DE69717811T2

DE69717811T2 - Substituierte phenethyl-derivate als matrx-metalloprotease-inhibitoren

Info

Publication number: DE69717811T2
Application number: DE69717811T
Authority: DE
Inventors: J. Wolanin
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1997-05-12
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2017-05-13
Also published as: EP0907632A1; PE66298A1; CA2253870A1; HRP970243A2; AU2938597A; TW363056B; SV1997000037A; HN1997000071A; JP3305328B2; AR007100A1; DK0907632T3; EP0907632B1; ATE229497T1; ID17424A; PA8429801A1; ZA974029B; DE69717811D1; YU18497A; CN1124255C; JPH11510517A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzym-Inhibitoren und ganz besonders neue substituierte Phenethyl-Verbindungen oder Derivate davon zur Inhibierung von Matrix-Metalloproteasen.

Beschreibung des Standes der Technik

Matrix-Metalloproteasen (auch Matrix-Metallo-Endoproteinasen oder MMPs genannt) sind eine Familie von Zink-Endoproteinasen, die, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Zwischenraum-Kollagenase (auch MMP-1 genannt), Stromelysin (auch Proteoglycanase, Transin oder MMP-3 genannt), Gelatinase A (auch 72kDa-Gelatinase oder MMP-2 genannt) und Gelatinase B (auch 95kDa- Gelatinase oder MMP-9 genannt) ein. Diese MMPs werden durch eine Vielzahl von Zellen, einschließlich von Fibroblasten und Chondrozyten, zusammen mit natürlichen proteinartigen Inhibitoren, die als TIMPs (Gewebe (Tissue)- Inhibitor von Metallo Proteinase) bekannt sind, sekretiert.
Alle diese MMPs sind dazu befähigt, eine Vielzahl von verbindenden Gewebekomponenten aus Gelenksknorpel oder Untergrundmembranen zu zerstören. Jede MMP wird als ein inaktives Proenzym sekretiert, das in der anschließenden Stufe gespalten werden muss, bevor es fähig ist, seine eigene proteolytische Aktivität auszuüben. Zusätzlich zum Matrixzerstörenden Effekt sind bestimmte dieser MMPs wie MMP-3 als der in vivo- Aktivator für weitere MMPs wie MMP-1 und MMP-9 implementiert worden (Ito et al. Arch. Biochem. Biophys. 267, 211, 1988; Ogata et al. J. Biol. Chem. 267, 3581, 1992). Somit kann eine Kaskade proteolytischer Aktivität durch einen Überschuss von MMP-3 ausgelöst werden. Daraus folgt, dass spezifische MMP- 3-Inhibitoren die Aktivität weiterer MMPs einschränken sollten, die nicht direkt durch solche Inhibitoren inhibiert werden.
Es ist auch berichtet worden, dass MMP-3 die endogenen Inhibitoren weiterer Proteinasen wie von Elastase spalten und dadurch inaktivieren können (Winyard et al. FEBS Letts. 279, 1, 91, 1991). Inhibitoren von MMP-3 könnten somit die Aktivität weiterer destruktiver Proteinasen durch Modifizierung des Gehalts von deren endogenen Inhibitoren beeinflussen.
Eine Anzahl von Krankheiten wird vermutlich durch überschüssige oder unerwünschte Matrix-zerstörende Metalloprotease-Aktivität oder durch ein Ungleichgewicht beim Verhältnis der MMPs zu den TIMPs mediiert. Diese schließen ein: a) Osteoarthritis (Woessner et al. J. Biol. Chem. 259(6), 3633, 1984; Phadke et al. J. Rheumatol. 10, 852, 1983), b) rheumatoide Arthritis (Mullins et al. Biochim. Biophys. Acta 695, 117, 1983; Wolley et al. Arthritis Rheum. 20, 1231, 1977; Gravallese et al. Arthritis Rheum. 34, 1076, 1991), c) septische Arthritis (Williams et al. Arthritis Rheum. 33, 533, 1990), d) Tumor-Metastase (Reich et al. Cancer Res. 48, 3307, 1988, und Martisian et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 83, 9413, 1986), e) periodontale Krankheiten (Wurzelhaut) (Overall et al. J. Periodontal Res. 22, 81, 1987), f) Kornealgeschwürbildung (Burns et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 1569, 1989), g) Proteinurie (Baricos et al. Biochem. J. 254, 609, 1988), h) Koronar-Thrombose aus atherosklerotischem Plaque-Bruch (Henney et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 88, 8154-8158, 1991), i) aneurysmale Aortakrankheit (Vine et al. Clin. Sci. 81, 233, 1991), j) Geburtenkontrolle (Woessner et al. Steroids 54, 491, 1989), k) dystrophobe Epidermolyse-Bullosa (Hautbläschen) (Kronberger et al. J. Invest. Dermatol. 79, 208, 1982) und l) degenerativen Knorpelverlust nach traumatischer Gelenkverletzung, m) Krankheitszustände, die zu Entzündungsreaktionen führen, Osteopönien (Knochenkrankheiten), mediiert durch MMP-Aktivität, n) Tempero-Mandibulargelenkskrankheit (Kieferkrankheiten), o) demyelatierende Krankheiten des Nervensystems (Chantry et al. J. Neurochem. 50, 688, 1988).
Die Notwendigkeit für neue Therapien ist besonders wichtig im Fall arthritischer Krankheiten. Der primäre Behinderungseffekt von Osteoarthritis (OA), rheumatoider Arthritis (RA) und von septischer Arthritis ist der fortschreitende Verlust von Artikularknorpel und dadurch der normalen Gelenksfunktion. Kein auf dem Markt befindliches pharmazeutisches Mittel vermag diesen Knorpelverlust zu verhindern oder zu verlangsamen, obwohl nicht-steroide anti-Entzündungsarzneimittel (NSAIDs) verabreicht worden sind, um Schmerz und Schwellung zu steuern. Das Endergebnis dieser Krankheiten ist der Totalverlust der Gelenksfunktion, was dann nur durch chirurgischen Ersatz des Gelenks behandelbar ist. Von MMP-Inhibitoren wird erwartet, dass sie das Fortschreiten von Knorpelverlust anhalten oder sogar zur Umkehr bringen und einen chirurgischen Eingriff umgehen oder aufschieben.
Proteasen sind kritische Elemente bei verschiedenen Stufen im Fortschreiten von metastatischem Krebs. Bei diesem Vorgangsablauf führt der proteolytische Abbau von strukturellem Protein in der Basalmembran zur Expansion eines Tumors in der Primärstelle, zur Evasion aus dieser Stelle sowie zur Beheimatung und Invasion in entferntere Sekundärstellen. Auch bedarf ein Tumorwachstum einer Tumorinduzierten Angiogenese und hängt von der Wiedererstellung von proteolytischem Gewebe ab. Transfizierungsversuche mit verschiedenen Typen von Proteasen haben gezeigt, dass die Matrix- Metalloproteasen eine dominierende Rolle in diesen Vorgängen und Abläufen spielen, und zwar insbesondere die Gelatinase A bzw. B (MMP-2 bzw. MMP-9).
Bezüglich einer Übersicht auf diesem Gebiet siehe Mullins et al. Biochim. Biophys. Acta 695, 177, 1983; Ray et al. Eur. Respir. J. 7, 2062, 1994; Birkedal-Hansen et al. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4, 197, 1993.
Ferner wurde belegt, dass eine Inhibierung des Abbaus extrazellulärer Matrix durch den nativen Matrix-Metalloprotease-Inhibitor TIMP-2 (ein Protein) Krebswachstum zum Anhalten bringt (DeClerck et al. Cancer Res. 52, 701, 1992) und dass TIMP-2 Tumorinduzierte Angiogenese in experimentellen Systemen inhibiert (Moses et al. Science 248, 1408, 1990). Beuzüglich eines Rückblicks siehe DeClerck et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 732, 222, 1994. Es wurde ferner belegt, dass der synthetische Matrix-Metalloprotease-Inhibitor Batimastat bei intraperitonealer Verabreichung menschliches Darmtumorwachstum und -ausbreitung in einem orthotopischen Modell in nackten Mäusen inhibiert (Wang et al. Cancer Res. 54, 4726, 1994) und das Überleben von Mäusen mit menschlichen Eierstock-Carcinom-Xenopfropfen verlängert (Davies et al. Cancer Res. 53, 2087, 1993). Die Verwendung dieser und ähnlicher Verbindungen ist von Brown et al in WO-9321942 A2 (931111) beschrieben worden.
Es gibt verschiedene Patente und Patentanmeldungen, die die Verwendung von Metalloproteinase-Inhibitoren zur Verzögerung von metastatischem Krebs, zur Förderung einer Tumorzurückdrängung, Inhibierung der Proliferation von Krebszellen, Verlangsamung oder Verhinderung von Knorpelverlust im Zusammenhang mit Osteoarthritis oder zur Behandlung weiterer bereits oben angegebener Krankheiten beanspruchen (z. B. Levy et al. WO-9519965 A1; Beckett et al. WO-9519956 A1; Beckett et al. WO-9519957 A1; Beckett et al. WO-9519961 A1; Brown et al. WO-9321942 A2; Crimmin et al. WO-9421625 A1; Dickens et al. US 4,599,361; Hughes et al. US 5, 190,937; Broadhurst et al. EP 574758 A1; Broadhurst et al. EP 276436; und Myers et al. EP 520573 A1. Die bevorzugten Verbindungen dieser Patente weisen ein Peptid-Rückgrat mit einer Zink-komplexierenden Gruppe (Hydroxamsäure, Thiol, Carbon- oder Phosphinsäure) an dem einen Ende und eine Vielzahl von Seitenketten, deren beide in den natürlichen Aminosauren vorgefunden werden, sowie jene mit neueren funktionellen Gruppen auf. Solch kleine Peptide werden oft nur gering absorbiert und zeigen und ergeben eine nur niedrige orale Bioverfügbarkeit. Sie unterliegen auch einem raschen protolytischen Metabolismus, wodurch deren Halbwertszeiten verkürzt sind. Als ein Beispiel kann Batimastat, die von Brown et al in WO-9321942 A2 beschriebene Verbindung, nur intraperitoneal verabreicht werden.
Bestimmte 3-Biphenoylpropan- und 4-Biaryloylbutansäuren sind in der Literatur als entzündungshemmende, anti-Plättchenaggregier-, antiphlogistische, anti-proliferative, hypolipidemische, antirheumatische, analgetische und hypocholesterolemische Mittel beschrieben. In keinem dieser Beispiele ist auch nur ein Bezug auf eine MMP-Inhibierung als Mechanismus für den beanspruchten therapeutischen Effekt hergestellt oder herleitbar. Bestimmte verwandte Verbindungen werden auch als Zwischenproduktverbindungen bei der Herstellung von Flüssigkristallen verwendet.
In spezifischer Weise beanspruchen Tomcufcik et al in US 3,784,701 bestimmte substituierte Benzoylpropionsäuren zur Behandlung von Entzündung und Schmerz. Diese Verbindungen schließen 3-Biphenoylpropansäure (auch Fenbufen genannt) ein: Fenbufen
Child et al. J. Pharm.Sci. 66, 466, 1977, beschreiben Struktur- Aktivitätsbeziehungen verschiedener Analoga von Fenbufen. Diese schließen verschiedene Verbindungen ein, in denen das Biphenyl-Ringsystem oder das Propansäure-Teilstück mit Phenyl, Halogen, Hydroxyl oder Methyl substituiert oder die Carbonsäure- oder Carbonyl-Funktionen in eine Vielzahl von Derivaten überführt sind. Es sind keine Verbindungen beschrieben, die ein 4'-substituiertes Biphenyl- und ein substituiertes Propansäure-Teilstück, kombiniert in 1 Molekül, enthalten. Die im folgenden dargestellten Phenyl-(Verbindungen XLIX und LXXVII) und Methyl-(Verbindung XLVII) substituierten Verbindungen sind als inaktiv beschrieben:
Kameo et al. Chem. Pharm. Bull. 36, 2050, 1988, und Tomizawa et al. JP 62132825 A2, beschreiben bestimmte substituierte 3- Biphenoylpropionsäure-Derivate und Analoga davon, einschließlich der folgenden. Verschiedene Verbindungen mit weiteren Substituenten am Propionsäure-Teilstück sind beschrieben, enthalten aber keine Biphenyl- Reste.
worin X = H, 4'-Br, 4'-Cl, 4'-CH&sub3; oder 2'-Br.
Cousse et al. Eur. J. Med. Chem., 22, 45, 1987, beschreiben die folgenden Methyl- und Methylen-substituierten 3-Biphenoylpropan- und -propensäuren. Die entsprechenden Verbindungen, in denen das Carbonyl durch entweder CH&sub2;OH oder CH&sub2; ersetzt ist, sind ebenfalls beschrieben:
worin X = H, Cl, Br, CH&sub3;O, F oder NH&sub2;.
Nichl et al. DE 1957750, beschreiben ebenfalls bestimmte der obigen Methylen-substituierten Biphenoylpropansäuren.
El-Hashash et-al. Revue Roum. Chim. 23, 1581, 1978, beschreiben Produkte, die aus β-Aroylacrylsäureepoxiden, einschließlich der folgenden Biphenylverbindung, abgeleitet sind. Es sind keine Verbindungen beschrieben, die am Biptrenyl-Teilstück substituiert sind:
Kitamura et al. JP 60209539, beschreiben bestimmte Biphenylverbindungen, die als Zwischenproduktverbindungen zur Erzeugung von Flüssigkristallen, einschließlich der folgenden, verwendet werden. Das Biphenyl ist in diesen Zwischenproduktverbindungen nicht substituiert:
worin R¹ ein Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist.
Thyes et al. DE 2854475, verwenden die folgende Verbindung als eine Zwischenproduktverbindung. Die Biphenylgruppe ist nicht substituiert:
Sammour et al. Egypt. J. Chem. 15, 311, 1972, und Couquelet et al. Bull. Soc. Chim. Fr. 9, 3196, 1971, beschreiben bestimmte Dialkylaminosubstituierte Biphenoylpropansäuren, einschließlich der folgenden. In keinem Fall ist die Biphenylgruppe substituiert:
worin R¹, R² = Alkyl, Benzyl, H oder, zusammen mit dem Stückstoff, Morpholinyl.
Weitere Autoren haben eine Reihe Biphenyl-haltiger Carbonsäuren, dargestellt durch die unten angegebene Verbindung, offenbart, welche Neural-Endopeptidase (NEP 24.11), eine Membran-gebundene Zink- Metalloprotease, inhibieren (Stanton et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 539, 1994; Lombaert et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2715, 1994; Lombaert et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 145, 1995; Lombaert et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5,151, 1995):
Es ist berichtet worden, dass N-Carboxyalkyl-Derivate, enthaltend ein Biphenylethylglycin, dargestellt durch die unten angegebene Verbindung, Inhibitoren von Stromelysin-1 (MMP-3), 72 kDA-Gelatinase (MMP-2) und von Kollagenase sind (Durette et al. WO-9529689):
D1 (WO 96/15096), die zum Stand der Technik gemäß Art. 54(3) und (4) EPU gehört, offenbart bestimmte Verbindungen mit MMP-Inhibitoraktivität, welche sich jedoch strukturell von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung unterscheiden.
Es wäre wünschenswert, wirkungsvolle MMP-Inhibitoren in der Hand zu haben, welche eine verbesserte Bioverfügbarkeit und biologische Stabilität gegenüber den Peptid-basierten Verbindungen des Standes der Technik besitzen und zur Anwendung gegen besondere Ziel-MMPs optimiert werden können. Solche Verbindungen sind Gegenstand der vorliegenden Anmeldung.
Die Entwicklung wirksamer MMP-Inhibitoren würde neue Therapien für Krankheiten ergeben, die durch das Vorliegen oder einen Überschuss von MMP- Aktivität mediiert werden, einschließlich Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, septicher Arthritis, Tumor-Metastase, Periodontalkrankheiten, Kornealgeschwüren und Proteinurie. Verschiedene Inhibitoren von MMPs sind in der Literatur beschrieben worden, einschließlich Thiolen (Beszant et al. J. Med. Chem. 36, 4030, 1993), Hydroxamsauren (Wahl et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 349, 1995; Conway et al. J. Exp. Med. 182, 449, 1995; Porter et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2741, 1994; Tomczuk et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 343, 1995; Castelhano et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 1415, 1995), Phosphor-basierten Säuren (Bird et al. J. Med. Chem. 37, 158, 1994; Morphy et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2747, 1994; Kortylewicz et al. J. Med. Chem. 33, 263, 1990) und Carbonsäuren (Chapman et al. J. Med. Chem. 36, 4293, 1993; Brown et al. J. Med. Chem. 37, 674, 1994; Morphy et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2747, 1994; Stack et al. Arch. Biochem. Biophys. 287, 240, 1991; Ye et al. J. Med. Chem. 37, 206, 1994K; Grobelny et al. Biochemistry 24, 6145, 1985; Mookhtiar et al. Biochemistry 27, 4299, 1988). Allerdings enthalten diese Inhibitoren im allgemeinen ein peptidisches Rückgrat und zeigen und ergeben deshalb gewöhnlich eine nur niedrige orale Bioaktivität wegen geringer Absorption und kurzen Halbwertszeiten wegen rascher Proteolyse. Daher besteht weiterhin ein Bedarf für verbesserte MMP-Inhibitoren.

