DE69637089T2 - Hapten-Träger-Konjugate zur Anwendung in der Drogen-Missbrauchs-Therapie - Google Patents

Hapten-Träger-Konjugate zur Anwendung in der Drogen-Missbrauchs-Therapie Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung bei Drogenmissbrauch. Insbesondere lässt sich die vorliegende Erfindung zur Behandlung bei Drogenmissbrauch unter Verwendung von Drogen-Hapten-Trägerkonjugaten, die die Fähigkeit besitzen, Antikörperreaktionen hervorzurufen und/oder unter Verwendung der Antikörper gegen die Drogen-Hapten-Trägerkonjugate heranziehen. Alle sich auf Kokain beziehenden Gegenstände sind lediglich zu Vergleichszwecken angegeben; die Aufgabe der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Gebrauch und der Missbrauch von Drogen hat weltweit, insbesondere in den Vereinigten Staaten, epidemische Ausmaße erreicht. Es gibt eine Überfülle von legalen und illegalen Drogen, deren Missbrauch zu einem ernsthaften öffentlichen Thema, das alle Schichten der Gesellschaft betrifft, geworden ist und offensichtlich medizinische und soziale Konsequenzen hat. Einige der Anwender leben im Kreis einer hochgefährdeten Bevölkerung, die mit Armut und illegalen Aktivitäten assoziiert wird. Andere Anwender, die sich selbst möglicherweise als Anwender für Entspannungszwecke einstufen, sind gefährdet, und zwar (a) aufgrund von Eigenschaften der Droge(n), die sie abhängig machen, (b) aufgrund einer Prädisposition des Anwenders, zu einem starken Anwender zu werden, oder (c) aufgrund einer Kombination von Faktoren, zu denen persönliche Umstände, Not, Umwelt und Zugang zu den Drogen gehören. Eine angemessene Behandlung von Drogenmissbrauch, einschließlich von Mehrfachdrogenmissbrauch, erfordert neuartige und kreative Programme der Intervention.
  • Eine besonders problematische Droge ist Kokain, ein aus den Blättern der Kokapflanze (Erythroxylon coca) gewonnenes Alkaloid. Allein in den USA gibt es derzeit mehr als 5 Millionen Personen, die regelmäßig Kokain einnehmen, von denen mindestens 600000 als schwer abhängig eingestuft werden (Miller et al., N.Y. State J. Med., (1989), S. 390-395; und Carroll et al., Pharm. News., Bd. 1 (1994), S. 11-16). Innerhalb dieser Bevölkerungsgruppe gibt es eine erhebliche Anzahl von abhängigen Personen, die aktiv eine Therapie anstreben. Beispielsweise haben sich im Jahre 1990 380 000 Personen um eine medizinische Behandlung von Kokain-Abhängigkeit bemüht. Ihre Anzahl steigt an. Zu der Zeit nahm man an, dass pro Jahr bei 100000 Notfallaufnahmen die Einnahme von Kokain im Spiel war. Die kumulativen Auswirkungen von Gewaltverbrechen im Zusammenhang mit Kokain, von Verlusten der individuellen Leistungsfähigkeit, von Krankheit und Tod stellen international ein Problem dar.
  • Der Mangel an wirksamen Therapien bei der Behandlung von Kokain-Abhängigkeit zeigt, dass neue Wege entwickelt werden müssen. Zusätzliche Faktoren, die zum Mangel an erfolgreichen Behandlungsprogrammen hinzukommen, bestehen darin, dass die Muster des Kokain-Missbrauches sich im Laufe der Zeit verändert haben. In dem Artikel "1994 Chemical Approaches to the Treatment of Cocaine Abuse" (Carroll et al., Pharm. Newes, Bd. 1 (1994), Nr. 2) berichten Carroll et al., dass seit Mitte der 1980er Jahre die intravenöse und nasale Dosierung des Hydrochloridsalzes (Koks, Schnee, Blow) und das Rauchen der freien Kokainbase (Crack) zu üblichen Wegen der Verabreichung geworden sind, die Euphorie und eine psychomotorische Stimulation für eine Zeitspanne von mindestens 30-60 Minuten hervorrufen. Im Gegensatz zu einigen anderen missbräuchlich verwendeten Drogen kann Kokain bei Gelagen, die mehrere Stunden dauern, eingenommen werden. Dieses Verhalten führt zur Abhängigkeit und in einigen Fällen zu toxischen Konsequenzen (Carroll et al., Pharm. Newes, a. a. O.).
  • Es gibt nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten beim Missbrauch von Drogen und keine wirksamen, lang anhaltenden Behandlungsmöglichkeiten für Kokain-Abhängigkeit. Zu Behandlungsmöglichkeiten gehören (ohne Beschränkung hierauf) eine Beratung in Verbindung mit der Verabreichung von Arzneistoffen, die als Antagonisten der Opioid-Rezeptoren wirken, oder von Arzneistoffen, mit denen versucht wird, das mit der Drogenabhängigkeit verbundene Verlangen zu verringern. Ein Behandlungsansatz besteht in der Detoxifikation. Eine auch nur zeitweilige Remission mit den damit verbundenen physischen, sozialen und psychologischen Besserungen wird gegenüber einer Fortsetzung oder zunehmenden Beschleunigung des Missbrauchs und seiner damit verbundenen nachteiligen medizinischen und sozialen Konsequenzen (Wilson et al., in Harrison's Principle of Internal Medicine, Bd. 2, 12. Auflg., McGraw-Hill (1991), S. 2157-2158) bevorzugt. Speziell beinhalten pharmakologische Ansätze zur Behandlung von Kokain-Missbrauch im Allgemeinen die Verwendung von antidepressiven Arzneistoffen, wie Desipramin oder Fluoxetin, die dazu beitragen können, die psychologischen Aspekte des Entzugs in den Griff zu bekommen, die jedoch im Allgemeinen nicht direkt die physiologischen Wirkungen von Kokain beeinflussen. Ferner unterliegt ihre Wirksamkeit starken Variationen (Brooke et al., Drug Alcohol Depend., Bd. 31 (1992), S. 37-43). Bei einigen Untersuchungen verminderte Desipramin die Eigenverabreichung (Tella, College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts, (1994); Mello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Bd. 254 (1990), S. 926-939; und Kleven et al., Behav. Pharmacol., Bd. 1 (1990), S. 365-373), wobei aber die Abstinenzrate im Anschluss an die Behandlung 70% nicht überstieg (Kosten, Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr., (1993), S. 85). Es gibt auch die Verwendung von Arzneistoffen, die die dopaminerge Übertragung steigern, wie Bromocriptin, jedoch ist der Nutzen derartiger Arzneistoffe teilweise durch ihre Toxizität eingeschränkt (Taylor et al., West. J. Med., Bd. 152 (1990), S. 573-577). Es wurden auch neuartige Arzneistoffe als Ersatz von Methadon bei Opioid-Abhängigkeit, wie Buprenorphin, eingesetzt, die auf einer Wechselwirkung mit dem dopaminergen System beruhen, jedoch sind nur begrenzte Informationen über klinische Untersuchungen verfügbar (Fudula et al., NIDA Research Monograph, Bd. 105 (1991), S. 587-588). Es wurde berichtet, dass Buprenorphin die Selbstverabreichung von Kokain verringert (Carroll et al., Psychopharmacology, Bd. 106 (1991), S. 439-446; Mello et al., Science, Bd. 245 (1989), S. 859-862; und Mello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Bd. 254 (1990), S. 926-939); jedoch übersteigen die Kokain-Abstinenzraten im Anschluss an eine Behandlung im Allgemeinen 50% nicht (Gastfried et al., College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts, (1994); und Schottenfeld et al., Problems on Drug Dependence, NIDA Res. Monogr., Bd. 311 (1993).
  • Derzeitige Therapien, die zur Behandlung von Kokain-Abhängigen herangezogen werden, weisen mindestens 4 hauptsächliche Einschränkungen auf, die Anlass zu einer hohen Rückfallrate sind. Erstens (und möglicherweise am wichtigsten) die Tatsache, dass die den Missbrauch und die Abhängigkeit von Kokain begleitenden neurochemischen Ereignisse sehr komplex sind (Carroll et al., (1994), a. a. O.). Als Folge davon sind neuropharmakologische Wege mit einem einzigen Wirkungsansatz, z. B. einer Hemmung der Dopaminaufnahme, scheinbar nicht ausreichend, um die Abhängigkeit zu überwinden. Zweitens weisen die derzeit bei der Behandlung von Kokain-Abhängigkeit verwendeten Arzneistoffe selbst erhebliche Nebenwirkungen auf, was ihre Verwendungsmöglichkeit begrenzt. Drittens ist die Akzeptanz der Drogentherapie unter dieser Patientengruppe problematisch. Die derzeitigen Therapien erfordern häufige Besuche bei den mit der Gesundheitsfürsorge befassten Stellen und/oder die Selbstverabreichung der Arzneistoffe, die zur Behandlung der Abhängigkeit bestimmt sind. Da zahlreiche dieser Arzneistoffe die mit Kokain verbundene Euphorie verhindern, besteht eine starke Demotivation zur Einnahme des Arzneistoffes (Carroll, et al., (1994), a. a. O.; Kosten et al., Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr., Bd. 132 (1993), S. 85; Schottenfeld et al., Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr., Bd. 132 (1993), S. 311). Viertens sind aufgrund der komplexen Chemie, die bei pharmakologischen Therapien vorliegt, zahlreiche dieser Therapien mit anderen Therapien, die derzeit eingesetzt werden oder sich im klinischen Versuchsstadium befinden, unverträglich.
  • In der Literatur wurden experimentelle diagnostische Wege und Therapien vorgeschlagen, die erst noch in die Praxis umzusetzen sind. Beispielsweise wurde im Prinzip die Impfung als therapeutischer Ansatz bei Arzneistoffabhängigkeit beschrieben. Bonese et al. untersuchten Veränderungen bei der Heroin-Selbstverabreichung durch einen Rhesus-Affen nach Immunisierung gegen Morphin (Bonese et al., Nature, Bd. 252 (1974), S. 708-710). Bagasra et al. untersuchten die Verwendung einer Kokain-KLH-Impfung als Maßnahme zur Verhinderung von Abhängigkeit (Immunopharmacol., Bd. 23 (1992), S. 173-179). Ratten wurden mit einem Kokain-KLH-Konjugat, das einige anti-Kokain-Antikörper hervorrief, immunisiert. Jedoch wird über diese Ergebnisse kontrovers diskutiert (Gallacher, Immunopharm., Bd. 27 (1994), S. 79-81). Offensichtlich muss ein Konjugat, wenn es bei einer therapeutischen Behandlung wirksam sein soll, zur Erzeugung von Antikörpern befähigt sein, die freies Kokain, das in vivo zirkuliert, erkennen. Cerny ( WO-92/03163 ) beschreibt einen Impfstoff und ein Immunserum gegen Drogen. Der Impfstoff besteht aus einem an einen Proteinträger gebundenen Hapten, um Antikörper zu erzeugen. Ferner wird die Erzeugung von Antikörpern gegen Drogen und die Verwendung dieser Antikörper bei der Detoxifikation einer Person, die die Droge eingenommen hat, beschrieben.
  • Eine passive Verabreichung von monoklonalen Antikörpern zur Behandlung von Drogenmissbrauch ist beschrieben worden (vergl. Killian et al., Pharmacol. Biochem. Behavior, Bd. 9 (1978), S. 347-352; Pentel et al., Drug Met. Dispositions, Bd. 19 (1991), S. 24-28). Bei diesem Ansatz werden vorgeformte Antikörper gegen ausgewählte Drogen passiv an Tiere verabreicht. Obgleich diese Daten die Eignung von immunologischen Ansätzen zur Therapie bei Abhängigkeit aufzeigen, leidet eine passive Immunisierung als Langzeitstrategie für die Therapie beim Menschen an einer Reihe von wesentlichen Nachteilen. Erstens werden diese Präparate dann, wenn die für die passive Therapie zu verwendenden Antikörper aus nicht-humanen Quellen stammen oder wenn es sich dabei um monoklonale Antikörper handelt, vom Patienten als Fremdproteine angesehen, so dass es zu einer raschen Immunantwort auf die fremden Antikörper kommen kann. Diese Immunantwort kann den passiv verabreichten Antikörper neutralisieren, dessen Wirksamkeit blockieren und die Zeit für den anschließenden Schutz erheblich verkürzen. Außerdem kann eine erneute Verabreichung des gleichen Antikörpers aufgrund der möglichen Einleitung einer Überempfindlichkeitsreaktion problematisch werden. Diese Schwierigkeiten lassen sich durch Erzeugung von Immun-Immunoglobulin in menschlichen Spender, die mit dem Impfstoff immunisiert worden sind, überwinden. Dieser Weg wird in den Beispielen ausführlicher erörtert. Zweitens werden passiv verabreichte Antikörper relativ rasch aus dem Kreislauf entfernt. Die Halbwertszeit eines vorgegebenen Antikörpers beträgt in vivo 2,5 bis 23 Tage, je nach dem Isotyp. Wenn somit die Antikörper passiv verabreicht werden (anstelle einer Induktion durch Immunisierung), lässt sich nur eine kurzzeitige Wirksamkeit erreichen.
  • Ein weiterer immunologischer Ansatz gegen Arzneistoffabhängigkeit besteht in der Verwendung eines katalytischen Antikörpers, der dazu befähigt ist, die Hydrolyse des Kokain-Moleküls im Patienten zu unterstützen (Landry et al., Science, Bd. 259 (1993), S. 1899-1901). Der katalytische Antikörper wird durch Immunisierung eines Versuchstiers mit einem Übergangszustand-Analogon von Kokain, das an ein Trägerprotein gebunden ist, erzeugt. Anschließend wird ein monoklonaler Antikörper ausgewählt, der die angestrebte katalytische Aktivität besitzt. Obgleich dieser Ansatz theoretisch attraktiv ist, ist er auch mit einigen ernsten Schwierigkeiten behaftet. Katalytische Antikörper müssen passiv verabreicht werden und leiden somit an sämtlichen Nachteilen der Therapie mit passiven Antikörpern. Eine aktive Immunisierung zur Erzeugung eines katalytischen Antikörpers ist nicht durchführbar, da eine enzymatische Aktivität unter Antikörpern gegen Übergangszustand-Analoga selten ist und die Aktivität in polyklonalen Präparaten scheinbar nicht nachweisbar ist. Außerdem machen die im Allgemeinen esterartige Aktivität von derartigen katalytischen Antikörpern und die unkontrollierte Natur der aktiven Immunantwort in genetisch unterschiedlichen Individuen diese Analoga zu potentiell toxischen Molekülen, insbesondere wenn sie in einem menschlichen Patienten erzeugt werden.
  • Yugawa et al. ( EP 0 613 899-A2 ) schlagen die Verwendung eines Kokain-Protein-Konjugats mit einem Kokain-Derivat zur Erzeugung von Antikörpern zum Nachweis von Kokain oder Kokain-Derivaten in einer Blutprobe vor. Die Syva-Patente ( US-3 888 866 , US-4 123 431 und US-4 197 237 ) beschreiben Konjugate zur Erzeugung von Kokain-Antikörpern für Immunoassays. Es werden Konjugate mit BSA unter Verwendung von Diazoniumsalzen, die sich von Benzoylecgonin und Kokain ableiten, offenbart. Die Konjugate werden unter Verwendung von p-Iminoesterderivaten von Kokain and Norkokain zur Konjugation eines Trägers hergestellt. Biosite ( WO-93/12111 ) offenbart Konjugate von Kokain unter Ausnutzung der p-Position des Phenylrings von verschiedenen Kokain-Derivaten unter Erhöhung der Stabilität gegen Hydrolyse durch Einführung einer Amidbindung. Die Strahilevitz-Patente ( US-4 620 977 , US-4 813 924 , US-4 834 973 und US-5 037 645 ) offenbaren die Verwendung von Proteinkonjugaten von endogenen Substanzen und Arzneistoffen zur Behandlung von Krankheiten, wobei die Abhängigkeit von psychoaktiven Haptenen verhindert wird, sowie deren Verwendung in Immunoassays, bei der Immunodialyse und bei der Immunoadsorption.
  • Bisher wurde jedoch noch keine wirksame Therapie für Drogenabhängigkeit, insbesondere für Kokain-Abhängigkeit, entwickelt. Somit besteht ein Bedarf zur Entwicklung einer Langzeittherapie bei Drogenabhängigkeit, insbesondere bei Kokain-Abhängigkeit, die nicht vollständig von der Akzeptanz und der Selbstverabreichung durch die von der Abhängigkeit betroffenen Person abhängt.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Die vorliegende Erfindung überwindet die vorerwähnten Nachteile und stellt Verfahren zur Behandlung von Drogenmissbrauch bereit. Unter Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen, insbesondere von Hapten-Träger-Konjugaten wird erfindungsgemäß eine Immunantwort in Form von Antidrogen-Antikörpern in der abhängigen Person hervorgerufen. Bei einer anschließenden Belastung mit der Droge wird in der geimpften Person die Droge neutralisiert, so dass die erwarteten pharmakologischen Wirkungen verringert, wenn nicht gar beseitigt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein therapeutisches Präparat für Drogenabhängigkeit auf der Grundlage einer Impfung von Personen mit einem Drogen/Hapten-Träger-Konjugat bereit. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines therapeutischen Hapten-Träger-Konjugats bereit, umfassend (a) wenigstens ein von Nikotin abgeleitetes Hapten und (b) einen proteinhaltigen Träger, wobei dieser Träger wenigstens ein T-Zellen-Epitop umfasst und ausgewählt ist aus:
    bakteriellen Produkten, viralen Untereinheiten, Lectinen, Malariaprotein-Antigen, synthetischen multiantigenen Peptiden und Modifikationen, Analoga und Derivaten davon und Proteinallergenen und Derivaten, Fragmenten und Analoga von Allergenen,
    wobei das therapeutische Hapten-Träger-Konjugat dazu in der Lage ist, bei einer Verwendung zur Impfung von Patienten die Produktion von Antinikotin-Antikörpern zu bewirken, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Drogensucht bei einem Menschen.
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen wenigstens ein Hapten und wenigstens einen Träger, der ein T-Zell-Epitop enthält, der bei Konjugation unter Bildung eines Hapten-Träger-Konjugats zur Stimulation der Erzeugung von anti-Hapten-Antikörpern befähigt ist. Beim Hapten kann es sich um eine Droge oder um ein Drogenderivat handeln. Wie beansprucht ist gemäß der Erfindung mindestens ein Hapten von Nicotin abgeleitet. Wenn die therapeutische Zusammensetzung, die das Drogen/Hapten-Träger-Konjugat enthält, einer an Abhängigkeit leidenden Person verabreicht wird, werden anti-Drogen-Antikörper, die spezifisch für die Droge sind, hervorgerufen. Ein therapeutisches Immunisierungsverfahren ruft ausreichend hohe Titer an anti-Drogen-Antikörper hervor und erhält diese in ausreichendem Maße aufrecht, so dass nach jeder anschließenden Belastung mit der Droge während der Schutzdauer, die durch das therapeutische Mittel erreicht wird, anti-Drogen-Antikörper eine ausreichende Menge der Droge neutralisieren, um die pharmakologische Wirkung der Droge zu verringern, wenn nicht ganz zu beseitigen.
  • Diese und weitere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich in deutlicherer und besser verständlicher Weise aus den folgenden Zeichnungen, der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen. Alle sich auf Kokain beziehenden Gegenstände sind lediglich zur Erläuterung angeführt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1a ist eine schematische Darstellung der Strukturformel von Kokain.
  • 1b zeigt schematisch die Variabilitätsstellen bei der Herstellung eines Kokain-Konjugats. Die Variabilitätsstellen sind zur einfachen Bezeichnung der Verbindung und Konjugate und nicht notwendigerweise der Reaktionsstellen willkürlich zugeordnet.
  • 2a ist eine Darstellung einer Anzahl von möglichen, willkürlich markierten "Verzweigungen" eines Hapten-Träger-Konjugats um das Verständnis für in der erfindungsgemäßen Praxis verwendete Verbindungen und Konjugate zu erleichtern.
  • 2b ist eine Darstellung einer Anzahl von möglichen, willkürlich markierten "Verzweigungen" eines Hapten-Träger-Konjugats um das Verständnis von in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten Verbindungen und Konjugaten zu erleichtern, wobei Q' einen ein modifiziertes T-Zell-Epitop enthaltenden Träger, z. B. einen modifizierten Proteinträger, bedeutet.
  • 3a ist eine Darstellung von 6 Kokain-Konjugaten (PS-2, PS-3, PS-4, PS-5, PS-6 und PS-9) der vorliegenden Erfindung, wobei Q einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Träger, z. B. ein Trägerprotein, oder einen ein modifiziertes T-Zell-Epitop enthaltenden Träger, z. B. ein modifiziertes Trägerprotein, bedeutet.
  • 3b ist eine Darstellung von "Verzweigungen" an den Variabilitätsstellen in Entfernung vom Kokain-Tropanring der Kokain-Konjugate und Zwischenprodukte.
  • 4 ist eine Darstellung von "Verzweigungen" an den Variabilitätsstellen in Entfernung des Tropanrings in 1b von 4 Verbindungen, die sich zur Herstellung von Konjugaten eignen.
  • 5 ist eine Darstellung der Strukturen von 5 Reagentien, die in der erfindungsgemäßen Praxis geeignet sind.
  • 6 ist eine Darstellung der Strukturen von 4 alternativen Missbrauchsdrogen, die sich zur Konjugation und Verabreichung eignen.
  • 7 ist eine schematische Darstellung zur Wiedergabe von zwei möglichen Konjugationsreaktionen zur Herstellung eines einzelnen Kokain-Konjugats (PS-5).
  • 8 ist eine Darstellung der Strukturen von "succinyliertem Norkokain" und "präaktiviertem succinyliertem Norkokain".
  • 9a ist ein Diagramm zur Darstellung der IgG-Antikörperreaktion bei mit einem erfindungsgemäßen Kokain-Konjugat (PS-5.1/.6 + CFA i.p.) immunisierten Mäusen. Die Antikörperreaktion wird durch In-vitro-Bindung an das geeignete HEL-Konjugat, das unter Verwendung von HEL anstelle von BSA als Träger hergestellt worden ist, nachgewiesen. Mäuse erhielten 2 Injektionen von 50 g pro Injektion. Die Kurven stellen die Reaktion von 5 einzelnen Mäusen pro Gruppe dar.
