiert. Plasma und weiße Blutkörperchen wurden abgetrennt, dann wurde der erhaltene Niederschlag in einer isotonischen Lösung mit 0,9% NaCl (nachstehend als „Kochsalzlösung" bezeichnet) resuspendiert und für fünf Minuten mit 120 × g zentrifugiert. Die roten Blutkörperchen wurden durch fünfmaliges Wiederholen dieses Vorgangs gewaschen. Schließlich wurde die Lösung für fünf Minuten mit 1100 × g zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die resultierenden konzentrierten roten Blutkörperchen (100% von der Kochsalzlösung (Vol./Vol.)) wurden bei 4°C gelagert.
BEISPIEL X
Chemische Modifizierung von roten Blutkörperchen mit mPEG:
Um die abgetrennten roten Blutkörperchen chemisch zu modifizieren, wurde die freie Hydroxylgruppe von mPEG wie folgt unter Verwendung von Cyanurchlorid als Aktivierungsmittel aktiviert. Zwanzig Gramm mPEG wurden in 160 ml wasserfreiem Benzol gelöst, auf 70°C erwärmt, dann wurden 5,6 g Cyanurchlorid und 4 g wasserfreies Kaliumcarbonat hinzugegeben und die Lösung wurde langsam gemischt und in einem Vakuumexsikkator bei Umgebungstemperatur für 16 Stunden umgesetzt. Hinterher wurde die Lösung unter Verwendung eines Sinterglasfilters filtriert, und 200 ml Petrolether wurden zu dem Filtrat hinzugegeben, um das mPEG auszufällen. Der resultierende weiße Niederschlag wurde wiederum unter Verwendung eines Sinterglasfilters filtriert und durch die Zugabe von 150 ml wasserfreiem Benzol gelöst. Nach mehr als sechsmaligem Wiederholen dieses Vorgangs, um jegliches unumgesetzte Cyanurchlorid vollständig zu entfernen, wurde das aktivierte mPEG zum letzten Mal ausgefällt, unter einem Vakuum getrocknet, in 1-g-Portionen geteilt, verschlossen, um das Eindringen von Feuchtigkeit zu verhindern, und bei –10°C gelagert.
Um rote Blutkörperchen unter Verwendung des synthetischen aktivierten mPEG von Beispiel X chemisch zu modifizieren, wurden vom Menschen oder Schaf stammende konzentrierte rote Blutkörperchen, hergestellt wie in Beispiel IX beschrieben, mit Kochsalzlösung verdünnt und auf 2% (Vol./Vol.) eingestellt. Unter Verwendung von pH-Titrimetrie wurde eine 0,5 M NaOH-Lösung langsam hinzugegeben, um den pH bei 9,2 zu halten. Indem 0, 0,5, 1, 2, 3, 4 und 5 mM aktiviertes mPEG, bezogen auf die Konzentration, hinzugefügt wurden, wurde die Lösung langsam gemischt und für eine Stunde bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Wenn die Reaktionen beendet waren, wurde die Lösung zentrifugiert, um die roten Blutkörperchen auszufällen, welche dann in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) suspendiert und wiederum zentrifugiert wurden. Die finalen roten Blutkörperchen wurden durch dreimaliges Wiederholen dieses Vorgangs Ausfällung-Suspendierung erhalten. Die Zellen wurden dann mit Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 20% (Vol./Vol.) verdünnt und bei 4°C gelagert.
BEISPIEL XI
Bestätigung der Verringerung der Agglutinierbarkeit von chemisch modifizierten roten Blutkörperchen:
Um zu bestimmen, ob chemisch modifizierte rote Blutkörperchen ungeachtet der Blutgruppe zur Transfusion verwendet werden können, wurde eine Untersuchung zu Blutgruppenantigen-Antikörper-Reaktionen unter Verwendung der folgenden Testverfahren Objektträgertest und Mikrovertiefungsausfällung durchgeführt. Der Objektträgertest ist ein Verfahren, bei welchem jeweils 100 μl von anti-A-, anti-B- und anti-D-(Rh)-Blutgruppenantikörpern auf einem Objektträger plaziert werden, nachfolgend 50 μl Probe jeweils von 20% (Vol./Vol.) roten Blutkörperchen vom Menschen oder Schaf, chemisch modifiziert wie in Beispiel X beschrieben, dann langsam für ungefähr eine Minute von Hand geschüttelt, bis Agglutination gesehen wird. Die Ergebnisse wurden photographiert, sobald sie visuell identifiziert wurden. Eine Verringerung der Agglutinierbarkeit wurde bei roten Blutkörperchen, behandelt mit 3 mM von mPEG, beobachtet. Ein Agglutinationstest unter Verwendung der roten Blutkörperchen vom Schaf erzeugte identische Ergebnisse.