Zusammenfassung der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung werden Verbindungen mit Matrix- Metalloprotease-Inhibitoraktivität bereitgestellt. Diese Verbindungen sind verwendbar zur Inhibierung von Matrix-Metalloproteasen und bekämpfen daher Krankheitsbedingungen bzw. entsprechende Zustände, zu denen MMPs beitragen. Demzufolge werden durch die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung derartiger Zustände und Bedingungen bereitgestellt und angegeben. Die beschriebenen Verbindungen betreffen ein Verfahren zur Behandlung des Menschen um einen Effekt zu erzielen, wobei der Effekt ist: Linderung von Osteoarthritis, rheumatoider- Arthritis, septischer Arthritis, Periodontalkrankheit, Kornealgeschwür, Proteinurie, aneurysmortischer Krankheit, dystrophober Epidermolyse- Bullosa, Bedingungen, die zu Entzündungsreaktionen führen, Osteopönien, mediiert durch MMP-Aktivität, Tempero-Mandibulargelenkskrankheit oder von Demyelinatierkrankheiten des Nervensystems; von Tumor-Metastase und degenerativem Knorpelverlust nach traumatischer Gelenksverletzung; und Herabsetzung von Koronar-Thrombose aus atherosklerotischem Plaque-Bruch. Die Verbindungen der Erfindung sind auch zur Geburtenkontrolle verwendbar. Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst die Verabreichung einer Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung der Erfindung, wie oben und detaillierter in der nun folgenden detaillierten Beschreibung beschrieben, wobei die Verabreichung wirksam ist, die Aktivität von zumindest einer Matrix-Metalloprotease zu inhibieren, was dann zur Erzielung des angestrebten Effekts führt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich ebenfalls als wissenschaftliche Forschungswerkzeuge zur Untersuchung von Funktionen und Mechanismen der Wirkung von Matrix- Metalloproteasen sowohl in in vivo- als auch in in vitro-Systemen. Wegen ihrer MMP-Inhibieraktivität können die vorliegenden Erfindungen zur Modulierung der MMP-Wirkung verwendet werden, um es dadurch für den Forscher zu ermöglichen, die Effekte verringerter MMP-Aktivität im experimentellen biologischen System zu beobachten, das untersucht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen mit Matrix- Metalloprotease-Inhibitoraktivität gemäß Anspruch 1.
Pharmazeutisch geeignete Salze dieser Verbindungen liegen ebenfalls im Rahmen und Umfang der Erfindung.
In den meisten verwandten Bezugsverbindungen des Standes der Technik ist der Biphenyl-Teil des Moleküls unsubstituiert und der Propan- oder Butansäure-Teil ist entweder unsubstituiert oder weist eine einzelne Methyl- oder Phenylgruppe auf. Vom Vorliegen der größeren Phenylgruppe ist berichtet worden, dass entsprechende Verbindungen des Standes der Technik inaktiv als entzündungshemmende analgetische Mittel sind. Siehe z. B. Child et al. J. Pharm. Sci. 66, 466, 1977. Im Gegensatz dazu, ist nun herausgefunden worden, dass Verbindungen, die potente MMP- Inhibitoraktivität zeigen und ergeben, einen Substituent signifikanter Größe am Propanoyl- oder Butanoyl-Teilstück des Moleküls enthalten. Die Biphenyl-Teilstücke der besten MMP-Inhibitoren enthalten auch einen Substituent an der 4'-Position, obwohl, wenn die Propanoyl- und Butanoyl- Teilstücke optimal substituiert sind, die unsubstituierten Biphenylverbindungen der Erfindung hinreichende Aktivität aufweisen, um als realistische Kandidaten für ein Arzneimittel betrachtet zu werden.
Alle Patente und weiteren Publikationen, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Durch die vorliegende Erfindung werden Verbindungen mit Matrix- Metalloprotease-Inhibitoraktivität bereitgestellt. Diese Verbindungen sind verwendbar zur Inhibierung von Matrix-Metalloproteasen und bekämpfen daher Krankheitszustände und entsprechende Bedingungen, zu denen MMPs beitragen. Demzufolge werden durch die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzung und Verfahren zur Behandlung derartiger Zustände und Bedingungen bereitgestellt und angegeben. Die beschriebenen Verbindungen beziehen sich auf ein Verfahren zur Behandlung des Menschen, um einen Effekt zu erzielen, wobei der Effekt ist: Linderung von Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Periodontalkrankheit, Kornealgeschwür, Proteinurie, aneurysmortischer Krankheit, dystrophober Epidermolyse-Bullosa, Krankheitsbedingungen, die zu Entzündungsreaktionen führen, Osteopönien, mediiert durch MMP-Aktivität, Tempero-Mandibular- Gelenkskrankheit oder von Demyelinatierkrankheiten des Nervensystems; von Tumor-Metastase und generativem Knorpelverlust nach traumatischer Gelenksverletzung und Herabsetzung von Koronar-Thrombose aus atherosklerotischem Plaque-Bruch. Die Verbindungen der Erfindung eignen sich ebenfalls zur Geburtenkontrolle. Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst die Verabreichung einer Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung der Erfindung, wie oben und detaillierter in der nun folgenden detaillierten Beschreibung beschrieben, wobei die Verabreichung wirkungsvoll ist, die Aktivität von zumindest einer Matrix-Metalloprotease zu inhibieren, was zur Erzielung des angestrebten Effekts führt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich ebenfalls als wissenschaftliche Forschungswerkzeuge zur Untersuchung von Funktionen und Mechanismen der Wirkung von Matrix-Metalloproteasen sowohl in in vivo- als in in vitro-Systemen. Wegen ihrer MMP-inhibierenden Aktivität können die vorliegenden Verbindungen verwendet werden, die MMP-Wirkung zu modulieren, wodurch es für den Forscher ermöglicht wird, die Effekte verringerter MMP- Aktivität im experimentellen biologischen System zu beobachten, das untersucht wird.
Insbesondere sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Materialien mit Matrix-Metalloprotease-Inhibitoraktivität gemäß Anspruch 1.
Über die vorliegende Anmeldung hinweg zeigt, in den dargestellten chemischen Strukturen eine offene Bindung den Punkt an, bei welchem die Struktur mit einer anderen Gruppe verbunden ist. Beispielsweise ist:
worin R&sup5;&sup0;:
ist,
die Struktur dann:
Die Verbindungen der Erfindung weisen die Formel auf:
worin x 1 oder 2 ist, 1 Substituentengruppe T an der 4-Position des A- Rings, relativ zum Bindungspunkt zwischen den A- und B-Ringen, angeordnet ist, n = 1 bis 5 und R²&sup4; steht ortho, meta oder para zum (CH&sub2;)n und ist aus einem der folgenden Reste ausgewählt:
Die Substituentengruppe T dieses Untergruppensatzes ist Halogen,
oder
T ist am meisten bevorzugt Cl und liegt in der para-Position des A- Rings, relativ zum B-Ring, vor. Die Verbindung 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[3-(1- piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure ist aus dem Umfang der vorliegenden Anmeldung ausgeschlossen.
Die Erfindung betrifft auch bestimmte Zwischenproduktverbindungen zur Verwendung in der Synthese einiger der beanspruchten Inhibitoren. Diese Zwischenproduktverbindungen sind Verbindungen der verallgemeinerten Formel:
worin n = 1 bis 5, R²¹ ein Halogen und R²² H oder eine Alkyl- (vorzugsweise Ethyl) oder Allylalkyl- (worin der Alkylrest vorzugsweise Methyl ist) Gruppe sind.
Der Durchschnittsfachmann erkennt, dass viele der Verbindungen der Erfindung in enantiomeren oder diastereomeren Formen vorliegen, und dass es im Stand der Technik selbstverständlich ist, dass solche Stereoisomere im allgemeinen unterschiedliche Aktivitäten in biologischen Systemen zeigen und ergeben. Die vorliegende Erfindung umfasst alle möglichen Stereoisomeren, die Inhibitoraktivität gegen eine MMP besitzen, unabhängig von deren stereoisomeren Bezeichnungen, sowie Mischungen aus Stereoisomeren, in denen mindestens ein Mitglied Inhibitoraktivität besitzt.
Die am meisten bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden nun aufgezeigt und in der folgenden Liste genannt:
I) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[2-[[(2-phenylethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
II) 4'-Chlor-α-[2-[2-[[(4-morpholinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'- biphenyl]-4-butansäure
III) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[2-[[(phenylmethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
IV) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[2-[[(3- phenylpropyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure,
V) 4-Chlor-γ-oxo-α-[2-[2-(1-piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-[1,1'- biphenyl]-4-butansäure
VI) 4'-Chlor-α-[2-2-[[(3-methylbutyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
VII) 4'-Chlor-α-[2-[2-[[(3-ethoxy-3-oxopropyl)amino]carbony]phenyl]ethyl]- γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
VIII) 4'-Chlor-α-[2-[2-[2-[[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- γ-oxo-[1,1-biphenyl]-4-butansäure
IX) 4'-Chlor-α-[2-[2-[[(2-ethoxy-2-oxoethyl)methylamino]carbonyl]- phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1-biphenyl]-4-butansäure
X) 4'-Chlor-α-[2-[3-(4-morpholinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1- biphenyl]-4-butansäure
XI) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[3-(1-piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-[1,1'- biphenyl]-4-butansäure
XII) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[3-[[(2-phenylethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XIII) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[3-[[(3- phenylpropyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XIV) 4'-Chlor-α-[2-[3-[[(3-methylbutyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XV) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[3-[[(phenylmethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XVI) 4'-Chlor-α-[2-[3-[[(2-ethoxy-2- oxoethyl)methylamino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo-]-[1,1'-biphenyl]-4- butansäure
XVII) 4'-Chlor-α-[2-[4-(4-morpholinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'- biphenyl]-4-butansäure
XVIII) 4'-Chlor-α-[2-4-[[(3-methylbutyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γoxo-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XIX) 4'-Chlor-α-[2-[4-[[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XX) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[4-[[(2-phenylethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXI) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[4-(1-piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]-[1,1'- biphenyl]-4-butansäure
XXII) 4'-Chlor-γ-oxo-α-[2-[2-[[(2- carboxyethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXIII) α-[2-[2-[[(2-Carboxymethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-4'- chlor-γ-oxo-]-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXIV) α-[2-[4-[[2-Carboxymethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-4'-4'-chlor-γoxo-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXV) 4'-Chlor-α-[2-[2-[[(2-(4- morpholinyl)ethyl]amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4- butansäure
XXVI) α-[2-[3-[[(2-Carboxyethyl)amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-4'-chlor-γoxo-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXVII) 4'-Chlor-α-[2-[3-[[(2- morpholinyl)ethyl]amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4- butansäure
XXVIII 4'-Chlor-α-[2-[3-[[[2-(dimethylamino)-2- oxoethyl]methylamino]carbonyl]-phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4- butansäure
XXIX) 4'-Chlor-α-[2-4-[[[2-(4- morpholinyl)ethyl]amino]carbonyl]phenyl]ethyl]-γ-oxo-[1,1'-biphenyl]-4- butansäure
XXX) γ-Oxo-4'-(phenylmethoxy)-α-[2-3-(1-piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure
XXXI) γ-Oxo-4'-(pentyloxy)-α-[2-[3-(1-piperidinylcarbonyl)phenyl]ethyl]- [1,1'-biphenyl]-4-butansäure und
XXXII) γ-Oxo-α-[2-[2-[[(2-oxo-1-piperidinyl)methyl]phenyl]ethyl]-4'- (phenylmethoxy)-[1,1'-biphenyl]-4-butansäure.