  • 9b ist ein Diagramm zur Darstellung der IgG-Antikörperreaktion bei Mäusen, die mit dem erfindungsgemäßen Kokain-Konjugat (PS-5.5 Alaun i.p.) immunisiert worden sind. Die Antikörperreaktion wird durch In-vitro-Bindung an das entsprechende HEL-Konjugat, das unter Verwendung von HEL anstelle von BSA als Träger hergestellt worden ist, nachgewiesen. Die Mäuse erhielten 2 Injektionen mit 50 g pro Injektion. Die Kurven stellen die Reaktion von 5 einzelnen Mäusen pro Gruppe dar.
  • 9c ist ein Diagramm zur Darstellung der IgG-Antikörperreaktion bei Mäusen, die mit dem erfindungsgemäßen Kokain-Konjugat (PS-9.2 + CFA i.p.) immunisiert worden sind. Die Antikörperreaktion wird durch In-vitro-Bindung an das entsprechende HEL-Konjugat, das unter Verwendung von HEL anstelle von BSA als Träger hergestellt worden ist, nachgewiesen. Die Mäuse erhielten 2 Injektionen mit 50 g pro Injektion. Die Kurven stellen die Reaktion von 5 einzelnen Mäusen pro Gruppe dar.
  • 10a ist ein Diagramm, das nachweist, dass die Antiserum-Bindung an ein Kokain-Protein-Konjugat unter Verwendung von freiem Kokain ausgeschaltet werden kann.
  • 10b ist ein Balkendiagramm zum Nachweis, dass Immun-Antiserum 3H-Kokain binden kann.
  • 11a ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung, dass ein nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestelltes Kokain-BSA-Konjugat einen 2-fachen Schutz bei einer hohen Kokain-LD50-Dosis bietet.
  • 11b ist ein weiteres Balkendiagramm, das erläutert, dass ein nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestelltes Kokain-BSA-Konjugat einen 2-fachen Schutz bei einer hohen Kokain-LD50-Dosis bieten kann.
  • 12a zeigt ein Gel zur Erläuterung der relativen Molekulargewichte von nativem (monomerem und pentamerem) und rekombinantem Cholera-Toxin-B (CTB) (Monomer).
  • 12b zeigt ein Gel zur Erläuterung der Stabilität von CTB-Pentameren über einen pH-Bereich von 3-9.
  • 12c zeigt ein Western-Blot-Gel unter Darstellung der Peakfraktionen rCTB#32 und rCTB#53, die durch periplasmatische Expression unter Bildung von pentamerem CTB erhalten worden sind.
  • 13a ist ein Diagramm zur Darstellung eines ELISA-Tests, wobei der anti-CTB-Antikörper die Fähigkeit von rCTB zur Bindung an Gangliosid GM1 auf der ELISA-Platte nachweist.
  • 13b stellt einen fließzytometrischen Bindungstest dar, wobei rCTB an eukaryontische Zellen, die Gangliosid GM1 exprimieren, gebunden ist.
  • 14a ist ein Diagramm zur Darstellung eines ELISA-Tests, wobei natives CTB und das Kokain-CTB-Konjugat CTB-5.8 (an CTB konjugiertes PS-5.8) als pentamer dargestellt sind, beruhend auf ihrer Fähigkeit zur Bindung an Gangliosid GM1.
  • 14b ist ein Diagramm zur Darstellung eines ELISA-Tests, bei dem CTB-5.8 (an CTB konjugiertes PS-5.8) an Gangliosid GM1 gebunden ist und das Konjugat mit einem monoklonalen anti-Kokain (anti-Benzoylecgonin)-Antikörper nachgewiesen wird.
  • 15 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Reaktion, die sich zur Herstellung erfindungsgemäßer Konjugate eignet, insbesondere von 3-Benzoatester-Addukt 4.
  • 16 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines 13C-markierten Konjugats.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die hier zitierten Patentschriften und wissenschaftlichen Arbeiten umfassen die Kenntnisse, die dem Fachmann zur Verfügung stehen.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet ein therapeutisches Mittel für Drogenabhängigkeit, das auf der Impfung einer von der Abhängigkeit betroffenen Person mit einem Drogen-Hapten-Träger-Konjugat beruht. Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen umfassen mindestens ein Hapten und mindestens einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Träger, der bei Konjugation unter Bildung eines Hapten-Träger-Konjugats dazu befähigt ist, die Erzeugung von anti-Hapten-Antikörpern zu stimulieren. Der hier verwendete Ausdruck "T-Zell-Epitop" bezieht sich auf das Grundelement oder die kleinste Erkennungseinheit durch einen T-Zell-Rezeptor, wobei das Epitop für die Rezeptorerkennung unerlässliche Aminosäuren umfasst. Aminosäuresequenzen, die die Aminosäuren der T-Zell- Epitope nachahmen und die die allergische Reaktion auf Protein-Allergene modifizieren, fallen unter den Umfang der Erfindung. Ein "Peptidomemetikum" lässt sich als chemische Strukturen definieren, die von bioaktiven Peptiden, die natürliche Moleküle nachahmen, abgeleitet sind. Beim Hapten kann es sich um eine Droge oder um ein Drogenderivat handeln. Wie beansprucht ist gemäß der Erfindung mindestens ein Hapten von Nicotin abgeleitet. Wenn die therapeutische Zusammensetzung, die das Hapten/Droge (oder ein Derivat davon) enthält, der von der Abhängigkeit betroffenen Person verabreicht wird, werden für die Droge spezifische anti-Drogen-Antikörper hervorgerufen. Eine therapeutische Immunisierungsbehandlung ruft ausreichend hohe Titer an anti-Drogen-Antikörper hervor und hält diese in ausreichendem Maße aufrecht, so dass bei einer anschließenden Belastung mit der Droge neutralisierende Antikörper an eine ausreichende Menge der Droge gebunden werden, um die pharmakologischen Wirkungen der Droge zu verringern, wenn nicht ganz zu beseitigen. Von der Verabreichung des erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels sind keine Nebenwirkungen zu erwarten. Zum Beispiel ist die Missbrauchsdroge klein und einwertig und somit nicht zur Vernetzung mit dem Antikörper befähigt. Daher sind die Bildung von Immunkomplexen und die damit verbundenen pathologischen Erscheinungen nach einer Belastung mit der Missbrauchsdroge nicht zu erwarten. Das therapeutische Mittel ist derzeit (und erwartungsgemäß auch in Zukunft) mit gegenwärtigen und zukünftigen pharmakologischen Therapien verträglich. Ferner hält die wirksame Neutralisation für eine lange Zeitspanne an. Beispielsweise ist es bekannt, dass neutralisierende Antikörper-Reaktionen gegen Pathogene über Jahre andauern. Demzufolge ist zu erwarten, dass der durch Verwendung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung hervorgerufene hohe Titer von anti-Drogen-Antikörpern über lange Zeiträume hinweg und möglicherweise für mindestens 1 Jahr aufrechterhalten werden kann. Diese Langzeitwirkung der therapeutischen Zusammensetzung mit verminderten Akzeptanzproblemen führt zu einer Verringerung von Rezidiven, die bei derzeitigen Therapien ein Problem darstellen.
  • Nachstehend werden verschiedene Ausdrücke definiert, um die Ausführungen leichter verständlich zu machen. Der Ausdruck "Hapten" bedeutet hier eine niedermolekulare organische Verbindung, die spezifisch mit einem Antikörper reagiert und die selbst nicht zur Herbeiführung einer Immunantwort befähigt ist, jedoch immunogen ist, wenn sie mit einem ein T-Zell-Epitop enthaltenden Träger unter Bildung eines Hapten-Träger-Konjugats komplexiert wird. Ferner ist das Hapten als der die Spezifität bestimmende Bereich des Hapten-Träger-Konjugats charakterisiert, d.h., ist zur Umsetzung mit einem für das Hapten im freien Zustand spezifischen Antikörper befähigt. Bei einer nicht-immunisierten, abhängigen Person kommt es nicht zur Bildung von Antikörpern gegen das Hapten. Die therapeutische Zusammensetzung wird dazu herangezogen, Personen, die eine Behandlung gegen Drogenabhängigkeit anstreben, zu impfen. Erfindungsgemäß soll der Ausdruck "Hapten" das Konzept eines spezifischeren Drogen/Haptens umfassen, bei dem es sich um eine Droge, ein Analogon eines Teils der Droge oder um ein Drogenderivat handelt. Die therapeutische Zusammensetzung oder der therapeutische anti-Drogen-Impfstoff führt bei anfänglicher Verabreichung zur Entwicklung eines "angestrebten messbaren Ergebnisses". Zunächst handelt es sich bei dem angestrebten messbaren Ergebnis um die Bildung eines hohen Titers von anti-Drogen-Antikörpern (etwa 0,1 mg/ml bis 1 mg/ml spezifischer Antikörper im Serum). Jedoch ergibt die Manipulation der für die Person geeigneten Dosierung eine anhaltende gewünschte therapeutische Wirkung, die aufrechterhalten wird. Die "gewünschte therapeutische Wirkung" besteht in der Neutralisation eines ausreichenden Teils der freien Missbrauchsdroge, um die pharmakologischen Wirkungen der Droge innerhalb eines therapeutisch annehmbaren Zeitrahmens durch für die Droge spezifische anti-Drogen-Antikörper bei einer anschließenden Belastung mit der Droge zu verringern oder zu beseitigen. Die Bestimmung der therapeutisch annehmbaren Zeitrahmen, d. h. wie lange es zur Erzielung einer ausreichenden Antikörper-Reaktion dauert und wie lange diese Antikörper-Reaktion aufrechterhalten wird, und die Bestimmung der ausreichenden Fraktion der freien Droge werden vom Fachmann vorgenommen, indem die Charakteristika der zu immunisierenden Person, der zu neutralisierenden Missbrauchsdroge sowie der Verabreichungsweg ermittelt werden. Unter Verwendung dieser und anderer Impfungsverfahren als Modell lässt sich für den Fachmann eine Immunität oder Schutzdauer von mehreren Monaten bis zu mehr als 1 Jahr erwarten.
  • "Passive Immunisierung" umfasst die Verabreichung von intakten anti-Drogen-Antikörpern oder polyklonalen Antikörpern oder monoklonalen Antikörperfragmenten (z. B. Fab, Fv, (Fab')2 oder Fab'), die unter Verwendung der erfindungsgemäßen neuartigen Konjugate hergestellt worden sind, oder die Belastung mit diesen Produkten. Wie vorstehend erwähnt, kann eine passive Immunisierung von Menschen mit einem anti-Kokain-Antikörper als isolierte Behandlung weniger geeignet sein als eine aktive Immunisierung. Eine passive Immunisierung würde sich als besonders wertvoll als anfängliche begleitende Behandlung und/oder ergänzende Behandlung erweisen (z. B. während der Zeitspanne nach der anfänglichen Verabreichung des Impfstoffes, jedoch vor Bildung von eigenen Antikörpern durch den Körper) oder in akuten Situationen, um Todesfälle zu verhindern (z. B. bei Personen mit einer Drogenüberdosis). In einigen Situationen kann eine alleinige passive Therapie vorzuziehen sein, z. B. wenn der Patient immunologisch beeinträchtigt ist oder einer raschen Behandlung bedarf.
  • Bei der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung und insbesondere beim therapeutischen anti-Drogen-Impfstoff handelt es sich um eine Zusammensetzung, die mindestens ein Drogen/Hapten-Träger-Konjugat enthält, das dazu befähigt ist, die Bildung eines ausreichend hohen Titers an Antikörpern, die für das Drogen/Hapten spezifisch sind, hervorzurufen, so dass bei anschließender Belastung mit der Droge des Drogen/Haptens diese Antikörper dazu befähigt sind, die abhängig machenden Eigenschaften der Droge zu verringern. Die erwartete Immunantwort auf ein Hapten-Träger-Konjugat besteht in der Bildung sowohl von anti-Hapten- als auch von anti-Träger-Antikörpern. Die therapeutische Konzentration ist erreicht, wenn eine ausreichende Menge der spezifischen anti-Drogen-Antikörper hervorgerufen worden ist und aufrechterhalten wird, um eine Neutralisationsattacke auf die nach der Impfung zugeführte Droge zu erreichen. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Maßnahmen bieten eine ausreichende Zeitspanne zur Erzeugung von Antikörpern nach der anfänglichen Impfung und etwaigen Auffrischungen. Ferner enthält der optimale anti-Drogen-Impfstoff mindestens ein Drogen/Hapten-Träger-Konjugat, das eine optimale Kombination der Droge als Hapten und eines Trägers umfasst, so dass die Bildung von anti-Drogen-Antikörpern dazu befähigt ist, eine optimale therapeutische Konzentration zu erreichen, d. h. in vivo mit einem ausreichend hohen Titer aufrechterhalten zu werden, um einer anschließenden Belastung mit der gewählten Droge innerhalb mehrerer Monate standzuhalten. Insbesondere bleiben die Antikörper-Titer ausreichend hoch, um eine wirksame Reaktion auf eine anschließende Belastung mit der Droge für einen Zeitraum von etwa 2 Monaten bis etwa 1 Jahr oder mehr, je nach der einzelnen Person, und üblicherweise von mindestens 3 Monaten bereitzustellen. Diese optimale Zusammensetzung besteht aus einem Hapten-Träger-Konjugat, Vehikeln und gegebenenfalls Hilfsstoffen.
  • Die anfängliche Impfung mit der erfindungsgemäßen therapeutischen Hapten-Träger-Konjugat-Zusammensetzung erzeugt in vivo hohe Titer von haptenspezifischen Antikörpern. Periodische Tests des Plasmas der geimpften Subjekte eignen sich zur Bestimmung der individuellen wirksamen Dosen. Die Titerwerte werden durch periodisches Auffrischen erhöht und aufrechterhalten. Es ist vorgesehen, dass diese therapeutische Maßnahme in Kombination mit laufenden Drogen-Rehabilitationsprogrammen, einschließlich Beratung, durchgeführt wird. Ferner können die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen auf eine einzige Droge oder gleichzeitig oder nacheinander auf mehrere Drogen abzielen und in Kombination mit anderen Therapien herangezogen werden. Beispielsweise werden die therapeutischen Hapten-Träger-Konjugat-Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung ohne nachteilige Wechselwirkungen in Kombination mit herkömmlichen pharmakologischen Vorgehensweisen und der vorstehend erörterten "kurzzeitigen" passiven Immunisierung und einer möglichen aktiven Immunisierung gegen Übergangszustände eingesetzt, um die Gesamtwirkung der Therapie zu verstärken.
  • Die erfindungsgemäße therapeutische Hapten-Träger-Konjugat-Zusammensetzung wird hergestellt, indem man ein oder mehr Hapten-Moleküle an einen proteinhaltigen Träger, der ein T-Zell-Epitop umfasst, kuppelt, wodurch man ein Hapten-Träger-Konjugat erhält, das zur Stimulation von T-Zellen befähigt ist (immunogen), wodurch es zur Vermehrung von T-Zellen und zu einer charakteristischen Freisetzung von Mediatoren kommt, die entsprechende B-Zellen aktivieren und die Bildung von spezifischen Antikörpern stimulieren. Bei Antikörpern von Interesse handelt es sich um Antikörper, die für den Haptenteil des Hapten-Träger-Konjugats (auch als Hapten-Träger-Komplex bezeichnet) spezifisch sind. Therapeutische Zusammensetzungen, die eine Kombination von Konjugaten (entweder der gleichen Droge (Kreuzimmunisierung) oder mehrerer Drogen (Coimmunisierung)) enthalten, werden offenbart. Derartige Cogemische von Konjugaten von mehreren Drogen eignen sich insbesondere bei der Behandlung von Mehrfachdrogen-Missbrauch.
  • Bei der Wahl einer für die Konjugation geeigneten Droge würde der Fachmann eine Droge auswählen, deren Eigenschaften es wahrscheinlich machen, dass hohe Antikörper-Titer hervorgerufen werden. Wenn jedoch das ausgewählte Molekül eine Ähnlichkeit zu den Molekülen aufweist, die im Individuum endogen sind, gehen Antikörper, die gegen ein derartiges Molekül erzeugt werden, eine Kreuzreaktion mit zahlreichen verschiedenen Molekülen im Körper ein, was zu einer unerwünschten Wirkung führt. Somit muss die als Hapten auszuwählende Droge (Droge/Hapten) einen ausreichenden Fremdheitsgrad und eine ausreichende Größe aufweisen, um die Erzeugung von Antikörpern gegen Moleküle, die üblicherweise innerhalb des menschlichen Körpers auftreten, zu vermeiden. Aus diesen Gründen würde sich beispielsweise Alkohol nicht für die therapeutischen Maßnahmen der vorliegenden Erfindung eignen. Die gegen die therapeutische Zusammensetzung erzeugten Antikörper sind hochspezifisch und liegen in einer ausreichenden Menge vor, um die Droge entweder im Blutkreislauf und/oder in den Schleimhäuten zu neutralisieren. Nachstehend sind die Arzneistoffe aufgeführt, die sich für die therapeutische Zusammensetzung eignen (nicht in der Reihenfolge ihrer Wichtigkeit):
    • Halluzinogene, z. B. Mescalin und LSD;
    • Cannabinoide, z. B. THC;
    • Stimulantien, z. B. Amphetamine, Kokain, Phenmetrazin,
    • Methylphenidat;
    • Nicotin;
    • Beruhigungsmittel, z. B. Nichtbarbiturate (wie Bromide, Chloralhydrat und dergl.), Methaqualon, Barbiturate, Diazepam, Flurazepam, Phencyclidin und Fluoxetin;
    • Opium und dessen Derivate, z. B. Heroin, Methadon, Morphin, Meperidin, Codein, Pentazocin und Propoxyphen; und
    • "Designer Drogen", wie "Ecstasy".
  • 6 zeigt die Struktur von vier Drogen, die sich für die Konjugation eignen. Wie beansprucht ist gemäß der Erfindung mindestens ein Hapten von Nicotin abgeleitet.
  • Beim erfindungsgemäßen Träger handelt es sich um ein Molekül, das mindestens ein T-Zell-Epitop enthält, das dazu befähigt ist, die T-Zellen des Subjekts zu stimulieren, was wiederum dazu beiträgt, in B-Zellen die andauernde Bildung von Antikörpern gegen Bereiche des gesamten Konjugats, einschließlich des Haptenbereiches, einzuleiten und aufrechtzuerhalten. Da somit ein Träger aufgrund seiner immunogenen Beschaffenheit ausgewählt wird, ist eine starke Immunantwort auf den Impfstoff in einer unterschiedlichen Patientenpopulation zu erwarten. Der Träger muss gleichermaßen wie das Hapten einen ausreichenden Fremdheitsgrad aufweisen, um eine starke Immunantwort gegen den Impfstoff hervorzurufen und die Erscheinung einer durch den Träger induzierten Epitop-Unterdrückung zu vermeiden. Ein konservativer, jedoch nicht wesentlicher Ansatz besteht in der Verwendung eines Trägers, dem die meisten Patienten noch nicht ausgesetzt waren. Selbst wenn es jedoch zu einer trägerinduzierten Epitop-Unterdrückung kommt, ist diese beherrschbar, da sie durch Dosisänderungen (DiJohn et al., Lancet, (1989), S. 1415-1418) und andere Verfahrensänderungen (Etlinger et al., Science, Bd. 249 (1990), S. 423-425), einschließlich der Verwendung von CTB (Stok et al., Vaccine, Bd. 12 (1994), S. 521-526) überwunden worden ist. Außerdem eignen sich Träger mit einer großen Anzahl an Lysinresten insbesondere für die Konjugation gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Es gibt zahlreiche geeignete TrägerMoleküle. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf):
    • Bakterielle Toxine oder Produkte, z. B. Cholera-Toxin B (CTB), Diphtherie-Toxin, Tetanus-Toxoid und Keuch-husten-Toxin und filamentöses Hämagglutinin, Shiga-Toxin, Pseudomonas-Exotoxin;
    • Lectine, wie Ricin-B-Untereinheit, Abrin und Süßerbsen-Lectin;
    • Subvirale Bestandteile, z. B. Retrovirus-Nucleoprotein (Retro NP), Tollwut-Ribonucleoprotein (Tollwut-RNP), Pflanzenviren (z. B. TMV, Langbohnen- und Blumenkohl-Mosaikviren), vesikuläres Stomatitis-Virus-Nucleocapsidprotein (VSV-N), Pockenvirus-Vektoren und Semliki-Forest-Virus-Vektoren;
    • Künstliche Träger, z. B. multiantigene Peptide (MAP), Mikrokügelchen;
    • hefevirusartige Teilchen (VLPs);
    • Malariaprotein-Antigen;
    sowie andere, wie z.B. Proteine und Peptide sowie beliebige Modifikationen, Derivate oder Analoga der vorstehend aufgeführten Materialien.
  • Zur Bestimmung der Eigenschaften von geeigneten Trägern wurden anfängliche Experimente unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Proteinträger durchgeführt. Das Protein erwies sich als ideal für Tierversuche, da es billig ist und eine große Anzahl an Lysinresten für die Konjugation enthält. Es eignet sich jedoch weniger gut für die Impfung des Menschen, da die Erzeugung von anti-BSA-Antikörpern möglicherweise zu nachteiligen Reaktionen führt. Somit wurden unter Berücksichtigung der Ergebnisse dieser Experimente die vorstehend beschriebenen Kriterien auf eine große Anzahl von als Kandidaten in Frage kommenden Trägern angewandt. Das Ergebnis hiervon ist die vorstehende Liste von Trägern, die sich für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen.
  • Beim Träger einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Protein oder um ein verzweigtes Peptid (z. B. multiantigene Peptide (MAP)) oder ein einkettiges Peptid. Ein idealer Träger ist ein Protein oder Peptid, das für Impfungen in dem Land, in dem die Therapie eingesetzt wird, nicht gebräuchlich ist, wodurch die Möglichkeit einer "trägerinduzierten Epitop-Unterdrückung" vermieden wird. Beispielsweise kann in den USA, wo die übliche Kinderimpfung Diphtherie und Tetanus einschließt, die Verwendung von Proteinen, wie Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid in unmodifizierter Form als entsprechende Träger weniger wünschenswert sein. Außerdem soll es sich beim Trägerprotein nicht um ein Protein handeln, gegenüber dem eine Toleranz besteht. Beim Menschen würde dies die Verwendung von unmodifiziertem Humanserumalbumin ausschließen. Ferner müssten zahlreiche Nahrungsmittelproteine vor der Verwendung als Träger einem sorgfältigen Screening zu unterworfen werden. Auch hier wäre beim Menschen Rinderserumalbumin als Träger weniger wünschenswert, was darauf zurückzuführen ist, dass Rindfleisch bei den meisten Menschen einen Nahrungsbestandteil darstellt. Ferner ist es in hohem Maße erwünscht, dass der Träger eine naturgegebene immunogene/adjuvative Beschaffenheit aufweist. Ein empfindliches Gleichgewicht zwischen dem Wunsch nach einer immunogenen Beschaffenheit des Trägers und dem Wunsch, einen optimalen anti-Hapten-Antikörper zu erzielen, muss eingehalten werden. Ferner wäre der bevorzugte Träger sowohl zu einer systemischen Reaktion als auch zu einer Reaktion an der Einwirkungsstelle befähigt. Dies gilt insbesondere für Kokain, das häufiger über Schleimhäute verabreicht wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist insbesondere dann kritisch, wenn Kokain geraucht wurde. Demzufolge ruft im Fall von Kokain ein bevorzugter Träger nicht nur eine systemische Reaktion, sondern auch eine vorher auftretende Schleimhaut-Antikörperreaktion hervor. Bei einer derartigen Schleimhautreaktion würde die Reaktion der Antikörper mit Kokain ausreichend rasch erfolgen, um der Droge entgegenzuwirken, bevor sie allmählich in den Blutkreislauf gelangt.
