DE69713230T2 - Sonde, nukleinsäuresequenzen, besonders geeignete methode zur detektion und identifizierung von hefen, sowie entsprechende genetische hilfsmittel - Google Patents

Description

Technisches Gebiet
• Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis und die Charakterisierung von Hefen. Im besonderen sieht sie spezifische, insbesondere Nukleinsäure-Sonden und ein Modell der Entwicklung besagter Sonden für den Nachweis und insbesondere die Identifikation und die Typisierung (infraspezifische Charakterisierung) von Hefestämmen verschiedener Arten von medizinischem und industriellem Interesse vor.
Stand der Technik
• Hefen sind Pilze, eukaryotische Mikroorganismen, bei welchen die einzellige Form vorherrschend ist (Barnett J., W., R., W. Payne und D. Yarrow., "Yeasts characteristics and identification", 2. Ausgabe, Cambridge University Press, Cambridge, 1991). Sie sind in Gattungen (z. B. Candida) und Spezies (z. B. Candida krusei) unterteilt, und zwar auf der Basis von die sexuelle Reproduktion betreffenden (falls vorhanden), morphologischen, physiologischen, chemotaxonomischen und molekularen Kriterien.
• Hefen sind ubiquitär. Im allgemeinen ist ihre Unschädlichkeit gut etabliert. Sie werden häufig als Transformationsmittel (technologisches Hilfsmittel) in landwirtschaftlichen-lebensmitteltechnischen Verfahren verwendet, aber bestimmte von ihnen sind manchmal pathogen. Hefen werden im allgemeinen als opportunistische Pathogene betrachtet.
• Opportunistisch pathogene Hefen sind auf dem Fachgebiet der medizinischen Mykologie von Interesse. Diese Hefen sind verantwortlich für oberflächliche, kutane, subkutane und systemische Infektionen. Die letzteren sind aufgrund der Sterblichkeitsrate, welche ihnen angelastet wird, am schwerwiegendsten. Pathogene Hefen gehören am häufigsten der Gattung Candida an. Unter dieser Gattung sind die weiter besonders bedeutsamen Spezies Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida (Torulopsis) glabrata. Die Infektionen, welche selbige hervorrufen, werden "Candidosen" genannt.
• Das Vorherrschen und die Pathogenität dieser opportunistischen Hefen sind bei Personen mit Immunschwäche, insbesondere bei Neutropenie-Patienten und an ADS, Krebs etc. Erkrankten erhöht.
• Sämtliche Schwierigkeiten bei der Behandlung dieses Typs von Infektionen rühren von der Tatsache her, daß bestimmte Arten resistent gegenüber bestimmten Anti-Pilz-Mitteln sind, insbesondere gegenüber Fluconazol (z. B. C. krusei, C. glabrata). Außerdem weisen, bei einer gleichen Art, bestimmte Stämme einen resistenten Charakter auf, während andere empfindlich gegenüber den betrachteten Anti-Pilz-Mitteln sind (z. B. C. albicans, C. lusitaniae).
• Demgemäß sind ein rascher Nachweis und eine genaue und zuverlässige Identifikation ebenso wie eine Typisierung der Stämme dieser Spezies zunehmend notwendig, insbesondere damit die Ausführung einer angemessenen Anti-Pilz-Behandlung gestattet wird. Außerdem besteht ein tatsächlicher Bedarf nach zuverlässigen epidemiologischen Markern zum Zwecke epidemiologischer Untersuchungen auf medizinischem Gebiet, oder als Tracer von Stämmen in der Landwirtschaft/Lebensmittel-Industrie oder zur Fermentation.
• Es muß jedoch festgestellt werden, daß die klassischen Identifikationsverfahren für Hefen nicht in allen diesen Hinsichten vollständig zufriedenstellend sind.
• Hierbei kennt man insbesondere diejenigen, welche beschrieben wurden von Barnett J., W., R., W. Payne und D. Yarrow., in "Yeasts characteristics and identification", 2. Auflage, Cambridge University Press, Cambridge, 1991, welche eine vorhergehende Isolierung des Mikroorganismus in Reinkultur erfordern, danach die Untersuchung seiner morphologischen und insbesondere physiologischen Merkmale (mehr als 80 Tests), wobei die Gesamtheit dieser Verfahrensschritte 10 bis 30 Tage für eine Identifikation benötigt. Diese Verfahren sind daher mühselig und besonders langwierig. Sie sind Referenz-Laboratorien vorbehalten und in der allgemeinen Praxis nicht anwendbar.
• In schnellerer und rationellerer Weise umfassen miniaturisierte und standardisierte Verfahren zur Identifikation von Hefen von medizinischer Bedeutung allerdings immer noch eine vorhergehende Isolierung, dann eine Identifizierung des Mikroorganismus mit Hilfe von physiologischen Tests, welche beispielsweise mit Hilfe von Test-Röhrchen (Galerien) ausgeführt werden. Die Dauer derartiger Tests beträgt ungefähr 5 Tage, um eine Identifizierung zu ergeben. Des weiteren ergeben diese Techniken manchmal zweideutige Resultate. Arten, wie C. krusei, C. inconspicua, C. lipolytica, C. norvegensis, C. rugosa und C. valida werden manchmal, sogar des öfteren, verwechselt.
• Mit dem Fortschritt der Molekularbiologie ist eine neue Technik entwickelt worden, welche das Prinzip der Hybridisierung von DNA-DNA oder DNA-RNA anwendet, um rasche, empfindliche und spezifische Identifikationstests vorzusehen. Das in der Probe vorhandene genetische Material der Mikroorganismen wird direkt mit Hilfe markierter DNA- oder RNA- Nukleinsäuresonden nachgewiesen. Der Nachweis und die Identifikation können gleichzeitig ohne vorhergehende Isolierung realisiert werden.
• Die wenigen beschriebenen Verfahren zur Identifikation von Hefen mit Hilfe von Nukleinsäuresonden zeigen den Nachteil, daß sie auf Sonden mit geringen Längen (30 bis 35 Nukleotiden) basieren, welche die Anwendung einer radioaktiven Markierung erfordern, welche empfindlicher als eine nicht-radioaktive Markierung, aber auch umständlicher ist.
• Ein anderer Nachteil dieser Sonden, welcher mit ihrer verringerten Größe zusammenhängt, zeigt sich im Rahmen ihrer Anwendung in Polymerisationskettentechniken (PCR). Die letztgenannten bestehen in der Amplifikation einer gegebenen DNA-Sequenz, wobei selbige ausgehend von einem Primer-Paar mit Hilfe einer Polymerase vervielfältigt wird. Derartige Amplifikationen können zu diagnostischen Zwecken angewandt werden, um den Nachweis zu erleichtern. Wenn diese Sonden als PCR-Primer verwendet werden würden, würde dies die Wahlmöglichkeiten der Primer auf eine kleine Sequenz von 30 bis 35 Nukleotiden beschränken.
• Diese Sonden richten sich im allgemeinen gegen Ziel-DNA-Sequenzen, codierend für die kleine 18 S-Untereinheit der ribosomalen RNA (ssu-rRNA). Diese Ziele sind klassischerweise gewählt worden, weil die für ribosomale RNA codierenden DNA-Sequenzen die ersten gewesen waren, welche bestimmt worden sind. Des Weiteren ist die Verwendung des 3'-Bereichs der Sequenzen beschrieben worden, welche für die große 25 S-Untereinheit der ribosomalen RNA (IsurRNA) codieren. Es besteht ein Problem im Zusammenhang mit der Auswahl von Sequenzen, welche für ssu-rRNA oder lsu-rRNA codieren, als Ziele. Tatsächlich besitzen diese Sequenzen einen universellen Charakter, d. h. daß sich ein bedeutender Abschnitt unter ihnen bei allen Mikroorganismen wiederfindet (Hefen, Bakterien); man sagt, daß sie "hyper-konserviert" sind. Die Wahl der Zielsequenzen ist somit auf begrenzte variable Abschnitte dieser für rRNAs codierenden Sequenzen beschränkt.
• Außerdem erlaubt keine unter den im Stand der Technik beschriebenen Sonden die Typisierung von Stämmen, das heißt die Differenzierung von Individuen innerhalb der Art, wobei diese Individuen bzw. Einzelfälle einzig einer Gruppe zugewiesen werden: z. B. der Spezies Candida krusei, der Spezies Candida glabrata, der Spezies Candida lusitaniae etc... In der Tat erlauben die früher beschriebenen Sonden keine Typisierung von Stämmen innerhalb der Spezies, weil sie keinen ausreichenden Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus unter den Stämmen dieser Spezies aufzeigen und somit keine zuverlässigen epidemiologischen Marker bereitstellen.
• Auf dem Wege der Veranschaulichung derartiger Sonden, welche bekannt sind und den im Fachgebiet vorliegenden technischen Anforderungen unvollständig genügen, kann man zitieren:
• Oligonukleotidsonden, entwickelt von der Gesellschaft Genetrak Systems, gerichtet gegen Sequenzen von 30 (Sonden 1351), 33 (Sonde 1537) und 35 (Sonde 1530) Nukleotiden der für ribosomale 18 S-RNA codierenden DNA. Diese Sonden sind in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 422 869 beschrieben. Sie wurden gegen 4 Stämme von Candida krusei getestet. Es ist anzumerken, daß in den Beispielen dieser Anmeldung keine Angaben über den Nachweis von Candida krusei durch Hybridisierung in Proben von menschlichem Blut, Speichel oder Cerebrospinalflüssigkeit (liquide cephalorachidien) gemacht werden. Darüber hinaus erlauben diese Sonden nicht, Stämme unter jenen der Spezies Candida krusei zu differenzieren.