Allgemeine präparative Verfahren

Die Verbindungen der Erfindung können durch Anwendung bekannter chemischer Reaktionen und Verfahren hergestellt werden. Dennoch werden die folgenden allgemeinen präparativen Vorgehensweisen dargelegt, um dem Leser bei der Synthese der Inhibitoren zu helfen, wobei detailliertere besondere Beispiele weiter unten im Experimentalabschnitt angegeben sind, worin die Ausführungsbeispiele beschrieben sind.
Geeignete pharmazeutisch zulässige Salze der Verbindung der vorliegenden Erfindung schließen Additionssalze ein, die mit organischen oder anorganischen Basen gebildet werden. Das Salz-bildende Ion, das aus solchen Basen abgeleitet wird, kann ein Metallion, z. B. Aluminium, Alkalimetallionen, wie Natrium oder Kalium, Erdalkalimetallionen, wie Calcium oder Magnesium, oder ein Aminsalz-Ion sein, von denen eine Anzahl für diesen Zweck bekannt sind. Beispiele schließen Ammoniumsalze, Arylalkylamine wie Dibenzylamin und N,N-Dibenzylethylendiamin, Niederalkylamine wie Methylamin, t-Butylamin, Procain, Niederalkylpiperidine wie N-Ethylpiperidin, Cycloalkylamine wie Cyclohexylamin oder Dicyclohexylamin, 1-Adamantylamin, Benzathin oder aus Aminosauren wie Arginin, Lysin oder dgl. abgeleitete Salze ein. Die physiologisch zulässigen Salze wie die Natrium- oder Kaliumsalze und die Aminosäure-Salze können medizinisch angewandt werden, wie unten beschrieben, und sie sind bevorzugt.
Diese und weitere Salze, die nicht unbedingt physiologisch zulässig sind, eignen sich zur Isolierung und Reinigung eines Produkts, das sich für die unten beschriebenen Zwecke eignet. Beispielsweise kann die Verwendung von im Handel erhältlichen enantiomer-reinen Aminen wie von (+)-Cinchonin in geeigneten Lösungsmitteln Salzkristalle eines Einzelenantiomers der Erfindungsverbindungen ergeben, wobei das entgegengesetzte Enantiomer in Lösung in einem Verfahren zurückbleibt, das oft als "klassische Auftrennung" bezeichnet wird. Da das eine Enantiomer einer gegebenen Erfindungsverbindung gewöhnlich einen wesentlich größeren physiologischen Effekt als sein Antipode aufweist, kann dieses aktive Isomer somit in gereinigter Form entweder in den Kristallen oder der flüssigen Phase aufgefunden werden. Die Salze werden erzeugt, indem die Säure-Form der Erfindungsverbindung mit einem Äquivalent der Base, die das gewünschte basische Ion stellt, in einem Medium, worin das Salz ausfällt, oder in wässrigem Medium zur Reaktion gebracht und dann lyophyilisiert wird. Die freie Säure-Form ist aus dem Salz durch herkömmliche Neutralisationstechniken, z. B. mit Kaliumbisulfat, Salzsäure usw., erhältlich.
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist, gefunden worden, dass sie die Matrix-Metalloproteasen MMP-3, MMP-9 und MMP-2 und zu einem geringeren Ausmaß MMP-1 inhibieren, weshalb sie zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheitszuständen bzw. entsprechenden Bedingungen verwendet werden können, die Am Abschnitt über den Hintergrund der Erfindung abgehandelt wurden. Da weitere MMPs, die oben nicht aufgelistet sind, einen hohen Grad an Homologie mit den oben aufgelisteten, besonders in der katalytischen Stelle, teilen, wird davon ausgegangen, dass Verbindungen der Erfindung auch derartige weitere MMPs in schwankenden Graden inhibieren sollten. Durch Variation der Substituenten an den Biaryl- Teilstücken der Moleküle sowie derjenigen der Propan- oder Butansäure- Ketten der beanspruchten Verbindungen ist belegt worden, dass die relative Inhibierung der aufgelisteten MMPs beeinflusst wird. Somit können Verbindungen der allgemeinen Klasse durch Auswahl spezifischer Substituenten so "abgetönt" werden, dass die Inhibierung spezifischer MMP(s) im Zusammenhang mit spezifischen pathologischen Bedingungen ausgeweitet werden kann, während nicht-betroffene MMP(s) weniger beeinflusst zuruckbleiben.
Das Verfahren zur Behandlung von durch Matrix-Metalloproteasen mediierten Krankheitsbedingungen kann bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, angewandt werden, welche unter derartigen Bedingungen leiden.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung werden für veterinär- und humanmedizinische Anwendungen in Betracht gezogen. Für solche Zwecke werden sie in pharmazeutischen Zusammensetzungen angewandt, die den oder die Wirkbestandteil(e) plus einen oder mehrere pharmazeutisch zulässige Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Bindemittel und weitere Exzipienten, abhängig von der in Betracht gezogenen Verabreichungsart und Dosierungsform, enthalten.
Die Verabreichung der Inhibitoren erfolgt auf geeignete Weise, die dem Fachmann bekannt ist. Beispiele geeigneter parenteraler Verabreichung schließen intravenöse, intraartikulare, subkutane und intramuskuläre Wege ein. Intravenöse Verabreichung kann angewandt werden, um eine akute Regulierung von Spitzen-Plasmakonzentrationen der Arznei zu erhalten. Verbesserte Halbwertszeit und Zielgerichtetheit der Arznei zu den Gelenkshöhlen können durch Einfangen der Arznei in Liposome begünstigt werden. Dabei ist es auch möglich, die Selektivität der liposomalen Zielgerichtetheit auf die Gelenkshöhlen durch Einbringung von Liganden in das Äußere der Liposomen zu verbessern, welche an synovial-spezifische Makromoleküle gebunden werden. Alternativ dazu, kann eine intramuskuläre, intraartikulare oder subkutane Depot-Injektion mit oder ohne Verkapselung der Arznei zu abbaubaren Mikrokugeln z. B. aus Poly(DL-lactid-co-glycolid) angewandt werden, um eine verlängert beibehaltene Freisetzung der Arznei zu erzielen. Zur verbesserten Bequemlichkeit der Dosierungsform ist es auch mölgich, ein i.p. implantiertes Reservoir und Septum wie das von Pharmacia verfügbare Percuseal-System anzuwenden. Verbesserte Bequemlichkeit und Patientenverträglichkeit können auch durch die Anwendung von entweder Injektornadeln (z. B. die Novo Pin oder Q-pen) oder von Nadelfreien Strahlinjektoren (z. B. von Bioject, Mediject oder Beeton Dickinson) bewerkstelligt werden. Verlängerte Null-Ordnung oder weitere präzise gesteuerte Freisetzung wie eine pulsatile Freisetzung können nach Bedarf mit implantierbaren Pumpen unter Abgabe der Arznei durch eine Kanüle in die Synovialräume bewerkstelligt werden. Beispiele schließen die subkutan implantierten Osmosepumpen ein, erhältlich von ALZA, wie die ALZET-Osmose- Pumpe.
Nasale Abgabe kann durch Einbringung der Arznei in bioadhäsive teilchenförmige Träger (< 200 um) wie diejenigen aus Cellulose, Polyacrylat oder Polycarbophil, zusammen mit geeigneten Absorptionsverstärkern wie Phospholipiden oder Acylcarnitinen, bewerkstelligt werden. Verfügbare Systeme schließen die von DanBiosys und Scios Nova entwickelten ein.
Ein bemerkenswertes Attribut der Verbindungen der vorliegenden Erfindung beruht im Gegensatz zu denen verschiedener peptidischer Verbindungen, auf die im Abschnitt über den Hintergrund der vorliegenden Anmeldung Bezug genommen wurde, beruht auf der dargelegten oralen Aktivität der vorliegenden Verbindungen. Bestimmte Verbindungen haben eine orale Bioverfügbarkeit in verschiedenen Tier-Modellen von bis zu 90 bis 98% gezeigt und ergeben. Orale Abgabe kann durch Einbringung der Arznei in Tabletten, überzogene Tabletten, Dragees, Hart- und Weich-Gelatine-Kapseln, Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen bewerkstelligt werden. Orale Abgabe kann auch durch Einbringung der Arznei in enterisch überzogene Kapseln bewerkstelligt werden, die dazu entworfen sind, die Arznei im Darm freizusetzen, wo die Verdauungsprotease-Aktivität niedrig ist. Beispiele schließen die OROS-CT/OsmetTM- und PULSINCAPTM-Systeme von ALZA bzw. Scherer Drug Delivery Systems ein. Weitere Systeme verwenden Azo-vernetzte Polymere, die durch Darm-spezifische bakterielle Azo-Reduktasen abgebaut werden, oder pH-empfindliche Polyacrylat-Polymere, die durch den pH-Anstieg am Darm aktiviert werden. Die obigen Systeme können zusammen mit einem weiten Bereich verfügbarer Adsorptionsverstärker angewandt werden.
Rektale Abgabe kann durch Einbringung der Arznei in Suppositorien bewerkstelligt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zu den oben aufgelisteten Formulierungen durch Zugabe verschiedener therapeutisch inerter, anorganischer oder organischer Trägermittel zubereitet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Entsprechende Beispiele schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talkum, Pflanzenöle, Wachse, Fette, Polyole wie Polyethylenglycol, Wasser, Saccharose, Alkohole, Glycerin und dgl. ein. Verschiedene Konservierungsstoffe, Emulgatoren, Dispergiermittel, Geschmacksstoffe, Benetzungsmittel, Antioxidanzien, Süßungsmittel, Farbstoffe, Stabilisiermittel, Salze, Puffer und dgl. werden ebenfalls zugefügt, um nach Bedarf einen Beitrag zur Stabilisierung der Formulierung bzw. Zubereitung oder zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit des oder der Wirkbestandteile zu leisten, um eine Formulierung mit akzeptablem Geschmack oder Geruch im Fall oraler Dosierung zu ergeben.
Die anzuwendende Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung hängt vom Empfänger und der zu behandelnden Krankheitsbedingung ab. Die erforderliche Menge kann ohne unangemessenen Versuchsaufwand durch Protokolle ermittelt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Alternativ dazu, kann die erforderliche Menge auf der Basis einer Bestimmung der Menge an Ziel-Enzym berechnet werden, welches inhibiert werden muss, um die jeweiligen Krankheitszustände bzw. die entsprechenden Bedingungen zu behandeln.
Die Matrix-Metalloprotease-Inhibitoren der Erfindung sind nicht nur zur Behandlung der oben diskutierten physiologischen Bedingungen, sondern auch auf solchen Gebieten wie der Reinigung von Metalloproteasen und zum Test der Matrix-Metalloprotease-Aktivität anwendbar. Solche Aktivitätstests können sowohl in vitro mit natürlichen oder synthetischen Enzym- Zubereitungen oder in vivo mit z. B. Tier-Modellen durchgeführt werden, in denen abnorme destruktive Enzym-Gehaltsmengen spontan vorgefunden (Anwendung genetisch mutierte oder transgener Tiere) oder durch Verabreichung exogener Mittel oder durch chirurgischen Eingriff induziert werden, der die Gelenkstabilität zerbricht.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sind lediglich zur weiteren Verdeutlichung angegeben und sind in keiner Weise darauf gerichtet noch dazu erstellt, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.

