DE69731473T2

DE69731473T2 - Verwendung von steroiden zur behandlung von asthma und atemwegerkrankungen

Info

Publication number: DE69731473T2
Application number: DE69731473T
Authority: DE
Inventors: Alastair G. Stewart
Original assignee: Amrad Operations Pty Ltd
Current assignee: CSL IP Investments Pty Ltd
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2017-05-10
Also published as: CN1218401A; EP0923376A4; CN1245982C; EP0923376A1; DE69731473D1; CA2253943C; JP4228116B2; US6200966B1; EP0923376B1; US5962445A; ATE281170T1; JP2000507923A; WO1997042958A1; CA2253943A1

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von spezifischen Steroiden oder Steroidanaloga für die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung einer chronischen und akuten Entzündung der Atemwege einschließlich asthmatischer Zustände. Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die diese Verbindungen als Wirkstoff umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt die Wirkstoffkomponente eine Entzündung und die Proliferation von glatten Muskelzellen in der Atemwegswand. Sie kann auch mindestens eine andere Aktivität, ausgewählt aus Antiangiogenese, Antioxidation und der Fähigkeit, die Mikrotubulusbildung zu unterbrechen, besitzen.
Hintergrund der Erfindung
Gegenwärtig werden zwei verschiedene Klassen von Mitteln bei der Behandlung von Asthma verwendet. Eine symptomatische Linderung wird durch die Verwendung von Bronchodilatatoren bereitgestellt, welche die β₂-Adrenozeptor-Agonisten wie Salbutamol und Salmeterol einschließen. Andere Mittel mit broncho-dilatatorischen Eigenschaften schließen den Muskarinrezeptor-Antagonisten Ipratropiumbromid und Phosphodiesterase-Hemmstoffe wie Theophyllin ein.
Die zweite Klasse von Mitteln ist prophylaktisch wirksam und schließt Glucocorticoide wie Beclomethasondipropionat ein. Dinatriumcromoglycat und Nedocromilnatrium werden auch verwendet, obwohl diese weniger wirksam als die Glucocorticoide sind.
Jedoch wirkt keines dieser Mittel der Überempfindlichkeit der Atemwege völlig entgegen oder verhindert katastrophale lebensbedrohende und letale Asthmaanfälle bei allen Patienten. Der Sachverhalt, dass diese Zustände die Oberhand gewinnen und zuweilen die Todesursache sind, hebt die Tatsache hervor, dass die Vorteile durch diese Mittel suboptimal sind.
Asthma wird nun als eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege angesehen, die durch eine eosinophile Bronchitis gekennzeichnet ist [Frigas et al., 1991]. Gemeinsam mit anderen chronischen entzündlichen Erkrankungen ruft die Entzündung bei Asthma einen Gewebeumbau hervor, der in den Atemwegen bei postmortalen Studien [Dunnill et al., 1969] und durch eine Bronchialbiopsie von lebenden Spendern [Brewster et al., 1990; Bai & Pare, 1995] dokumentiert worden ist. Der Umbau beinhaltet: eine epitheliale Schorfbildung; eine deutliche Einwanderung von Eosinophilen in die Schleimhaut; eine Aktivierung von Mastzellen und Lymphocyten; eine Vergrößerung von Schleimdrüsen; eine Ablagerung von Kollagen vom Wundtyp unmittelbar unter der eigentlichen Basalmembran des Epithels und in der gesamten Schleimhaut; und eine Erhöhung der Anzahl an Myofibroblasten. Zusätzlich wird eine Zunahme des Volumens und der Anzahl an Blutgefäßen in asthmatischen Atemwegen beobachtet, was darauf hinweist, dass der Umbauprozess von einer Angiogenese begleitet ist [Kuwano et al., 1993]. Das Gesamtvolumen der Atemwegswand ist erhöht [James et al., 1989], was mit einer Zunahme des Volumens der glatten Muskulatur der Atemwege assoziiert ist [Kuwano et al., 1993], woraus sowohl hypertrophische als auch hyperplastische Reaktionen resultieren [Ebina et al., 1993].
Eine Überempfindlichkeit der Atemwege (AHR) ist die übermäßige broncho-konstriktive Antwort von Asthmapatienten auf eine Reihe von verschiedenen Reizen. Die Auffassung, dass die Verdickung der Atemwegswand für die Entwicklung einer AHR die Hauptursache ist, hat während den letzten 10 Jahren an Akzeptanz gewonnen. Durch Studien an mathematischen Modellen ist gezeigt worden, dass die Verdickung der Atemwege die Folgen einer Verkürzung der glatten Muskulatur verstärkt – dabei errechnet sich, dass ein bestimmtes Ausmaß der Verkürzung der glatten Muskulatur eine viel größere Erhöhung des Atemwegswiderstands bei Asthmatikern im Vergleich zu gesunden Individuen ergibt (z. B. ergibt eine Verkürzung um 40% eine 15-fache Erhöhung bei gesunden Individuen, aber eine 290-fache Erhöhung bei Asthmatikern) [James et al., 1989]. Die Fläche der Atemwegswand ist um 50–250% vergrößert, wobei höhere Zunahmen in den größeren Atemwegen beobachtet werden [James et al., 1989]. Der Muskel nimmt um das 2–3-fache an Volumen zu, und das Ausmaß der Zunahme steht mit der Schwere des Asthmas in Beziehung [Kuwano et al., 1993]. Die Art der Veränderung ist nicht umfassend untersucht worden, aber sie umfasst sowohl eine Hyperplasie als auch eine Hypertrophie [Ebina et al., 1993]. Nach längerer Allergenvermeidung durch allergische Asthmatiker ist eine Verringerung der Empfindlichkeit der Atemwege auf die bei gesunden Individuen beobachteten Werte nachgewiesen worden, wobei dies mit einer Rückbildung der Symptome verbunden ist [Platts-Mills et al., 1987]. Studien wie diese stehen im Einklang mit der Annahme, dass die strukturellen Veränderungen in den asthmatischen Atemwegen auch reversibel sind.
Diese langfristigen Veränderungen in den asthmatischen Atemwegen stellen neue Ziele für ein therapeutisches Eingreifen bereit [Stewart et al., 1993]. Folglich bestand ein erhebliches Interesse daran, den Mechanismen für diese Umbaureaktion der Atemwegswand und den Einfluss von vorhandenen Antiasthma-Arzneistoffen auf diese Prozesse zu identifizieren. Eine große Zahl von Faktoren ist als Mitogen für gezüchtete glatte Muskeln der Atemwege aus verschiedenen Spezies einschließlich des Menschen etabliert worden [vgl. Stewart et al., 1995a, für eine Übersicht]. Wie erwartet, sind Reize, die zur Familie der Wachstumsfaktoren gehören, einschließlich basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), von Thrombocyten gebildeter Wachstumsfaktor (PDGF_BB) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), die wirksamsten proliferativen Mittel [Hirst et al., 1992; Stewart et al., 1995a]. Thrombin ist auch ein wirksamer Wachstumsfaktor [Tomlinson et al., 1994], während Bronchokonstriktoren wie Endothelin-1 und das Thromboxan A₂-Mimetikum U46619, nur schwach aktiv sind und einige andere Konstriktoren wie Histamin und Neurokinine völlig inaktiv sind [Stewart et al., 1995a].
Bei gezüchteten menschlichen glatten Muskelzellen der Atemwege verringert die kontinuierliche Aussetzung gegen β-Adrenozeptor-Agonisten die proliferativen Reaktionen auf einen großen Bereich von Mitogenen einschließlich Thrombin, EGF und dem Thromboxan A₂-Analogon U46619 [Tomlinson et al., 1994; 1995]. Ferner haben Dexamethason und andere entzündungshemmende Steroide auch eine antiproliferative Wirkung auf gezüchtete glatte Muskelzellen der Atemwege [Stewart et al., 1995b], aber die Größenordnung der Hemmung hängt von dem Mitogen ab, das die Proliferation zunächst stimuliert. Es ist auch wichtig anzumerken, dass die Langzeitbehandlung mit inhalierten entzündungshemmenden Steroiden nur eine mäßige Verringerung der AHR hervorruft [Sotomayor et al., 1984; Lungren et al., 1988], während über β₂-Agonisten berichtet wird, dass sie entweder keine Wirkung haben oder die AHR verstärken [Wahedna et al., 1993]. Folglich weisen die zwei am häufigsten verwendeten und wirksamten Arzneistoffklassen für die Behandlung von Asthma suboptimale Wirkungen bei einer AHR auf, und daher ist es unwahrscheinlich, dass sie bei der Regulierung der strukturellen Veränderungen in Verbindung mit dem Umbau der Atemwege, die zu dem Fortschreiten und der Entwicklung des Zustands beitragen, wirksam sind.