  • Ein derartiger idealer Träger, nämlich Cholera-Toxin B (CTB), stellt eine hochgradig immunogene Protein-Untereinheit dar, die zur Stimulation von starken systemischen und mukosalen Antikörper-Reaktionen befähigt ist (Lycke, J. Immunol., Bd. 150 (1992), S. 4810-4821; Holmgren et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 50 (1994), S. 42-54; Silbart et al., J. Immun. Meth., Bd. 109 (1988), S. 103-112; Katz et al., Infection Immun., Bd. 61 (1993), S. 1964-1971). Diese kombinierte IgA- and IgG-anti-Hapten-Reaktion ist beim Blockieren von Kokain hochgradig erwünscht, da es nasal oder durch Inhalation verabreicht wird. Ferner wurde für CTB in klinischen Versuchen für Cholera-Impfstoffe bereits gezeigt, dass es für die Anwendung beim Menschen sicher ist (Holmgren et al., a. a. O.; Jertborn et al., Vaccine, Bd. 12 (1994), S. 1078-1082; "The Jordan Report, Accelerated Development of Vaccines", NIAID (1993)). Ferner sind die meisten Kokain-Abhängigen in den USA nicht mit Cholera belastet gewesen und somit nicht gegenüber CTB bereits immun.
  • Zu weiteren geeigneten Trägern gehören solche mit der Fähigkeit zur Verstärkung einer Schleimhautreaktion, insbesondere die LTB-Familie von bakteriellen Toxinen, Retrovirus-Nucleoprotein (Retro NP), Tollwut-Ribonucleoprotein (Tollwut-RNP), vesikuläres Stomatitis-Virus-Nucleocapsidprotein (VSV-N), rekombinante Pockenvirus-Untereinheiten und multiantigene Peptide (MAP).
  • In einer weiteren Ausführungsform werden verschiedene Proteine, Derivate, Peptide, Fragmente oder Analoga von Allergenen als Träger verwendet. Diese Träger werden gewählt, da sie eine T-Zell-Reaktion hervorrufen, die dazu befähigt ist, für eine Unterstützung der B-Zell-Initiierung in Bezug auf anti-Hapten-Antikörper zu sorgen. Beispiele für Allergen-Proteine und -Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Sequenzen sind in WO-95/27786 (Veröffentlichungstag 19. Oktober 1995) beschrieben.
  • Unter Anwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und insbesondere unter Anwendung der in den nachstehenden Beispielen dargelegten Techniken verbindet der Fachmann die ausgewählte Droge/Hapten mit dem ausgewählten Träger unter Bildung des erfindungsgemäßen Hapten-Träger-Konjugats. Ein Allergen, das sich besonders gut als Träger eignet, ist Cryptomeria japonica, insbesondere rekombinantes Cry j 1, dessen Sequenz mit leichten Variationen veröffentlicht worden ist. In Ländern außerhalb Japans ist Cryptomeria japonica nicht weit verbreitet. Daher erfüllt Cry j 1-Allergen im Allgemeinen eines der Kriterien eines geeigneten Trägers, d. h. eines Trägers, dem ein Subjekt vorher noch nicht ausgesetzt war.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wirken die durch die therapeutische Zusammensetzung induzierten Antikörper innerhalb der Zeitspanne, die die Droge zur Wanderung von der Lunge durch das Herz in. das Hirn benötigt. Die Fähigkeit zur Hervorrufung dieser Antikörper-Reaktion erfordert die sorgfältige Auswahl des TrägerMoleküls.
  • Rekombinante Herstellung der B-Untereinheit von Cholera-Toxin
  • Cholera-Toxin ist das von Vibrio cholerae erzeugte Enterotoxin und besteht aus fünf identischen B-Untereinheiten, wobei jede Untereinheit ein Molekulargewicht von 11,6 KDa (103 Aminosäuren) aufweist, und einer A-Untereinheit von 27,2 KDa (230 Aminosäuren) (Finkelstein, Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path., (1988), S. 85-102). Die bindende Untereinheit, CTB, bindet an Gangliosid GM1, an der Zelloberfläche (Sixma et al., Nature, Bd. 351 (1991), S. 371-375; Orlandi et al., J. Biol. Chem., Bd. 268 (1993), S. 17038-17044). CTA ist die enzymatische Untereinheit, die in die Zelle eintritt und die ADP-Ribosylierung eines G-Proteins katalysiert und dadurch Adenylat-cyclase aktiviert (Finkelstein, Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path., (1988), S. 85-102). Bei Abwesenheit der A-Untereinheit ist das Cholera-Toxin nicht toxisch.
  • Andere Autoren offenbaren die hochgradige rekombinante Expression von CTB-Pentameren (L'hoir et al., Gene, Bd. 89 (1990), S. 47-52; Slos et al., Protein Exp. Purif., Bd. 5 (1994), S. 518-526). Natives CTB ist zwar im Handel erhältlich, ist aber häufig mit (etwa 0,1%) CTA verunreinigt. Daher wurde rekombinantes CTB in E. coli exprimiert, und es wurden Tests für seine Charakterisierung entwickelt. Das choleragenoide Konstrukt wurde von der American Type Culture Collection bezogen (gemäß US-Patent 4 666 837 ). Rekombinantes CTB wurde aus dem ursprünglichen Vektor (pRIT10810) in ein Expressionsplasmid (pET11d, Novagen) mit einer zusätzlichen N-terminalen Sequenz mit einem His6-Tag kloniert und in E. coli in einer Konzentration von 25 mg/Liter Kultur exprimiert. Das Protein wurde nach üblichen Techniken an einer Ni2+-Säule gereinigt und an SDS-PAGE analysiert (vergl. 12a, b und c). Das rekombinante CTB ist in diesem Test monomer und größer als das native CTB-Monomer, was auf die N-terminale Verlängerung zurückzuführen ist.
  • Pentameres rekombinantes CTB wurde sowohl mit als auch ohne His-Tag unter Verwendung der durch PCR so modifizierten cDNA, dass sie die Pel b-Leadersequenz enthielt, erzeugt. Ein C-terminales Stoppcodon wurde zur Entfernung des His-Tags inseriert. Beide Konstrukte wurden in E. coli aus dem pET22b-Vektor (Novagen) exprimiert. Das mit His markierte Protein wurde durch Ni2+-Affinitätschromatographie auf die vorstehend angegebene Weise gereinigt (13 mg/Liter). Das unmarkierte rekombinante CTB wurde durch Gangliosid GM1-Säulenaffinitätschromatographie gemäß den Angaben von Tayot et al. (Eur. J. Biochem., Bd. 113 (1981), S. 249-258) gereinigt. Von rekombinantem CTB-Pentamer wurde gezeigt, dass es in einem ELISA-Test an Gangliosid GM1, bindet und mit pentamerspezifischen Antikörpern in Western-Blots und ELISA-Tests reagiert.
  • Rekombinantes CTB ist auch aus anderen Quellen erhältlich.
  • Die pentamere Struktur von CTB kann für die Bindung an Gangliosid-GM1 bevorzugt werden. Das Pentamer ist gegenüber SDS stabil, so lange die Proben nicht gekocht werden, so dass es möglich ist, die Pentamerisierung durch SDS-PAGE zu bestimmen. Das Gel in 12a zeigt, dass es sich beim nativen CTB um ein Pentamer handelt, das leicht von dem denaturierten monomeren CTB unterscheidbar ist. Die pentamere Struktur wird über einen pH-Bereich von 4 bis 9 aufrechterhalten (vergl. 12b), was verschiedene chemische Konjugationsreaktionen erleichtert. Das ursprünglich exprimierte rekombinante CTB ist monomer. Ein Weg, um pentameres CTB zu erhalten, besteht in der Vornahme von Anpassungen, um in geeigneter Weise gefaltetes pentameres CTB zu exprimieren. Es wurde festgestellt, dass eine zytoplasmatische Expression wesentlich höhere Konzentrationen an monomerem CTB liefert. Der Fachmann kennt Verfahren zur Faltung von monomerem CTB zu pentamerem CTB (vergl. z. B. L'hoir et al., Gene, Bd. 89 (1990), S. 47-52). Eine Alternative zum erneuten Falten von monomerem CTB zum Erhalt von pentamerem CTB besteht in der periplasmatischen Expression, die zu pentamerem rekombinantem CTB führt, das im ELISA-Test zur Bindung von GM1-Gangliosid befähigt ist; 13a und 13b zeigen Daten, die diesen Befund stützen. Der Fachmann kann verschiedene Ansätze finden, die zum Erhalt von pentamerem rekombinantem CTB beschrieben worden sind, einschließlich die periplasmatische Expression mit einem Leader (Slos et al., a. a. O.; Sandez et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., Bd. 86 (1989), S. 481-485; Lebens et al., BioTechnol., Bd. 11 (1993), S. 1574-1578) oder eine posttranslationale erneute Faltung (L'hoir et al., a. a. O.; Jobling et al., Mol. Microbiol., Bd. 5 (1991), S. 1755-1767).
  • Ein weiterer wertvoller Träger ist Cholera-Toxin, das gegenüber CTB eine verbesserte Schleimhautreaktion ergibt. Es wurde berichtet, dass das enzymatisch aktive A-Untereinheit-Adjuvans die Aktivität verstärkt (Liang et al., J. Immunol., Bd. 141 (1988), S. 1495-1501; Wilson et al., Vaccine, Bd. 11 (1993), S. 113-118; Snider et al., J. Immunol., Bd. 153 (1994), S. 647).
  • Ein Aspekt zum Erhalt des erfindungsgemäßen Konjugats beinhaltet die Modifikation des Haptens in ausreichender Weise, um es zur Konjugation oder Verbindung mit einem Träger zu befähigen, wobei seine Struktur in ausreichender Weise aufrechterhalten wird, so dass es als Hapten im freien Zustand (z. B. als freies Kokain) erkannt wird. Es ist wesentlich, dass geimpfte Personen Antikörper aufweisen, die freies Hapten (Kokain) erkennen. Radioimmunoassays und kompetitive ELISA-Tests (10a und 10b), die in den Beispielen ausführlicher erläutert sind, sind dazu in der Lage, die Antikörper-Titer gegenüber freiem Hapten zu messen. Bei Antikörpern von Interesse handelt es sich um haptenspezifische Antikörper und bei einigen Ausführungsformen um kokainspezifische Antikörper. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Prinzipien und Verfahren, die zur Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen herangezogen werden, von dieser Offenbarung auf einen weiten Bereich von Hapten-Träger-Konjugaten ausgedehnt werden können, die sich zur Behandlung einer Vielzahl von Drogenabhängigkeiten und toxischen Reaktionen eignen.
  • Konjugate
  • Die Herstellung von Kokain-Träger-Konjugaten geht von Kokain und Kokain-Metaboliten aus, vorwiegend von Derivaten von Norkokain, Benzoylecgonin und Ecgoninmethylester. 4 zeigt eine Darstellung des Kokain-Moleküls im Vergleich zu den genannten Molekülen. Im Fall von Norkokain und Ecgoninmethylester sind die funktionellen sekundären Amin- bzw. sekundären Alkoholgruppen, die in den beiden Verbindungen jeweils vorliegen, so modifiziert, dass sich eine chemische Verknüpfung, die eine Haftung an einen Protein-Träger ermöglicht, ergibt. Im Fall von Benzoylecgonin wird die freie Säure entweder direkt zur Haftung an einem Trägerprotein verwendet oder mit einer Verknüpfung, um die Haftung zu erleichtern, modifiziert. Die Länge und die Art der Verknüpfung ist so beschaffen, dass das Hapten in einem ausreichenden Abstand von der Trägerdomäne angeordnet ist, um seine optimale Erkennung durch die ursprünglich gegen das Hapten erzeugten Antikörper zu ermöglichen. Die Länge des Linkers wird optimiert, indem man die Anzahl der -CH2-Gruppen variiert, die strategisch innerhalb einer "Verzweigung", die aus folgender Gruppe ausgewählt ist, angeordnet sind:
    CJ 0 Q
    CJ 1 (CH2)nQ
    CJ 1.1 CO2Q
    CJ 1.2 COQ
    CJ 2 OCO(CH2)n,Q
    CJ 2.1 OCOCH=Q
    CJ 2.2 OCOCH(O)CH2
    CJ 2.3 OCO(CH2)nCH(O)CH2
    CJ 3 CO(CH2)nCOQ
    CJ 3.1 CO(CH2)nCNQ
    CJ 4 OCO(CH2)nCOQ
    CJ 4.1 OCO(CH2)nCNQ
    CJ 5 CH2OCO(CH2)nCOQ
    CJ 5.1 CH2OCO(CH2)nCNQ
    CJ 6 CONH(CH2)nQ
    CJ 7 Y(CH2)nQ
    CJ 7.1 CH2Y(CH2)nQ
    CJ 8 OCOCH(OH)CH2Q
    CJ 8.1 OCO(CH2)nCH(OH)CH2Q
    CJ 9 OCOC6H5
    CJ 10 dargestellt in Fig. 2b
    und in den 2a und 2b dargestellt sind. In den vorstehenden Verzweigungen bedeutet n eine ganze Zahl, die vorzugsweise einen Wert von etwa 3 bis etwa 20 und insbesondere von etwa 3 bis etwa 6 aufweist. Y wird vorzugsweise aus der Gruppe S, O und NH ausgewählt. Q wird vorzugsweise aus folgender Gruppe ausgewählt:
    • (1) -H
    • (2) -OH
    • (3) -CH2
    • (4) -CH3
    • (4a) -OCH3
    • (5) -COOH
    • (6) Halogen
    • (7) Protein- oder Peptid-Träger
    • (8) modifizierter Protein- oder Peptid-Träger
    • (9) aktivierte Ester, wie 2-Nitro-4-sulfophenylester und N-Oxysuccinimidylester
    • (10) Gruppen, die gegenüber Trägern oder modifizierten Trägern reaktiv sind, wie gemischte Anhydride, Acylhalogenide, Acylazide, Alkylhalogenide, N-Maleinimide, Iminoester, Isocyanat, Isothiocyanat oder
    • (11) eine weitere "Verzweigung", die durch ihre "CJ"-Referenznummer identifiziert ist.
  • Der erfindungsgemäße Träger, der das T-Zell-Epitop enthält (z. B. ein Protein- oder Peptid-Träger) kann nach dem Fachmann geläufigen Verfahren modifiziert werden, um die Konjugation an das Hapten zu erleichtern, z. B. durch Thiolisierung, z. B. mit 2-Iminothiolan (Traut-Reagens), oder durch Succinylierung und dergl. Der Einfachheit halber kann (CH2)nQ, wobei Q H bedeutet, als (CH3), Methyl oder Me bezeichnet werden; es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass diese Gruppe in das Motiv gemäß den in den 2a und b identifizierten "Verzweigungen" passt.
  • Weitere Abkürzungen für handelsübliche Verbindungen, die hier verwendet werden, sind nachstehend aufgeführt:
    • BSA
    = Rinderserumalbumin
    DCC
    = Dicyclohexylcarbodiimid
    DMF
    = N,N-Dimethylformamid
    EDC (oder EDAC)
    = N-Ethyl-N'-(3-(dimethylamino)-propyl)-carbordiimid-hydrochlorid
    EDTA
    = Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz
    HATU
    = O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    NMM
    = N-Methylmorpholin
    HBTU
    = 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    TNTU
    = 2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat
    PyBroP®
    = Brom-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluorphosphat
    HOBt
    = N-Hydroxybenzotriazol
  • Ferner wird nachstehend für einige Verbindungen die IUPAC-Nomenklatur angegeben.
  • Norkokain
    • 3-(Benzoyloxy)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäure-methylester
  • Benzoylecgonin
    • 3-(Benzoyloxy)-8-methyl- 8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäure
  • Kokain
    • 3-(Benzoyloxy)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäuremethylester
  • Ecgoninmethylester
    • 3-(Hydroxy)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäuremethylester
  • Der Haptenisierungsgrad lässt sich durch UV-Absorption oder durch Laufzeit-Massenspektralanalyse ((TOF)-Massenspektralanalyse) bestimmen. Tabelle 2 zeigt, dass eine Haptenisierung unter Verwendung verschiedener Konjugate (einige mit CTB als Träger), die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden waren, erreicht wurde. Verschiedene Ansätze werden durch Zusatz eines Dezimalpunkts und einer anschließenden Ziffer bezeichnet, z. B. wird der Ansatz 6 von PS-5 als PS-5.6 bezeichnet. Die erfindungsgemäßen Hapten-Träger-Konjugate können unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren sowie unter Anwendung verschiedener Konjugationsverfahren, die dem Fachmann geläufig sind, in unterschiedlichen Ausmaßen haptenisiert werden, indem man beispielsweise verschiedene Aktivierungsmittel, verschiedene Puffer, verschiedene Reaktionszeiten und dergl. wählt. Das Ausmaß der Haptenisierung des Konjugats ist jedoch durch die Anzahl von nukleophilen Gruppen, die innerhalb des Trägers enthalten sind, beschränkt. Tabelle 2
    Konjugat Trägerprotein Hapten/Monomer Konjugationsverfahren
    PS-2.2 BSA 16 Bsp.1
    PS-4.3 BSA 24 Bsp.4
    PS-5.1 BSA 4-20 Bsp.3, Verfahren A
    PS-5.4 BSA 29 Bsp.3, Verfahren A
    PS-5.6 BSA 20 Bsp.3, Verfahren A
    PS-5.7 BSA 27 Bsp.3, Verfahren B
    PS-6.1 BSA 9 Bsp.4
    PS-9 BSA 1-2 Bsp.5
    PS-9.2 BSA 7 Bsp.5
    PS-5.6 CTB 1,25 Bsp.6, Verfahren A
    PS-5.7 CTB <1 Bsp.7, Verfahren A
    PS-5.8 CTB 1,9 Bsp.6, Verfahren A
    PS-5.9 CTB 0,9-6,5 Bsp.7, Verfahren B
    PS-5.10 CTB 0,5-2,5 Bsp.7, Verfahren C
    PS-11 CTB 1,0-7,8 Bsp.6, Verfahren A
    PS-5.53 CTB 3,4 Bsp.6, Verfahren A
    PS-5.70 CTB NA Bsp.6, Verfahren B
    • NA nicht verfügbar
  • Hierbei handelt es sich um eine nicht-beschränkende Auflistung von Konjugaten. Weitere Konjugate wurden hergestellt, indem mehr als 1 Hapten an den das T-Zell-Epitop enthaltenden Träger gekuppelt wurde. Vorzugsweise werden 1 bis 100 Haptene an den das T-Zell-Epitop enthaltenden Träger gekuppelt. Insbesondere werden 1 bis 70 Haptene an den das T-Zell-Epitop enthaltenden Träger gekuppelt.
  • Verfahren zur Synthese der Verbindungen PS-2, PS-3, PS-4, PS-5 und PS-6 sind in den Beispielen beschrieben. Gemäß den beschriebenen Verfahren, z. B. unter Verwendung von Aktivierungsmitteln unter wässrigen Bedingungen, kann der Fachmann die Verbindungen PS-10 bis PS-26 (vergl. 3b(1) und (2)) synthetisieren.
  • Die Hydrolyse des Methylesters in den PS-2-, PS-4-, und PS-5-Konjugaten führt zur Erzeugung von für Benzoylecgonin spezifischen Antikörpern, wodurch das Konjugat als therapeutischer Impfstoff im Wesentlichen unwirksam gemacht wird. Für eine optimale Konjugation und zur Verhinderung einer starken Hydrolyse des Methylesters in den succinylierten Norkokain- und PS-5-Konjugaten wird der Puffer-pH-Wert während der Konjugation auf 7,6 bis 7,8 gehalten, wobei die Reaktionszeiten auf eine Zeitspanne bis zu 1,5 Stunden beschränkt werden. Ferner wird die im Anschluss an die Konjugation durchgeführte Reinigung des PS-5-Konjugats idealerweise bei einem pH-Wert von 6,5 unter Verwendung von 20 mM Natriumsuccinatpuffer durchgeführt.
  • Um die Stabilität des Methylesters zu überwachen, lassen sich sowohl immunologische als auch physikochemische Techniken heranziehen. Ein für Kokain spezifischer monoklonaler Antikörper wurde erzeugt, der zwischen Kokain und dessen Metaboliten unterscheiden kann, wenn er an den Proteinträger angeheftet wird. Die Reaktivität gegenüber inaktiven Metaboliten war 2000-fach geringer als gegenüber Kokain. In Bezug auf Benzoylecgonin spezifische monoklonale Antikörper lassen sich intern unter Anwendung einer ähnlichen Technik erzeugen. Jeder dieser beiden monoklonalen Antikörper oder vorzugsweise beide können zur Messung der Konzentrationen von intakten und hydrolysierten Konjugaten im Vergleich mit Standardgemischen verwendet werden. Diese Differenzierung hängt von der relativen Reaktivität der einzelnen monoklonalen Antikörper mit dem hydrolysierten und intakten Konjugat ab. Gemäß einer weiteren Ausführungsform lässt sich ein in Bezug auf Kohlenstoff-13 angereichertes Methylester-Analogon von succinyliertem Norkokain synthetisieren (16). Bei Konjugation an ein Trägerprotein zur Bildung von PS-5 lässt sich eine 13C-NMR-Spektroskopie zur Überwachung der Gegenwart des Methylesters heranziehen. Da die Methylgruppe in Bezug auf das Isotop angereichert ist, ist das Signal, das dem Methylester entspricht, von den Proteinsignalen unterscheidbar.
  • Ein Konjugat, das radioaktiv markierten Methylester enthält, lässt sich synthetisieren. Dieses Konjugat könnte entweder ein Kohlenstoff-14 oder ein Tritium enthaltendes Methylester-Analogon von succinyliertem Norkokain umfassen. Bei Konjugation an ein Trägerprotein unter Bildung von PS-5 kann der Verlust an Radioaktivität eines der beiden Analoga im Laufe der Zeit durch Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, überwacht werden. Die Überwachung des Verlustes an Radioaktivität zeigt dann die Restkonzentrationen an intaktem Methylester an.