Allgemeine Vorgehensweisen:

Alle Reaktionen wurden in Flamm - oder Ofen-getrockneten Glasgeräten unter einem positiven Argon-Druck durchgeführt und magnetisch gerührt, wennnichts Anderes ausgesagt ist. Empfindliche Flüssigkeiten und Lösungen wurden über Spritze oder Kanüle übertragen und in Reaktionsgefäße durch Gummi-Verschlußkappen hindurch eingebracht. Reaktionsprodukt-Lösungen wurden in einem Büchi-Verdampfer eingeengt, wenn nichts Andres ausgesagt ist.

Materialien:

Reagenzien und Lösungsmittel vom handelsüblichen-Reinheitsgrad wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt, mit der Ausnahme, dass Diethylether und Tetrahydrofuran gewöhnlich unter Argon aus Benzophenon-Ketyl und Methylenchlorid unter Argon aus Calciumhydrid destilliert wurden. Viele der speziellen organischen oder organometallischen Ausgangsmaterialien und der Reagenzien wurden von Aldrich, 1001 West Saint Paul Avenue, Milwaukee, WI 53233, erhalten. Lösungsmittel wurden oft von EM Science erhalten, wie sie von VWR Scientific im Handel verteilt werden.

Chromatografie:

Analytische Dünnschicht-Chromatografie (TLC) wurde an Analtech®- vorüberzogenem Glas-gestützten Kieselgel GHLF 250 mm Platten durchgeführt. Die Sichtbarmachung der Flecken erfolgte mit einer der folgenden technischen Verfahrensweisen: (a) UV-Beleuchtung, (b) Behandeln mit Jod- Dampf, (c) Eintauchen der Platte in eine 10%-ige Lösung von Phosphomolybdänsäure in Ethanol und anschließendes Erwärmen und (d) Eintauchen der Platte in eine 3%-ige Lösung von p-Anisaldehyd in Ethanol, enthaltend 0,5% konz. Schwefelsäure, und anschließendes Erwärmen.
Säulen-Chromatografie wurde mit 230 bis 400 Mesh EM Science®- Kieselgel durchgeführt.

Geräteausstattung:

Schmelzpunkte (F.) wurden mit einem Thomas-Hoover-Schmelzpunktsgerät bestimmt und sind unkorrigiert.
Proton(¹H)-Kernmagnetische Resonanz (NMR)-Spektren wurden mit einem General Electric GN-OMEGA 300 (300 MHz)-Spektrometer und Kohlenstoff dreizehn-(¹³C)-NMR-Sektren wurde mit einem General Electric GN-OMEGA 300 (75 MHz)-Spektrometer gemessen. Die meisten der in den unten angegebenen Versuchen synthetisierten Verbindungen wurden mit NMR analysiert, und die Spektren stimmten mit den vorgeschlagenen Strukturen in jedem Fall überein.
Massenspektren (MS)-Daten wurden an einem Kratos Concept 1-H- Spektrometer durch Flüssig-Cäsium-Sekundärion (LCIMS), einer modernisierten Version von schneller Atom-Bombardierung (FAB), erhalten. Die meisten in den unten angegebenen Versuchen synthetisierten Verbindungen wurden durch Massenspektroskopie analysiert, und die Spektren stimmten mit den vorgeschlagenen Strukturen in jedem Fall überein.

Allgemeine Bemerkungen:

Für mehrstufige Verfahren sind aufeinander folgende Stufen durch Zahlen beziffert. Variationen innerhalb der Stufen sind mit Buchstaben bezeichnet. Gestrichelte Linien in den Tabellendaten zeigen den Bindungspunkt an. Beispiel 1 - Herstellung der Verbindung 1
Stufe 1: Eine Lösung von o-Jodphenylessigsäure (19,87 g, 75,83 mMol) in trockenem Tetrahydrofuran (110 mL) wurde 41 min lang zu einer Lösung von Boran in Tetrahydrofuran (151 ml 1 M Lösung, ca. 151,0 mMol) getropft, welche mit einem Eiswasser-Bad gekühlt wurde. Die Reaktion wurde bei 0 bis 10ºC 2 h 15 min lang gerührt. Nach Abkühlung der Reaktionsmischung auf 0ºC wurde sie durch vorsichtige Zugabe (Schäumen!) von 10 (Vol.)% Essigsäure in Methanol 20 min lang abgeschreckt. Es wurde 25 min lang weitergerührt, bevor die Reaktionsmischung an einem Rotationsverdampfer eingeengt wurde. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst und mit gesättigtem Ammoniumchlorid und dann mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen. Die organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem gelben Öl (18,07 g) eingeengt, welches in der nächsten Stufe ohne Reinigung eingesetzt wurde. Reines 2-(2-Jodphenyl)ethanol (17,75 g, 71,55 mMol) wurde tropfenweise mit Phosphortribromid (3,5 mL, 36,85 mMol) 6 min lang behandelt, wobei das Reaktionsgefäß in ein Wasser-Bad gegeben wurde, um die exotherme Reaktion zu modulieren. Es wurde 15 min lang bei Raumtemperatur und dann 2 h lang weitergerührt, wobei die Mischung in einem Öl-Bad bei 100ºC erhitzt wurde. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ether verdünnt und vorsichtig mit Wasser abgeschreckt (Schäumen/exotherm!). Die Schichten wurden getrennt, die organischen Phasen wurden mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Einengen ergab ein gelbes Öl, das durch Kugelrohr-Destillation (140ºC/700 Millitorr) gereinigt wurde, um ein farbloses Öl zu ergeben (19,50 g, 62,71 mMol; 83% Ausbeute für die obigen beiden Stufen). MS (EI) 310,312 [M]&spplus;
Stufe 2: Ein trockener 250 mL Rundkolben wurde mit einem Rührstab und einem Argon-Einlass versehen. In den Kolben wurde eine Suspension aus Natriumhydrid (1,65 g 95%iges NaH; ca. 65,1 mMol) in trockenem THF (25 mL) gegeben. Diethylmalonat (9,99 g, 62,37 mMol) wurden via Spritze 25 min lang zugetropft. Frisches THF (10 mL) wurde verwendet, um die Zutropfspritze in das Reaktionsgefäß hinein auszuwaschen. Es wurde 10 min lang weitergerührt, bevor das Bromid aus Stufe 1 (19,36 g, 62,26 mMol) in THF (20 ml) rasch zugegeben wurde. Die Zugabespritze wurde in die Reaktion hinein ausgewaschen (10 mL THF). Die blass gelbe Lösung wurde am Rückfluß unter Argon unter Rühren über Nacht erhitzt. Die weiße Suspension wurde zwischen 10%iger HCl und Ether verteilt. Die Ether-Schicht wurde 2 Mal mit NaHCO&sub3; gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem Öl eingeengt, das durch Blasezu-Blase-Destillation gereinigt wurde: Eine vorauslaufende Fraktion (gesammelt bei 145ºC, 700 bis 900 Millitorr) wurde verworfen, und die Hauptmenge destillierte bei 220ºC (500 bis 600 Millitorr). Die Hauptfraktion wurde durch Abdestillieren von niedriger siedendem Material bei 150ºC (300 bis 500 Millitorr) weiter gereinigt, um das reine gewünschte Produkt im Topf zurückzulassen (15,28 g, 39,16 mMol; 63% Ausbeute). TLC (2 Mal entwickelt in Hexanen-Ethylacetat, 20 : 1): Rf = 0,33
Stufe 3: Ein 2 L Dreihalsrundkolben wurde mit einem mechanischen Rührer, einem Thermometer und einem Argon-Einlass ausgestattet. In den Kolben wurde eine Lösung von 4-Chlorbiphenyl (48,30 g, 0,256 Mol) in Dichlormethan (500 mL, aus frisch geöffneter Flasche) gegeben. Bromacetylbromid (23 ml, ca. 53,3 g, ca. 0,26 Mol) wurden via Spritze zugegeben, und die Lösung wurde mit einem Eiswasser-Bad auf eine Innentemperatur von 3ºC gekühlt. Das Thermometer wurde zeitweise herausgenommen, und AlCl&sub3; wurde in Anteilen 5 min lang zugegeben. Die Innentemperatur stieg auf 10ºC an, und weißes Gas entwickelte sich aus der opaken olivgrünen Reaktionsmischung. Nach 24 h Rühren wurde die Reaktion durch vorsichtiges Gießen in kalte 10%ige HCl (1 L) abgeschreckt. Die organische Schicht wurde trüb gelb-grün. Chloroform wurde zugegeben, um die Auflösung von Feststoffen zu unterstützen, die organische Schicht wurde aber niemals durchsichtig, Die organischen Anteile wurden an einem Rotationsverdampfer eingeengt und unter Hochvakuum weiter getrocknet. Das Rohprodukt war ein blassgrüner Feststoff (ca. 82 g), der aus heißem Ethylacetat umkristallisiert wurde, um 1-(2-Bromethawon)-4-(4- chlorphenyl)benzol als braune Nadeln (58,16 g) zu ergeben. Einengen der Mutterlauge und anschließende Zugabe von Hexanen ergab eine zweite Ernte von Kristallen (11,06 g), welche ein NMR-Spektrum ergaben, das mit dem der ersten Ernte identisch war. Die Gesamtausbeute des Titelprodukts betrug 87%. TLC (Hexane-Dichlormethan, 2 : 1): Rf = 0,30
Stufe 4: Ein trockener 250 ml Rundhalskolben wurde mit einem Rührstab und einem Argon-Einlass versehen. In den Kolben wurde eine Suspension aus Natriumhydrid (1,07 g 95%iges NaH; ca. 42,4 mMol) in trockenem THF (100 ml) gegeben, und es wurde das Ganze mit einem Eiswasser-Bad gekühlt. Eine Lösung des Malonats aus Stufe 2 (15,25 g, 39,08 mMol) in THF (30 ml) wurde 30 min lang zugetropft. Frisches THF (10 ml) wurde mit einer Spritze zum Reaktionsgefäß gegeben, worauf das Kühlbad weggenommen wurde. Nach Rühren der Reaktion über 10 min wurde das Brommethylketon aus Stufe 3 in einer Einzelportion zugegeben. Die orangefarbene Mischung wurde unter Argon über Nacht gerührt, wobei dann langsam auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig zu 10%iger HCl gegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden nacheinander mit 10%iger HCl und gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingeengt, um ein orange-braunes Öl (24,41 g) zu ergeben. Das Rohmaterial wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.
Das rohe Öl (24,19 g, ca. 39,08 mMol) wurde in THF (150 ml) und absolutem Ethanol (100 ml) gelöst. Zu dieser Mischung wurde NaOH-Lösung (10 ml 50 Gew.-% wässrige NaOH, ca. 0,125 Mol) gegeben, und die Reaktion wurde unter Argon über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde auf einen pH von ca. 1 durch Zugabe von 10%iger HCl gebracht, und die trübe, gelbe Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzlauge gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem orangefarbenen Schaum eingeengt (22,06 g). Dieses Material wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt. TLC (Chloroform-Methanol, 20 : 1, mit Spur Essigsäure): Rf = 0,12
Stufe 5: Das Disäure-Produkt aus Stufe 4 (22,06 g) wurde in 1,4- Dioxan (400 mL) gelöst und am Rückfluß unter Argon über Nacht gehalten. Einengen ergab das Rohprodukt als gelben Feststoff (19,50 g), welcher aus Chloroform umkristallisiert wurde, um 2 Ernten der Titelverbindung als flaumigen Feststoff (11,55 g, 22,26 mMol; 57% Gesamtausbeute) nach Trocknung über Nacht in einem Vakuumofen bei 66ºC zu liefern. TLC (Chloroform-Methanol, 20 : 1, mit Spur Essigsäure): Rf = 0,54 Verbindung I
Stufe 6: Eine Teilmenge der Säure aus Stufe 5 (405,7 mg, 0,78 mMol) wurde in Dimethylsulfoxid (3,0 ml) gelöst. Triethylamin (0,34 ml) und dann Palladium(II)acetat (20,3 mg, 0,09 mMol), 1,3-Bis(diphenylphosphino)propan (35,2 mg, 0,085 mMol) und Phenethylamin (1,42 g, 11,7 mMol) wurden zugegeben. Kohlenmonoxid wurde durch die Lösung 5 min lang geleitet. Die Lösung wurde unter eine Kohlenmonoxid-Atmosphäre gestellt und in einem Öl- Bad bei 70 bis 75ºC über Nacht erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtempeatur abgekühlt, mit Ethylacetat (50 mL) verdünnt und mit 10%iger HCl und dann mit Wasser gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat rückextrahiert, und die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem gelb-orangefarbenen Feststoff eingeengt. Reinigung durch Blitzchromatografie (Chloroform-Methanol, 95 : 5) ergab einen off-weißen Feststoff, der aus Ethylacetat/Hexanen unikristallisiert wurde, um die Titelverbindung zu ergeben (219,7 mg, 0,41 mMol; 53% Ausbeute). Anal. (fur C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub0;NO&sub4;Cl) C: ber.: 73,39; gef.: 73,11; H: ber.: 5,60; gef.: 5,40; N: ber.: 2,59; gef.: 2,32