Die Anmelder haben mögliche Verfahren untersucht, um den Umbauprozess aufzuhalten oder zu modulieren, haben überraschenderweise ein Steroid und Analoga davon identifiziert, die für diesen Zweck geeignet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
2-Methoxyoestradiol ist ein natürlicher Metabolit von 17β-Oestradiol, dem physiologisch wirksamen Oestrogen bei Menschen.
Es wird in einem zweistufigen Prozess hergestellt, der die Hydroxylierung von Oestrogen zur Herstellung eines Catecholoestrogens, gefolgt durch eine Methoxylierung zur Herstellung des entsprechenden Methoxyoestrogens über einen induzierbaren Cytochrom p450-Weg beinhaltet [Spink et al., 1994]. Obwohl 2-Methoxyoestradiol bisher als biologisch inaktiv angesehen wurde [Rosner et al., 1991], ist in Zellkulturstudien nachgewiesen worden, dass es die Proliferation von bestimmten transformierten Zelllinien [Lottering et al. 1992] und von aktiv proliferierenden oder nicht-ruhenden Endothelzellen und Fibroblasten [Fotsis et al., 1994] hemmt. Fotsis et al. zeigten auch, dass die Verabreichung von 2-Methoxyoestradiol das Wachstum von Tumoren durch Suppression der tumorinduzierten Angiogenese anstatt durch die direkte Hemmung der Tumorzellproliferation hemmte. Es wurde angenommen, dass die Verbindung den Abbau der Basalmembran verringert, wodurch die Zellmigration in die extrazelluläre Matrix verhindert wird, was es zu einem möglichen antiangiogenen Mittel für die Behandlung von festen Tumoren oder angiogenen Erkrankungen macht. Die Hemmung der Gefäßneubildung bei Tumoren wurde auch bei Klauber et al., 1997, gezeigt.
Die antiproliferativen Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol auf gezüchtete glatte Muskelzellen aus der Aorta eines Kaninchens [Nishigaki et al., 1995] deuteten auch auf die Nützlichkeit dieser Verbindung bei der Verhinderung einer Progression von Atherosklerose hin, einer Erkrankung, die durch zelluläre Ereignisse verursacht wird, welche sich von denjenigen unterscheiden, die bei Asthma und einer AHR beobachtet werden.
Der Mechanismus der antiproliferativen Wirkungen ist noch nicht ermittelt worden. Lottering et al. (1992) nahmen an, dass eine Erhöhung von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) die Hemmwirkungen von 2-Methoxyoestradiol auf die DNA-Synthese erklärt, während die Hemmung der Mikrotubulusaggregation während der Spindelbildung bei der Mitose als Grund für die Hemmwirkungen auf die Zellteilung angesehen wird [Fotsis et al., 1994]. Die anderen biologischen Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol sind nicht umfassend charakterisiert worden. In Kulturen von Endometriumzellen des Schweins hemmt 2-Methoxyoestradiol die Synthese von PGF_2α [Zhang & Davis, 1992]. Nichtgenomische Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol schließen die Disruption von Mikrotubuli über die Bindung an die Colchicinstelle auf Tubulin [D'Amato et al., 1994; Aizu-Yokota et al., 1995] und die Entspannung von vaskulären glatten Muskelzellen [Goyache et al., 1995] ein.
In der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO95/04535 sind Oestradiolderivate offenbart, die antimitotische Wirkungen durch die Hemmung der Tubulinpolymerisation in vitro ausüben. Aus diesen in vitro-Studien wird gefolgert, dass die Verbindungen die Proliferation von Endothelzellen hemmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol und die Hemmung der Aktivierung von Entzündungszellen. Sie betrifft insbesondere die Behandlung von oder die Vorbeugung vor Atemwegserkrankungen wie Asthma.
Keines der vorstehend erwähnten Dokumente legt die Erfindung nahe oder offenbart sie. Zum Beispiel kann die Hemmung der Proliferation von glatten Muskelzellen und der Aktivierung von Entzündungszellen in den Atemwegen nicht durch die in WO95/04535 beschriebenen in vitro-Beobachtungen vorhergesagt werden, und der Mechanismus dieser Aktivitäten scheint nicht mit den Wirkungen auf die Mikrotubulusaggregation in Beziehung zu stehen.
Die antiproliferative Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf vaskuläre glatte Muskelzellen des Kaninchens [Nishigaki et al., vorstehend] kann auch nicht auf die glatten Muskelzellen der Atemwege übertragen werden, da es bekanntermaßen Unterschiede hinsichtlich der Empfindlichkeit der Zellen aus diesen zwei verschiedenen Quellen gibt.
Einige Mittel, welche die Proliferation von Endothelzellen erhöhen, z. B. Heparin, hemmen eigentlich die Proliferation von glatten Muskelzellen in den Atemwegen. Daher deuten die antiproliferativen Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol bei Endothelzellen [Fotsis et al., WO95/04535, vorstehend] nicht darauf hin, dass glatte Muskelzellen auf die gleiche Weise antworten würden.
Die Anmelder haben festgestellt, dass 2-Methoxyoestradiol die Freisetzung von Myeloperoxidase aus polymorphkernigen Leukocyten, die aus menschlichem peripherem Blut erhalten wurden, sowie die phagocytische Aktivität dieser Zellen hemmt. Die Verringerung der phagocytischen Aktivität in diesen Zellen liefert einen Beweis für die entzündungshemmenden Eigenschaften davon. Dies ist überraschend, insbesondere weil nicht bekannt ist, dass 2-Methoxyoestradiol eine wesentliche Affinität für Glucocorticoid- oder für Oestrogen-Rezeptoren hat [Merriam et al., 1980].
Diese Eigenschaften machen 2-Methoxyoestradiol und verwandte Verbindungen bei der Behandlung von Zuständen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Asthma, chronisch-obstruktive Atemwegserkrankungen und andere Atemwegserkrankungen, die durch eine Entzündung gekennzeichnet sind, nützlich. Andere Zustände, die für eine Behandlung unter Verwendung von im Einklang mit der Erfindung hergestellten Arzneimitteln zugänglich sind, schließen zum Beispiel Emphysem, Lungenentzündung oder Atemwegserkrankungen, die durch proliferative und/oder entzündliche Zustände gekennzeichnet sind, z. B. eine Neutrophileninfiltration, oder Lungeninfektionskrankungen, wobei die Symptome oder Folgeerscheinungen davon aus der Aktivierung von dort vorkommenden und entzündlichen Zellen resultieren, ein.
Zustände wie allergische Rhinitis können ebenfalls behandelt werden, da die Anmelder auch festgestellt haben, dass 2-Methoxyoestradiol die Degranulation der mit Mastzellen verwandten Zelllinie RBL2H3 hemmt. Diese Hemmwirkung von 2-Methoxyoestradiol war für die durch Antigen stimulierte Freisetzung selektiv, da die Antwort auf den Proteinkinase C-Stimulator PMA und auf das Calciumionophor A23187 nicht beeinflußt wurde. Folglich ist die Wirkung auf die Antigenfreisetzung wahrscheinlich nicht das Ergebnis einer unspezifischen Wirkung auf die Mikrotubulus-abhängige Granulaextrusion. Die Ergebnisse der Anmelder zeigen, dass 2-Methoxyoestradiol und verwandte Steroide, die diese Aktivitäten aufweisen, zur Behandlung von allergischen Zuständen nützlich sind, die Rhinitis und atopische Hautzustände einschließen, aber nicht darauf begrenzt sind. Ohne an eine bestimmte Wirkungsweise gebunden zu sein, legen diese Daten nahe, dass spezifische Signalübermittlungsmechanismen in Verbindung mit Rezeptoren beteiligt sind und zu der Hemmung einer Entzündung in den Atemwegen beitragen.