  • Die Benzoatestergruppe in den PS-5-Konjugaten ist unter den Konjugats- und Reinigungsbedingungen im Wesentlichen stabil und erfordert daher keine Überwachung der Beibehaltung der strukturellen Unversehrtheit. Wenn jedoch eine erhöhte biologische Verfügbarkeit erwünscht ist, können eine Amidbindung oder eine andere metabolisch stabile Gruppe, die dem Fachmann geläufig ist, in das Konjugat eingebaut werden. Gleichermaßen lässt sich der Methylester in den PS-5-Konjugaten unter Verwendung der Verzweigung CJ6, worin Q = H, d. h. eine Amidbindung, stabilisieren. Dieser Einbau würde sowohl in vitro als auch in vivo die Stabilität der Konjugate erhöhen.
  • Es werden die Verbindungen PS-27 bis PS-50 über eine Reaktionsfolge synthetisiert, die einen neuen Zugang zur Tropanklasse von Alkaloiden bietet. Dieser neue Weg beinhaltet eine durch freie Radikale vermittelte 1,6-Dien-artige, intermolekulare Cyclisierung (March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4. Auflg., Wiley-Interscience, (1992), S. 744 und die dort zitierten Literaturstellen). Tropan-Alkaloide und insbesondere Kokain und dessen Analoga, wurden bereits früher synthetisiert. Jedoch erfordern diese Herstellungswege mehrfache Stufen und üblicherweise die Auftrennung eines Zwischenprodukts (Wilstatter et al., Ann. Chem., Bd. 434 (1923), S. 111-139; Tufariello et al., J. Am. Chem., Bd. 101 (1979), S. 2435-2442; Lewin et al., J. Heterocyclic Chem., Bd. 24 (1987), S. 19-21; und Simoni et al., J. Med. Chem., Bd. 36 (1993), S. 3975-3977). Unter Beschränkung auf die Synthese von 3-Aryltropan-Derivaten synthetisierten Davies et al. ( US-Patent 5 262 428 ) Kokain-Analoga durch Zersetzung von Vinyldiazothanen in Gegenwart von Pyrrolen unter Bildung eines Tropanrings, wonach sich eine Grignard-Addition unter Bereitstellung der Kokain-Analoga anschloss. Bei dieser alternativen Ausführungsform werden neuartige Kokain-Träger-Konjugate mit Verzweigungen an einer "entfernten Stelle" synthetisiert. Gemäß der hier verwendeten Terminologie werden "entfernte Stellen" in 1 mit C, D und E bezeichnet. Diese Stellen stellen für den Chemiker aufgrund der Natur des Tropanrings spezielle Herausforderungen dar und sind besonders schwierige Positionen für "Verzweigungen", die für die erfindungsgemäßen Konjugate erforderlich sind. Eine Ausführungsform fügt die "Verzweigungen" hinzu und baut sodann am Schluss den Tropanring auf. Wie in 15 dargestellt, gibt es eine neuartige einstufige Reaktion zur Addition des Restes 2 und zur Cyclisierung (bei niedriger Temperatur) der allgemeinen Verbindung 1. Das stereochemische Ergebnis wird durch die bootartige Form des Zwischenprodukts 3 definiert, bei dem die Addition des Restes 2 äquatorial an der Position 3 erfolgt, wonach sich der Ringschluss durch den vorhergesagten Mechanismus anschließt, wodurch man das 3-Benzoatester-Addukt 4 (Kokain-Analogon) erhält. Die Orientierung von C, D, E und CO2R ist in 1 vordefiniert.
  • Es gibt einen breiten Bereich von Verbindungen, die entwickelt wurden, um die Vernetzung von Proteinen/Peptiden oder die Konjugation von Proteinen an derivatisierte Moleküle, z. B. Haptene, zu erleichtern. Hierzu gehören (ohne Beschränkung darauf) von Carbonsäuren abgeleitete aktive Ester (aktivierte Verbindungen), gemischte Anhydride, Acylhalogenide, Acylazide, Alkylhalogenide, N-Maleinimide, Iminoester, Isocyanate und Isothiocyanate, die dem Fachmann geläufig sind. Diese Verbindungen sind zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mit einer reaktiven Gruppe eines ProteinMoleküls befähigt. Je nach der Aktivierungsgruppe handelt es sich bei der reaktiven Gruppe um die Aminogruppe eines Lysinrestes an einem ProteinMolekül oder an einer Thiolgruppe in einem Trägerprotein oder einem modifizierten TrägerproteinMolekül, das bei der Umsetzung zur Ausbildung einer Amid-, Amin-, Thioether-, Amidinharnstoff- oder Thioharnstoff-Bindung führt. Der Fachmann kann weitere geeignete Aktivierungsgruppen identifizieren, z. B. in Werken der allgemeinen Referenz, wie Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, (1991)). Idealerweise erfolgt die Konjugation über eine Lysin-Seitenketten-Aminogruppe. Die meisten Reagentien reagieren bevorzugt mit Lysin. Ein besonders geeigneter Träger ist CTB, da er in seiner nativen Form 9 Lysinreste pro Monomer aufweist. Um festzustellen, ob das konjugierte CTB seine Struktur und Aktivität behält, kann die GM1-Gangliosid-Bindung bestimmt werden.
  • Die Anmelderin hat große Mengen an rekombinantem CTB exprimiert und gereinigt, das nach Optimierung in großen Fermentationsansätzen erzeugt wird. Verfahren zum Exprimieren und Reinigen von rekombinantem Protein sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. aus der US-SN 07/807,529. Beispielsweise lässt sich CTB durch Affinitätschromatographie (Tayot et al., Eur. J. Biochem., Bd. 113 (1981), S. 249-258) unter Konjugation an Kokain-Derivate reinigen. Das Konjugat wird sodann weiter gereinigt. Das gereinigte CTB und das erhaltene Konjugat werden auf die Reinheit und die Aufrechterhaltung der pentameren Struktur von CTB analysiert. Zu entsprechenden Techniken gehören SDS-PAGE, native PAGE, Gelfiltrationschromatographie, Western-Blotting, direkte und GM1-Einfang-ELISA-Tests und kompetitive ELISA-Tests mit biotinyliertem CTB. Der Haptenisierungsgrad wird durch Massenspektrometrie und durch Analyse der Zunahme der UV-Absorption aufgrund der Anwesenheit des Haptens gemessen.
  • Sowohl die Löslichkeit als auch die Stabilität des Konjugats werden bei der Herstellung für Präparate in vollem Maßstab optimiert. Einzelheiten einiger dieser Analysen finden sich in den Beispielen.
  • Mehrere Konjugate wurden hergestellt, welche Analoga von Kokain und entweder BSA, HEL oder CTB als Proteinträger umfassen. Sechs repräsentative Kokain-Analoga sind in 3a dargestellt. Von den sechs Produkten waren PS-2, PS-4, PS-5, PS-6 und PS-9 mit BSA oder HEL konjugiert, während PS-5 auch mit CTB konjugiert war (vergl. die vorstehende Tabelle 2).
  • Um die Haptenisierungsgrade zu variieren, werden alternative Ansätze ergriffen. Bei einer Ausführungsform wird der Träger mit einem mehrwertigen Kokain-Konstrukt haptenisiert. Diese Idee beruht auf dem Konzept von mehrfachen antigenen Peptiden (MAP) (Lu et al., Mol. Immunol., Bd. 28 (1991), S. 623-630). Bei diesem System werden mehrfach verzweigte Lysinreste verwendet, um die Hapten-Dichte und -Valenz zu optimieren. Die Prämisse bei diesem Ansatz besteht darin, dass die Immunantwort verstärkt wird, wenn mehrfache Kopien des Haptens an das gleiche Peptid- oder ProteinMolekül gebunden werden. Daher wird ein mehrwertiges Hapten, das nur an eine oder zwei Stellen am Träger-CTB-Pentamer zu binden ist, gemäß den hier gemachten Ausführungen hergestellt. Der Kern eines derartigen mehrfachen antigenen Haptens ist ein verzweigter Polylysinkern gemäß der Anregung von Tam (Lu et al., a. a. O.). Ein chemisch reaktiver "Griff' wird durch Einbau eines geschützten Cys-Restes bewahrt. Nach Kokain-Haptenisierung sämtlicher verfügbaren Aminogruppen wird die Sulfhydrylgruppe von Cys demaskiert und für die Kupplung an das Protein mit einem oder mehreren bifunktionellen sulfhydryl/amino-spezifischen Vernetzungsmitteln verfügbar gemacht (Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., Bd. 101 (1979), S. 395-399. Eine Anzahl von dendrimeren Strukturen wird als Kern verwendet.
  • Adjuvans
  • Beliebige Adjuvantien, die die Wirkung des Trägers nicht maskieren, werden als geeignet angesehen (vergl. Edelman, Rev. Infect. Dis., Bd. 2 (1980), S. 370-373). Anfängliche Experimente, die darauf abzielten, die Eignung eines therapeutischen Impfstoffes gegen Kokain-Abhängigkeit nachzuweisen, bedienten sich des wirkungsvollen Adjuvans CFA (9a und c). Jedoch wird CFA bei Menschen nicht bevorzugt. Ein geeignetes Adjuvans, das derzeit für Menschen zugelassen ist, ist Alaun mit Aluminiumhydroxid (Spektrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, NJ) oder Aluminiumphosphat (Spektrum). Typischerweise wird der Impfstoff am Alaun, der nur eine begrenzte Löslichkeit aufweist, adsorbiert. Vorläufige Daten am Mäusemodell lassen darauf schließen, dass der Alaun dazu befähigt ist, eine starke anti-Kokain-Antikörper-Reaktion zu induzieren (9b), und dass RIBI-Adjuvans ebenfalls geeignet ist.
  • Eine wirksame Immunisierung mit CTB als Trägerprotein erfordert kein starkes Adjuvans. Wie in den Beispielen dargelegt, wurden anti-Kokain-Antikörper-Reaktionen mit hohem Titer durch Immunisierung mit CTB-Kokain-Konjugat induziert, wobei entweder Alaun als Adjuvans verwendet wurde oder in Abwesenheit von jeglichem zugesetzten Adjuvans gearbeitet wurde.
  • Exzipientien und Hilfsstoffe
  • Therapeutische Zusammensetzungen können gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Exzipientien enthalten, wozu (ohne Beschränkung hierauf) folgende Produkte gehören: steriles Wasser, Salzlösungen, wie Kochsalzlösung, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Alkohol, Gummi arabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykol, Gelatine, Mannit, Kohlenhydrate, Magnesiumstearat, viskoses Paraffin, Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose und Puffer. Weitere geeignete Exzipientien können vom Fachmann eingesetzt werden. Die therapeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls mindestens einen Hilfsstoff umfassen, z. B. Dispergiermedien, Überzüge, wie Lipide und Liposomen, oberflächenaktive Mittel, wie Netzmittel und Emulgatoren, Gleitmittel, Konservierungsmittel, z. B. antibakterielle Mittel und Antipilzmittel, Stabilisatoren und andere Mittel, die dem Fachmann geläufig sind. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ferner Adjuvantien, Mittel und/oder inerte pharmazeutisch verträgliche Exzipientien enthalten, die zugesetzt werden können, um die therapeutischen Eigenschaften des Arzneistoffes zu verstärken oder um alternative Verabreichungsarten zu ermöglichen.
  • Auf die vorstehende Weise hergestellte hochgereinigte Hapten-Träger-Konjugate lassen sich zu erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen, die für die Humantherapie geeignet sind, zubereiten. Wenn eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung durch Injektion zu verabreichen ist (d. h. durch subkutane Injektion), so ist es bevorzugt, dass das hochgereinigte Hapten-Träger-Konjugat in wässriger Lösung bei einem pharmazeutisch verträglichen pH-Wert (d. h. einem Bereich von etwa 4 bis 9) löslich ist, so dass die Zusammensetzung flüssig ist und eine leichte Verabreichung gegeben ist. Die Zusammensetzung enthält auch gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Exzipientien, Adjuvantien und Hilfsstoffe oder zusätzliche Wirkstoffe. Je nach der Verabreichungsart gewährleisten fakultative Bestandteile erstrebenswerte Eigenschaften der therapeutischen Zusammensetzung, z. B. eine geeignete Fließfähigkeit, eine Verhinderung der Einwirkung von unerwünschten Mikroorganismen, eine verstärkte biologische Verfügbarkeit oder eine verlängerte Absorption.
  • Eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung soll steril, unter den Bedingungen der Herstellung, Lagerung, Verteilung und Anwendung stabil und gegen die verunreinigende Einwirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, konserviert sein. Eine bevorzugte Maßnahme bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung besteht mit dem Ziel, den unveränderten Bestand der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten, in der Zubereitung des Konjugats und des pharmazeutischen Exzipiens in der Weise, dass die Zusammensetzung in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegen kann, das unmittelbar vor der Verwendung in Exzipientien oder Hilfsstoffen, z. B. sterilem Wasser, rekonstituiert wird. Im Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen bestehen die bevorzugten Herstellungsverfahren in der Vakuumtrocknung, Gefriertrocknung oder Schleudertrocknung, wodurch aus einer vorher steril filtrierten Lösung ein Pulver aus dem Wirkstoff und etwaigen zusätzlichen erwünschten Bestandteilen entsteht.
  • Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe lassen sich gemäß herkömmlichen Verfahren der galenischen Pharmazie zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung an Patienten, z. B. an Säugetiere, einschließlich Menschen, verarbeiten. Die bevorzugten Verabreichungsarten sind intranasal, intratracheal, oral, dermal und/oder durch Injektion. Eine besonders geeignete Kombination von Verabreichungsarten umfasst eine anfängliche Injektion in Kombination mit intranasalen Auffrischungen.
  • Für die parenterale Anwendung eignen sich insbesondere injizierbare sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Suppositorien. Ampullen stellen zweckmäßige Dosierungseinheiten dar. Für eine enterale Verabreichung eignen sich insbesondere Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen, Suppositorien oder Kapseln. Ein Sirup, ein Elixier oder dergl. können bei Verwendung eines gesüßten Trägers herangezogen werden.
  • Zusammensetzungen mit verzögerter oder direkter Wirkstofffreisetzung lassen sich zubereiten, z. B. Liposomen oder Produkte, bei denen der Wirkstoff (Konjugat) mit in unterschiedlicher Weise abbaubaren Überzügen geschützt ist, z. B. durch Mikroverkapselung, mehrfache Überzüge und dergl. Ferner ist es möglich, die neuen Verbindungen gefrierzutrocknen und die erhaltenen Lyophilisate beispielsweise zur Herstellung von Produkten für Injektionszwecke zu verwenden.
  • Für die topische Anwendung können nicht-sprühbare Formen, viskose bis halbfeste oder feste Formen herangezogen werden, die einen Träger umfassen, der für eine topische Anwendung verträglich ist und eine dynamische Viskosität, die vorzugsweise über der von Wasser liegt, aufweist. Zu geeigneten Zubereitungen gehören (ohne Beschränkung hierauf) Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben und dergl., die gegebenenfalls sterilisiert oder mit einem Hilfsstoff vermischt werden. Für die topische Anwendung eignen sich versprühbare Aerosolpräparate, bei denen der Wirkstoff (vorzugsweise in Kombination mit einem geeigneten Exzipiens oder Hilfsstoff) in einer Spritzflasche oder im Gemisch mit einem unter Druck gesetzten flüchtigen, normalerweise gasförmigen Treibmittel abgepackt ist.
  • Ein unter Anwendung der vorliegenden Erfindung erzeugter Antikörper kann ein Molekulargewicht im Bereich von 150 bis 1000 KDa aufweisen. Falls das Subjekt nach der Impfung mit dem optimierten Konjugat in der therapeutischen Zusammensetzung freiem Kokain ausgesetzt wird, stellt das freie Kokain das Ziel für den oder die gegenüber Kokain spezifischen Antikörper dar. Keine Änderungen bezüglich der Form oder der Struktur der Droge sind erforderlich, dass der Antikörper in vivo die Droge erkennt. Es wird angenommen, dass bei Belastung des geimpften Individuums mit Kokain die anti-Drogen-Antikörper die Wirkungen von Kokain blockieren. Es wird angenommen, dass mindestens drei Mechanismen an der Blockierungswirkung beteiligt sind. Zunächst sind die Antikörper zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke unfähig. Daher wird angenommen, dass Kokain bei Bindung an den anti-Kokain-Antikörper die Blut-Hirn-Schranke nicht überwindet und nicht dazu befähigt ist, seine Wirkung auf Dopamin-Transporter auszuüben. Zweitens hindert der Antikörper die Droge an einer Bindung an seinen Rezeptor durch eine einfache sterische Blockade. Es wird erwartet, dass dieser Mechanismus eine Blockierung einiger der Nicht-ZNS-Wirkungen von Kokain (z. B. die Herztoxizität) und die Aktivität von Antikörpern gegen andere Drogen mit Nicht-ZNS-Zielen blockiert. Drittens weist Kokain in vivo eine relativ kurze Halbwertszeit auf, was auf eine enzymatische und eine nichtenzymatische Hydrolyse zurückzuführen ist, die zur Bildung von inaktiven Metaboliten führt. Insbesondere Kokain ist eine ausreichend kleine Droge, die zur Vernetzung von Antikörpern unfähig ist, so dass es zu keiner Bildung von Immunkomplexen kommt.
  • In der erfindungsgemäßen Praxis werden weitere Ausführungsformen von Anwendungsformen auf Schleimhäute herangezogen. Beispielsweise werden Copolymer-Mikrokügelchen verwendet, um eine Immunantwort der Schleimhäute herbeizuführen oder zu verstärken. Diese kleinen, biologisch abbaubaren Mikrokügelchen verkapseln und schützen das Konjugat und erleichtern dessen Aufnahme durch das Schleimhaut-Immunsystem. Obgleich sie weitgehend für die orale Immunisierung eingesetzt werden, wurde berichtet, dass sie auch bei intranasaler Immunisierung wirksam sind (Walker, Vaccine, Bd. 12 (1994), S. 387-399). Inerte Polymere, wie Poly-(lactid-co-glycolid) (PLG), mit einem Durchmesser von 1-10 μm sind diesbezüglich besonders geeignet (Holmgren et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 50 (1994), S. 42-54; Serva, Science, Bd. 265 (1994), S. 1522-1524).
  • Zusätzlich zu den bevorzugten Konjugaten wird eine Kreuzimmunisierung mit unterschiedlichen Konjugaten durchgeführt, um die Antikörper-Kreuzreaktivität auf ein Minimum zu begrenzen. Mäuse werden einer Erstbehandlung mit Konjugaten und insbesondere mit PS-5- oder PS-9-Konjugaten ausgesetzt, wonach sie 14 Tage später eine Auffrischung mit den reziproken PS-9 oder PS-5-Konjugaten, die an den gleichen Träger, nämlich BSA, gekuppelt sind, erhalten. Nur die Untergruppe von Antikörper sezernierenden B-Zellen, die beide Kokain-Konjugate erkennen, sind maximal stimuliert und expandiert. Es wird angenommen, dass aufgrund der Tatsache, dass sich die beiden Konjugate bezüglich der Anheftungsstelle an das Kokain-Molekül unterscheiden, die Spezifität der Erkennung zunimmt. Die Spezifität der induzierten Antiseren wird sodann durch einen kompetitiven ELISA-Test bestätigt.
  • Ferner stimulieren therapeutische Zusammensetzungen, die mehr als ein Konjugat enthalten, polyklonale Antikörper, wodurch die Antikörper-Reaktion bei einer anschließenden Belastung verstärkt wird.
  • Dosis
  • Es ist bekannt, dass neutralisierende Antikörper-Reaktionen gegen Pathogene jahrelang anhalten. Es sollte möglich sein, einen hohen Titer der anti-Kokain-Antikörper-Reaktion zu erzielen, der mindestens 1 Jahr aufrechterhalten wird. Auf der Grundlage von Werten, die mit herkömmlichen Impfstoffen erhalten worden sind, sollte es möglich sein, die für eine Neutralisation von Kokain-Plasma-Konzentrationen (1-10 μM) erforderlichen Konzentrationen des spezifischen Antikörpers zu erzielen. Die in den Beispielen beschriebenen pharmakokinetischen Daten bei Mäusen belegen klar, dass die physiologisch relevanten Konzentrationen von neutralisierendem Antikörper erreicht werden können. Schließlich stellt die Fähigkeit von maternalen Antikörpern die Plazenta einer von Kokain abhängigen Frau zu durchqueren und somit den Fötus zu schützen, eine weitere wünschenswerte Wirkung einer therapeutischen Kokain-Impfung dar. Die Therapie in einer breiten Bevölkerungsschicht zu optimieren, stellt immer eine Herausforderung dar, doch der Fachmann wägt verschiedene Faktoren bei der Bestimmung der geeigneten therapeutischen Dosis sorgfältig ab. Ferner können Antikörper-Reaktionen unter Anwendung spezifischer ELISA-Tests, die in den Beispielen dargelegt sind, und durch andere Tests auf Antikörperbasis überwacht werden.
  • Genetische Variationen der Ausscheidungsraten, Wechselwirkungen mit anderen Arzneistoffen, krankheitsbedingte Veränderungen bezüglich der Ausscheidung und der Verteilung und andere Faktoren tragen zu einem weiten Bereich von Impfgraden bei Patienten, die die gleiche Dosis erhalten haben, bei. Klinische Indikatoren tragen dazu bei, dass der Titer einiger Drogen in den gewünschten Bereich fällt, wobei keine chemische Bestimmung einen Ersatz für sorgfältige Beobachtungen der Reaktion auf die Behandlung darstellt. Da die Clearance, die Halbwertszeitanreicherung und die Plasmakonzentrationen im stationären Zustand schwierig vorherzusagen sind, ist eine Messung der Bildung von anti-Missbrauchsdrogen-Antikörpern eine wertvolle Richtlinie zur Festlegung der optimalen Dosis.
  • Weitere Einzelheiten über die Wirkungen von Trägern und Adjuvantien bei der Induktion einer Antikörper-Reaktion sind in den Beispielen aufgeführt.
  • Somit ist es ersichtlich, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen eines Wirkstoffes in einem speziellen Fall je nach dem zu verwendenden spezifischen Konjugat, den besonderen Zubereitungen, dem Verabreichungsweg und dem speziellen Ort und Organismus, die zu behandeln sind, abhängen. Beispielsweise wird bei einer Ausführungsform die therapeutische Zusammensetzung, die einen geeigneten Träger enthält, zunächst parenteral verabreicht, wonach eine Auffrischung über die Schleimhäute vorgenommen wird. Wie hier ausführlich erörtert wird, ist dieser Typ von Immunisierung mit der optimalen Kombination von Hapten und Träger bei der vorwiegend systemischen Erzeugung von IgG und der vorwiegend lokalen Erzeugung von IgA besonders wirksam.
