ES2287379T3 - Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. - Google Patents
Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2287379T3 ES2287379T3 ES03008324T ES03008324T ES2287379T3 ES 2287379 T3 ES2287379 T3 ES 2287379T3 ES 03008324 T ES03008324 T ES 03008324T ES 03008324 T ES03008324 T ES 03008324T ES 2287379 T3 ES2287379 T3 ES 2287379T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cocaine
- antibody
- conjugate
- hapten
- transporter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0013—Therapeutic immunisation against small organic molecules, e.g. cocaine, nicotine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/34—Tobacco-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/36—Opioid-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Addiction (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Utilización de: un conjugado terapéutico hapteno-transportador que comprende (a) al menos un hapteno derivado de la nicotina y (b) un transportador que contiene una proteína, cuyo transportador contiene al menos un epítopo de célula T y es seleccionado de: productos bacterianos, subunidades víricas, lectinas, antígeno de la proteína de la malaria, péptidos multi-antigénicos sintéticos y modificaciones, análogos y derivados de éstos, y alergenos proteicos y derivados, fragmentos y análogos de alergenos; siendo dicho conjugado terapéutico hapteno-transportador capaz de incitar anticuerpos antinicotina cuando se utiliza para la vacunación de sujetos; en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de drogadicción en un ser humano.
Description
Conjugados de
hapteno-transportador para usar en terapia del abuso
de drogas.
La presente invención se refiere al tratamiento
del abuso de drogas. Más específicamente, la presente invención
puede ser utilizada para el tratamiento del abuso de drogas
utilizando conjugados droga-hapteno transportadores
que inducen respuestas de anticuerpos y/o utilizando los anticuerpos
contra los conjugados droga-hapteno transportadores.
Toda la materia que se refiere a la cocaína se indica sólo para
fines comparativos mientras que el objeto de la invención está
definido en las reivindicaciones.
La frecuencia del uso y abuso de drogas en el
mundo, especialmente en los Estados Unidos, ha alcanzado niveles
epidémicos. Existen multitud de drogas, tanto legales como ilegales,
cuyo abuso se ha convertido en un problema público serio que afecta
a todos los estratos de la sociedad con unas consecuencias médicas y
sociales obvias. Algunos usuarios viven en una población con un
riesgo extremadamente alto asociado a la pobreza y a las actividades
ilegales. Otros usuarios, que pueden definirse a sí mismos como
usuarios recreacionales, también se encuentran en riesgo debido a
(a) propiedades de la(s) droga(s) que las hacen
adictivas, (b) la predisposición del usuario a convertirse en
usuario de gran cantidad o (c) una combinación de factores que
incluyen circunstancias personales, apuros económicos, entorno y
accesibilidad. El tratamiento adecuado del abuso de drogas,
incluyendo el abuso de varias drogas, requiere de programas de
intervención innovativos y creativos.
Una droga especialmente problemática es la
cocaína, un alcaloide derivado de las hojas de la planta de coca
(Erythroxylon coca). Únicamente en los Estados Unidos,
existen actualmente más de 5 millones de usuarios regulares de
cocaína de los cuales al menos 600.000 están clasificados como
adictos severos (Miller et al. (1989) N.Y. State J.
Med. pp. 390-395; y Carroll et al. (1994)
Pharm. News. 1:11-16). Dentro de esta
población, un número significativo de adictos está buscando terapia
activamente. Por ejemplo, en 1990, 380.000 personas buscaron
tratamiento médico para la adicción a la cocaína y este número se
encuentra en aumento. En ese momento, se estimó que 100.000
admisiones por año en urgencias implicaban la utilización de
cocaína. Los efectos cumulativos del crimen violento asociado a la
cocaína, la pérdida de productividad individual, y la muerte,
constituyen un problema internacional.
La ausencia de terapias eficaces para el
tratamiento de la adicción a la cocaína, sugiere de manera firme
que se deben desarrollar nuevas aproximaciones. Otros factores
adicionales que contribuyen a la falta de éxito de los programas de
tratamiento es la variación con el tiempo de los patrones del abuso
de la cocaína. En un artículo titulado "1994 Chemical Approaches
to the Treatment of Cocaine Abuse" (Carroll et al. (1994)
Pharm. News, Vol. 1, No. 2), Carroll et al. describen
que desde mediados de los años 80, la administración por vía
intravenosa y nasal de la sal clorhidrato (coke, snow, blow) y el
fumar base libre de cocaína (crack) se han convertido en rutas
comunes de administración, produciendo euforia y estimulación
psicomotora que dura 30-60 minutos. Al contrario
que otras drogas de abuso, la cocaína puede ser tomada en excesos
que duren varias horas. Este comportamiento lleva a la adicción, y
en algunos casos, a consecuencias tóxicas (Carroll et al.,
Pharma News, supra).
Solamente existen tratamientos muy limitados
para las drogas de abuso y no existe ningún tratamiento eficaz a
largo plazo para la adicción a la cocaína. Los tratamientos
incluyen, pero no están limitados a, asesoramiento asociado con la
administración de drogas que actúan como antagonistas de los
receptores de opiáceos o drogas que tratan de reducir el ansia
asociada con la drogadicción. Una aproximación al tratamiento es la
desintoxicación. Incluso remisiones temporales con mejoras físicas,
sociales y psicológicas concomitantes son preferibles a la
continuación de la aceleración progresiva del abuso y sus
consecuencias médicas e interpersonales adversas (Wilson et
al. en Harrison's Principle of Internal Medicine Vol. 2.
12ª Ed., McGraw-Hill (1991) pp.
2157-8). Más específicamente, las aproximaciones
farmacológicas al tratamiento del abuso de cocaína implican
generalmente la utilización de drogas antidepresivas, como la
desipramina o fluoxetina, que pueden ayudar en el manejo de los
aspectos psicológicos del abandono pero que, en general, no afectan
directamente a la fisiología de la cocaína. Aún más, su efectividad
varía mucho (Brooke et al. (1992) Drug Alcohol Depend.
31:37-43). En algunos estudios, la
desipramina reduce la administración propia (Tella (1994) College
on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; Mello et
al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther.
254:926-939; y Kleven et al. (1990)
Behavl. Pharmacol. 1:365-373), pero la
proporción de abstinencia después del tratamiento no supera el 70%
(Kosten (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr.
85). También se han utilizado drogas que potencian la transmisión
dopaminérgica, como la bromocriptina, pero los beneficios de estas
drogas están limitados en parte por su toxicidad (Taylor et
al. (1990) West. J. Med.
152:573-577). Se han utilizado también
drogas nuevas con el fin de reemplazar a la metadona en la adicción
opiácea, como la buprenorfina, basadas en la interferencia cruzada
con el sistema dopaminérgico, sin embargo sólo se encuentra
disponible una información limitada de estudios clínicos (Fudula
et al. (1991) NIDA Research Monograph,
105:587-588). Se ha descrito que la
buprenorfina disminuye la administración propia de cocaína (Carrol
et al. (1991) Psycopharmacology
106:439-446; Mello et al. (1989)
Science 245:859-862; y Mello et
al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther.
254:926-939); sin embargo, la proporción de
abstinencia a la cocaína después del tratamiento no supera
generalmente el 50% (Gastfried et al. (1994) College on
Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; y Schottenfeld
et al. (1993) Problems on Drug Dependence, NIDA Res.
Monogr. 311).
Las terapias utilizadas actualmente para tratar
a los adictos a la cocaína presentan al menos cuatro limitaciones
principales que dan lugar a una alta proporción de recidivismo.
Primera, y quizá la más importante, los eventos neuroquímicos que
contribuyen al abuso y adicción a la cocaína son complejos (Carroll
et al. (1994) supra.). Como resultado, las
aproximaciones que actúan solamente a nivel neurofarmacológico, como
la inhibición del transporte de dopamina, no parecen suficientes
para superar la adicción. Segunda, las drogas que se utilizan
actualmente en los tratamientos de adicción a la cocaína tienen
efectos secundarios significativos en ellas mismas, lo que limita
su utilidad. Tercera, el seguimiento de las terapias con drogas
entre la población de estos pacientes es problemático. Las terapias
actuales pueden requerir de visitas frecuentes al médico y/o
administración propia de drogas que curan la adicción de su hábito.
Al prevenir muchas de estas drogas la euforia asociada a la
cocaína, existe una falta de incentivo importante para tomarlas.
(Carroll, et al. (1994) supra.; Kosten et al.
(1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr.
132:85; Schottenfeld et al. (1993) Problems of Drug
Dependence, NIDA Res. Monogr. 132:311). Cuarta, debido
a las químicas complejas implicadas en las terapias farmacológicas,
muchas de ellas pueden no ser compatibles con otras terapias
actualmente en uso en los ensayos clínicos.
Se han sugerido en la literatura aproximaciones
y terapias de diagnóstico experimentales aunque todavía no se han
llevado a la práctica. Por ejemplo, se ha descrito la vacunación
como una aproximación terapéutica para la drogadicción. Bonese
et al. han investigado cambios en la administración propia de
heroína por un mono rhesus después de ser inmunizado contra la
morfina (Bonese et al. (1974) Nature
252:708-710). Bagasra et al. han
investigado la vacunación utilizando cocaína-KLH
para prevenir la adicción (Immunopharmacol. (1992)
23:173-179). Se inmunizaron ratas con un
conjugado cocaína-KLH lo que indujo algunos
anticuerpos anticocaína. Sin embargo, estos resultados están en
disputa (Gallacher (1994) Immunopharm.
27:79-81). Obviamente, si un conjugado tiene
que ser eficaz en un régimen terapéutico, debe ser capaz de incitar
los anticuerpos que puedan reconocer a la cocaína libre circulante
in vivo. Cerny (WO 92/03.163) describe una vacuna y un
inmunosuero contra las drogas. La vacuna comprende un hapteno unido
a una proteína transportadora con el fin de producir anticuerpos.
También se describe la producción de anticuerpos contra las drogas,
y la utilización de estos anticuerpos en la desintoxicación de una
persona que había tomado la droga.
Se ha descrito previamente la administración
pasiva de anticuerpos monoclonales para el tratamiento del abuso de
drogas (véase, Killian et al. (1978) Pharmacol. Biochem.
Behavior 9:347-352; Pentel et al.
(1991) Drug Met. Dispositions
19:24-28). En esta aproximación, se
administran pasivamente a animales anticuerpos preformados contra
drogas seleccionadas. Aunque estos datos demuestran la viabilidad de
las aproximaciones inmunológicas en la terapia de adicción, la
inmunización pasiva como estrategia terapéutica en los seres humanos
a largo plazo presenta numerosos inconvenientes. Primero, si los
anticuerpos que van a ser utilizados en la terapia pasiva proceden
de fuentes no humanas o son anticuerpos monoclonales, estas
preparaciones van a ser reconocidas como proteínas extrañas por el
paciente, y puede existir una rápida respuesta inmune contra los
anticuerpos extraños. Esta respuesta inmune puede neutralizar el
anticuerpo administrado pasivamente, bloqueando su eficacia y
reduciendo drásticamente el tiempo de la protección posterior.
Además, la readministración del mismo anticuerpo puede resultar
problemática, debido a una potencial inducción de una respuesta de
hipersensibilidad. Estos problemas pueden solucionarse por la
producción de inmunoglobulinas en donantes humanos inmunizados con
la vacuna. Esta aproximación se discute con más detalle en los
Ejemplos. Segundo, los anticuerpos administrados pasivamente son
eliminados rápidamente de la circulación. La vida media de un
determinado anticuerpo in vivo se encuentra entre 2,5 y 23
días, dependiendo del isotipo. De esta manera, cuando los
anticuerpos se administran pasivamente, en lugar de incitar
inmunización, presentan únicamente eficacia a corto plazo.
Otra aproximación inmunológica a la drogadicción
ha sido la utilización de un anticuerpo catalítico que es capaz de
ayudar en la hidrólisis de la cocaína en el paciente (Landry et
al. (1993) Science 259:1899-1901).
El anticuerpo catalítico se genera por inmunización de un animal
experimental con un análogo de estado de transición de la cocaína
unido a una proteína transportadora; se selecciona entonces un
anticuerpo monoclonal que presenta la actividad catalítica deseada.
Aunque esta aproximación es atractiva en teoría, también presenta
serios problemas. Los anticuerpos catalíticos deben ser
administrados pasivamente por lo que presentan todos los
inconvenientes de la terapia pasiva con anticuerpos. La inmunización
activa para generar un anticuerpo catalítico no es viable, porque
la actividad enzimática no es común entre anticuerpos producidos
frente a análogos de estados de transición, y la actividad no
parece ser detectable en preparaciones policlonales. Además, la
actividad semejante a la esterasa de estos anticuerpos catalíticos y
la naturaleza no controlada de la respuesta inmune activa en
individuos genéticamente diversos, hacen de ellos moléculas
potencialmente tóxicas, particularmente cuando son producidos en un
paciente humano.
Yugawa et al. (EP 0613.899 A2) sugieren
la utilización de un conjugado cocaína-proteína que
contenga un derivado de la cocaína para la producción de
anticuerpos para la detección de la cocaína o derivados de la
cocaína en una muestra de sangre. Las patentes Syva (Patentes de
EEUU No. 3.888.866, No. 4.123.431 y No. 4.197.237) describen
conjugados para producir anticuerpos contra la cocaína para
inmunoensayos. Se describen conjugados con BSA utilizando sales de
diazonio derivadas de benzoilecgonina y de cocaína. Los conjugados
se preparan utilizando derivados ésteres para-imino
de la cocaína y de la norcocaína para conjugar un transportador.
Biosite (WO 93/12.111) describe conjugados de cocaína utilizando la
posición para de un anillo de fenilo de varios derivados de la
cocaína que incrementan la estabilidad frente a hidrólisis al
introducir un enlace amida. Las patentes Strahilevitz (Patente de
EEUU No. 4.620.977; Patente de EEUU No. 4.813.924; Patente de EEUU
No. 4.834.973: y Patente de EEUU No. 5.037.645) describen la
utilización de conjugados de proteínas con sustancias endógenas y
drogas para el tratamiento de enfermedades, para prevenir la
dependencia de haptenos psicoactivos, así como para su uso en
inmunoensayos, inmunodiálisis e inmunoadsorción.
Sin embargo, no se ha desarrollado ninguna
terapia eficaz para la drogadicción, especialmente, para la adicción
a la cocaína. Existe, por lo tanto, una necesidad de desarrollar
una aproximación a largo plazo para el tratamiento de la
drogadicción, en particular para la adicción a la cocaína, que no
dependa totalmente del seguimiento y administración propia del
individuo adicto.
El objeto de la invención aparece definido en
las reivindicaciones.
La presente invención supera los inconvenientes
descritos anteriormente y proporciona métodos para el tratamiento
del abuso de drogas. Utilizando composiciones terapéuticas, en
particular conjugados hapteno-transportadores, la
presente invención induce una respuesta inmune contra las drogas en
el adicto en la forma de anticuerpos antidroga, que en una
exposición posterior a la droga en un individuo vacunado neutraliza
la droga por lo que los efectos farmacológicos esperados
disminuyen, si no se eliminan. La presente invención proporciona
una terapia para la drogadicción basada en la vacunación de sujetos
con un conjugado droga/hapteno-transportador. La
presente invención proporciona la utilización de un conjugado
terapéutico hapteno-transportador que comprende (a)
al menos un hapteno derivado de la nicotina y (b) un transportador
que contiene una proteína, cuyo transportador contiene al menos un
epítopo de célula T y es seleccionado de:
productos bacterianos, subunidades víricas,
lectinas, antígeno de la proteína de la malaria, péptidos
multi-antigénicos sintéticos y modificaciones,
análogos y derivados de éstos, y alergenos proteicos y derivados,
fragmentos y análogos de alergenos.
siendo dicho conjugado terapéutico
hapteno-transportador capaz de incitar anticuerpos
antinicotina cuando se utiliza para la vacunación de sujetos, en la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
drogadicción en un ser humano.
Las composiciones terapéuticas de la invención
constan al menos de un hapteno y al menos de un transportador que
contenga un epítopo de célula T que cuando se conjuga para formar el
conjugado hapteno-transportador es capaz de
estimular la producción de anticuerpos antihapteno. El hapteno puede
ser una droga o un derivado de una droga. Según la invención como
se reivindica, al menos un hapteno deriva de la nicotina. Cuando la
composición terapéutica que contiene el conjugado droga/hapteno
transportador se administra a un individuo adicto, se inducen
anticuerpos específicos antidroga contra la droga. Un régimen de
inmunización terapéutica induce y mantiene una titulación de
anticuerpos antidroga lo suficientemente alta como para que en cada
exposición posterior a la droga durante el periodo de protección
que proporciona la terapia, los anticuerpos antidroga neutralicen
una cantidad suficiente de droga con el fin de disminuir, si no
eliminar, el efecto farmacológico de la droga.
Estas y otras características, aspectos y
ventajas de la presente invención aparecerán más aparentes y mejor
explicados en relación con los dibujos siguientes, descripción, y
reivindicaciones adjuntas. Toda la materia que se refiere a la
cocaína se indica sólo para fines ilustrativos.
La Figura 1a es una representación esquemática
de la fórmula estructural de la cocaína.
La Figura 1b es un diagrama que representa
sitios de variabilidad cuando se prepara un conjugado de cocaína.
Los sitios de variabilidad se asignan arbitrariamente para designar
fácilmente el compuesto y los conjugados y no son necesariamente
sitios de reacción.
La Figura 2a es una representación de un número
de posibles "ramificaciones", marcadas arbitrariamente, de un
conjugado hapteno-transportador identificadas para
facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados
utilizados en la práctica de la presente invención.
La Figura 2b es una representación de un número
de posibles "ramificaciones", marcadas arbitrariamente, de un
conjugado hapteno-transportador identificadas para
facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados
utilizados en la práctica de la presente invención, donde Q' es un
transportador modificado que contiene un epítopo de célula T, como
por ejemplo un transportador de proteína modificado.
La Figura 3a es una representación de 6
conjugados de cocaína (PS-2, PS-3,
PS-4, PS-5, PS-6, y
PS-9) de la presente invención, donde Q es un
transportador que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo
un transportador de proteína o un transportador modificado que
contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador
de proteína modificado.
La Figura 3b es una representación de
"ramificaciones" en los sitios de variabilidad fuera del anillo
de tropano de la cocaína de los conjugados de cocaína e
intermediarios.
La Figura 4 es una representación de las
"ramificaciones" en los sitios de variabilidad fuera del anillo
de tropano en la Figura 1b de cuatro compuestos útiles en la
preparación de conjugados.
La Figura 5 es una representación de las
estructuras de cinco reactivos útiles en la práctica de la presente
invención.
La Figura 6 es una representación de las
estructuras de cuatro drogas de abuso alternativas apropiadas para
conjugación y administración.
La Figura 7 es un diagrama esquemático que
representa dos posibles reacciones de conjugación para la
preparación de un único conjugado de cocaína
(PS-5).
La Figura 8 es una representación de las
estructuras de "norcocaína succinilada" y "norcocaína
succinilada pre-activada".
La Figura 9a es un gráfico que muestra la
respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado
de cocaína (PS-5,1/,6 + CFA i.p.) de la presente
invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante
unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado
utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones
recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas
representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.
La Figura 9b es un gráfico que muestra la
respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado
de cocaína (PS-5,5 Alumbre i.p.) de la presente
invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante
unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado
utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones
recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas
representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.
La Figura 9c es un gráfico que muestra la
respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado
de cocaína (PS-9,2 + CFA i.p.) de la presente
invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante
unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado
utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones
recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas
representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.
La Figura 10a es un gráfico que demuestra que la
unión del antisuero al conjugado cocaína-proteína
puede equilibrarse utilizando cocaína libre.
La Figura 10b es un gráfico de barras que
muestra que el antisuero inmune puede unir
^{3}H-cocaína.
La Figura 11a es un gráfico de barras que
muestra que un conjugado cocaína-BSA preparado de
acuerdo con el método descrito en la presente memoria proporciona
una protección de dos veces utilizando una dosis alta de cocaína
DL_{50}.