• Bei der von Niesters und Mitarbeitern beschriebenen Sonde (Niesters et al., 1993, Rapid polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species, J. Clin. Microbiol., 31, 904-910, 1993) handelt sich um eine Sonde von 20 Nukleotiden (Oligonukleotid 705), gerichtet gegen eine spezifische Sequenz des Amplifikationsproduktes der kleinen Untereinheit der ribosomalen RNA (ssu-rRNA). Diese Untersuchung wird in einem Verfahren zur Identifikation von Spezies der Gattung Candida angewandt, welches basiert auf der Kettenamplifikation (PCR) von Sequenzen des für die ssu-rRNA codierenden Gens und danach direkter Sequenzierung dieser Sequenzen. Diese Methodik betrifft weiterhin ribosomale RNA. Sie hat den Nachteil, daß sie eine direkte Sequenzierung des Amplifikationsproduktes erfordert, eine Technik welche nur in einer begrenzten Anzahl von Forschungslaboratorien verfügbar und sicher nicht routinemäßig anwendbar ist. Weiterhin erlaubt, nach den Autoren, daß Oligonukleotid 705 keine spezifische Amplifikation der DNA von Candida krusei. Die von Niesters und Mitarbeitern beschriebenen Sonden gestatten ihrerseits auch keine Typisierung der Stämme von Candida krusei.
• Ebenfalls bekannt ist insbesondere der Artikel, verfaßt von BALEIRAS COUTO et al., Applied & Environmental Microbiology, Jan. 1996, S. 41-46, "Evaluation of molecular typing techniques to assign genetic diversity among Saccharomyces cerevisiae strains". Dieser Artikel offenbart die Unterscheidung von Stämmen innerhalb der Spezies Saccharomyces cerevisiae unter Zuhilfenahme von Identifikationstechniken des Typs, bei welchem man sich der Vermittlung durch in statistischer Weise amplifizierten polymorphen DNA-Fragmenten (RAPD) bedient, und des Typs von Polymerisationskettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Nukleotidprimern. Die durch diese Techniken erhaltenen Fragmente werden anschließend Restriktionsenzym- Verdaus unterworfen. Alle derartig erhaltenen Sequenzen und Fragmente werden in einer infraspezifischen Identifikation 16 unterschiedlicher Stämme von Saccharomyces cerevisiae getestet. Die RAPD und die PCR erlaubten, intergenische transkribierte Spacer- bzw. Abstands-Regionen (IGR-ITS) und nicht-transkribierte intergenische Regionen (IGR-NTS) von rDNA-Cistrons zu rekonstituieren, welche für die Synthese von ribosomaler RNA (rRNA) codieren. Diese Druckschrift beschreibt in keiner Weise den Inhalt der durch RAPD und PCR rekonstituierten Sequenzen, deren Länge übrigens mindestens 7 Kilobasen (kb) beträgt. Dieser Artikel lehrt, daß kein signifikanter Polymorphismus zwischen den Stämmen von Saccharomyces cerevisiae A besteht. In den besten Fällen (entsprechend denjenigen, wo man TaqI verwendet) ist es lediglich möglich, 6 Stämme von 16 zu unterscheiden. Dieses Ergebnis ist in der Tat verbesserungswürdig.
• Ferner lenken BALEIRAS COUTO et al. das Interesse des Lesers vielmehr auf intergenische transkribierte Spacer-Regionen (ITS) für die infraspezifische Differenzierung von Hefe. Die intergenischen transkribierten Regionen werden als geeigneter denn als nicht-transkribierte intergenische Regionen (NTS) dargestellt. Außerdem funktionieren die in dieser Druckschrift genauer angegebenen, in der PCR-Technik verwendeten Primer nicht in einer universellen Art bei allen Hefearten, was einen einschränkenden Faktor für die Technik darstellt. Insbesondere geben die Autoren an, daß die Amplifikation für die Spezies C. valida, C. krusei, Z. bailii oder Z. rouxii nicht möglich war.
• Es scheint daher, daß die in diesem Artikel beschriebenen Techniken lediglich zur infraspezifischen Typisierung von Hefe und insbesondere nicht zur Identifikation von Hefe-Spezies zweckmäßig sind.
• Die Anmeldung des Internationalen Patentes WO 95/11 991 beschreibt eine Sonde und ein Verfahren zum Nachweis von Hefen der Spezies C. krusei. Die genetischen Hilfsmittel, welche diese Sonde konstituieren, werden gebildet durch ein DNA- und/oder RNA-Fragment einer Größe zwischen 7 und 4 kb, welches spezifisch mit DNA und/oder RNA von Candida krusei hybridisiert und nicht für ribosomale RNA (rRNA) codiert.
• Unter diesen genetischen Mitteln sind ebenfalls Transkriptions- und Transduktions-Produkte des obengenannten Fragmentes enthalten, sowie Assoziationen zwischen diesen verschiedenen Mitteln. Diese Patentanmeldung offenbart nicht die Struktur der in dieser Sonde eingesetzten DNA-Fragmente. Die angewandte Methode zur Charakterisierung dieser Fragmente besteht in deren Restriktionsenzym-Karte. Die in diesem Dokument ausschließlich betrachtete Hefeart ist Candida krusei.
• Die Anmeldung PCT WO-A-93 23 568 (A. R. HOLMES et al.) betrifft Verfahren zur Diagnose von Pilzinfektionen, gemäß denen man Nukleinsonden einsetzt, welche von einem ausschließlich von C. albicans abstammenden DNA-Fragment erhalten werden und ausschließlich bei dieser Hefeart anwendbar sind. In dieser Patentanmeldung wird die bevorzugte Anwendung einer Sonde EOB2 verkündet, welche von der Gesamtheit oder einem Teil einer Nukleotidsequenz gebildet wird, enthalten in dem rDNA-Gen, codierend für die 55-rRNA-Untereinheit. Diese rDNA- Sequenz umfaßt 121 Basenpaare, lokalisiert zwischen dem Nukleotid 937 und dem Nukleotid 1057 der SEQ ID NO: 1 des 55-rDNA-Gens, welche in dieser PCT-Anmeldung offenbart ist. Zum zweiten beschreibt die WO-A-93 23 568 eine Sonde EOB1, lokalisiert in der intergenischen nicht transkribierten Region (IGR-NTS), gelegen zwischen dem rDNA-Gen, codierend für die 55-rRNA, und dem rDNA-Gen, codierend für die 18S-rRNA. Diese Sonde EOB1 hybridisiert mit einer rDNA-Sequenz, enthalten zwischen den Nukleotiden 1 und 936, bevorzugt 1 und 710 der SEQ ID NO: 1. In dem Fall, wo sie von geringer Länge sind, können diese Sonden EOB2 und EOB1 durch PCR-Primer PS pA&sub1;, PS pA&sub2;, PCon&sub1;, PCon&sub2; amplifiziert werden.
• Die EOB2-Sonde, welche in der 5S-rDNA enthalten ist, erlaubt den Nachweis von pathogenen Hefen, wohingegen die Sonde EOB1 als interspezifisch dargestellt wird. In der gesamten Sachlage ist es klar, daß die WO-93 23 568 keineswegs eine Erwähnung einer infraspezifischen Unterscheidung von Stämmen der zitierten verschiedenen Hefearten (C. albicans, C. krusei etc.) macht. Die Sonde EOB1 ist keine Ursprungssequenz von besonderer Struktur, wie z. B. vom iterativen Typ, welche mehrere, untereinander homologe, wiederholte Teilsequenzen umfasst. Somit offenbart die WO-93 23 568 keine genetische Struktur, welche typisch für die Identifizierung und den Nachweis in inter- und infraspezifischer Weise wäre.
Kurze Beschreibung der Erfindung
• In diesem Stand der Technik besteht eines der wesentlichen Ziele der vorliegenden Erfindung darin, eine Sonde zum spezifischen und/oder infraspezifischen Nachweis/Identifikation von Hefe zum universellen Gebrauch auf dem Gebiet der Hefen vorzusehen.
• Ein anderes wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde, insbesondere nukleinsäureartig, vorzusehen, welche gleichzeitig einen spezifischen Nachweis und eine infraspezifische Identifikation von Hefe in einer effektiven, zuverlässigen und reproduzierbaren Weise gestattet.
• Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde, insbesondere nukleinsäureartig, vorzusehen, welche eine ausreichende Länge aufweist, um die Verwendung eines Markers zu gestatten, welcher nicht radioaktiv und somit bequemer anzuwenden ist.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, daß diese Nukleinsäuresonde gerichtet ist gegen DNA-Zielsequenzen, verschieden von derjenigen, welche für die kleinen Untereinheiten 5,8 S oder 18 S von ribosomaler RNA codiert, welche im allgemeinen wenig repräsentativ für die Art sind, da sie unter den Mikroorganismen stark konserviert sind.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, daß diese Sonde in komplexen biologischen Milieus vom Typ des menschlichen Bluts, Speichels oder der Cerebrospinalflüssigkeit angewandt werden kann.
• Ein anderes wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde, insbesondere gegen Candida krusei, vorzusehen, die es ermöglicht, über den einfachen Nachweis von Spezies hinauszugehen, um die präzise Identifikation und Typisierung von Hefen sogar innerhalb der Spezies Candida krusei zu erlauben.
• Ein weiteres essentielles Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde insbesondere gegen Geotrichum candidum vorzusehen, welche es gestattet, über den einfachen Nachweis von Spezies hinauszugehen, um zu der genauen Identifikation und zur Typisierung von Hefen sogar innerhalb der Spezies Geotrichum candidum zu führen.
• Ein anderes wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde zum Nachweis von Hefe vorzusehen, welche vollständig identifiziert und reproduzierbar aus genetischen Hilfsmitteln vom DNA- und/oder RNA-Typ aufgebaut ist.
• Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde zum Nachweis von Hefe vorzusehen, die signifikant leistungsfähig zur inter- und infraspezifischen Identifikation einer ausreichend großen Anzahl von Hefen ist, um wirtschaftlich durchführbar sein zu können.