Die Anmelder haben ferner festgestellt, dass 2-Methoxyoestradiol die DNA-Synthese und die Zellteilung in glatten Muskelzellen der Atemwege, die durch eine Reihe von Wachstumsfaktoren einschließlich FCS und bFGF stimuliert wird, hemmt. Zusätzlich werden die durch Serotonin stimulierten Steigerungen hinsichtlich der Proteinsyntheseraten durch 2-Methoxyoestradiol gehemmt, woraus sich die Möglichkeit für antihypertrophe Wirkungen zusätzlich zur Hemmung der Zellproliferation ergibt. Die Beobachtungen der Anmelder zusammen mit der antiangiogenen Aktivität von 2-Methoxyoestradiol zeigen, dass diese Verbindung und verwandte Verbindungen einen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen, die durch eine Entzündung gekennzeichnet sind, wie vorstehend beschrieben, und insbesondere bei der Behandlung von chronischem Asthma durch den besonderen Einfluss auf den Umbau der Atemwegswand und daher auf die Überempfindlichkeit der Atemwege haben können. Analoga von 2-Methoxyoestradiol wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die DNA-Synthese zu hemmen, und die Ergebnisse zeigen, dass diese auch einen therapeutischen Nutzen haben können.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Steroids oder eines Steroidanalogons, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Methoxyoestradiol, 2-Hydoxyoestradiol, 2-Methoxyoestron, 2-Methoxy-oestradiol-3-methylether und 4-Methoxyoestradiol, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die durch eine chronische oder akute Entzündung der Atemwege gekennzeichnet ist, bereit. Solche Steroide oder Steroidanaloga besitzen die Fähigkeit, den Umbau der Atemwege in einem Säuger zu modulieren, der eine solche Behandlung benötigt. Vorzugsweise ist der Säuger ein Mensch, eine Katze, ein Pferd oder ein Rind und mehr bevorzugt ein Mensch. Das Steroid 2-Methoxyoestradiol wird zur Verwendung im Einklang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt. Steroide oder Analoga davon, die keine wirksame Glucocorticoidaktivität bei der Dosierungsmenge zeigen, welche im Einklang mit dieser Erfindung verwendet wird, werden besonders bevorzugt.
Vorzugsweise hemmt das im Einklang mit der Erfindung verwendete Steroid die phagocytische Aktivität, bevorzugt von polymorphkernigen Leukocyten. Vorzugsweise wird auch die Freisetzung von Myeloperoxidase aus den Leukocyten gehemmt. Die Aktivierung von Makrophagen kann auch gehemmt werden.
Besonders bevorzugt moduliert das im Einklang mit der Erfindung verwendete Steroid ferner den Umbau der Atemwege durch die Hemmung der Proliferation von glatten Muskelzellen und einer Entzündung. Der Umbau kann ferner durch die Hemmung einer oder mehrerer Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Angiogenese, Bildung von Oxidantien und Mikrotubulusfunktion, in der Atemwegswand moduliert werden, d. h. das Steroid besitzt eine antiangiogene Aktivität und/oder Antioxidansaktivität und/oder die Fähigkeit, Mikrotubuli in der Atemwegswand zu zerstören.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zu behandelnde Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asthma, Überempfindlichkeit der Atemwege, Bronchokonstriktion, Emphysem, Lungenentzündung, atopischer Erkrankung wie allergische Rhinitis und Lungeninfektion.
Das erfindungsgemäß verwendete Steroid oder Steroidanalogon besitzt vorzugsweise die Fähigkeit, die Proliferation von glatten Muskelzellen in den Atemwegen, insbesondere als Antwort auf einen mitogenen Reiz, zu hemmen.
Das erfindungsgemäß verwendete Steroid oder Steroidanalogon zeigt keine Glucocorticoidaktivität.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein Steroid oder Steroidanalogon, wie vorstehend beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und Excipienten umfasst, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation angepaßt ist. Im Einklang mit der Erfindung hergestellte Arzneimittel für eine Behandlung können einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und Excipienten enthalten. Beispiele solcher Träger und Excipienten schließen trocken mikronimierte Pulver zusammen mit Lactose oder vor kurzem entwickelte Hydrofluoralkane ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Die im Einklang mit der Erfindung hergestellten Arzneimittel können in Formulierungen zur Verabreichung über einen üblichen Weg, der bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen oder Asthma verwendet wird, zum Beispiel durch topische, orale oder nasale Verabreichung oder durch Inhalation, verwendet werden. Diese Formulierungen können in einer herkömmlichen Form wie Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse, Tabletten, Aerosole, pulverisierte Granula, mikronimierte Teilchen oder als eine Lösung vorliegen. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind zur Verabreichung durch Inhalation angepaßt. Gegebenenfalls kann das Steroid oder das Steroidanalogon mit Cyclodextrin komplexiert sein und kann auch in Form eines Esters, der mit einer pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet wird, wie ein Sulfat, Acetat, Benzoat oder dergleichen, vorliegen. Ein Fachmann ist unter Bezugnahme auf Standardtexte wie Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, in der Lage, herauszufinden, wie die Formulierungen hergestellt werden und wie diese verabreicht werden können.
Die Dosis des zu verabreichenden Steroids oder Steroidanalogons hängt von dem zu behandelnden Zustand und dem Verabreichungsweg ab und liegt im Ermessen des behandelnden Arztes oder Tierarztes. Eine solche Person ist ohne weiteres in der Lage, eine geeignete Dosis, Verabreichungsweise und -häufigkeit zu festzulegen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann zur Behandlung von Zuständen einer chronischen oder akuten Entzündung der Atemwege einschließlich Asthma, Überempfindlichkeit der Atemwege (AHR) oder Bronchokonstriktion verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Arzneimittel oder die Zusammensetzung der Erfindung 2-Methoxyoestradiol, das eine Entzündung und die Proliferation von glatten Muskelzellen in der Atemwegswand eines Asthmapatienten hemmt.
Obwohl die Erfindung unter besonderer Bezugnahme auf 2-Methoxyoestradiol beschrieben wird, ist selbstverständlich, dass Analoga dieser Verbindung, welche die erforderlichen biologischen Aktivitäten aufweisen, auch im Einklang mit der Erfindung verwendet werden können. Diese sind 2-Hydoxyoestradiol, 2-Methoxyoestron, 2-Methoxy-oestradiol-3-methylether und 4-Methoxyoestradiol.
Eine Vielzahl von Verbindungen ist als ein Oestradiolderivat mit einer antiproliferativen und/oder antiangiogenen Aktivität in anderen Geweben identifiziert worden. Vgl. zum Beispiel WO95/04535.
Für die Zwecke dieser Beschreibung sollen die Begriffe "Steroid", "Steroidanalogon" oder "steroidähnlich" 2-Methoxyoestradiol, 2-Hydoxyoestradiol, 2-Methoxyoestron, 2-Methoxy-oestradiol-3-methylether und 4-Methoxyoestradiol umfassen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun nur anhand eines Beispiels unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren ausführlich beschrieben, wobei:
1 das Fehlen einer Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die durch Meerrettichperoxidase vermittelte Oxidation von Tetramethylbenzidin zeigt.
2 die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol (0,3–10 μM, 30 min Vorbehandlung) auf den Mitogen induzierten Einbau von [³H]-Thymidin in gezüchteten menschlichen glatten Muskelzellen der Atemwege zeigt. Die getesteten Mitogene waren 0,3 E/ml Thrombin, 1% FCS, 300 pM bFGF (2a), 10% FCS und 3 nM EGF (2b). Weitere Experimente mit einer entsprechenden Anordnung wie der in 2a und b veranschaulichten wurden ausgeführt, und die Kombination der letzteren Daten und derjenigen in den 2a und b ist in 2c wiedergegeben. Der zeitliche Verlauf der Wirkung von 2-Methoxyoestradiol (3 μM) auf die durch Thrombin (0,3 E/ml) induzierte DNA-Synthese wurde auch untersucht (2d). Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidin-Einbaus in nicht vorbehandelte Zellen angegeben.
3 die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol (0,3–10 μM, 30 min Vorbehandlung) auf den Mitogen induzierten Einbau von [³H]-Leucin zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz des [³H]-Leucin-Einbaus in nicht vorbehandelte Zellen angegeben.
4 die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol (0,3–10 μM, 30 min Vorbehandlung) auf die Zellzahl in Anwesenheit von (a) FCS (1%) oder (b) bFGF (300 pM) zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz der Erhöhung der Zellzahl bei nicht vorbehandelten Zellen angegeben.