Ein Mikrovertiefungsagglutinationstest wurde verwendet, um die Agglutination quantitativ zu bestimmen. Er kann die minimale Konzentration von Antikörpern, die Agglutination auslösen, identifizieren, weil Blutgruppenantikörper unter Verwendung serieller Verdünnung untersucht werden. Die Böden der in diesem Test verwendeten 96 Mikrovertiefungen hatten eine V-Form, was es leicht macht, das Vorhandensein von Agglutination während der Ausfällung zu identifizieren.
Anti-A-, anti-B- und anti-D-(Rh)-Blutgruppenantikörper wurden seriell um eine Hälfte verdünnt und 70 μl von jedem wurden in die Vertiefungen gegeben. Zwanzig μl der Testprobe von menschlichen roten Blutkörperchen, verdünnt mit 1% (Vol./Vol.), wurden in jede Vertiefung gegeben und für ungefähr zwei Stunden belassen. Die Mikrovertiefungsplatte wurde dann mit einer Vergrößerung von 20 unter einem umgekehrten Mikroskop untersucht. Der Grad der Agglutination von roten Blutkörperchen wurde quantitativ als die finale Konzentration (Verdünnungsverhältnis) von Antikörpern bestimmt, die den Zustand der Ausfällung zeigen, bei welchem sich keine Aggregate bildeten und rote Blutkörperchen die Wände hinabrollten, wobei sie sich auf den Böden der Mikrovertiefungen sammelten (siehe Tabelle 3).
Der Mikrovertiefungsausfällungstest (Antikörperbindungstest) wurde auch verwendet, um die Anzahl von Blutgruppenantikörpern zu bestimmen, die sich an die Oberfläche von roten Blutkörperchen binden. In Röhrchen, enthaltend 150 μl jeweils von den Blutgruppenantikörpern anti-A, anti-B und anti-D (Rh), wurden 40 μl der Testprobe von roten Blutkörperchen, verdünnt mit 1% (Vol./Vol.), gegeben. Diese wurden sorgfältig gemischt, dann für eine Stunde umgesetzt, bei Umgebungstemperaturen in dem Fall von anti-A- und anti-B-Blutgruppenantikörpern, bei 37°C in dem Fall von anti-D-(Rh)-Blutgruppenantikörpern. Danach wurden die anfänglich umgesetzten Antikörper durch Zentrifugieren entfernt; während die überstehende Flüssigkeit behalten und einer seriellen Verdünnung um eine Hälfte in den Mikrovertiefungen unterworfen wurde. Unmodifizierte rote Blutkörperchen wurden zu dieser Flüssigkeit gegeben (1% (Vol./Vol.)) und umgesetzt. Durch Verwendung unmodifizierter roter Blutkörperchen war es möglich, die Menge von restlichen Antikörpern zu messen, die sich in der anfänglichen Reaktion zwischen den Blutgruppenantikörpern und roten Blutkörperchen umgesetzt hatten (siehe Tabelle 3). Die Werte, die nachstehend in Tabelle 3 enthalten sind, zeigen Quantitäten von Blutgruppenantikörpern, bestimmt durch Verwendung roter Blutkörperchen vom Menschen. Werte aus diesen Agglutinationstests unter Verwendung roter Blutkörperchen vom Schaf sind nicht dargestellt, weil identische Ergebnisse erhalten wurden.