Die Beispiele in Tabelle I wurden durch das Palladium-medrierte Carbonylierungsverfahren des Beispiels 1 mit dem entsprechenden Man anstatt dem Phenethylamin hergestellt. Ferner wurden die erforderlichen isomeren Jod-Vorstufenverbindungen mit dem Verfahren des Beispiels 1 mit m- oder p-Jodphenylessigsaure als Ausgangsmaterial hergestellt. Tabelle I Beispiel 22 - Herstellung der Verbindung XXII Verbindung XXII
Die Saure aus Beispiel 7 (200 mg, 0,37 mMol) wurde in Ethanol (15 mL) gelöst und mit 1 N NaOH (1,8 mL, 1,8 mMol) behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über das Wochenende gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen Chloroform und 10%-iger HCl verteilt. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde erneut mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem off-weißen Feststoff eingeengt. Das Rohrprodukt wurde aus Ethanol-Hexan uxnkristallisiert, um das Produkt als off-weiße Kristalle zu ergeben (65 mg, 0,128 mMol: 35% Ausbeute). F. = 189,5 bis 190,5ºC Beispiel 23 - Herstellung der Verbindung XXIII Verbindung XXIII
Die Saure aus Beispiel 8 (180 mg, 0,34 mMol) wurde gemäß dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 22 verseift, um das Disäure-Produkt als gelben Feststoff zu ergeben (142 mg, 85% Ausbeute). F. = 71-75ºC Beispiel 24: Herstellung der Verbindung XXIV Verbindung XXIV
Die Säure aus Beispiel 19 (104 mg, 0,199 mMol) wurde gemäß dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 22 verseift, um das Disäure-Produkt als farblose Kristalle zu ergeben (79 mg, 80% Ausbeute). F. = 164,5 bis 165,5ºC Beispiel 25 - Herstellung der Verbindung XXV
Stufe 1: Eine Probe der Jodsäure aus Beispiel 1, Stufe 5 (1,0 g, 1,93 mMol), wurde in trockenem Dichlormethan (20 ml) suspendiert. Zur gerührten Suspension wurden Benzylakohol (0,44 ml, 4,05 mMol), DCC (0,6 g, 2,89 mMol) und DMAP (50 mg, 0,39 mMol) gegeben. Die gelbe Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit Hexanen (60 ml) und Wasser (5 mL) verdünnt. Die Mischung wurde gerührt und filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Hexanen gewaschen. Die organischen Phasen wurden getrennt, getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem Öl eingeengt. Blitzchromatografie (Gradientelution: Hexan-Ethylacetat, 9 : 1 bis 1 : 1) ergab den gereinigten Ester als Öl (0,95 g, 1,56 mMol; 81% Ausbeute) TLC (Hexane- Ethylacetat, 1 : 1), Rf = 0,64
Stufe 2: Der Jodester aus Stufe 1 (0,910 g, 1,49 mMol) wurde dem Palladium-mediierten Carbonylierungsverfahren des Beispiels 1 mit Wasser anstatt Phenethylamin unterzogen, um das Halbsäure-Ester-Produkt zu ergeben (475 mg, 0,90 mMol; 61% Ausbeute). MS (FAB-LSIMS): 527 [M + H]&spplus;
Stufe 3: Der Halbsäureester aus Stufe 2 (0,46 g, 0,87 mMol) wurde in Dichlormethan (8 ml) gelöst. Zur Lösung wurden 4-(2-Aminoethyl)morpholin (0,13 g, 0,96 mMol) und 1-Hydroxybenztriazol (0,12 g, 0,87 mMol) gegeben. Der Kolben wurde mit Dichlormethan (2 ml) ausgewaschen und in einem Eis-Bad gekühlt. 4-Methylmorpholin (97 mg, 0,96 mMol) und dann 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (0,18 g, 0,96 mMol) wurden zugegeben. Die gelbe Lösung wurde auf Raumtemperatur unter Rühren über Nacht erwärmt, die Mischung wurde mit Dichlormethan (40 mL) verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingeengt. Reinigung durch Blitzchromatografie (Chloroform- Methanol, 95 : 5) ergab das Produkt als blassgelbes Öl (0,438 g, 0,685 mMol; 78% Ausbeute). TLC (Chloroform-Methanol, 9 : 1): Rf = 0,70 Verbindung XXV
Stufe 4: Die Säure aus Stufe 3 (0,15 g, 0,47 mMol) wurde gemäß dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 22 verseift, um das Produkt als cremefarbenen Schaum zu ergeben (65,2 mg, 52%). F. = 127-129ºC Beispiel 26 - Herstellung der Verbindung XXVI
Stufe 1: Das meta-Jod-Isomer von Beispiel 1, Stufe 5 (d. h., hergestellt gemäß dem Verfahren des Beispiels 1, beginnend mit m- Jodphenylessigsäure; 2,0 g, 3,86 mMol) wurde in 1,2-Dichlorethan (8 ml) gelöst. Zur Lösung wurden Ethanol (0,68 ml, 11,57 mMol) und einige Tropfer konzentrierte Schwefelsäure gegeben. Die Lösung wurde über Nacht am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde abgekühlt, auf eine Silika-Säule gegeben und Blitz-chromatografiert (Hexane-Ethylacetat, 3 : 1), um das Produkt als gelbes Öl zu ergeben (2,142 g), das gemäß Proton-NMR noch Lösungsmittel zurückhielt. TLC (Chloroform-Methanol, 10 : 1): Rf = 0,91
Stufe 2: Der Jodester aus Stufe 1 (2,1 g, 3,84 mMol) wurde dem Palladium-mediierten Carbonylierungsverfahren des Beispiels 1 mit Wasser anstatt Phenylethylamin unterzogen, um das Halbsäure-Ester-Produkt zu ergeben (1,1 g, 2,37 mMol; 62% Ausbeute). TLC (1 : 1 Hexan-Ethylacetat mit 1% Essigäsure): Rf = 0,70 Verbindung XXVI
Stufe 3: Der Halbsäureester aus Stufe 2 wurde in die Verbindung des Beispiels 26 mit β-Alaninethylester gemäß dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 25 überführt. F. = 261 bis 262ºC
Die Beispiele in Tabelle II wurden mit dem allgemeinen mehrstufigen Verfharen des Beispiels 25, ausgehend von der entsprechenden Jodsäure und den jeweiligen Amin-Vorstufenverbindungen, hergestellt: Tabelle 2 Beispiel 30 - Herstellung der Verbindung XXX
Stufe 1: In einen 1000 ml Rundhalskolben mit Argon-Einlaßadapter wurden 500 ml CH&sub2;Cl&sub2;, 4-Phenylphenolacetat (50,0 g, 235 mMol) und Bromacetylbromid (73,2 g, 31,6 ml, 363 mMol) gegeben und auf 0ºC abgekühlt, während Aluminiumtrichlorid (94,2 g, 707 mMol) in kleinen Anteilen 5 min lang zugegeben wurde. Die entstandene Mischung wurde 30 min lang bei 0ºC und 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zu kalter 10%iger HCl-Losung (500 ml) gegeben und 3 Mal mit 200 ml Anteilen Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingeengt, um einen schwarzen Feststoff zu ergeben. Umkristallisation aus Ethylacetat-Hexanen ergab 44,3 g (56%) der gewünschten Verbindung als braunen Feststoff. TLC (Hexane-Ethylacetat, 9 : 1) Rf = 0,14
Stufe 2: Die gewünschte Verbindung wurde aus dem Produkt von obiger Stufe 1 mit dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 synthetisiert. TLC (Hexane-Ethylacetat, 3 : 1) Rf = 0,49
Stufe 3: Eine Tetrahydrofuran (400 ml)- und Ethanol (50 mL) Lösung des Produkts aus Stufe 2 (18,4 g) wurde mit K&sub2;CO&sub3; behandelt und unter Argon bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Weil eine signifikante Menge Ausgangsmaterial zurückblieb, wurde das Volumen der Reaktion auf die Hälfte verringert, worauf zusätzliches K&sub2;CO&sub3; (12 g) zugegeben wurde. Die Reaktion war nach 3 h beendet. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und mit 10%iger HCl angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem braunen öligen Rückstand eingeengt. Reinigung durch Blitzchromatografie (Hexane-Ethylacetat, 3 : 1) ergab das Produkt als gelbes Öl (14,8 g; 86%). TLC (Hexane-Ethylacetat, 3 : 1) Rf = 0,20
Stufe 4: Eine Suspension aus NaH (95 Gew.-%, 143 mg, ca. 5,95 mMol) in trockenem DMF (10 ml) wurde in einem Eiswasser-Bad gekühlt und mit einer Lösung des Phenols aus Stufe 3 (3,4 g, 5,66 mMol) in trockenem DMF (20 ml) behandelt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, worauf Benzylbromid (3,4 ml, ca. 28,3 mMol) in einer Einzelportion zugegeben wurde. Der Kolben wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Mischung wurde mit 10%iger HCl verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem gelben Öl eingeengt. Blitzchromatografie (Gradientelution: Hexane-Ethylacetat, 9 : 1 bis 3 : 2) ergab den Zwischenprodukt-Diester (3,32 g). Dieses Material wurde in einer Mischung aus THF (25 ml), Ethanol (100 mL) und 1 N NaOH (22 ml) gelöst, worauf die Lösung über Nacht gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen 10%iger HCl und Ethylacetat verteilt. Die organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem weißen Feststoff (2,51 g) eingeengt. Diese Disäure wurde in 1,4- Dioxan (250 mL) gelöst, worauf die Lösung am Rückfluß über Nacht gehalten wurde. Die Lösung wurde abgekühlt und zu einem gelb-weißen Feststoff eingeengt (2,36 g). Umkristallisation aus Ethylacetat ergab gelbe Kristalle (1,77 g). F. = 173-174ºC, TLC (Hexane-Ethylacetat, 3 : 1, mit einer Spur Essigsäure) Rf = 0,43 Verbindung XXX
Stufe 5: Die Verbindung des Beispiels 30 wurde mit dem Palladium- mediierten Carbonylierungsverfahrens des Beispiels 1 mit Piperidin als Nukleophil hergestellt. F. = 100 bis 102,5ºC

