DE69738140T2 - Hapten-träger konjugate zur verwendung in der drogentherapie und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von Drogenmissbrauch. Spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Drogen/Hapten-Carrier-Konjugate, die Antikörper-Reaktionen hervorrufen und die zur Behandlung von Drogenmissbrauch eingesetzt werden können.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das weltweite Überhandnehmen des Drogengebrauchs und -missbrauchs hat speziell in den Vereinigten Staaten epidemisches Niveau erreicht. Es gibt eine Überfülle an Drogen, sowohl legalen als auch illegalen, deren Missbrauch ernsthaft Thema der öffentlichen Politik geworden ist, das alle Gesellschaftsschichten mit all seinen offensichtlichen medizinischen und sozialen Konsequenzen berührt. Einige Anwender leben in einer hoch riskanten Population in Verbindung mit Armut und illegaler Aktivität. Andere Anwender, die sich selbst als Freizeitanwender bezeichnen würden, haben ein Risiko infolge (a) von Eigenschaften der Droge(n), die sie süchtig machen, (b) einer Prädisposition der Anwender zu starker Gebrauch oder (c) einer Kombination von Faktoren, einschließlich persönlicher Umstände, Not, Umgebung und Zugang. Eine angemessene Behandlung von Drogenmissbrauch, einschließlich des Missbrauchs mehrerer Drogen, erfordert innovative und kreative Interventionsprogramme.
  • Drei besonders süchtig machende Drogen sind Kokain, Heroin und Nikotin.
  • Nikotin [1-Methyl-2-(3-pyridyl)pyrrolidon] ist ein Alkaloid, das aus den Tabakblättern gewonnen wird. Nikotingebrauch ist weltweit verbreitet und ist legal in vielen Formen erhältlich, z.B. Zigaretten, Zigarren, Pfeifentabak und rauchlosem Tabak (Kautabak). Obwohl die zur Sucht führende Natur von Nikotin und die Gefahren des Rauchens seit vielen Jahren bekannt sind (Slade et al (1995) JAMA 274(3):225-233), bleibt Zigarettenrauchen populär. Geschätzte 51 Millionen Amerikaner rauchen und, gemäß dem Center for Disease Control and Prevention sterben jährlich 420 000 Menschen an Erkrankungen, die mit dem Rauchen zusammenhängen.
  • Das populärste Nikotin abgebende System ist die Zigarette. Zigaretten enthalten 6 bis 11 mg Nikotin, wovon der Raucher typischerweise 1 bis 3 mg absorbiert. Der typische Päckchen-pro-Tag-Raucher absorbiert pro Tag 20 bis 40 mg Nikotin, womit er Plasmakonzentrationen von 25 bis 50 ng pro Milliliter erreicht. Die Halbwertszeit von Nikotin im Plasma ist etwa zwei Stunden; die Halbwertszeit des hauptsächlichen Metaboliten Cotinin ist 19 Stunden. (Henningfield (1995) The New England Journal of Medicine 333(18):1196-1203).
  • Da Nikotin legal und in weitem Umfang erhältlich ist, gibt es relativ wenig Druck gegen seinen Gebrauch im Gegensatz zu Kokain und Heroin. Obwohl ein großer Prozentsatz süchtiger Raucher den Wunsch geäußert hat, das Rauchen zu beenden, und viele tatsächlich aufzuhören versuchen, werden nur 2 bis 3 Prozent der Raucher jährlich Nichtraucher. (Henningfield (1995) s.o.). Die hohe Rückfallrate von Rauchern, die auszusteigen versuchen, ist ein Indikator für den starken Effekt der Nikotinabhängigkeit. (O'Brien et al. (1996) Lancet 347:237-240).
  • Nikotinsucht ist eine chronische Erkrankung mit Rückfallsneigung. Nikotin zielt auf das mesolimbische Belohnungssystem, was gelegentlich zur Abhängigkeit führt. Untersuchungen zeigen, dass Nikotin an die α-Subunit des Nikotin-acetylcholin-Rezeptors im zentralen und peripheren Nervensystem bindet, was zu gesteigerter Dopamin-Freisetzung führt. Es wird angenommen, dass erhöhte Zahlen an Nikotin-acetylcholin-Rezeptoren im Gehirn die physiologische Abhängigkeit von Nikotin steigern (Balfour (1994) Addiction 89:1419-1423). Diese physiologischen Effekte von Nikotin sind mächtige Verstärker der psychologischen Sucht. Die gesteigerte Wahrnehmung und verbesserte Stimmung von Nikotinnutzern sowie die negativen Wirkungen, die mit der Abstinenz verbunden sind (z.B. Entzugserscheinungen) wirken als kraftvolle Motivatoren für einen fortgesetzten Tabakgebrauch.
  • Der Mangel an effektiven Therapien von Nikotinabhängigkeit und die geringe Erfolgsrate bei jenen, die es versuchen und den Gebrauch beenden, zeigen, dass es einen großen Bedarf an einer neuen Therapie gibt. Derzeit sind die beiden populärsten Therapien Nikotin-Polacrilex („Nikotingummi") und Systeme zur transdermalen Abgabe („Nikotinpflaster"). Diese „Ersatzmedikationen" wirken, indem sie geringe Nikotinmengen während eines Zeitraums freisetzen, um den Nikotinanwender langsam von der Droge zu entwöhnen. Es wird angenommen, dass diese Methoden Entzugssymptome reduzieren und gewisse Effekte liefern, deretwegen der Anwender sich zuvor auf Zigaretten verließ (z.B. erwünschte Stimmung und Aufmerksamkeitszustände) (Henningfield (1995) s.o.). Diese Methoden leiden jedoch an den Nachteilen einer geringen Durchsetzung und Rückfällen bei nicht motivierten Aussteigern. Außerdem wurden negative Effekte von Anwendern von Nikotingummi berichtet, wie Mundirritationen, Dyspepsie, Übelkeit, Schluckauf, Parästhesie. Berichtete nachteilige Effekte des Nikotinpflasters umfassen Hautreaktionen (Jucken oder Ausschläge), Schlafstörungen, Verdauungsprobleme, Schläfrigkeit, Nervosität, Benommenheit und Schwitzen (Haxby (1995) Am.J.Health-Syst.Pharm. 52:265-281).
  • Experimentelle diagnostische Ansätze und Therapien zur Behandlung von Drogensucht wurden in der Literatur vorgeschlagen, die jedoch in die Praxis umgesetzt werden müssen. Beispielsweise wurde die Impfung als therapeutischer Ansatz für Drogensucht zuvor prinzipiell beschrieben. Bonese et al. untersuchten Veränderungen der Selbstverabreichung von Heroin bei einem Rhesusaffen nach Immunisierung gegen Morphin (Bonese et al. (1974) Nature 252: 708-710). Bagasra et al. forschten unter Verwendung von Kokain-KLH-Impfung als Mittel um Sucht vorzubeugen (Immunopharmacol. (1952) 23:173-179), obwohl keine schlüssigen Resultate produziert werden, und die von Bagasra angewendeten Methoden diskutiert werden. (Gallacher (1994) Immunopharm. 27:79-81). Offensichtlich muss ein Konjugat, wenn es in einem therapeutischen Ansatz effektiv sein soll, imstande sein, Antikörper hervorzurufen, die in vivo zirkulierendes freies Kokain, Heroin oder Nikotin erkennen können. Cerny ( WO 92/03163 ) beschreibt einen Impfstoff und Immunoserum gegen Drogen. Der Impfstoff besteht aus einem an ein Carrier-Protein gebundenen Hapten, das Antikörper produzieren soll. Ebenso geoffenbart ist die Produktion von Antikörpern gegen Drogen und der Einsatz dieser Antikörper in der Entgiftung von jemand, der die Droge genommen hat. Carrera et al., Nature 378:727-730 (1995) offenbaren die Synthese eines Kokain-KLH-Impfstoffs, der Antikörper gegen Kokain hervorrufen soll, die die Effekte der freien Beweglichkeit der Droge in Ratten blockieren. Blincko, US-Patent Nr. 5 256 409 offenbart einen Impfstoff, der ein Carrier-Protein, gebunden an ein Hapten aus der Desipramine/Imipramine-Klasse von Drogen umfasst. Liu et al., US-Patent Nr. 5 283 066 , offenbart die Verwendung eines festen Hapten-Polymer-Trägerkomplexes, um eine Immunantwort hervorzurufen.
  • Die passive Verabreichung von monoklonalen Antikörpern zur Behandlung von Drogenmissbrauch wurde früher beschrieben (siehe Killian et al. (1978) Pharmacol. Biochem. Behavior 9:347-352; Pentel et al. (1991) Drug Met. Dispositions 19:24-28). In diesem Ansatz werden vorgebildete Antikörper gegen ausgewählte Drogen passiv an Tiere verabreicht. Während diese Daten eine Demonstration der Ausführbarkeit immunologischer Ansätze zur Suchttherapie liefern, leidet die passive Immunisierung als Strategie für eine Langzeittherapie beim Menschen an einer Anzahl wesentlicher Nachteile. Erstens, wenn Antikörper, die für eine passive Therapie verwendet werden sollen, aus nicht-humanen Quellen stammen oder monoklonale Antikörper sind, werden diese Präparate vom Patienten als fremde Proteine erkannt, und es kann eine rasche Immunantwort auf die fremden Antikörper geben. Diese Immunantwort kann die passiv verabreichten Antikörper neutralisieren, wodurch ihre Effektivität blockiert wird und der Zeitraum des folgenden Schutzes drastisch reduziert wird. Außerdem kann die neuerliche Verabreichung des gleichen Antikörpers infolge der potentiellen Verursachung einer Hypersensivitätsreaktion problematisch werden. Diese Probleme können überwunden werden durch Produktion von immunem Immunoglobulin in menschlichen Spendern, die mit dem Impfstoff immunisiert wurden. Dieser Ansatz wird detaillierter in den Beispielen diskutiert. Zweitens werden die passiv verabreichten Antikörper relativ rasch aus dem Kreislauf ausgeschieden. Die Halbwertszeit eines gegebenen Antikörpers in vivo liegt zwischen 2,5 und 23 Tagen je nach dem Isotyp. Wenn also die Antikörper passiv verabreicht werden, statt sie durch Immunisierung hervorzurufen, kann nur kurzfristige Effektivität erreicht werden.
  • Eine weitere immunologische Annäherung an die Drogensucht liegt in der Verwendung eines katalytischen Antikörpers, der imstande ist, die Hydrolyse des Kokainmoleküls im Menschen zu unterstützen (Landry et al. (1993) Science 259:1899-1901). Der katalytische Antikörper wird erzeugt durch Immunisierung eines Versuchstieres mit einem Kokain-Analogon im Übergangsstadium, das an ein Carrier-Protein gebunden ist; ein monoklonaler Antikörper wird dann ausgewählt, der die gewünschte katalytische Aktivität hat. Obwohl dieser Ansatz theoretisch attraktiv ist, leidet er ebenfalls an einigen ernsthaften Problemen. Katalytische Antikörper müssen passiv verabreicht werden und weisen daher alle Nachteile der passiven Antikörpertherapie auf. Eine aktive Immunisierung zur Erzeugung eines katalytischen Antikörpers ist nicht durchführbar, da enzymatische Aktivität unter Antikörpern, die gegen Analoga im Übergangsstadium hervorgerufen werden, selten ist, und eine Aktivität scheint in polyklonalen Präparaten nicht feststellbar zu sein. Außerdem macht die generelle Esterase-ähnliche Aktivität derartiger katalytischer Antikörper und die unkontrollierte Natur der aktiven Immunantwort in genetisch verschiedenen Individuen sie zu potentiell toxischen Molekülen, besonders, wenn sie in einem menschlichen Patienten produziert werden.
  • Yugawa et al. ( EP 0 613 899 A2 ) schlägt die Verwendung eines ein Kokainderivat enthaltenden Kokain-Protein-Konjugats zur Erzeugung von Antikörpern für den Nachweis von Kokain oder Kokainderivaten in einer Blutprobe vor. Die Syva-Patente ( US Patent Nr. 3 88 866 , Nr. 4 123 431 und Nr. 4 197 237 ) beschreiben Konjugate zur Erzeugung von Kokainantikörpern für Immunoassays. Veröffentlicht sind Konjugate zu BSA unter Verwendung von Diazoniumsalzen, abgeleitet von Benzoylecgonin und Kokain. Konjugate werden hergestellt unter Verwendung von para-Iminoesterderivaten von Kokain und Norkokain, die einen Carrier konjugieren. Biosite ( WO 93/12111 ) offenbart Konjugate von Kokain, die die para-Stellung des Phenylrings verschiedener Kokainderivat nutzen, die Stabilität gegen Hydrolyse durch Einführung einer Amidbindung zu erhöhen. Die Strahilevitz-Patente ( US Patent Nr. 4 620 977 ; US Patent 4 813 924 ; US Patent 4 834 973 und US Patent 5 037 645 ) offenbaren die Verwendung von Proteinkonjugaten endogener Substanzen und Drogen zur Behandlung von Erkrankungen, Vorbeugung gegen psychoaktive Haptene, sowie zur Verwendung in Immunoassays, Immunodialyse, und Immunoadsorption.