La Figura 11b es otro gráfico de barras que
muestra que un conjugado cocaína-BSA preparado de
acuerdo con el método descrito en la presente memoria proporciona
una protección de dos veces utilizando una dosis alta de cocaína
DL_{50}.
La Figura 12a es un gel que muestra los pesos
moleculares relativos de la toxina B del cólera (CTB) nativa
(monómero y pentámero) y recombinante (monómero).
La Figura 12b es un gel que muestra la
estabilidad de los pentámeros CTB en un intervalo de pH de
3-9.
La Figura 12c es un dibujo de un gel de Western
Blot que muestra las fracciones de los picos CTBr#32 y CTBr#53 que
se obtuvieron por expresión periplasmática que dio lugar a CTB
pentámerica.
La Figura 13a es un gráfico que representa un
ELISA donde el anticuerpo antiCTB detecta la capacidad de CTBr de
unirse al gangliósido G_{M1} en la placa ELISA.
La Figura 13b es un escaneo que representa un
ensayo de unión de citometría de flujo en el que CTBr se une a
células eucariotas que expresan el gangliósido G_{M1}.
La Figura 14a es un gráfico que representa un
ELISA en el que se muestra que la CTB nativa y el conjugado
cocaína-CTB CTB-5,8
(PS-5,8 conjugado con CTB) son pentaméricos, en base
a su capacidad para unirse al gangliósido G_{M1}.
La Figura 14b es un gráfico que representa un
ELISA en el que CTB-5,8 (PS-5,8
conjugado con CTB) se une al gangliósido G_{M1} y el conjugado se
detecta con un anticuerpo monoclonal anticocaína
(antibenzoilecgonina).
La Figura 15 es una representación esquemática
de otra reacción útil en la preparación de conjugados de la
presente invención, en particular, del éster 3 benzoato aducto
4.
La Figura 16 es una representación esquemática
de la síntesis de un conjugado marcado con carbono 13.
La literatura de patentes y científica a la que
se refiere la presente memoria contienen la información que se
encuentra disponible para aquellas personas especializadas en el
tema.
La presente invención utiliza una terapia para
la drogadicción, basada en la vacunación de un individuo adicto con
un conjugado droga hapteno-transportador. Las
composiciones terapéuticas de la invención comprenden al menos un
hapteno y al menos un transportador que contenga un epítopo de
célula T que cuando se conjuga para formar el conjugado
hapteno-transportador es capaz de estimular la
producción de anticuerpos antihapteno. Cuando se utilice en la
presente memoria, el término "epítopo de célula T" se refiere
al elemento básico o a la unidad más pequeña de reconocimiento por
parte de un receptor de la célula T, donde el epítopo comprende
aminoácidos esenciales para el reconocimiento por el receptor. Las
secuencias de aminoácidos que mimetizan las de los epítopos de la
célula T y que modifican la respuesta alérgica a alergenos
proteicos, se encuentran en el ámbito de esta invención. Un
"péptido mimético" se puede definir como una estructura química
derivada de péptidos bioactivos que mimetiza las moléculas
naturales. El hapteno puede ser una droga o un derivado de droga.
Según la invención como se reivindica, al menos un hapteno deriva de
la nicotina. Cuando se administra la composición terapéutica que
contiene el hapteno/droga (o derivado) a un individuo adicto, se
producen anticuerpos antidroga específicos contra la droga. Un
régimen de inmunización terapéutica produce y mantiene titulaciones
de anticuerpos antidroga lo suficientemente altas, de manera que en
exposiciones posteriores a la droga los anticuerpos neutralizantes
se unen a una cantidad suficiente de la droga como para disminuir,
si no eliminar, los efectos farmacológicos de la droga. No se
esperan efectos secundarios por la administración terapéutica de la
presente invención. Por ejemplo, la droga de abuso es pequeña y
monovalente y por tanto no es capaz de entrecruzar el anticuerpo.
Por lo tanto, no se espera que se produzca la formación de complejos
inmunes y las patologías asociadas, después de la exposición a la
droga de abuso. Es, y se espera que sea, compatible con terapias
farmacológicas actuales y futuras. Es más, la neutralización
efectiva es de larga duración. Por ejemplo, se sabe que las
respuestas de neutralización de los anticuerpos contra patógenos
duran años. De acuerdo con esto, se espera que los anticuerpos
antidroga producidos en alta titulación utilizando la composición
terapéutica de la presente invención puedan ser mantenidos durante
largos periodos de tiempo y posiblemente, al menos durante un año.
Este efecto a largo plazo de la composición terapéutica, que reduce
los problemas del seguimiento, reduce el recidivismo que es un
problema de las terapias actuales.
Lo que sigue son términos que se utilizan en la
presente memoria, cuyas definiciones se proporcionan como
orientación. Cuando se utilice en la presente memoria
"hapteno", es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que
reacciona específicamente con un anticuerpo y que no es capaz de
producir una respuesta inmune por sí mismo pero que es inmunogénico
cuando forma un complejo con un transportador que contenga un
epítopo de célula T formando un conjugado
hapteno-transportador. Es más, el hapteno se
caracteriza por ser la porción que determina la especificidad del
conjugado hapteno-transportador, esto es, es capaz
de reaccionar con un anticuerpo específico del hapteno en su estado
libre. En un sujeto adicto no inmunizado, no se produce la formación
de anticuerpos frente al hapteno. La composición terapéutica se
utiliza para vacunar individuos que buscan tratamiento para su
adicción a las drogas. En la presente invención, el término hapteno
puede incluir el concepto de droga/hapteno más específico, como una
droga, un análogo de una parte de la droga, o un derivado de la
droga. La composición terapéutica, o vacuna antidroga terapéutica,
cuando se administra inicialmente da lugar a un "resultado deseado
perceptible". Inicialmente, el resultado deseado perceptible es
la producción de una alta titulación de anticuerpos antidroga
(aproximadamente 0,1 mg/ml a 1 mg/ml del anticuerpo específico en
suero). Sin embargo, la manipulación del régimen de dosis adecuado
para cada individuo da lugar y mantiene un efecto terapéutico
deseado y mantenido. El "efecto terapéutico deseado" es la
neutralización de una fracción suficiente de la droga de abuso libre
con anticuerpos específicos contra la droga después de una
posterior exposición a la droga, con el fin de reducir o eliminar
los efectos farmacológicos de la droga dentro de un tiempo de
terapia aceptable. La determinación del tiempo de terapia aceptable
en base al tiempo que se tarda en obtener una respuesta de
anticuerpo suficiente y al tiempo que se mantiene esta respuesta de
anticuerpo y la fracción suficiente de droga libre, puede hacerse
por una persona especializada en el tema, mediante el estudio de las
características del sujeto que va a ser inmunizado, la droga de
abuso que se va a neutralizar, así como la ruta de administración.
Utilizando éste y otros protocolos de vacunación como modelos, una
persona especializada en el tema esperaría que la inmunidad o el
periodo de protección durase varios meses, hasta más de un año.
"La inmunización pasiva" se describe como
la administración de o la exposición a un anticuerpo antidroga o a
un anticuerpo policlonal o a un fragmento de anticuerpo monoclonal
(como Fab, Fv, (Fab')_{2} o Fab') preparados utilizando
conjugados nuevos de la presente invención. Como se ha descrito
arriba, la inmunización pasiva de seres humanos con un anticuerpo
anticocaína puede resultar, como tratamiento único, menos eficaz que
la inmunización activa. La inmunización pasiva sería
particularmente útil como cotratamiento inicial y/o como
tratamiento complementario suplementario (por ejemplo, durante el
periodo de tiempo posterior a la administración inicial de vacuna
pero anterior a la producción de anticuerpos propios por el cuerpo)
o en situaciones graves para evitar la muerte (por ejemplo, cuando
se presente una persona con sobredosis de drogas). En algunas
situaciones, la terapia pasiva sola puede ser preferible, como
cuando el paciente está comprometido inmunológicamente o necesita
de un tratamiento rápido.
La composición terapéutica de la presente
invención, y más específicamente, la vacuna antidroga terapéutica,
es una composición que contiene al menos un conjugado
droga/hapteno-transportador capaz de incitar la
producción de una titulación suficientemente alta de anticuerpos
específicos contra la droga/hapteno como para que una posterior
exposición a la droga de los mencionados anticuerpos contra la
droga/hapteno sean capaces de reducir las propiedades adictivas de
la droga. La respuesta inmune esperada contra un conjugado
hapteno-transportador es la formación de
anticuerpos tanto antihapteno como antitransportador. El nivel
terapéutico se alcanza cuando se induce y se mantiene una cantidad
suficiente de anticuerpos específicos antidroga capaces de organizar
un ataque de neutralización de la droga introducida después de la
vacunación. Los regímenes terapéuticos de la presente invención
proporcionan el tiempo suficiente para la producción de anticuerpos
después de la vacunación inicial y de cualquier refuerzo. Es más,
la vacuna antidroga óptima contiene al menos un conjugado
droga/hapteno transportador que comprende una combinación óptima de
la droga como hapteno y de un transportador, de manera que la
producción de anticuerpos antidroga es capaz de alcanzar un nivel
terapéutico óptimo, esto es, permanecer a una titulación lo
suficientemente alta in vivo como para resistir una
exposición a la droga seleccionada en los meses posteriores. Más
particularmente, la titulación de anticuerpos permanece lo
suficientemente alta como para proporcionar una respuesta eficaz
después de una exposición posterior a la droga, durante
aproximadamente dos meses hasta aproximadamente un año o más
dependiendo del individuo, más habitualmente al menos tres meses.
Esta composición óptima consiste en un conjugado
hapteno-transportador, excipientes y, opcionalmente,
adyuvantes.
La vacunación inicial con la composición del
conjugado terapéutico hapteno-transportador de la
presente invención crea una alta titulación de los anticuerpos
específicos contra el hapteno in vivo. Resulta útil la
realización de ensayos periódicos del plasma de los sujetos
vacunados para determinar las dosis individuales eficaces. Los
niveles de titulación se elevan y se mantienen durante las dosis de
refuerzo periódicas. Se anticipa que esta terapia se utilizará en
combinación con programas de rehabilitación utilizados actualmente,
incluido el asesoramiento. Es más, las composiciones terapéuticas
de la presente invención pueden estar dirigidas a una sola droga, a
varias drogas simultáneamente o en sucesión y puede ser utilizada en
combinación con otras terapias. Por ejemplo, las composiciones del
conjugado terapéutico hapteno-transportador y los
métodos de la presente invención son utilizados sin interacciones
adversas en combinación con aproximaciones farmacológicas
convencionales y con la anteriormente descrita inmunización pasiva
"a corto plazo" e inmunización activa frente a estados de
transición para aumentar el efecto global de la terapia.
La composición del conjugado terapéutico
hapteno-transportador de la presente invención se
prepara por acoplamiento de una o más moléculas de hapteno a un
transportador que contiene proteína que comprende un epítopo de
célula T para obtener un conjugado
hapteno-transportador capaz de estimular a las
células T (inmunogénico) lo que da lugar a la proliferación de
células T y a una liberación característica de mediadores que
activan a las células B relevantes y que estimulan la producción de
anticuerpos específicos. Los anticuerpos de interés son aquellos
específicos para la porción de hapteno del conjugado
hapteno-transportador (también llamado complejo
hapteno-transportador). Se describen las
composiciones terapéuticas que contienen una combinación de
conjugados bien de la misma droga (inmunización cruzada) o de
múltiples drogas (coinmunización). Estas comezclas de conjugados de
múltiples drogas resultan particularmente útiles en el tratamiento
del abuso de varias drogas.
En la selección de una droga adecuada para
conjugación, una persona especializada en el tema seleccionará una
droga que sea capaz de producir una alta titulación de anticuerpos.
Sin embargo, si la molécula elegida es similar a las moléculas
endógenas del individuo, los anticuerpos producidos frente a esta
molécula reaccionarán de manera cruzada con varias moléculas
diferentes en el cuerpo dando lugar a un efecto no deseado. De esta
manera, la droga seleccionada como hapteno (droga/hapteno) debe ser
lo suficientemente extraña y de un tamaño suficiente como para
evitar la producción de anticuerpos frente a moléculas encontradas
habitualmente en el cuerpo humano. Por estos motivos, el alcohol,
por ejemplo, no sería adecuado para la terapia de la presente
invención. Los anticuerpos creados frente a la composición
terapéutica son muy específicos y son inducidos en una cantidad
suficiente como para neutralizar la droga tanto en el torrente
sanguíneo como en la mucosa o en ambos. Las drogas apropiadas para
la composición terapéutica (no presentadas en orden de importancia)
son:
Alucinógenos, por ejemplo mescalina y LSD;
Cannabinoides, por ejemplo THC;
Estimulantes, por ejemplo anfetaminas, cocaína,
fenmetrazina, metilfenidato;
Nicotina;
Depresivos, por ejemplo, no barbitúricos (por
ejemplo, bromuros, hidrato de cloral etc.), metacualona,
barbitúricos, diazepam, flurazepam, fenciclidina, y fluoxetina;
Opio y sus derivados, por ejemplo, heroína,
metadona, morfina, meperidina, codeína, pentazocina, y propoxifeno;
y
"Drogas de diseño" como el
"éxtasis".
La Figura 6 muestra la estructura de 6 drogas
apropiadas para la conjugación. Según la invención como se
reivindica, al menos un hapteno deriva de la nicotina.
El transportador de la presente invención, es
una molécula que contiene al menos un epítopo de célula T que es
capaz de estimular las células T del sujeto, que a su vez ayudan a
las células B a iniciar y mantener la producción de anticuerpos
contra fracciones del conjugado entero, incluyendo la porción
hapteno. De esta manera, como el transportador se selecciona porque
es inmunogénico, es de esperar una potente respuesta inmune a la
vacuna en una población diversa de pacientes. El transportador, como
el hapteno, debe ser lo suficientemente extraño como para producir
una respuesta inmune potente a la vacuna y para evitar el fenómeno
de supresión de la inducción del epítopo por el transportador. Una
aproximación conservadora, pero no imprescindible, es la
utilización de un transportador al que la mayoría de los pacientes
no hayan sido expuestos. Sin embargo, aunque se produzca la
supresión de la inducción del epítopo por el transportador, la
situación es manejable al haber sido superada por cambios en la
dosis (DiJohn et al. (1989) Lancet
1415-1418) y por otros cambios en el protocolo
(Etlinger et al. (1990) Science
249:423-425), incluyendo la utilización de
CTB (Stok et al. (1994) Vaccine
12:521-526). Aún más, los transportadores que
contienen un alto número de lisinas son particularmente apropiados
para la conjugación de acuerdo con los métodos de la presente
invención. Son numerosas las moléculas transportadoras apropiadas e
incluyen, pero no están limitadas a:
Toxinas bacterianas o productos, por ejemplo,
toxina B del cólera-(CTB), toxina de la difteria, toxoide del
tétanos, y toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa, toxina
shiga, exotoxina de pseudomonas;
Lectinas, por ejemplo, subunidad B de la ricina,
abrina y lectina de guisante dulce;
Fracciones subvirales, por ejemplo,
nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la
rabia (rabia RNP), virus de plantas (por ejemplo, TMV, virus de
mosaico de fréjol de vaca y coliflor), proteína de la nucleocápside
del virus de la estomatitis vesicular (VSV-N),
vectores del virus de la sífilis y vectores del virus del bosque
Semliki; Vehículos sintéticos, por ejemplo, péptidos
multi-antigénicos (MAP), microesferas;
Partículas semejantes a virus de levaduras
(VLPs);
Antígeno de la proteína de la malaria;
y otros como proteínas y péptidos y cualquier
modificación, derivados o análogos de las moléculas listadas
arriba.
Para determinar las características de los
transportadores apropiados, se llevaron a cabo experimentos
iniciales utilizando albúmina de suero bovino como proteína
transportadora. La proteína resultó perfecta en experimentos con
animales, al ser barata y contener un alto número de lisinas para la
conjugación. Sin embargo, resulta menos apropiada para la
vacunación en los seres humanos porque la producción de anticuerpos
antiBSA tiene el potencial de producir respuestas adversas. Así,
utilizando los resultados de estos experimentos, los criterios
descritos más arriba se aplicaron a un gran número de
transportadores potenciales. El resultado es la lista de
transportadores apropiados para la práctica de la presente invención
descrita arriba.
El transportador de una realización preferida es
una proteína o un péptido ramificado (por ejemplo, péptidos
multi-antigénicos (MAP)) o un péptido de una cadena
única. Un transportador perfecto es una proteína o péptido que no
se utiliza habitualmente en los procesos de vacunación del país en
el que se vaya a utilizar la terapia, evitando de esta manera el
potencial de "supresión de la inducción del epítopo por el
transportador". Por ejemplo, en los EEUU, donde la inmunización
estándar de los niños incluye difteria y tétanos, las proteínas
como el toxoide del tétanos y el toxoide de la difteria, si no se
modifican, resultan poco deseables como transportadores apropiados.
Además, la proteína transportadora no debe ser una proteína a la que
uno es tolerante. En los seres humanos, esto excluiría a la
albúmina de suero humano sin modificar. Además, muchas proteínas
alimenticias deben ser examinadas cuidadosamente antes de ser
utilizadas como transportadores. También en los seres humanos, la
albúmina de suero bovino sería poco deseable como transportador
debido a la presencia de bovino en la dieta de la mayoría de las
personas. Aún más, resulta altamente ventajoso que el transportador
tenga una inmunogenicidad/adyuvanticidad inherente. Se debe
conseguir un equilibrio entre el deseo de inmunogenicidad del
transportador y el deseo de maximizar el anticuerpo antihapteno. Aún
más, el transportador preferido debería ser capaz de producir tanto
una respuesta sistémica como una respuesta en el lugar de la
exposición. Esto resulta particularmente aplicable a la cocaína que
es administrada frecuentemente a través de las membranas mucosas.
La velocidad de la respuesta es especialmente crítica cuando la
cocaína se fuma. De acuerdo con esto, en el caso de la cocaína, un
transportador preferido produciría no solo una respuesta sistémica
sino también una respuesta de anticuerpo preexistente en la mucosa.
En dicha respuesta mucosal la reacción de los anticuerpos con la
cocaína ocurriría lo suficientemente rápida como para contrarrestar
a la droga antes de que ésta empiece a circular en el torrente
sanguíneo.
Un transportador perfecto, la toxina B del
cólera (CTB), es una subunidad proteica altamente inmunogénica
capaz de estimular respuestas de anticuerpos sistémicas y mucosales
(Lycke (1992) J. Immunol.
150:4810-4821; Holmgren et al. (1994)
Am. J. Trop. Med. Hyg. 50:42-54;
Silbart et al. (1988) J. Immun. Meth.
109:103-112; Katz et al. (1993)
Infection Immun. 61:1964-1971). Esta
respuesta combinada antihapteno IgA e IgG es altamente deseable
para bloquear a la cocaína que es administrada nasalmente o por
inhalación. Además, mediante ensayos clínicos con vacunas del
cólera, se ha demostrado que CTB es segura para ser utilizada en los
seres humanos (Holmgren et al., supra; Jertborn et
al. (1994) Vaccine 12:1078-1082:
"The Jordan Report, Accelerated Development of Vaccines"
1993., NIAID, 1993). Más aún, la mayoría de los adictos a la
cocaína en los EEUU, no se han expuesto al cólera y por lo tanto no
son inmunes a CTB.
Otros transportadores útiles incluyen aquellos
con capacidad para aumentar una respuesta mucosal, más
particularmente, la familia LTB de toxinas bacterianas,
nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la
rabia (rabia RNP), proteína de la nucleocápside del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-N), subunidades
recombinantes del virus de la sífilis, y péptidos
multi-antigénicos (MAP).
En otra realización, se utilizan como
transportadores varios fragmentos de péptidos derivados de proteínas
o análogos, de alergenos. Estos transportadores son elegidos porque
inducen una respuesta de célula T capaz de proporcionar ayuda a la
iniciación de la producción de anticuerpos antihapteno por las
células B. Ejemplos y métodos para producir proteínas y péptidos
alergénicos así como sus secuencias aparecen descritos en WO
95/27.786 publicado el 19 de Octubre de 1995.