5 die Wirkung des Steroidrezeptor-Antagonisten RU486 (1 μM) auf die 2-Methoxyoestradiol (3 μM)-Hemmung der durch FCS (1%) induzierten DNA-Synthese zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidin-Einbaus in nicht vorbehandelte Zellen angegeben. RU486 wurde 30 min vor 2-Methoxyoestradiol zugegeben, das 30 min vor FCS zugesetzt wurde.
6 die Wirkung von 17β-Oestradiol und 2-Hydroxyoestradiol (0,3–10 μM, 30 min Vorbehandlung) auf den durch FCS (1%) induzierten Einbau von [³H]-Thymidin zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidin-Einbaus in nicht vorbehandelte Zellen angegeben. Um den Vergleich zu erleichtern, sind die mit 2-Methoxyoestradiol in Beziehung stehenden Daten aus 1 wiedergegeben.
7 die Wirkungen von 2-Methoxyoestron und 2-Methoxyoestriol (0,3–10 μM, 30 min Vorbehandlung) auf den durch Thrombin (0,3 E/ml) induzierten Einbau von [³H]-Thymidin zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichungen der Mittelwerte aus drei Experimenten in drei verschiedenen Kulturen dargestellt und sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidin-Einbaus in nicht vorbehandelte Zellen angegeben. Um den Vergleich zu erleichtern, sind die mit 2-Methoxyoestradiol in Beziehung stehenden Daten aus 2a wiedergegeben.
8 die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Superoxidanionen-Freisetzung in peritonealen Makrophagen des Meerschweinchens zeigt. Diese Verbindung blockiert die Superoxidanionen-Antwort der Makrophagen auf Zymosan vollständig und verringert diejenige auf fMLP.
9 die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Prostacyclin-Freisetzung in peritonealen Makrophagen des Meerschweinchens zeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Oestradiol die Makrophagen-Antwort auf fMLP vollständig blockiert, während die Antwort auf PMA um 50% gehemmt wurde.
10 ein Diagramm ist, das die Wirkungen von verschiedenen Konzentrationen von Ovalbumin (DNP-OA) auf die Degranulation von Mastzellen (RBL2H3) und die Hemmung durch 2-Methoxyoestradiol zeigt.
11 zeigt, dass 2-Methoxyoestradiol die durch Ovalbumin (DNP-OA) stimulierte Freisetzung von [³H]-5HT aus peritonealen Makrophagen des Meerschweinchens verringerte, aber nicht die Freisetzung als Antwort auf PMA beeinflusste.
Abkürzungen

Die hierin verwendeten Abkürzungen sind wie folgt:

AHR	Überempfindlichkeit der Atemwege
bFGF	basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor
DNP-OA	Dinitrophenoyl behandeltes Ovalbumin
EGF	epidermaler Wachstumsfaktor
fMLP	Formylmethionylleucyl-Phenylalanin
PDGF	von Thrombocyten gebildeter Wachstumsfaktor
PMA	Phorbolmyristatacetat
5HT	Serotonin

Allgemeine Methoden
Zellkultur
Menschliche bronchiale glatte Muskelzellen der Atemwege wurden aus makroskopisch normalen Lungenresektionsproben von Lungentransplantat-Spendern oder -Empfängern, die durch das Alfred Hospital (Melbourne) bereitgestellt wurden, erhalten. Die Kulturen wurden hergestellt, wie bereits ausführlich beschrieben worden ist (Tomlinson et al., 1994). Kurz zusammengefasst wurde das Gewebe in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) [supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Streptomycin, 100 E/ml Penicillin-G, 2 μg/ml Amphotericin B und 0,25% Gew./Vol. Rinderserumalbumin (BSA)], enthaltend 3 mg/ml Kollagenase, für 30 Minuten bei 37°C teilweise aufgeschlossen, und etwa 0,5 g des glatten Muskels wurden durch eine Inkubation für 2 Stunden in 0,5 mg/ml Elastase, gefolgt durch eine Inkubation für 18 Stunden in Kollagenase (3 mg/ml) bei 37°C, weiter aufgeschlossen. Die Zellsuspensionen wurden zentrifugiert (10 min, 100 × g, 25°C), dreimal in supplementiertem DMEM gewaschen, in 25 ml DMEM, enthaltend 10% (Vol./Vol.) hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), resuspendiert, in 25 cm²-Falcon-Kulturflaschen überimpft und für 7 bis 10 Tage inkubiert (37°C, 5% CO₂), bis eine Einschicht-Konfluenz erreicht wurde. Die Zellen wurden dann durch Aussetzen für 10 min gegen 0,5% Trypsin, 1 mM EDTA wöchentlich geerntet und es wurden in einem 1 : 3-Aufteilungsverhältnis in 75 cm²-Falcon-Kulturflaschen Passagen durchgeführt. Zellen mit Passagenzahlen von 3 bis 15 wurden für Experimente verwendet.
Immuncytochemie
Die Zellen wurden in Gewebekulturkammer-Objektträgern aus Glas mit 8 Vertiefungen (Labtek) subkultiviert und bis zu 100% Konfluenz in DMEM (10% FCS) gezüchtet. Die Objektträger wurden dreimal in PBS gewaschen, bevor sie für 20 Sekunden in eiskaltem Aceton fixiert und für bis zu vier Wochen bei 4°C vor dem Färben aufbewahrt wurden. Nach der Rehydration in PBS/BSA (0,25%) für 20 Minuten wurden die Zellen durch Inkubation in 0,5% Triton X-100 (in PBS) permeabilisiert und für mindestens 60 Minuten bei 22°C mit dem Primärantikörper inkubiert. Der Primärantikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit 0,25% BSA in PBS entfernt, und anschließend wurden die Zellen für mindestens 60 Minuten bei 22°C dem Sekundärantikörper (Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper; Ig-F(ab')₂-Fragment oder Ziege-anti-Kaninchen-IgG) ausgesetzt. Kontrollen wurden durch Ersetzen des Primärantikörpers durch PBS/BSA (0,25%) bereitgestellt. Die Färbung der fixierten Zellen wurde mit einem Lichtmikroskop (Olympus BH2, verbunden mit einem VideoPro 32-Bildanalysesystem, Faulding Imaging, Clayton, Victoria) analysiert. Die Eigenschaften der Antikörper, welche für die Identifizierung der glatten Muskeln in Kultur verwendet wurden, wurden bei nativen Proben der Atemwegswand überprüft. Die verwendeten Antikörper wurden gegen α-Actin, Myosin, Calponin (alle spezifisch für glatte Muskeln), Cytokeratin (Epithelzellen) und PECAM-1 (CD31, ein Marker von Endothelzellen) hervorgerufen.
Die Expression von α-Actin, Myosin und Calponin in glatten Muskeln wurde in allen Kulturen beobachtet, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Kulturen zeigten keine nachweisbare Färbung einer PECAM-1-Expression, und weniger als 5% der Zellen waren bezüglich der Färbung mit dem monoclonalen Antikörper gegen Cytokeratin positiv. In Paraffin eingebettete Schnitte eines Bereichs der Atemwege, der an denjenigen angrenzte, der für die Herstellung der Kulturen verwendet wurde, zeigte nur eine positive Färbung auf α-Actin und Myosin in glatten Muskeln in Bündeln von glatten Muskeln der Atemwege und in Blutgefäßen. Der Antikörper gegen PECAM-1 färbte das Gefäßendothel, während derjenige gegen Cytokeratin nur das Epithel färbte, was die Spezifität dieser Antikörper für die Zielantigene bestätigt.