  • Bjerke et al. (1987) Journal of Immunological Methods 96: 239-246 beschreibt die Verwendung eines Konjugats von Cotinin-4'-carbonsäure, kovalent gebunden an Poly-L-lysin, zur Erzeugung von Antikörpern gegen den Nikotinmetaboliten Cotinin für den Einsatz beim Nachweis der Anwesenheit von Cotinin in physiologischen Flüssigkeiten. Ferner beschreibt Abad et al. (1993) Anal. Chem. 65(22): 3227-3231 die Verwendung von 3'-(Hydroxymethyl)-nikotin-hemisuccinat, konjugiert an BSA, zur Bildung von Antikörpern gegen Nikotin für die Verwendung in einem ELISA, der zur Messung von Nikotin in Kondensaten von Zigarettenrauch eingesetzt wird. Keine der Referenzen jedoch lehrt oder schlägt die Verwendung eines Nikotin-Carrier-Konjugats zur Verwendung als Impfstoff gegen Nikotinmissbrauch vor.
  • Keine wirksame Therapie von Drogenmissbrauch, speziell Nikotinmissbrauch, wurde entwickelt. Es besteht daher ein Bedarf, einen Ansatz für die Langzeitbehandlung von Nikotinmissbrauch zu entwickeln, die nicht vollständig vom süchtigen Individuum im Hinblick auf Compliance (Therapietreue) und Selbstverabreichung abhängt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beseitigt die oben erwähnten Nachteile und sieht Konjugate zur Behandlung von Drogenmissbrauch vor. Indem therapeutische Präparate, insbesondere Hapten-Carrier-Konjugate, verwendet werden, ruft die vorliegende Erfindung eine Immunantwort in Form von Antidrogen-Antikörpern im Süchtigen hervor, die, wenn das geimpfte Individuum anschließend Drogen ausgesetzt wird, die Droge neutralisieren, sodass die erwarteten pharmakologischen Effekte vermindert, wenn nicht eliminiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Hapten-Carrier-Konjugat vor, das zumindest ein Hapten, abgeleitet von Nikotin, und zumindest einen Carrier, enthaltend ein T-Zell-Epitop, umfasst und worin das Hapten und der Carrier durch den CJ11-Zweig, in der Anmeldung als YCO(CH2)nCOQ identifiziert, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S, O und NH, und Q ist der Carrier und n ist eine ganze Zahl von 2 bis 20, gebunden sind.
  • Die Erfindung sieht ferner ein Hapten-Carrier-Konjugat vor, das zumindest ein von Nikotin abgeleitetes Hapten und zumindest einen Carrier, enthaltend ein T-Zell-Epitop, umfasst, wobei das Hapten und der Carrier durch den CJ11-Zweig, in der Anmeldung als YCO(CH2)nCOQ identifiziert, verbunden sind, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats zur Behandlung von Drogenmissbrauch beim Menschen.
  • Die Erfindung sieht noch weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats vor, das die Verbindung des Haptens und des ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carriers durch Vernetzung mit einer Verbindung, ausgewählt aus einem von einer Carbonsäure abgeleiteten aktiven Ester, einem gemischten Anhydrid, einem Acylazid, einem Acylhalogenid, einem Iminoester, umfasst.
  • Wenn das das Droge/Hapten-Carrier-Konjugat enthaltende therapeutische Präparat einem süchtigen Individuum verabreicht wird, werden für die Droge spezifische Antidrogen-Antikörper hervorgerufen. Eine therapeutische Immunisierungsreaktion verursacht genügend hohe Titer der Antidrogen-Antikörper und hält sie aufrecht, sodass die Antidrogen-Antikörper während der durch das Therapeutikum vorgesehenen Schutzperiode bei jeder folgenden Zufuhr der Droge Antidrogen-Antikörper eine ausreichende Menge der Droge neutralisieren, um den pharmakologischen Effekt der Droge zu vermindern, wenn nicht zu eliminieren.
  • Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden deutlicher und besser verständlich unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen, die Beschreibung und die anhängenden Patentansprüche.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Darstellung einer Anzahl möglicher, willkürlich aufgezeichneter „Zweige" eines Hapten-Carrier-Konjugats, die zum leichteren Verständnis geeigneter Verbindungen und Konjugate identifiziert sind.
  • 1b ist eine Darstellung einer Anzahl möglicher, willkürlich aufgezeichneter „Zweige" eines Hapten-Carrier-Konjugats, die zum leichteren Verständnis geeigneter Verbindungen und Konjugate identifiziert sind, worin Q' ein modifizierter ein T-Zell-Epitop enthaltender Carrier ist, z.B. ein modifizierter Protein-Carrier.
  • 2 ist eine Darstellung der Strukturen von fünf Reagenzien.
  • 3 ist eine Darstellung der Strukturen von vier verschiedenen zu missbrauchenden Drogen die für die Konjugierung und Verabreichung geeignet sind.
  • 4a ist eine Darstellung eines Gels, die die relativen Molekulargewichte von nativem (Monomer und Pentamer) und rekombinantem Cholera-Toxin-B (CTB) (Monomer) zeigt.
  • 4b ist eine Darstellung eines Gels, die die Stabilität von CTB in einem pH-Bereich von 3-9 zeigt.
  • 4c ist die Zeichnung eines Western Blot Gels, die 35 Peak Fraktionen rCTB#32 und rCTB#53 zeigt, die erhalten wurden durch periplasmische Expression, die pentameres CTB ergibt.
  • 5a ist eine Kurve, die einen ELISA darstellt, worin der anti-CTB Antikörper die Fähigkeit von rCTB, an das Gangliosid GMI auf der ELISA Platte zu binden, detektiert.
  • 5b ist eine Aufzeichnung, die einen Durchflusszytometrie-Bindungsversuch zeigt, worin rCTB an eukaryotische Zellen gebunden ist, die Gangliosid GM1 exprimieren.
  • 6a ist eine schematische Darstellung der Strukturformel von Nikotin.
  • 6b ist ein Diagramm, das die Variabilitätsorte bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Nikotinkonjugats darstellt. Die Variabilitätsorte sind willkürlich zugeordnet, um die erfindungsgemäße Verbindung und Konjugate leicht zu benennen, und nicht unbedingt Reaktionsorte. Diese Variabilitätsorte sind jene, auf die in 7 Bezug genommen wird.
  • 7 ist eine Darstellung von „Zweigen" an den Variabilitätsorten des Nikotinmoleküls für Nikotinkonjugate und Zwischenprodukte der vorliegenden Erfindung. Erfindungsgemäße Nikotinkonjugate sind dargestellt, wenn Q ein Carrier ist, der ein T-Zell-Epitop enthält.
  • 8 ist die Darstellung von Nikotinmetaboliten, die brauchbar für die Herstellung einiger der erfindungsgemäßen Konjugate sind.
  • 9a-b zeigen Ergebnisse der Untersuchung von Maus-Sera in einem ELISA auf Antikörperbindung an ein Konjugat von PS-55 und Hühnerei-Lysozym-Protein (HEL). In 9a waren die Mäuse mit einem Nikotin-BSA-Konjugat immunisiert worden. In 9b waren die Mäuse mit einem Nikotin-CTB-Konjugat immunisiert worden.
  • 10 zeigt die Resultate der Untersuchung von Anti-Nikotin-Antisera in einem konkurrierenden ELISA auf die Spezifität der Antisera für freies Nikotin, wenn variierende Konzentrationen an freiem Nikotin und die Nikotinmetaboliten Cotitin und Nornikotin zugesetzt wurden. Die Antisera wurden in Mäusen durch Injektion des Nikotin-Konjugats PS-55 BSA hergestellt. Es gab geringe oder keine Erkennung der Nikotinmetaboliten, was zeigt, dass die Anti-Nikotin-Antikörper in den Antisera spezifisch für Nikotin waren. Das Anästhetikum Lidocaine wurde als negative Kontolle eingesetzt, und war nicht konkurrenzfähig für die Bindung des Antikörpers. Das Nikotin-Konjugat PS-55 HEL wurde als positive Kontrolle verwendet, und seine Bindung an Antikörper wurde durch freies Nikotin gehemmt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die hier angezogene Patent- und wissenschaftliche Literatur stellt das Wissen dar, das den Fachleuten zugänglich ist.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Therapeutikum für die Drogensucht vor, das auf der Impfung eines süchtigen Individuums mit einem Nikotin-Protein-Konjugat beruht. Therapeutische Präparate gemäß der Erfindung umfassen zumindest ein Hapten und zumindest einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier, die, zu einem Hapten-Carrier-Konjugat konjugiert, imstande sind, die Produktion von Antihapten-Antikörpern zu stimulieren. Der hier verwendete Begriff „T-Zell-Epitop" bezieht sich auf das Basiselement oder die kleinste für einen T-Zell-Rezeptor erkennbare Einheit, wobei das Epitop für die Rezeptorerkennung essentielle Aminosäuren umfasst. Aminosäuresequenzen, die jene der T-Zell-Epitope imitieren und die die allergische Reaktion auf Proteinallergene modifizieren, werden von dieser Erfindung umfasst. Eine „Peptidimitation" kann definiert werden als chemische Strukturen, abgeleitet von bioaktiven Peptiden, die natürliche Moleküle imitieren. Das Hapten kann eine Droge sein, beispielsweise Heroin, Nikotin oder Drogenderivate.
  • Wenn das das Hapten/Droge (oder ein Derivat davon) enthaltende Therapeutikum an das süchtige Individuum verabreicht wird, werden drogenspezifische Antidrogen-Antikörper hervorgebracht. Eine therapeutische Immunisierungskur ruft ausreichend hohe Titer an Antidrogen-Antikörper hervor und hält sie aufrecht, sodass bei anschließender Zufuhr der Droge neutralisierende Antikörper an einer ausreichenden Menge der Droge binden, um die pharmakologischen Effekte der Droge zu vermindern oder sogar ausschalten. Keine Nebenwirkungen werden von der Verabreichung des erfindungsgemäßen Therapeutikums erwartet. Beispielsweise sind die derzeit missbrauchten Drogen klein und monovalent und sind daher nicht imstande, Antikörper zu vernetzen. Es wird daher das Auftreten der Bildung von Immunkomplexen und der damit verbundenen pathologischen Erscheinungen nach einer Einnahme der missbrauchten Droge nicht erwartet. Es ist jetzt, und es wird angenommen, dass es mit derzeitigen und zukünftigen Therapien kompatibel sein wird. Ferner hält die effektive Neutralisation lange an. Beispielsweise halten neutralisierende Antikörperantworten gegen Pathogene bekanntermaßen Jahre an. Es wird daher erwartet, dass hohe Titer von Antidrogen-Antikörpern, hervorgerufen durch Anwendung des erfindungsgemäßen therapeutischen Präparats, für lange Zeiträume und möglicherweise zumindest ein Jahr aufrechterhalten werden können. Dieser Langzeiteffekt des therapeutischen Präparats bei verminderten Verträglichkeitsproblemen reduziert die Rückfallquote, die ein Problem bei derzeitigen Therapien ist.
  • Der erfindungsgemäße therapeutische Ansatz einer Impfung gegen Nikotinsucht ist verträglich mit anderen Therapien zur Minimierung von Nikotinentzugs-Symptomen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Nikotin-Carrier-Konjugat zusammen mit Clonidine, Buspirone und/oder Antidepressiva oder Sedativa verwendet werden. Der durch diesen Ansatz produzierte Impfstoff wird kompatibel sein mit den laufenden Nikotinersatztherapien, z.B. Gummis und Pflaster. Da Antinikotin-Antikörper mehrere Wochen für ihre Produktion brauchen, kann ein gewisses Maß an Kontrolle des Verlangens durch die Anwendung von Nikotinersatztherapien geboten werden.