TABELLE 3 Das Ausmaß der Bindung von Blutgruppenantikörpern und Agglutination in Mikrovertiefungen von chemisch modifizierten roten Blutkörperchen, ausgedrückt als Verdünnungsverhältnis von Blutgruppenantikörpern
Wie in Tabelle 3 gesehen werden kann, haben chemisch mit mPEG modifizierte rote Blutkörperchen eine finale Aggregatkonzentration, die verglichen mit der der unmodifizierten Kontrolle beträchtlich reduziert ist. Aus der viel höheren Anzahl von Blutgruppenantikörpern, die in der überstehenden Flüssigkeit verblieben ist, wurde gefunden, daß mit mPEG chemisch modifizierte rote Blutkörperchen reduzierte Agglutinierbarkeit und unterdrückte Bindung von Blutgruppenantikörpern haben. Dies bedeutet, daß die Reduktion von Agglutinierbarkeit durch die Unfähigkeit der Blutgruppenantikörper, sich mit roten Blutkörperchen zu verbinden, verursacht wurde, die auf das mPEG zurückzuführen ist.
BEISPIEL XII
Untersuchung des Mechanismus der Reduktion der Agglutinierbarkeit in chemisch modifizierten roten Blutkörperchen:
Es wurde osmotischer Schock verwendet, um die Membran der chemisch modifizierten roten Blutkörperchen, beschrieben in Beispiel XI, abzutrennen, und die Membranproteine wurden unter Verwendung von 12% SDS-PAGE analysiert. In dem Fall der ABH-Antigengruppe, ein Membranprotein des roten Blutkörperchens, übertragend die Blutgruppenantigenität, wird im allgemeinen berichtet, daß Antigene in Kohlenhydraten wie beispielsweise das Glycophorin von Bande 3, Bande 4,5, PAS-1 und PAS-2 vorhanden sind. In dem Fall der Rh-Antigengruppe wird berichtet, daß Antigene in dem Protein vorhanden sind. Glycoprotein, ein ABH-Antigen, färbt mit der herkömmlichen Methode der Proteinfärbung, Coomassie-Blau, nicht gut, so wurde PAS (Periodsäurefärbung) verwendet.
Wenn die Konzentration von modifiziertem mPEG zunahm, verschwanden die Banden 3 und 4,5 und die Banden PAS-1 und PAS-2 allmählich, wobei allmähliche Ablagerung in den oberen Anteilen des Gels gezeigt wurde. Diese Verschiebung von Banden ist ein Ergebnis von mPEG-Bindung mit dem Membranprotein von roten Blutkörperchen. mPEG-Bindung findet nur an der Membranoberfläche statt und reagiert daher nicht mit den Banden 1 und 2, welche Spectrin, ein Protein aus dem Membraninneren, enthielten. Es wurde keine Verschiebung dieser Banden beobachtet. Es wurde daher gefunden, daß sich mPEG direkt mit diesen Membranproteinen verband, wobei eine Reduktion der Agglutinierbarkeit von Antigenen roter Blutkörperchen verursacht wurde. Ergebnisse, identisch mit den vorstehenden, wurden in einer Analyse gesehen, die unter Verwendung der roten Blutkörperchen vom Schaf durchgeführt wurde.
BEISPIEL XIII
Bestätigung der Sauerstofftransportaktivität von chemisch modifizierten roten Blutkörperchen:
Wenn Hämoglobin in roten Blutkörperchen sich mit Sauerstoff verbindet, teilt sich sein 560-nm-Peak des Absorptionsvermögens in Peaks von 540 nm und 576 nm. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Hemox Analyzer (TCS Medicals Co., USA), welcher automatisch diese Veränderung des Absorptionsvermögens mißt, verwendet, um entsprechend dem Verfahren, verwendet von Stetler et al., Bio/Technology, 9, 57 (1991), eine Sauerstoffdissoziationskurve zu erzeugen. Eine Probe zur Analyse wurde durch Hinzufügen von 10 μl Antischaummittel und 20 μl Zusatzstoff B zu 4 ml einer Hemox-Pufferlösung und Hinzufügen von 200 μl Lösung von 20% (Vol./Vol.) roten Blutkörperchen hergestellt. Diese Analysenprobe wurde für fünf Minuten in einem 37°C-Wasserbad plaziert, dann in einen Hemox Analyzer, gehalten bei 37°C, injiziert. Die Probe wurde durch Hinzufügen von Stickstoff durch einen mit der Maschine verbundenen Adapter vollständig von Sauerstoff befreit. Danach wurde eine Sauerstoffdissoziationskurve berechnet, während langsam 20% Sauerstoff injiziert wurden (siehe 13).