Utilizando los métodos y las composiciones de la
presente invención, y más particularmente, las técnicas listadas en
los Ejemplos que aparecen más abajo, una persona especializada en el
tema puede unir la droga/hapteno seleccionado con el transportador
seleccionado para producir el conjugado
hapteno-transportador de la presente invención. Un
alergeno particularmente apropiado como transportador es
Cryptomeria japonica, más particularmente, Cry j 1
recombinante, cuya secuencia ha sido publicada con una pequeña
variación. Por lo tanto, el alergeno Cry j 1 cumple de
manera general uno de los criterios de un transportador apropiado,
esto es, un transportador al cual el sujeto no ha sido previamente
expuesto.
En una realización de la presente invención, los
anticuerpos inducidos por la composición terapéutica actúan en el
tiempo que tarda la droga en viajar desde los pulmones a través del
corazón hasta el cerebro. La capacidad de producir esta respuesta
de anticuerpos requiere de la selección cuidadosa de la molécula
transportadora.
La toxina del cólera es una enterotoxina
producida por Vibrio cholerae y consta de cinco subunidades B
idénticas teniendo cada subunidad un peso molecular de 11,6 KDa
(103 aminoácidos) y una subunidad A de 27,2 KDa (230 aminoácidos)
(Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path.
85-102). La subunidad de unión, CTB, se une al
gangliósido G_{M1} en la superficie celular (Sixma et al.
(1991) Nature 351:371-375; Orlandi
et al. (1993) J. Biol. Chem.
268:17038-17044). CTA es la subunidad
enzimática que entra en la célula y cataliza la
ADP-ribosilación de una proteína G, activando de
manera constitutiva la adenilato ciclasa (Finkelstein (1988)
Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. pp.
85-102). En ausencia de la subunidad A, la toxina
del cólera no es tóxica.
Otros autores han descrito la producción de
altos niveles de la expresión recombinante de pentámeros CTB (L'hoir
et al. (1990) Gene 89:47-52;
Slos et al. (1994) Protein Exp. Purif.
5:518-526). Aunque la CTB nativa se
encuentra disponible comercialmente, aparece contaminada
frecuentemente con CTA (aproximadamente un 0,1%). Por este motivo,
la CTB recombinante ha sido expresada en E. coli y se han
desarrollado ensayos para su caracterización. La construcción
coleragenoide se adquirió de la American Type Culture Collection
(conforme a la Patente de EEUU 4.666.837). La CTB recombinante se
clonó del vector original (pRIT10810) en un plásmido de expresión
(pET11d, Novagen) con una secuencia N-terminal extra
que contenía un marcador His6 y fue expresada en E. coli en
una cantidad de hasta 25 mg/litro de cultivo. La proteína se
purificó a través de una columna de Ni^{2+} utilizando técnicas
estándar y se analizó mediante SDS-PAGE (véanse las
Figuras 12a, b y c). La CTB recombinante es monomérica en este
ensayo y es mayor que el monómero CTB nativo debido a la extensión
N-terminal.
La CTB pentamérica recombinante fue producida
tanto en ausencia como en presencia del marcador His utilizando el
ADNc modificado por PCR para incluir la secuencia líder Pel
b. Se insertó un codón de parada en el
C-terminal para eliminar el marcador His. Ambas
construcciones se expresaron en E. coli del vector pET22b
(Novagen). La proteína marcada en His se purificó mediante
cromatografía de afinidad Ni^{2+}, como se ha descrito más arriba
(13 mg/L). La CTB recombinante sin marcar se purificó por
cromatografía de afinidad con el gangliósido G_{M1} como se ha
descrito (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem.
113:249-258). Se demostró que el pentámero
recombinante de la CTB se unía al gangliósido G_{M1} en un ELISA y
que reaccionaba con anticuerpos específicos de pentámero en Western
blots y en ELISA. La CTB recombinante puede ser obtenida también de
otras fuentes.
La estructura pentamérica de la CTB puede ser
preferida para la unión al gangliósido G_{M1}. El pentámero es
estable frente al SDS si las muestras no son hervidas, permitiendo
que la pentamerización sea evaluada por SDS-PAGE.
El gel de la Figura 12b demuestra que la CTB nativa es un pentámero
y que es fácilmente distinguible de la CTB monomérica
desnaturalizada. La estructura pentamérica se mantiene en un
intervalo de pH de 4 a 9 (véase la Figura 12b), lo que facilita una
gran variación de químicas conjugacionales. La CTB recombinante
expresada inicialmente es monomérica. Una manera de obtener CTB
pentamérica es haciendo ajustes para expresar la CTB pentamérica
apropiadamente plegada. Se ha visto que la expresión citoplasmática
proporciona unos niveles de CTB monomérica mucho mayores. Una
persona especializada en el tema conoce métodos para el plegamiento
de la CTB monomérica en CTB pentamérica (véase, por ejemplo L'hoir
et al. (1990) Gene 89:47-52).
Una alternativa al replegamiento de la CTB monomérica para obtener
la CTB pentamérica es la expresión periplasmática que resulta en
una CTB pentamérica recombinante capaz de unir gangliósido G_{M1}
por ELISA, las Figuras 13a y 13b muestran los datos que apoyan esta
afirmación. Una persona especializada en el tema descubrirá que se
han descrito numerosas aproximaciones para la obtención de CTB
pentamérica recombinante, incluyendo la expresión periplasmática
al. (1993) BioTechnol. 11:1574-1578) o
con replegamiento post-translacional (L'hoir et
al., supra; con un líder (Slos et al.,
supra; Sandez et al. (1989) Proc. Natl. Acad.
Sci. 86:481-485; Lebens et Jobling et
al. (1991) Mol. Microbiol.
5:1755-1767).
Otro transportador útil es la toxina del cólera
que proporciona una respuesta mucosal mayor que la de CTB. Se ha
descrito que la subunidad A activa desde un punto de vista
enzimático utilizada como adyuvante aumenta la actividad (Liang
et al. (1988) J. Immunol.
141:1495-1501; Wilson et al. (1993)
Vaccine 11:113-118; Snider et
al. (1994) J. Immunol. 153:647).
Un aspecto de conseguir el conjugado de la
presente invención implica modificar el hapteno lo suficiente como
para convertirlo en capaz de ser conjugado o unido a un
transportador manteniendo su estructura lo suficiente como para que
sea reconocido como el hapteno en estado libre (por ejemplo, como
cocaína libre). Resulta esencial que los individuos vacunados
tengan anticuerpos que reconozcan al hapteno libre (cocaína).
Experimentos de radioinmunoensayo y ensayos de ELISA de competición
(Figuras 10a y 10b), explicados con más detalle en los Ejemplos,
pueden medir las titulaciones del anticuerpo contra el hapteno
libre. Los anticuerpos de interés son anticuerpos específicos
contra el hapteno que, en algunas realizaciones, son anticuerpos
específicos contra la cocaína. Debe ser entendido que los
principios y métodos utilizados para describir las realizaciones
preferidas pueden aplicarse, partiendo de esta descripción, a un
amplio rango de conjugados hapteno-transportador
útiles en el tratamiento de numerosas adicciones a drogas y de
respuestas tóxicas.
Los conjugados
cocaína-transportador se derivan de la cocaína y de
los metabolitos de la cocaína, sobre todo derivados de la
norcocaína, benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina. La Figura
4 muestra una representación de la molécula de cocaína comparándola
con estas otras moléculas. En el caso de la norcocaína y del éster
metílico de ecgonina, los grupos funcionales amina secundaria y
alcohol secundario presentes en los dos compuestos respectivamente,
son modificados con el fin de proporcionar un anclaje químico que
permita la unión a una proteína transportadora. En el caso de la
benzoilecgonina, el ácido libre se utiliza directamente para la
unión a la proteína transportadora o se modifica con un anclaje para
permitir esta unión. La longitud y naturaleza del anclaje debe ser
tal que el hapteno sea desplazado a una distancia suficiente del
dominio del transportador como para permitir un reconocimiento
óptimo por los anticuerpos producidos contra él. La longitud del
anclaje se optimiza variando el número de grupos -CH_{2}- que se
encuentran estratégicamente situados en la "ramificación"
seleccionada del grupo que consiste
en:
en:
- CJ 0
- Q
- CJ 1
- (CH_{2})_{n}Q
- CJ 1,1
- CO_{2}Q
- CJ 1,2
- COQ
- CJ 2
- OCO(CH_{2})_{n}Q
- CJ 2,1
- OCOCH=Q
- CJ 2,2
- OCOCH(O)CH_{2}
- CJ 2,3
- OCO(CH_{2})_{n}CH(O)CH_{2}
- CJ 3
- CO(CH_{2})_{n}COQ
- CJ 3,1
- CO(CH_{2})_{n}CNQ
- CJ 4
- OCO(CH_{2})_{n}COQ
- CJ 4,1
- OCO(CH_{2})_{n}CNQ
- CJ 5
- CH_{2}OCO(CH_{2})_{n}COQ
- CJ 5,1
- CH_{2}OCO(CH_{2})_{n}CNQ
- CJ 6
- CONH(CH_{2})_{n}Q
- CJ 7
- Y(CH_{2})_{n}Q
- CJ 7,1
- CH_{2}Y(CH_{2})_{n}Q
- CJ 8
- OCOCH(OH)CH_{2}Q
- CJ 8,1
- OCO(CH_{2})_{n}CH(OH)CH_{2}Q
- CJ 9
- OCOC_{6}H_{5}
- CJ 10
- aparece en la Figura 2b
y que se muestran en las Figuras 2a y 2b de la
presente memoria. Respecto a las ramificaciones anteriores, n es un
número entero seleccionado entre aproximadamente 3 y aproximadamente
20, más particularmente de aproximadamente 3 a aproximadamente 6; Y
se selecciona preferentemente de un grupo que consiste en S, O, y
NH; y Q se selecciona preferentemente de un grupo que consiste
en:
- (1)
- -H
- (2)
- -OH
- (3)
- -CH_{2}
- (4)
- -CH_{3}
- (4a)
- -OCH_{3}
- (5)
- -COOH
- (6)
- halógeno
- (7)
- proteína o péptido transportador
- (8)
- proteína o péptido transportador modificados
- (9)
- ésteres activados, como éster 2-nitro-4-sulfofenilo y éster N-oxisuccinimidilo
- (10)
- grupos reactivos frente a transportadores o transportadores modificados, como anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianato, isotiocianato; u
- (11)
- otra "ramificación" identificada por su número de referencia "CJ".
El transportador que contiene el epítopo de
célula T (por ejemplo, una proteína o péptido transportador de la
presente invención) puede ser modificado para facilitar su
conjugación con el hapteno (por ejemplo, por tiolación) mediante
métodos conocidos por una persona especializada en el tema. Por
ejemplo, con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) o
por succinilación, etc. Para simplificar, (CH_{2})_{n}Q,
donde Q=H, puede ser referido como (CH_{3}), metilo o Me, sin
embargo, se entiende que se corresponde con el grupo según se
identifica en las "ramificaciones" que se muestran en las
Figuras 2a y b.
\vskip1.000000\baselineskip
En las abreviaturas de compuestos utilizados en
la presente memoria que se obtienen comercialmente se incluyen:
- BSA=
- Albúmina de suero bovino
- DCC=
- Diciclohexilcarbodiimida
- DMF=
- N,N-Dimetilformamida
- EDC (o EDAC)=
- Clorhidrato de N-Etil-N'-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida
- EDTA=
- Ácido etilendiamínico tetraacético, sal disódica
- HATU=
- Hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- NMM=
- N-Metilmorfolina
- HBTU=
- Hexafluorofosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- TNTU=
- Tetrafluoroborato de 2-(5-Norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- PyBroP®=
- Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio
- HOBt=
- N-Hidroxibenzotriazol
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La nomenclatura IUPAC para muchos de los
compuestos que se mencionan es:
Éster metílico del ácido
3-(Benzoiloxi)-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ácido
3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Éster metílico del ácido
3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Éster metílico del ácido
3-(Hidroxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
El grado de haptenación puede ser determinado
por absorción UV o análisis espectral de masas de tiempo de vuelo
(TOF). La Tabla 2 muestra que la haptenación se logró utilizando
numerosos conjugados (algunos con CTB como transportador)
producidos siguiendo los métodos descritos en la presente invención.
Los diferentes lotes lotes se indican por la adición de un decimal
a un número, por ejemplo, el lote 6 de PS-5 es
PS-5,6. Los conjugados
hapteno-transportador de la invención pueden ser
haptenados a diferentes grados utilizando los métodos descritos en
el Ejemplo 5, así como utilizando métodos de conjugación conocidos
por las personas especializadas en el tema, por ejemplo, diferentes
posibilidades de agentes activadores, diferentes tampones,
diferentes tiempos de reacción, etc. La cantidad de haptenación del
conjugado está sin embargo limitada por el número de grupos
nucleófilos que contenga el transportador.
Esta lista de conjugados no es limitante. Se han
producido otros conjugados con más de un hapteno acoplado al
transportador que contiene el epítopo de célula T. Preferentemente,
se acoplan de 1 a 100 haptenos al transportador que contiene el
epítopo de célula T. Más preferentemente, se acoplan de 1 a 70
haptenos al transportador que contiene el epítopo de célula T.
Los métodos para sintetizar los compuestos
PS-2, PS-3, PS-4,
PS-5 y PS-6 aparecen descritos en
los Ejemplos. Siguiendo los métodos descritos, por ejemplo
utilizando agentes activadores en condiciones acuosas, una persona
especializada en el tema puede sintetizar los compuestos
PS-10 a PS-26 (véase la Figura
3b(1) y (2)).
La hidrólisis del éster metílico de los
conjugados PS-2, PS-4 y
PS-5 da lugar a la producción de anticuerpos
específicos contra la benzoil ecgonina, convirtiendo de esta manera
el conjugado en esencialmente inactivo como vacuna terapéutica.
Para una conjugación óptima y para prevenir una hidrólisis extensiva
del éster metílico de la norcocaína succinilada y de los conjugados
PS-5, durante la conjugación el pH del tampón se
mantiene entre pH 7,6 y 7,8, con unos tiempos de reacción limitados
a 1,5 horas. Además, la purificación después de la conjugación del
conjugado PS-5 se lleva a cabo idealmente a pH 6,5
utilizando tampón succinato de sodio 20 mM.
Con el fin de evaluar la estabilidad del éster
metílico, se pueden utilizar técnicas tanto inmunológicas como
fisicoquímicas. Se ha generado un anticuerpo monoclonal específico
de la cocaína que puede discriminar entre cocaína y sus metabolitos
cuando se une a una proteína transportadora. La reactividad frente a
los metabolitos inactivos fue 2.000 veces menor que frente a la
cocaína. Se pueden generar anticuerpos monoclonales específicos
contra la benzoilecgonina utilizando una tecnología similar.
Cualquiera de los dos anticuerpos monoclonales o preferiblemente
los dos pueden utilizarse para determinar los niveles de conjugados
intactos e hidrolizados comparados con mezclas estándar. Esta
diferenciación depende de la reactividad relativa de cada anticuerpo
monoclonal frente al conjugado hidrolizado e intacto. En otra
realización, se puede sintetizar un análogo éster metílico de la
norcocaína succinilada enriquecido en carbono-13
(Figura 16). Cuando se conjuga con una proteína transportadora para
formar PS-5, se puede utilizar la espectroscopía de
resonancia magnética nuclear de carbono-13
(^{13}C NMR) para evaluar la presencia del éster metílico y como
el grupo metilo está enriquecido con el isótopo, la señal que
corresponde al éster metílico se distinguirá por encima de las
señales de proteína.
Se puede sintetizar un conjugado que contiene un
éster metílico marcado radiactivamente. Esto podría incluir un
análogo éster metílico de la norcocaína succinilada que contenga
carbono-14 o tritio. Cuando se conjuga con una
proteína transportadora para formar PS-5, la pérdida
de radiactividad con el tiempo de cualquiera de los dos análogos se
puede evaluar utilizando técnicas conocidas para una persona
especializada en el tema. La evaluación de la pérdida de
radiactividad indicará los niveles residuales del éster metílico
intacto.
El grupo éster benzoato de los conjugados
PS-5 es estable esencialmente en las condiciones de
conjugación y purificación, y por lo tanto no requiere de una
evaluación de la retención de su integridad estructural. Si, sin
embargo, se desea una biodisponibilidad incrementada se puede
incorporar en el conjugado un enlace amida u otro grupo estable
metabólicamente, conocidos para una persona especializada en el
tema. De manera similar, el éster metílico de los conjugados
PS-5 se puede estabilizar utilizando la ramificación
CJ6 donde Q=H, es decir, un enlace amida. Esta incorporación
incrementaría la estabilidad de los conjugados tanto in
vitro como in vivo.
Los compuestos PS-27 a
PS-50 se sintetizan a través de una serie de
reacciones que permiten una entrada nueva en la clase tropano de
alcaloides. Esta nueva ruta, implica una ciclación intermolecular
mediada por radicales libres tipo 1,6 dieno (March, Advanced
Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, (1992)
4ª ed., Wiley-Interscience, p. 744, y las
referencias citadas en ese trabajo). Los alcaloides tropano, en
particular la cocaína y sus análogos, han sido previamente
sintetizados; sin embargo, estas rutas están compuestas de
múltiples etapas y normalmente con la producción de un intermediario
(Wilstatter et al. (1923) Ann. Chem.
434:111-139; Tufariello et al. (1979)
J. Am. Chem. 101:2435-2442; Lewin
et al. (1987) J. Heterocyclic Chem.
24:19-21; y Simoni et al. (1993) J.
Med. Chem. 36:3975-3977). Aunque
limitados a la síntesis de derivados 3-ariltropano
Davies et al. (Patente de EEUU 5.262.428), sintetizaron
análogos de la cocaína por descomposición de vinildiazotanos en
presencia de pirroles para formar un anillo tropano que es seguido
de una adición Grignard para producir los análogos de la cocaína. En
esta realización alternativa, se sintetizan nuevos conjugados
cocaína-transportador con ramificaciones en
"sitios remotos". Cuando se utilice en la presente memoria los
"sitios remotos" se marcarán con C, D y E en la Figura 1. Estos
sitios presentan un especial reto para el químico debido a la
naturaleza del anillo de tropano y son posiciones especialmente
difíciles para "ramificaciones" necesarias para los conjugados
de la presente invención. Una realización, añade las
"ramificaciones" y por último construye el anillo de tropano.
Como aparece representado en la Figura 15, existe una adición nueva
en una sola etapa del radical 2 y la ciclación, a baja temperatura,
del compuesto general 1. El resultado estereoquímico se define por
la forma semejante a nave del intermediario 3 en el que la adición
del radical 2 se produce de manera ecuatorial a la posición 3
seguida del cierre del anillo mediante el mecanismo pronosticado lo
que da lugar al aducto 4 del éster 3-benzoato
(análogo de la cocaína). La orientación de C, D, E y CO_{2}R
vendrán predefinidas en 1.
Se ha desarrollado un amplio rango de compuestos
para facilitar el entrecruzamiento de proteínas/péptidos o la
conjugación de proteínas con moléculas derivatizadas, por ejemplo,
haptenos. Estos incluyen, pero no están limitados a, ésteres
activos derivados de ácidos carboxílicos (compuestos activados),
anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de
alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianatos e
isotiocianatos, que resultan conocidos para las personas
especializadas en el tema. Estos compuestos son capaces de formar
un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula de
proteína. Dependiendo del grupo activador, el grupo reactivo será
el grupo amino de un residuo de lisina en una molécula de proteína o
el grupo tiol en una proteína transportadora o una proteína
transportadora modificada que, cuando reacciona, resulta en la
formación de una enlace amida, amina, tioéter, amidina, urea o
tiourea. Una persona especializada en el tema, puede identificar
otros grupos activadores apropiados, por ejemplo, en textos de
referencia como Chemistry of Protein Conjugation and
Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc., Boca
Raton, FL). Idealmente, la conjugación se realiza a través de un
grupo amino de una lisina en la cadena lateral. La mayoría de los
reactivos reaccionan preferentemente con lisina. Un transportador
especialmente apropiado es CTB por tener 9 residuos de lisina por
monómero en su forma nativa. Para determinar si la CTB conjugada
retiene su estructura y actividad, se puede evaluar su unión al
gangliósido G_{M1}.