• Ein anderes wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis und zum inter/infraspezifischen Identifizieren von Hefen vorzusehen, welches einfach, nicht kompliziert und wirtschaftlich durchführbar ist und in welchem man die obenstehend erwähnte Sonde verwendet.
• Ein anderes essentielles Ziel der Erfindung besteht darin, eine Sonde vorzusehen, welche unter anderem insbesondere zum spezifischen Nachweis zur infraspezifischen Identifikation von Hefe anwendbar ist, aber gleichermaßen als epidemiologischer Marker, als Tracer von Stämmen oder im Rahmen einer therapeutischen Behandlung im Hinblick auf Erkrankungen durch Hefe anwendbar ist.
• Diese und weitere andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, welche eine Sonde betrifft, insbesondere zum spezifischen und/oder infraspezifischen Nachweis von Hefen, eines solchen Typs, der ausgewählt ist aus den folgenden genetischen (oder verwandten) Hilfsmitteln:
• - wenigstens einem Teil von:
• * wenigstens einem Fragment F einer DNA-Nukleinsäure und/oder umkopierter RNA, das konstruiert wurde und/oder ausgehend von wenigstens einer Ursprungssequenz ribosomaler DNA (rDNA) isoliert wurde:
• → das nicht für die Synthese von ribosomaler RNA (rRNA) codiert, und
• → das in der nicht transkribierten (NTS) intergenischen Abstandsregion (IGR) lokalisiert ist und zwischen der rDNA, die für die Untereinheit 25 S der rRNA codiert, und der rDNA, die für die Untereinheit 18 5 der rRNA codiert, enthalten ist,
• * und/oder wenigsten einem analogen Fa dieses Fragmentes, das aus der Degeneriertheit des genetischen Codes resultiert;
• * und/oder wenigstens einem Fragment Fc einer cDNA, das zu dem Fragment F komplementär ist,
• - wenigstens einem Teil der primären Transkriptionsprodukte der Fragmente F und/oder Fa und/oder Fc,
• - und einer Assoziation bzw. Mischung der hier obenstehend aufgezählten Hilfsmittel,
• dadurch gekennzeichnet, daß die Ursprungssequenz der rDNA für F und/oder Fa und/oder Fc ausgewählt ist aus solchen,
• die iterativ sind
• die wenigstens 2, vorzugsweise 2 bis 12 wiederholte Teilsequenzen enthalten,
• und wobei der Homologiegrad zwischen diesen Teilsequenzen größer oder gleich SO %, vorzugsweise 55%, und noch weiter bevorzugt 60% ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Es ist nun der Verdienst der in der vorliegenden Anmeldung zitierten Erfinder, eine bestimmte Anzahl von F-Nukleinsäurefragmenten isoliert und charakterisiert haben zu können, welche eine wahrhaftig besondere Struktur aufweisen, und welche de facto einen wahrlich digitalen Abdruck nicht nur einer gegebenen Hefe-Art sondern gleichwohl der in dieser Art enthaltenen unterschiedlichen Stämme abgibt. Der Verdienst der Erfinder ist insofern um so größer, als daß die Isolierung und Charakterisierung der besagten Fragmente innerhalb von nicht transkribierten intergenischen Abstands-Zonen von ribosomalen Cistrons realisiert worden ist, zumal ein wissenschaftlicher Zeitgeist bestand, veranschaulicht insbesondere durch den Artikel von BALEIRAS COUTO et al., wie hierin obenstehend erwähnt, nach welchem es bevorzugt und empfehlenswert schien, sich für den Nachweis und die Identifikation von Hefen für transkribierte Regionen der ribosomalen Gene zu interessieren.
• Es ist gleichermaßen dem Verdienst der Erfinder zuzurechnen, genetische oder verwandte Hilfsmittel vorgeschlagen zu haben, gebildet aus den obenstehend erwähnten Fragmenten, für Inter-Spezies-Nachweis und -Identifikation von Hefen, sowie für den infraspezifischen Nachweis (Unterscheidung von Hefen einer gegebenen Spezies) und insbesondere, ohne darauf eingeschränkt zu sein, für die Spezies Candida krusei und Geotrichum candidum.
• Die Nukleinsäurefragmente F, Fa, Fc gemäß der Erfindung weisen als ursprüngliches und vorteilhaftes Merkmal auf, daß sie nicht-transkribiert sind und ein oder mehrere sequenzielle Module von Nukleinbasen enthalten (welche in der vorliegenden Beschreibung gleichermaßen als iterative Ursprungssequenzen bezeichnet werden), welche jeweils eine oder mehrere wiederholte Teilsequenzen umfassen, welche sehr nahe Kopien voneinander darstellen. Es ist oder es sind diese(s) Modul(e), welche ein oder mehrere primäre Motive konstituieren, welche für den inter- und infraspezifischen Nachweis/Identifikation einer Vielzahl von Hefen angewendet werden.
• Die Anzahl von Nukleotidbasen dieser Module oder Ursprungssequenzen variieren von einer Spezies zur anderen, aber man findet diese ähnliche wiederkehrende Organisation in mehreren Hefespezies wieder.
• Ohne durch die Theorie gebunden sein zu vollen, scheint es, daß das Mittel der infraspezifischen Identifikation der Sonden gemäß der Erfindung durch den Polymorphismus begründet sein kann, welcher, innerhalb einer gegebenen Hefe-Spezies, sich aus der Anzahl der Teilsequenzen in den iterativen Modulen oder Ursprungssequenzen ergibt, oder zu der Konstitution der Fragmente F, Fa, Fc der Sonden gemäß der Erfindung führt.
• Nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung, wobei diese erste Form übrigens bevorzugt wird, ist die Ursprungssequenz von F in einer nichttranskribierten (NTS) intergenischen Spacer-Region 2 (IGR&sub2;), enthalten zwischen der rDNA, codierend für die Untereinheit 5S von rRNA, und der rDNA, codierend für die Untereinheit 18S von rRNA, lokalisiert (vgl. die beigefügte Fig. 2).
• Gemäß einer vorteilhaften Variante der ersten Ausführungsform der Erfindung entspricht die iterative Ursprungssequenz von F einer Sequenz Fα und umfaßt mindestens drei wiederholte Teilsequenzen, wobei jede mindestens 80, vorzugsweise mindestens 120 und noch weiter bevorzugt zwischen 150 und 300 Nukleotidbasen umfaßt. In der Praxis umfaßt die Ursprungssequenz Fα zwischen 3 und 10 wiederholte Teilsequenzen, umfassend zwischen 150 und 250 Nukleotidbasen.
• Vorzugsweise umfassen die iterativen Ursprungssequenzen von F, und insbesondere Fα, der Sonde gemäß der Erfindung jeweils mindestens eine Teilsequenz, die im Vergleich zu anderen Teilsequenzen eine verkürzte Länge aufweist, wobei diese verkürzte Teilsequenz vorzugsweise terminal ist.
• Bei der Betrachtung der iterativen Ursprungssequenz Fα ist davon auszugehen, ohne daß man durch die Theorie gebunden sein will, daß die Anzahl von wiederholten elementaren Teilsequenzen den Polymorphismus innerhalb einer gleichen Art von Hefen bestimmt. Dies könnte aus einer Replikation resultieren (Verdopplung einer oder mehrerer der wiederholten Teilsequenzen). Das gemeinsame Struktur-Hauptmerkmal unter den verschiedenen Stämmen einer selben Art bezieht sich auf eine Ähnlichkeit in der Organisation der Wiederholungen jeder Teilsequenz.
• Die Phänomene der Replikation (Duplikation) als Ursprung des Polymorphismus zwischen Stämmen sind mit Rekombinationen verbunden, welche sich in der letztendlichen verkürzten terminalen Sequenz, welche hierin obenstehend erwähnt wurde, widerspiegeln.
• Immer noch im Umfang der bevorzugten Form zur Ausführung der Erfindung, gemäß welcher die Ursprungssequenz F im IGR&sub2; liegt, wird es gemäß einer weiteren vorteilhaften Variante vorgesehen, daß die iterative Ursprungssequenz von F einer Sequenz Fβ entspricht und mindestens drei wiederholte Teilsequenzen umfaßt, welche jede mindestens 4, vorzugsweise mindestens 6 und noch weiter bevorzugt zwischen 7 und 25 Nukleotidbasen umfassen, wobei jede Teilsequenz mindestens ein Motiv (Com 1) umfaßt, welches allen Teilsequenzen gemeinsam ist und eine geringere oder gleiche Länge zu derjenigen der Teilsequenz aufweist, zu welcher es gehört. In der Praxis umfassen diese Ursprungssequenzen Fβ geweils 8 bis 12 wiederholte Teilsequenzen, welche ihrerseits jeweils zwischen 7 und 13 Nukleotidbasen umfassen.
• Gemäß einer zweiten Art zur Ausführung der Sonde gemäß der Erfindung ist die Ursprungssequenz von F:
• - in der nicht ranskribierten (NTS) intergenischen Spacer-Region 1 (IGR&sub1;) lokalisiert und zwischen der rDNA, die für die Untereiheit 5S der rRNA codiert, und der rDNA, die für die Untereinheit 25S der rRNA codiert, enthalten
• - und entspricht mindestens einer Sequenz Fγ und umfaßt mindestens drei wiederholte Teilsequenzen, die jeweils wenigstens 4, vorzugsweise wenigstens 5 und noch weiter bevorzugt zwischen 5 und 50, sogar zwischen 5 und 45 und noch besser zwischen 5 und 40 Nukleotidbasen aufweisen, wobei jede Teilsequenz wenigstens ein Motiv (Com 2 oder 3) umfaßt, das allen Teilsequenzen gemeinsam ist und eine Länge aufweist die kürzer ist oder gleich zu jener der Teilsequenz, zu welcher dieses gehört.
• Ein besonders bevorzugter beispielhafter Fall ist jener, in welchem F wenigstens zwei Sequenzen Fγ entspricht: Fγ&sub1; und Fγ&sub2;, welche vorteilhafterweise 5 bis 20 bzw. 9 bis 25 Nukleotidbasen aufweisen.