Die Sauerstoffdissoziationskurve zeigt den Grad der Bindung oder Dissoziation von Hämoglobin-Sauerstoff innerhalb der roten Blutkörperchen, basierend auf dem Partialdruck des gelösten Sauerstoffs (pO₂). 13 zeigt den Grad (%) von Sauerstofftransport zu Geweben, den n-Wert oder Hill-Koeffizienten, der kooperative Wirkung anzeigt, und den P₅₀-Wert, welcher Affinität mit Sauerstoff zeigt, alle aus der Sauerstoffdissoziationskurve in 13 berechnet. Wie in 13 gesehen werden kann, zeigen chemisch modifizierte rote Blutkörperchen eine Form der Sauerstoffdissoziationskurve, einen P₅₀-Wert, n-Wert und Sauerstofftransport zu Geweben ähnlich denen von unmodifizierten roten Blutkörperchen. Es wurde daher gefunden, daß mPEG, gebunden an rote Blutkörperchen, keine wesentliche Änderung in der Sauerstofftransportaktivität verursacht.
Die in dem folgenden Beispiel verwendete Methodik ist mit der identisch, die vorstehend in Beispiel 1 verwendet wurde, aber es werden andere funktionalisierte Polyethylenglycole (oder Derivate davon) verwendet.
Dieses Beispiel begründet das allgemeine Prinzip der antigenen Modulation von Zellen durch die kovalente Verknüpfung von immunogenfreien Materialien.
Die verwendeten Verbindungen sind wie folgt:
BEISPIEL XIV
Derivatisierung von Erythrozyten:
Vollblut (Mensch, Maus, Schaf, Ratte usw.) wird erhalten und 3× in isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Eine Suspension von roten Blutkörperchen (Hämatokrit von 12%) wird in isotonischem alkalischen Phosphatpuffer hergestellt (PBS; 50 mM K₂HPO₄ und 105 mM NaCl, pH 9,2). Die funktionalisierten Derivate von entweder Polyethylenoxid oder Polyoxyethylen werden hinzugegeben und die roten Erythrozyten werden für 30 Minuten bei 4°C inkubiert 3 mg der funktionalisierten Derivate wurden zu 1 ml eines 12%-Hämatokrit in PBS (wie vorstehend angegeben) hinzugegeben. Nach der Derivatisierung wurden die kovalent modifizierten Erythrozyten dreimal gewaschen und die Erythrozytenmikroaggregation wurde unter Verwendung eines Plättchen-Aggregometers gemessen (wie bei den mit Methoxypolyethylenglycol-Cyanurchlorid modifizierten Zellen). Ähnliche Verfahrensweisen, obwohl bei niedrigerem pH (z.B. pH 8,0), sind auch verwendet worden, um kernhaltige (epitheliale und endotheliale) Zellen zu modifizieren. In der Tat sind der pH, die Zeit- und Temperaturbedingungen, bei welchen die Modifizierungsreaktionen ausgeführt werden können (basierend auf dem Verknüpfer, z.B.: Cyanurchlorid versus Nitrophenylcarbonate) sehr dehnbar, was diese Erfindung somit für eine weite Vielfalt von Zelltypen anwendbar macht.
Wichtig ist, daß in allen vorstehenden Fällen die kovalente Modifizierung von intakten RBC mit immunogenfreien Materialien verschiedener Größen (Molekulargewichte von 3350, 5000 und 20000) unter Verwendung einer weiten Vielfalt von Verknüpfungen verringerte antigene Erkennung der Zellen demonstriert (wie durch verringerte RBC-Agglutination in Response auf Blutgruppenbestimmungs-Seren demonstriert).
Wie vorstehend ausführlich beschrieben und demonstriert wurde, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung roter Blutkörperchen bereit, bei welchen Agglutination, verursacht durch Antigen-Antiköper-Reaktionen, unterdrückt wird. Der Zugang von Blutgruppen- und Gewebe-spezifischen Antikörpern ist sterisch durch chemische Modifizierung durch die kovalente Bindung von nichttoxischen Polymeren von mPEG in dem Bereich um Blutgruppen- und Gewebe-spezifische Antigene herum auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen versperrt. Rote Blutkörperchen, chemisch modifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, können daher ungeachtet der Blutgruppe verwendet werden und haben ausreichend Sauerstofftransportaktivität. Folglich können sie auf allen medizinischen Gebieten, auf denen rote Blutkörperchen verwendet werden, für derartige Zwecke wie Notfallbluttransfusion und Transplantatorganlagerung verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung roter Blutkörperchen, chemisch modifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, kann ungeachtet der Blutgruppe auf alle Blutgruppenantigene angewendet werden. Das Verfahren ist sehr einfach und ökonomisch, was es in der Zukunft für die Gestaltung von Reaktoren zur Massenproduktion sehr vorteilhaft macht.