  • Das Folgende befasst sich mit hier verwendeten Ausdrücken, deren Definitionen zur Erläuterung angegeben sind. Das hier verwendete „Hapten" ist eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, die spezifisch mit einem Antikörper reagiert und die nicht imstande ist, für sich eine Immunantwort anzuregen, jedoch immunogen ist, wenn sie mit einem ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier zu einem Komplex Hapten-Carrier-Konjugat verarbeitet wurde. Ferner ist das Hapten charakterisiert als der die Spezifität bestimmende Teil des Hapten-Carrier-Konjugats, d.h. es ist imstande mit einem für das Hapten in seinem freien Zustand spezifischen Antikörper zu reagieren. In einem nicht immunisierten süchtigen Subjekt fehlt die Bildung von Hapten-Antikörpern. Das therapeutische Präparat wird verwendet, um Individuen zu impfen, die Behandlung wegen Drogenabhängigkeit suchen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Begriff Hapten das Konzept eines spezifischeren Drogen/Haptens einschließen, das eine Droge, ein Analogon eines Teils der Droge oder Drogenderivat ist. Das therapeutische Präparat oder der therapeutische Antidrogen-Impfstoff lässt, wenn es/er zu Beginn verabreicht wird, ein „gewünschtes messbares Ergebnis" entstehen. Zu Beginn ist das gewünschte messbare Ergebnis die Produktion eines hohen Titers von Antidrogen-Antikörpern. Titer ist definiert als die Serumverdünnung, die erforderlich ist für die halbe maximale Antikörper-Detektion durch ELISA. Eine Beeinflussung der für das Individuum geeigneten Kurdosierung jedoch ergibt einen anhaltenden gewünschten therapeutischen Effekt und hält ihn aufrecht. Der „gewünschte therapeutische Effekt" ist die Neutralisation einer ausreichenden Fraktion der missbrauchten freien Droge, um die pharmakologischen Effekte der Droge innerhalb eines therapeutisch akzeptablen Zeitraumes zu reduzieren oder auszuschalten durch Antidrogen-Antikörper, die spezifisch für die Droge bei einer nachfolgenden Einwirkung der Droge sind. Die Bestimmung der therapeutisch akzeptablen Zeitrahmen dafür, wie lange es braucht, eine ausreichende Antikörperantwort auf eine gegebene Droge zu bekommen, und wie lange diese Antikörperantwort dazu aufrechterhalten wird, wird von den Fachleuten ausgeführt, indem die Charakteristika des zu immunisierenden Subjekts, die zu neutralisierende missbrauchte Droge sowie die Art der Verabreichung untersucht werden. Unter Verwendung dieser und anderer Impfprotokolle als Modell wird ein Fachmann erwarten, dass die Immunität oder die Dauer des Schutzes mehrere Monate bis zu mehr als einem Jahr anhält.
  • „Passive Immunisierung" ist ebenfalls offenbart, die die Verabreichung von oder den Kontakt mit intaktem Antidrogen-Antikörper- oder polyklonalem Antikörper- oder monoklonalem Antikörper-Fragment (wie Fab, Fv, (Fab')2 oder Fab'), hergestellt unter Verwendung der neuen Konjugate der vorliegenden Erfindung, umfasst. Wie oben ausgeführt, kann die passive Immunisierung von Menschen mit einem erfindungsgemäßen Antinikotin-Antikörper als alleinige Behandlung weniger nützlich sein als die aktive Immunisierung. Die passive Immunisierung wird besonders nützlich als anfängliche Co-Behandlung und/oder eine zusätzliche komplementäre Behandlung (beispielsweise während des Zeitraums nach der anfänglichen Verabreichung des Impfstoffs, aber vor der körpereigenen Produktion von Antikörpern) oder in akuten Situationen um Tod vorzubeugen (beispielsweise wenn eine Person eine Drogenüberdosis aufweist). In manchen Situationen kann eine passive Therapie allein vorzuziehen sein, beispielsweise wenn der Patent immunsupprimiert ist oder eine rasche Behandlung braucht.
  • Die erfindungsgemäßen Drogenkonjugate sowie die erfindungsgemäßen Präparate können auch als Prophylaxe verwendet werden. D.h., die Drogenkonjugate oder Präparate können einem Säugetier verabreicht werden, bevor es irgendeiner Droge ausgesetzt wird, um Antidrogen-Antikörper zu erzeugen. Die gebildeten Antidrogen-Antikörper werden in dem Säugetier vorhanden sein, um jede nach der Verabreichung des Konjugats oder des Präparats zugeführte Droge zu binden und dadurch die Möglichkeit, nach der Droge süchtig zu werden, zu minimieren oder zu verhindern.
  • Das erfindungsgemäße therapeutische Präparat und insbesondere der therapeutische Antidrogen-Impfstoff ist eine Zusammensetzung, die zumindest ein Droge/Hapten-Carrier-Konjugat enthält, das imstande ist, die Produktion eines ausreichend hohen Titers an für die Droge/Hapten spezifischen Antikörpern anzuregen, sodass bei folgender Belastung mit der Droge/Hapten die Antikörpers imstande sind, die süchtig machenden Eigenschaften der Droge zu reduzieren. Die erwartete Immunantwort auf ein Hapten-Carrier-Konjugat ist die Bildung von sowohl Anti-Hapten- als auch Anti-Carrier-Antikörpern. Das therapeutische Niveau ist erreicht, wenn eine genügende Menge der anti-drogenspezifischen Antikörper ausgelöst und aufrechterhalten wird, um eine Neutralisationsattacke auf nach der Impfung zugeführte Droge auszuführen. Der Therapierplan der vorliegenden Erfindung lässt genügend Zeit für die Produktion von Antikörpern nach der anfänglichen Impfung und jede Nachimpfung. Ferner enthält der optimale Antidrogen-Impfstoff zumindest ein Droge/Hapten-Carrier-Konjugat, das eine optimale Kombination der Droge als Hapten und einen Carrier umfasst, sodass die Produktion von Antidrogen-Antikörpern ein optimales therapeutisches Niveau erreichen kann, d.h. dass sie in vivo mit einem ausreichend hohen Titer vorhanden sind, sodass sie einem folgenden Angriff mit der gewählten Droge mehrere Monate lang widerstehen können. Insbesondere bleiben die Antikörpertiter hoch genug, um eine effektive Antwort auf eine folgende Zufuhr der Droge während etwa zwei Monaten bis etwa ein Jahr oder mehr, abhängig vom Individuum, meist zumindest drei Monate lang hervorzubringen. Das optimale Präparat besteht aus einem Hapten-Carrier-Konjugat, Vehikeln und gegebenenfalls Zusatzstoffen.
  • Bei Verwendung in der Nikotinbehandlung umfasst die vorliegende Erfindung ein Hapten-Carrier-Konjugat, worin das Hapten Nikotin oder ein Nikotinderivat ist, das benutzt werden kann, um Säuger, speziell Menschen, zu immunisieren, um Antinikotin-Antikörper hervorzurufen, die imstande sind die freie Droge zu binden und den Transit der Droge zum Belohnungssystem im Gehirn zu verhindern, wodurch süchtiges Drogenkonsumverhalten (z.B. das Rauchen von Zigaretten) abgewöhnt wird. Es wird angenommen, dass Nikotin an die α-Subeinheit der Nikotin-acetylcholin-Rezeptoren im Gehirn bindet, was zu einer erhöhten Dopamin-Freisetzung führt. Es wird angenommen, dass höhere Zahlen an Nikotinacetylcholin-Rezeptoren im Gehirn die physiologische Abhängigkeit von Nikotin erhöhen. Wie oben in Bezug auf Heroin erwähnt, limitieren Antinikotin-Antikörper vermutlich die Verteilung des Nikotins über die Blut-Gehirnschranke im Gehirn, wodurch seine pharmakologischen Effekte reduziert werden.
  • Es gibt z.B. ein gewisses Standardisierungsniveau für Nikotinzufuhr; d.h. jede Zigarette enthält durchschnittlich 9 mg Nikotin, wovon 1-3 mg während des Rauchens effektiv abgegeben werden. Außerdem ist die Spitzenkonzentration von Nikotin im Plasma 25-50 ng/ml, was deutlich niedriger ist als jene von Kokain (0,3-1 μg/ml). Das sollte eine ideale Gelegenheit für eine Intervention mit Antikörpern mit moderat hoher Affinität bieten.
  • Die anfängliche Impfung mit dem erfindungsgemäßen therapeutischen Präparat Hapten-Carrier-Konjugat erzeugt hohe Titer Hapten-spezifischer Antikörper in vivo. Periodische Untersuchungen des Plasmas der geimpften Subjekte sind geeignet, die individuellen effektiven Dosen zu bestimmen. Die Titerniveaus werden gesteigert und aufrechterhalten durch periodische Nachimpfung. Es wird vorausgesetzt, dass dieses Therapeutikum in Kombination mit laufenden Drogenrehabilitationsprogrammen angewendet wird, die Beratung einschließen. Ferner können die erfindungsgemäßen therapeutischen Präparate auf eine einzelne Droge oder mehrere Drogen gleichzeitig oder nacheinander abzielen, und sie können in Kombination mit anderen Therapien angewendet werden. Beispielsweise werden die erfindungsgemäßen therapeutischen Hapten-Carrier-Konjugat-Präparate und Methoden ohne nachteilige Interaktionen in Kombination mit konventionellen pharmakologischen Ansätzen und zuvor erwähnter passiver „Kurzzeit"-Immunisierung angewendet, um den Gesamteffekt der Therapie zu steigern.
  • Das erfindungsgemäße therapeutische Hapten-Carrier-Konjugat-Präparat wird hergestellt, indem eine oder mehrere Haptenmoleküle an einen T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier gekuppelt werden, um ein Hapten-Carrier-Konjugat zu erhalten, das imstande ist, (immunogene) T-Zellen zu stimulieren, was zur Proliferation von T-Zellen und einer charakteristischen Freisetzung von Mediatoren führt, die relevante B-Zellen aktivieren und die Produktion des spezifischen Antikörpers stimulieren. Interessante Antikörper sind jene, die spezifisch für den Hapten-Teil des Hapten-Carrier-Konjugats (auch Hapten-Carrier-Komplex genannt) sind. Therapeutische Präparate, die eine Kombination von Konjugaten entweder für dieselbe Droge (Quer-Immunisierung) oder für mehrere Drogen enthalten, sind offenbart. Solche Co-Mischungen von Konjugaten mehrerer Drogen sind besonders nützlich zur Behandlung von mehrfachem Drogenmissbrauch.
  • Bei der Auswahl einer für die Konjugation geeigneten Droge, wird der Fachmann eine Droge mit Eigenschaften wählen, die wahrscheinlich hohe Antikörper-Titer hervorbringen. Wenn jedoch das gewählte Molekül ähnlich jenen Molekülen ist, die endogen dem des Individuums sind, können gegen ein solches Molekül hervorgebrachte Antikörper mit vielen verschiedenen Molekülen im Körper quer-reagieren mit einem unerwünschten Effekt. Daher muss die Droge, die als Hapten (Droge/Hapten) gewählt werden soll, genügend fremd und von ausreichender Größe sein, um zu vermeiden, dass Antikörper gegen Moleküle gebildet werden, die innerhalb eines menschlichen Körpers zu finden sind. Aus diesen Gründen wäre beispielsweise Alkohol ungeeignet für das erfindungsgemäße Therapeutikum. Die gegen das therapeutische Präparat gebildeten Antikörper sind hoch spezifisch und von einer ausreichenden Menge, um die Droge entweder im Blutstrom oder in der Schleimhaut oder in beiden zu neutralisieren.
  • 3 zeigt die Struktur von vier Drogen, die für die Konjugation geeignet sind.
  • Der erfindungsgemäße Carrier ist ein Molekül, das zumindest ein T-Zell-Epitop enthält, welches imstande ist, die T-Zellen des Subjekts zu stimulieren, die ihrerseits den B-Zellen helfen, eine erhöhte Antikörperproduktion gegen Teile des gesamten Konjugats, einschließlich des Hapten-Teils, aufrecht zu erhalten. Daher wird, wenn ein Carrier wegen seiner immunogenen Eigenschaften gewählt wird, eine starke Immunantwort auf den Impfstoff in einer verschiedenartigen Patientenpopulation erwartet. Der Carrier ebenso wie das Hapten müssen genügend fremd sein, um eine starke Immunantwort auf den Impfstoff hervorzurufen. Ein konservativer, aber nicht wesentlicher Ansatz ist die Verwendung eines Carriers, dem die meisten Patienten nicht ausgesetzt waren, um das Phänomen der Carrier-induzierten Epitopsuppression zu vermeiden. Jedoch sogar wenn Carrier-induzierte Epitopsuppression auftritt, ist sie beherrschbar, da sie überwunden wurde durch Veränderungen der Dosis (Dijohn et al. (1989) Lancet 1415-1418) und andere Veränderungen des Protokolls (Etlinger et al. (1990) Science 249: 423-425), einschließlich der Verwendung von CTB (Stok et al. (1994) Vaccine 12: 521-526). Impfstoffe, die Carrier-Proteine nutzen, gegen die Patienten bereits immun sind, sind im Handel erhältlich. Weiters sind Carrier, die eine große Anzahl von Lysinen enthalten, besonders geeignet für die Konjugation nach den Methoden der vorliegenden Erfindung. Geeignete Carrier-Moleküle sind zahlreich und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein:
    bakterielle Toxine oder Produkte, beispielsweise Choleratoxin B-(CTB), Diphtherietoxin, Tetanustoxoid, und Pertussistoxin sowie filamentöses Hämagglutinin, Shigatoxin, Pseudomonas Exotoxin;
    Phytagglutinine, beispielsweise Ricin-B Subunit, Abrin und Wicken-Phytagglutinin;
    Subvirale, beispielsweise Retrovirus nucleoprotein (retro NP), Tollwut ribonucleoprotein (rabies RNP), Pflanzenvirusse (z.B. TMV, Kuherbsen- und Karfiol-Mosaikvirusse), Nucleocapsidprotein des Virus von bläschenförmiger Mundschleimhautentzündung (VSV-N), Pockenvirus-Vektoren und Semliki Forstvirus-Vektoren; Künstliche Vehikel, beispielsweise multiantigene Peptide (MAP), Mikrokügelchen;
    Hefevirus-ähnliche Partikel (VLPs);
    malariaverseuchtes Protein Antigen;
    und andere, z.B. Proteine und Peptide sowie beliebige Modifikationen, Derivate oder Analoga der obigen.