DNA- und Proteinsynthese
Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen bei einem 1 : 3-Verhältnis subkultiviert und bis zu einer Einschicht-Konfluenz über einen Zeitraum von 72–96 Stunden in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft bei 37°C wachsen gelassen. Das serumhaltige Medium wurde durch serumfreies DMEM für einen Zeitraum von 24 Stunden ersetzt, um einen Wachstumsstillstand hervorzurufen. In einigen Experimenten wurden die Zellen 30 min vor der Zugabe des Mitogens mit 2-Methoxyoestradiol vorbehandelt. Das Stimulans (Mitogen) wurde zu den geeigneten Vertiefungen zusammen mit einer Ergänzung, enthaltend Insulin, Transferrin und Selen (Monomed A, 1% Vol./Vol.), zugegeben. Monomed A wurde zugegeben, um Progressionsfaktoren bereitzustellen, die für die mitogene Aktivität von Wachstumsfaktoren wie Thrombin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) essentiell sind [Steward et al., 1995a]. Die Mitogene und die Hemmstoffe wurden vom Zeitpunkt der Zugabe bis zum Ende des Experiments mit den Zellen in Kontakt belassen, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen wurden für 24 Stunden inkubiert (37°C, 5% CO₂), bevor sie mit [³H]-Thymidin (1 μCi/ml für 4 Stunden) radioaktiv markiert wurden, um den Einbau des radioaktiv markierten Stoffs in die neu synthetisierte DNA im Einklang mit einer vorherigen Studie der Anmelder zu messen [Steward et al., 1995]. Der Einbau von Radioaktivität wurde am Ende des Zeitraums der Pulsmarkierung durch Filtration nachgewiesen. Das Medium, enthaltend die Radioaktivität, wurde abgesaugt, und die Zellen wurden durch Zugabe von 200 μl 0,1 M NaOH lysiert. Die DNA wurde durch Filtration in ein Bindungserntegerät (Packard Filtermate 196) auf Glasfaserfilter (Packard, Standard) immobilisiert, die dann mit 3 × 3 ml-Volumina destilliertem Wasser und einem einzigen 1 ml-Volumen von 100% Ethanol gewaschen wurden. Die getrockneten Filter wurden einer Zählung in einem Packard Topcount-Flüssigkeitsszintillationszähler unterzogen. Die Proteinsyntheseraten wurden in Experimenten bestimmt, die eine entsprechende Anordnung aufwiesen, wie vorstehend beschrieben, wobei aber [³H]-Leucin das [³H]-Thymidin in dem Pulsmarkierungszeitraum von 4 Stunden ersetzte. Außerdem wurden in Experimenten, um die Wirkungen von Mitogenen und 2-Methoxyoestradiol auf die Proteinsyntheserate zu bestimmen, die Inkubationen mit dem Mitogen für einen Zeitraum von 48 Stunden ausgeführt. Die längere Dauer dieser Experimente war erforderlich, um einen ausreichenden Zeitraum vorzusehen, damit eine Zellteilung erfolgt.
Zellzählung
Die Progression von glatten Muskelzellen der Atemwege durch den Zellzyklus bis zur Mitose wurde durch die Messung von Veränderungen bezüglich der Zellzahl in Experimenten mit einer ähnlichen Anordnung wie die für die DNA-Synthese verwendeten, außer dass die Inkubationen mit dem Mitogen für 48 Stunden fortgesetzt wurden, bestimmt. Die Zellen wurden aus jeder der Vertiefungen der in diesen Experimenten verwendeten Kulturplatten mit 6 Vertiefungen durch die Aussetzung gegen 200 μl 0,5% Trypsin in PBS, enthaltend 1 mM EDTA, für einen Zeitraum von 30–45 min entfernt, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig voneinander und von der Kulturplatte dissoziiert wurden, um eine genaue Zählung durchführen zu können. Am Ende dieses Zeitraums wurden weitere 200 μl PBS (20% FCS) zugegeben, um die Zelllyse durch Trypsin zu verhindern, und die Zellen wurden direkt in einem Hämocytometer gezählt.
Statistische Analysen
Jede Behandlung in einem einzelnen Experiment wurde für die DNA- und Proteinsyntheseexperimente in vierfacher Ausfertigung ausgeführt. Jedes Experiment wurde in mindestens drei verschiedenen Kulturen durchgeführt, die von drei verschiedenen Individuen erhalten wurden. Für die Zellzählung wurden die einzelnen Inkubationen in drei Kulturen ausgeführt. Die Ergebnisse sind als in Gruppen zusammengefasste Daten aus mehreren Kulturen wiedergegeben und sind als Mittelwert ±SE von n Kulturen angegeben. Das Ausmaß der Steigerung wurde berechnet, indem die Antwort der behandelten Vertiefungen durch diejenige der Kontrollvertiefungen auf der gleichen Platte mit 24 Vertiefungen dividiert wurde. Die in Gruppen zusammengefasste Daten wurden nach der Normalisierung durch eine log-Transformation durch einen gepaarten t-Test analysiert. Gegebenenfalls wurde die Bonferroni-Anpassung für multiple Vergleiche verwendet. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05 war.
Materialien
Alle verwendeten Chemikalien wiesen Analysequalität oder eine höhere Qualität auf. Die verwendeten Verbindungen und deren Bezugsquellen waren wie folgt: 2-Methoxyoestradiol (1,3,5[10]-Oestratrien-2,3,17-triol-2-methylether, Charge 83H4065); 17β-Oestradiol ((1,3,5[10]-Oestratrien-3,17β-diol, Kat. Nr. E8876); 2-Methoxyoestriol (1,3,5[10]-Oestratrien-2,3,16α,17β-tetrol, Charge 26F 4038); 2-Methoxyoestron (2,3-Dihydroxy-1,3,5[10]-oestratrien-17-on, Charge 110F4003); 2-Hydroxyoestradiol (1,3,5[10]-Oestratrien-2,3,17β-triol, Charge 75H0853); L-Glutamin, im Wesentlichen fettsäurefreie Rinderserumalbumin-Fraktion V (BSA), Thrombin (Rinderplasma), Sigma, USA; Amphotericin B (Fungizone), menschlicher rekombinanter basischer FGF (bFGF), Promega, USA; Kollagenase Typ CLS 1, Elastase, Worthington Biochemical, USA; A-phosphatgepufferte Dulbecco Salzlösung (RBS), Oxoid, England; Trypsin, Versen, Penicillin-G, Streptomycin, Monomed A, CSL, Australien, fötales Kälberserum (FCS), Flow Laboratories, Australien; Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Flow Laboratories, Schottland. [6-³H]-Thymidin (185 GBq/mMol, 5 Ci/mMol), Amersham, GB; Microscint – O-Szintillationssubstanz, Canberra-Packard, Australien. Die für die Immuncytochemie verwendeten Antikörper waren anti-α-Actin aus glattem Muskel (Maus, monoclonal) (Dako M851), monoclonaler Maus-anti-PECAM-1 (Dako-CD31, JC/70A) (Dako M823), Dako Corporation, USA; anti-Cytokeratin (Maus, monoclonaler CY90, Sigma, USA), anti-Maus-Ig-F(ab')₂-Fragment-FITC-Konjugat (Wirt Schaf), Schaf-anti-Kaninchen-Ig-HRP-Konjugat (Silenus DDAF), Silenus, Australien, und anti-Myosin aus glattem Muskel (Kaninchen, polyclonal), bereitgestellt durch Professor M. Sparrow, Perth, WA.
Beispiel 1
Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Leukocytenaktivität
Die Aktivierung von Leukocyten ist ein Merkmal für die Pathologie von Asthma. Die Bindung von 2-Methoxyoestradiol an die Colchicin-Bindungsstelle auf Tubulin eröffnete die Möglichkeit, dass diese Verbindung in Leukocytenfunktionen wie die Phagocytose und die Lokomotion eingreift.
Die funktionellen Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol wurden bei polymorphkernigen Leukocyten (PMN) und adhärenten Monocyten, die aus menschlichem peripherem Blut erhalten wurden, untersucht. Die Superoxidanionen-Bildung wurde durch die Superoxiddismutase empfindliche Reduktion von Cytochrom C bestimmt [Steward & Harris, 1992]. Die Freisetzung von Myeloperoxidase wurde durch Oxidation von Tetramethylbenzidin bestimmt [Menegazzi et al., 1992]. Die Phagocytose wurde durch Radioiodierung von Zymosanpartikeln bestimmt [Shelton & Hosking, 1975).