Beispiel 31 - Herstellung der Verbindung XXXI

Die Verbindung des Beispiels 31 wurde mit dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 30 mit Jodpentan in der Alkylierungsstufe und Piperidin als dem Nukleophil in der Palladium-mediierten Carbonylierung hergestellt. F. = 105,5-107,5ºC Verbindung XXXII

Beispiel 32 - Herstellung der Verbindung XXXII

Die Verbindung des Beispiels 32 wurde mit dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 30 mit denr entsprechenden isomeren Jodvorstufenverbindung hergestellt. F. = 168-169ºC

Beispiel 33

Biologische Assays von Erfindungsverbindungen
P218-Quench-Fluoreszenzassay zur MMP-Inhibierung:
Der P218-gequenchte Fluoreszenzassay (Mikrofluorometrischer Profilierungsassay) ist eine Modifikation desjenigen, der ursprünglich von Knight et al. FEBS Lett. 296, 263, 1992, für eine verwandte Substanz und eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in Küvetten beschrieben wurde. Der Assay wurde mit jeder Erfindungsverbindung und den 3 MMPs, MMP- 3, MMP-9 und MMP-2, parallel analysiert, durchgeführt und wie folgt für eine 96-Vertiefung-Mikrotiterplatte und eine Hamilton AT ®-Workstation angepasst.
P218-Fluorogenes Substrat: P218 ist ein snythetische Substrat, enthaltend eine 4-Acetyl-7-methoxycoumann (MCA)-Gruppe in der N-terminalen Position und eine 3-[2,4-Dinitrophenyl]-L-2,3-diaminopropionyl (DPA)-Gruppe im Inneren. Dieses ist eine Modifikation eines Peptids, über das von Knight (1992) berichtet wurde, welches als ein Substrat für Matrix- Metalloproteinasen verwendet wurde. Sobald das P218-Peptid gespalten ist (vermutete Spaltstelle an der Ala-Leu-Bindung), kann die Fluoreszenz der MCA-Gruppe an einem Fluorometer mit Anregung bei 328 nm und Emission bei 393 nm nachgewiesen werden. P218 wird derzeit von BACHEM exklusiv für Bayer produziert. P218 weist die Struktur auf:
H-MCA-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Leu-DPA-Ala-Arg-NH&sub2; (MG = 1332,2)

Rekombinant-Human-CHO-Stromelysin (MMP-3)

Rekombinant-Human-CHO-Pro-MMP-3: Human-CHO-Pro-Stromelysin-257 (Pro- MMP-3) wurde exprimiert und gereinigt, wie beschrieben von Housley et al. J. Biol. Chem. 268, 4481, 1993.
Aktivierung von Pro-MMP-3: Pro-MMP-3 mit 1,72 uM (100 ug/mL) in 5 mM Tris bei pH = 7,5, 5 mM CaCl&sub2;, 25 mM NaCl und 0,005% Brij-35 (MMP-3- Aktivierungspuffer) wurde durch Inkubation mit TPCK (N-Tosyl-(L)- phenylalaninchlormethylketon)trypsin (1 : 100 G/G zu Pro-MMP-3) bei 25ºC 30 min lang aktiviert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Sojabohnentrypsin- Inhibitor (SBTI: 5 : 1 G/G zur Trypsin-Konzentration) gestoppt. Dieses Aktivierungsprotokoll führt zur Bildung von 45 kDa-Aktiv-MMP-3, welche immer noch das C-terminale Teilstück des Enzyms enthält.

Herstellung von Human-Rekombinant-Pro-Gelatinase A (MMP-2):

Rekombinant-Human-Pro-MMP-2: Human-Pro-Gelatinase A (Pro-MMP-2) wurde mit einem Impf-Expressionssystem gemäß dem Verfahren von Fridman et al. J. Biol. Chem. 267, 15398, 1992, hergestellt.
Aktivierung von Pro-MMP-2: Pro-MMP-2 mit 252 mg/mL wurde 1 : 5 auf eine Endkonzentration von 50 ug/mL Lösung in 25 mM Tris mit pH = 7,5, 5 mM
CaCl&sub2;, 150 mM NaCl und 0,005 Brij-35 (MMP-2-Aktivierungspuffer) verdünnt. p-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) wurde in 10 mM (3,5 mg/mL) in 0,05 NaOH zubereitet. Die APMA-Lösung wurde mit 1/20 des Rekationsvolumens für eine End-AMPA-Konzentration von 0,5 mM zugegeben, und das Enzym wurde bei 37ºC 30 min lang inkubiert. Aktivierte MMP-2 (15 ml) wurde 2 Mal gegen 2 L MMP-2-Aktivierungspuffer dialysiert (die Dialysemembranen wurden mit einer Lösung aus 0,1% BSA in MMP-2- Aktivierungspuffer 1 min lang vorbehandelt und dann gründlich mit H&sub2;O gewaschen). Das Enzym wurde an Centricon-Konzentratoren eingeengt (die Konzentratoren wurden ebenfalls mit einer Lösung aus 0,1% BSA in MMP-2- Aktivierungspuffer 1 min lang vorbehandelt und dann mit H&sub2;O und mit MMP-2- Aktivierungspuffer gewaschen), worauf erneut verdünnt und erneut eingeengt wurde, was 2 Mal wiederholt wurde. Das Enzym wurde auf 7,5 mL (0,5-faches Ursprungsvolumen) mit MMP-2-Aktivierungspuffer verdünnt.