• Gemäß einem weiteren dieser Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Sequenzen, vorzugsweise ribosomale (rDNA), geeignet, um den obenstehend zitierten F- Fragmenten: Fα, Fβ, Fγ, Fγ&sub1; und Fγ&sub2;, zu entsprechen, oder geeignet, um die Gesamtheit oder einen Teil von einem oder mehreren der besagten Fragmente F zu enthalten, welche aus einer langen Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise rDNA, entstammen.
• Die vorliegende Erfindung hat somit gleichermaßen eine rDNA-Sequenz zum Ziel, dadurch gekennzeichnet, dass diese ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden angefügten Sequenzen: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; wobei die SEQ ID NO: 2 bis 5 besonders bevorzugt sind.
• Tatsächlich enthält die angefügte SEQ ID NO: 1 alle von den SEQ ID NO: 2 bis 5:
• - SEQ ID NO: 2: → Base N 2256 bis Base 3512
• - SEQ ID NO: 3: → Base N 4823 bis Base 4903
• - SEQ ID NO: 4: → Base N 923 bis Base 1011
• - SEQ ID NO: 5: → Base N 1012 bis Base 1151
• Gemäß einem besonderen Beispiel zur Veranschaulichung der Erfindung ist die von ihr betroffene Sonde dadurch gekennzeichnet, daß:
• Fα der SEQ ID NO: 2 entspricht;
• Fβ der SEQ ID NO: 3 entspricht;
• Fγ&sub1; der SEQ ID NO: 4 entspricht;
• Fγ&sub2; der SEQ ID NO: 5 entspricht;
• Dieses Ausführungsbeispiel entspricht einem Stamm von Candida krusei.
• Gemäß einer Ausführung oder einer Verfahrensweise von Interesse für die Erfindung ist die hierin obenstehend beschriebene Sonde dadurch gekennzeichnet, dass
• - sie mindestens einen Bereich wenigstens eines der Fragmente Fα, Fβ, Fγ&sub1;, Fγ&sub2; enthält, wobei das Fragment Fα besonders bevorzugt wird;
• - diese angewendet wird für:
• -- den spezifischen und intraspezifischen Nachweis/Identifizierung von Hefen,
• -- oder als epidemiologischer Marker,
• -- oder auch als Tracer für einen Stamm,
• -- oder aber im Rahmen einer therapeutischen Behandlung im Hinblick auf Erkrankungen durch Hefen.
• Bezüglich des Ursprungs typischer Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung, ist ersichtlich, daß sie natürlich sind, da sie ja auf der Basis des Genoms von Hefestämmen beruhen.
• Es versteht sich jedoch von selbst, dass es selbstverständlich innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns liegt, "nicht-natürliche" Nukleinsäuresequenzen durch Kopieren der Sequenzen zum Beispiel gemäß den Prinzipien der Klonierung oder der Polymerisationskettenreaktion (PCR) oder auf synthetischem Wege herzustellen. Insbesondere kann man Nukleinsturesequenzen mit Hilfe automatischer Synthesevorrichtungen, wie jenen die im Handel von Applied Biosystems erhältlich sind, synthetisieren.
• Des weiteren beziehen sich, in der gesamten vorliegenden Beschreibung, die Begriffe Fragmente oder Nukleinsäuresequenzen ebenso auf jene vom synthetischen Typ wie auf jene vom natürlichen Typ.
• Im Rahmen der Anwendung beim Nachweis/Identifizierung werden die Fragmente F, Fa und Fc als Sonden nach dem Prinzip der Hybridisierung von DNA-DNA oder DNA-RNA verwendet. Eine aus diesen Fragmenten gebildete Sonde erlaubt die Ausführung von schnellen, empfindlichen und inter/infraspezifischen Tests zum Nachweis und zur Identifizierung einer Vielzahl von Hefespezies. Mit anderen Worten kann diese Sonde insbesondere einen exzellenten Marker für die Typisierung von Stämmen einer gegebenen Art und insbesondere von Candida krusei oder Geotrichum candidum sein, wobei die letztgenannten Arten unter anderen gewählt worden sind, um die Veranschaulichung der vorliegenden Beschreibung zu unterstützen.
• Man muß berücksichtigen, dass sich die Hybridisierung der Nukleinsäuresonde der Erfindung mit den Zielnukleinsäuresequenzen von Hefe (z. B. C. krusei) ausführen lässt mit Hilfe der Gesamtheit der hier obenstehend angegebenen F-Fragmente, aber auch mit nur einer Fraktion der Gesamtheit oder eines Teils dieser Fragmente, wobei deren Länge vorzugsweise größer oder gleich 5 Basen, vorzugsweise 10 Basen und noch weiter bevorzugt 100 Basen bleibt.
• Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Nukleinsäuresonde gemäß der Erfindung hängt mit der Tatsache zusammen, dass die letztere mit Hilfe von Markierungsmitteln markiert werden kann, welche geeignet zum Aufzeigen der Hybridisierung sind. Diese Markierungsmittel können radioaktiv sein, oder nicht. Unter den klassischen radioaktiven Markierungsmitteln kann man ³²p zitieren. Hinsichtlich nicht-radioaktiver Marker kann man zum Beispiel angeheftete Enzyme, wie Peroxidase, erwähnen.
• Darüber hinaus kann die Sonde nach der Erfindung gegebenenfalls als eine Quelle für spezifische Primer verwendet werden, welche in Polymerisationskettenreaktionen (PCR) anwendbar sind. Diese Primer stellen ein weiteres Ziel der Erfindung dar.
• Wie es bereits angedeutet wurde, ist die Empfindlichkeit der Sonde gemäß der Erfindung hervorragend, weshalb diese perfekt für den Nachweis und/oder die Typisierung von Hefen (z. B. Candida krusei oder Geotrichum candidum) durch Hybridisierung im "Dot-Blot" oder im "Southern-Blot" geeignet ist. Diese Empfindlichkeit zeigt sich in indirekten Hybridisierungs-Assays ("Depot"-Verfahren, Dot-Blot, Southern-Blot, Northern-Blot, "Sandwich"-Hybridisierungstechnik) aber auch in direkten Hybridisierungs-Experimenten in situ. Letztere bestehen in der Anfertigung eines Abdrucks auf einem Filter von Kolonien, welche auf einem festen Kulturmedium wachsen, und in der direkten Zuführung der Hybridisierungssonde auf den Filter.
• Wie es aus dem obenstehenden Text sowie aus Patentanspruch 1 folgt, ist die Sonde gemäß der Erfindung vorzugsweise von Nukleinsäure-Natur, d. h. aufgebaut aus Nukleinsäuren vom Typ DNA, cDNA, mRNA oder ihren Varianten und Analogen. Diese Säuren können von natürlicher oder synthetischer Herkunft sein.
• Es ist interessant, anzumerken, daß die Sonde gemäß der Erfindung effektiv in allen komplexen Medien angewandt werden kann, wie es bei biologischen Milieus der Fall sein kann: Blut, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit etc. Dies stört keineswegs ihre Qualitäten für Nachweis und Identifizierung.
• Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zum inter- und/oder infraspezifischen Nachweis/Identifizierung von Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Anwendung mindestens einer Nukleinsäure-Sonde, wie der obenstehend Beschriebenen, besteht.
• Dieses Verfahren reiht sich in den Rahmen der Verfahrensweisen ein, welche im Fachgebiet des genetischen Nachweis/Identifizierung von Mikroorganismen bekannt sind.
• Vorzugsweise umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:
• - Extrahieren der gesamten genomischen DNA der zu untersuchenden Stämme,
• - gegebenenfalls Unterwerfen dieser Gesamt-DNA unter einen enzymatischen Verdau mit Hilfe wenigstens eines Restriktionsenzyms,
• - Denaturieren der gegebenenfalls verdauten gesamten DNA,
• - Zusammenbringen der so denaturierten gesamten DNA mit der Sonde, die mit wenigstens einem Marker ausgestattet ist, um eine Hybridisierung durchzuführen,
• - Entfernen der DNA und der nicht hybridisierten Sonde
• - und Aufzeigen der Hybridisierung mit Hilfe des Markers.
• Es handelt sich um eine Hybridisierungstechnik, in welcher die Ziel-DNA des zu untersuchenden Mikroorganismus einer Denaturierung unterworfen wird, mit oder ohne vorhergehendem enzymatischen Verdau. Der nachfolgende Schritt ist jener einer Reassoziation der getrennten Stränge der denaturierten DNA mit der Sonde, wobei die ursprünglichen Paarungen der Basenpaare erneut gebildet werden. Während dieses Reassoziationsschrittes werden die einzelsträngigen Moleküle der Sonde und des Ziels unter Bedingungen gebracht, welche für die Paarung mehr oder weniger günstig sind (mehr oder weniger stringent). Unter sehr stringenten Bedingungen hybridisieren nur die Moleküle, deren Sequenzen über eine große Zahl von Basen hinweg komplementär sind, unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls. Die Sonde ist dann spezifisch für das Ziel. Mit einer durch ein radioaktives Element, wie ³²P, oder ein aufgepfropftes Enzym, wie zum Beispiel Peroxidase, markierten Sonde wird die Hybridisierung leicht qualitativ und quantitativ aufgezeigt.
• In dem Fall, wo die Sonde typische Nukleinsäure-Fragmente (Sequenzen) von natürlichem Ursprung umfasst, werden diese selbstverständlich in der gleichen Art wie die Ziele denaturiert, damit man sie nachweisen kann. Dies ist offensichtlich bei synthetischen Fragmenten nicht der Fall.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Reagenz zum Nachweis/Identifizierung der Hefen, welches wenigstens eine Sonde gemäß der Erfindung umfasst.
Industrielle Anwendbarkeit
• Aus dem vorstehenden geht hervor, dass die Nukleinsäuresonde nach der Erfindung sowie das Verfahren unter Verwendung derselbigen perfekt spezifisch für Hefen (z. B. Candida krusei oder Geotrichum candidum) sind und eine hervorragende Empfindlichkeit bieten. Dies eröffnet ihnen wahrhaft interessante Endanwendungen in Anwendungsbereichen der Identifizierung und der Raster-Differenzierung von Stämmen unterschiedlicher Arten (medizinische Diagnostik, industrielle Kontrollen von Lebensmitteln, Fermentation...).