  • Um Merkmale geeigneter Träger zu bestimmen, wurden Experimente durchgeführt unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Proteincarrier. Das Protein war ideal für Tierversuche, da es billig ist und große Mengen an Lysinen für die Konjugation enthält. Es ist jedoch weniger geeignet für die Impfung von Menschen, da die Entstehung von anti-BSA Antikörpern das Potential hat, nachteilige Antworten zu verursachen. Derart wurden die oben beschriebenen Kriterien auf eine große Anzahl von Carrier-Kandidaten unter Verwendung der Ergebnisse dieser Experimente angewendet. Das Ergebnis ist die oben beschriebene Liste von Carriern, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
  • Der Carrier einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Protein oder ein verzweigtes Peptid (z.B. multi-antigene Peptide (MAP)) oder ein Peptid mit einer einzigen Kette. Ein idealer Carrier ist ein Protein oder Peptid, das nicht allgemein zum Impfen in dem Land verwendet wird, in dem die Therapie angewendet wird, wodurch das Potential von „Carrier-induzierter Epitopsuppression" vermieden wird. Beispielsweise werden in den USA, wo die Standardimmunisierung in der Kindheit Diphtherie und Tetanus umfasst, Proteine wie Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid weniger erwünscht sein als geeignete Carrier. Ferner soll das Carrierprotein kein Protein sein, gegenüber welchem jemand tolerant ist. Im Menschen würde dies unmodifiziertes Humanserumalbumin ausschließen. Ferner müssten viele Nahrungsmittelproteine vor dem Gebrauch als Carrier gründlich untersucht werden. Wieder wäre Rinderserumalbumin beim Menschen weniger erwünscht als Carrier wegen des Rindfleisches in der Kost der meisten Menschen. Es ist obendrein von großem Vorteil, wenn der Carrier inherente Immunogenizität/verstärkende Hilfswirkung hat. Eine delikate Balance muss eingehalten werden zwischen dem Wunsch nach Immunogenizität des Carriers und dem Wunsch den Antihapten-Antikörper zu maximieren. Weiters sollte der bevorzugte Carrier sowohl zu einer systemischen Antwort als auch zu einer Antwort an der Stelle des Auftreffens imstande sein. Dies trifft besonders auf Nikotin zu, das häufiger durch Schleimhautmembranen verabreicht wird. Dementsprechend löst ein bevorzugter Carrier im Fall von Nikotin nicht nur eine systemische Antwort, sondern auch eine zuvor bestehende Antikörperreaktion der Schleimhaut aus. In einer solchen Schleimhautantwort würde die Reaktion von Antikörpern mit Kokain, Heroin und/oder Nikotin rasch genug eintreten, um der Droge entgegenzuwirken, bevor sie im Blutstrom zu zirkulieren beginnt.
  • Ein solcher bevorzugter Carrier ist Choleratoxin B (CTB), ein hoch immunogenes Protein-Bruchstück, das imstande ist, starke Antikörperreaktionen im System und in der Schleimhaut zu stimulieren (Lycke (1992) J.Immunol. 150:4810-4821; Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med Hyg. 50: 42-54; Silbart et al. (1988) J. Immun.Meth. 109: 103-112; Katz et al. (1993) Infection Immun. 61: 1964-1971). Diese kombinierte IgA und IgG Anti-Hapten-Antwort ist hoch erwünscht zum Blockieren von Heroin oder Kokain, das nasal oder durch Inhalieren eingenommen wird, und zum Blockieren von Nikotin, das in Mund und Lungen absorbiert wird. Ferner hat sich CTB bereits als sicher für den menschlichen Gebrauch in klinischen Studien für Cholera-Impfstoffe erwiesen (Holmgren et al., s.o.; Jertborn et al. (1944) Vaccine 12: 1078-1082; „The Jordan Report, Accelerated Development ov Vaccines" 1993., NIAID, 1993).
  • Andere brauchbare Carrier umfassen jene mit der Fähigkeit eine Schleimhautantwort zu steigern, insbesondere LTB Familie bakterieller Toxine, Retrovirus Nukleoprotein (retro NP), Tollwut Ribonucleoprotein (rabies RNP), Nukleokapsid-Protein des Virus der bläschenförmigen Mundschleimhautentzündung (VSV-N und rekombinante Pockenvirus-Bruchstücke.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden verschiedene Proteinderivate, Peptidfragmente oder Analoga von Allergenen als Carrier verwendet. Diese Carrier werden gewählt, weil sie eine T-Zell-Antwort auslösen, die imstande ist, Hilfe für eine B-Zell-Initiation von Antihapten-Antikörpern zu liefern. Beispiele für die und Methoden der Herstellung von Allergenproteinen und Peptiden und deren Sequenzen sind in WO 95/27786 , veröffentlicht 19. Oktober 1995, offenbart. Ein Allergen, das sich als Carrier besonders eignet, ist Cryptomeria japonica, insbesondere rekombinantes Cry j 1, dessen Sequenz mit leichter Variation veröffentlicht wurde. In anderen Ländern als Japan ist Cryptomeria japonica nicht vorherrschend. Daher entspricht das Allergen Cry j 1 einem der Kriterien für einen geeigneten Carrier, das ist ein Carrier, dem ein Subjekt vorher noch nicht ausgesetzt war.
  • Bei Anwendung der Einsatzmöglichkeiten und Präparate gemäß der Erfindung und insbesondere der in den folgenden Beispielen erläuterten Techniken vernetzt der Fachmann das ausgewählte Droge/Hapten mit dem ausgewählten Carrier unter Bildung des erfindungsgemäßen Hapten-Carrier-Konjugats.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wirken die durch das therapeutische Präparat hervorgerufenen Antikörper innerhalb der Zeit, die die Droge braucht, um von den Lungen durch das Herz ins Gehirn zu gelangen. Die Fähigkeit, diese Antikörperantwort auszulösen, erfordert sorgfältige Selektion des Carrier-Moleküls.
  • Herstellung der rekombinanten B Untereinheit von Choleratoxin
  • Choleratoxin ist das von Vibrio cholerae produzierte Enterotoxin und besteht aus fünf identischen B Untereinheiten, wobei jede Untereinheit ein Molekulargewicht von 11,6 KDa (103 Aminosäuren) hat, und einer A Untereinheit mit 27,2 KDa (230 Aminosäuren) (Finkelstein (1988) immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path 85-102). Die bindende Untereinheit, CTB, bindet an das Gangliosid GM1 an der Zelloberfläche (Sixma et al (1991) Nature 351: 371-375; Orlandi et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 17038-17044). CTA ist die enzymatische Untereinheit, die in die Zelle gelangt und die ADP-Ribosylation eines G Proteins katalysiert, das konstitutiv Adenylatcyclase aktiviert (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. pp. 85-102) in Abwesenheit einer A Untereinheit ist Choleratoxin nicht toxisch.
  • Andere haben die Produktion rekombinanter Expression von CTB Pentameren auf hohem Niveau offenbart (L'hoir et al. (1990) Gene 89: 47-52; Slos et al. (1994) Protein Exp. Purif. 5: 518-526). Während natürliche CTB kommerziell erhältlich ist, ist es schwierig, Kontamination mit CTA auszuschließen. Daher wurde rekombinantes CTB in E.coli exprimiert, und es wurden Versuche zu seiner Charakterisierung entwickelt. Das choleragenoide Konstrukt wurde von der American Type Culture Collection (folgend US Patent 4 666 837 ) gekauft. Rekombinantes CTB wurde aus dem Originalvektor (Prit10810) geklont in ein Expressionsplasmid (pET11d, Novagen) mit einer extra N-terminalen Sequenz, enthaltend ein His6 tag und exprimiert in E.coli bis zu einem Gehalt von 25 mg/Liter Kultur. Das Protein wurde über einer Ni2+-Säule unter Verwendung von Standardtechniken gereinigt und an SDS-PAGE (siehe 4a, b und c) analysiert. Das rekombinante CTB in diesem Versuch ist monomer und ist größer als das natürliche CTB Monomer infolge der N-terminalen Verlängerung.
  • Pentameres rekombinantes CTB wurde sowohl mit als auch ohne His tag produziert unter Verwendung der cDNA modifiziert durhc PCR unter Einschluß der Pel b Leadersequenz. Ein C-terminaler Stop Codon wurde eingesetzt, um den His Anhänger zu entfernen. Beide Konstrukte wurden in E. coli aus dem pET22b Vektor (Novagen) exprimiert. Das His verlängerte Protein wurde durch Ni2+ Affinitätschromatographie wie oben gereinigt (13 mg/l). Das unverlängerte rekombinante CTB wurde durch Gangliosid GM1 Säulenaffinitionschromatographie gereinigt wie beschrieben (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113: 249-258). Es zeigte sich, dass rekombinantes CTB Pentamer an Gangliosid GM1 in einem ELISA bindet und mit pentamerspezifischen Antikörpern in Western blots und ELISA reagierte. Rekombinantes CTB ist auch aus anderen Quellen wie SBL Vaccin AB erhältlich.
  • Die pentamere Struktur von CTB kann bevorzugt werden für die Bindung an Gangliosid GM1. Das Pentamer ist stabil gegen SDS, solange die Proben nicht gekocht werden, was erlaubt, die Pentamerisation durch SDS-PAGE nachzuweisen. Das Gel in 4a demonstriert, dass das natürliche CTB ein Pentamer ist und leicht vom denaturierten Monomer CTB zu unterscheiden ist. Die pentamere Struktur bleibt über einen pH-Bereich von 4 bis 9 (siehe 4b) erhalten, was eine Varietät von Konjugationsvorgängen erleichtert. Das ursprünglich exprimierte rekombinante CTB ist monomer. Ein Weg, Pentameres CTB zu erhalten, besteht darin, Anpassungen vorzunehmen, um richtig gefaltetes Pentameres CTB zu exprimieren. Es wurde gefunden, dass die cytoplasmische Expression einen viel höheren Wert an monomerem CTB liefert. Ein Fachmann kennt Methoden für die Faltung von monomerem CTB zu pentamerem CTB (siehe z.B. L'hoir et al. (1990) Gene 89: 47-52). Eine Alternative zum Falten von monomerem CTB, um Pentameres CTB zu erhalten, ist die periplasmische Expression, die Pentameres rekombinantes CTB ergab, das GM1-Gangliosid binden kann durch ELISA. 5a und 5b unterstützen dieses Ergebnis. Ein Fachmann kann feststellen, dass mehrere Ansätze, um Pentameres rekombinantes CTB zu erhalten, beschrieben wurden, einschließlich der periplasmischen Expression mit einem Leader (Slos et al., s.o.; Sandez et al (1989) Proc. Nat, 1. Acad. Sci. 86: 481-485; Lebens et al. (1993) BioTechnol. 11: 1574-1578) oder der post-translationalen Neufaltung (L'hoir et al., s.o.; Jobling et al (1991) Mol. Microbiol. 5:1755-1767).
  • Ein weiterer brauchbarer Carrier ist Choleratoxin, das gegenüber CTB verbesserte Schleimhautantwort liefert. Es wurde berichtet, dass die enzymatisch aktive A Untereinheit als Hilfsstoff die Aktivität verstärkt (Liang et al. (1988) J. Immunol. 141: 1495-1501; Wilson et al (1993) Vaccine 11: 113-118; Snider et al. (1994) J. Immunol. 153: 647).
  • Ein Aspekt der Erzielung die Konjugats vorliegender Erfindung umfasst die ausreichende Modifikation des Haptens, sodass es in die Lage versetzt wird, mit einem Carrier konjugiert oder verbunden zu werden, während genügend von der Struktur erhalten bleibt, sodass es als Hapten im freien Zustand (freies Nikotin) erkennbar ist. Es ist wesentlich, dass ein geimpftes Individuum Antikörper hat, die freies Hapten (Nikotin) erkennen. Radioimmunoassay- und Kompetitive-ELISA-Experimente, die detaillierter in den Beispielen erläutert werden, können Antikörpertiter gegenüber freiem Hapten messen. Interessante Antikörper sind nikotinspezifische Antikörper. Selbstverständlich können Prinzipien und Methoden, die zur Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen verwendet wurden, von dieser Offenbarung auf einen weiten Bereich von Hapten-Carrier-Konjugaten ausgedehnt werden, die zur Behandlung von verschiedenen Drogensüchten und toxischen Reaktionen brauchbar sind.
  • Konjugate
  • Die Herstellung der neuen Nikotin-Carrier-Konjugate der vorliegenden Erfindung sind abgeleitet von Nikotin und Nikotinmetaboliten. 8 zeigt eine Darstellung von Nikotin und einigen seiner Metaboliten.