  • Wie in den Beispielen dargelegt, werden Mäusemodelle dazu herangezogen, verschiedene Eigenschaften der Antikörper-Reaktion unter besonderer Bezugnahme auf Kokain aufzuzeigen und zu messen. Diese schließen Antikörper-Titer, die Fähig keit zur Erkennung von freiem Kokain, die Kokain-Bindungskapazität, die Affinität für Kokain, die Spezifität der Antikörper-Reaktion, des Antikörper-Isotyps, der Antikörper-Gewebelokalisierung und die physiologischen Wirkungen des Antikörpers im Anschluss an die Kokain-Verabreichung ein.
  • Antikörper-Titer
  • Die erste Frage bei der Impfung besteht darin, ob das Konjugat von Interesse eine Antikörper-Reaktion mit hohem Titer herbeiführt. Die Antikörper-Titer werden durch einen ELISA-Test, wie er in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist, bestimmt. Platten werden mit einem Kokain-HEL-Konjugat beschichtet, gründlich gewaschen und mit verschiedenen Verdünnungen des Testserums inkubiert. Die Platten werden sodann erneut gewaschen und mit einem enzymmarkierten, zweiten anti-Maus-IgG-Antikörper entwickelt. Die Titer werden als der reziproke Wert der Serumverdünnung definiert, die zu 50% der maximalen Reaktion führt.
  • Der Antikörper-Titer hängt sowohl von der Konzentration des Antikörpers als auch von der Antikörper-Affinität ab. Wie in den Beispielen ausführlich dargelegt, wiesen Antiseren mit etwa 0,7 mg/ml kokainspezifischem Antikörper mit einer mittleren Affinität von etwa 2 × 10–8 M (oder 5 × 107M–1) einen ELISA-Titer von 80000 auf. Bei der Abschätzung des erforderlichen Antikörper-Titers werden sowohl die Konzentration als auch die Affinität der Antikörper vom Fachmann berücksichtigt.
  • Obgleich andere Verfahren zur Berechnung geeigneter Antikörper-Konzentrationen dem Fachmann geläufig sind, wird hier (ohne die Erfindung beschränken zu wollen) ein Verfahren zur Vorhersage der Erfordernisse für die anti-Kokain-Antikörper-Konzentration beschrieben. Veröffentlichte maximale Plasmakonzentrationen von Kokain liegen bei abhängigen Personen im Bereich von 0,3-1,5 g/ml (Ambre et al., J. Anal. Tox., Bd. 15 (1991), S. 17-20; Cone, J. Anal. Tox., Bd. 19 (1995), S. 159-478; und Cone et al., J. Anal. Tox., Bd. 13 (1989), S. 65-68). Daher liegt ein Wert von 0,075-0,375 mg/ml Antikörper nahe bei der molaren Äquivalenz (das Gewichtsverhältnis von monoklonalem Antikörper/Kokain = etwa 160000/303 = etwa 500, wobei aber zwei Bindungsstellen an jedem Antikörper vorhanden sind, so dass das Molverhältnis Bindungsstelle/Kokain etwa 250 beträgt). Es ist möglich, diesen Grad der Antikörper-Reaktion mit einem haptenisierten Träger zu erzielen, wie in den Beispielen gezeigt wird. Wenn jedoch in der Schleimhaut eine für die Missbrauchsdroge spezifische, in dimerer Form sezernierte IgA-Reaktion induziert wird, wie in mindestens einer der hier vorgestellten Ausführungsformen beschrieben wird, so ist die erforderliche Antikörper-Konzentration relativ zur Missbrauchsdroge nur halb so groß. Es soll nicht der Eindruck erweckt werden, dass ein molarer Überschuss des Antikörpers gegenüber der Missbrauchsdroge für eine erfolgreiche Therapie erforderlich ist.
  • In einer therapeutischen Zusammensetzung blockierte der kokainspezifische Antikörper (monoklonaler Antikörper) die Wirkungen eines molaren Überschusses von Kokain in einem Modell der abhängigen Ratte. Ratten erhielten 4 mg monoklonalen Antikörper vor einer Infusion von Kokain (1 mg/kg; 300 g/Ratte). Die gemessene Konzentration des monoklonalen Antikörpers in den Ratten betrug etwa 50 g/ml. Der Antikörper lag in einer unterhalb der molaren Äquivalenz zu Kokain liegenden Menge vor, wenn man einen Vergleich entweder im gesamten Tier oder im Plasma vornahm.
  • Die Antikörper-Affinität gibt die Menge des Antikörper-Drogen-Komplexes im Gleichgewichtszustand mit ungebundenem Antikörper und ungebundener Missbrauchsdroge wieder: Keq = [Ab + Drogenkomplex]/[Ab] × [Droge]wobei [Ab] = molare Konzentration von unbesetzten Antikörper-Bindungsstellen; [Droge] = molare Konzentration an ungebundener Droge; und [Ab + Droge] = molare Konzentration von Antikörper-Drogenkomplex.
  • Beispielsweise sind auf der Grundlage von Berechnungen bei den erwarteten Antikörper- und Kokain-Plasmakonzentrationen Antikörper mit einer Affinität für Kokain von mehr als 10–6 M überwiegend an Kokain gebunden und Antikörper mit Affinitäten von etwa 10–7 M nahezu vollständig an Kokain gebunden.
  • Fähigkeit zur Erkennung von freiem Kokain
  • Nachdem ein Konjugat zur Herbeiführung einer Antikörper-Reaktion mit hohem Serumtiter befähigt ist, wird das Serum auch auf seine Fähigkeit zur Erkennung von freiem Kokain in einem kompetitiven ELISA-Test, wie er in den Beispielen beschrieben ist, getestet. Ein ELISA-Test wird unter Verwendung einer suboptimalen Verdünnung von Serum konzipiert. Variierende Konzentrationen von freiem Kokain werden zusammen mit dem Antiserum zugegeben und die ELISA-Reaktion wird auf die vorstehende Weise entwickelt. Die Daten werden als die Konzentration freien Kokains, das zu einer 50%igen Konkurrenz um die Antikörper-Bindung erforderlich ist, angegeben, d. h. ein ungefähres Maß zur Messung der Affinität. Unter anderem wird Lidocain als negative Kontrolle bei den kompetitiven Experimenten herangezogen. Das Kokain-Träger-Konjugat, das bei der Immunisierung verwendet worden ist, wird als positive Kontrolle eingesetzt.
  • Ferner wird zusätzlich zum kompetitiven ELISA-Test die Bindung unter Verwendung von radioaktiv markiertem Kokain bestimmt. Die Daten dieser Tests können einen Hinweis darauf liefern, ob das Immunserum freies Kokain bindet. Dies wird in den Beispielen ausführlicher erläutert.
  • Spezifität der Antikörper-Reaktion
  • Um eine maximale Wirksamkeit der Blockierung der Aktivität von Kokain zu erreichen, müssen die induzierten Antikörper eine minimale Affinität für pharmakologisch inaktive Metaboliten von Kokain aufweisen. Die Bindung von Antikörpern an pharmakologisch inaktive Metaboliten von Kokain würde die Wirkungsstärke des Impfstoffes vermindern. Die primären inaktiven Metaboliten sind Ecgoninmethylester, Norkokain und Benzoylecgonin, die jeweils im Handel erhältlich sind. Die Spezifität der Antiseren für jeden dieser Metaboliten wird durch einen kompetitiven ELISA-Test und durch einen radioaktiv markierten Immunoassay bestimmt. Dies wird in den nachstehenden Beispielen ausführlicher erläutert.
  • Zusätzlich sollte eine Wechselwirkung der erzeugten Antikörper mit anderen, bei der Therapie der Abhängigkeit verwendeten Arzneistoffen und bei anderen medizinischen Maßnahmen auf ein Minimum beschränkt bleiben. Insbesondere wird eine Kreuzreaktion mit Arzneistoffen, die üblicherweise bei Missbrauch von Kokain und Mehrfachdrogenmissbrauch verschrieben werden, vermieden. Obgleich die einzigartige Beschaffenheit der Kokain-Tropanring-Struktur Kreuzreaktivitäten auf ein Minimum beschränkt, lassen sich diese leicht durch einen kompetitiven ELISA-Test bestimmen. Tatsächlich wird Lidocain als negative Kontrolle bei unserem kompetitiven ELISA-Test herangezogen. Die nachstehend aufgeführten Moleküle eignen sich zur gleichzeitigen Behandlung: Buprenorphin, Desipramin, Naloxon, Haloperidol, Chlorproazin und Bromocriptin, sowie andere Stoffe, die möglicherweise indiziert sind.
  • Einfluss auf den Kokain-LD50-Wert
  • Die Konjugate und Immunisierungsverfahren, die sich als besonders wirksam bei der Induktion von spezifischen Antikörper-Reaktionen mit hohem Titer erweisen, werden ferner einer Bewertung ihrer Fähigkeit zur Verschiebung des Kokain-LD50-Wertes unterzogen. Bei diesen Experimenten erhalten mit Kokain immunisierte und mit dem Kontrollträger immunisierte Mäuse eine intravenöse Injektion von Kokain in Dosen, die um den vorher definierten LD50-Wert herum liegen. Für jeden Punkt werden 10 Mäuse herangezogen. Die Daten werden unter Anwendung eines Cochran-Mantel-Haenzel-Chi-Quadrat-Tests analysiert.
  • Ferner wird ein Modell der Versagenszeit zur Analyse der Zeitspanne, die bis zu dem durch Kokain herbeigeführten Tod verstreicht, herangezogen. Der Grad, in dem die anti-Kokain-Antikörper sowohl (a) die Dosis des für eine letale Wirkung erforderlichen Kokains als auch (b) die Zeitspanne bis zum Eintritt des Todes erhöhen bzw. verlängern, stellt ein Maß für die Wirksamkeit bei diesem Modell dar. Diese Werte ergeben einen raschen und genauen Test für die in vivo-Wirksamkeit der Antikörper.
  • Beobachtung der physiologischen Wirkung bei Menschen
  • Personen, die während einer Missbrauchsepisode den Arzt aufsuchen, können einen raschen Puls, eine erhöhte Atemfrequenz und eine erhöhte Körpertemperatur aufweisen. Bei hohen Überdosen verschlechtert sich das Erscheinungsbild zu Grandmal-Krämpfen, ausgeprägt hohem Blutdruck und sehr hoher Körpertemperatur, die alle zu einem kardiovaskulären Schock führen können. Zusätzlich zu den Blutwerten werden alle diese Faktoren bestimmt und es werden spezifische Kriterien aufgestellt, wann entweder eine aktive Immunisierung mit dem Impfstoff oder eine passive Verabreichung von Antikörpern an Menschen in Betracht gezogen wird.
  • Beim Test an Mäusen induzierte eine Immunisierung mit einem Protein-Kokain-Konjugat eine Antikörperreaktion, die den LD50-Wert für Kokain verschiebt ( 11a u. b). Es wird angenommen, dass die relativ geringe Verschiebung, die bei sehr hohen Dosen von Kokain beobachtet wurde, sich bei geringeren Kokain-Konzentrationen in einer stärkeren Verschiebung auswirkt. Die starke Wirkung des monoklonalen anti-Kokain-Antikörpers bei Selbstverabreichung von Kokain stimmt mit dieser Hypothese überein.
  • Sofern in den Beispielen nichts anderes angegeben wird, werden für diese Untersuchungen weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 2-3 Monaten herangezogen. Diese Tiere zeigen eine gut definierte, reproduzierbare Reaktion auf die zu untersuchenden Antigene. Die Tiere werden intramuskulär, subkutan, intratracheal oder intranasal mit einem Protein-Kokain-Konjugat entweder in Kochsalzlösung oder an Alaun oder in CFA immunisiert. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden BALB/c-Mäuse subkutan mit 50 μg Testkonjugat immunisiert. Nach 14 Tagen erhalten die Mäuse eine Auffrischung in der gleichen Dosis. Bei den unter Verwendung von CFA immunisierten Mäusen wurde IFA für die anschließenden Immunisierungen verwendet. Antikörper-Reaktionen im Serum werden 14 Tage später gemessen. Pro Gruppe werden 5 Mäuse eingesetzt. Sämtliche Seren werden individuell getestet. Das in den folgenden Beispielen verwendete CTB stellt ein handelsübliches Produkt dar, z.B. von List oder Sigma.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen lediglich zu Erläuterungszwecken dienen und dass für den Fachmann bei Kenntnis dieser Ausführungen verschiedene Modifikationen ersichtlich sind. Demzufolge dienen die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele nur als Richtlinie für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 1
  • Synthese von PS-2
  • Eine Lösung von Ecgoninmethylester-hydrochlorid (50 mg, 0,21 mmol), Diisopropylethylamin (80 l, 0,46 mmol) in DMF (3 ml) wurde mit Bromacetylbromid (22 l, 0,25 mmol) behandelt und über Nacht auf 40°C erwärmt. Sodann wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie (9:1 Chloroform/Methanol als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt die Bromverbindung (67 mg, 96%) in Form eines blassgelben Pulvers (3-(Bromacetyloxy)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäuremethylester).
  • Eine Lösung der Bromverbindung (17 mg, 0,053 mmol) in PBS (0,5 ml) wurde mit thiolisiertem BSA (15 mg) in PBS (0,5 ml) versetzt und 3 Tage bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Konjugat wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt und sodann durch Massenspektroskopie analysiert.
  • Beispiel 2
  • Synthese von PS-4
  • Eine Lösung von Ecgoninmethylester (32 mg, 0,16 mmol) in DMF (2 ml) wurde mit Triethylamin (22 l, 0,16 mmol) und anschließend mit Bernsteinsäureanhydrid (16 mg, 0,16 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden auf 35°C erwärmt. Sodann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie (9 : 1 Chloroform/Methanol als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt das angestrebte Hämisuccinat (21 mg, 44%) in Form eines weißen Pulvers (3-(Succinoyloxy)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäuremethylester).
  • Eine Lösung des Hämisuccinats (2,4 mg, 7,69 mol) in destilliertem Wasser (0,5 ml) wurde bei 0°C mit EDC (1,5 mg, 7,69 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde BSA (2 mg in 0,5 ml PBS) zugegeben. Sodann ließ man die Lösung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Das Konjugat wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Grad der Haptenisierung wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 3
  • Synthese von PS-5
  • Verfahren A
  • Eine Lösung von Norkokain-hydrochlorid (1 g, 3,07 mmol), und Triethylamin (0,86 ml, 6,14 mmol) in DMF (20 ml) wurde mit Bernsteinsäureanhydrid (614 mg, 6,14 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht auf 45°C erwärmt. Sodann wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie (2 : 1 Chloroform/Methanol als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt succinyliertes Norkokain (1,0 g, 84%) in Form eines dickflüssigen Sirups (3-(Benzoyloxy)-8-succinoyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäure-methylester).
  • Eine Lösung der Säure (14 mg, 0,036 mmol) in destilliertem Wasser (1 ml) wurde bei 0°C mit EDC (10,4 mg, 0,055 mmol) versetzt. Nach 5 Minuten wurde eine Lösung von BSA (14 mg) in PBS (1 ml) zugetropft. Man ließ das Gemisch über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Das Konjugat wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Grad der Konjugation wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Verfahren B
  • Eine Lösung von BSA (500 mg) in 0,2 M Boratpuffer (80 ml) wurde innerhalb von 30 Minuten mit Bernsteinsäureanhydrid (270 mg, 2,70 mmol) in 1,4-Dioxan (10 ml) in Aliquotmengen von 200 I versetzt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 3 N Natriumhydroxidlösung auf 9,3 gehalten. Die Lösung wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur belassen, gegen 0,01 M Triethylamin dialysiert und sodann lyophilisiert. Man erhielt 583 mg in Form eines lockeren weißen Pulvers. Eine massenspektroskopische Analyse des Produkts ergab 55 Succinoylgruppen pro BSA-Molekül.
  • Eine Lösung von succinyliertem BSA (72 mg) in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer, pH-Wert 8,8 (15 ml) wurde bei 0°C mit EDC (88 mg, 0,46 mmol) versetzt. Nach 5 Minuten wurde Norkokain-hydrochlorid (100 mg, 0,31 mmol) zugegeben. Man ließ die Lösung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Die Konjugatlösung wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 4
  • Synthese von PS-6
  • Eine Lösung von Benzoylecgonin (276 mg, 0,96 mmol) in DMF (5 ml) wurde bei –10°C tropfenweise mit Boran-Dimethylsulfid-Komplex (1,0 M Lösung in Methylenchlorid, 1,0 ml, 1,01 mmol) versetzt. Sodann ließ man das Gemisch über Nacht auf Umgebungstemperatur erwärmen. Sodann wurde die Umsetzung durch Zugabe von THF : Wasser (Verhältnis 1: 1 Vol./Vol.) gestoppt, wonach weitere 10 Minuten gerührt wurde. Der nach Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie (Chloroform und anschließend Methanol als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt den angestrebten Alkohol (246 mg, 93%) in Form eines weißen Pulvers (3-(Benzoyloxy)-2-(hydroxymethyl)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan).
  • Eine Lösung des Alkohols (190 mg, 0,69 mmol) in DMF (5 ml) wurde mit Triethylamin (0,19 ml, 1,38 mmol) und anschließend mit Bernsteinsäureanhydrid (138 mg, 1,38 mmol) versetzt und über Nacht auf 40°C erwärmt. Sodann wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie (1 : 1 Chloroform/Methanol als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt das Hämisuccinat (123 mg, 48%) in Form eines weißen Pulvers (3-(Benzoyloxy)-2-(hydroxymethylsuccinoyl)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan).
  • Eine Lösung des Hämisuccinats (16 mg, 0,043 mmol) in destilliertem Wasser (0,5 ml) wurde hei 0°C mit EDC (12 mg, 0,064 mmol) versetzt. Nach 5 Minuten wurde BSA (16 mg) in PBS (0,5 ml) tropfenweise zugegeben. Sodann ließ man die Lösung über Nacht auf Umgebungstemperatur erwärmen. Die Konjugatlösung wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 5
  • Synthese von PS-9
  • Eine Lösung von Benzoylecgonin (10 mg, 0,035 mmol) in destilliertem Wasser (1,0 ml) wurde bei 0°C mit EDC (10 mg, 0,052 mmol) versetzt. Nach 5 Minuten wurde BSA (10 mg) in PBS (0,5 ml) tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht auf Umgebungstemperatur erwärmt. Das Proteinkonjugat wurde durch Dialyse gegen PBS-Puffer gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 6
  • Synthese von CTB-PS-5
  • Verfahren A
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit HATU (2 mg, 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml 10 mM Boratpuffer, pH-Wert 7,8) gegeben und 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt, wonach eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert 6,5, durchgeführt wurde. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder durch UV-Absorption gemessen.
  • Verfahren B
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit HBTU (1,9 mg), 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml PBS-Puffer, pH-Wert 7,6) gegeben und 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt, wonach eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert 6,5, erfolgte. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisie rungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder durch UV-Absorption gemessen.
  • Verfahren C
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit TNTU (1,9 mg, 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml PBS-Puffer, pH-Wert 7,6) gegeben und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt. Anschließend wurde eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert, 6,5 durchgeführt. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder durch UV-Absorption gemessen.
  • Verfahren D
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit TNTU (1,9 mg, 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml 10 mM Boratpuffer, pH-Wert 7,8) gegeben und 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt, wonach eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert 6,5, durchgeführt wurde. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder durch UV-Absorption gemessen.
  • Verfahren E
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit PyBroP (2,4 mg, 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml PBS-Puffer, pH-Wert 7,6) gegeben und 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt, wonach eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert 6,5, durchgeführt wurde. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder durch UV-Absorption gemessen.
  • Verfahren F
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (2 mg, 5,14 mol) in DMF (0,1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (2 l, 10,3 mol) und anschließend mit PyBroP (2,4 mg, 5,40 mol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,5 mg in 0,9 ml 10 mM Boratpuffer, pH-Wert 7,8) gegeben und 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1 N HCl auf 6,5 eingestellt, wonach eine Reinigung durch Dialyse gegen 20 mM Natriumsuccinat, pH-Wert 6,5, durchgeführt wurde. Das Dialysat wurde durch einen 0,2 m-Filter filtriert. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse oder UV-Absorption gemessen.
  • Beispiel 7
  • Alternative Synthesen von CTB-PS-5
  • Verfahren A
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (15 mg, 0,39 mol) und Thionylchlorid (28 l, 0,39 mmol) in DMF (250 l) wurde 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nachdem die Umsetzung als vollständig angesehen worden war (aufgrund von dünnschichtchromatographischer Analyse) wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das erhaltene Chlorderivat (3-(Benzoyloxy)-8-chlorsuccinoyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäuremethylester) wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.
  • Das Chlorderivat (16 mg, 0,04 mmol) wurde in DMF (100 l) gelöst and tropfenweise zu einer Lösung von CTB (0,38 mg/ml in 3 ml PBS) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur belassen, gegen PBS dialysiert und einer Bestimmung des Haptenisierungsgrades durch massenspektroskopische Analyse unterzogen.
  • Verfahren B
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (100 mg, 0,26 mmol) in DMF (5 ml) wurde mit DCC (64 mg, 0,31 mmol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde 4-Hydroxy-3-nitrobenzol-sulfonsäure-natriumsalz (74 mg, 0,31 mmol) zugegeben. Die erhaltene gelbe Lösung wurde 4 Tage bei Umgebungstemperatur belassen. Die erhaltene Suspension wurde unter vermindertem Druck filtriert. Das Filtrat wurde unter heftigem Rühren zu kaltem Diethylether (10 ml) gegeben. Hexan (5 ml) wurde zugegeben. Nach vollständiger Fällung eines gelben Öls wurde der farblose Überstand abdekantiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt. Das 01 wurde unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Man erhielt den gewünschten Ester (157 mg) (3-(Benzoyloxy)-8-(2-nitro-4-sulfophenylester)-succinoyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäure-methylester), der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
  • Der Ester (5 mg, 8,16 mol) wurde in DMF (100 l) gelöst und tropfenweise bei 4°C zu CTB (1 mg in 2 ml PBS) gegeben und sodann auf Umgebungstemperatur erwärmt. Nach 3 Stunden wurde die Konjugatlösung durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Verfahren C
  • Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (108 mg, 0,28 mmol) in DMF (5 ml) wurde bei 0°C mit NMM (37 l, 0,33 mmol) und anschließend mit Chlorameisensäureethylester (32 l, 0,33 mmol) versetzt. Nach 10 Minuten wurde N-Hydroxysuccinimid (38 mg, 0,33 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde innerhalb von 18 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmt. Nach Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wurde der Rückstand aus Isopropanol/Diethylether umkristallisiert. Man erhielt den N-Oxysuccinimidylester (113 mg, 84%) in Form eines weißen Pulvers (3-(Benzoyloxy)-8-(N-oxysuccinimidoyl)-succinoyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-2-carbonsäure-methylester).