• Die Sonde und das Verfahren gemäß der Erfindung sind von Interesse bei verschiedenenartigen Hefespezies und besonders bei jenen von medizinischem Interesse, wie jenen der Gattung Candida, oder von industriellem Interesse (Landwirtschaft/Lebensmittel, wie Geotrichum candidum).
• Neben dem Nachweis, welcher die Identifizierung und die Typisierung von Mikroorganismen vom Hefetyp reformiert, kann die Sonde gemäß der Erfindung im Rahmen einer therapeutischen Behandlung im Hinblick auf Erkrankungen durch Hefe eingesetzt werden. Genauer gesagt, bedeutet dies, dass die F-Fragmente, welche die Sonde bilden, als zu bekämpfende Ziele verwendet werden können, und zwar bei Medikamenten-Wirkstoffen gegen Hefen. Diese Ziel- Rolle für ein Arzneimittel könnte insbesondere von DNA oder von ihren primären Transkriptionsprodukten eingenommen werden.
• Die Anwendung der Sonde gemäß der Erfindung als epidemiologischer Marker oder als Tracer von Stämmen bildet weitere Einsatzvarianten der Sonde nach der Erfindung.
• Die hierin obenstehend vorgenommene Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung erfolgte auf der Basis von Arbeiten für die Hefearten Candida krusei und Geotrichum candidum, aber es versteht sich, dass die auf Candida krusei und Geotrichum candidum beruhenden Beispiele auf andere Hefearten und insbesondere auf jene von industriellem und medizinischem Interesse, extrapoliert werden können.
• Nach dem gesamten Stand der Sache, wird man die Erfindung, weitere Vorteile davon und Varianten der Ausführung, welche durchaus zugehörig sind, besser angesichts der nichteinschränkenden Beispiele verstehen, welche folgen und welche unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen die Struktur einer erfindungsgemäßen Sonde und insbesondere der F- Fragmente, welche diese aufbauen, sowie mehrere Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung unter Verwendung dieser, beschreiben.
Beschreibung der Figuren
• - Die angefügte Sequenzauflistung gibt die Struktur der SEQ ID. 1 bis 5 wieder, jeweils entsprechend den Fragmenten F1 und Fα, Fβ, Fγ1 und Fγ2. Das Fragment F1 gibt die Sequenzierung der intergenischen Abstand-Region (IGR) zwischen der 25 S-rDNA und der 18 S-rDNA eines ribosomalen Cistrons von Candida krusei wieder. Die Beispiele der Fragmente Fα, Fβ, Fγ1 und Fγ2 werden im folgenden gleichfalls jeweils bezeichnet als CKRS-1/b/a1/a2.
• - Die angefügte Fig. 1 repräsentiert eine Southern-Blot-Hybridisierung von Candida krusei- LMCK31 mit den Sonden F1 und/oder F2.
• - Die Fig. 2 ist eine schematische Wiedergabe eines Cistrons von ribosomaler DNA (rDNA), aufzeigend die Lokalisierung des Fragments F1 in der intergenischen Abstand-Region (IGR) und, innerhalb des letzteren, das Vorliegen der Fragmente Fα, Fβ, (IGR&sub2;) sowie Fγ1 und Fγ2 (IGR&sub1;) in Übereinstimmung mit der Erfindung.
• - Die Fig. 3 ist eine Restriktionskarte des Fragments F1 der Fig. 2.
• - Die Fig. 4 ist eine schematische Wiedergabe der Sequenzierungsstrategie in Hinsicht auf das Fragment F1 von Fig. 3.
• - Die Fig. 5 ist eine schematische Risswiedergabe des Fragmentes Fα, welches in den Fig. 2 und 3 gezeigt wird.
• - Die Fig. 6 gibt die Sequenzierung von F&alpha;, insbesondere seiner Teilsequenzen Kre-0 bis 7, wieder, wobei ein Vergleich zwischen den verschiedenen Teilsequenzen vorgenommen wird. Die Sternchen repräsentieren Basen, welche analog zu jenen der Teilsequenz Kre-1 sind. > > ivr1< < ist eine 8 Basen umfassende inverse Sequenz. < < pall> > ist ein Palindrom von 8 Basen.
• - Die Fig. 7A, 7B und 7C sind Vergleichs-Repräsentationen der Teilsequenzen, welche die iterativen Ursprungssequenzen F&beta;, F&gamma;1 bzw. F&gamma;2 bilden.
• - Die Fig. 8A und 8B sind Pulsfeld-Elektrophoresen von Chromosomen von C. krusei bzw. C. albicans, jeweils vor und nach Hybridisierung mit den Sonden F1, F&alpha; und F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2.
• - Die Fig. 9A ist eine Photographie einer Auftrennung durch Elektrophorese auf einem Agarosegel von DNA-Fragmenten von Stämmen unterschiedlicher Hefearten (1 bis 11), verdaut mit EcoRI.
• - Die Fig. 9B ist eine Hybridisierung gemäß Southern von DNA unterschiedlicher Arten der Fig. 9A, veranschaulichend die Spezifität der iterativen Ursprungssequenzen F&alpha; (oder CKRS- 1), welche als Sonde verwendet wurde.
• - Die Fig. 10A ist eine Photographie einer Gelelektrophorese von DNA aus mehreren Stämmen der Art Candida krusei.
• - Die Fig. 10B ist eine Hybridisierung gemäß Southern von DNA unterschiedlicher Stämme von C.krusei, wobei der Polymorphismus veranschaulicht wird, der bei Verwendung der Sequenz F&alpha; (oder CKRS-1) als Sonde nachgewiesen wird.
• - Die Fig. 11 zeigt das Ergebnis der selektiven PCR-Amplifikation der F&alpha; umfassenden Region.
• - Die Fig. 12 ist eine schematische Wiedergabe der Restriktionskarte des Fragments F&sub1;&sub0;, das die Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7; für Geotrichum candidum bildet. Dabei umfasst diese Sonde ein Unterfragment F, dessen iterative Ursprungssequenz F&delta; (variable Region GCRS-A) ist.
• - Die Fig. 13 repräsentiert ein Hybridisierungsprofil (Southern) mit der Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7;, die für Geotrichum candidum spezifisch ist und gemäß der Art der Sonde F (F&alpha;, F&beta;, F&gamma;1, F&gamma;2) für Candida krusei entwickelt worden ist.
Beispiele Beispiel 1: Sequenzierung eines DNA-Fragmentes F1 von C. krusei, erhalten durch Verdau des Stammes LMCK1 mit EcoRI
• 1.1. Der Stamm LMCK31 wurde in einer bronchio-alveolaren Probenentnahme bei einem Patienten aus einem Krankenhaus isoliert. Dieser Stamm wurde am 22. Oktober 1993 bei der CNCM des Institut Pasteur de PARIS unter der Referenznummer I-1372 hinterlegt. Dieser Stamm LMCK31 wird auf Gel-Kulturmedien vom Typ AGAR YM (1% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 0,5% Pactopepton) oder AGAR SM (1% Glucose, 1% Bactopepton, 0,1% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,22% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% K&sub2;HPO&sub4;, 0,1% Hefeextrakt) kultiviert.
1.2. Isolierung und Klonierung des Fragments F1
• Ein F1-Fragment mit einer ungefähren Länge von 5,4 kb wird ausgehend von genomischer DNA des Stammes LMCK31 gemäß des Protokolls isoliert, welches in der Patentanmeldung PCT WO-95 11 991 beschrieben wurde. Das F1-Fragment wird unter einer Vielzahl von Fragmenten ausgewählt, welche durch den Verdau von Gesamt-DNA von LMCK-31 mit EcoRI oder mit Hin- fI erzeugt wurden.
• Genauer gesagt, hat man eine "Southern-Blot"-Hybridisierung vorgenommen, indem man 5 ug genomische DNA von Candida krusei LMCK31, verdaut mit EcoRI oder HinfI, welche danach durch Elektrophorese nach ihrer Größe auf einem (0,8% w/v) Agarosegel aufgetrennt wurde, verwendet. Die aufgetrennte DNA wird im Gel mit einer Natriumhydroxid-Lösung denaturiert und anschließend mit einem Tris-Puffer neutralisiert. Die DNA wird anschließend auf eine Nylon-Membran (AMERSHAM Life Science Inc., ARLINGTON HEIGHTS, IL) transferiert und dann mit der DNA-Sonde, enthaltend die Fragmente F1 und F2, entsprechend IGR&sub1; und IGR&sub2;, oder mit Plasmiden, enthaltend entweder das Fragment F1 oder das Fragment F2, hybridisiert. Die Anzeige der Hybridisierung durch "Southern-Blot" wird mit Hilfe eines ECL-Kits von Amersham bewerkstelligt. Die Hybridisierungsbanden werden durch Markieren mit Peroxidase und Nachweis durch Chemolumineszenz erhalten.
• Die angefügte Fig. 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Die Spur A entspricht EcoRI- Verdauungsprodukten von DNA aus Candida krusei, ohne Hybridisierung mit einer Sonde. Die Spur B entspricht der Hybridisierung mit einer Sonde, umfassend die Fragmente F1 und F2. Die Spur C entspricht einer Hybridisierung mit einer Plasmid-Sonde, enthaltend F1, und die Spur D einer Hybridisierung mit mit einer Plasmid-Sonde, enthaltend F2. Die geschätzten Molekulargewichte der vier Hybridisierungsbanden der Spuren B, C, D sind in Kilobasen (kb) am linken Rand angegeben.
1.3. Sequenzierung von F1
• F1 wird in seiner Gesamtheit in den zwei Richtungen sequenziert. Das zur Sequenzierung angewandte Verfahren ist ein klassisches Verfahren auf dem betreffenden technischen Gebiet. Es handelt sich um das Didesoxy-Terminations-Verfahren unter Verwendung der Sequenase Version 2.0 (US Biochemical, Cleveland, OH). Die eingesetzten Mittel sind das Kit ERASE-A-Base (Promega -Madison, WI).
• Die Fig. 2 zeigt in schematischer Weise die Lokalisierung des Fragments F1 in dem Cistron der ribosomalen DNA von LMCK31.
• Die angefügte Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des Fragmentes F1. Die für die Restriktionsenzyme verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: E = EcoRI (0,5261), Ev = EcoRV (1803), H = HinfI (229, 1155; 1551, 4828, 4864), N = NsiI (401, 4383), P = PstI (2183), S = SmaI (803); St = StyI (2425, 2589, 2754, 2919, 3084, 3249, 3414).