Peritoneale Makrophagen des Meerscheinchens wurden geerntet und im Einklang mit vorherigen Studien der Anmelder gezüchtet [Steward & Phillips, 1989]. Die Zellen wurden mit Stimulantien einschließlich dem chemotaktischen Tripeptid Formylmethionylleucyl-Phenylalanin (fMLP, 100 nM), Zymosan (400 μg/ml) oder Phorbolmyristatacetat (PMA, 100 nM) für 30 min in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2-Methoxyoestradiol (10 μM), das 15 min vor den Stimulantien zugegeben wurde, inkubiert. Das Superoxidanion wurde durch die Superoxiddismutase empfindliche Reduktion von Cytochrom C bestimmt [Steward & Harris, 1992], und der stabile Metabolit von Prostacyclin, 6-oxo-PGF1, wurde durch einen Radioimmuntest gemessen [Steward & Phillips, 1989]. Alle einzelnen Inkubationen wurden in doppelter Ausfertigung ausgeführt, und die Experimente wurden in Makrophagen aus fünf Meerscheinchen ausgeführt.
RBL2H3-Zellen wurden in RPMI-1640, enthaltend 10% FCS, gezüchtet und es wurden für die Experimente Passagen in Platten mit 24 Vertiefungen durchgeführt. Die Zellen wurden durch eine Inkubation für 48 Stunden mit 50% (Vol./Vol.) konditioniertem Medium aus einer Lymphoidzelllinie, die einen anti-DNP-Ovalbumin-Antikörper sezerniert, sensibilisiert. Während der letzten 24 Stunden dieser Inkubation wurde [³H]-5HT (1 μCi/ml) zu jeder der Vertiefungen zugegeben, um granuläre Aminspeicher zu markieren. Am Ende des Inkubationszeitraums wurde das Medium abgesaugt, die Zellen wurden zweimal in RPMI-1640 gewaschen und in RPMI-1640 (0,25% BSA) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2-Methoxyoestradiol für 15 min inkubiert, bevor die Stimulation mit DNP behandeltem Ovalbumin, A23187 oder PMA für 30 min erfolgte; zu diesem Zeitraum wurden die Überstände geerntet und einer Zentrifugation (1000 × g, 4°C, 5 min) unterzogen, und Aliquots wurden für die Bestimmung der freigesetzten Menge an [³H]-5HT entnommen. Alle Experimente wurden in vierfacher Ausfertigung ausgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass 2-Methoxyoestradiol (3 μM) die Oxidation von Tetramethylbenzidin in Leukocyten, die durch entweder Zymosan (400 μg/ml) oder fMLP stimuliert wurden, verringerte, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Zellfreie Überstände von durch fMLP stimulierten Leukocyten enthielten auch eine Myeloperoxidaseaktivität, wie durch eine Tetramethylbenzidin-Oxidation bestimmt wurde, aber diese Aktivität wurde nur durch die höchste Konzentration von 2-Methoxyoestradiol (10 μM) verringert. Zusätzlich wurden Experimente ausgeführt, um zu untersuchen, ob es eine direkte Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Oxidation von Tetramethylbenzidin durch gereinigte Meerrettichperoxidase gab. 2-Methoxyoestradiol (10 μM) zeigte in diesem Test keine Wirkung. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Tetramethylbenzidin-Oxidation durch menschliche polymorphkernige Leukocyten
Die Daten sind als Änderung des Extinktionswerts angegeben. Die Tests wurden unter Verwendung von 2 × 10⁶ PMN in 0,5 ml Puffer ausgeführt.
Bei PMN wurde die Superoxidanionen-Bildung als Antwort auf fMLP (100 nM) oder Zymosan (400 μg/ml) durch Konzentrationen von 2-Methoxyoestradiol bis zu 10 μM nicht verringert. Bei Phagocytose-Experimenten wurde die Radioiodierung von Zymosanpartikeln in PMN durch 2-Methoxyoestradiol verringert, wobei signifikante Wirkungen bei sowohl 3 als auch 10 μM beobachtet werden, wie in Tabelle 2 gezeigt ist.
Tabelle 2: ¹²⁵I-Aufnahme durch menschliche polymorphkernige Leukocyten
Die Daten sind als Prozentsatz des ¹²⁵I-Einbaus in das mittels Glasfaserfilter abfiltrierbare Material angegeben. Die Tests wurden unter Verwendung von 1 × 10⁶ PMN ausgeführt.
Bei adhärenten Monocyten wurde die Oxidation von Tetramethylbenzidin als Antwort auf Phorbolmyristatacetat (1 μM), PMA oder Zymosan (400 μg/ml) durch 10 μM 2-Methoxyoestradiol nicht beeinflußt. Ferner wurde auch die Superoxidanionen-Bildung als Antwort auf PMA bei diesem Zelltyp nicht beeinflußt. Jedoch schien die durch Zymosan stimulierte Superoxidanionbildung durch 2-Methoxyoestradiol (10 μM) in Monocyten von zumindest einigen Spendern deutlich gehemmt zu werden.
Die Superoxidanionantwort von Makrophagen des Meerscheinchens auf Zymosan oder fMLP wurde durch 2-Methoxyoestradiol verringert, wie in 8 gezeigt ist. Jedoch wurde die Antwort auf PMA (100 nM) nicht beeinflußt. Zusätzlich wurden die durch fMLP (100 nM) hervorgerufenen Steigerungen bezüglich der 6-oxo-PGF1-α-Bildung durch 2-Methoxyoestradiol vollständig blockiert, während die Antwort auf PMA nur um 50% verringert wurde, und Zymosan stimulierte keine Erhöhung der Spiegel des Prostacyclin-Metaboliten, wie in 9 gezeigt ist.
Ovalbumin (DNP-OA) löste eine konzentrationsabhängige Freisetzung von [³H]-5HT aus, welche durch 10 μM 2-Methoxyoestradiol verringert wurde, wie in 10 erkennbar ist. Jedoch wurden die basale Freisetzung von [³H]-5HT und diejenige als Antwort auf entweder PMA (100 nM) oder das Calciumionophor A23187 (10 μM) durch 2-Methoxyoestradiol nicht beeinflußt, wie in 11 gezeigt ist.
Die Hemmwirkungen von 2-Methoxyoestradiol auf die PMN-Myeloperoxidase-Freisetzung und -Aktivität zusammen mit der Verringerung der Phagocytose zeigen, dass die Verbindung eine entzündungshemmende Wirkung in vivo besitzt. Die selektive Hemmung der durch Zymosan stimulierten Superoxidanionbildung deutet auf eine spezifische Wirkung auf diesen phagocytischen Stimulus hin. Diese Beobachtungen und die Experimente der Anmelder, welche die Hemmwirkungen auf die Makrophagenfunktion zeigen, liefern einen eindeutigen Beweis für die entzündungshemmenden Eigenschaften, die bei Asthma und anderen chronisch-obstruktiven Atemwegserkrankungen, besonders solchen mit einer nachweisbaren PMN-Beteiligung, nützlich sind.
Beispiel 2
Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die DNA-Synthese
Die Inkubation von gezüchteten menschlichen glatten Muskelzellen der Atemwege mit 0,3–10 μM 2-Methoxyoestradiol für 30 min vor der Zugabe des Mitogens und während der restlichen 28 Stunden des Experiments rief eine konzentrationsabhängige Verringerung bei dem durch Thrombin (0,3 E/ml) stimulierten Einbau von [³H]-Thymidin hervor, wie in 2a gezeigt ist. Bei der höchsten verwendeten Konzentration von 2-Methoxyoestradiol (10 μM) wurde die Antwort auf Thrombin auf etwa 10% des Kontrollwerts verringert. Diese Hemmwirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die DNA-Synthese war nicht auf die Anwesenheit von Thrombin begrenzt, da ähnliche mit der Konzentration in Beziehung stehende Hemmwirkungen von 2-Methoxyoestradiol bei Zellen beobachtet wurden, bei denen die DNA-Synthese durch entweder fötales Kälberserum (FCS, 1% Vol./Vol.) oder den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 300 pM) stimuliert wurde (2a und 2b). Jedoch wurde die DNA-Synthese in Anwesenheit von entweder EGF (3 nM) oder 10% FCS in einem wesentlich geringeren Ausmaß gehemmt als die Antworten auf Thrombin, bFGF oder geringere Konzentrationen von FCS (2c). Die DNA-Synthese in Antwort auf 10% FCS (27,2 ± 7,8 mal höher als der Spiegel des [³H]-Thymidin-Einbaus ohne eine Stimulierung) war signifikant größer (p < 0,05, gepaarter Student-t-Test) als die Antwort auf 0,3 E/ml Thrombin (8,4 ± 3,1-fach), 3 nM EGF (4,5 ± 0,7) oder 1% FCS (12,7 ± 0,4), aber unterschied sich nicht signifikant von der Antwort auf 300 pM bFGF (22,5 ± 5,3).