Die kovalente Modifizierung der äußeren Zellmembran mit immunogenfreien Materialien (z.B. mPEG) „verbirgt" wirksam sowohl Haupt- als auch Neben-Antigen-Bestimmungsmittel auf einer breiten Vielfalt von kernhaltigen und kernlosen Zellen. Das kovalente Verbinden immunogenfreier Materialien mit intakten Zellen (z.B. RBC, Endothelzellen, Epithelzellen, Pankreas-β-Zellen usw.) kann ebenfalls verwendet werden für: (1) Derivatisierung, durch Perfusion von mPEG-Lösungen, von menschlichen Organtransplantaten, um unerwartete hyperakute Abstoßungsepisoden zu verhindern; und (2) Derivatisierung – durch Perfusion von mPEG-Lösungen – von Organen von nichtmenschlichen Lebewesen, um hyperakute Abstoßung zu verhindern und die Chancen letztlich erfolgreicher Transplantation zu verbessern.
Obwohl bevorzugte Ausführungsformen hier ausführlich geschildert und beschrieben worden sind, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedenartige Modifizierungen, Hinzufügungen, Ersetzungen und dergleichen gemacht werden können, ohne von dem Geist der Erfindung abzuweichen, und diese werden daher als innerhalb des Bereichs der Erfindung angesehen, wie sie in den Ansprüchen, welche folgen, definiert ist.
LISTE DER ZITIERTEN DRUCKSCHRIFTEN

Abuchowski, A. et al. (1977a) Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol (Veränderung der immunologischen Eigenschaften von Rinderserumalbumin durch kovalente Anbindung von Polyethylenglycol). J. Biol. Chem., 252: 3358–3581.
Abuchowski, A. et al. (1977b) Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulatiog life of bovine liver catalase (Auswirkung kovalenter Anbindung von Polyethylenglycol auf Immunisierungsstärke und Zirkulationslebensdauer von Rinderleberkatalase). J. Biol. Chem., 252: 33823586.
Harris, J. M. et al. (1984) Synthesis and characterization of Polyethylene Glykol) Derivatives (Synthese und Charakterisierung von Poly(ethylenglycol)-Derivaten). J. Poly. Sci., 22: 341:352.
Harris, J. M. (1985) Laboratory Synthesis of Polyethylene Glycol Derivatives (Laborsynthese von Polyethylenglycolderivaten). Journal of Macromolecular Sciences Reviews in Macromolecular chemistry and Physics. C25: 325–373.
Jackson, C-J. et al. (1987) Synthesis, isolation and characterization of conjugates of ovalbumin with monomethoxypolyethylene glycol using cyanuric chlorid as the coupling agent (Synthese, Isolierung und Charakterisierung von Konjugaten von Ovalbumin mit Monomethoxypolyethylenglycol unter Verwendung von Cyanurchlorid als Kupplungsmittel). Anal. Biochem., 165: 114–127.
Klibanov, A. L. et al. (1991) Activity of amphipathic polyethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target (Aktivität von amphipatischem Poly(ethylenglycol) 5000 zur Verlängerung der Zirkulationszeit von Liposomen hängt von der Liposomgröße ab und ist ungünstig für Immunoliposombindung an das Ziel). Biochim. Biophys. Acta, 1062: 2782–1794.
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Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Application (Poly(ethylenglycol)-Chemie: Biotechnische und biomedizinische Anwendung). Harris, J. M., Herausgeber (1992), Plenum Press, NY.

Claims

Immunogenfreie zellulare Zusammensetzung bzw. Zelle (nachfolgend als "zellulare Zusammensetzung" bezeichnet), aufweisend: eine Säugetierzelle oder eine andere Zelle mit einer Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmitteln) auf der Zellenoberfläche; eine immunogenfreie Zusammensetzung, die mit der Zellenoberfläche kovalent direkt oder mittels Verknüpfungskomponenten verbunden ist, so dass eine Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche (bzw. der antigenen Natur der Zellenoberfläche) durch die immunogenfreie Verbindung blockiert ist.