  • Eine Lösung des Esters (2 mg, 4,11 mol) in DMF (100 l) wurde tropfenweise zu einer Lösung von CTB (1 mg in 2 ml PBS) gegeben. Nach 3 Tagen wurde die Konjugatlösung durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 8
  • Synthese eines Konjugats mit einem erweiterten Spacer
  • Eine Lösung von Norkokain-hydrochlorid (50 mg, 0,15 mmol) in DMF (1 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (27 l, 0,31 mmol) versetzt. Nach 5 Minuten wurde die Lösung auf 0°C abgekühlt und tropfenweise zu einer Lösung von Adipoylchlorid (44 l, 0,080 mmol) in DMF (100 l) bei 0°C gegeben. Nach 2 Stunden wurde die Lösung bei 0° tropfenweise zu einer Lösung von CTB (1 mg in 2 ml PBS) gegeben und über Nacht auf Umgebungstemperatur erwärmt. Die Konjugatlösung wurde durch Dialyse gegen PBS gereinigt. Der Haptenisierungsgrad wurde durch massenspektroskopische Analyse bestimmt.
  • Beispiel 9
  • Konjugation von succinyliertem Norkokain mit MAP
  • MAP-Harz (Novabiochem USA, La Jolla, CA) (Substitutionsgrad 0,48 mmol/g, 50 mg, 0,023 mmol) wurde in DMF (5 ml) vorgequollen. Das Lösungsmittel wurde dekantiert. Das Harz wurde mit einer Lösung von 20% Piperidin in DMF (5 ml) behandelt und 15 Minuten bewegt. Sodann wurden die Lösungsmittel durch Dekantieren entfernt. Das Harz wurde nacheinander mit DMF (5 ml), Methanol (5 ml) und DMF (5 ml) gewaschen. Eine Lösung von succinyliertem Norkokain (18 mg, 0,046 mmol) in DMF (1 ml) wurde mit einem Gemisch von HOBt/DMF/HATU (0,5 M frisch hergestellte Lösung in DMF, 921, 0,046 mmol) behandelt. Nach Ablauf von 5 Minuten wurde das Gemisch über Nacht bewegt, wonach die Umsetzung gemäß dem Kaiser-Ninhydrin-Test zu > 90% beendet war. Die Lösungsmittel wurden abdekantiert. Die Harzkügelchen wurden gründlich mit Methanol gewaschen und anschließend unter einem Argonstrom getrocknet. Das derivatisierte MAP wurde durch Suspendieren des Harzes in 2,5% Phenol/TFA/EDT (5 ml) und 1-stündiges Bewegen abgespalten, filtriert und mit TFA (4 × 4 ml) gewaschen. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Das rohe Peptid wurde mit kaltem Diethylether verrieben und 5 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt. Sodann wurde das Pellet in Wasser gelöst und lyophilisiert. Man erhielt 1 mg rohes Peptid.
  • Beispiel 10
  • Synthese von (N-Succinamidyl-kokain)8-MAP-Protein-Konjugat
  • Die Synthese des Nicht-Haptenteils (MAP-Kern) des polyhaptenisierten MAP wird durch manuelle Peptidsynthese gemäß den Angaben von Tam et al., ( US-Patent 5 229 490 ) durchgeführt. Die Gruppen werden durch die Boc-Funktion (tert.-Butyloxycarbonyl) geschützt und die Sulfhydrylgruppe von Cys wird als 3-Nitro-2-pyridylsulfenyl-Derivat (Npys) geschützt. Nach Zusammenstellung am Harz und Entfernung von Boc-Schutzgruppen mit TFA gemäß den Angaben von Tam (a. a. O.) wird der MAP-Kern vom Harz durch HF-Spaltung abgespalten, wobei die Npys-Gruppe intakt bleibt. Der rohe MAP-Kern wird in 7 M Guanidin-hydrochlorid mit 0,2 M HOAc aufgenommen und der Gelpermeationschromatographie in 0,2 M HOAc an Sephadex G-10 unterworfen, um etwaige verbleibende niedermolekulare Nebenprodukte, die durch die HF-Spaltung entstanden sind, zu entfernen. Der MAP-Kern wird aus 0,2 M HOAc lyophilisiert. (N-Succinamidylnorkokain)8-MAP wird gemäß Beispiel 9 hergestellt.
  • Vor der Kupplung an aktiviertes Protein wird die Thiolgruppe durch Behandlung mit einem molaren Äquivalent von Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid (TCEP) freigelegt. Aktivierter Proteinträger wird in einer Konzentration von 5 mg/ml in 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer bei Raumtemperatur gelöst. Diese Lösung wird mit einem 2-fachen molaren Überschuss von (N-Succinamidylnorkokain)8-MAP in einer Konzentration von 5 mg/ml versetzt. Die Umsetzung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wird das Produkt über Nacht gegen 0,2 M HOAc dialysiert und lyophilisiert.
  • Beispiel 11
  • Testen der Induktion der kokainspezifischen Antikörper-Reaktion
  • Um eine Antikörper-Reaktion gegen ein kleines Molekül oder Hapten, wie Kokain, zu induzieren, ist es erforderlich, dieses Molekül an einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Träger, z. B. einen Proteinträger, zu binden. Der Träger wird durch die T-Zellen erkannt, die die kokainspezifischen B-Zellen darin unterstützen, eine anhaltende Antikörperbildung einzuleiten und aufrechtzuerhalten. In diesem Beispiel handelt es sich beim verwendeten Träger um BSA, ein Protein mit 36 Lysinresten, die frei liegen und für die Konjugation verfügbar sind. Ein Satz von strukturell unterschiedlichen Kokain-Protein-Konjugaten wurde hergestellt, die über unterschiedliche Regionen des KokainMoleküls verknüpft waren (1a, 1b, 2a, 2b). Ein Satz von Konjugaten wurde synthetisiert, da das Kokain-Molekül während des Konjugationsvorgangs am Träger physikalisch verändert und unterschiedlich orientiert wird. Da jedes gegebene Kokain-Konjugat Antikörper induzieren kann, die nur das Konjugat und nicht das freie Hapten (Kokain) selbst erkennen, wurde ein Screening durchgeführt.
  • Mäuse wurden mit 50 g Kokain-BSA-Konjugat PS-5.1 and PS-5.6 (9a und b) oder mit PS-9.1 (9c) intraperitoneal entweder mit CFA (9a und 9c) oder mit Alaun (9b) immunisiert. Die Mäuse erhielten eine einmalige Auffrischungsimmunisierung und wurden sodann zur Blutentnahme herangezogen. Die mit Kokain-BSA-Konjugat PS-5.1 immunisierten Mäuse erhielten eine Auffrischung mit Kokain-BSA-Konjugat PS-5.6. Seren wurden in einem ELISA-Test unter Verwendung von Platten, die mit PS-5 (konjugiert an HEL) bzw. PS-9 (konjugiert an HEL) beschichtet waren. Die Reaktionen von 5 einzelnen Mäusen pro Gruppe sind dargestellt. Diese Daten zeigen, dass die Kokain-BSA-Konjugate dazu befähigt sind, Antikörper-Reaktionen mit hohen Titern zu induzieren.
  • Beispiel 12
  • Erkennung von freiem Kokain
  • Um direkt festzustellen, ob die induzierten Antikörper zur Erkennung des freien Kokain-Moleküls befähigt waren, wurde ein kompetitiver ELISA-Test eingerichtet. Platten wurden mit einem entsprechenden freien Kokain-HEL-Konjugat beschichtet und mit den Antiseren in einer Verdünnung von 1 : 2000 in Gegenwart von variierenden Konzentrationen an freiem Kokain als Kompetitor inkubiert. Bei Verwendung von PS-5.6-BSA als Immunogen wurde der Großteil der Antikörper-Reaktion in wirksamer Weise kompetitiv durch freies Kokain verdrängt (10a und b). In diesem Satz von Seren von 10 Mäusen (die einzelnen Linien im Diagramm von 10a zeigen jeweils verschiedene Mäuse) war ein Serum bei diesem kompetitiven Test (leere Quadrate und gestrichelte Linie) weniger wirksam. Diese Maus wurde nicht für die hier beschriebenen LD50-Experimente herangezogen. Das PS-9.2-BSA-Konjugat induziert ebenfalls kokainspezifische Antikörper. Diese Daten zeigten, dass Kokain-Träger-Konjugate synthetisiert werden können, die einen hohen Titer von kokainspezifischen Antikörper-Reaktionen induzieren, die in vivo zur Neutralisation von Kokain befähigt sein sollten.
  • Beispiel 13
  • Möglichkeit der Impfung zum Schutz gegen Kokain-Toxizität
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Kokain-Protein-Konjugat, das in einem Mäusemodell eine anti-Kokain-Antikörper-Reaktion induzierte. Diese anti-Kokain-Antikörper neutralisierten in vivo Kokain, wobei sie die Kokain-Dosis, die zu einer letalen Reaktion bei Mäusen erforderlich war, signifikant verschoben.
  • Die Wirksamkeit einer therapeutischen Impfung gegen Kokain wurde durch Ermittlung der letalen Dosis von Kokain (LD50) bei immunisierten und unbehandelten Tieren bestimmt. Die Vorhersage bestand darin, dass eine starke kokainspezifische Antikörper-Reaktion ausreichende Mengen an Kokain binden sollte, um die raschen kardiologischen, respiratorischen und neurologischen Wirkungen von Kokain zu verhindern und somit den LD50-Wert von Kokain bei den immunisierten Mäusen zu erhöhen. 60 BALB/c-Mäuse wurden mit 50 μg PS-5.4-BSA in CFA immunisiert und nur 1-mal mit dem gleichen Konjugat in IFA aufgefrischt. 34 Tage später wurde jeder Maus Blut entnommen und die Serum-Antikörper-Titer und die kompetitive Reaktion mit Kokain wurden bestimmt. Für das Experiment wurden 48 Mäuse mit durchschnittlichen Titern von 18700 herangezogen, wobei sich bei sämtlichen Tieren eine kompetitive Reaktion mit freiem Kokain ergab. Für das LD50-Experiment wurden 4-6 Mäuse pro Gruppe verwendet. Jede Gruppe wurde einer sorgfältigen Anpassung in Bezug auf Antikörper-Titer und offensichtliche Affinität für freies Kokain unterzogen.
  • Wie in 11 dargestellt, betrug der LD50-Wert für Kokain in unbehandelten BALB/c-Mäusen 3 mg/kg bei intravenöser Verabreichung der Droge (i. v., 11b) und 20 mg/kg bei intraperitonealer Verabreichung (i. p., 11a). Eine Immunisierung von Mäusen mit dem Kokain-Protein-Konjugat veränderte den LD50-Wert signifikant. Die für die halbmaximale Toxizität erforderlichen Dosen betrugen 4,5 mg/kg und 35 mg/kg für die intravenöse bzw. intraperitoneale Verabreichung. Diese Dosen unterschieden sich signifikant von dem Wert, der sich bei den unbehandelten Mäusen ergab (p = 0,048 für i. v. und p = 0,014 für i. p., Cochran-Mantel-Haenszel-Chi-Quadrat-Test). Der nahezu 2-fache Schutz in Bezug auf eine hohe akute Toxizitätsdosis durch die Kokain-Impfung erweist sich als günstig im Vergleich mit einigen Drogen, die die Kokain-Pharmakologie beeinflussen. Beispielsweise erhöhte der NMDA-Antagonist MK-801 den LD50-Wert auf das 1,3-fache und auf das 1,4-fache bei Kombination mit Propranolol (Itzhak et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., Bd. 262 (1992), S. 464-467). Ferner verlängerte eine Impfung in signifikanter Weise die Zeitspanne bis zum Eintritt des Todes von einem Mittelwert von 3,2 Minuten auf 5,4 Minuten bei intravenöser Verabreichung (p = 0,007, Wilcoxon-Doppelprobentest) und von 4,0 min auf 8,5 min bei intraperitonealer Verabreichung (p = 0,0003). Diese Untersuchung belegt, dass der Antikörper in vivo die physiologische Reaktion auf Kokain in hoher Dosis beeinflusste.
  • Beispiel 14
  • Unterscheidung zwischen Kokain und Kochsalzlösung beim Rattenmodell
  • Um die Stabilität und Reproduzierbarkeit dieses Systems zu belegen, wurden 8 Ratten darauf trainiert, zwischen intraperitonealen Injektionen von 10 mg/kg Kokain und Kochsalzlösung unter Anwendung eines Doppelhebelverfahrens zu unterscheiden (Kantak et al. J. Pharmacol. Exp. Therap., Bd. 274 (1995), 5. 657-665). Nach Injektion von Kokain mussten die Tiere einen der Hebel (Drogen-Hebel) 10-mal drücken (FR 10), um ein Futterpellet zu erhalten. Bei Injektion von Kochsalzlösung mussten sie den anderen Hebei (Kochsalzlösung-Hebel) 10-mal drücken, um ein Futterpellet zu erhalten. Nachdem die Tiere gelernt hatten, Kokain von Kochsalzlösung zu unterscheiden, erfolgten mindestens 90% der gesamten Reaktionen an mehreren folgenden Tagen am richtigen Hebel. Um während späterer Substitutionstestsitzungen ein kumulatives Dosierungsverfahren einzubauen, werden Trainingssitzungen aus mehreren Komponenten zusammengesetzt, die jeweils 10 Minuten oder bis zur Beendigung von 10 FRs (je nachdem was zuerst eintrat) dauerten.
  • In Anschluss an das Training wurden Substitutionstestsitzungen mit verschiedenen Dosen an Kokain (0,3-17,8 mg/kg) 2-mal wöchentlich durchgeführt, wobei Trainingssitzungen an den dazwischen liegenden Tagen vorgenommen wurden. Die Drogen-Substitutionstestsitzungen bestanden aus vier 10-minütigen Komponenten, denen jeweils eine 15-minütige Auszeit vorherging. Während der Substitutionstests wurde nach Beendigung von 10 Reaktionen an jedem der Hebel ein Futterpellet geliefert. Zunehmende Dosen an Kokain wurden zu Beginn der jeweils vier Auszeitperioden injiziert. Überlappende Bereiche von kumulativen Dosen wurden an unterschiedlichen Testtagen untersucht, was es ermöglichte, in einer einzigen Woche eine aus 7 Punkten bestehende kumulative Dosis-Reaktions-Kurve aufzustellen.
  • Bei den Substitutionstests erhöhte Kokain die dosisabhängige Steigerung der prozentualen richtigen Reaktionen auf Kokain, was zu einer vollständigen Substitution (> 90% richtige Reaktionen auf Kokain) für alle Subjekte nach Verabreichung von Dosen führte, die zumindest auf der Höhe der Trainingsdosis lagen. Die einzelnen Datenpunkte beruhten auf 2 bis 3 Bestimmungen an einzelnen Subjekten. Der ED50-Wert (±95% C.I.) für richtige Kokain-Reaktionen betrug 2,14 ± 0,20 mg/kg, was im Vergleich mit dem Wert bei Ratten günstig war, die so trainiert waren, dass sie zwischen Injektionen von 10 mg/kg Kokain unter Verwendung einer einzelnen Komponente und Einzeldosierungsverfahren unterscheiden konnten (2,6 ± 0,29 mg/kg (Kantak et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. (1994) (in der Prüfungsphase)).
  • Beispiel 15
  • Tests zum Nachweis der Funktionsaktivität von CTB
  • Um die funktionelle Aktivität von CTB allein zu testen, wurden zwei Tests entwickelt. Zunächst wurde die Bindung von CTB an Zellen durch Fließzytometrie gemessen. Die Zellen wurden mit CTB und anschließend mit einem handelsüblichen anti-CTB-Ziegen-Antiserum und mit sekundärem anti-Ziegen-Antikörper, der mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert war, inkubiert (13). Natives, pentameres CTB ging eine Bindung mit den Zellen ein und verursachte eine drastische Verschiebung der Fluoreszenzintensität. Monomeres CTB war bei diesem Test nicht zur Bindung an Zellen befähigt. Zweitens wurde ein ELISA-Test entwickelt, um die Fähigkeit des CTB zur Bindung an Gangliosid GM 1 zu messen. ELISA-Platten wurden mit GM1-Gangliosid beschichtet und mit verschiedenen CTB-Konzentrationen inkubiert. Die Bindung wurde unter Verwendung eines anti-CTB-Antikörpers (oder Kochsalzlösung als Kontrolle) unter anschließendem Zusatz eines enzymmarkierten zweiten Antikörpers und Entwicklung mit Substrat nachgewiesen. Dieser Test ergab eine quantitative und äußerst sichere Messung der Fähigkeit von pentamerem CTB zur Bindung an GM1-Ganglioside. Diese Tests werden zur Überwachung der funktionellen Aktivität von rekombinanten und haptenisierten CTB-Konjugaten vor in vivo-Experimenten herangezogen. Gleichermaßen zeigt 14a, dass die Konjugation nicht die Fähigkeit von CTB-spezifischen Antikörpern zur Erkennung des Konjugats beeinträchtigt. 14b zeigt, dass die konjugierten CTB-Moleküle, die zur Bindung an GM1 befähigt sind, auch durch kokainspezifische Antikörper gebunden werden können, was die Aufrechterhaltung der CTB-Aktivität durch haptenisiertes CTB zeigt.
  • Beispiel 16
  • Selbstverabreichungsmodell der Abhängigkeit und Einfluss des Impfstoffes
  • Bei Ratten lassen sich die verstärkenden Reizeigenschaften von Kokain in zuverlässiger Weise durch intravenöse Selbstverabreichungsverfahren untersuchen. Hier handelt es sich um ein direktes Modell der Abhängigkeit und des Drogen-Selbstverabreichungsverhaltens bei tierischen Subjekten, das eine positive Korrelation mit dem Missbrauch dieser Droge bei humanen Subjekten zeigt. Um den Einfluss des therapeutischen Impfstoffes zu prüfen, werden erwachsenen männlichen Ratten (Wistar, etwa 300 g) chronische Jugularvenenkatheter implantiert, wobei man sich der von Weeks (Meth. Psychobiol., Bd. 2 (1972), S. 115-168) beschriebenen allgemeinen Verfahren unter Anpassung gemäß Kantak et al. (Kantak et al, Pharm. Biochem. Behavior, Bd. 36 (1990) S. 9-12; Kantak et al. Psychopharm., Bd. 104 (1991), S. 527-535; und Kantak et al., Pharmacol. Biochem. Behav., Bd. 41 (1992), S. 415-423) bedient. Sämtliche Tiere werden individuell gehalten. Sie werden auf 80-85% ihres Körpergewichts bei freier Fütterung gehalten, um einen Vergleich mit den Drogen-Unterscheidungsexperimenten zu erleichtern. 1 Woche nach dem chirurgischen Eingriff steht eine 1,0 mg/kg/Infusion von Kokain als Trainingsdosis bei täglichen 2-stündigen Sitzungen bereit. Die Ratten führen typischerweise jede Stunde eine Selbstinfusion einer kumulativen Dosis von 10 mg/kg durch. Während der anfänglichen Trainingsphase führt jeder Hebeldruck zu einer Drogenabgabe. Die erforderliche Anzahl an Reaktionen zur Selbstinfusion von Kokain wird allmählich auf 5 (FR 5) erhöht und anschließend wird das FR 5: FI-5 min-Schema der Drogenabgabe eingeführt. Im Anschluss an eine mindestens 5-tägige stabile Reaktion wird eine Grundlinien-Kokain-Dosis-Reaktionskurve (0,1, 0,3, 0,56, 1,0 und 3,0 mg/kg/Infusion) bestimmt. Die einzelnen Dosen von Kokain sowie von Kochsalzlösung werden für einen Block von mindestens 5 Sitzungen und bis zu dem Zeitpunkt, an dem keine systematischen Aufwärts- oder Abwärtstrends der Reaktion beobachtet werden, geprüft. Die Daten werden als durchschnittliche Reaktionsgeschwindigkeiten über die letzten 2 Tage der einzelnen Sitzungsblöcke angegeben.
  • Im Anschluss an die Bestimmung der Grundlinien-Kokain-Dosis-Reaktionskurve bei 30 Ratten wird die Hälfte der Ratten mit dem optimalen Kokain-Träger-Konjugat und die andere Hälfte mit dem Träger allein immunisiert. Die Selbstverabreichungssitzungen werden unterbrochen, bis signifikante anti-Kokain-Antikörper-Titer erreicht sind, was 4 bis 6 Wochen dauern sollte. Den Ratten wird Blut aus der Schwanzvene entnommen, um sicherzustellen, dass sämtliche Ratten vergleichbare Titer an kokainspezifischen Antikörpern aufweisen. Im Anschluss an die Immunisierung werden die Ratten auf ihre Fähigkeit zur Reaktion auf Kokain getestet. Die Ratten haben freien Zugang zu variierenden Dosen an Kokain (0,3-3,0 mg/kg/Infusion) oder zu Kochsalzlösung in Blicken von 5 Tagen. Mit dem Träger allein immunisierte Kontrollratten kehren rasch zu ihrem Grundlinienmuster der Kokain-Selbstverabreichung zurück.
  • Anti-Kokain-Antikörper blockieren die stärkenden Wirkungen von Kokain. Gegebenenfalls werden Kokaindosen bis zu 30 mg/kg/Infusion geprüft, um festzustellen, wie stark der Schutz durch den Antikörper ist. Wenn der anti-Kokain-Antikörper partiell Kokain blockiert, benötigen die Ratten viel größere Dosen an Kokain, um die gewünschte physiologische Wirkung zu erreichen, und die durch Kokain aufrechterhaltenen Reaktionen werden unter einer Rechtsverschiebung in der Kokain-Dosis-Reaktionskurve wiederhergestellt. Wenn der polyklonale Kokain-Antikörper Kokain-Dosen bis zu 30 mg/kg/Infusion vollständig blockiert, so wird die Reaktion, die durch Kokain aufrechterhalten wird, nicht wiederhergestellt und die Kokain-Selbstverabreichung hört auf, wobei die Kokain-Dosis-Reaktionskurve flach in der Nähe des Nullniveaus ähnlich wie bei Kochsalzlösung verläuft.