Studien zum zeitlichen Verlauf wurden auch ausgeführt, um zu bestimmen, ob die Zugabe von 2-Methoxyoestradiol nach dem Aussetzen gegen die Mitogene noch die DNA-Synthese hemmte. Die durch Thrombin (0,3 E/ml) stimulierte DNA-Synthese wurde gehemmt, wenn 2-Methoxyoestradiol (3 μM) bis zu 4 Stunden nach dem Thrombin zugegeben wurde, wobei eine maximale Hemmung bei 2 Stunden nach der Thrombin-Zugabe beobachtet wurde. Die Zugabe von 2-Methoxyoestradiol zwischen 4 und 14 Stunden nach dem Thrombin ergab eine geringe Hemmung (~20%), während die Zugabe bei 18 Stunden oder später keine Wirkung auf die DNA-Synthese in Anwesenheit dieses Mitogens hatte, wie in 2d gezeigt ist. Später wurden weitere Zeitpunkte untersucht, und diese Studien zeigten, dass der höchste Aktivitätsgrad beobachtet wurde, wenn 2-Methoxyoestradiol entweder gleichzeitig mit oder eine Stunde nach dem Thrombin zugegeben wurde, aber dass eine signifikante Hemmung bis zu 6 Stunden nach der Thrombin-Zugabe fortbestand (2d).
Beispiel 3
Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Proteinsynthese und die Zellzahlen
Um zu bestimmen, ob die Hemmung der DNA-Synthese auch einen Stillstand der Zellzyklusprogression und eine Hemmung der Mitose zur Folge hatte, wurden Messungen von sowohl der Proteinsynthese als auch der Zellzahlen nach einer Inkubation für 48 Stunden mit den Mitogenen durchgeführt. Der Konzentrationsgrenzwert für die Hemmung des Einbaus von [³H]-Leucin in Anwesenheit von Thrombin (0,3 E/ml), FCS (1% Vol./Vol.) oder bFGF (300 pM) betrug 1 μM und entsprach den Ergebnissen für die Hemmung des [³H]-Thymidin-Einbaus. Die maximale prozentuale Verringerung der Antwort von etwa 30% war geringer als der Wert, welcher bei der DNA-Synthese beobachtet wurde, und trat bei 3 μM auf. Bei 10 μM wurde keine signifikante Hemmwirkung in Anwesenheit von Thrombin oder bFGF beobachtet, wie in 3 gezeigt ist. 2-Methoxyoestradiol allein rief eine geringe Stimulation des [³H]-Leucin-Einbaus bei 3 μM hervor. Höhere Konzentrationen (1 und 3 μM) zeigten geringe Hemmwirkungen, und bei 10 μM wurde keine Wirkung beobachtet. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Im Gegensatz dazu waren die Erhöhungen der Zellzahl als Antwort auf entweder FCS (1% Vol./Vol.) oder bFGF (300 pM) für eine Hemmung durch 2-Methoxyoestradiol empfindlicher als entweder die Protein- oder die DNA-Synthese, wobei eine vollständige Hemmung der Proliferationsantworten bei 3 μM beobachtet wurde, wie in den 4a und b gezeigt ist.
Tabelle 3: Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Proteinsyntheseraten in nicht stimulierten glatten Muskelzellen
Beispiel 4
Durch Serotonin stimulierter [³H]-Leucin-Einbau in glatte Muskelzellen
Serotonin (5HT) in Konzentrationen von 0,1 nM bis zu 10 μM hatte keine Wirkungen auf den Einbau von [³H]-Thymidin, aber 10 nM 5HT erhöhten den Einbau von [³H]-Leucin. Die vorherige Inkubation mit 0,3–10 μM 2-Methoxyoestradiol verringerte die durch 5HT (10 nM) stimulierte Steigerung der Proteinsynthese in einer konzentrationsabhängigen Weise, wie in Tabelle 4 zusammengefasst ist.
Tabelle 4: Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Proteinsyntheseraten in mit 5HT stimulierten glatten Muskelzellen
Beispiel 5
Morphologische Wirkungen von 2-Methoxyoestradiol
Morphologische Veränderungen einschließlich der Manifestation eines abgerundeten Aussehens der normalerweise spindelförmigen Zellen wurden bei Konzentrationen von 3 und 10 μM 2-Methoxyoestradiol beobachtet. Die Formveränderungen setzten relativ schnell ein und waren innerhalb von 6 Stunden zu beobachten und wurden für die Dauer der Inkubation beibehalten. Diese Formveränderungen waren solchen ähnlich, die durch die Inkubation von Zellen mit dem Mikrotubulus-Auflösungsmittel Colchicin (0,1–10 μM) ausgelöst wurden. Der Steroidrezeptor-Antagonist RU486 [Stewart et al., 1995b] verringerte die Formveränderungen als Antwort auf entweder Colchicin oder 2-Methoxyoestradiol, aber hatte keine Wirkung auf die Hemmung der DNA-Synthese durch 2-Methoxyoestradiol. Diese Ergebnisse sind in 5 veranschaulicht.
Beispiel 6
Wirkungen von Analoga von 2-Methoxyoestradiol
Mehrere Verbindungen, die mit 2-Methoxyoestradiol verwandt sind, wurden auf eine Hemmung der durch FCS (1%, Vol./Vol.) stimulierten DNA-Synthese untersucht, einschließlich der Stammverbindung 17β-Oestradiol und dem unmittelbaren Vorläufer 2-Hydroxyoestradiol. Die niedrigeren Konzentrationen jeder dieser Verbindungen erhöhten die durch FCS (1%) stimulierte DNA-Synthese, wie in 6 gezeigt ist. Bei höheren Konzentrationen wurde die Verstärkung umgekehrt, und eine Hemmung wurde bei 10 μM dieser Verbindungen beobachtet. Die Hemmwirkung von 2-Hydroxyoestradiol (10 μM) entsprach derjenigen von 2-Methoxyoestradiol (10 μM). Eine zweiphasige Wirkung wurde bei Analoga einschließlich 2-Methoxyoestron und 2-Methoxyoestriol beobachtet, welche die durch Thrombin stimulierte DNA-Synthese bei Konzentrationen bis zu 3 μM erhöhten, aber das Ausmaß der Verstärkung nahm bei 10 μM ab, wie in 7 gezeigt ist. Die Wirkungen von 17β-Oestradiol und 2-Hydroxyoestradiol auf die Proteinsynthese sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Wirkung von 2-Methoxyoestradiol auf die Proteinsyntheseraten in nicht stimulierten glatten Muskelzellen
Die Anmelder haben hierin gezeigt, dass 2-Methoxyoestradiol, ein natürlicher Metabolit von 17β-Oestradiol, von dem man bisher annahm, dass es inaktiv ist, entzündungshemmende Aktivitäten aufweist und die DNA-Synthese und die nachfolgende Teilung von glatten Muskelzellen der Atemwege, die aus menschlichen Bronchien gezüchtet wurden, hemmt.
Die entzündungshemmende Eigenschaft macht die Verbindung und deren Analoga bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, z. B. die Behandlung von Asthma und anderen chronisch-obstruktiven Atemwegserkrankungen, besonders solchen mit einer nachweisbaren PMN-Beteiligung, nützlich.