Herstellung von Human-Rekombinant-Pro-Gelatinse B (MMP-9):

Rekombinant-Human-Pro-MMP-9: Human-Pro-Gelatinase B (Pro-MMP-9), abgeleitet aus U937 cDNA, wie beschrieben von Wilhelm et al. J. Biol. Chem. 264, 17213, 1989, wurde als die Form in voller Länge mit einem Baculovirus- Protein-Expressionssystem exprimiert. Das Pro-Enzym wurde mit Verfahren gereinigt, die früher von Hibbs et al. J. Biol. Chem. 260, 2493, 1984, beschrieben wurden.
Aktivierung von Pro-MMP-9: Pro-MMP-2 mit 20 ug/mL in 50 mM Tris mit ph = 7,4, 10 mM CaCl&sub2;, 150 mM NaCl und 0,005% Brij-35 (MMP-9- Aktivierungspuffer) wurde durch Inkubation mit 0,5 mM p-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) 3,5 h lang bei 37ºC aktiviert. Das Enzym wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert, um das APMA zu entfernen.

Geräteausstattung:

Hamiltion Microlab AT Plus: Der MMP-Profilierungsassay wird robotorisch an einem Hamilton MicroLab AT Plus ® durchgeführt. Der Hamilton wird Pprogrammiert, um (1) in Serie bis zu 11 potenzielle Inhibitoren automatisch aus einem 2,5 mM Vorrat in 100% DMSO zu verdünnen; (2) Substrat und dann Inhibitor in eine 96-Vertiefungen-Cytofluor-Platte zu verteilen; und (3) ein Einzel-Enzym auf die Platte unter Vermischen zu geben, um die Reaktion zu starten. Anschließende Platten für jedes zusätzliche Enzym werden automatisch zubereitet, wobei das Programm am Substrat-Zugabepunkt beginnt, die verdünnten Inhibitoren erneut vermischt und die Reaktion durch Zugabe von Enzym begonnen werden. Auf diese Weise werden alle MMP- Assayverfahren mit den gleichen Inhibitor-Verdünnungen durchgeführt.
Millipore Cytofluor II: Nach Inkubation wurde die Platte an einem Cytofluor II-Fluorometrie-Platten-Ablesegerät mit Anregung bei 340 nm und Emission bei 395 nm mit dem Gewinnungssatz bei 80 abgelesen.

Puffer:

Mikrofluorometrischer Reaktionspuffer (MRB): Die Testverbindungen, Enzyme und das P218-Substrat für den Mikrofluormetrischen Assay wurden im mikrofluorometrischen Reaktionspuffer aus 50 mM 2-(N- Morpholino)ethansulfonsäure (MES) mit pH = 6,5 mit 10 mM CaCl&sub2;, 150 mM NaCl, 0,005% Brij-35 und 1% DMSO verdünnt.

Verfahrensweisen:

MMP-Mikrofluorometrischer Profilierungsassay: Der Assay wird mit einer End-Substrat-Konzentration von 6 uM P218 und ca. 0,5 bis 0,8 mM mit variablen Arznei-Konzentrationen durchgeführt. Der Hamilton wird programmiert, um in Serie bis zu 11 Verbindungen aus einem 2,5 mM Vorrat (100% DMSO) auf 10-fache End-Verbindungskonzentrationen im Assay zu verdünnen. Anfänglich gibt das Gerät verschiedene Mengen- mikrofluorometrischen Reaktionspuffer (MRB) auf das 96-Röhrchen-Gestell von 1 mL Marsh-Verdünnungs-Röhrchen. Das Gerät entnimmt dann 20 uL Inhibitor (2,5 mM) aus dem Proben Gestell und mischt ihn mit einem Puffer in Reihe-A des Marsh-Gestells, was eine Arznei-Konzentration von 50 uM ergibt. Die Inhibitoren werden dann reihenweise auf 10, 5, 1, 0,2, 0,05 und auf 0,01 uM verdünnt. Position 1 auf dem Proben-Gestell enthält nur DMSO für die "nur- Enzym"-Vertiefungen im Assay, was keinen Inhibitor in Säule 1, Reihen A bis H, ergibt. Das Gerät verteilt dann 107 uL P218-Substrat (8,2 uM in MRB) auf eine einzelne 96-Vertiefungen-Cytofluor-Mikrotiterplatte. Das Gerät vermischt erneut und gibt 14,5 uL verdünnte Verbindung aus den Reihen A bis G im Marsh-Gestell auf die entsprechenden Reihen in der Mikrotiterplatte (Reihe H stellt die "Hintergrund"-Reihe dar, und es wurden 39,5 uL MRB anstatt Arznei oder Enzym aufgegeben). Die Reaktion wird durch Zugabe von 25 uL des entsprechenden Enzyms (mit 5,86-facher End-Enzymkonzentration) aus einem BSA-behandelten Reagens-Reservoir auf jede Vertiefung, ausgenommen Reihe H, die "Hintergrund-Reihe", gestartet. (Das Enzym- Reservoir wird mit 1% BSA in 50 mM Tris, pH = 7,5, enthaltend 150 mM NaCl, 1 h lang bei Raumtemperatur vorbehandelt und dann gründlich mit H&sub2;O gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.
Nach Zugabe und Vermischen des Enzyms wird die Platte bedeckt und 25 min lang bei 37ºC inkubiert. Zusätzliche Enzyme werden in der gleichen Weise getestet, wobei das Hamilton-Programm mit der Verteilung des P218- Substrats auf die Mikrotiterplatte beginnt, worauf erneut vermischt und die Arznei aus dem gleichen Marsh-Gestell auf die Mikrotiterplatte gegeben wird. Die zweite (oder dritte usw.) MMP, die getestet werden, wird dann aus einem Reagens-Gestell auf die Mikrotiterplatte unter Vermischen verteilt, worauf das Ganze bedeckt und inkubiert wird. Dies wird für alle zusätzlichen MMPs wiederholt, die getestet werden.
IC&sub5;&sub0;- und Ki-Bestimmung im Mikrofluorometrischen Assay: Daten aus dem Cytofluor II werden aus einem exportierten "CSV"-Ordner auf ein Master- Excel-Faltblatt kopiert. Daten aus verschiedenen unterschiedlichen MMPs (1 96-Vertiefungen Platte pro MMP) wurden gleichzeitig berechnet. Die Prozent- Inhibierung beruht auf der Bestimmung für jede Arznei-Konzentration durch Vergleich der Hydrolyse-Menge (Fluoreszenz-Einheiten, erzeugt über 25 Minuten Hydrolyse) von Vertiefungen, enthaltend Verbindung, mit "nur- Enzym"-Vertiefungen in Säule 1. Nach Substraktion des Hintergrunds wurde die Prozent-Inhibierungterechnet als:
((Vergleichwerte - Behandelte Werte)/Vergleichswerte) · 100
Prozent-Inhibierungen wurden für Inhibitor-Konzentrationen von 5, 1, 0,5, 0,1, 0,02 0,005 und von 0,001 uM Arznei bestimmt. Linear-Regressions- Analyse der Prozent-Inhibierung gegen log-Inhibitor-Konzentration wurde angewandt, um die IC&sub5;&sub0;-Werte zu erhalten.
Ki's wurden automatisch für jedes getestete Enzym auf Basis der Gleichung berechnet:
Ki = ((Km · IC&sub5;&sub0;)/(Km ü [S]),
worin [S] = Substrat-Konzentration = 6 uM. Dies ist das Verfahren von Williams et al. Methods Enzym 653, 437, 1979. Tabelle III

Claims

1. Matrix-Metalloprotease-inhibierende Verbindung der allgemeinen Formel:

worin gilt:

T stellt Halogen, Benzyloxy oder Alkyloxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen dar;

x ist 1 oder 2;

M ist -CO&sub2;H, -CON(R¹¹)&sub2; oder -CO&sub2;R¹², worin

R¹¹ H oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffen und

R¹² Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffen sind;

n ist eine ganze Zahl von 1 bis 5; und

R²&sup4; ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:

und

sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon,

mit der Maßgabe, dass

ausgeschlossen ist.

2. Zusammensetzung mit Matrix-Metalloprotease-Inhibitoraktivitat, umfassend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch zulassigen Träger.

3. Verwendung einer Matrix-Metalloprotease-Inhibitorverbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Matrix-Metalloprotease-Aktivität in einem Sauger.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin der genannte Säuger der Mensch ist.

5. Verwendung gemäß Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments zur:

(a) Linderung der Auswirkungen von Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Periodontalkrankheiten, Kornealgeschwürbildung, Proteinurie, aneurysmaler Aortakrankheit, dystrophober Epidermolyse-Bullosa, Bedingungen, die zu Entzündungsreaktionen führen, Osteopönien, mediiert durch MMP-Aktivität, Tempero-Mandibulargelenkskrankheit, und von demyelatierenden Krankheiten des Nervensystems;

(b) Verzögerung von Tumor-Metastase oder degenerativem Knorpelverlust in der Folge einer traumatischen Gelenksverletzung,

(c) Herabsetzung von Koronarthrombose aus athrosklerotischem Plaque-Bruch; oder

(d) zur Geburtenkontrolle.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5 zur Linderung von Osteoarthritis.

7. Verwendung gemäß Anspruch 5 zur Verzögerung von Tumor- Metastase.