• Die angefügte Fig. 4 zeigt die angenommene Sequenzierungs-Strategie. In dieser Fig. 4 entsprechen die eingekreisten Ziffern 1, 2 und 3 den durch Deletionen hergestellten Subklonen. Die zwischen Klammern nach den Enzymen angegeben Zahlen entsprechen der Nummer der Nukleotidbase, welche die Schnittstelle identifiziert.
• Es geht somit hervor, dass F1 eine Makrosequenz ist, umfassend 5261 Basenpaare und aufweisend ein GC-Basenverhältnis von 42,2 Mol%. Die vollständige Sequenz von F1 wird in SEQ ID NO: 1 in der angefügten Sequenzauflistung angegeben. F1 umfasst:
• - 488 Basenpaare vom 3'-Ende der 25S-rDNA,
• - die intergenische Abstand-Region 1 (IGR&sub1;),
• - die 5S-rDNA, und
• - die intergenische Abstand-Region 2 (IGR&sub2;).
• Wie aus den Fig. 2 und 3 folgt, umfasst IGR&sub2; (oder NTS = nicht-transkribierte Sequenz) zwei iterative Ursprungssequenzen F&alpha; und F&beta;. Dahingegen schließt IGR&sub1; die zwei iterativen Ursprungssequenzen F&gamma;1 und F&gamma;2 ein.
1.3.1. F&alpha;
• Die iterative Ursprungssequenz F&alpha; hat eine Länge von 1256 Basenpaaren (Base 2256 bis Base 3512). F&alpha; wird schematisch in der Fig. 5 repräsentiert. Die Fig. 6 und die SEQ ID NO: 2 der angefügten Sequenzauflistung geben die vollständige Sequenzierung von F&alpha; wieder. F&alpha; besteht aus 8 wiederholten Teilsequenzen, jeweils bezeichnet als Kre-0 bis Kre-7. Die sieben ersten wiederholten Teilsequenzen Kre-0 bis Kre-6 haben eine variable Länge zwischen 164 und 165 Basenpaaren. Die letzte Teilsequenz Kre-7 umfasst 103 Basenpaare (siehe Fig. 5 und 6). Das F&alpha; entsprechende DNA-Fragment weist einen Gehalt an GC-Basen von 35 Mol% auf.
1.3.2. F&beta;
• Die andere iterative Ursprungssequenz eines Fragments F, welche fähig zur Verwendung beim Aufbau einer Sonde gemäß der Erfindung ist, ist in IGR&sub2; enthalten und wird mit der Bezeichung F&beta; benannt. Die Sequenzierung von F&beta; wird in der Fig. 7A und der SEQ ID NO: 3 der angefügten Sequenzauflistung repräsentiert. Die Ursprungssequenz F&beta; umfasst 9 wiederholte Teilsequenzen, enthalten zwischen der Base 4823 und der Base 4903. Diese Teilsequenzen besitzen eine Länge, welche zwischen 8 und 10 Basen schwankt. Sie enthalten einen gemeinsamen Kern von 6 Basen, welcher ein gemeinsames Motiv aufbaut (in der Fig. 7A bezeichnet durch ComI), welches entweder direkt (eines nach dem anderen) oder in Trennung durch Abstände von einigen Nukleotidbasen wiederholt wird.
1.3.3. F&gamma;1 und F&gamma;2
• Diese zwei iterativen Ursprungssequenzn F&gamma;1 und F&gamma;2 sind in IGR&sub1; lokalisiert. F&gamma;1 umfasst 9 wiederholte Teilsequenzen einer Länge, die zwischen 6 und 16 Basen schwankt, wobei diese Teilsequenzen sich von der Base 923 bis zur Base 1011 erstrecken (Fig. 7B). F&gamma;2 erstreckt sich von der Base 1012 bis zur Base 1151 und umfasst 9 Teilsequenzen einer Länge, die zwischen 10 und 17 Basen schwankt (Fig. 7C). Die Teilsequenzen von F&gamma;2 sind sehr nahe Kopien voneinander. Es konnten zwei Kerne mit gemeinsamen Motiven von 6 bis 7 Basen jeweils in F&gamma;1 bzw. F&gamma;2 isoliert werden. Die gemeinsamen Motive von F&gamma;1 und F&gamma;2 werden in den Fig. 7B bzw. 7C als Com2 bzw. Com3 angegeben. Nach Art von Com1 von F&gamma; werden Com2 und Com3 entweder direkt (eines nach dem anderen) oder in Trennung durch Abstände von einigen Nukleotidbasen wiederholt.
Beispiel 2: Untersuchung der Homologie zwischen den acht Teilsequenzen von F&alpha;
• Die Homologie der Teilsequenzen Kre-0 bis Kre-7 wurde untersucht, indem man die Teilsequenzen einem beinahe optimalen Alignment bzw. Parallelübereinanderstellung unterwarf. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 Prozentsatz von Basen, welche "aufgehen" oder welche sich zwischen den 8 Teilsequenzen Kre-0 bis Kre-7 entsprechen.
• * Die 103 Basen von Kre-7 wurden verglichen mit den ersten 103 Basen von Kre-n = 0 bis 6
Beispiel 3: Hybridisierung von Chromosomen von Caudida krusei und von Candida albicaus mit Sonden, umfassend die Fragmente F1 oder F&alpha; und F&beta; oder F&gamma;1, F&gamma;2
• Dieses Beispiel zielt darauf ab, zu zeigen, daß die Lokalisation der Fragmente F1, F&alpha;, F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2, welche die erfindungsgemäße Sonde aufbauen, lediglich auf den Chromosomen, welche Cistrons von rRNA enthalten, vorliegt.
• 3.1. Die verwendeten Stämme sind LMCK31 für Candida krusei und der Stamm 3153A für Candida albicans.
• 3.2. Die angewandten Fragmente F1, F&alpha;, F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2 sind diejenigen, welche in den Beispielen 1 und 2 isoliert wurden.
• 3.3. Die angewandte Technik ist diejenige der Quer-Elektrophorese in einem Pulsfeld. Chromosomale DNA enthaltende Agarosescheibchen bzw. -plaques werden ausgehend von Kultursuspensionen des Stammes C. krusei LMCK31 und C. albicans 3153A hergestellt. Die Zellen werden durch das Verfahren von Shareman et al., gemäß welchem man ZYMOLYASE 20 T anwendet, in Sphäroplasten umgewandelt. Die Sphäroplasten werden sofort zweimal in einer Lösung von molarem Sorbitol gewaschen, und danach bei einem Verhältnis von 10&sup9; Zellen/ml resuspendiert. Die Sphäroplasten werden mit einem Volumen 1%iger "Seaplaque"-GT-Agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME) vermischt und unmittelbar in eine Gießform gegeben. Die Scheibchen werden mit 1% SARCOSYL und mit einer Proteinase K mit einem Titer von 100 mg/ml behandelt und schließlich 60 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Die Scheibchen werden anschließend in einer TE-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) gewaschen und in diesem Medium bei 4ºC aufbewahrt. Die chromosomalen DNAs werden durch Gelelektrophorese in einem Puls-Feld in einer "Gene-Line"-Vorrichtung (BECKMAN, FULLERTON, CA) unter Verwendung von 0,65% Agarose LE (FMC Bioproducts, Rockland, ME) sowie Tris-Acetat-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA, pH 8) getrennt. Die Elektrophorese wird in fünf Schritten durchgeführt, welche hierin nachstehend beschrieben sind: 6 Stunden lang bei 65 V mit einer Wechsel- bzw. Umschalt-Dauer von einer Minute; 65 V während 12 Stunden mit einer Wechseldauer von 2 Min.; 65 V während 16 Stunden mit einer Wechseldauer von 4 Min.; 65 V während 20 Stunden mit einer Wechseldauer von 7 Min. und 65 V während 18 Stunden mit einer Wechseldauer von 10 Min. Die Gele werden anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt, photographiert und anschließend auf eine ZETABIND-Nylonmembran überführt. Die Hybridisierung und das Waschen werden gemäß der Methode von CHURCH und GILBERT realisiert. Die chromosomalen Banden werden mit unterschiedlichen radioaktiv markierten Sonden: F1, F&alpha; und F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2, nach dem Hybridisierungsverfahren auf der Membran sondiert.
3.4. Ergebnisse
• Die Fig. 8A zeigt die Pulsfeld-Elektrophoresegele, wobei gezeigt wird, daß man 5 größere Chromosomen für Candida krusei und 7 größere Chromosomen für Candida albicans aufgetrennt hat.
• Die Fig. 8B zeigt, daß die Sonden F1, F&alpha; und F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2 ausschließlich mit den drei größten Chromosomen 1, 2 und 3 von Candida krusei hybridisieren. Die Sonden hybridisieren nicht mit irgendeinem der 7 Chromosomen von Candida albicans. Dies zeigt die Inter-Spezies- Spezifität der besagten Sonden. Die Fig. 8A zeigt gleichermaßen ein Minichromosom m (für Candida krusei).
• Die Fig. 8 zeigt eine Hybridisierung auf Membran, in welcher die Sonden 4 Tage lang mit den Chromosomen in Kontakt gebracht wurden.
• Die Kennzeichnung P auf den Fig. 8A bis 8B entspricht der Aufbringungszone der Probe.
Beispiel 4: Test zum Nachweis und zur Identifikation zwischen Spezies
• Die Fig. 9A zeigt die Gelelektrophorese von DNA von Stämmen verschiedener Hefearten, verdaut mit dem Enzym EcoRI. Die Fig. 9B zeigt die entsprechende Hybridisierung gemäß Southern, wenn die Sonden F1, F&alpha; und F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2 verwendet werden, wobei selbige mit Peroxidase markiert sind. Das experimentelle Protokoll ist das gleiche, wie dasjenige, welches in dem obenstehenden Beispiel 1 sowie in Beispiel 3 von WO-95/11991, beschrieben worden ist. Die Sonden hybridisieren einzig mit DNA von C. krusei (CBS 573T, Bande Nr. 10) und nicht mit DNA von anderen getesteten Hefen. Dies zeigt die interspezifische Spezifität der besagten Sequenzen.
• In den der Fig. 9A und 9B entsprechenden Tests sind die betrachteten Mikroorganismen die folgenden:
• S: Standard: Lambda-Phage, verdaut mit HindIII
• 1: C. tropicalis CBS 94T
• 2: C. parapsilosis CBS 604T
• 3: C. guilliermondii CBS 6021T
• 4: C. lusitaniae CBS 6936T
• 5: C. kefyr CBS 607T