Distintos investigadores han expresado y
purificado cantidades de CTB recombinante que, una vez optimizado,
son producidas en grandes lotes de fermentación. Los procesos para
expresar y purificar proteínas recombinantes son conocidos en éste
ámbito, por ejemplo, USSN 07/807.529. CTB puede ser purificada, por
ejemplo, por cromatografía de afinidad (Tayor et al. (1981)
Eur. J. Biochem. 113:249-258), puede
ser conjugada con derivados de la cocaína, y el conjugado puede ser
entonces purificado adicionalmente. Se analiza la pureza de CTB
purificada y del conjugado resultante y el mantenimiento de la
estructura pentamérica de CTB. Las técnicas incluyen
SDS-PAGE, cromatografía de filtración en gel,
Western blotting, ELISA directo y de captura de G_{M1}, y ELISA de
competición con CTB biotinilada. El grado de haptenación se
determina por espectrometría de masas y por análisis del incremento
de la absorción UV que resulta de la presencia del hapteno. Tanto la
solubilidad como la estabilidad del conjugado se optimizan en la
preparación para la formulación a gran escala. Los detalles de
algunos de estos análisis aparecen en los Ejemplos.
Se han producido numerosos conjugados con
análogos de la cocaína y con BSA, HEL o CTB como proteína
transportadora. En la Figura 3a se muestran seis BSA, HEL o CTB
como proteína transportadora. Seis análogos de la cocaína
representativos se muestran en la Figura 3a. De estos seis,
PS-2, PS-4, PS-5,
PS-6 y PS-9 se conjugaron con BSA o
HEL, mientras que PS-5 se conjugó también con CTB
(véase la Tabla 2 más arriba).
Con el fin de variar el grado de haptenación, se
pueden adoptar aproximaciones alternativas. En una realización, el
transportador es haptenado con una construcción de cocaína
multivalente. Esta idea está basada en el concepto de péptidos
multi-antigénicos (MAP) (Lu et al. Mol.
Immunol. 28:623-630 (1991)). En este
sistema, los residuos de lisina muy ramificados son utilizados para
maximizar la densidad y valencia del hapteno. La premisa de esta
aproximación es que la respuesta inmune se incrementa si existen
múltiples copias del hapteno unido a la misma molécula de péptido o
proteína. Por lo tanto, se prepara un hapteno multivalente que
necesita unirse únicamente a uno o dos sitios del transportador CTB
pentamérico como se describe en la presente memoria. El núcleo de
este hapteno antigénico múltiple es un núcleo de polilisina
ramificado como sugiere Tam (Lu et al., supra). Se
conserva un anclaje químicamente reactivo por la inclusión de un
residuo de Cys protegido. Después de la haptenación de la cocaína
de todos los grupos amino disponibles, el grupo sulfhidrilo de Cys
se desprotege y aparece disponible para el acoplamiento con la
proteína que presente alguno o numerosos grupos de entrecruzamiento
específicos bifuncionales sulfhidril/amino (Yoshitake et al.
(1979) Eur. J. Biochem. 101:395-399.
Como núcleo se utiliza un número de estructuras
dendriméricas.
dendriméricas.
Cualquier adyuvante que no enmascare el efecto
del transportador se considera útil (véase, Edelman (1980) Rev.
Infect. Dis. 2:370-373). En experimentos
iniciales con el objetivo de demostrar la viabilidad de una vacuna
terapéutica frente a la adicción a la cocaína se utilizó el potente
adyuvante CFA (Figuras 9a y c). Sin embargo, CFA no es preferido en
los seres humanos. Un adyuvante útil que está actualmente permitido
para su uso en los seres humanos es el alumbre, incluyendo hidróxido
de aluminio (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, NJ) o
fosfato de aluminio (Spectrum). Típicamente, la vacuna se adsorbe en
el alumbre, que presenta una solubilidad muy limitada. Los datos
preliminares en el modelo murino sugieren que el alumbre es capaz
de incitar una respuesta potente de anticuerpo anticocaína (Figura
9b), y el adyuvante RBI también resulta apropiado.
La inmunización eficaz utilizando CTB como
proteína transportadora no requiere de un adyuvante potente. Como
se muestra en los Ejemplos, se indujeron respuestas con alta
titulación de anticuerpos anticocaína por inmunización con el
conjugado CTB-cocaína utilizando alumbre como
adyuvante o en ausencia de adyuvante añadido.
Las composiciones terapéuticas pueden contener
opcionalmente uno o más excipientes aceptables desde un punto de
vista farmacéutico que incluyen, pero no están limitados a, agua
estéril, disoluciones de sales como, disolución salina, fosfato
sódico, cloruro sódico, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales,
alcoholes bencílicos, polietilenglicol, gelatina, manitol,
carbohidratos, estearato de magnesio, parafina viscosa, ésteres de
ácidos grasos, hidroximetil celulosa y tampón. Las personas
especializadas en el tema pueden utilizar otros excipientes
apropiados. La composición terapéutica puede contener opcionalmente
al menos un agente auxiliar, por ejemplo, medio de dispersión,
envolturas, como lípidos y liposomas, surfactantes como agentes
humidificantes y emulsionantes, lubricantes, conservantes como
agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, estabilizantes y
otros agentes conocidos para personas especializadas en el tema. La
composición de la presente invención puede contener adyuvantes
adicionales, agentes y/o excipientes inertes aceptables desde un
punto de vista farmacéutico que pueden ser añadidos para
incrementar las propiedades terapéuticas del medicamento o para
permitir medios de administración alternativos.
Los conjugados
hapteno-transportador altamente purificados
producidos tal y como se discute arriba, pueden ser formulados en
composiciones terapéuticas de la invención adecuadas para terapia en
los seres humanos. Si una composición terapéutica de la invención
va a ser administrada por inyección (es decir, inyección
subcutánea), es preferible que el conjugado
hapteno-transportador altamente purificado sea
soluble en una solución acuosa a un pH aceptable desde un punto de
vista farmacéutico (es decir, en un intervalo de aproximadamente
4-9) de manera que la composición sea líquida y
permita una administración fácil. La composición también incluye
opcionalmente excipientes aceptables desde un punto de vista
farmacéutico, adyuvantes y agentes auxiliares o compuestos
suplementarios activos. Dependiendo del modo de administración, la
inclusión de ingredientes opcionales asegurará las propiedades
deseadas de la composición terapéutica, por ejemplo, fluidez
adecuada, prevención de la acción de microorganismos no deseados,
incremento de la biodisponibilidad o absorción prolongada.
Una composición terapéutica de la invención debe
ser estéril, estable en las condiciones de fabricación,
almacenamiento, distribución y uso, y debe ser preservada de la
acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. Con
el fin de mantener la integridad de la composición, una forma
preferida de fabricación de la composición terapéutica de la
invención es preparar la formulación del conjugado y del excipiente
farmacéutico de manera que la composición esté en la forma de un
polvo liofilizado que se reconstituya en excipientes o agentes
auxiliares, por ejemplo, agua estéril, justo antes de su
utilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de
soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de
preparación son secado en vacío, secado por liofilización o secado
por centrifugación que dan lugar a un polvo del ingrediente activo
además de cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una
disolución estéril previamente filtrada.
Los compuestos activos de la invención pueden
ser procesados de acuerdo con métodos convencionales de farmacia
galénica para la producción de composiciones terapéuticas que van a
ser administradas a pacientes, por ejemplo, mamíferos incluyendo
los seres humanos. Los medios preferidos de administración son
intranasal, intratraqueal, oral, dérmico, y/o inyección. Una
combinación particularmente apropiada de medios de administración
comprende una inyección inicial con dosis de refuerzo
intranasales.
Para aplicaciones parenterales, resultan
particularmente apropiadas las disoluciones estériles, inyectables,
preferentemente disoluciones aceitosas o disoluciones acuosas, así
como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo
supositorios. Las ampollas son convenientes para dosificaciones
unitarias. Para aplicaciones entéricas, resultan particularmente
apropiadas las pastillas, grageas, líquidos, gotas, supositorios, o
cápsulas. Se puede utilizar un jarabe, elixir o semejante cuando se
utilice un vehículo endulzado.
Se pueden formular composiciones de liberación
dirigida o sostenida, por ejemplo, liposomas o aquellas donde el
compuesto activo (conjugado) se protege con diferentes envolturas
degradables, por ejemplo, mediante microencapsulación, múltiples
envolturas, etc. También es posible liofilizar los nuevos compuestos
y utilizar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la
preparación de productos para inyección.
Para una aplicación tópica, se utilizan en forma
no pulverizable, en forma viscosa a semisólida o sólida que
contenga un transportador compatible con la aplicación tópica y que
tenga una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del
agua. Las formulaciones apropiadas incluyen, pero no están limitadas
a, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, etc.,
que son, si se desea, esterilizadas o mezcladas con el agente
auxiliar. Para una aplicación tópica son apropiadas las
preparaciones en aerosol pulverizables en las que el compuesto
activo, preferiblemente en combinación con un excipiente o agente
auxiliar apropiados, se empaqueta en una botella comprimida o se
mezcla con un propelente presurizado, volátil, normalmente
gaseoso.
Un anticuerpo producido utilizando la presente
invención puede tener un peso molecular que varía entre 150 KDa y
1.000 KDa. Si el sujeto se expuso a la cocaína libre después de la
vacunación con el conjugado optimizado en la composición
terapéutica, la cocaína libre será detectada por el o los
anticuerpos específicos de la cocaína. No se necesitan cambios en
la forma o estructura de la droga para que el anticuerpo reconozca a
la droga in vivo. Se piensa que después de la exposición de
un individuo vacunado a la cocaína, los anticuerpos antidroga
bloquearán los efectos de la cocaína. Se piensa que al menos tres
mecanismos contribuyen a la actividad bloqueante. Primero, los
anticuerpos no son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica.
Por lo tanto, se cree que la cocaína, cuando se una al anticuerpo
anticocaína, no cruzará la barrera hematoencefálica y no será capaz
de ejercer su efecto en los transportadores de dopamina. Segundo, el
anticuerpo impide que la droga se una a su receptor por un simple
bloqueo estérico. Se espera que este mecanismo sea operativo en el
bloqueo de algunos de los efectos de la cocaína no localizados en
el SNC (por ejemplo toxicidad cardiaca) y en la actividad de los
anticuerpos contra otras drogas que no tengan como blanco el SNC.
Tercero, la cocaína tiene una vida media relativamente corta in
vivo debido a hidrólisis enzimática y no enzimática, que dan
lugar a metabolitos inactivos. En particular, la cocaína es una
droga lo suficientemente pequeña como para no ser capaz de
entrecruzar anticuerpos, por lo que no se producirá la formación de
complejos inmunes.
En la práctica de la presente invención se
utilizan realizaciones de aplicaciones mucosales. Por ejemplo, se
utilizan microesferas de copolímero para incitar o incrementar una
respuesta inmune mucosal. Estas microesferas pequeñas y
biodegradables encapsulan y protegen al conjugado y facilitan su
captación por el sistema inmune mucosal. Aunque se utilizan
preferentemente para inmunización oral, también se ha descrito su
eficacia en la inmunización intranasal (Walker (1994)
Vaccine 12:387-399). Resultan
particularmente útiles para esta aplicación los polímeros inertes
como el poli(láctido-coglicolido) (PLG) de
diámetro 1-10 \muM (Holmgren et al. (1994)
Am. J. Trop. Med. Hyg. 50:42-54; Serva
(1994) Science 265:1522-1524).
Además de los conjugados preferidos, se lleva a
cabo una inmunización cruzada con diferentes conjugados con el fin
de minimizar la reactividad cruzada del anticuerpo. Se administran
conjugados a ratones, más particularmente los conjugados
PS-5 o PS-9, y se administran dosis
de refuerzo en el día 14 de los conjugados recíprocos
PS-9 o PS-5 acoplados al mismo
transportador, BSA. Únicamente se estimulará y expandirá el
subconjunto de células B secretoras de anticuerpos que reconozca a
los dos conjugados de cocaína. Se piensa que al diferenciarse los
dos conjugados en el punto de unión a la molécula de cocaína, la
especificidad del reconocimiento se ve incrementada. La
especificidad del antisuero inducido se confirma entonces por ELISA
de competición.
Aún más, las composiciones terapéuticas que
contienen más de un conjugado estimulan la producción de anticuerpos
policlonales aumentando de esta manera la respuesta de anticuerpo
en una exposición posterior.
Se sabe que las respuestas de neutralización de
los anticuerpos frente a patógenos duran años, y debería ser
posible alcanzar una respuesta de anticuerpo anticocaína con una
alta titulación que se mantenga durante al menos un año. Sería
posible, en base a los valores obtenidos con vacunas convencionales,
alcanzar las concentraciones de anticuerpo específico requeridas
para neutralizar las concentraciones de cocaína en plasma
(1-10 \muM); los datos farmacocinéticos en ratón,
descritos en los Ejemplos, demuestran claramente que se pueden
alcanzar concentraciones del anticuerpo neutralizante relevantes
desde un punto de vista fisiológico. Finalmente, la capacidad de
los anticuerpos maternales de cruzar la placenta en mujeres adictas
a la cocaína, protegiendo de esta manera al feto, representa un
efecto deseado adicional de la vacunación terapéutica de la cocaína.
La optimización de la terapia para que sea eficaz en una población
amplia supone un reto, por lo que las personas especializadas en el
tema valoran cuidadosamente varios factores con el fin de determinar
la dosis terapéutica apropiada. Aún más, las respuestas de
anticuerpo pueden ser evaluadas utilizando ELISAs específicos como
se describe en los Ejemplos, y otros ensayos basados en
anticuerpos.
La variación genética en las tasas de
eliminación, las interacciones con otras drogas, las alteraciones en
la eliminación y la distribución inducidas por enfermedades, y
otros factores combinados, dan lugar a un amplio espectro de
respuesta a los niveles de vacunación en pacientes a los que se
administra la misma dosis. Los indicadores clínicos ayudan en la
titulación de algunas drogas en el intervalo deseado, y ninguna
determinación química puede sustituir una observación cuidadosa de
la respuesta al tratamiento. Debido a la eliminación, la vida media
de la acumulación y los niveles en plasma permanentes resultan
difíciles de predecir, la valoración de la producción del
anticuerpo antidroga de abuso resulta útil como guía para obtener la
dosis óptima.
En los Ejemplos aparecen más detalles acerca de
los efectos de los transportadores y adyuvantes en la inducción de
una respuesta de anticuerpo.
Así, se aprecia que las cantidades realmente
preferidas del compuesto activo para un caso específico variarán de
acuerdo con el conjugado específico que vaya a ser utilizado, las
composiciones formuladas, el modo de aplicación, y el organismo
tratado. Por ejemplo, en una realización, la composición terapéutica
que contiene un transportador apropiado, se administra en primer
lugar por vía parenteral y se administra una dosis de refuerzo por
vía mucosal. Como se discute con más detalle en la presente memoria,
este tipo de inmunización con la combinación óptima
hapteno-transportador resulta muy eficaz para
generar en primer término IgG de manera sistémica y en primer
término IgA de manera local.
Como se muestra en los Ejemplos se han utilizado
modelos murinos para demostrar y determinar las diferentes
características de la respuesta de anticuerpos con referencia
particular a la cocaína. Éstas incluyen titulación de anticuerpos,
capacidad para reconocer cocaína libre, capacidad de unión a la
cocaína, afinidad por la cocaína, especificidad de la respuesta de
anticuerpos, isotipo de los anticuerpos, localización tisular de los
anticuerpos, y los efectos fisiológicos del anticuerpo después de
la administración de cocaína.
La primera valoración de una vacunación consiste
en evaluar si el conjugado de interés induce una alta titulación de
la respuesta de anticuerpo. Las titulaciones de anticuerpo se
determinan utilizando un ensayo ELISA como se describe en los
Ejemplos más adelante. Las placas se recubren con el conjugado
cocaína-HEL, se lavan, y se incuban con diferentes
diluciones del suero que se quiere valorar. Las placas se lavan de
nuevo y se revelan con un segundo anticuerpo contra IgG de ratón
marcado enzimáticamente. Las titulaciones se definen como el
inverso de la dilución de suero que produce un 50% de la respuesta
máxima.
La titulación de anticuerpo depende de la
concentración del anticuerpo y de la afinidad del anticuerpo. Como
se detalla en los Ejemplos, antisueros con aproximadamente 0,7 mg/ml
de anticuerpo específico contra la cocaína de afinidad media de
aproximadamente 2 x 10^{-8} M (ó 5 x 10^{7} M^{-1}) tienen una
titulación en ELISA de 80.000. En la estimación de la titulación de
anticuerpo requerida, una persona especializada en el tema
considera tanto la concentración como la afinidad de los
anticuerpos.
Aunque las personas especializadas en el tema
conocen otros métodos para calcular la concentración apropiada de
anticuerpo, sin intención de limitar la invención, se describe un
método para predecir los requerimientos de la concentración del
anticuerpo anticocaína. El pico de los niveles de cocaína en plasma
en adictos se encuentra en el intervalo 0,3-1,5
g/ml (Ambre et al. (1991) J. Anal. Tox.
15:17-20; Cone (1995) J. Anal. Tox.
19:159-478; y Cone et al. (1989) J.
Anal. Tox. 13:65-68). Por lo tanto,
0,075-0,375 mg/ml de anticuerpo se corresponde
aproximadamente con la equivalencia molar (La proporción en peso
anticuerpo monoclonal/cocaína = aproximadamente 160.000/303=
aproximadamente 500 pero al existir dos sitios de unión en cada
anticuerpo, la proporción molar por cada sitio de unión a la
cocaína es aproximadamente 250). Es posible alcanzar este nivel en
la respuesta de anticuerpo con un transportador haptenado, como se
demuestra en los Ejemplos. Sin embargo, si se induce en la mucosa
una respuesta específica de IgA dimérica secretada contra una droga
de abuso, como se describe en al menos una de las realizaciones de
la presente memoria, el requerimiento de la concentración de
anticuerpo es dos veces menor en comparación con la droga de abuso.
No se quiere indicar con esto que se necesite un exceso molar de
anticuerpo respecto a la droga de abuso para conseguir una terapia
con éxito.
En una composición terapéutica el anticuerpo
específico contra la cocaína (anticuerpo monoclonal) bloquea los
efectos de un exceso molar de cocaína en un modelo de adicción en
ratas. Se inyectaron a las ratas 4 mg de anticuerpo monoclonal
antes de la infusión de la cocaína (1 mg/kg; 300 g/rata). La
concentración de anticuerpo monoclonal determinada en las ratas fue
de aproximadamente 50 g/ml. El anticuerpo se encontraba por debajo
de la equivalencia molar a la cocaína cuando se comparó en el animal
completo o en el plasma.
La afinidad del anticuerpo refleja la cantidad
del complejo anticuerpo-droga en equilibrio con
anticuerpo no unido y droga de abuso no unida, de esta manera:
K_{eq} =
[complejo \ Ab+droga]/[Ab] \ x \
[droga]
donde [Ab] = concentración molar de
los sitios de unión del anticuerpo no unidos; [droga] =
concentración molar de droga no unida; [Ab+droga] = concentración
molar del complejo
anticuerpo-droga.
Por ejemplo, en base a diferentes cálculos, los
anticuerpos con afinidad por la cocaína por encima de 10^{-6} M
se encuentran en su mayoría unidos a la cocaína y los anticuerpos
con afinidades de aproximadamente 10^{-7} M están prácticamente
todos unidos a la cocaína a las concentraciones plasmáticas
esperadas de anticuerpo y cocaína.
Una vez que un conjugado es capaz de incitar una
alta titulación de respuesta de anticuerpo en suero, el suero
también se chequea mediante un ELISA de competición para valorar su
capacidad de reconocer a la cocaína libre como se describe en los
Ejemplos. Se pone a punto un ensayo ELISA utilizando una dilución
subóptima de suero. Se añaden diferentes concentraciones de cocaína
libre junto con el antisuero, y el ELISA se revela como se ha
descrito más arriba. Los datos se expresan como la concentración de
cocaína libre requerida para competir al 50% en la unión al
anticuerpo, una medida aproximada de afinidad. La lidocaína, entre
otras, se utiliza como control negativo en los experimentos de
competición, y el conjugado cocaína-transportador
utilizado en la inmunización se utiliza como control positivo.