  • Die Selbstverabreichung von Kokain kann auch durch passiv verabreichten anti-Kokain-Antikörper gehemmt werden. Monoklonaler anti-Kokain-Antikörper oder Kontroll-Antikörper wurde getrennten Gruppen von Ratten verabreicht. Die Tiere, die vorher auf einem FR5 : F15-Plan der Kokain-Verabreichung stabilisiert worden waren, beendeten ihre Selbstverabreichung von Kokain, wenn sie passiv mit anti-Kokain-Antikörpern behandelt wurden. Mit Kontroll-Antikörper behandelte Ratten behielten ihre Kokain-Selbstverabreichungsreaktionen bei.
  • Beispiel 17
  • Gemeinsame Behandlung mit anderen Arzneistoffen
  • Es wird ein Screening durchgeführt, um festzustellen, ob eine Pharmakotherapie mit Buprenorphin und/oder Desipramin die Aktivität des therapeutischen Impfstoffes verstärkt. Eine Verträglichkeit der Behandlung mit Buprenorphin und/oder Desipramin ist zu erwarten. Es ist möglich, dass die therapeutischen Mittel immunosuppressiv sind, so dass sie die Induktion einer anti-Kokain-Antikörperreaktion mit hohem Titer hemmen. Zur Prüfung dieser Möglichkeit werden Ratten mit dem Kokain-Träger-Konjugat in Gegenwart oder Abwesenheit von Buprenorphin oder Desipramin immunisiert. Der Antikörper-Titer wird zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Ein Arzneistoff, der sich signifikant immunosuppressiv verhält, wird als unverträgliche Therapie ausgeschlossen. Dieser Screening-Test wird für beliebige Arzneistoffe herangezogen, für die eine gemeinsame Behandlung in Betracht gezogen wird.
  • Wenn keine Immunosuppression ersichtlich ist, wird ein weiteres Screening durchgeführt, um festzustellen, ob die beiden Wege eine synergistische Wirkung zeigen. Im Anschluss an Training, Immunisierung und Test werden die Ratten einer zusätzlichen Bewertung in zwei Modellen in Gegenwart der Arzneistoffe unterzogen. Die Ratten erhalten die Arzneistoffe vor Sitzungen mit unterschiedlichen Dosen an Kokain. Anfängliche Experimente mit Ratten, die mit Kontrollträger immunisiert worden sind, werden durchgeführt, um eine Arzneistoffdosis zu wählen, die das Verhalten bei den Systemen der Selbstverabreichung oder der Drogenunterscheidung nicht vollständig beseitigt. Es wird angenommen, dass diese Basis etwa 5,6 mg/kg (-)-Buprenorphin oder 10 mg/kg Desipramin beträgt. Die Daten werden bewertet, um festzustellen, ob die Wirkung des therapeutischen Impfstoffes additiv mit der Behandlung mit Buprenorphin oder Desipramin auftritt.
  • Beispiel 18
  • Induktion der Schleimhaut-Reaktion
  • Von der B-Untereinheit von Cholera-Toxin (CTB) wurde gezeigt, dass sie in zahlreichen Systemen die Aktivität von intaktem Cholera-Toxin behält, einschließlich der Induktion einer Schleimhaut-Antikörper-Reaktion. Daher sollte dieser Träger eine starke anti-Kokain-IgA-Antikörper-Reaktion induzieren.
  • Ein wirksamer Weg um eine Immunreaktion im Atmungstrakt herbeizuführen, besteht in der direkten Abgabe eines Antigens an die entsprechenden Stellen. Das Antigen wird in Kochsalzlösung verabreicht, wobei CTB als sein eigenes Adjuvans wirkt. Um die Fähigkeit von CTB zur Herbeiführung einer mukosalen IgA-Reaktion zu bestätigen, werden anfängliche Experimente mit dem Träger allein durchgeführt. Mäuse werden auf zwei wegen mit 50 μg CTB oder Kokain-CTB-Konjugat behandelt: nasal oder intratracheal. Eine nasale Verabreichung stellt einen einfachen und üblichen Weg der Behandlung dar. Das Antigen wird auf jeden Nasenflügel einer leicht betäubten Maus aufgebracht, und zwar in einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Maus. 14 Tage nach der Behandlung erhalten die Mäuse eine Auffrischung nach dem gleichen Verfahren. Die nasale Verabreichung ist für die Anwendung beim Menschen leicht in Form eines Nasensprays anwendbar. Eine nasale Impfung wurde mit Erfolg mit lebenden Grippe-Impfstoffen durchgeführt (Walker et al., Vaccine, Bd. 12 (1994), S. 387-399).
  • Bei einer intratrachealen Immunisierung wird das Antigen direkt in den unteren Atmungstrakt gebracht, wodurch die Immunität in den Lungen verstärkt wird. Mäuse werden mit einem Cocktail aus Ketamin and Xylazin betäubt. Die Tiere werden auf einer Vorrichtung angebracht, die deren Mund offen hält und die Luftröhre freilegt. Die Luftröhre wird mit einer faseroptischen Lichtsonde sichtbar gemacht. Eine stumpfe Nr. 23-Nadel wird zur Abgabe von 50 μl der Lösung in die Lungen verwendet. 14 Tage nach der Behandlung erhalten die Mäuse eine Auffrischung nach der gleichen Vorgehensweise.
  • Die Tiere werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Auffrischung (14, 21, oder 28 Tage) durch Ersticken mit CO2 getötet. Nasale und bronchoalveoläre Spülflüssigkeiten werden gesammelt und auf IgA, das für das verabreichte Konjugat spezifisch ist, getestet. Die nasale Waschflüssigkeit wird durch 4-maliges Waschen der Nasenhöhle mit insgesamt 1 ml PBS gemäß (Tamura et al., Vaccine, Bd. 7 (1989), S. 257-262) gewonnen. Bronchoalveoläre Spülflüssigkeit wird durch chirurgisches Freilegen der Luftröhre, Injektion von 0,5 ml PBS in die Lungen und 3-maliges Spülen gemäß den Angaben von Nedrud et al. (J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 3484-3492) gewonnen. Im Anschluss an eine Zentrifugation zur Entfernung von Zellen werden die Proben auf antigenspezifisches IgA durch ELISA unter Verwendung eines zweiten IgA-spezifischen Antikörpers getestet. Kokainspezifisches IgG wird in den Nasen- und Lungenspülflüssigkeiten gemessen, da berichtet worden ist, dass IgG häufig in der Lunge sowohl nachweisbar als auch von Bedeutung ist (Cahill et al., FEMS Microbiol. Lett, Bd. 107 (1993), S. 211-216).
  • Die beiden Verabreichungswege werden direkt auf ihre Fähigkeit zur Induktion einer IgA-Reaktion sowohl in der Lungen- als auch in der Nasenspülflüssigkeit verglichen. Der jeweils wirksamste Verabreichungsweg wird bevorzugt und für die restlichen Experimente eingesetzt. Wenn die beiden Verabreichungswege eine vergleichbare Wirksamkeit aufweisen, wird die nasale Immunisierung aufgrund ihrer Einfachheit bevorzugt.
  • Für einen maximalen Schutz gegen Kokain können systemische IgG- und mukosale IgA-Reaktionen beide auf maximale Werte gebracht werden. Daher werden sowohl eine systemische Injektion mit dem Kokain-CTB-Konjugat in Alaun (oder einem anderen Adjuvans) als auch eine Schleimhautbehandlung mit dem Konjugat bevorzugt, um beide Bereiche wirksam zu behandeln. Drei Gruppen werden verglichen. Erstens werden Mäuse systemisch behandelt, wobei 14 Tage später eine Schleimhautbehandlung folgt. Zweitens werden die Mäuse zunächst einer Schleimhautbehandlung unterzogen, wonach 14 Tage später eine systemische Behandlung erfolgt. Drittens werden sie gleichzeitig sowohl systemisch als auch mukosal behandelt, wonach 14 Tage später eine identische Auffrischung erfolgt. Kontrollmäuse werden nur mukosal oder nur systemisch behandelt. In jedem Fall wird die Wirksamkeit der Behandlung durch Messung der IgG- und IgA-anti-Kokain-Antikörper-Titer bestimmt.
  • Als ein anfängliches Maß der in vivo-Wirksamkeit von mukosalen anti-Kokain-Antikörpern wird der LD50-Wert für mukosal verabreichtes Kokain gemessen. Variierende Dosen von Kokain werden betäubten Mäusen entweder intratracheal oder intranasal verabreicht. 3 Gruppen von Mäusen werden beim LD50-Experiment verglichen: unbehandelte Mäuse, Mäuse, die nur systemisch immunisiert wurden und Mäuse, die sowohl systemisch als auch mukosal immunisiert wurden. Die tatsächlichen LD50-Werte sämtlicher Gruppen werden möglicherweise durch die Betäubung verschoben (Tella et al., J. Pharm. Exper. Therap., Bd. 262 (1992), S. 936-946). Dieser Weg kann auch in einem nicht-humanen Primatenmodell für Kokain unter Verwendung einer gerauchten Kokain-Base eingeschlagen werden (Carroll et al., J. Pharm. Exper. Therap., Bd. 261 (1992), S. 26-37).
  • Beispiel 19
  • Immunogenizität von Kokain-CTB-Konjugaten
  • A. Definition der für die Immunogenizität erforderlichen Dosis
  • Die Immunogenizität von Kokain-CTB-Konjugaten wurde durch Immunisierung von Nagetieren mit Kokain-CTB, gegebenenfalls unter Auffrischung und durch Bestimmung der Antikörper-Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Die Antikörper-Konzentrationen wurden in einem antigenspezifischen ELISA-Test gemessen. Die Antikörper-Titer wurden als Reziprokwerte der Serumverdünnung, die 50% der maximalen Reaktion beim ELISA-Test ergaben, bestimmt und sind als geometrische Mittelwerte der Ergebnisse von 5 oder mehr Mäusen angegeben.
  • Zur Bestimmung des Bereiches der Antigendosis, die zur Induktion einer anti-Kokain-Antikörper-Reaktion erforderlich ist, wurden Mäuse entweder subkutan oder intramuskulär mit verschiedenen Dosen von Kokain-CTB-PS-5.53 immunisiert. Die Tiere erhielten am 23. und 59. Tag Auffrischungen. Eine Blutentnahme erfolgte am 71. Tag. Dosen von 3, 10 und 30 g induzierten bei intramuskulärer Verabreichung Titer des kokainspezifischen IgG von 18429, 29013 bzw. 22957. Bei subkutaner Immunisierung induzierten die gleichen Dosen spezifische Antikörper-Titer von 10097, 15136 und 21169. Diese Daten belegen, dass Kokain-CTB in wirksamer Weise im Bereich von 3 bis 30 g verwendet werden kann. Die Wirksamkeit von höheren und niedrigeren Dosen wird erwartet. Ähnliche Dosen sind auch bei Verwendung an Ratten wirksam. Der Fachmann kann diese Daten heranziehen, um optimale menschliche Dosen, die üblicherweise vergleichbar sind, festzustellen.
  • B. Immunisierung an Schleimhautoberflächen
  • Zur Erzeugung von optimalen Antikörper-Reaktionen in Schleimhautsekreten ist es üblicherweise erforderlich, eine Schleimhautoberfläche zu behandeln. Um festzustellen, ob CTB ein geeignetes Trägerprotein für die Induktion einer mukosalen Antikörper-Reaktion darstellt, wurden Mäuse intranasal oder intratracheal immunisiert. Die Verfahren zur intranasalen und intratrachealen Immunisierung sind in Beispiel 18 beschrieben. Eine intranasale Immunisierung mit Kokain-CTB induzierte signifikante Konzentrationen von zirkulierendem kokainspezifischem IgG, obgleich die Titer niedriger waren als im Anschluss an eine subkutane oder in tramuskuläre Immunisierung. Wie bei den in Teil A dieses Beispiels beschriebenen Verabreichungswegen induzierten Dosen von 3 bis 30 g Kokain-CTB alle signifikante Konzentrationen an kokainspezifischem Antikörper. Eine gleichzeitige Immunisierung auf subkutanem und intranasalem Wege induzierte Antikörper-Titer, die von den Titern, die durch subkutane Verabreichung allein induziert wurden, nicht unterscheidbar waren. Die Eignung des intratrachealen Immunisierungsweges wurde durch Immunisierung mit CTB allein bestimmt. Es wurde festgestellt, dass dieser Weg ebenfalls antigenspezifisches IgG im Serum induziert (in diesem Fall CTB-spezifisch). Diese Daten belegen, dass CTB zur Induktion einer systemischen, antigenspezifischen IgG-Reaktion im Anschluss an eine Immunisierung an einer Schleimhautoberfläche in Abwesenheit von jeglichem zugesetzten Adjuvans befähigt ist.
  • C. Induktion von kokainsspezifischen Antikörpern in Schleimhautsekreten
  • Um den Schutz gegen die abhängig machenden Eigenschaften von Kokain zu optimieren, ist es wünschenswert, die Konzentrationen an kokainspezifischem Antikörper an den Stellen der Kokain-Einwirkung (z. B. Nasen- und Lungenschleimhäute) sowie im Blut zu optimieren. Mäuse wurden intranasal oder subkutan mit 10 g Kokain-CTG immunisiert und erhielten nach 27 und 61 Tagen eine Auffrischungsimmunisierung auf die gleiche Weise. Die Tiere wurden am 78. Tag getötet. Bronchiale und nasale Waschflüssigkeiten wurden gemäß den Ausführungen in den vorstehenden Beispielen gewonnen und auf kokainspezifisches IgA und IgG getestet. Anti-Kokain-Antikörper waren sowohl in den nasalen als auch in den bronchialen Waschflüssigkeiten bei Anwendung beider Immunisierungsarten nachweisbar. Eine intranasale Immunisierung induzierte höhere Konzentrationen an antigenspezifischem IgA, während beide Verabreichungswege in Bezug auf eine Induzierung von anti-Kokain-IgG-Reaktionen in den Schleimhautsekreten vergleichbar waren. Vom intranasalen Verabreichungsweg wurde auch festgestellt, dass er am wirksamsten zur Induktion von antigenspezifischem IgA im Serum ist. Eine intratracheale Immunisierung mit CTB induzierte ebenfalls CTG-spezifisches IgA und IgG in den Atmungssekreten. Diese Daten belegen, dass CTB ein wirksames Trägerprotein für die Induktion einer antigenspezifischen Antikörper-Reaktion im Atmungstrakt darstellt.
  • D. Verwendung von Alaun als Adjuvans zur Immunisierung
  • Die Verwendung von Adjuvans erweist sich bei Immunisierungsvorgängen häufig als günstig. Um den Beitrag von Alaun zur Immunreaktion zu bestimmen, wurden Mäuse mit 10 g Kokain-CTB-PS-5.53 intraperitoneal in Kochsalzlösung oder nach Adsorption an Alaun immunisiert. Die Mäuse erhielt im nach 27 Tagen eine Auffrischungsimmunisierung gemäß der gleichen Vorgehensweise. Bei beiden Gruppen von Tieren wurden hohe Konzentrationen an kokainspezifischen Antikörpern nach 43 Tagen nachgewiesen (Titer von 14687 ohne Alaun bzw. 16775 mit Alaun). Eine Immunisierung mit Kokain-CTB, das an Alaun adsorbiert war, erwies sich auch als wirksam bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung. Daher ist die Verwendung von Alaun bei diesem Antigen akzeptabel.
  • E. Dauer der Antikörper-Reaktionen
  • Um festzustellen, ob die mit Kokain-CTB-PS-5.8 induzierten Antikörper-Reaktionen lange anhalten, wurden die Serum-Antikörper-Konzentrationen als Funktion der Zeit überwacht. Die im Abschnitt D dieses Beispiels beschriebenen Tiere wurden für eine Zeitspanne von 128 Tagen nach der Immunisierung überwacht. Zu diesem Zeitpunkt waren die Antikörper-Titer noch hoch, wobei sie vom Maximum am 43. Tag etwa auf die Hälfte abgefallen waren. Diese Daten belegen, dass die anti-Kokain-Antikörper-Reaktionen auf Kokain-CTB-Konjugat lange anhalten.
  • F. Relative Konzentrationen von anti-Hapten- und anti-Träger-Antikörper-Reaktionen
  • Eine Immunisierung mit Kokain-CTB induziert eine Antikörper-Reaktion sowohl gegen das Hapten (Kokain) als auch gegen den Träger (CTB). CTB ist ein sehr starkes Immunogen. Es ist möglich, dass die anti-CTB-Reaktion dominieren und verhindern könnte, dass die anti-Kokain-Reaktion sehr hohe Titer erreicht. Um festzustellen, ob es möglich war, differenziell die anti-Kokain und anti-CTB-Antikörper-Reaktion gegen CTB durch Veränderung des Immunisierungsschemas zu regulieren, wurde der folgende nichtbeschränkende Test durchgeführt. Mäuse wurden intramuskulär mit 30 g Kokain-CTB immunisiert und auf ihre Antikörper-Reaktion überwacht. Diese Immunisierung induzierte sowohl anti-Kokain- als auch anti-CTB-Antikörper mit dem relativen Verhältnis der Serum-IgG-Titer von 0,04. Im Gegensatz dazu wurde ein Verhältnis von 0,2 festgestellt, wenn die Mäuse mit 3 g Kokain-CTB immunisiert wurden. Diese Dosen von 3 g und 30 g erzeugen ähnliche Titer von 18429 bzw. 22957. Es ist wahrscheinlich, dass das Verhältnis von anti-Kokain-Antikörpern zu anti-CTB-Antikörpern auch durch andere Parameter des Immunisierungsschemas sowie durch die Eigenschaften des Konjugats selbst, z. B. den Grad der Haptenisierung, beeinflusst wird.
  • Beispiel 20
  • Direkte Bindung von Kokain durch Antikörper aus immunisierten Mäusen
  • Die Fähigkeit der Antikörper zur Bindung von freiem Kokain kann unter Verwendung von radioaktiv markiertem Kokain bestimmt werden. 3H-Kokain (1 Ci) wurde mit Serum aus normalen Mäusen (0,05 ml), mit Serum von Mäusen, die mit einem PS-5.4-Konjugat (konjugiert mit BSA) immunisiert waren (0,05 ml, Serumpool von 10 Mäusen), oder mit handelsüblichen monoklonalen anti-Kokain-Antikörpern (Gemisch aus zwei verschiedenen Antikörpern, jeweils 2 g) inkubiert (vergl. 10b). Mit Protein G beschichtete Kügelchen wurden bei der Inkubation mitgeführt, um den Fc-Bereich von Antikörper-Molekülen zu binden. 2 Stunden später wurden die Kügelchen durch Zentrifugation pelletisiert, 3-mal mit kaltem PBS gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Daten in 10b geben den Mittelwert und die Standardabweichungen von Doppelproben wieder. Diese Daten zeigen klar, dass das Immunserum zur Bindung von freiem Kokain befähigt ist, wobei die Affinität ausreichte, um das Ausfällen und Waschen des gebundenen Kokains zu ermöglichen. Dies ist der Beweis, dass diese Antikörper zur Bindung an Kokain und zu dessen Neutralisation im Kreislauf von Personen, die von Kokain abhängig sind, befähigt sind.
  • Beispiel 21
  • Spezifität von kokainspezifischen Antikörpern
  • Um die Spezifität der anti-Kokain-Antikörper, die durch den Kokain-Impfstoff induziert worden waren, zu analysieren, wurden Seren von Mäusen, die mit Kokain-CTB-Konjugat immunisiert worden waren, in einem kompetitiven ELISA-Test getestet. Eine Gruppe von Metaboliten von Kokain und verwandten Molekülen wurde in verschiedenen Konzentrationen getestet. Wenn die Antikörper eine hohe Affinität für den Metabolit aufwiesen, so waren niedrige Konzentrationen zu einer wirksamen Konkurrenz bei diesem Test befähigt. Die relative Reaktivität wird als IC50-Wert angegeben, d. h. die Konzentration des Inhibitors, die das ELISA-Signal um 50% senkt. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass die durch Immunisierung mit Kokain-BSA-PS-5.6 hervorgerufenen Antikörper sowohl Norkokain, den pharmakologisch aktiven Metaboliten von Kokain, als auch Kokaethylen, das wirksame Derivat von Kokain, das durch Umesterung im Anschluss an Alkoholkonsum entsteht, wirksam waren. Im Gegensatz dazu erkannten die Antikörper die pharmakologisch inaktiven Metaboliten Benzoylecgonin und Ecgoninmethylester nur in schwachem Umfang. Durch Kokain-BSA-PS-5.6 und Kokain-CTB-PS-5.53 induzierte Antikörper zeigten eine ähnliche Spezifität, was zeigt, dass das Trägerprotein die Spezifität der anti-Kokain-Antikörper nicht beeinflusst. Ein hochspezifischer monoklonaler Antikörper wurde aus einem mit Kokain-BSA immunisierten Tier gewonnen. Er zeigte ebenfalls eine sehr ähnliche Spezifität für Kokain und dessen aktive Metaboliten. Die Reaktivität dieses monoklonalen Antikörpers war gegenüber Kokain 2000-fach größer als gegenüber Benzoylecgonin.
  • Beispiel 22
  • Quantitative Bestimmung des kokainspezifischen Antikörpers
  • Ohne Beschränkung der Erfindung wird nachstehend ein Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung der Antigen-Bindungskapazität und der Affinität der antigenspezifischen Antikörper, die unter Verwendung des Kokain-Konjugat-Impfstoffes erhalten worden sind, beschrieben. Es wird die klassische immunochemische Technik der Gleichgewichtsdialyse herangezogen. Immunseren, die durch Immunisierung mit Kokain-BSA-PS-5.6 erzeugt worden waren, und Kontroll-Antiseren wurden in Dialysebeutel (Celluloseester, Molekulargewichtsgrenze 25000, Spectrum, Los Angeles, CA) eingebracht und bis zum Gleichgewichtszustand gegen ein großes Volumen mit verschiedenen Konzentrationen an 3H-Kokain in PBS dialysiert. Dies ermöglichte die Messung der Menge an Kokain, die an dem Antikörper gebunden war, und die Menge des ungebundenen Kokains. Die Daten wurden sowohl durch Auftragen der Menge an gebundenem Kokain als Funktion der Menge an gesamten Kokain als auch durch ein Scatchard-Diagramm (gebundenes gegen gebundenes/freies Antigen) analysiert. Erwartungsgemäß enthielten die Antiseren ein heterogenes Gemisch von Antikörpern mit Affinitäten im Bereich von 1 × 10–7 bis 1 × 10–10 M. Die gemessene Kokain-Bindungskapazität ging bis zu etwa 10 M, was eine Konzentration von antigenspezifischem Antikörper von etwa 0,7 mg/ml anzeigt. Daher kann eine Immunisierung mit Kokain-Konjugat-Impfstoff Antikörper mit einem Bereich von geeigneten Affinitäten und mit hohen Kokain-Bindungskapazitäten erzeugen, so dass ein wesentlicher Anteil des gesamten Antikörpers im Kreislauf mit Kokain reagieren und dieses neutralisieren kann.