Die Hemmwirkung auf die DNA-Synthese ist nicht das Ergebnis einer Cytotoxizität, da die Proteinsyntheseraten durch die Inkubation von Zellen mit den höchsten Konzentrationen von 2-Methoxyoestradiol (10 μM) nicht verändert wurden und keine Zellablösung von den Kulturplatten bei dieser Konzentration beobachtet wurde. Ohne an einen angenommenen Mechanismus für die beobachteten Vorteile gebunden zu sein, ist es möglich, dass das Steroid die Zellen in der frühen G1-Phase des Zellzyklus hemmt (2,0 Stunden nach dem Mitogen), woraus eine maximale Hemmung der DNA-Synthese resultiert. Es bleibt zu beweisen, ob durch die Zugabe von 2-Methoxyoestradiol nach dem Mitogen die antiproliferative Wirkung davon beibehalten wird. 2-Methoxyoestradiol hemmte die Antworten auf bFGF, Thrombin und FCS (1%) bei ähnlichen Wirksamkeiten, was zeigt, dass die Wirkung für keines der Mitogene spezifisch war. Diese Beobachtung legt nahe, dass 2-Methoxyoestradiol auf einen oder mehrere frühe intrazelluläre signalgebende Schritte einwirkt, welche durch jedes dieser Mitogene verwendet werden. Trotzdem war die Hemmwirkung auf die DNA-Synthese überwindbar, wobei höhere Konzentrationen von FCS (10%) durch die Vorinkubation mit 2-Methoxyoestradiol wesentlich weniger gehemmt werden. Diese Resistenz könnte durch die stärkere Antwort auf die höhere Konzentrationen von FCS erklärt werden, aber ein ähnliches Argument kann nicht für die Resistenz gegen die Hemmung angeführt werden, wenn das Mitogen EGF ist, der schwächere Antworten auslöste als solche, die durch Thrombin, FCS 1% oder bFGF hervorgerufen wurden. Jedoch können die proliferativen Wirkungen von EGF und 10% FCS durch 2-Methoxyoestradiol gehemmt werden. Die Anmelder haben noch keinen Hinweis darauf, dass die Hemmung der DNA-Synthese mit der Hemmung der Zellproliferation verknüpft ist. Jedoch deutet die Tatsache, dass die letztere Wirkung bei niedrigeren Konzentrationen von 2-Methoxyoestradiol beobachtet wird, darauf hin, dass andere Wirkungen als die Hemmung der DNA- Synthese durch 2-Methoxyoestradiol ebenso zu den antiproliferativen Wirkungen davon beitragen.
Mehrere Analoga von 2-Methoxyoestradiol wurden untersucht, um zu bestimmen, ob sie die antiproliferative Wirkung gemeinsam haben. Sowohl die Stammverbindung 17β-Oestradiol als auch der unmittelbare Vorläufer 2-Hydroxyoestradiol erhöhten bei niedrigeren Konzentrationen die DNA-Synthese als Antwort auf FCS (1%) und hemmten die DNA-Synthese bei 3 und 10 μM. Es wurde nicht überprüft, ob diese Veränderungen bezüglich der DNA-Synthese entsprechende Veränderungen bei der Zellproliferation zur Folge hatten. Die Steigerung der durch Thrombin stimulierten DNA-Synthese durch 2-Methoxyoestron und 2-Methoxyoestriol zeigte eine glockenförmige Konzentration-Antwort-Kurve, wobei eine geringere Wirkung bei den höheren Konzentrationen beobachtet wurde. Zusammenfassend deuten die Beobachtungen der Anmelder darauf hin, dass 2-Methoxyoestradiol das wirksamste Analogon der untersuchten Analoga ist, was mit früheren Beobachtungen bei den proliferativen Antworten von Endothelzellen im Einklang steht [Fotsis et al., 1994].
Es kann auch möglich sein, die Stammverbindung 17β-Oestradiol zusammen mit Mitteln zu verabreichen, welche den Metabolismus zu der aktiven Verbindung induzieren. Zum Beispiel können Induktoren von P450-Cytochrom und von Catecholamin-Methyltransferase verwendet werden. Hemmstoffe von Arylsulphatase können auch in Betracht gezogen werden.
Die antiproliferative Wirkung von 2-Methoxyoestradiol und dessen Fähigkeit, die durch 5HT induzierten Steigerungen der Proteinsynthese zu verringern, weisen sowohl auf antihyperplastische als auch antihypertrophe Wirkungen hin. Es gibt einen zwingenden Hinweis für eine Hyperplasie und eine Hypertrophie in asthmatischen Atemwegen [Ebina et al., 1993], die zu einem großen Teil zu dem Phänomen einer AHR beitragen [James et al., 1989]. Verringerungen bei einer AHR sind bei einigen Asthmatikern mit einer vollständigen Rückbildung der Symptome assoziiert [Platts-Mills et al., 1987]. Außerdem wird von allen strukturellen Veränderungen, die bei der Umbaureaktion in der Atemwegswand bei Asthma dokumentiert wurden, eine Vermehrung der glatten Muskelzellen in den Atemwegen als von größter Wichtigkeit angesehen [Pare & Bai, 1995]. Folglich würde eine Verbindung wie 2-Methoxyoestradiol, welche die Wachstumsreaktion von glatten Muskeln in den Atemwegen verhindert, eine AHR verringern und daher die Symptome von Asthma vermindern. Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass die antiangiogene Aktivität von 2-Methoxyoestradiol [Fotsis et al., 1994] die Umbaureaktion begrenzt, da nachgewiesen worden ist, dass es eine angiogene Komponente bei dem Umbau gibt [Kuwano et al., 1993]. Es scheint wahrscheinlich zu sein, dass diese Angiogenese erforderlich ist, um den Stoffwechselanforderungen der vergrößerten Gewebemasse zu genügen. Daher kann eine Verhinderung der Angiogenese die Umbaureaktion zum Stillstand bringen, unabhängig von irgendwelchen direkten Hemmwirkungen von 2-Methoxyoestradiol auf den glatten Muskel und andere Zelltypen.
Eine Reihe von anderen Eigenschaften von 2-Methoxyoestradiol sind wahrscheinlich bei der Behandlung von Asthma von therapeutischem Nutzen, einschließlich seiner nachgewiesenen Fähigkeit, die Mikrotubulusbildung zu unterbrechen [D'Amato et al., 1994], welche die exocytotische Freisetzung von Entzündungsvermittlern aus Mastzellen, Makrophagen und Eosinophilen verringern kann.
Die Daten der Anmelder zeigen, dass 2-Methoxyoestradiol die antigeninduzierte Degranulation von Mastzellen hemmt. Diese Aktivität begünstigt die Verwendung von 2-Methoxyoestradiol bei einem großen Bereich von allergischen Zuständen einschließlich allergischer Rhinitis und atopischer Hautzustände. Die Hemmung der Aktivierung von peritonealen Makrophagen des Meerschweinchens durch fMLP deutet darauf hin, dass die Wirkung von 2-Methoxyoestradiol über Ereignisse hinaus, die mit dem Cytoskelett assoziiert sind, ausgedehnt werden kann, da fMLP die mit dem G-Protein verbundenen Rezeptoren anstatt die Phagocytose aktiviert.
Zusätzlich können auch die Antioxidans-Aktivitäten von 2-Methoxyoestradiol vorteilhaft sein, da die drei wichtigsten Entzündungszelltypen, die an einer Entzündung der Atemwege beteiligt sind, jeweils die Fähigkeit besitzen, große Mengen an Sauerstoffradikalen zu erzeugen, und zusammen mit Stickstoffoxid eine wesentliche Oxidans-Schädigung hervorrufen können. Diese Aktivitäten begünstigen ebenfalls die Verwendung von 2-Methoxyoestradiol bei der Behandlung einer chronisch-obstruktiven Erkrankung der Atemwege, bei der für Sauerstoffradikale eine wichtige Rolle hinreichend bewiesen ist und es einen Hinweis auf einen Umbau der Atemwegswand gibt [Kuwano et al., 1993]. Schließlich zeigen mehrere Studien, dass 2-Methoxyoestradiol und verwandte Verbindungen den Calciumeinstrom in glatten Muskel verringern [Goyache et al., 1995], was, falls auch für den glatten Muskel der Atemwege nachgewiesen, dem Bronchospasmus bei Asthma entgegenwirken würde.
Die hierin erwähnten Referenzen sind auf den folgenden Seiten aufgeführt.
Referenzen

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Claims

Verwendung eines Steroids oder eines Steroidanalogons, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Methoxyoestradiol, 2-Hydroxyoestradiol, 2-Methoxyoestron, 2-Methoxy-oestradiol-3-methylether und 4-Methoxyoestradiol für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die durch eine chronische oder akute Entzündung der Atemwege gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Steroid 2-Methoxyoestradiol ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die zu behandelnde Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asthma, Überempfindlichkeit der Atemwege, Bronchokonstriktion, Emphysem, Lungenentzündung, atopischer Erkrankung und Lungeninfektion.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Erkrankung Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die atopische Erkrankung allergische Rhinitis ist.
Zusammensetzung, umfassend ein Steroid oder Steroidanalogon gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 oder 2, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Zusammensetzung für die Verabreichung durch Inhalation angepasst ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Verwendung in der Therapie.