• 6: C. albicans Serotyp B
• 7: C. albicans Serotyp A
• 8: C. albicans ATCC 2091
• 9: C. valida CBS 638T
• 10: C. krusei CBS 573T
• 11: Y. lipolytica CBS 6124T
• S: Standard: Lambda-Phage, verdaut mit HindIII
Beispiel 5: Infra-spezifischer Typisierungstest für unterschiedliche Stämme von C. krusei
• Die Fig. 10A zeigt ein Elektrophorese-Gel von DNA mehrerer Stämme der Art C. krusei, verdaut mit dem Enzym EcoRI. Die Fig. 10B zeigt die entsprechende Hybridisierung gemäß Southern, wenn die Sonden F1, F&alpha; und F&beta;, F&gamma;1 und F&gamma;2, markiert mit Peroxidase, verwendet werden. Das experimentelle Protokoll ist das gleiche, wie jenes, welches im obenstehenden Beispiel 1 (oder Beispiel 3 von WO-95/11991) beschrieben wurde. Die Sonden hybridisieren mit allen getesteten Stämmen von C. krusei, was ihre Eignung für den Nachweis und die Identifizierung dieser Spezies veranschaulicht. Außerdem enthüllen diese Sonden einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus gemäß den Sonden. Dies veranschaulicht die Brauchbarkeit dieser Sonden zur Differenzierung der Stämme unter ihnen auf infraspezifischem Niveau und daher für die Typisierung von Stämmen im Rahmen von epidemiologischen Untersuchungen oder als Tracer für Stämme auf industriellem Gebiet. In beispielhafter Weise, wurden die Referenz-Stämme K62-K64, deren Hybridisationsprofile identisch sind, vom gleichen Patienten erhalten.
Beispiel 6: Test zur Identifikation und Typisierung von Stämmen von C. krusei durch Polymerisationskettenreaktion (PCR) der Region F&alpha; (oder CKRS-1)
• Die Fig. 11 zeigt das Ergebnis der selektiven Amplifikation (gemäß dem PCR-Verfahren) der Region F&alpha; (CKRS-1) mit Hilfe der Primer Arno 1: CGTAGGATACTAACCACAGC und Arno 2: GGCCAACACATACATACCTT, deren Sequenzen innerhalb des Fragmentes F1 von C. krusei gewählt sind (Positionen 2138-2167 und 3989-3970). Die Amplifikationsbedingungen sind diejenigen, welche von Carlotti et al., 1994: Systematic and Applied Microbiology 17, 380- 386, beschrieben wurden. Das Amplifikations-Verfahren durch PCR ist wie folgend beschaffen: 50 ul der zu testenden DNA-Lösung (DNA von C. krusei und DNAs von anderen Hefearten), enthaltend ungefähr 10 bis 100 pg, werden zu 50 ul der Reaktionsmischung, enthaltend die Taq- Polymerase, in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, und in einen Thermozykler gebracht. Die Anfangs-Denaturierung dauert 3 Minuten bei 92ºC. Hieran schließen sich 30 Zyklen an, bestehend aus: 1 Minute bei 92ºC, 1 Minute bei 60ºC, 2 Minuten bei 72ºC. Die Schluß-Verlängerung dauert 10 Minuten bei 72ºC.
• Die in diesem Beispiel getesteten, verschiedenen Stämme werden durch die Kennzeichnungen R, 12-26 in der Fig. 11 angegeben. Die Legende dieser Kennzeichnungen ist hier nachstehend angegeben:
• R: Raoul
• 12: C. krusei CBS 573T
• 13: C. krusei LMCK 31
• 14: Negativkontrolle
• 15: S. cerevisiae CBS 1171
• 16: C. albicans ATCC 2091
• 17: C. norvegensis LM Q243
• 18: C. glabrata CBS 138T
• 19: Y. lipolytica CBS 6124T
• 20: C. kefyr CBS 607T
• 21: C. lusitaniae CBS 6936T
• 22: C. guilliermondü CBS 6021T
• 23: C. parapsilosis CBS 604T
• 24: C. rugosa SIPH
• 25: C. valida CBS 638T
• 26: C. inconspicua CBS 180T
• Aufgrund der Spezifität der Zielregion (CKRS-1) und der gewählten Primer ergaben lediglich die DNAs der Stämme von C. krusei (Ref. 12, 13) ein positives Amplifikationssignal (Fig. 11). Die DNAs der anderen getesteten Hefearten wurden nicht amplifiziert. Außerdem ergaben die Längendifferenzen der amplifizierten Fragmente bei den zwei getesteten Stämmen von C. krusei den Polymorphismus der Region F&alpha; (CKRS-1). Dieses Beispiel veranschaulicht gut die Nützlichkeit der PCR-Amplifikationstests der F&alpha;-Region (CKRS-1) zur Identifikation von Stämmen von C. krusei und zu ihrer gleichzeitigen Typisierung. Diese Methodik besitzt den Vorteil, sehr schnell und direkt bei biologischen Proben (Speichel, Blut, Stuhlproben, LCR bzw. Cerebrospinalflüssigkeit) oder Proben von Lebensmitteln anwendbar zu sein.
Beispiel 7: Test zum Nachweis und zur Identifikation/Typisierung von Hefen der Spezies Geotrichum candidum
• 7. 1. Die Isolierung und Klonierung des F&delta; umfassenden Fragmentes F&sub1;&sub0;, enthalten in der Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7;, welche für Geotrichum candidum entwickelt wurde, sind gemäß des im obenstehenden Beispiel 1 beschriebenen Protokolls durchgeführt worden.
• Die Fig. 12 gibt die Restriktionskarte des Fragmentes F10 an, umfassend die iterative Ursprungssequenz F&delta; (GCRS-1).
• Abkürzungen: EV = EcoRV, SII = SacII, EI = EcoRI.
7.2. Nachweis/Identifikations-Test
• Die Fig. 13 zeigt die Resultate der gemäß des Verfahrens von Southern erfolgenden Hybridisierung von DNA der Stämme der Spezies Geotrichum candidum und Geotrichum fermentans (verdaut mit MspI) mit der für Geotrichum candidum spezifischen Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7;. Die MspI- Restriktionsfragmente der DNA der untersuchten Stämme wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und danach auf eine Nylon-Membran überführt. Die Membran wurde mit ungefähr 100 ng der Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7; sondiert. Diese Sonde hybridisierte nur mit DNA der Stämme von Geotrichum candidum und zeigt einen Restriktionsfragmentlänenpolymorphismus auf.
• Die Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7; ist gemäß dem Modell der Sonde F = F1, F&alpha;, F&beta;, F&gamma;1, F&gamma;2, weiterentwickelt worden. Die Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7; besteht aus einem F&sub1;&sub0;-Teil, worin sich F&delta; von IGR&sub1; eines Stammes von Geotrichum candidum befindet. Die Sonde A&sub2;O&sub2;&sub7; hybridisiert ausschließlich mit DNA aus Stämmen von Geotrichum candidum (Fig. 13). Sie hybridisiert nicht mit DNA aus Stämmen von Geotrichum fermentans, obwohl diese zwei Spezies nah verwandt sind. Dieses Beispiel zeigt gut die Spezifität dieser Sonde gemäß der Erfindung. Außerdem enthüllt diese Sonde gleichermaßen einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus nach den Stämmen von Geotrichum candidum. Dies gestattet, unter selbigen zu differenzieren und selbige somit zu typisieren.
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Gültigkeit des vorliegenden Modells einer Sonde zur Identifizierung/Typisierung für Hefen von medizinischem Interesse und/oder industriellem Interesse. Die in der Fig. 13 als Nr. 27 bis 37 angegebenen Stämme haben folgende Entsprechungen:
• S = Standard
• G. fermentans CBS 50.57
• G. fermentans CBS 25.29
• G. candidum F
• G. candidum A
• G. candidum B
• G. candidum LMGC3
• G. fermentans
• G. candidum 149.26
• G. candidum LMGC8
• G. candidum LMGC7
• G. candidum CBS 557.83
• Standard
Sequenzauflistung
• (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
• (i) ANMELDER:
• (A) NAME: Universite Claude Bernard Lyon I
• (B) STRASSE: 43, Boulevard du 11 Novembre 1918
• (C) STADT: Villeurbane
• (E) LAND: Frankreich
• (F) PLZ: 69622 Cedex
• (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Sonde und Verfahren, insbesondere zum Nachweis und/oder zur inter/infraspezifischen Identifikation von Hefen, sowie entsprechende genetische Hilfsmittel
• (iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 5
• (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
• (A) MEDIUMTYP: Floppy disk
• (B) COMPUTER: IBM PC-Kompatible
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
• (vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
• (A) ANMELDUNGSNUMMER: FR 96 03835
• (B) DATUM DER EINREICHUNG: 22. MÄRZ 1996
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 1:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 5261 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGART: einzel
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SINN: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 2:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 1257 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGART: einzel
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SINN: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 3:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 81 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGART: einzel
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SINN: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 4:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 89 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGART: einzel
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SINN: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
• (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 5:
• (i) SEQUENZMERKMALE:
• (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGART: einzel
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SINN: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