Además del ensayo ELISA de competición la unión
se evalúa utilizando cocaína marcada radiactivamente. Los datos que
resultan de estos ensayos indican si el suero inmune se está uniendo
a la cocaína libre. Este punto se discute con más detalle en los
Ejemplos.
Con el fin de tener la máxima eficacia en
bloquear la actividad de la cocaína, los anticuerpos inducidos deben
tener una afinidad mínima por los metabolitos de la cocaína
inactivos desde un punto de vista farmacológico. La unión de los
anticuerpos a los metabolitos de la cocaína inactivos desde un punto
de vista farmacológico reduciría la potencia de la vacuna. Los
metabolitos inactivos principales son el éster metílico de ecgonina,
norcocaína y benzoilecgonina, estando todos disponibles
comercialmente. La especificidad de los antisueros para cada uno de
estos metabolitos se determina en un ELISA de competición y por
inmunoensayo con marcaje radiactivo. Estos puntos se discuten con
más detalle en los Ejemplos, más adelante.
Adicionalmente, debe ser minimizada la
interacción de los anticuerpos producidos por otras drogas
utilizadas en la terapia de adicción y en otros procedimientos
médicos. En particular, se evita la reacción cruzada con drogas
prescritas habitualmente para los adictos a la cocaína y a varias
drogas. Aunque la naturaleza única de la estructura del anillo de
tropano de la cocaína minimiza las reacciones cruzadas, éstas pueden
ser valoradas en un ELISA de competición. Así, la lidocaína se
utiliza como control negativo en nuestro ELISA de competición. Las
siguientes moléculas resultan útiles como cotratamiento,
buprenorfina, desipramina, naloxón, haloperidol, clorproazina, y
bromocriptina, así como otras que pudieran resultar relevantes.
Los conjugados y los protocolos de inmunización
que resultan más eficaces para incitar respuestas de anticuerpo
específicas con alta titulación se evalúan adicionalmente para
valorar su capacidad de desviar la DL_{50} de la cocaína. En
estos experimentos, a los ratones inmunizados con la cocaína e
inmunizados con el transportador (control) se les inyecta por vía
intravenosa dosis de cocaína cercanas a la DL_{50} definida
previamente. Se utilizan diez ratones para cada punto, y los datos
se analizan utilizando un test de chi-cuadrado de
Cochran-Mantel-Haenzel.
Además, se utiliza un modelo del tiempo de fallo
para analizar el tiempo hasta la muerte inducido por la cocaína. La
magnitud en la que los anticuerpos anticocaína incrementan tanto (a)
la dosis de cocaína requerida para producir letalidad como (b) el
tiempo hasta la muerte, son medidas de la eficacia en este modelo.
Estos datos resultan en una evaluación rápida y rigurosa de la
eficacia de los anticuerpos in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una persona que busca atención médica durante un
episodio de abuso puede presentarse con un pulso rápido, una tasa
respiratoria aumentada y una temperatura corporal elevada. A altos
niveles de sobredosis, se pasa a convulsiones, presión sanguínea
marcadamente elevada, y una temperatura corporal muy alta, todos
estos factores pueden resultar en shock cardiovascular. Además de
los niveles en sangre, todos estos factores serán evaluados y se
establecerán criterios específicos cuando se contemple la
administración de inmunización activa por medio de una vacuna o la
administración pasiva por medio de anticuerpos.
Cuando se ensayó en ratones, la inmunización con
un conjugado proteína-cocaína indujo una respuesta
de anticuerpo que varió la DL_{50} de la cocaína (Figuras 11a y
b). Se establece la hipótesis de que la relativamente pequeña
desviación observada con dosis muy altas de cocaína se traduce en
una desviación mayor a concentraciones de cocaína más bajas; el
dramático efecto del anticuerpo monoclonal anticocaína en la
administración propia de cocaína es consistente con esta
hipótesis.
A no ser que se indique otra cosa en los
Ejemplos, en estos estudios se utilizaron ratas hembra BALB/c de
2-3 meses de edad. Estos animales presentan una
respuesta reproducible a los antígenos utilizados en esta
investigación. Los animales se inmunizaron bien por vía
intramuscular, subcutánea, intratraqueal, o intranasal con un
conjugado proteína-cocaína bien en disolución
salina, o en alumbre, o en CFA. A no ser que se indique otra cosa,
los ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea con 50 \mug
del conjugado a ensayar. Después de 14 días, se administró a los
ratones la misma dosis de refuerzo. En los ratones inmunizados
utilizando CFA, se utilizó IFA para las inmunizaciones posteriores.
Las respuestas de anticuerpo en el suero se determinaron después de
14 días adicionales. Se utilizaron cinco ratones por grupo y todos
los sueros fueron ensayados de manera individual. La CTB utilizada
en los siguientes ejemplos se encuentra disponible comercialmente,
por ejemplo, de List o Sigma.
Se sobreentiende que el ejemplo y las
realizaciones descritas en la presente memoria tienen un propósito
únicamente ilustrativo, y que las personas especializadas en el
tema podrán sugerir varias modificaciones. De acuerdo con esto, los
siguientes Ejemplos, no limitantes, se ofrecen como guía en la
práctica de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se trata una disolución de clorhidrato del éster
metílico de ecgonina (50 mg, 0,21 mmol), diisopropiletilamina (80
l, 0,46 mmol) en DMF (3 ml) con bromuro de bromoacetilo (22 l, 0,25
mmol) y se calienta a 40ºC durante toda la noche. Los disolventes
se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por
cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol
como eluyente), dando lugar al compuesto bromado (67 mg, 96%) como
un polvo amarillo claro (éster metílico de ácido
3-(Bromoacetiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).
A una disolución del compuesto bromado (17 mg,
0,053 mmol) en PBS (0,5 ml), se añade BSA tiolada (15 mg) en PBS
(0,5 ml) y se agita de manera continua a temperatura ambiente
durante 3 días. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS
y se analiza entonces por análisis espectral de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A una disolución del éster metílico de ecgonina
(32 mg, 0,16 mmol) en DMF (2 ml), se añade trietilamina (22 1, 0,16
mmol) seguida de anhídrido succínico (16 mg, 0,16 mmol) y la
disolución se calienta a 35ºC durante 2 horas. El disolvente se
elimina bajo presión reducida y el residuo se purifica por
cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol
como eluyente). Mediante este proceso se obtiene el deseado
hemisuccinato (21 mg, 44%) como un polvo blanco (éster metílico de
ácido
3-(Succinoloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).
A una disolución del hemisuccinato (2,4 mg, 7,69
mol) en agua destilada (0,5 ml) a 0ºC, se le añade EDC (1,5 mg,
7,69 mol). Después de 10 minutos, se añade BSA (2 mg en 0,5 ml de
PBS) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante
toda la noche. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y
se determina el grado de haptenación por análisis espectral de
masas.
\newpage
Ejemplo
3
Método
A
Se trata una disolución de clorhidrato de
norcocaína (1 g, 3,07 mmol), trietilamina (0,86 ml, 6,14 mmol) en
DMF (20 ml) con anhídrido succínico (614 mg, 6,14 mmol) y la mezcla
se calienta a 45ºC durante toda la noche. Los disolventes se
eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por
cromatografía flash con gel de sílice (con 2:1 cloroformo:metanol
como eluyente). Esto da lugar a la norcocaína succinilada (1,0 g,
84%) en forma de un jarabe espeso (éster metílico de ácido
3-(Benzoiloxi)-8-succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).
A una disolución del ácido (14 mg, 0,036 mmol)
en agua destilada (1 ml) a 0ºC, se añade EDC (10,4 mg, 0,055 mmol).
Después de 5 minutos se añade gota a gota una disolución de BSA (14
mg) en PBS (1 ml) y la mezcla se deja templar a temperatura
ambiente durante toda la noche. El conjugado se purifica por
diálisis frente a PBS y se determina el grado de conjugación por
análisis espectral de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
B
A una disolución de BSA (500 mg) en tampón
borato 0,2 M (80 ml), se añade anhídrido succínico (270 mg, 2,70
mmol) en 1,4-dioxano (10 ml) en alicuotas de 200 l
durante 30 minutos. Se mantiene el pH en 9,3 por adición de una
disolución de hidróxido sódico 3 N. La disolución se guarda a
temperatura ambiente durante 18 horas, se dializa frente a
trietilamina 0,01 M y se liofiliza para obtener un polvo blanco. El
análisis espectral de masas del producto indica 55 grupos
succinoilo por cada molécula de BSA.
Se trata una disolución de BSA succinilada (72
mg) en tampón bicarbonato sódico 0,1 M, pH 8,8 (15 ml) a 0ºC con
EDC (88 mg, 0,46 mmol). Después de 5 minutos, se añade clorhidrato
de norcocaína (100 mg, 0,31 mmol) y la disolución se deja templar a
temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del
conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el
grado de haptenación por análisis espectral de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
A una disolución de benzoilecgonina (276 mg,
0,96 mmol) en DMF (5 ml) a -10ºC, se añade gota a gota complejo
borano-sulfuro de dimetilo (disolución 1,0 M en
cloruro de metileno; 1,0 ml, 1,01 mmol). La mezcla se deja templar
a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual la
reacción se para por la adición de THF:agua (proporción 1:1 v/v)
seguido de agitación durante 10 minutos adicionales. Los disolventes
se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por
cromatografía flash con gel de sílice (cloroformo seguido de
metanol como eluyentes). Esto da lugar al alcohol deseado (246 mg,
93%) como un polvo blanco
(3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano).
A una disolución del alcohol (190 mg, 0,69 mmol)
en DMF (5 ml) se añade trietilamina (0,19 ml, 1,38 mmol), seguida
de anhídrido succínico (138 mg, 1,38 mmol) y se calienta a 40ºC
durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión
reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de
sílice (1:1 cloroformo:metanol como eluyente). Esto da lugar al
hemisuccinato (123 mg, 48%) como un polvo blanco
(3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil
succinoil)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano).
A una disolución del hemisuccinato (16 mg, 0,043
mmol) en agua destilada (0,5 ml) a 0ºC se añade EDC (12 mg, 0,064
mmol). Después de 5 minutos, se añade gota a gota BSA (16 mg) en PBS
(0,5 ml) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente
durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por
diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por
análisis espectral de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
A una disolución de benzoilecgonina (10 mg,
0,035 mmol) en agua destilada (1,0 ml) a 0ºC, se añade EDC (10 mg,
0,052 mmol). Después de 5 minutos, se añade gota a gota BSA (10 mg)
en PBS (0,5 ml) y la disolución se deja templar a temperatura
ambiente durante toda la noche. El conjugado de proteína se purifica
por diálisis frente a PBS. El grado de haptenación determina por
análisis espectral de masas.
\newpage
Ejemplo
6
Método
A
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de HATU (2 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos,
la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una
disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10 mM, pH 7,8)
y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la
disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Método
B
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de HBTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos,
la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una
disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH 7,6) y se
agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la
disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Método
C
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos,
la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una
disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH 7,6) y se
agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la
disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Método
D
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos,
la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una
disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10 mM, pH 7,8)
y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la
disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Método
E
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de PyBroP (2,4 mg, 5,40 mol). Después de 10
minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a
gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH
7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de
la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Método
F
A una disolución de norcocaína succinilada (2
mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,
10,3 mol) seguida de PyBrop (2,4 mg, 5,40 mol). Después de 10
minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a
gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10
mM, pH 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El
pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo
cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente
a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través
de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por
análisis espectral de masas o absorción UV.
Ejemplo
7
Método
A
Se agita una disolución de norcocaína
succinilada (15 mg, 0,39 mol), cloruro de tionilo (28 l, 0,39 mmol)
en DMF (250 l) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de
que la reacción se estime terminada (por análisis por CCF), los
disolventes se eliminan bajo presión reducida y el derivado clorado
resultante (éster metílico de ácido
3-(Benzoiloxi)-8-clorosuccinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico)
se pasa a la siguiente etapa sin purificación adicional.
El derivado clorado (16 mg, 0,04 mmol) se
disuelve en DMF (100 l) y se añade gota a gota a una disolución de
CTB (0,38 mg/ml en 3 ml de PBS). La mezcla resultante se mantiene a
temperatura ambiente durante toda la noche, se dializa frente a PBS
y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de
masas.
Método
B
A una disolución de norcocaína succinilada (100
mg, 0,26 mmol) en DMF (5 ml), se añade DCC (64 mg, 0,31 mmol).
Después de 10 minutos, se añade sal sódica de ácido
4-hidroxi-3-nitrobencenosulfónico
(74 mg, 0,31 mmol) y la disolución amarilla resultante se mantiene
a temperatura ambiente durante 4 días. La suspensión resultante se
filtra bajo presión reducida y el filtrado se añade a éter dietílico
frío (10 ml) con agitación vigorosa. Se añade hexano (5 ml) y
después de una precipitación completa de un aceite amarillo, se
decanta el sobrenadante incoloro. El proceso se repite y el aceite
se seca durante toda la noche bajo presión reducida, dando lugar al
éster deseado (157 mg) (éster metílico de ácido
3-(Benzoiloxi)-8-(2-nitro-4
éster
sulfofenilo)succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico)
que se pasa a la siguiente etapa sin purificación adicional.
El éster (5 mg, 8,16 mol) se disuelve en DMF
(100 l) y se añade gota a gota a CTB (1 mg en 2 ml de PBS) a 4ºC y
se templa entonces a temperatura ambiente. Después de 3 horas la
disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se
determina el grado de haptenación por análisis espectral de
masas.
Método
C
A una disolución de norcocaína succinilada (108
mg, 0,28 mmol) en DMF (5 ml) a 0ºC, se añade NMM (37 l, 0,33 mmol)
seguido de cloroformato de etilo (32 l, 0,33 mmol). Después de 10
minutos, se añade N-hidroxisuccinimida (38 mg, 0,33
mol) y la disolución se templa a temperatura ambiente durante 18
horas. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el
residuo se recristaliza con isopropanol/éter dietílico para dar
lugar al éster N-oxisuccinimidilo (113 mg, 84%) en
forma de un polvo blanco (éster metílico de ácido
3-(Benzoiloxi)-8-(N-oxisuccinimidoil)succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).
Una disolución del éster (2 mg, 4,11 mol) en DMF
(100 l) se añade gota a gota a una disolución de CTB (1 mg en 2 ml
de PBS). Después de 3 días la disolución del conjugado se purifica
por diálisis frente a PBS y el grado de haptenación se determina
por análisis espectral de masas.
Ejemplo
8
A una disolución de clorhidrato de norcocaína
(50 mg, 0,15 mmol) en DMF (1 ml) se añade diisopropiletilamina (27
l, 0,31 mmol). Después de 5 minutos la disolución se enfría hasta
0ºC y se añade gota a gota a una disolución de cloruro de adipoilo
(44 l, 0,080 mmol) en DMF (100 l) a 0ºC. Después de 2 horas, la
disolución se añade gota a gota a una disolución de CTB (1 mg en 2
ml de PBS) a 0ºC y se templa a temperatura ambiente durante toda la
noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a
PBS y el grado de haptenación se determina por análisis espectral
de masas.
Ejemplo
9
La resina MAP (Novabiochem EEUU, La Jolla, CA)
(grado de sustitución: 0,48 mmol/g; 50 mg, 0,023 mmol) se esponja
previamente en DMF (5 ml). El disolvente se decanta y la resina se
trata con una disolución de piperidina 20% en DMF (5 ml), se agita
durante 15 minutos y los disolventes se eliminan por decantación. La
resina se lava de manera secuencial con DMF (5 ml), metanol (5 ml)
y DMF (5 ml). Una disolución de norcocaína succinilada (18 mg,
0,046 mmol) en DMF (1 ml) se trata con una mezcla de HOBt/DMF/HATU
(disolución 0,5 M recién preparada en DMF; 92 l, 0,046 mmol) y
después de 5 minutos, se agita durante toda la noche después de lo
cual se estima que la reacción se ha completado en >90% mediante
el test Kaiser-Ninhydrin. Los disolventes se
decantan y los lechos de resina se lavan de manera exhaustiva con
metanol, seguido de secado bajo una corriente de argón. El MAP
derivatizado se disocia al resuspender la resina en fenol/TFA/EDT
2,5% (5 ml), agitar durante 1 hora, filtrar, lavar con TFA (4 x 4
ml) y los disolventes se eliminan bajo presión reducida. El péptido
crudo se tritura con éter dietílico frío, se centrifuga durante 5
minutos a 5.000 rpm y se repite el proceso. El sedimento se
disuelve en agua y se liofiliza para obtener 1 mg del péptido
crudo.
Ejemplo
10
La síntesis de la porción que no incluye al
hapteno (núcleo MAP) del MAP polihaptenado se lleva a cabo por
síntesis manual de péptidos como describe Tam et al (Patente
de EEUU 5.229.490). Los grupos amino se protegen por la función Boc
(t-butiloxicarbonilo) y el grupo sulfhidrilo de Cys
se protege como su derivado
3-nitro-2-piridilsulfenilo
(Npys). Después de la unión a la resina y la eliminación de los
grupos protectores Boc con TFA como describe Tam (supra), el
núcleo MAP se disocia de la resina por disociación HF dejando los
grupos Npys intactos. El núcleo MAP crudo se recoge en clorhidrato
de guanidina 7 M que contiene HOAc 0,2 M y se somete a cromatografía
de permeación en gel en HOAc 0,2 M en Sephadex G-10
para eliminar cualquier subproducto de bajo peso molecular generado
por la disociación HF. El núcleo MAP se liofiliza de HOAc 0,2 M. Se
prepara
(N-succinamidil-cocaína)8-MAP
de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 9.
Antes del acoplamiento con la proteína activada
el grupo tiol se expone por tratamiento con un equivalente molar de
clorhidrato de tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP).
La proteína transportadora activada se disuelve en tampón
bicarbonato 0,2 M a temperatura ambiente hasta alcanzar una
concentración de 5 mg/ml. A esta disolución se añade un exceso
molar de 2 veces de
(N-succinamidil-cocaína)8-MAP
a 5 mg/ml. Se deja que la reacción se lleve a cabo durante 20 horas
a temperatura ambiente y se dializa entonces durante toda la noche
frente a HOAc y se liofiliza.
Ejemplo
11
Con el fin de incitar una respuesta de
anticuerpo contra una molécula pequeña o hapteno, como la cocaína,
es necesario unirla a un transportador que contenga un epítopo de
célula T, por ejemplo, una proteína transportadora. El
transportador es reconocido por las células T que proporcionan ayuda
a las células B específicas de cocaína para la iniciación y el
mantenimiento de una producción de anticuerpos sostenida. En este
ejemplo, el transportador utilizado es BSA, una proteína con 36
residuos de lisina que se encuentran expuestos y disponibles para la
conjugación. Se produjo un panel de conjugados
cocaína-proteína estructuralmente diferentes que se
unieron a través de diferentes regiones de la molécula de cocaína
(Figuras 1a, 1b, 2a, 2b). Se sintetizó un conjunto de conjugados
porque la molécula de cocaína se altera físicamente y se orienta de
manera distinta durante el proceso de conjugación con el
transportador. Como cualquier conjugado de la cocaína puede incitar
anticuerpos que reconozcan sólo al conjugado, y no al hapteno libre
(cocaína), se llevó a cabo un cribado.
Los ratones se inmunizaron con 50 g del
conjugado cocaína-BSA PS-5,1 y
PS-5,6 (Figuras 9a y b) o con PS-9,1
(Figura 9c) por vía intraperitoneal bien con CFA (Figuras 9a y 9c)
o con alumbre (Figura 9b). Se administró a los ratones una dosis de
refuerzo y luego se sangraron. Los ratones inmunizados con el
conjugado cocaína-BSA PS-5,1 se
refuerzan con el conjugado cocaína-BSA
PS-5,6. Los sueros se ensayaron en un ensayo ELISA
utilizando placas recubiertas con PS-5 (conjugado
con HEL) o PS-9 (conjugado con HEL). Se muestran las
respuestas de 5 ratones individuales por grupo. Estos datos
demuestran que los conjugados cocaína-BSA son
capaces de incitar respuestas de anticuerpo con una alta
titulación.