Zellulare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die immunogenfreie Verbindung ein Polyalkylenglykol ist.
Zellulare Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die immunogenfreie Verbindung ein Methoxypolyethylenglykol ist.
Zellulare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die immunogenfreie Verbindung Dextran, Ficoll oder Arabinogalactan ist.
Zellulare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein rotes Blutkörperchen ist.
Zelluläre Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Antigen-Bestimmungsmittel ein Blutgruppen-Antigen-Bestimmungsmittel umfassen.
Zellulare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die genannte Zelle eine vaskulare Endothelzelle, eine Leberzelle, eine Neuronalzelle, eine Pankreaszelle oder eine Epithelzelle ist.
Verfahren zum Immunogenfreimachen einer Säugetierzelle oder einer anderen Zelle mit einer immunogenen Oberfläche, wobei das Verfahren aufweist: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so dass die immunogenfreie Verbindung die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche (oder der antigenen Natur der Zellenoberfläche) blockiert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Verknüpfungskomponente kovalent mit den Antigen-Bestimmungsmitteln auf der Zellenoberfläche oder mit der Zellenoberfläche anders als durch die Antigen-Bestimmungsmittel verbunden wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zelle ein rotes Blutkörperchen ist.
Immunogenfreie Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 10 zur Transfusion in eine menschliche Person.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zelle einen Teil eines Gewebes oder eines Organs ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine vaskulare Endothelzelle ist, die eine freiliegende Antigen-Oberfläche des Gewebes oder des Organs bildet.
Säugetierzelle zum Einbau in ein Säugetier, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist, wobei die Zelle durch ein Verfahren behandelt worden ist, das die Schritte aufweist: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so dass die immunogenfreie Verbindung die Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche (oder der antigenen Natur der Zellenoberfläche) blockiert und die Zelle immunogenfrei macht; wobei Phagozytose, eine komplementvermittelte Zerstörung oder eine zellenvermittelte Zerstörung der resultierenden immunogenfreien Zelle reduziert werden, wenn diese in das Säugetier eingebracht wird.
Rotes Blutkörperchen zum Transfundieren in ein Säugetier, wobei das rote Blutkörperchen eine Zellenoberfläche und Blutgruppen-Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist, wobei die Zelle durch ein Verfahren behandelt worden ist, das die Schritte aufweist: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so dass die immunogenfreie Verbindung die Erkennung der Blutgruppen-Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche (oder der antigenen Natur der Zellenoberfläche) blockiert, und ein immunogenfreies rotes Blutkörperchen erzeugt; wobei eine ungünstige Reaktion auf das Transfundieren des immunogenfreien roten Blutkörperchens verringert wird, wenn dieses in das Säugetier transfundiert wird.
Säugetierzelle zum Transplantieren in ein Säugetier, wobei die Zelle eine Zellenoberfläche und Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche aufweist, wobei die Zelle durch ein Verfahren behandelt worden ist, das die Schritte aufweist: kovalentes Verbinden einer Menge einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche direkt oder mittels einer Verknüpfungskomponente, so dass die immunogenfreie Verbindung die Erkennung der Antigen-Bestimmungsmittel auf der Zellenoberfläche (oder der antigenen Natur der Zellenoberfläche) blockiert; wobei ein Abstoßen der resultierenden immunogenfreien Zelle verringert wird, wenn diese in die Säugetierzelle transplantiert wird.
Verfahren zum Verringern der Antikörper-induzierten Aggregation von Säugetierzellen mit Zellenoberflächen, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: kovalentes Verbinden einer immunogenfreien Verbindung mit der Zellenoberfläche von jeweils einer Population von Zellen direkt oder mittels Verknüpfungskomponenten, so dass die immunogenfreie Verbindung die Erkennung von Antigen-Bestimmungsmittel der Zellenoberfläche (oder der antigenen Natur der Zellenoberfläche) blockiert, um nicht-aggregierende Zellen zu erzeugen, wobei die Antikörper-induzierte Aggregation der nicht-aggregierenden Zellen im Vergleich zu einer Antikörper-induzierten Aggregation von Zellen vor dem Verbinden mit der Verbindung verringert wird.