  • Beispiel 23
  • Wirksam keit von kokainspezifischem Antikörper bei der in vivo-Hemmung der Kokain-Verteilung
  • A. Hemmung der Kokain-Verteilung im Gehirn
  • Um Veränderungen in der Kokain-Gewebeverteilung, die durch den kokainspezifischen Antikörper hervorgerufen wird, zu bestimmen, wurde die 3H-Kokain-Verteilung in mit PS-5.7-Kokain-BSA immunisierten Mäusen im Vergleich zu mit BSA-immunisierten Kontrollmäusen verfolgt. Immunisierte und kontrollimmunisierte Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von 0,5 mg/kg 3H-Kokain. 0,5 Minuten nach der Injektion wurde ihnen der Kopf abgetrennt. Hirn, Herz und Blut (Plasma) wurden für die anschließende Analyse von Gewebe und Plasma-Kokain-Konzentrationen entnommen. Blut wurde in Röhrchen gesammelt, die Natriumfluoridlösung zur Hemmung von Esterasen und EDTA zur Verhinderung der Gerinnung enthielten. Hirn-, Herz- und Plasmaproben wurden in Szintillationsfläschchen mit Gewebe-Solubilisator gegeben. Eine Verdauung der Proben erfolgte innerhalb von 3 Tagen bei Raumtemperatur. Die Proben wurden entfärbt. Ein Szintillationscocktail wurde zu jeder Probe gegeben. Zur Klärung der Proben wurde Eisessig zugefügt. Anschließend wurden die Proben in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Daten wurden auf ng/g oder ng/ml Gewebe umgerechnet. Die Kokain-Konzentration im Hirngewebe war 0,5 Minuten nach der Injektion erheblich niedriger (n = 10, p < 0,05; 636,1 ± 57,5 ng/g (Mittelwert ± Standardfehler) für mit Kokain-BSA immunisierte Mäuse im Vergleich zu 1052,2 ± 93,85 ng/g für mit BSA immunisierte Mäuse.
  • Mehrere Gruppen von Mäusen erhielten 2-mal eine intravenöse Injektion von 0,5 mg/kg Kokain, um die Fähigkeit des kokainspezifischen Antikörpers zur Hemmung der Verteilung von wiederholten Kokaindosen zu bestimmen. Nur die zweite Dosis von Kokain, die 10 Minuten nach der ersten Dosis verabreicht wurde, enthielt das 3H-Kokain. Der Antikörper hemmte die Verteilung der erneuten Kokain-Dosis im Hirngewebe in mit Kokain-BSA immunisierten Mäusen (443,6 ± 48,5 ng/g) im Vergleich zu mit BSA immunisierten Mäusen (948,9 ± 43,3 ng/g (n = 10, p < 0,001)). Somit war die Hemmung der Kokain-Verteilung nach der zweiten Kokain-Dosis ähnlich der Hemmung der Verteilung nach einer Dosis.
  • B. Hemmung der Ausbreitung auf Herzgewebe
  • Immunisierte und kontrollimmunisierte Mäuse wurden betäubt und erhielten eine intravenöse Injektion von 0,015 mg/kg 3H-Kokain. 0,5 Minuten nach der Injektion wurde ihnen der Kopf abgetrennt. Hirn-, Herz- und Blut-(Plasma)Proben wurden für eine anschließende Analyse der Kokain-Konzentration entnommen. Die Konzentration an Kokain im Herzgewebe von mit Kokain-BSA immunisierten Mäusen betrug 5,7 ± 0,78 ng/g und war signifikant niedriger als der Wert von Kontroll-BSA-Mäusen von 23,4 ± 4,6 ng/g (n = 5, p < 0,001). Die Hemmung der Kokain-Verteilung im Herzgewebe in mit Kokain immunisierten Mäusen entsprach der Hemmung der Kokain-Verteilung im Hirngewebe oder war größer als diese.
  • C. Hemmung der Kokain-Gewebeverteilung nach intranasaler Verabreichung
  • Die Wirkungen des kokainspezifischen Antikörpers nach intranasaler Kokain-Verabreichung wurden mit den Wirkungen nach intravenöser Kokain-Verabreichung verglichen. Bei der intranasalen Verabreichung unterscheidet sich die Kinetik der Verteilung von der der intravenösen Verabreichung. Immunisierte oder Kontrollmäuse wurden betäubt und erhielten eine intranasale Verabreichung von 1 mg/kg 3H-Kokain in 501 PBS. Die Kokain-Konzentrationen erreichten erst 2 bis 5 Minuten nach intranasaler Verabreichung den Peakwert, im Gegensatz zu 15 Sekunden nach intravenöser Verabreichung. Daher wurde den Mäusen 2 Minuten nach der Kokain-Injektion der Kopf abgetrennt. Hirn- und Blut (Plasma)-Proben wurde für die anschließende Analyse der Kokain-Konzentration entnommen. Beim Vergleich der intranasalen Kokain-Verabreichung mit der intravenösen Verabreichung stimmen die Gesamtkonzentrationen von Kokain im Hirn von Kontrollmäusen gut überein (1538 ng/g intranasal gegenüber 2260 ng/g intravenös).
  • Die Verteilung von Kokain im Gehirn nach intranasaler Kokain-Verabreichung wurde durch die Gegenwart von anti-Kokain Antikörper gehemmt. Eine signifikante Hemmung der Verteilung von Kokain im Gehirn wurde nach intranasaler Verabreichung von Kokain an Kokain-BSA-Immunmäuse (708,3 ± 82,8 ng/g) im Vergleich zu Kontrollmäusen (1538,1 ± 49,5 ng/g (n = 5, p < 0,0001)) festgestellt.
  • D. Antikörper-Titer
  • Mäuse mit verschiedenen Konzentrationen an kokainspezifischem Antikörper wurden verglichen, um festzustellen, wie der Antikörper-Titer den Hemmgrad der Kokain-Verteilung beeinflussen kann. Gruppen von immunisierten Mäusen erreichten bei dieser Untersuchung Titerwerte von 6000 bis 256000. 0,015 mg/kg 3H-Kokain wurden Mäusen mit einem niedrigen Titer (etwa 6000 bis 18000) oder einem hohen Titer (etwa 54000 bis 256000) an anti-Kokain-Antikörper verabreicht. 30 Sekunden nach der intravenösen Injektion wurde den Mäusen der Kopf abgetrennt. Hirn- und Blut (Plasma)-Proben wurden für die Analyse der Kokain-Verteilung entnommen.
  • Bei Mäusen mit hohen Antikörper-Titern war die Verteilung von Kokain im Gehirn in stark signifikanter Weise gehemmt (Kontrollmäuse: 26,1 ± 2,0 ng/g, mit Kokain immunisierte Mäuse: 8,9 ± 1,2 ng/g; n = 10, p < 0,0001). Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit niedrigen Titern eine verringerte Fähigkeit zur Hemmung der Verteilung im Gehirn (Kontrollmäuse: 24,4 ± 2,98 ng/g; mit Kokain immunisierte Mäuse: 15,7 ± 3,4 ng/g).
  • E. Kokain-Stoffwechsel
  • Um festzustellen, ob ein kokainspezifischer Antikörper den Kokain-Stoffwechsel in vivo verändert, wurden Kokain-Metaboliten im zeitlichen Verlauf in gegenüber Kokain immunen Mäusen und Kontrollmäusen analysiert. Die getesteten Plasmaproben wurden wie in den Tierversuchen, die gemäß Teil A dieses Beispiels beschreiben und durchgeführt wurden, erhalten. Der Zeitpunkt für den Test der Metabolitenzusammensetzung war 30 Minuten. Das Verfahren zur Vorbereitung des Plasmas für die Analyse ist vorstehend im Teil A beschrieben.
  • Aliquotmengen wurden von Plasmaproben entnommen und mit nicht-radioaktivem Kokain, Benzoylecgonin und Norkokain in der angegebenen Reihenfolge versetzt, um die Sichtbarmachung der Verbindungen im UV-Licht zu unterstützen. Proben wurden sodann auf Kieselgel-Dünnschichtplatten aufgesetzt. Es wurden zwei Laufmittelsysteme verwendet: Methanol, Chloroform und Triethylamin (3 : 1 : 0,1); und Essigsäureethylester, Methanol, Wasser und konzentriertes Ammoniak (85 : 10 : 3 : 1). Metaboliten wurden unter Bezugnahme auf Kontrollverbindungen, die auf den gleichen Platten liefen, identifiziert. Die Banden wurden von den Platten abgekratzt. Verbindungen mit 3H wurden durch Szintillationszählung nachgewiesen. Aus den erhaltenen Zählergebnissen wurden die Mengen an Kokain, Benzoylecgonin, Benzoesäure und Norkokain als prozentuale Anteile der Gesamtzählergebnisse ermittelt. Die gesamte Radioaktivität im Plasma wurde durch Szintillationszählung von Gesamtplasma bestimmt. Benzoesäure wird als Metabolit nachgewiesen, wenn Kokain zu Ecgoninmethylester und Benzoesäure abgebaut wird. Ihre Menge ist somit äquimolar zum Ecgoninmethylester-Metabolit.
  • Die anti-Kokain-Antikörper haben scheinbar keinen nachweisbaren Einfluss auf den in vivo-Kokain-Stoffwechsel. Nach 30 Minuten wurden folgende Metaboliten (angegeben als prozentuale Anteile der Gesamtmenge) gefunden:
    Metabolit Kokain-BSA-immun BSA-Kontrolle
    Kokain 19,66 ± 7,5 17,31 ± 3,7
    Norkokain 5,5 ± 0,93 3,6 ± 0,93
    Benzoesäure 47,51 ± 8,5 50,28 ± 4,4
    Benzoylecgonin 27,3 ± 0,6 29 ± 7,2
  • F. Verschwinden von Kokain aus Plasma
  • Um festzustellen, ob der kokainspezifische Antikörper die Geschwindigkeit des Verschwindens von Kokain aus dem Plasma verändert, wurden Plasmaproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Injektion von Kokain von mit Kokain-BSA immunisierten Tieren und von mit BSA immunisierten Tieren gewonnen und analysiert. Die immunisierten und kontrollimmunisierten Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von 1 mg/kg 3H-Kokain. Ihre Köpfe wurden 0,5, 5 oder 30 Minuten nach der Injektion abgetrennt. Hirn- und Blut (Plasma)-Proben wurden für die anschließende Analyse der Kokain-Konzentration in Hirn und Plasma, des prozentualen Anteils von an Antikörper gebundenem Kokain und für die dünnschichtchromatographische quantitative Bestimmung von Kokain und Kokain-Metaboliten im Plasma entnommen.
  • Plasma wurde gemäß dem vorstehenden Abschnitt E auf den prozentualen Anteil der gesamten Radioaktivität in Form von Kokain and etwaigen Metaboliten analysiert.
  • Plasmaproben wurden ferner auf ihre gesamte Radioaktivität analysiert. Die Geschwindigkeit des Verschwindens von Kokain aus dem Plasma von mit Kokain-BSA immunisierten Mäusen wurde mit der Geschwindigkeit des Verschwindens von Kokain aus mit BSA immunisierten Mäusen verglichen. Bei dieser Analyse wurde der kleine Anteil von Norkokain (weniger als 5%) zusammen mit Kokain berücksichtigt, da Norkokain ZNS-Aktivität aufweist und an Antikörper bindet. Dies verändert nicht die nachstehend beschriebenen Ergebnisse.
  • Kokain verschwindet aus dem Plasma beider Tiergruppen mit sehr ähnlichen Geschwindigkeiten. Zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten waren etwa 80% des Kokains aus dem Plasma beider Tiergruppen verschwunden. Das Verschwinden von Kokain im Plasma zu diesen Zeitpunkten nach der Injektion war sowohl auf die Wiederverteilung als auch auf den Stoffwechsel zurückzuführen. Obgleich Kokain in beiden Tiergruppen mit der gleichen Geschwindigkeit verschwindet, tritt zu sämtlichen Zeitpunkten mehr Kokain im Plasma von mit Kokain-BSA immunisierten Mäusen als im Plasma von mit BSA-immunisierten Mäusen auf. Die Anwesenheit von kokainspezifischem Antikörper veränderte nicht in nachweisbarer Weise die Dauer der Anwesenheit von Kokain.
  • G. Prozentualer Anteil von an Antikörper gebundenem Kokain
  • Die vorstehend dargelegte Hemmung der Verteilung ist möglich, wenn Kokain im gleichen Tier an Antikörper gebunden wird. Um den Grad der Bindung von Plasma-Kokain an Antikörper zu bestimmen, erhielten immunisierte und kontrollimmunisierte Mäuse eine intravenöse Injektion von 1 mg/kg 3H-Kokain. 0,5 Minuten nach der Injektion wurden ihre Köpfe abgetrennt. Blut (Plasma) wurde entnommen und Protein G-Kügelchen wurden zum Abfangen der Antikörper-Kokain-Komplexe verwendet. Protein G-Kügelchen wurden zu Plasma von Tieren mit 3H-Kokain-Injektion (mit NaF zur Hemmung des Kokain-Abbaus) gegeben und inkubiert. Nach Spülen wurden die Spülflüssigkeiten und die Kügelchen jeweils zu Szintillationsflüssigkeit gegeben. Das 3H-Kokain wurde durch Szintillationszählung nachgewiesen. Das gleiche Plasma wurde auf den Abbau von Kokain wie beim vorstehenden Stoffwechseltest (Teil E) analysiert. Da die nach Immunisierung mit Kokain-BSA erzeugten Antikörper an Kokain und an Norkokain binden, jedoch nicht an die anderen Hauptmetaboliten, wie in den Beispielen dargelegt, wurde die prozentuale Bindung auf der Grundlage der Menge von Kokain und Norkokain, die in der Plasmaprobe festgestellt wurde, berechnet.
  • Bei den Tieren, die mit Kokain-BSA immunisiert worden waren, waren durchschnittlich etwa 50% des Kokains in der Plasmaprobe an Antikörper gebunden. Im Vergleich dazu waren bei den mit BSA immunisierten Tieren nur 3% des Kokains an Antikörper gebunden. Der Wert von 3% stellt bei diesem Test den Hintergrundwert dar.
  • H. Kokain-CTB-Hapten-Träger ruft einen wirksamen Antikörper hervor
  • Kokain-CTB-PS-5.53 wurde Mäusen injiziert, um festzustellen, ob es möglich war, Antikörper hervorzurufen, die die Kokain-Verteilung verändern. CTB selbst wurde Gruppen von Kontrollmäusen injiziert. Die Mäuse erhielten nach Bedarf eine Auffrischung mit Kokain-CTB-PS-5.53 und -PS-5.70, bis die Antikörper-Titer etwa 54000 oder mehr erreicht hatten. Die Verfahren zur Immunisierung und zum Testen der Titer von kokainspezifischen Antikörpern sind in den Beispielen beschrieben. Mäuse mit kokainspezifischen Antikörper-Titern und Kontrollmäuse erhielten eine Injektion von 0,5 mg/kg 3H-Kokain. Ihre Köpfe wurden 30 Sekunden nach der Injektion abgetrennt. Gemäß Teil A dieses Beispiels wurden Hirngewebe und Plasma isoliert und auf den Gehalt an 3H-Kokain analysiert.
  • Der nach der Immunisierung mit Kokain-CTB erzeugte Antikörper hemmte die Verteilung von Kokain im Gehirn in signifikantem Maße. Bei mit Kokain-CTB immunisierten Mäusen fand sich im Vergleich zu den mit CTB immunisierten Mäusen signifikant weniger Kokain im Hirngewebe (678,8 ng/g, verglichen mit 885,4 ng/g, n = 6, p = 0,0004 beim zweiseitigen t-Test). Gleichermaßen wurde das Kokain im Plasma von Kokain-CTB-Mäusen in erheblich größerem Umfang als bei CTB-immunisierten Tieren zurückgehalten. Daher erweist sich Kokain-CTB als wirksam zur Erzeugung von Antikörpern, die die Verteilung von Kokain im Gehirn hemmen.
  • Beispiel 24
  • Passive Übertragung von durch Immunisierung erhaltenem Immunoglobulin bei Mäusen
  • Mäuse werden mit PS-5-CTB unter Anwendung der in den Beispielen beschriebenen optimalen Immunisierungsverfahren immunisiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird den Mäusen Blut entnommen. Die Titer an anti-Kokain-Antikörper werden durch ELISA bestimmt. Tiere mit Antikörper-Titern von etwa 54000 oder mehr werden durch Herzpunktur getötet und entblutet. Kontrollmäuse werden mit dem Trägerprotein allein immunisiert. Serum von mehreren Mäusen (mindestens 20) wird gepoolt. Die IgG-Fraktion wird durch Fällung mit Ammoniumsulfat isoliert. Nach einer Dialyse zur Entfernung von Ammoniumsulfat wird die Konzentration an kokainspezifischem Antikörper in der vereinigten Immunoglobulinfraktion quantitativ durch ELISA bestimmt. Variierende Mengen an Immunoglobulin werden intraperitoneal oder intravenös an unbehandelte Mäuse verabreicht. 24 Stunden später wird den Empfängermäusen Blut entnommen. Das Serum wird zur Bestimmung der Konzentration an kokainspezifischem Antikörper getestet. Unter Anwendung dieses Verfahrens wird die Menge an Antikörper, die zur Erzielung eines bestimmten Titers übertragen werden muss, bestimmt. Gruppen von Mäusen erhalten durch Immunisierung gebildetes Immunoglobulin und werden zu verschiedenen Zeitpunkten einer Blutentnahme unterworfen, um die Clearance-Rate des antigenspezifischen Antikörpers zu bestimmen. Weitere Gruppen von Mäusen werden mit radioaktiv markiertem Kokain gemäß den Angaben in den Beispielen behandelt und einer Messung der Kokain-Verteilung im Gehirn unterworfen.
  • Kontrollmäuse erhalten IgG aus mit Träger immunisierten Mäusen. Diese Experimente belegen die Fähigkeit von passiv übertragenem, durch Immunisierung erhaltenem Immunglobulin zur Hemmung des Eintritts von Kokain in das Gehirn.
  • Beispiel 25
  • Passive Übertragung von durch Immunisierung erhaltenem Immunoglobulin bei Menschen
  • Eine Gruppe von humanen Spender wird mit PS-5-CTB oder anderen erfindungsgemäßen Konjugaten unter Anwendung der in den Beispielen beschriebenen optimalen Immunisierungsverfahren immunisiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird den Spender durch Venenpunktur Blut entnommen. Die Titer von anti-Kokain-Antikörper werden durch ELISA bestimmt. Hyperimmunes Plasma von mehreren Spender wird vereinigt. Die IgG-Fraktion wird durch Alkoholfraktionierung in der Kälte isoliert. Das Antikörperpräparat wird entsprechend den Bedürfnissen für hyperimmune Antikörperpräparate zur menschlichen Verwendung gepuffert, stabilisiert, konserviert und standardisiert. Die Konzentration an anti-Kokain-Antikörper wird durch ELISA-Test oder andere auf Antikörpern beruhende Tests standardisiert.
  • Eine geeignete Dosis von gereinigtem Antikörper wird Patienten intramuskulär oder intravenös mit oder ohne den Kokain-CTB-Impfstoff, jedoch nicht an der gleichen anatomischen Stelle wie der Impfstoff, verabreicht. Die geeignete Dosis wird durch Testen der Serumkonzentrationen von Empfängern in einer überprüften Patientenpopulation durch ELISA oder einen anderen, auf Antikörper basierenden Test nach 24 Stunden oder einem anderen geeigneten Zeitpunkt nach der Injektion des hyperimmunen Antikörperpräparats und/oder durch Testen der Wirksamkeit verschiedener Dosen in Bezug auf die Hemmung der Kokain-Wirkungen ermittelt.
  • Das passiv übertragene Immunglobulin hemmt die Wirkungen von Kokain bei den Patienten. Der Einsatz von humanen Spender, polyklonalem Antikörper und die große Anzahl von Spender im Spenderpool begrenzt die Chance einer Immunreaktion durch die Patienten auf den übertragenen Antikörper. Dies belegt, dass das Kokain-CTB in einem Spenderpool Antikörper hervorruft, die zur passiven Immunisierung von Patienten gegen die Wirkungen von Kokain verwendet werden können.
  • Äquivalente
  • Der Fachmann erkennt oder kann feststellen, dass unter Anwendung routinemäßiger Experimente zahlreiche Äquivalente zu den spezifischen Substanzen und Verfahren, die hier beschrieben wurden, möglich sind. Derartige Äquivalente fallen unter den Umfang der Erfindung und sind durch die folgenden Ansprüche abgedeckt.

Claims (10)

  1. Verwendung eines therapeutischen Hapten-Träger-Konjugats, bestehend aus (a) mindestens einem von Nicotin abgeleiteten Hapten und (b) einem proteinhaltigen Träger, wobei der Träger mindestens ein T-Zell-Epitop enthält und von einem der Folgenden ausgewählt wird: Bakterienprodukten, viralen Fragmenten, Lektine, Malariaprotein-Antigen, synthetischem Multiantigen-Peptid und seinen Modifikationen, Analoga oder Derivaten; und Proteinallergenen und Derivaten, Fragmenten oder Analoga eines Allergens; wobei das besagte therapeutische Hapten-Träger-Konjugat in einem pharmazeutischen Präparat zur Behandlung von Drogenabhängigkeit im Menschen in einer Verwendung als Impfstoff bei den Probanden zur Bildung von Antinikotin-Antikörpern führen kann.
  2. Verwendung eines Hapten-Träger-Konjugats gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ein Bakteriotoxin-Derivat ist.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das besagte pharmazeutische Präparat eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz enthält.
  4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat mukosal verabreicht werden kann und Copolymer-Mikrotropfen, wahlweise aus Poly-(lactid-Coglycolid)-Copolymer, enthält.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat ein Präparat zur anhaltenden oder gezielten Abgabe ist.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat lyophiliert ist.
  7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat topisch verabreicht werden kann und wobei das Präparat wahlweise eine höhere Viskosität als Wasser aufweist.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat ein sprühbares Präparat in einer Sprühdose ist und wobei es wahlweise ein flüchtiges gasförmiges Treibmittel enthält.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte pharmazeutische Präparat ein Adjuvans enthält, wahlweise Aluminiumhydroxid.
  10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens zwei und bis zu 70 Haptene mit dem Proteinträger gepaart sind.
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