Ejemplo
12
Para determinar directamente si los anticuerpos
inducidos eran capaces de reconocer a la molécula de cocaína libre,
se realizó un ELISA de competición. Las placas se recubrieron con el
conjugado cocaína libre-HEL apropiado y se
incubaron con el antisuero en una dilución 1:2.000 en presencia de
distintas concentraciones de cocaína libre como competición. Cuando
se utiliza PS-5,6-BSA como
inmunógeno, la mayoría de la respuesta del anticuerpo es
efectivamente competida por la cocaína libre (Figuras 10a y b). En
este lote de sueros procedentes de diez ratones (cada línea en el
gráfico de la Figura 10a representa un ratón diferente), uno es
menos efectivo en el ensayo de competición (cuadrados abiertos y
línea de puntos) y este ratón no se utilizó en los experimentos de
DL_{50} descritos en la presente memoria. El conjugado
PS-9,2-BSA también induce
anticuerpos específicos contra la cocaína. Estos datos demuestran
que los conjugados cocaína-transportador pueden ser
sintetizados y que inducen respuestas de anticuerpo específicas
contra la cocaína con una titulación alta que deberían ser capaces
de neutralizar a la cocaína
in vivo.
in vivo.
Ejemplo
13
La presente invención describe un conjugado
cocaína-proteína que induce una respuesta de
anticuerpo anticocaína en un modelo de ratón. Estos anticuerpos
anticocaína neutralizan a la cocaína in vivo, desviando
significativamente la dosis de cocaína requerida para incitar una
respuesta letal en ratones.
La eficacia de la vacunación terapéutica contra
la cocaína se evaluó determinando la dosis letal de cocaína
(DL_{50}) en animales inmunizados. La predicción fue que una gran
respuesta de anticuerpo específica contra la cocaína debería unir
suficientes cantidades de cocaína como para evitar los rápidos
efectos cardíacos, respiratorios y neurológicos de la cocaína,
incrementando de esta manera la DL_{50} de la cocaína en los
ratones inmunizados. Se inmunizaron sesenta ratones BALB/c con 50
\mug de PS-5,4-BSA en CFA y se les
administró una dosis de refuerzo con el mismo conjugado en IFA.
Cada ratón se sangró en el día 34 y se valoraron las titulaciones y
la competición con la cocaína de los anticuerpos en el suero. Se
eligieron cuarenta y ocho ratones para el experimento, con unas
titulaciones medias de 18.700, y todos mostraron competición con la
cocaína libre. Para los experimentos de DL_{50}, se utilizaron
4-6 ratones por grupo y cada grupo fue
cuidadosamente formado de acuerdo con la titulación de anticuerpo y
la afinidad aparente por la cocaína libre.
Como se muestra en la Figura 11, la DL_{50}
para la cocaína en ratones BALB/c no inmunizados fue 3 mg/kg cuando
la droga se administró por vía intravenosa (i.v., Figura 11b) y 20
mg/kg cuando se administró por vía intraperitoneal (i.p., Figura
11a). La inmunización de los ratones con el conjugado
cocaína-proteína cambió la DL_{50} de manera
significativa. Las dosis requeridas para una toxicidad mitad de la
máxima fue 4,5 mg/kg y 35 mg/kg para las dosis i.v. e i.p.,
respectivamente. Estas dosis fueron significativamente diferentes de
los valores obtenidos en los ratones no inmunizados (p = 0,048 para
i.v. y p = 0,014 para i.p., test chi-cuadrado de
Cochran-Mantel-Haenszel). La
protección de la vacunación contra la cocaína de casi dos veces
frente a la toxicidad aguda a altas dosis se compara favorablemente
con algunas drogas que afectan la farmacología de la cocaína. Por
ejemplo, el antagonista de NMDA, MK-801 incrementa
la DL_{50} 1,3 veces y 1,4 veces cuando se combina con propanolol
(Itzhak et al. (1992) J. Pharmacol. Exp. Therap.
262:464-467). Además, la vacunación prolonga
significativamente el tiempo hasta la muerte de una media de 3,2 min
a 5,4 min, para la administración i.v. (p = 0,007, test de Wilcoxon
2 muestras) y de 4,0 min a 8,5 min. para la administración i.p. (p =
0,0003). Este estudio demuestra que el anticuerpo afecta la
respuesta fisiológica a altas dosis de cocaína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Con el fin demostrar la estabilidad y
reproducibilidad de este sistema, se adiestraron 8 ratas para
discriminar inyecciones i.p. de 10 mg/kg de cocaína de las de
disolución salina utilizando un procedimiento de 2 palancas (Kantak
et al. (1995) J. Pharmacol. Exp. Therap.
274:657-665). Después de la administración de
las inyecciones de cocaína, se hace a los animales presionar una de
las palancas (la palanca correspondiente a la droga) 10 veces (FR
10) para obtener una bola de comida; después de las inyecciones de
disolución salina, se les hace presionar la otra palanca (la
palanca correspondiente a la disolución salina) 10 veces para
obtener una bola de comida. Cuando los animales han aprendido a
discriminar la cocaína de la disolución salina, al menos un 90% del
total de respuestas se realizan en la palanca apropiada durante
varios días consecutivos. Con el fin de incorporar un procedimiento
de dosificación cumulativo durante las sesiones posteriores de
sustitución, las sesiones de adiestramiento se componen de
múltiples componentes, cada uno de ellos de 10 minutos de duración
o hasta que se completen 10 FRs, lo que ocurra antes.
Después del adiestramiento, se llevaron a cabo
sesiones de sustitución con diferentes dosis de cocaína
(0,3-17,8 mg/kg) dos veces por semana, con sesiones
de entrenamiento en días intermedios. Las sesiones de sustitución
de la droga consistieron en cuatro componentes de 10 minutos, cada
uno de ellos precedido de un período de 15 min de tiempo de
descanso. Durante los ensayos de sustitución, la realización de 10
respuestas en cualquiera de las palancas produce una bola de
comida. Se inyectaron dosis cada vez mayores de cocaína al inicio de
cada uno de los 4 períodos de tiempo de descanso. Se estudiaron los
intervalos superpuestos de dosis cumulativas en diferentes días de
ensayo, lo que permitió determinar una curva de dosis respuesta de
siete puntos en una única semana.
En los ensayos de sustitución, la cocaína
produjo incrementos en el porcentaje de respuestas correspondientes
a la cocaína relacionados con la dosis, lo que resultó en una
sustitución total (>90% de respuestas correspondientes a la
cocaína) en todos los sujetos después de la administración de dosis
al menos iguales a la dosis utilizada en el adiestramiento. Cada
punto de datos se basa en 2-3 determinaciones en
sujetos individuales. La DE_{50} \pm 95% C.I. para las
respuestas correspondientes a la cocaína es 2,14 \pm 0,20 mg/kg,
lo que se compara favorablemente con el valor obtenido en ratas
adiestradas para discriminar inyecciones de 10 mg/kg de cocaína
utilizando procedimientos de un único componente y una única
dosificación (2,6 \pm 0,29 mg/kg; (Kantak et al. (1994)
J. Pharmacol. Exp. Ther. (en revisión)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Para ensayar la actividad funcional de CTB, se
desarrollaron dos ensayos. Primero, se determinó la unión de CTB a
células mediante citometría de flujo. Las células se incubaron con
CTB, seguido de antisuero antiCTB comercial de cabra y de un
segundo anticuerpo anticabra marcado con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) (Figura 13). La CTB petamérica nativa se unió a
las células produciendo una dramática desviación de la intensidad
de la fluorescencia. La CTB monomérica resultó incapaz de unirse a
las células en este ensayo. Segundo, se puso a punto un ELISA para
determinar la capacidad de CTB para unirse al gangliósido G_{M1}.
Las placas de ELISA se recubrieron con gangliósido G_{M1} y se
incubaron con diferentes concentraciones de CTB. La unión se
detectó utilizando un anticuerpo antiCTB (o disolución salina como
control) seguido de un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente y
de revelado con el sustrato. Este ensayo proporcionó una
determinación cuantitativa y muy sensible de la capacidad de CTB
pentamérica para unirse a los gangliósidos G_{M1}. Estos ensayos
se utilizaron para evaluar la actividad funcional de los conjugados
CTB haptenados y recombinantes antes de llevar a cabo los
experimentos in vivo. De manera similar, la Figura 14a
muestra que la conjugación no afecta la capacidad de los
anticuerpos específicos contra CTB para reconocer al conjugado. La
Figura 14b, muestra que las moléculas CTB conjugadas que son
capaces de unir G_{M1}, también pueden ser unidas por anticuerpos
específicos contra la cocaína, lo que demuestra la retención de la
actividad CTB de la CTB haptenada.
\newpage
Ejemplo
16
En ratas, las propiedades de refuerzo de
estímulos de la cocaína pueden ser estudiadas de manera fiable
utilizando procedimientos de administración propia intravenosa.
Este es un modelo directo de adicción y del comportamiento de la
administración propia en sujetos animales que se correlaciona
positivamente con el abuso de esa droga por sujetos humanos. Para
examinar el efecto de la vacuna terapéutica, se implanta a ratas
macho adultas (Wistar, 300 g aproximadamente) un catéter en la vena
yugular utilizando los procedimientos generales descritos por Weeks
(Meth. Psychobiol. (1972) 2:115-168) y
adaptados por Kantak et al. (Kantak et al. (1990)
Pharm. Biochem. Behavior 36:9-12;
(Kantak et al. (1991) Psycopharm.
104:527-535; y Kantak et al. (1992)
Pharmacol. Biochem. Behav.
41:415-423). Todos los animales se guardan
individualmente y se mantienen a un 80%-85% de sus pesos corporales
sin comida para facilitar la comparación con los experimentos de
discriminación de droga. Una semana después de la cirugía, 1,0
mg/kg/infusión de cocaína resulta válida como dosis de
adiestramiento en sesiones diarias de 2 horas. La infusión propia
de las ratas es de una dosis cumulativa de 10 mg/kg cada hora.
Durante la fase inicial de adiestramiento, cada presión en la
palanca resulta en la liberación de droga. El número requerido de
respuestas para la infusión propia de cocaína se aumenta
gradualmente hasta 5 (FR5) y se introduce entonces el programa de
liberación de droga FR 5:F15 min. Después de una respuesta estable
durante al menos 5 días, se determina una línea base en la curva de
dosis respuesta a la cocaína (0,1, 0,3, 0,56, 1,0 y 3,0
mg/kg/infusión). Cada dosis de cocaína, así como de disolución
salina, se examina en un bloque de al menos 5 sesiones y hasta que
no se observen tendencias sistemáticas al alza o a la baja. Los
datos se expresan como velocidades de respuesta medias durante los
últimos dos días de cada bloque de
sesiones.
sesiones.
Después de la determinación de la línea base en
la curva de dosis respuesta a la cocaína en ratas, se inmuniza a la
mitad de las ratas con el conjugado
cocaína-transportador óptimo y se inmuniza a la otra
mitad únicamente con el transportador. Las sesiones de
administración propia se interrumpen hasta que se alcanzan
titulaciones significativas de anticuerpo anticocaína, lo que suele
tardar 4-6 semanas. Las ratas se sangran de la vena
de la cola para asegurar que todas las ratas presentan titulaciones
comparables de anticuerpos específicos contra la cocaína. Después
de la inmunización, se ensaya la capacidad de las ratas para
responder a la cocaína. Se permite el acceso de las ratas a
diferentes dosis de cocaína (0,3-3,0
mg/kg/infusión), o a disolución salina, en bloques de 5 días. Las
ratas control inmunizadas únicamente con el transportador vuelven
rápidamente al patrón de la línea base de la administración propia
de cocaína.
El anticuerpo anticocaína bloquea los efectos de
refuerzo de la cocaína. Si es necesario, se estudian dosis de
cocaína de hasta 30 mg/kg/infusión para determinar la magnitud de la
protección que proporciona el anticuerpo. Si el anticuerpo
anticocaína bloquea parcialmente la cocaína, las ratas requieren
dosis mucho mayores de cocaína para alcanzar el efecto fisiológico
deseado y las respuestas mantenidas por la cocaína se restituyen
mediante una desviación a la derecha en la curva de dosis respuesta
de la cocaína. Si el anticuerpo policlonal frente a la cocaína
bloquea completamente dosis de cocaína de hasta 30 mg/kg/infusión,
entonces la respuesta que es mantenida por la cocaína no se
restituye y se acaba la administración propia de cocaína,
permaneciendo la curva de dosis respuesta de la cocaína plana,
cerca del cero semejante a los niveles que corresponden a la
disolución salina.
La administración propia de cocaína, puede
inhibirse también por administración pasiva del anticuerpo
anticocaína. Se administró a grupos separados de ratas anticuerpo
monoclonal anticocaína o anticuerpo control. Los animales que
habían sido previamente estabilizados en un programa FR5:F15 de
administración de cocaína acabaron su administración propia de
cocaína cuando se les trató de manera pasiva con anticuerpos
anticocaína. Las ratas tratadas con el anticuerpo control
mantuvieron sus respuestas de administración propia de cocaína.
Ejemplo
17
Se realizó un cribado para determinar si la
terapia farmacológica con buprenorfina y/o desipramina aumentaba la
actividad de la vacuna terapéutica. Es de esperar que los
tratamientos con buprenorfina y/o desipramina sean compatibles.
Resulta posible que los agentes terapéuticos puedan ser
inmunosupresores, inhibiendo la inducción de una respuesta de alta
titulación de anticuerpos anticocaína. Para estudiar esta
posibilidad, se inmunizaron ratas con el conjugado
cocaína-transportador en presencia o ausencia de
buprenorfina o desipramina y se determinó la titulación de
anticuerpo a diferentes tiempos. Una droga que resulte
significativamente inmunosupresora se eliminará por ser una terapia
incompatible. Este ensayo de cribado se utiliza para cualquier
droga para la que se considere cotratamiento.
Si no se observa inmunosupresión, se lleva a
cabo un cribado adicional para determinar si las dos aproximaciones
son sinérgicas. Después del adiestramiento, de la inmunización y del
ensayo, se evalúa adicionalmente a las ratas en los dos modelos en
presencia de las drogas. Las ratas reciben drogas antes de las
sesiones con diferentes dosis de cocaína. Se llevan a cabo
experimentos iniciales con ratas control inmunizadas con el
transportador para seleccionar una dosis de droga que no acabe
completamente con el comportamiento en la administración propia o
en los sistemas de discriminación de droga; se estima que esta dosis
es de aproximadamente 5,6 mg/kg (-)-buprenorfina o
de 10 mg/kg desipramina. Los datos se evalúan para determinar si la
acción de la vacuna terapéutica es aditiva con el tratamiento con
buprenorfina o desipramina.
Ejemplo
18
Se ha demostrado en muchos sistemas que la
subunidad B de la toxina del cólera (CTB) retiene la actividad de
la toxina del cólera intacta, incluyendo la inducción de una
respuesta de anticuerpo mucosal. Por lo tanto, este transportador
debería incitar una fuerte respuesta de anticuerpo IgA
anticocaína.
Un medio efectivo de producir una respuesta
inmune en el tracto respiratorio es llevar el antígeno directamente
a esa zona. El antígeno se administra en disolución salina, con CTB
actuando como su propio adyuvante. Para confirmar la capacidad de
CTB para incitar una respuesta de IgA mucosal, se llevaron a cabo
experimentos iniciales únicamente con el transportador. Los ratones
se indujeron con 50 \mug de CTB o con el conjugado
cocaína-CTB por dos vías: nasal e intratraqueal. La
administración nasal es una vía de inducción simple y común. El
antígeno se aplica a cada ventana de la nariz de un ratón
ligeramente anestesiado, en un volumen total de 50 \mul por
ratón. Catorce días después de la inducción, se administró a los
ratones dosis de refuerzo utilizando el mismo protocolo. La
administración nasal se adapta fácilmente a la aplicación en seres
humanos como un pulverizador nasal. La vacunación nasal se ha
utilizado con éxito con vacunas de influenza vivos (Walker et
al. (1994) Vaccine
12:387-399).
En la inmunización intratraqueal el antígeno se
aplica directamente al tracto respiratorio inferior, aumentando de
esta manera la inmunidad en los pulmones. Los ratones se anestesian
con una mezcla de ketamina y xilazina. Los animales se ponen en un
aparato que mantiene su boca abierta y expone la tráquea; la tráquea
se visualiza con una sonda de luz de fibra óptica. Se utiliza una
aguja sin filo de calibre 23 para administrar 50 \mul de
disolución en los pulmones. Catorce días después de la inducción, se
administró a los ratones dosis de refuerzo utilizando el mismo
protocolo.
Los animales se sacrifican por asfixia con
CO_{2} a diferentes tiempos después de las dosis de refuerzo (14,
21, ó 28 días) y se recogen los fluidos de lavado nasales y
broncoalveolares y se ensaya la presencia de IgA específica para el
conjugado administrado. El fluido de lavado nasal se obtiene por
lavado (cuatro veces) de la cavidad nasal con un total de 1 ml de
PBS como se ha descrito (Tamura et al. (1989) Vaccine
7:257-262). El fluido de lavado
broncoalveolar se obtiene por exposición quirúrgica de la traquea,
inyección de 0,5 ml de PBS en los pulmones y lavado (tres veces)
como se ha descrito (Nedrud et al. (1987) J. Immunol.
139:3484-3492). Después de centrifugar para
eliminar las células, las muestras se ensayaron para detectar IgA
específica del antígeno mediante ELISA utilizando un segundo
anticuerpo específico de IgA. La IgG específica de la cocaína se
determina en los lavados nasales y de pulmón, porque se ha descrito
que la IgG se detecta y resulta importante en el pulmón (Cahill
et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett.
107:211-216).
Se comparan directamente las dos vías de
administración para estudiar su capacidad de incitar una respuesta
IgA, tanto en el fluido de lavado nasal como en el de los pulmones.
La ruta que sea más potente será la preferida y la utilizada en el
resto de experimentos. Si la eficacia de las dos rutas resulta
comparable, se prefiere la inmunización nasal por su
simplicidad.
Para conseguir una protección máxima contra la
cocaína, tanto la respuesta IgG sistémica como la IgA mucosal
pueden ser maximizadas. Por lo tanto, se prefiere una inyección
sistémica con el conjugado cocaína-CTB en alumbre
(u otro adyuvante) y un pulso mucosal con el conjugado, a la
inducción efectiva de los dos compartimentos. Se comparan tres
grupos. Primero, los ratones se inducen sistémicamente, seguido de
un pulso mucosal después de 14 días. Segundo, los ratones se
inducen por vía mucosal, seguido de un pulso sistémico después de 14
días. Tercero, son inducidos al mismo tiempo tanto por vía
sistémica como por vía mucosal seguido de la administración de
dosis de refuerzo iguales después de 14 días. Los ratones control se
inducen sólo por vía mucosal o sólo por vía sistémica. Se valora,
en cada caso, la eficacia del pulso mediante la determinación de la
titulación de los anticuerpos anticocaína IgG e IgA.
Como medida inicial de la eficacia de los
anticuerpos anticocaína mucosales in vivo, se determina la
DL_{50} para la cocaína administrada por vía mucosal. Se
administran diferentes dosis de cocaína bien por vía intratraqueal
o por vía intranasal a ratones anestesiados. Se comparan tres grupos
de ratones en el experimento de DL_{50}: ratones sin inmunizar,
ratones inmunizados sólo por vía sistémica y ratones inmunizados
tanto por vía sistémica como por vía mucosal. La DL_{50} real de
todos los grupos puede verse desviada por la anestesia (Tella et
al. (1992) J. Pharm. Exper. Therap.
262:936-946). Esta aproximación también se
puede proseguir en un modelo de primate no humano utilizando
cocaína base fumada (Carrol et al. (1992) J. Pharm. Exper.