  • Die Länge und Natur der Hapten-Carrier-Bindung ist derart, dass das Hapten ausreichend entfernt von der Carrierdomäne ist, um die optimale Erkennung durch die anfangs dagegen hervorgerufenen Antikörper zu ermöglichen. Die Länge der Verbinder wird durch Variieren der Anzahl der -CH2-Gruppen optimiert, die innerhalb eines „Zweiges" CJ11 wie unten identifiziert strategisch angeordnet sind
    CJ 0 Q
    CJ 1 (CH2)nQ
    CJ 1.1 CO2Q
    CJ 1.2 COQ
    CJ 2 OCO(CH2)nQ
    CJ 2.1 OCOCH=Q
    CJ 2.2 OCOCH(O)CH2
    CJ 2.3 OCO(CH2)nCH(O)CH2
    CJ 3 CO(CH2)nCOQ
    CJ 3.1 CO(CH2)nCNQ
    CJ 4 OCO(CH2)nCOQ
    CJ 4.1 OCO(CH2)nCNQ
    CJ 5 CH2OCO(CH2)COQ
    CJ 5.1 CH2OCO(CH2)nCNQ
    CJ 6 CONH(CH2)nQ
    CJ 7 Y(CH2)nQ
    CJ 7.1 CH2Y(CH2)nQ
    CJ 8 OCOCH(OH)CH2Q
    CJ 8.1 OCO(CH2)CH(OH)CH2Q
    CJ 9 OCOC6H5
    CJ 10 in Fig. 2b dargestellt
    CJ 11 YCO(CH2)nCOQ
    und hier in den 1a und 1b dargestellt. In Bezug auf die obigen Zweige ist n eine ganze Zahl, vorzugsweise ausgewählt aus etwa 2 bis etwa 20, insbesondere etwa 2 bis etwa 8, am meisten bevorzugt 3 bis 5; Y ist vorzugsweise ausgewählt der Gruppe, bestehend aus S, O und NH; und Q ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (1) -H
    • (2) -OH
    • (3) -CH2
    • (4) -CH3
    • (4a) -OCH3
    • (5) COOH
    • (6) Halogen
    • (7) Protein- oder Peptid-Carrier
    • (8) modifizierter Protein- oder Peptid-Carrier
    • (9) aktivierten Ester, z.B. 2-Nitro-4-sulfophenylester und N-Oxysuccinimidylester
    • (10) Gruppen, die gegenüber Carriern oder modifizierten Carriern reaktiv sind, z.B. gemischte Anhydride, Acylahlogenide, Acylazide, Alkylhalogenide, N-Maleimide, Iminoester, Isocyanate, Isothiocyanate; oder
    • (11) ein anderer durch seine „CJ"-Referenznummer identifizierter „Zweig".
  • Ein ein T-Zell-Epitop enthaltender Carrier (z.B. ein Protein- oder Peptid-Carrier) kann durch dem Fachmann bekannte Methoden modifiziert werden, um die Konjugation mit dem Hapten zu erleichtern (z.B. Thiolation). Beispielsweise mit 2-Iminothiolan (Traut's Reagens) oder durch Succinylierung etc. Der Einfachheit halber kann (CH2)nQ, worin Q = H, als (CH3), Methyl oder Me bezeichnet werden, selbstverständlich passt es jedoch in das Motiv, wie in den in den 1a und 1b dargestellten „Zweigen" identifiziert.
  • Weiters umfassen hier verwendete Abkürzungen handelsüblicher Verbindungen:
    • BSA
    = Rinderserumalbumin
    DCC
    = Dicyclohexylcarbodiimid
    15 DMF
    = N,N-Dimethylformamid
    EDC (oder EDAC)
    = N-Ethyl-N'-(dimethylamino)propyl-carbodiimid-hydrochlorid
    EDTA
    = Ethylendiamin-tetraessigsäure, Dinatriumsalz
    HATU
    = O-(Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    NMM
    = N-Methylmorpholin
    HBTh
    = 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    TNTU
    = 2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat
    PyBroP®
    = Brom-tris-pyrrolidono-phosphonium-hexafluorphosphat
    HOBt
    = N-Hydroxybenzotriazol
  • Ferner ist die IUPAC Nomenklatur für einzelne erwähnte Verbindungen:
    • Nikotin
    1-Methyl-3-(3-pyridyl)pyrrolidin
    Cotinin
    N-Methyl-2-(3-pyridyl)-5-pyrrolidon
  • Reaktionen
  • In einer Ausführungsform wurden die Vorläufer der Konjugate PS-54 synthetisiert durch Acylierung von racemischem Nornikotin mit Bernsteinsäureanhydrid in Methylenchlorid in Gegenwart von zwei Äquivalenten Diisopropylethylamin. Das Produkt dieser Reaktion wird dann mit dem Lysinrest eines Carrier-Proteins unter Verwendung von HATU gekuppelt unter Bildung der Konjugate PS-54 (siehe Beispiel 1, Methode B).
  • In einer anderen Ausführungsform wurden die Vorläufer von PS-55, PS-56, PS-57 und PS-58 synthetisiert, indem der Pyridinstickstoff in (S)-(–)-Nikotin in wasserfreiem Methanol mit Ethyl-3-brombutyrat, 5-Brom-valeriansäure, 6-Bromcapronaäure bzw. 8-Bromoctansäure (siehe Beispiel 2, Methoden A, B, C und D) selektiv alkyliert wurden. Die Produkte dieser Reaktionen wurden mit einem Carrier-Protein konjugiert unter Verwendung von HATU unter Bildung der Konjugate PS-55, PS-56, PS-57 und PS-58 (siehe Beispiel 3, Methode A) TABELLE 1
    Konjugat Carrier Protein Haptene/Monomer Konjugationsmethode
    PS-54 BSA 19,5 Beispiel 1, Methode B
    PS-54 HEL 3,2 Beispiel 1, Methode B
    PS-55 BSA 33,2 Beispiel 3, Methode A
    PS-55 HEL 1,09 Beispiel 3, Methode A
    PS-56 BSA 27 Beispiel 3, Methode A
    PS-56 HEL 2,2 Beispiel 3, Methode A
    PS-57 BSA 81 Beispiel 3, Methode A
    PS-57 HEL 8 Beispiel 3, Methode A
    PS-58 BSA 66,8 Beispiel 3, Methode A
    PS-58 HEL 7,4 Beispiel 3, Methode A
  • Dies ist eine nicht einschränkende Liste von Konjugaten. Andere Konjugate wurden hergestellt mit mehr als einem Hapten, gekuppelt an den ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier. Vorzugsweise werden 1 bis 100 Haptene an den ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier gekuppelt. Am meisten bevorzugt werden 1 bis 70 Haptene an den ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier gekuppelt.
  • Methoden zum Synthetisieren der Verbindungen PS-54, PS-55, PS-56, PS-57 und PS-58 sind in den Beispielen offenbart. Wenn er den offenbarten Methoden folgt, z.B. Verwendung von Aktivierungsmitteln unter wässerigen Bedingungen, kann der Fachmann jede gewünschte Verbindung synthetisieren.
  • Es gibt einen weiten Bereich von Verbindungen, die entwickelt wurden, um das Vernetzen von Proteinen/Peptiden oder die Konjugation von Proteinen an derivatisierte Moleküle, z.B. Haptene zu erleichtern. Diese umschließen, ohne darauf beschränkt zu sein, von Carbonsäure abgeleitete aktive Ester (aktivierte Verbindungen), gemischte Anhydride, Acylhalogenide, Acylazide, Alkylhalogenide, N-Maleimide, Iminoester, Isocyanate und Isothiocyanate, die den Fachleuten bekannt sind. Sie sind imstande, eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe eines Proteinmoleküls zu bilden. In Abhängigkeit von der aktivierenden Gruppe ist die reaktive Gruppe die Aminogruppe eines Lysinrests an einem Proteinmolekül oder eine Thiolgruppe in einem Carrierprotein oder einem modifizierten Carrierproteinmolekül, die, wenn umgesetzt, zur Bildung einer Amid-, Amin-, Thioether-, Amidinharnstoff- oder Thioharnstoff-Bindung führen. Ein Fachmann wird weitere geeignete Aktivierungsgruppen identifizieren, beispielsweise in allgemeinen Referenz-Texten wie Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc. Boca Raton, FL). Idealerweise erfolgt die Konjugation über eine Aminogruppe der Lysinseitenkette. Die meisten Reagenzien reagieren bevorzugt mit Lysin. Ein besonders geeigneter Carrier ist CTB, da er 9 Lysinreste pro Monomer in seiner natürlichen Form hat. Um zu bestimmen, ob konjugiertes pentameres CTB seine Struktur und Aktivität beibehält, kann die GM1 Gangliosid-Bindung untersucht werden.
  • Die Anmelder haben Mengen an rekombinantem CTB exprimiert und gereinigt, die, einmal optimiert, in großen Fermentationschargen hergestellt werden. Verfahren zum Exprimieren und Reinigen von rekombinantem Protein sind aus dem Stand der Technik bekannt, siehe z.B. USSN 07/807 529. CTB kann beispielsweise gereinigt werden durch Affinitätschromatographie (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113: 249-258), konjugiert an Heroin- oder Nikotinderivate, und das Konjugat kann dann weiter gereinigt werden. Das gereinigte CTB und das resultierende Konjugat werden auf Reinheit und Beibehaltung der pentameren Struktur von CTB analysiert. Techniken umfassen SDS-PAGE, NATIV-PAGE, Gelfiltrationschromatographie, Western blotting, direkte und GM1-Capture ELISA und Konkurrenz-ELISA mit biotinyliertem CTB. Das Ausmaß der Haptenierung wird gemessen durch Massenspektrometrie, Umkehrphasen-HPLC und durch Analyse der Zunahme der UV-Absorption infolge der Anwesenheit von Hapten. Sowohl die Löslichkeit als auch die Stabilität des Konjugats werden bei der Vorbereitung für die Herstellung im Originalmaßstab optimiert. Details einiger dieser Analysen sind in den Beispielen angegeben.
  • Obwohl die pentamere Struktur von CTB ein bevorzugter Carrier für die Ausführung der vorliegenden Erfindung ist und die GM1-Bindung eine effektive Untersuchungsmethode ist, um zu bestimmen, dass die pentamere Form von CTB vorhanden ist, ist die Erfindung nicht auf die Verwendung der pentameren Form von CTB beschränkt. Andere T-Zell-Epitop-Carrier sind von der Erfindung umfasst ebenso wie andere Formen von CTB (z.B. Monomer, Dimer etc.), die für den Einsatz bei der Erfindung manipuliert werden können. Wenn ein von der pentameren Form von CTB verschiedener Träger verwendet wird, wird der Fachmann eine geeignete Untersuchung anwenden, um die Anwesenheit und Aktivität des gewünschten Carriers festzustellen (z.B. den Einsatz der GM1-Bindung zur Bestimmung der Anwesenheit der pentameren Form von CTB).
  • Um Grade der Haptenierung zu variieren, werden alternative Ansätze unternommen. In einer Ausführungsform ist der Carrier hapteniert mit einem multivalenten Heroin- oder Nikotin-Konstrukt. Diese Idee basiert auf dem Konzept der multiplen antigenen Peptide (MAP) (Lu et al. Mol. Immunol., 28: 623-630 (1991)). In diesem System werden mehrfach verzweigte Lysinreste entwickelt, um die Haptendichte und Valenz zu maximieren. Voraussetzung dieses Ansatzes ist, dass die Immunantwort gesteigert wird, wenn mehrere Kopien des Haptens an demselben Peptid- oder Proteinmolekül gebunden sind. Es wird daher ein multivalentes Hapten, das nur an eine oder zwei Stellen am CTB Carrier-Pentamer gebunden werden muss, hergestellt, wie hier erläutert. Der Kern eines solchen mehrfach antigenen Haptens ist ein verzweigter Polylysinkern, wie von Tam (Lu et al., s.o.) vorgeschlagen. Ein chemisch reaktiver Ansatz wird bewahrt durch Einschluss eines geschützten Cys-Restes. Nach der Heroin- oder Nikotinhaptenierung aller zugänglichen Aminogruppen wird das Sulfhydryl von Cys demaskiert und für die Kupplung an das Protein mit einem von mehreren bifunktionellen Sulfhydryl/Amino-spezifischen Vernetzern zugänglich gemacht (Yoshitake et al (1979) Eur. J. Biochem. 101: 395-399). Eine Anzahl dendrimerer Strukturen wird als Kern verwendet.
  • Zusatzstoff
  • Jeder Zusatzstoff, der den Effekt des Carriers nicht maskiert, wird für brauchbar in den erfindungsgemäßen therapeutischen Heroin- und Nikotin-Impfstoffen gehalten (siehe Edelman (1980) Rev. Infect. Dis. 2: 370-373). Die anfänglichen Versuche der Anmelder, die die Machbarkeit eines therapeutischen Impfstoffes gegen Kokainmissbrauch zeigen sollten, nützten den kraftvollen Zusatzstoff CFA. CFA wird jedoch im Menschen nicht bevorzugt. Ein brauchbarer Zusatzstoff, der derzeit für den Gebrauch im Menschen zugelassen ist, ist Alum, einschließlich Aluminiumhydroxid (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, NJ) oder Aluminiumphosphat (Spectrum). Typischerweise wird der Impfstoff auf dem Alum adsorbiert, das eine sehr begrenzte Löslichkeit hat. Vorläufige Daten im Mausmodell legen nahe, dass Alum imstande ist eine starke Anti-Kokain Antikörperantwort hervorzurufen, und MF59 (Chiron, Emeryville, CA) oder RIBI Zusatzstoff ist ebenfalls geeignet.