Claims (24)

1. Nachweissonde, die für Hefen spezifisch und/oder intraspezifisch ist, eines solchen Typs, der ausgewählt ist aus den folgenden genetischen Hilfsmitteln: wenigstens einem Teil von:

- wenigstens einem Fragment F einer Nukleinsäure DNA, das konstruiert wurde und/oder ausgehend von wenigstens einer Ursprungssequenz ribosomaler DNA (rDNA) isoliert wurde:

das in dem nicht transkribierten (NTS) intergenen Bereichsabschnitt (IGR) lokalisiert ist und zwischen der rDNA, die für die Untereinheit 25 S der rRNA codiert, und der rDNA, die für die Untereinheit 18 S der rRNA codiert, enthalten ist,

- und/oder wenigstens einem Analogen Fa dieses Fragments, das aus der Degeneriertheit des genetischen Codes resultiert;

- und/oder wenigstens einem Fragment Fc einer cDNA, das zu dem Fragment F komplementär ist,

wenigstens einem Teil der primären Transkriptionsprodukte der Fragmente F, Fa und/oder Fc,

dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungssequenz der rDNA für F und/oder Fa und/oder Fc ausgewählt ist aus solchen,

- die iterativ sind

- die wenigstens zwei, vorzugsweise 2 bis 12 wiederholte Teilsequenzen enthalten,

- und wobei der Homologiegrad zwischen diesen Teilsequenzen größer oder gleich 50% ist.

2. Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Homologiegrad größer oder gleich 55% ist.

3. Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Homologiegrad größer oder gleich 60% ist.

4. Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungssequenz von F in dem nicht transkribierten (NTS) intergenen Bereichsabschnitt 2 (IGR&sub2;) lokalisiert ist und zwischen der rDNA, die für die Untereinheit 5 S der rRNA codiert, und der rDNA, die für die Untereinheit 18 S der rRNA codiert, enthalten ist.

5. Sonde nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die iterative Ursprungssequenz von F wenigstens drei wiederholte Teilsequenzen umfasst, die jeweils wenigstens 80 Nukleotidbasen aufweisen.

6. Sonde nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Sequenzen jeweils wenigstens 120 Nukleotidbasen aufweisen.

7. Sonde nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Sequenzen jeweils zwischen 150 und 300 Nukleotidbasen aufweisen.

8. Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die iterative Ursprungssequenz von F wenigstens eine Teilsequenz umfasst, die im Vergleich zu anderen Teilsequenzen eine verkürzte Länge aufweist.

9. Sonde nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die verkürzte Teilsequenz terminal ist.

10. Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die iterative Ursprungssequenz von F wenigstens drei wiederholte Teilsequenzen umfasst, die jeweils wenigstens 4 Nukleotidbasen aufweisen; wobei jede Teilsequenz wenigstens ein Motiv umfasst, das allen Teilsequenzen gemeinsam ist und eine Länge aufweist, die kürzer ist oder gleich jener der Teilsequenz, welcher dieses angehört.

11. Sonde nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Sequenzen jeweils wenigstens 6 Nukleotidbasen aufweisen.

12. Sonde nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Sequenzen jeweils zwischen 7 und 25 Nukleotidbasen aufweisen.

13. Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungssequenz von F:

- in dem nicht transkribierten (NTS) intergenen Bereichsabschnitt 1 (IGR&sub1;) lokalisiert ist und zwischen der rDNA, die für die Untereinheit 5 S der rRNA codiert, und der rDNA, die für die Untereinheit 25 S der rRNA codiert, enthalten ist

- und wenigstens drei wiederholte Teilsequenzen umfasst, die jeweils wenigstens 4 Nukleotidbasen aufweisen, wobei jede Teilsequenz wenigstens ein Motiv umfasst, das allen Teilsequenzen gemeinsam ist und eine Länge aufweist, die kürzer ist oder gleich jener der Teilsequenz, welcher dieses angehört.

14. Sonde nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Teilsequenzen jeweils wenigstens 5 Nukleotidbasen aufweisen.

15. Sonde nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Teilsequenzen jeweils zwischen 5 und 50 Nukleotidbasen aufweisen.

16. Sonde nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wiederholten Teilsequenzen jeweils zwischen 5 und 40 Nukleotidbasen aufweisen.

17. Sonde nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungssequenz von F wenigstens zwei Sequenzen entspricht, welche 5 bis 20 bzw. 9 bis 25 Nukleotidbasen aufweisen.

18. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass diese ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden angefügten Sequenzen: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5.

19. Sonde nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungssequenz von F entspricht:

SEQ ID NO: 2;

SEQ ID NO: 3;

SEQ ID NO: 4; und

SEQ ID NO: 5.

20. Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass:

- diese wenigstens einen Teil wenigstens einer der Ursprungssequenzen von F, wie diese in den Ansprüchen 5 bis 7, 10 bis 17 und 19 definiert sind, umfasst,

- diese angewendet wird für:

- den spezifischen und intraspezifischen Nachweis/Identifizierung von Hefen,

- oder als epidemiologischer Marker,

- oder auch als Tracer für einen Stamm,

- oder aber im Rahmen einer therapeutischen Behandlung im Hinblick auf Erkrankungen durch Hefen.

21. Sonde nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass diese wenigstens einen Teil einer der Ursprungssequenzen von F, wie diese in den Ansprüchen 5 bis 7 definiert sind, umfasst.

22. Verfahren des Nachweisens und der Identifizierung von Hefen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses aus dem Anwenden wenigstens einer Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 und 19 bis 21 besteht und die folgenden Schritte umfasst:

- Extrahieren der gesamten genomischen DNA der zu untersuchenden Stämme,

- gegebenenfalls Unterwerfen dieser gesamten DNA unter einen enzymatischen Verdau mit Hilfe wenigstens eines Restriktionsenzyms,

- Denaturieren der gegebenenfalls verdauten gesamten DNA,

- Zusammenbringen der so denaturierten gesamten DNA mit der Sonde, die mit wenigstens einem Marker ausgestattet ist, um eine Hybridisierung durchzuführen,

- Entfernen der DNA und der nicht hybridisierten Sonde und

- Aufzeigen der Hybridisierung mit Hilfe des Markers.

23. Oligonukleotidprimer, der insbesondere für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass dieser aus der Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 und 19 besteht.

24. Verwendung der Sonde nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 und 19 bis 21 für den Nachweis, die Interspezies-Identifizierung und/oder die intraspezifische Differenzierung der Hefen insbesondere der Spezies Candida krusei oder Geotrichum candidum.