Therap. 261:26-37).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
La inmunogenicidad de los conjugados
cocaína-CTB se determinó por inmunización de
roedores con cocaína-CTB, dosis de refuerzo cuando
resultara apropiado, y valoración de los niveles de anticuerpo a
diferentes tiempos. Los niveles de anticuerpo se determinaron en un
ELISA específico de antígeno. Las titulaciones de anticuerpo se
determinaron como los valores inversos de la dilución de suero que
produce un 50% de la respuesta máxima en el ELISA y se expresan como
las medias geométricas de los resultados en 5 o más ratones.
Para determinar el intervalo de la dosis de
antígeno requerido para incitar una respuesta de anticuerpo
anticocaína, los ratones se inmunizaron bien subcutáneamente o
intramuscularmente con diferentes dosis de
cocaína-CTB PS-5,53. Se
administraron dosis de refuerzo a los animales en los días 23 y 59 y
se sangraron en el día 71. Las dosis de 3, 10, y 30 g administradas
intramuscularmente indujeron titulaciones de IgG específicas de
cocaína de 18.429, 29.013, y 22.957, respectivamente. Utilizando
inmunización subcutánea, las mismas dosis indujeron titulaciones de
anticuerpo específico de 10.097, 15.136, y 21.169. Estos datos
demuestran que el conjugado cocaína-CTB puede ser
utilizado de manera eficaz en el intervalo 3-30 g y
que se espera que dosis más altas y más bajas sean eficaces. Dosis
similares resultan también eficaces para ser utilizadas en ratas.
Las personas especializadas en el tema utilizan estos datos para
identificar las dosis óptimas en seres humanos, que normalmente son
comparables.
Para generar respuestas óptimas de anticuerpo en
las secreciones mucosales, es normalmente necesaria la inducción en
una superficie mucosal. Para determinar si CTB es una proteína
transportadora útil para la inducción de una respuesta de
anticuerpo mucosal, se inmunizaron ratones intranasalmente o
intratraquealmente. Los métodos para la inmunización intranasal e
intratraqueal se describen en el Ejemplo 18. La inmunización
intranasal con el conjugado cocaína-CTB indujo unos
niveles significativos de IgG circulante específica de la cocaína,
aunque las titulaciones fueron más bajas que las observadas después
de la inmunización subcutánea o intramuscular. Como ocurre con las
vías de administración descritas en la Parte A de este ejemplo, las
dosis del conjugado cocaína-CTB de
3-30 g indujeron niveles significativos de
anticuerpo específico de la cocaína. La inmunización simultánea por
vía subcutánea e intranasal indujo unas titulaciones de anticuerpo
iguales a las inducidas por vía subcutánea exclusivamente. Se
valoró la viabilidad de la vía de inmunización intratraqueal
mediante la inmunización con CTB exclusivamente. Se encontró que
esta vía también inducía IgG específica del antígeno en el suero
(en este caso específica de CTB). Estos datos demuestran que CTB es
capaz de incitar una respuesta IgG sistémica específica del
antígeno después de una inmunización en una superficie mucosal en
ausencia de un adyuvante añadido.
Para maximizar la protección frente a las
propiedades adictivas de la cocaína, es deseable optimizar los
niveles del anticuerpo específico de la cocaína en los lugares de
aplicación de la cocaína (por ejemplo, mucosa nasal y pulmonar) así
como en la sangre. Se inmunizaron ratones intranasalmente o
subcutáneamente con 10 g del conjugado cocaína-CTB y
se les administraron dosis de refuerzo en los días 27 y 61
utilizando el mismo protocolo. Después de ser sacrificados el día
78, se recogieron los lavados bronquial y nasal como se describe en
los Ejemplos y se ensayaron para determinar IgA e IgG específicas
de la cocaína. Se detectaron anticuerpos anticocaína tanto en el
lavado nasal como bronquial utilizando los dos regímenes de
inmunización. La inmunización intranasal indujo unos niveles de IgA
específica del antígeno mayores, mientras que las dos vías fueron
comparables en su inducción de respuestas IgG anticocaína en las
secreciones mucosales. La vía de administración intranasal también
resultó la más efectiva en la inducción de IgA específica del
antígeno en el suero. La inmunización intratraqueal con CTB también
indujo IgA e IgG específicas de CTB en las secreciones
respiratorias. Estos datos demuestran que CTB es una proteína
transportadora eficaz para la inducción de una respuesta de
anticuerpo específica del antígeno en el tracto respiratorio.
Normalmente la utilización de un adyuvante
resulta beneficiosa en los protocolos de inmunización. Para valorar
la contribución del alumbre en la respuesta inmune, se inmunizaron
ratones intraperitonealmente con 10 g del conjugado
cocaína-CTB PS-5,53 en disolución
salina o adsorbido en alumbre. Se administró a los ratones dosis de
refuerzo en el día 27 utilizando el mismo protocolo. En ambos
grupos de animales se detectaron altos niveles de anticuerpos
específicos de la cocaína en el día 43 (titulación de 14.687 en
ausencia de alumbre y 16.775 en presencia de alumbre). También se ha
demostrado que la inmunización con el conjugado
cocaína-CTB adsorbido en alumbre es eficaz si es
administrado por vía subcutánea o intramuscular. Por lo tanto, la
utilización de alumbre con este antígeno resulta aceptable.
Para determinar si las respuestas de anticuerpo
inducidas con el conjugado cocaína-CTB
PS-5,8 resultan duraderas, se evaluaron los niveles
de anticuerpo en suero en función del tiempo. Los animales
descritos en la sección D de este Ejemplo se estudiaron hasta el día
128 después de la inmunización. En este punto en el tiempo, las
titulaciones de anticuerpo permanecían altas, siendo aproximadamente
2 veces más bajas que el pico del día 43. Estos datos demuestran
que las respuestas de anticuerpo anticocaína contra el conjugado
cocaína-CTB son duraderas.
La inmunización con el conjugado
cocaína-CTB induce una respuesta de anticuerpo tanto
contra el hapteno (cocaína) como contra el transportador (CTB). La
CTB es un inmunógeno muy potente y es posible que la respuesta
antiCTB pueda dominar, evitando que la respuesta anticocaína
alcance unas titulaciones muy altas. Para determinar si es posible
regular de manera diferencial las respuestas de anticuerpo
anticocaína y antiCTB mediante un cambio en el régimen de
inmunización, se llevó a cabo el ensayo no limitante siguiente. Se
inmunizaron los ratones intramuscularmente con 30 g del conjugado
cocaína-CTB y se evaluó la respuesta de anticuerpo.
Esta inmunización indujo anticuerpos tanto anticocaína como antiCTB
con una relación relativa de titulaciones de IgG en suero de 0,04.
En contraste, se observó una relación de 0,2 cuando los ratones se
inmunizaron con 3 g del conjugado cocaína-CTB. Las
dosis de 3 g y 30 g produjeron titulaciones similares, 18.429 y
22.957, respectivamente. Resulta posible que la relación de
anticuerpos anticocaína frente a anticuerpos antiCTB se vea también
afectada por otros parámetros del régimen de inmunización así como
por las propiedades inherentes al conjugado, como el grado de
haptenación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se puede valorar la capacidad de los anticuerpos
para unir cocaína libre utilizando cocaína marcada radiactivamente.
Se incubó ^{3}H-Cocaína (1 Ci) con suero de
ratones normales (0,05 ml), con suero de ratones inmunizados con un
conjugado PS-5,4 (conjugado con BSA) (0,05 ml,
combinación del suero de 10 ratones) o con anticuerpos monoclonales
anticocaína comerciales (mezcla de dos anticuerpos diferentes, 2 g
de cada uno) (véase la Figura 10b). Se incluyeron en la incubación
lechos recubiertos con proteína G que se une a la porción Fc de las
moléculas de anticuerpo. Después de 2 horas, los lechos se
sedimentaron por centrifugación, se lavaron tres veces con PBS frío
y se contaron en un contador de centelleo. Los datos de la Figura
10b representan las medias y las desviaciones estándar de muestras
en duplicado. Estos datos demuestran claramente que el suero inmune
es capaz de unir cocaína libre con una afinidad lo suficientemente
alta como para permitir que la cocaína unida sea precipitada y
lavada. Esto es una evidencia de que estos anticuerpos serán capaces
de unir y neutralizar a la cocaína en la circulación de los adictos
a la cocaína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Para analizar la especificidad de los
anticuerpos anticocaína inducidos por la vacuna de la cocaína, se
ensayaron los sueros de ratones inmunizados con el conjugado
cocaína-CTB en un ELISA de competición. Se ensayó un
conjunto de metabolitos de la cocaína y moléculas relacionadas a
diferentes concentraciones. Si los anticuerpos tuvieran una alta
afinidad por el metabolito, entonces concentraciones bajas serían
capaces de competir de manera eficaz en este ensayo. La reactividad
relativa se expresa como CI_{50}, la concentración del inhibidor
que disminuye un 50% la señal en el ELISA. Utilizando este método
se determinó que los anticuerpos producidos por la inmunización con
el conjugado cocaína-BSA PS-5,6
reconocen tanto la norcocaína, el metabolito farmacológicamente
activo de la cocaína, como el cocaetileno, el derivado activo de la
cocaína producido por transesterificación después del consumo de
alcohol. Por el contrario, los anticuerpos reconocían en baja medida
los metabolitos farmacológicamente inactivos benzoilecgonina y
éster metílico de ecgonina. Los anticuerpos inducidos por los
conjugados cocaína-BSA PS-5,6 y
cocaína-CTB PS-5,53 mostraron una
especificidad similar, demostrando que la proteína transportadora
no afecta la especificidad de los anticuerpos anticocaína. Se indujo
un anticuerpo monoclonal altamente específico en un animal
inmunizado con el conjugado cocaína-BSA que también
mostraba una especificidad muy similar frente a la cocaína y sus
metabolitos activos. La reactividad de este anticuerpo monoclonal
fue 2.000 veces mayor hacia la cocaína que hacia la
benzoilecgonina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Sin intención de limitar la invención, se
describe un método para cuantificar directamente la capacidad de
unión al antígeno y la afinidad de los anticuerpos específicos de
antígeno obtenidos utilizando la vacuna de conjugado de cocaína. Se
utiliza la técnica inmunológica clásica de diálisis de equilibrio.
Los sueros inmunes inducidos por inmunización con el conjugado
cocaína-BSA PS-5,6 y los antisueros
control se colocaron en bolsas de diálisis (éster de celulosa,
25.000 MWCO, Spectrum, Los Angeles, CA) y se dializaron hasta el
equilibrio frente a un gran volumen que contenía diferentes
concentraciones de ^{3}H-cocaína en PBS. Esto
permitió la determinación de la cantidad de cocaína unida al
anticuerpo y la cantidad no unida. Los datos se analizaron
representando la cantidad de cocaína unida en función de la cantidad
de cocaína total y por representación de Scatchard (antígeno unido
frente a antígeno unido/libre).
Como era de esperar, los antisueros contenían
una mezcla heterogénea de anticuerpos con afinidades que variaban
desde 1 x 10^{-7} hasta -1 x 10^{-10} M. La capacidad de unión a
la cocaína fue de hasta aproximadamente 10 M, lo que indica una
concentración de anticuerpo específico de antígeno de
aproximadamente 0,7 mg/ml. Por lo tanto, la inmunización con la
vacuna del conjugado de cocaína puede producir anticuerpos con un
intervalo de afinidades de utilidad y con alta capacidad de unión a
la cocaína, de manera que una proporción sustancial del anticuerpo
total en circulación puede reaccionar con y neutralizar la
cocaína.
\newpage
Ejemplo
23
Para evaluar los cambios producidos por el
anticuerpo específico de la cocaína en la distribución de cocaína
en los tejidos, se siguió la distribución de
^{3}H-cocaína en ratones inmunizados con el
conjugado PS-5,7 cocaína-BSA y se
comparó con ratones control inmunizados con BSA. Se inyectaron por
vía intravenosa 0,5 mg/kg de ^{3}H-cocaína a los
ratones inmunizados con el conjugado y a los ratones control y se
les decapitó 0,5 minutos después de la inyección. Se extrajeron los
cerebros, corazones y sangre (plasma) para análisis posteriores de
la concentración de cocaína en tejidos y en plasma. La sangre se
recogió en tubos que contenían una disolución de fluoruro sódico
para inhibir esterasas y EDTA para evitar la coagulación. Las
muestras de cerebro, corazón y plasma se pusieron en viales de
centelleo que contenían un solubilizador de tejido; la digestión de
las muestras se produce durante 3 días a temperatura ambiente. Las
muestras se descoloraron y se añadió a cada muestra líquido de
centelleo. Se añadió ácido acético glacial para clarificar las
muestras. Después de contar las muestras en un contador de
centelleo, los datos se convirtieron en ng/g o ng/ml de tejido. La
concentración de cocaína en el tejido cerebral fue
significativamente más baja (n = 10, p<,05) a 0,5 minutos
después de la inyección (636,1 \pm 57,5 ng/g (media \pm ES)
para los ratones inmunizados con el conjugado
cocaína-BSA que para los ratones inmunizados con BSA
(1.052,2 \pm 93,85 ng/g).
Se inyectaron a varios grupos de ratones 0,5
mg/kg de cocaína por vía intravenosa dos veces para determinar la
capacidad del anticuerpo específico de la cocaína de inhibir la
distribución de dosis repetidas de cocaína. Solamente la segunda
dosis de cocaína, administrada 10 minutos después de la dosis
inicial, incluía ^{3}H-cocaína. El anticuerpo
inhibió la distribución de la redosis de cocaína al tejido cerebral
en los ratones inmunizados con el conjugado
cocaína-BSA (443,6 \pm 48,5 ng/g) comparado con
los ratones inmunizados con BSA (948,9 \pm 43,3 ng/g (n = 10,
p<,001)). De esta manera, la inhibición de la distribución de
cocaína después de la segunda dosis de cocaína fue similar a la
inhibición de la distribución después de una dosis.
Se anestesiaron ratones inmunes y ratones
control y se les inyectaron por vía intravenosa 0,015 mg/kg de
^{3}H-cocaína y se decapitaron 0,5 minutos después
de la inyección. Se extrajeron muestras de cerebro, corazón y
sangre (plasma) para análisis posteriores de la concentración de
cocaína. La concentración de cocaína en el tejido cardíaco en
ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA
(5,7 \pm 0,78 ng/g) fue significativamente más baja que la de los
ratones inmunizados con BSA (23,4 \pm 4,6 ng/g (n = 5,
p<,001)). La inhibición de la distribución de cocaína al tejido
cardíaco en ratones inmunizados con cocaína fue igual o mayor que
la inhibición de la distribución de cocaína al tejido cerebral.
Se compararon los efectos del anticuerpo
específico de la cocaína después de la administración intranasal de
cocaína con los efectos después de la administración intravenosa de
cocaína. En la administración intranasal la cinética de distribución
es diferente que en la administración intravenosa. Se anestesiaron
ratones inmunizados y control y se les administró intranasalmente 1
mg/kg de ^{3}H-cocaína en 50 l de PBS. Los niveles
de cocaína no alcanzaron el máximo hasta 2-5
minutos después de la administración intranasal comparado con el
máximo a los 15 segundos de la inyección intravenosa. Por lo tanto,
los ratones se decapitaron dos minutos después de la inyección de
cocaína y se extrajeron muestras de cerebro y sangre (plasma) para
análisis posteriores de la concentración de cocaína. Comparando la
administración intranasal de cocaína con la administración
intravenosa, los niveles totales de cocaína en los cerebros de los
ratones control son prácticamente iguales (1.538 ng/g intranasal
frente a 2.260 ng/g intravenoso).
La distribución de cocaína al cerebro después de
la administración intranasal de cocaína resultó inhibida por la
presencia de anticuerpo anticocaína. Se determinó una inhibición
significativa de la distribución de cocaína al cerebro después de
la administración intranasal de cocaína a ratones inmunizados con el
conjugado cocaína-BSA (708,3 \pm 82,8 ng/g)
comparado con los ratones control (1538,1 \pm 49,5 ng/g (n = 5,
p<,0001)).
Se compararon ratones con diferentes niveles de
anticuerpo específico de cocaína para determinar como afecta la
titulación de anticuerpo al grado de inhibición de la distribución
de cocaína. Los grupos de ratones inmunizados en este estudio
alcanzaron niveles de titulación que variaban entre 6.000 y
256.000. Se administraron 0,015 mg/kg de
^{3}H-cocaína a los ratones que presentaban una
titulación baja (de aproximadamente 6.000 a 18.000) o una
titulación alta (de aproximadamente 54.000 a 256.000) del anticuerpo
anticocaína. Treinta segundos después de la inyección intravenosa,
los ratones se decapitaron y se extrajeron muestras de los cerebros
y de la sangre (plasma) para análisis de la distribución de
cocaína.
Los ratones con titulaciones altas de anticuerpo
inhibieron la distribución de cocaína al cerebro significativamente
(ratones control: 26,1 \pm 2,0 ng/g, ratones inmunizados con
cocaína: 8,9 \pm 1,2 ng/g; n = 10, p<,0001). Por el contrario,
los ratones con titulaciones bajas mostraron una capacidad reducida
de inhibir la distribución al cerebro (ratones control: 24,4 \pm
2,98 ng/g, ratones inmunizados con cocaína: 15,7 \pm 3,4
ng/g).
Para determinar si el anticuerpo específico de
la cocaína modifica el metabolismo de la cocaína in vivo, se
analizaron en el tiempo los metabolitos de la cocaína en ratones
inmunizados con cocaína y en ratones control. Las muestras de
plasma ensayadas se obtuvieron como en los experimentos con
animales descritos y realizados en la Parte A de este Ejemplo. El
tiempo en el que se determinó la composición de metabolitos fue 30
minutos. El método de preparación del plasma para el análisis es el
descrito en la Parte A anterior.
Las muestras de plasma se alicuotaron y se
añadió cocaína no radiactiva, benzoilecgonina y norcocaína con el
fin de ayudar en la visualización UV de los compuestos. Las muestras
se aplicaron entonces a placas CCF de sílice que se revelaron en
dos sistemas de disolventes: metanol, cloroformo, y trietilamina
(3:1:0,1); y etilacetato, metanol, agua, y amoniaco concentrado
(85:10:3:1). Los metabolitos se identificaron por referencia con
compuestos control aplicados en las mismas placas. Las bandas se
rasparon de las placas y los compuestos que contenían ^{3}H se
detectaron por contaje de centelleo. De las cuentas obtenidas se
determinó la cantidad de cocaína, benzoilecgonina, ácido benzoico y
norcocaína como tanto por ciento del total de cuentas. La
radiactividad total en el plasma se determinó por contaje de
centelleo del plasma total. El ácido benzoico se detecta como un
metabolito cuando la cocaína se degrada a éster metílico de ecgonina
y ácido benzoico, por lo que es equimolar con el metabolito éster
metílico de ecgonina.
Los anticuerpos anticocaína parecen no tener un
efecto detectable en el metabolismo de la cocaína in vivo.
Después de 30 minutos los metabolitos encontrados son los
siguientes, expresados como tanto por ciento del total:
Para determinar si el anticuerpo específico de
cocaína cambia la velocidad de desaparición de la cocaína del
plasma, se analizaron muestras de plasma recogidas a diferentes
tiempos después de inyectar cocaína a animales inmunizados con el
conjugado cocaína-BSA y a animales inmunizados con
BSA. Se inyectó a los ratones inmunizados y control 1 mg/kg de
^{3}H-cocaína por vía intravenosa y se decapitaron
a los 0,5, 5 ó 30 minutos después de la inyección. Se extrajeron
los cerebros y la sangre (plasma) para análisis posterior de la
concentración de cocaína en cerebro y en plasma, del tanto por
ciento de cocaína unida al anticuerpo y para cuantificar por CCF la
concentración de cocaína y los metabolitos de la cocaína en
plasma.
El plasma se analizó, como se describe en la
Parte E más arriba, para determinar el porcentaje de la
radiactividad total en la forma de cocaína y cualquiera de sus
metabolitos. Las muestras de plasma también se analizaron para
determinar el total de radiactividad. La velocidad de desaparición
de la cocaína del plasma de los ratones inmunizados con el
conjugado cocaína-BSA se comparó con la velocidad de
desaparición de la cocaína del plasma de los ratones inmunizados
con BSA. En este análisis, se consideró la pequeña fracción de
norcocaína (menor del 5%) con la cocaína al presentar la norcocaína
actividad en el SNC y unirse al anticuerpo. Este hecho no modifica
los resultados descritos más adelante.