  • Eine effektive Immunisierung mit CTB als Carrier-Protein erfordert keinen kraftvollen Zusatzstoff. Wie in den Beispielen gezeigt, werden hohe Titer von Anti-Nikotin Antikörperantworten hervorgerufen durch Immunisierung mit dem CTB-Nikotin-Konjugat entweder unter Verwendung von Alum als Zusatzstoff oder in Abwesenheit von irgendeinem zugefügten Zusatzstoff. Für von CTB verschiedene Carrier wird der Fachmann imstande sein, nötigenfalls einen geeigneten Zusatzstoff zu finden.
  • Vehikel und Hilfsmittel
  • Therapeutische Präparate können gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch zulässige Vehikel enthalten, umfassend ohne darauf beschränkt zu sein steriles Wasser, Salzlösungen, z.B. Kochsalzlösung, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Alkohol, Gummiarabikum, Pflanzenöle, Benzylalkohole, Polyethylenglykol, Gelatine, Mannitol, Kohlenhydrate, Magnesiumstearat, viskoses Paraffin, Fettsäureester, Hydroxymethylzellulose und Puffer. Andere geeignete Vehikel können von den Fachleuten verwendet werden. Das therapeutische Präparat kann gewünschtenfalls zumindest ein Hilfsmittel, z.B. Dispergiermittel, Überzüge wie Lipide und Liposome, grenzflächenaktive Mittel wie Netzmittel und Emulgiermittel, Schmiermittel, Konservierungsmittel wie antibakterielle Mittel und pilzhemmende Mittel, Stabilisatoren und andere Mittel, die den Fachleuten wohl bekannt sind. Das erfindungsgemäße Präparat kann auch weitere Zusatzstoffe, Mittel und/oder inerte pharmakologisch zulässige Vehikel enthalten, die zugesetzt werden können, um die therapeutischen Eigenschaften des Präparats zu steigern oder alternative Verabreichungsarten zu ermöglichen.
  • Hoch reine Hapten-Carrier-Konjugate, hergestellt wie oben beschrieben, können in therapeutische Präparate gemäß der Erfindung eingearbeitet werden, die für die Humantherapie geeignet sind. Wenn ein erfindungsgemäßes therapeutisches Präparat durch Injektion (d.h. subkutane Injektion) verabreicht werden soll, dann wird bevorzugt, dass die hoch reine Hapten-Carrier-Konjugat in wässeriger Lösung bei einem pharmazeutisch zulässigen pH-Wert (d.h. einem Bereich von etwa 4-9) löslich ist, sodass das Präparat flüssig ist und eine leichte Verabreichung stattfindet. Es ist jedoch möglich, ein Präparat zu verabreichen, worin das hoch reine Hapten-Carrier-Konjugat in wässeriger Lösung suspendiert ist, und eine solche Suspension liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Das Präparat enthält optional auch pharmazeutisch zulässige Vehikel, Zusatzstoffe und Hilfsmittel oder zusätzliche aktive Verbindungen. Je nach der Art der Verabreichung sollen optionale Zutaten gewünschte Eigenschaften des therapeutischen Präparats gewährleisten, beispielsweise angemessene Fließfähigkeit, Vorbeugung der Wirkung unerwünschter Mikroorganismen, gesteigerte Bioverfügbarkeit oder verlängerte Absorption.
  • Ein erfindungsgemäßes therapeutisches Präparat soll steril, unter den Bedingungen von Herstellung, Lagerung, Auslieferung und Gebrauch stabil, und konserviert gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen sein. Eine bevorzugte Technik zur Herstellung eines erfindungsgemäßen therapeutischen Präparats, um die Integrität des Präparats aufrechtzuerhalten, ist, die Formulierung von Konjugat und pharmazeutischem Vehikel so zuzubereiten, dass das Präparat die Form eines gefriergetrockneten Pulvers haben kann, das in Vehikeln oder Hilfsstoffen, z.B. sterilem Wasser, unmittelbar vor Gebrauch wieder hergestellt wird. Im Fall steriler Pulver für die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren, Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen oder Trockenschleudern, was ein Pulver des aktiven Bestandteils plus beliebiger gewünschter zusätzlicher Bestandteile aus einer zuvor steril filtrierten Lösung ergibt.
  • Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen können in Übereinstimmung mit herkömmlichen Methoden der pharmazeutischen Technologie zu therapeutischen Präparaten für die Verabreichung an Patienten, z.B. Säuger, einschließlich Menschen, verarbeitet werden. Die bevorzugten Verabreichungsarten sind intranasal, intratracheal, oral, dermal und/oder als Injektion. Eine besonders günstige Kombination von Verabreichungsarten umfasst eine anfängliche Injektion mit intranasalen Nachimpfungen.
  • Für die parenterale Applikation besonders geeignet sind injizierbare, sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässerige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate einschließlich Suppositorien. Ampullen sind zweckmäßige Einheitsdosen. Für die enterale Verabreichung besonders geeignet sind Tabletten, Dragees, Flüssikgkeiten, Suspensionen, Tropfen, Suppositorien oder Kapseln, die einen verdaubaren Überzug haben können. Ein Sirup, Elixir od.dgl. kann angewendet werden, worin ein gesüßtes Vehikel verwendet wird.
  • Präparate mit lang anhaltender oder gezielter Freisetzung können zubereitet werden, z.B. Liposome oder solche, worin die aktive Verbindung (Konjugat) mit differentiell abbaubaren Überzügen geschützt ist, z.B. durch Mikrokapselung, Mehrfachüberzüge etc. Es ist auch möglich, die neuen Verbindungen gefrierzutrocknen und die erhaltenen Lyophilisate beispielsweise zur Herstellung von injizierbaren Produkten zu verwenden.
  • Für die topische Anwendung werden sie als nicht sprühbare Formen, viskose bis halbfeste oder feste Formen verwendet, die einen Träger enthalten, der mit der topischen Anwendung verträglich ist und eine dynamische Viskosität vorzugsweise größer als Wasser hat. Geeignete Zubereitungen sind z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen, Salben etc., die gewünschtenfalls sterilisiert oder mit Hilfsstoffen vermischt sind. Für die topische Anwendung geeignet sind sprühbare Aerosole, worin die aktive Verbindung, vorzugsweise in Kombination mit einem geeigneten Vehikel oder Hilfsstoff, in eine quetschbare Flasche oder in Mischung mit einem unter Druck stehenden flüchtigen, normalerweise gasförmigen Treibmittel verpackt ist.
  • Ein durch die Präparate und Methoden der vorliegenden Erfindung hervorgerufener Antikörper kann ein Molekulargewicht im Bereich von 150 KDa bis 1000 KDa haben. Wenn das Subjekt nach Impfung mit dem optimierten Konjugat in dem therapeutischen Präparat freiem Heroin oder Nikotin ausgesetzt wird, ist das freie Heroin oder Nikotin Ziel des oder der heroin-spezifischen oder nikotin-spezifischen Antikörper(s). Keine Veränderungen in der Form oder Struktur der Droge sind notwendig, damit der Antikörper die Droge in vivo erkennt. Während die vorliegende Erfindung nicht eingeschränkt werden soll, wird angenommen, dass die Antidrogen-Antikörper, wenn das geimpfte Individuum Heroin oder Nikotin ausgesetzt wird, die Wirkungen von Heroin und Nikotin blockieren. Es wird angenommen, dass zumindest drei Mechanismen zu der blockierenden Aktivität beitragen. Erstens sind die Antikörper nicht imstande die Blut-Gehirnschranke zu überwinden. Es wird daher angenommen, dass Heroin oder Nikotin, wenn sie an den Anti-Heroin- oder Anti-Nikotin Antikörper gebunden sind, die Blut-Gehirnschranke nicht überwinden können und nicht imstande sind, ihre Wirkung auf die Opoidrezeptoren bzw. Dopamintransporter ausüben können. Zweitens wird, ohne auf eine spezielle Theorie beschränkt zu sein, angenommen, dass der Antikörper eine Bindung der Droge an ihren Rezeptor durch einfache sterische Blockade verhindert. Es wird erwartet, dass dieser Mechanismus wirksam ist bei der Blockierung einiger der nicht ZNS-bezogenen Effekte (z.B. cardiale Toxizität) und in der Aktivität von Antikörpern gegen andere Drogen mit nicht ZNS-bezogenen Zielen. Drittens haben sowohl Heroin als auch Nikotin relativ kurze Halbwertszeiten in vivo infolge sowohl enzymatischen als auch nicht enzymatischen Abbaus, wobei inaktive Metaboliten entstehen. Heroin und Nikotin sind insbesondere ausreichend kleine Drogen, sodass es sehr unwahrscheinlich ist, dass sie mit Antikörpern vernetzen könnten, weshalb es sehr unwahrscheinlich ist, dass physiologisch signifikante Immunkomplexbildung bei einer der beiden Drogen eintritt.
  • Noch weitere Ausführungsformen für Schleimhautanwendungen werden bei der praktischen Umsetzung der Erfindung benützt. Beispielsweise werden Copolymer-Mikrokügelchen verwendet, um eine Immunreaktion der Schleimhaut hervorzurufen oder zu steigern. Diese kleinen biologisch abbaubaren Mikrokügelchen umhüllen und schützen das Konjugat und erleichtern die Aufnahme durch das Immunsystem der Schleimhaut. Obwohl sie weitest verbreitet für eine orale Immunisierung verwendet werden, wurde auch berichtet, dass sie bei intranasaler Immunisierung wirksam sind (Walker (1994) Vaccine 12: 387-399). Inerte Polymere wie Poly(lactid-co-glycolid) (PLG) mit 1-10 μm Durchmesser sind in dieser Hinsicht besonders brauchbar (Holmgren et al (1994) Am.J.Trop.Med.Hyg. 50:42-54; Serva (1994) Science 265: 1522-1524).
  • Zusätzlich zu den bevorzugten Konjugaten wird Querimmunisierung mit verschiedenen Konjugaten ausgeführt, um eine Querreaktivität der Antikörper zu minimieren. Mäuse werden mit einem Konjugat grundimmunisiert, und dann am Tag 14 mit einem an denselben Carrier gekuppelten anderen Konjugat nachgeimpft. Nur die Untergruppe von Antikörper produzierenden B-Zellen, die sowohl das Heroin- als auch das Nikotinkonjugat erkennen, werden maximal stimuliert und expandiert. Es wird angenommen, dass die Spezifität der Erkennung ansteigt, da die sich die beiden Konjugate in ihrem Angriffspunkt an dem Drogenmolekül unterscheiden. Die Spezifität der hervorgerufenen Antisera wird dann durch kompetitiven ELISA bestätigt.
  • Obendrein stimulieren therapeutische Präparate, die mehr als ein Konjugat enthalten, polyklonale Antikörper, wodurch die Antikörperantwort auf folgende Herausforderungen erhöht wird.
  • Dosis
  • Jahrelang anhaltende neutralisierende Antikörperreaktionen auf Pathogene sind bekannt, und es scheint möglich zu sein, eine Anti-Heroin oder Anti-Nikotin Antikörperantwort mit hohem Titer zu erreichen, der zumindest ein Jahr aufrechterhalten wird. Basierend auf Werten, die mit konventionellen Impfstoffen erhalten wurden, sollte es möglich sein, die Konzentrationen eines spezifischen Antikörpers zu erzielen, die für die Neutralisation von Nikotinkonzentrationen im Plasma erforderlich sind. Pharmakokinetische Daten in Mäusen – die Daten sind nicht gezeigt – zeigen klar, dass physiologisch relevante neutralisierende Antikörperkonzentrationen erreicht werden können. Schließlich stellt die Fähigkeit mütterlicher Antikörper, die Plazenta heroinsüchtiger oder rauchender Frauen zu überschreiten und so den Fötus zu schützen, einen weiteren erwünschten Effekt der therapeutischen Nikotinimpfung dar. Die Optimierung einer Therapie, um für eine breite Population effektiv zu sein, ist immer eine Herausforderung, doch die Fachleute nutzen ein sorgfältiges Verständnis verschiedener Faktoren bei der Bestimmung der geeigneten therapeutischen Dosis. Ferner können Antikörperantworten unter Verwendung spezifischer ELISAs aufgezeichnet werden, wie in den Beispielen und anderen auf Antikörpern basierenden Versuchen erläutert.
  • Genetische Variationen in Eliminationsraten, Interaktionen mit anderen Drogen, durch Krankheiten verursachten Änderungen in Elimination und Verteilung und andere Faktoren vereinigen sich zu einem weiten Bereich von Reaktionen auf Impfstofflevels bei Patienten, denen die gleiche Dosis verabreicht wird. Klinische Indikatoren unterstützen die Titration mancher Medikamente in den gewünschten Bereich, und keine chemische Bestimmung ist ein Ersatz für sorgfältige Beobachtungen der Reaktion auf die Behandlung. Da Ausscheidung, Ansammlung in der Halbwertszeit und beständiger Zustand der Plasmagehalte schwer vorherzusagen sind, ist die Messung der Produktion der Antikörper gegen die missbrauchte Droge brauchbar als Anleitung für die optimale Dosis. Alle einzelnen erfindungsgemäßen Konjugate/Carrier/Vehikel werden bewertet auf ihre Fähigkeit eine Antikörperantwort zu induzieren, die am besten imstande, ist freies Heroin oder freies Nikotin im Kreislauf zu binden.