La cocaína desaparece del plasma de ambos grupos
de animales a velocidades similares. Entre 30 segundos y 30
minutos, alrededor del 80% de la cocaína ha desaparecido del plasma
de ambos grupos de animales. La desaparición de la cocaína del
plasma a esos tiempos después de la inyección se debe tanto a la
redistribución como al metabolismo. Aunque la cocaína desaparece a
la misma velocidad en los dos grupos de animales, hay más cocaína
en el plasma de los ratones inmunizados con el conjugado
cocaína-BSA que en el plasma de los ratones
inmunizados con BSA a todos los tiempos. La presencia del
anticuerpo específico de la cocaína no modifica de manera detectable
la duración de la cocaína.
La inhibición de la distribución mostrada más
arriba es posible si la cocaína se encuentra unida al anticuerpo en
el mismo animal. Para determinar el grado de unión de la cocaína al
anticuerpo en plasma, se inyectó a ratones inmunizados y control 1
mg/kg de ^{3}H-cocaína por vía intravenosa y se
decapitaron a los 0,5 minutos después de la inyección. Se extrajo la
sangre (plasma) y se utilizaron lechos de proteína G para capturar
los complejos anticuerpo-cocaína. Los lechos de
proteína G se añadieron al plasma de un animal inyectado con
^{3}H-cocaína (con NaF para inhibir la degradación
de la cocaína) y se incubaron. Después de aclarar, cada volumen de
aclarado y los lechos se añadieron a líquido de centelleo. La
^{3}H-cocaína se detectó por contaje de centelleo.
Se analizó el mismo plasma para determinar la degradación de la
cocaína como en el ensayo de metabolismo (Parte E) más arriba. Como
los anticuerpos producidos después de la inmunización con el
conjugado cocaína-BSA se unen a la cocaína y a la
norcocaína, pero no a los otros metabolitos principales, como se
demuestra en los Ejemplos, se calculó el porcentaje de unión en
base a la cantidad de cocaína y norcocaína hallada en la muestra de
plasma.
En los animales inmunizados con el conjugado
cocaína-BSA, una media de aproximadamente 50% de
cocaína en la muestra de plasma estaba unida al anticuerpo. Esto se
compara con los animales inmunizados con BSA en los que el 3% de la
cocaína estaba unida al anticuerpo. Este 3% representa la línea base
en el ensayo.
Se inyectó el conjugado
cocaína-CTB PS-5,53 a ratones para
determinar su capacidad de incitar anticuerpos que alteren la
distribución de cocaína. Se inyectó CTB a grupos de ratones
control. Se administraron a los ratones dosis de refuerzo de los
conjugados cocaína-CTB PS-5,53 y
PS-5,70 según lo que se necesite, hasta que las
titulaciones de anticuerpo sean alrededor de 54.000 o mayores. Los
métodos utilizados para la inmunización y el ensayo de las
titulaciones de anticuerpo específico de la cocaína se describen en
los Ejemplos. Se inyectaron con 0,5 mg/kg de
^{3}H-cocaína ratones con titulaciones de
anticuerpo específico de la cocaína y ratones control y se
decapitaron 30 segundos después de la inyección. Se aisló tejido
cerebral y plasma y se analizaron para determinar el contenido de
^{3}H-cocaína como se describe en la parte A de
este Ejemplo.
El anticuerpo producido después de la
inmunización con el conjugado cocaína-CTB inhibía la
distribución de cocaína al cerebro de manera significativa. Se
encontró una cantidad significativamente menor de cocaína en el
tejido cerebral de ratones inmunizados con el conjugado
CTB-cocaína que en el de ratones inmunizados con
CTB (678,8 ng/g comparado con 885,4 ng/g, n = 6, p = 0,0004 test de
Student para dos colas). De la misma manera, la cocaína se retuvo
en mayor cantidad en el plasma de ratones inmunizados con el
conjugado cocaína-CTB que en el de ratones
inmunizados con CTB. Por lo tanto, el conjugado
cocaína-CTB resulta eficaz para generar anticuerpo
que inhibirá la distribución de cocaína al cerebro.
Ejemplo
24
Los ratones se inmunizan con el conjugado
PS-5-CTB utilizando regímenes de
inmunización óptimos como se describe en los Ejemplos. A diferentes
tiempos, los animales se sangran y se evalúan las titulaciones de
anticuerpo anticocaína por ELISA. Los animales con titulaciones de
anticuerpo de aproximadamente 54.000 o mayores se sacrifican y se
sangran por punción cardiaca. Los ratones control se inmunizan
únicamente con la proteína transportadora. Los sueros de varios
ratones (al menos 20) se juntan y se aísla la fracción IgG por
precipitación con sulfato amónico. Después de diálisis para
eliminar el sulfato amónico, se cuantifica por ELISA el nivel del
anticuerpo específico de la cocaína en la fracción de
inmunoglobulina. Se administran i.p. o i.v. diferentes cantidades
de inmunoglobulina a ratones sin inmunizar. Después de 24 horas, los
ratones se sangran y se ensaya el suero para determinar el nivel
del anticuerpo específico de la cocaína. Utilizando este método, se
determina la cantidad de anticuerpo que debe ser transferida para
alcanzar una determinada titulación. Se administra a grupos de
ratones inmunoglobulina inmune y se sangran en diferentes períodos
de tiempo para determinar la velocidad de desaparición del
anticuerpo específico del antígeno. A otros grupos de ratones se les
administra cocaína radiactiva, como se describe en los Ejemplos, y
se determina la distribución de cocaína al cerebro. Los ratones
control reciben IgG de los ratones inmunizados con el transportador.
Estos experimentos demuestran la capacidad de la inmunoglobulina
inmune transferida pasivamente de inhibir la entrada de cocaína en
el cerebro.
Ejemplo
25
Se inmuniza un conjunto de donantes humanos con
el conjugado PS-5-CTB o con otros
conjugados de la invención utilizando regímenes de inmunización
óptimos como se describe en los Ejemplos. A diferentes tiempos, los
donantes se sangran por punción venosa y se ensayan las
titulaciones del anticuerpo anticocaína por ELISA. Se junta el
plasma hiperinmune de varios donantes y se aísla la fracción IgG por
fraccionamiento con alcohol frío. La preparación de anticuerpo se
tampona, se estabiliza, se conserva y se estandariza según lo
requerido para preparaciones de anticuerpo hiperinmunes para uso en
seres humanos. Se estandariza la cantidad de anticuerpo anticocaína
por ELISA o por otros ensayos basados en anticuerpos.
Se administra intramuscular o intravenosamente
una dosis apropiada del anticuerpo purificado a pacientes con o sin
la vacuna cocaína-CTB, que se administra en otro
sitio anatómico distinto al de la administración de la vacuna. La
dosis apropiada se determina ensayando los niveles séricos de los
receptores en una población de pacientes experimental por ELISA o
por otro ensayo basado en anticuerpos a las 24 horas o a otro tiempo
apropiado después de la inyección de la preparación hiperinmune de
anticuerpo y/o ensayando la eficacia de diferentes dosis para
inhibir los efectos de la cocaína.
La globulina inmune transferida pasivamente
inhibe los efectos de la cocaína en los pacientes. La utilización
de donantes humanos, de anticuerpo policlonal, y de un gran número
de donantes limita la posibilidad de una respuesta inmune de los
pacientes al anticuerpo transferido. Esto demuestra que el conjugado
cocaína-CTB induce anticuerpos en un conjunto de
donantes que pueden ser utilizados para inmunizar pasivamente a
pacientes contra los efectos de la cocaína.
Las personas especializadas en el tema, podrán
identificar, o ser capaces de descubrir, únicamente a través de la
experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a las sustancias
específicas y a los procedimientos descritos en la presente
memoria. Estos equivalentes se consideran dentro del ámbito de esta
invención, y son abarcados por las siguientes reivindicaciones.
Claims (10)
1. Utilización de: un conjugado terapéutico
hapteno-transportador que comprende (a) al menos un
hapteno derivado de la nicotina y (b) un transportador que contiene
una proteína, cuyo transportador contiene al menos un epítopo de
célula T y es seleccionado de:
productos bacterianos, subunidades víricas,
lectinas, antígeno de la proteína de la malaria, péptidos
multi-antigénicos sintéticos y modificaciones,
análogos y derivados de éstos, y alergenos proteicos y derivados,
fragmentos y análogos de alergenos;
siendo dicho conjugado terapéutico
hapteno-transportador capaz de incitar anticuerpos
antinicotina cuando se utiliza para la vacunación de sujetos; en la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
drogadicción en un ser humano.
2. Utilización de un conjugado
hapteno-transportador de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el transportador es un derivado de una
toxina bacteriana.
3. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la mencionada preparación
farmacéutica comprende un excipiente aceptable desde un punto de
vista farmacéutico.
4. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica puede ser administrada por vía mucosal y comprende
microesferas de copolímero, opcionalmente de copolímero
poli(láctido-coglicólido).
5. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica es una preparación de liberación sostenida o
dirigida.
6. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica está liofilizada.
7. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica puede ser administrada tópicamente y cuya preparación
tiene opcionalmente una viscosidad mayor que la del agua.
8. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica es una preparación en aerosol pulverizable y que
comprende, opcionalmente, un propelente gaseoso volátil.
9. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mencionada preparación
farmacéutica consta de un adyuvante, opcionalmente hidróxido de
aluminio.
10. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que se acoplan al menos dos
haptenos y hasta 70 haptenos a la proteína transportadora.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41497195A | 1995-03-31 | 1995-03-31 | |
US414971 | 1995-03-31 | ||
US563673 | 1995-11-28 | ||
US08/563,673 US5760184A (en) | 1995-03-31 | 1995-11-28 | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2287379T3 true ES2287379T3 (es) | 2007-12-16 |
Family
ID=27022809
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03008324T Expired - Lifetime ES2287379T3 (es) | 1995-03-31 | 1996-03-27 | Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. |
ES96910595T Expired - Lifetime ES2210356T3 (es) | 1995-03-31 | 1996-03-27 | Conjugados de haptano-transportador para empleo en terapia contra el uso de drogas. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96910595T Expired - Lifetime ES2210356T3 (es) | 1995-03-31 | 1996-03-27 | Conjugados de haptano-transportador para empleo en terapia contra el uso de drogas. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6054127A (es) |
EP (1) | EP0814843B1 (es) |
AT (2) | ATE362380T1 (es) |
AU (1) | AU5374996A (es) |
CA (1) | CA2216658C (es) |
DE (2) | DE69630877T2 (es) |
DK (2) | DK1329226T3 (es) |
ES (2) | ES2287379T3 (es) |
PT (1) | PT814843E (es) |
WO (1) | WO1996030049A2 (es) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020032316A1 (en) * | 1995-03-31 | 2002-03-14 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same |
US5840307A (en) * | 1995-03-31 | 1998-11-24 | Immulogic Pharmacuetical Corp. | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation |
US5876727A (en) * | 1995-03-31 | 1999-03-02 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same |
US5817770A (en) | 1997-03-21 | 1998-10-06 | Drug Abuse Sciences, Inc. | Cocaethylene immunogens and antibodies |
SE9801923D0 (sv) * | 1998-05-29 | 1998-05-29 | Independent Pharmaceutical Ab | Nicotine vaccine |
US6232082B1 (en) | 1998-12-01 | 2001-05-15 | Nabi | Hapten-carrier conjugates for treating and preventing nicotine addiction |
US20010049375A1 (en) | 2000-03-15 | 2001-12-06 | Wolfgang Sadee | Neutral antagonists and use thereof in treating drug abuse |
WO2002046234A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | The Scripps Research Institute | Cocaine haptens |
RU2326693C2 (ru) * | 2002-07-18 | 2008-06-20 | Цитос Байотекнолоджи Аг | Конъюгаты гаптен-носитель и их применение |
US7220842B2 (en) * | 2004-04-05 | 2007-05-22 | Dade Behring Inc. | Immunoassays for buprenorphine and norbuprenorphine |
MXPA04006617A (es) | 2004-07-07 | 2006-01-12 | Inst Nac De Psiquiatria Ramon | Proceso para la preparacion y uso de una vacuna bivalente contra la adiccion a la morfina-heroina. |
US20060024768A1 (en) * | 2004-07-29 | 2006-02-02 | Saladax Biomedical, Inc. | Taxol immunoassay |
EP1854478A1 (en) * | 2006-05-12 | 2007-11-14 | Cytos Biotechnology AG | Nicotine-carrier vaccine formulation |
WO2009051824A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Aiko Biotechnology | Combination analgesic employing opioid and neutral antagonist |
US8748448B2 (en) | 2007-10-18 | 2014-06-10 | Aiko Biotechnology | Combination analgesic employing opioid agonist and neutral antagonist |
FR2952935B1 (fr) * | 2009-11-20 | 2011-12-02 | Sanofi Aventis | Procede de preparation du n-biotinyl-6-aminocaproate de n succinimidyle |
CA2789539A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-12 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
US9347065B2 (en) | 2012-03-29 | 2016-05-24 | International Aids Vaccine Initiative | Methods to improve vector expression and genetic stability |
CN108409749B (zh) * | 2018-01-30 | 2019-09-06 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 钩吻素己半抗原和全抗原及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4375414A (en) * | 1971-05-20 | 1983-03-01 | Meir Strahilevitz | Immunological methods for removing species from the blood circulatory system and devices therefor |
US3766162A (en) * | 1971-08-24 | 1973-10-16 | Hoffmann La Roche | Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor |
US3888886A (en) * | 1972-06-08 | 1975-06-10 | Mobil Oil Corp | Oxidation of alkanes to maleic anhydride using promoted vanadium-phosphorus catalyst |
US4045420A (en) * | 1973-05-29 | 1977-08-30 | Syva Company | Non-oxo-carbonyl containing benzoyl ecgonine and cocaine compounds polypeptide and derivatives thereof |
US4197237A (en) * | 1973-06-01 | 1980-04-08 | Syva Company | Antibodies to nitrogen derivatives of benzoyl ecgonine antigenic conjugates thereof |
US4207307A (en) * | 1977-01-21 | 1980-06-10 | Research Corporation | Simultaneous immunoassay of multiple antigens and assay for cocaine metabolites |
SU792869A1 (ru) * | 1979-03-30 | 1982-03-30 | Научно-Исследовательский Институт По Биологическим Испытаниям Химических Соединений | Способ получени конъюгированных антигенов барбитурова кислота-иммуногенный носитель |
US4376825A (en) * | 1979-05-07 | 1983-03-15 | Syva Company | Enzyme amplification compounds for assays for androgens |
US4666837A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-19 | Smithkline-Rit | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits |
SU1123704A1 (ru) * | 1983-04-08 | 1984-11-15 | Научно-Исследовательский Институт По Биологическим Испытаниям Химических Соединений | Способ получени конъюгированных антигенов |
US5019384A (en) * | 1986-06-30 | 1991-05-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunonodulating compositions and their use |
US5229490A (en) * | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US4791067A (en) * | 1987-06-25 | 1988-12-13 | Fisher Scientific Co. | Agglutination immunoassay for hapten involving monoclonal antibody of IgA class reagent |
DE3884731D1 (de) * | 1987-10-09 | 1993-11-11 | Ube Industries | Monoklonaler Antikörper gegen Methamphetamin, seine Herstellung, Testverfahren und Testsatz für Methamphetamin. |
JP2921574B2 (ja) * | 1988-02-01 | 1999-07-19 | アメリカン・サイアナミド・カンパニー | 接合体ワクチンの担体分子としてのt細胞のエピトープ |
GB8812214D0 (en) * | 1988-05-24 | 1988-06-29 | Hoffmann La Roche | Use of peptide from circumsporozoite protein of p falciparum as universally recognized t-cell epitope |
US5026827A (en) * | 1988-09-02 | 1991-06-25 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Amphetamine-protein complex as immunogen for obtaining antibodies specific to methamphetamine |
US5268276A (en) * | 1988-09-16 | 1993-12-07 | Jan Holmgren | Recombinant systems for expression of cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides |
EP0363041A1 (en) * | 1988-09-21 | 1990-04-11 | Ube Industries, Ltd. | Monoclonal antibody to morphine, preparation of monoclonal antibody, assaying kit and assaying method of morphine |
EP0386644B1 (en) * | 1989-03-10 | 1997-06-04 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Reagents for the determination of drugs |
GB8924438D0 (en) * | 1989-10-31 | 1989-12-20 | Hoffmann La Roche | Vaccine composition |
US5096838A (en) * | 1989-11-27 | 1992-03-17 | Abbott Laboratories | Barbiturate assay compositions and methods |
CH678394A5 (es) * | 1990-08-22 | 1991-09-13 | Cerny Erich H | |
JPH04182499A (ja) * | 1990-11-14 | 1992-06-30 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | エクゴニン・タンパク質コンジュゲート及びその誘導体 |
US5233042A (en) * | 1991-12-16 | 1993-08-03 | Biosite Diagnostics, Inc. | Cocaine derivatives |
US5283066A (en) * | 1992-02-19 | 1994-02-01 | Development Center For Biotechnology | Method of stimulating an immune response by using a hapten |
US5302715A (en) * | 1992-04-06 | 1994-04-12 | Biosite Diagnostics, Inc. | Benzodiazepine derivatives |
WO1993023076A1 (en) * | 1992-05-20 | 1993-11-25 | The Johns-Hopkins University | Alternative receptor therapy |
DE69332637T2 (de) * | 1993-03-04 | 2003-10-23 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Kokainderivat,Proteinkonjugat,davon,einen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom-Zellinie, Verfahren zur Herstellung der Hybridom-Zellinie und des monoklonalen Antikörpers |
AU686669B2 (en) * | 1993-09-17 | 1998-02-12 | Smithkline Beecham Corporation | Drug binding protein |
WO1995027786A1 (en) * | 1994-04-08 | 1995-10-19 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | Pharmaceutical formulations for treating japanese cedar pollen allergy |
-
1996
- 1996-03-27 AT AT03008324T patent/ATE362380T1/de active
- 1996-03-27 ES ES03008324T patent/ES2287379T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-27 PT PT96910595T patent/PT814843E/pt unknown
- 1996-03-27 ES ES96910595T patent/ES2210356T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-27 AT AT96910595T patent/ATE254930T1/de active
- 1996-03-27 DE DE69630877T patent/DE69630877T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-27 DK DK03008324T patent/DK1329226T3/da active
- 1996-03-27 DE DE69637089T patent/DE69637089T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-27 EP EP96910595A patent/EP0814843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-27 CA CA002216658A patent/CA2216658C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-27 AU AU53749/96A patent/AU5374996A/en not_active Abandoned
- 1996-03-27 DK DK96910595T patent/DK0814843T3/da active
- 1996-03-27 WO PCT/US1996/004189 patent/WO1996030049A2/en active IP Right Grant
-
1997
- 1997-06-27 US US08/884,497 patent/US6054127A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE362380T1 (de) | 2007-06-15 |
AU5374996A (en) | 1996-10-16 |
DK0814843T3 (da) | 2004-03-29 |
CA2216658C (en) | 2008-05-13 |
US6054127A (en) | 2000-04-25 |
EP0814843A2 (en) | 1998-01-07 |
EP0814843B1 (en) | 2003-11-26 |
PT814843E (pt) | 2004-04-30 |
DE69637089T2 (de) | 2008-01-17 |
DE69630877D1 (de) | 2004-01-08 |
CA2216658A1 (en) | 1996-10-03 |
ES2210356T3 (es) | 2004-07-01 |
WO1996030049A3 (en) | 1997-03-06 |
ATE254930T1 (de) | 2003-12-15 |
DK1329226T3 (da) | 2007-09-24 |
DE69630877T2 (de) | 2004-11-11 |
WO1996030049A2 (en) | 1996-10-03 |
DE69637089D1 (de) | 2007-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5876727A (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same | |
ES2287379T3 (es) | Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. | |
US5760184A (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same | |
US20100209449A1 (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same | |
WO1998014216A9 (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy and methods for preparation of same | |
AU776410B2 (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy | |
CA2588767A1 (en) | Hapten-carrier conjugates for use in drug-abuse therapy |