  • Weitere Details zu den Effekten von Carriern und Vehikeln auf die Induktion einer Antikörperantwort sind in den Beispielen angegeben. So ist zu bemerken, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen aktiver Verbindung in einem speziellen Fall variieren entsprechend dem spezifischen Konjugat, das verwendet wird, den speziellen formulierten Präparaten, der Art der Applikation und den besonderen Stellen und Organismen, die behandelt werden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform das einen geeigneten Carrier enthaltende Präparat zuerst parenteral verabreicht und über die Schleimhaut nachverstärkt. Wie hier detaillierter behandelt, ist diese Art der Immunisierung mit der optimalen Kombination von Hapten und Carrier sehr effektiv in der Hervorbringung primär von IgG systemisch und primär IgA lokal.
  • Wie in den Beispielen erläutert, wurden Mausmodelle verwendet, um verschiedene Charakteristika der Antikörperantwort zu zeigen und zu messen, einschließlich Antikörpertiter, Fähigkeit freies Nikotin zu erkennen, Nikotinbindungskapazität, Affinität für Nikotin, Spezifizität der Antikörperantwort, Antikörper-Isotyp, Antikörperlokaliation im Gewebe und der physiologischen Effekte des Antikörpers, die auf die Nikotinverabreichung folgen.
  • Antikörpertiter
  • Die erste Überprüfung der Impfung ist, ob das interessierende Konjugat eine Antikörperantwort mit hohem Titer hervorruft. Antikörpertiter können mittels eines ELISA bestimmt werden, wie den Fachleuten wohl bekannt ist. Beipielsweise werden Platten mit einem Nikotin-HEL-Konjugat beschichtet, gründlich gewaschen und mit verschiedenen Verdünnungen des Testserums inkubiert. Die Platten werden wieder gewaschen und mit einem zweiten enzym-markierten anti-Maus IgG Antikörper entwickelt. Die Titer werden definiert als der Kehrwert der Verdünnung des Serums, die 50 % der maximalen Antwort ergibt.
  • Der Antikörpertiter hängt sowohl von der Antikörper-Konzentration als auch der Antikörper-Affinität ab. Bei der Bestimmung des erforderlichen Antikörpertiters werden von den Fachleuten sowohl die Konzentration als auch die Affinität der Antikörper in Betracht gezogen.
  • Die Antikörperaffinität spiegelt die Menge des Antikörper-Droge-Komplexes im Gleichgewicht mit ungebundenem Antikörper und ungebundener missbrauchter Droge wider, sodass: Keq = [Ab + Drogenkomplex]/[Ab] × [Droge]worin [Ab] = molare Konzentration unbesetzter Antikörper-Bindungsstellen; [Droge] = molare Konzentration ungebundener Droge; und [Ab + Drogenkomplex] = molare Konzentration des Antikörper-Drogen-Komplexes.
  • Spezifität der Antikörperantwort
  • Um beim Blocken der Aktivität einer süchtig machenden Droge maximal effektiv zu sein, müssen die induzierten Antikörper minimale Affinität für pharmakologisch inaktive Metaboliten dieser Droge haben. Die Bindung von Antikörpern an pharmakologisch inaktive Metaboliten einer Droge würde die Potenz des Impfstoffs reduzieren. Die Spezifität der Antisera für Metaboliten wird in einem kompetitiven ELISA und durch radiomarkierten Immunoassay bestimmt. Außerdem wird die Effektivität des Impfstoffs erhöht, wenn die induzierten Antikörper an pharmakologisch aktive Metaboliten und Derivate einer Droge binden.
  • Außerdem sollte die Interaktion der hervorgerufenen Antikörper mit anderen Medikamenten, die in der Suchttherapie und in anderen medizinischen Verfahren verwendet werden, minimiert sein. Insbesondere werden Querreaktionen mit Medikamenten, die Heroin- und Mehrfachdrogensüchtigen gewöhnlich verschrieben werden, vermieden. Die folgenden Medikamente sind brauchbar als Co-Behandlungen: Buprenorphine, Desipramine, Naloxone, Haloperidol, Chlorproazine, Mazindol und Bromocriptine, sowie andere, die relevant werden könnten.
  • BEISPIEL 1:
  • Herstellung von Nikotin-Konjugat
  • Verfahren A: Einer Lösung von Nornikotin (50 mmol) in Methylenchlorid wurden Triethylamin (75 mmol), gefolgt von Bernsteinsäureanhydrid (100 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde sequentiell mit 10 %iger wässeriger Chlorwasserstoffsäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Kochsalzlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen (MgSO4) und Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wurde der Rückstand gereinigt unter Verwendung von Silicagel-Blitzchromatographie, um das gewünschte Produkt zu liefern.
  • Verfahren B: Das succinylierte Nornikotin wurde dann verwendet, um das Nikotin-Konjugat PS-54 (7) zu synthetisieren. Einer Lösung von succinyliertem Nornikotin (5 μm) in DMF (0,1 ml) wurde Diisopropylethylamin (10 μm) zugesetzt, gefolgt von HATU (5,5 μm). Nach 10 Minuten wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise einer Lösung von entweder HEL oder BSA (500 μg) in 0,1 M Natriumboratpuffer bei pH 8,8 (0,9 ml) zugesetzt, und die Mischung wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Der pH-Wert der Konjugatlösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 0,1 M wässeriger Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt, worauf durch Dialyse gegen PBS gereinigt wurde. Das Dialysat wurde durch ein 0,2 μm Filter filtriert, und das Ausmaß der Haptenierung durch Massenspektralanalyse oder UV-Absorption gemessen.
  • Induktion von Nikotin-spezifischen Antikörperantworten
  • Um eine für ein kleines Molekül oder Hapten wie Nikotin spezifische Antikörperantwort zu induzieren, war es notwendig, es mit einem ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier, z.B. einem Protein-Carrier, zu vernetzen. Der Carrier wird von T-Zellen erkannt, die nötig sind für die Initiation und Aufrechterhaltung der Antikörperproduktion durch Nikotin-spezifische B-Zellen. In diesem Beispiel war der verwendete Carrier BSA. Eine Reihe strukturell verschiedener Nikotin-BSA-Konjugate wurde hergestellt, die durch verschiedene Teile des Nikotinmoleküls mit etlichen verschiedenen Typen von Vernetzern (6b) vernetzt wurden. Der Satz verschiedener Konjugate ermöglichte die Testung verschiedener Abänderungen und Darstellungen des Nikotinmoleküls. Da jedes gegebene Nikotin-Konjugat variable Mengen an Antikörpern induzieren kann, die entweder das freie Hapten (Nikotin), den Carrier oder nur das Konjugat (und nicht das Nikotin selbst) erkennen, wurde die Prüfung der Konjugate wie im folgenden Beispiel ausgeführt.
  • Vier weibliche Balb/c Mäuse, 2-3 Monate alt, wurden intraperitoneal mit 50 μg Nikotin-BSA-Konjugat, PS-55-BSA, in vollständigem Freund Adjuvans immunisiert. Diese Tiere haben eine gut gestaltete reproduzierbare Antwort auf die zu untersuchenden Antigene. Eine zweite Injektion von PS-55-BSA wurde am Tag 21 verabreicht, und die Mäuse wurden am Tag 35 getötet. Die Sera wurden in einem ELISA auf Antikörperbindung an ein Konjugat von PS-55 und Hühnerei-Lysozym-Protein (HEL) untersucht und sind in 9a gezeigt. Diese Daten zeigen, dass dieses Nikotin-BSA-Konjugat imstande war, starke Antikörperantworten hervorzurufen.
  • Eine zweite Gruppe von 10 weiblichen Balb/cbyj Mäusen, 2-3 Monate alt, wurde zur Herstellung eines Sera-Pools von Anti-Nikotin Antisera immunisiert. In diesem Experiment war der verwendete Carrier CTB. Die Mäuse wurden durch intramuskuläre Injektion mit 10 μg PS-55-CTB in Alhydrogel geimpft und dreimal mit demselben nachgeimpft. Die Mäuse wurden getötet und das Serum wurde separat behandelt. Das Serum von jedem Tier wurde zuerst in einem direkten Nikotin ELISA getestet, um Anti-Nikotin-Antikörper zu messen, und dann in einem kompetitiven ELISA, um festzustellen, ob die induzierten Antikörper imstande waren, freies Nikotin zu erkennen.
  • Das Serum jedes Tieres wurde in einem direkten Anti-Nikotin-ELISA untersucht, um die produzierten Antikörper wie folgt zu messen. Immunolon 2 96 Well ELISA Platten wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl von 10 μg/ml eines zweiten Konjugats Nikotin und HEL. PS-55-HEL, verdünnt in 1 × PBS beschichtet. Die Platten wurden 1 Stunde lang mit 0,5 % Gelatine in PBS bei Raumtemperatur geblockt. Die Platten wurden dreimal mit 1 × PBS gewaschen, das 0,05 % Tween-20 (PBS-T) enthält. Serumproben wurden den Platten zugesetzt, beginnend mit einer 1/300 Verdünnung für die mit PS-55-HEL beschichteten Platten. Das Serum wurde mit dreifachen Verdünnungen verdünnt und auf den geblockten Platten 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS-T gewaschen. Biotinyliertes Ziegen-anti-Maus IgG (Lot #J194-N855B oder C) wurde 1/10 000 in PBS-T verdünnt, und 100 μl wurden jeder Welle zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Streptavidin-HRP wurde 1/10 000 verdünnt und den Wellen 10 Minuten lang zugesetzt, worauf eine Waschung mit PBS-T folgte. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T gewaschen und dann entwickelt, indem jeder Welle TMB Substrat zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten mit 1 M Phosphorsäure gestoppt. Die Platten wurden gelesen unter Verwendung eines ELISA Lesegeräts bei O.D. 450 nm. Sera, die im direkten ELISA Antinikotin-Antikörper generierten, wurden dann in einem kompetitiven ELISA untersucht.
  • Erkennung von freiem Nikotin
  • Um festzustellen, ob die induzierten Antikörper imstande sind, das freie Nikotinmolekül zu erkennen, wurde ein kompetitiver ELISA ausgeführt. In diesem Versuch konkurriert das freie Nikotin mit PS-55 HEL, mit dem ELISA Platten beschichtet sind, um die Bindung von Antikörpern im Serum. Wenn die Antikörper, die eine hohe Affinität für Nikotin haben, die meisten Antikörper umfassen, die an PS-55 HEL binden, dann sind geringe Konzentrationen an Nikotin imstande, die Antikörperbindung zu hemmen.
  • Für 3 von 4 der oben beschriebenen Mäuse, die mit PS-55 BSA geimpft worden waren, wurde die Antikörperbindung an PS-55 HEL durch freies Nikotin gehemmt (Daten nicht gezeigt). Es ergibt sich, dass die Anwesenheit von Antikörpern, die für das Konjugat allein spezifisch sind, wahrscheinlich nicht in die Wirkung der Anti-Nikotin Antikörper eingreift. Dies zeigt an, dass Antikörper in jedem dieser Sera vorhanden ist, der freies Nikotin erkennt. Der hauptsächliche Metabolit von Nikotin, Cotinin, wurde ebenfalls im kompetitiven ELISA untersucht, und er kann nicht mit Antikörpern in irgendeinem der Sera konkurrieren außer in sehr hohen Konzentrationen. Um zu verifizieren, dass die induzierten Antikörper imstande waren, das freie Nikotinmolekül zu erkennen, wurde ein RIA angewendet, um die spezifische Bindung an [3H]-Nikotin zu messen. Immunsera aus dem obigen Experiment wurden mit [3H]-Nikotin und Protein-G-konjugierten Sepharose-Perlen (Gammabind-G Sepharose, Pharmacia) inkubiert, die IgG in den Serumproben bindet. Das Antikörper-gebundene [3H]-Nikotin wurde durch Zentrifugieren der Perlen isoliert und durch Scintillationszählung der Perlen detektiert. Sera von 3 der 4 Mäuse waren signifikant an freies [3H]-Nikotin gebunden (Daten nicht gezeigt). Eine Vorinkubation dieser Sera mit 50-fachem Überschuss an unmarkiertem Nikotin hemmte die Bindung von [3H]-Nikotin an diese Antikörper vollständig. Diese Ergebnisse zeigen, dass Nikotin-Carrier-Konjugate synthetisieert worden sind, die Nikotin-spezifische Antikörperantworten hervorrufen, die geeignet sind sollten, der Distribution von Nikotin zum Gehirn in vivo vorzubeugen.
  • Für die zweite Gruppe von 10 Mäusen, die unter Verwendung von PS-55-CTB immunisiert wurden, wurde die Antikörperbindung von PS-55 HEL durch freies Nikotin gehemmt (10). Eine Verdünnung von Serum wurde benutzt, die den 50 %-Punkt Titer darstellte. Immunolon 2 96 Well ELISA Platten wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl von 10 μg/ml PS-N-3,2 HEL, verdünnt in 1 × PBS überzogen. Die Platten wurden mit 0,5 % Gelatine in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Platten wurden dreimal mit 1 × PBS, das 0,05 % Tween-20 (PBS-T) enthielt, gewaschen. Die Platten wurden mit Antiserum in Gegenwart variierender Konzentrationen von freiem Nikotin sowie von Metaboliten, Drogen und verwandten Verbindungen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS-T gewaschen. Biotinyliertes Ziegen Anti-Maus IgG (Lot#J194-N855B oder C) wurde 1/10 000 in PBS-T verdünnt, und 100 μl wurden jeder Welle zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Streptavidin-HRP wurde 1/10 000 verdünnt und den Wellen 30 Minuten lang mit PBS-T zugesetzt, anschließend wurde mit PBS-T gewaschen. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T gewaschen und denn entwickelt, indem TMB Substrat jeder Welle zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten mit 1M Phosphorsäure beendet. Platten wurden gelesen unter Verwendung eines ELISA Lesegeräts bei O.D. 450 nm. Die Konkurrenzkurven für jeden untersuchten Sera Pool sind in 10 gezeigt. Steigende Konzentrationen des Konkurrenten wurden an der x-Achse dargestellt, und die Absorption bei 450 nm war an der y-Achse.
  • Wie in 10 gezeigt, gab es wenig oder keine Erkennung zu den Metaboliten von Nikotin, Cotinin oder Nornikotin. Das Anästhetikum Lidocaine wurde als negative Kontrolle eingesetzt und war nicht imstande, die Bindung der Antikörper zu konkurrieren. Das Konjugat selbst wurde auch als Konkurrent verwendet und war imstande, die Bindung dieses Antikörpers zu konkurrieren.
  • Um maximal effektiv beim Blocken der Aktivität von Nikotin zu sein, sollten die induzierten Antikörper minimale Affinität gegenüber den Metaboliten von Nikotin haben. Eine Bindung der Antikörper an die stabileren Metaboliten würde das Potential des Impfstoffes reduzieren. Beim Überprüfen des Antisera-Pools war nur Nikotin imstande, die Bindung des Antikörpers an das Konjugat zu hemmen. In diesem Experiment wurde wenig oder kein Erkennen der Metaboliten (Cotidin und Nornikotin) und des Anästhetikums (Lidocain) festgestellt. Das Nikotin-CTB-Konjugat induziert daher Antikörper, die Nikotin erkennen und die weniger aktiven Metaboliten nicht erkennen. Das Nikotin-CTB-Konjugat erkennt auch nicht die Verbindungen, die verwandte Strukturen haben, und die Medikamente, die derzeit zur Behandlung von Nikotinsucht verwendet werden (Daten nicht gezeigt).
  • Spezifität von Nikotin-spezifischen Antikörpern.
  • Um die Spezifität der durch den Nikotinimpfstoff hervorgerufenen Antinikotin-Antikörper zu analysieren, werden Sera von den mit Nikotin-CTB-Konjugat immunisierten Mäusen in einem kompetitiven ELISA getestet. Eine Platte von Nikotinmetaboliten und verwandten Molekülen wird bei verschiedenen Konzentrationen getestet. Wenn die Antikörper hohe Affinität für den Metaboliten haben, dann sind niedrige Konzentrationen imstande, diesen Versuch effektiv zu konkurrieren. Die relative Reaktivität wird ausgedrückt als IC50, die Konzentration des Inhibitors, die das ELISA Signal um 50 % senkt. Die folgenden Metaboliten werden auf ihre Reaktivität untersucht: Nikotinglucuronid, Cotinin, Cotininglucuronid, trans-3'-Hydroxycotinin, trans-3'-Hydroxycotinin-glucuronid, Nikotin-1'-N-oxid, Cotinin-N-oxid und Nornikotin.
  • Effektivität des Nikotin-spezifischen Antikörpers hinsichtlich Hemmung der Nikotindistribution in vivo Hemmung der Nikotindistribution zum Gehirn
  • Um durch Nikotin-spezifische Antikörper verursachte Änderungen in der Distribution von Nikotin im Gewebe festzustellen, wird die 3H-Nikotindistribution in mit Nikotin-CTB immunisierten Mäusen, verglichen mit natürlichen (nicht immunisierten) Kontrollmäusen, verfolgt. Immunen und kontrollimmunisierten Mäusen werden 0,08 mg/kg 3H-Nikotin i.v. injiziert, und dann werden sie 1,0 Minuten nach der Injektion geköpft. Gehirne und Blut (Plasma) werden für die folgende Analyse der Nikotinkonzentration in Gewebe und Plasma entfernt. Blut wird in EDTA enthaltenden Röhrchen gesammelt, um eine Gerinnung zu vermeiden. Blut- und Plasmaproben werden in Scintillationsampullen gegeben, die Gewebestabilisator enthalten; die Digestion der Proben tritt während 3 Tagen bei Raumtemperatur ein. Die Proben werden entfärbt und Scintillationscocktail wird jeder Probe zugesetzt. Eisessig wird zugesetzt, um die Proben zu klären. Nachdem die Proben in einem Scintillationszähler gezählt wurden, werden die Daten auf ng/g oder ng/ml Gewebe umgerechnet. Die Nikotinkonzentration im Gehirngewebe von mit Nikotin-CTB immunisierten Mäusen ist deutlich geringer nach der Injektion von 3H-Nikotin als im Gehirngewebe natürlicher Kontrollmäuse (Daten nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 2:
  • Methode A N'-Buttersäure-addukt von (S)-Nikotin
  • Einer Lösung von (S)-Nikotin (0,031 mol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) bei Eiswassertemperatur unter Argon werden während 10 Minuten tropfenweise Ethyl-4-brombutyrat (0,0341 mol) zugesetzt. Die resultierende orange-farbige Lösung wurde auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen und 18 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt, und der braune Rückstand wurde mit Hexan gefallt, sodass man eine analytisch reine Probe des gewünschten Esters erhielt.
  • Der Ester (36 mg) wurde in Methanol (3 ml) und 1 M-Natriumhydroxidlösung (5 ml) gelöst und 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 10 % Salzsäure gelöst und mit Ethylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen (MgSO4) wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und man erhielt die gewünschte Verbindung.
  • Methode B N'-Valeriansäure-addukt von (S)-Nikotin
  • Einer Lösung von (S)-Nikotin (0,031 mol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) bei Eiswassertemperatur unter Argon werden während 10 Minuten tropfenweise 1-Bromvaleriansäure (0,0341 mol) zugesetzt. Die resultierende orange-farbige Lösung wurde auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen und 18 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt, und der braune Rückstand wurde mit Hexan gefällt, sodass man eine analytisch reine Probe der gewünschten Verbindung erhielt.
  • Methode C N'-Capronsäure-addukt von (S)-Nikotin
  • Einer Lösung von (S)-Nikotin (0,031 mol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) bei Eiswassertemperatur unter Argon werden während 10 Minuten tropfenweise 1-Bromcapronsäure (0,0341 mol) zugesetzt. Die resultierende orange-farbige Lösung wurde auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen und 18 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt, und der braune Rückstand wurde mit Hexan gefallt, sodass man eine analytisch reine Probe der gewünschten Verbindung erhielt.
  • Methode D N'-Octansäure-addukt von (S)-Nikotin
  • Einer Lösung von (S)-Nikotin (0,031 mol) in wasserfreiem Methanol (50 ml) bei Eiswassertemperatur unter Argon werden während 10 Minuten tropfenweise die entsprechende 1-Bromoctansäure (0,0341 mol) zugesetzt. Die resultierende orange-farbige Lösung wurde auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen und 18 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt, und der braune Rückstand wurde mit Hexan gefällt, sodass man eine analytisch reine Probe der gewünschten Verbindung erhielt.
  • BEISPIEL 3:
  • Methode A Allgemeine Herstellung von PS-55, PS-56, PS-57 und PS-58
  • Einer Lösung des entsprechenden N'-Alkansäure-Analogons von Nikotin (6,27 × 10–5 Mol) (aus Beispiel 1) in DMF (1,6 ml) wurden DIEA (1,25 × 10–4 Mol) und HATU (7,53 × 10–5 Mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde die blassgelbe Lösung entweder HEL oder BSA (16,5 mg) in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,3 (14,4 ml) zugesetzt und 18 Stunden gerührt. Die Konjugat-Lösung wurde über Nacht durch Dialyse gegen PBS bei 4°C gereinigt. Die Konjugate wurden analysiert unter Anwendung von Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • Methode B Herstellung von PS-55
  • Einer Lösung des N'-Buttersäure-Addukts von Nikotin (39 mg, 1,56 × 10–4 Mol) (aus Beispiel 2, Methode A) in DMF (0,4 ml) wurden DIEA (54 ml, 3,10 × 10–4 Mol) und HATU (71 mg, 1,87 × 10–4 Mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–5 Mol [15,6 × 10–6 Mol Lysin]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,5 Puffer, zugesetzt und dann 1 Stunde lang gerührt. Das Konjugat wurde analysiert unter Anwendung von Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • Methode C Herstellung von PS-56
  • Einer Lösung des N'-Valeriansäure-Addukts von Nikotin (2 mg) (aus Beispiel 2, Methode B) in DMF (0,4 ml) wurden DIEA (2 ml) und HATU (2 mg) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 Mol [15,6 × 10–6 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,5 Puffer, zugesetzt und dann 1 Stunde lang gerührt. Das Konjugat wurde über Nacht durch Dialyse gegen PBS bei 4°C gereinigt. Das Konjugat wurde analysiert unter Anwendung von Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • Methode D Herstellung von PS-57
  • Einer Lösung des N'-Capronsäure-Addukts von Nikotin (2 mg) (aus Beispiel 2, Methode C) in DMF (0,4 ml) wurden DIEA (2 ml) und HATU (2 mg) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 Mol [15,6 × 10–6 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,5 Puffer, zugesetzt und dann 1 Stunde lang gerührt. Das Konjugat wurde über Nacht durch Dialyse gegen PBS bei 4°C gereinigt. Das Konjugat wurde analysiert unter Anwendung von Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • Methode E Herstellung von PS-58
  • Einer Lösung des N'-Octansäure-Addukts von Nikotin (2 mg) (aus Beispiel 2, Methode D) in DMF (0,4 ml) wurden DIEA (2 ml) und HATU (2 mg) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 Mol [15,6 × 10–6 mol Lysin]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,5 Puffer, zugesetzt und dann 1 Stunde lang gerührt. Das Konjugat wurde über Nacht durch Dialyse gegen PBS bei 4°C gereinigt. Das Konjugat wurde analysiert unter Anwendung von Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • Methode F Herstellung von PS-60
  • i) Herstellung des N-Pyrrolidin-Addukts
  • Einer Lösung von Nornikotin (10 mmol) in Methanol wird Ethyl-5-bromvalerat (10 mmol) tropfenweise zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird unter Verwendung von Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt, sodass man das gewünschte N-Pyrrolidin-Addukt erhält.
  • ii) Herstellung des Konjugats
  • Der Ester (15 mmol) wird in 5 % wässerigem Methanol gelöst, und diesem wird Natriumhydroxid (15 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, wird der pH durch vorsichtige Zugabe von wässeriger 1M-Salzsaure auf pH 2 eingestellt und dann mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen (MgSO4) und Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird das Produkt gereinigt unter Anwendung von Silicagel-Blitzchromatographie, sodass man die gewünschte freie Säure erhält.
  • Einer Lösung der freien Säure (1,55 × 10–4 Mol) in DMF (0,4 ml) wird DIEA (3,1 × 10–4 Mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–4 Mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 Mol [15,5 × 10–6 Mol Lysine]) in 4 ml 0,1M-Natriumborat, 0,15M-Natriumlchlorid bei pH 8,5 als Puffer zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gehalten, neutralisiert und dann extensiv bei 4°C gegen PBS dialysiert, sodass man PS-60 erhält.
  • Methode G Herstellung von PS-51
  • i) Herstellung von Methyl-6-methylnikotinat
  • 6-Methylnicotinat (0,375 mol) wird einer unter Rückfluss befindlichen Lösung von konzentrierter Schwefelsäsure (25 mol) in Methanol (250 ml) zugesetzt und drei Stunden am Rückfluss gerührt. Methanol (250 ml) wird dann zugesetzt, und die entstehende Mischung wird weitere 18 Stunden am Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und unter vermindertem Druck zu einem Schlamm eingeengt, der einer Lösung von Natriumbicarbonat (80 g) in Wasser (450 ml) zugesetzt wird. Die Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das meiste Methanol zu entfernen. Die resultierende trübe Mischung wird mit Methylenchlorid extrahiert, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Destillation unter vermindertem Druck gereinigt; man erhält den gewünschten Ester.
  • ii) Herstellung von 6-Methylmyosmin
  • Einer Lösung von Diisopropylamin (0,33 Mol) in Diethylether (500 ml) unter Argon bei –70°C wird n-Butyllithium (0,247 mol oder 1,6M-Lösung in Hexan) zugesetzt. Dem hergestellten Lithiumdiisopropylamin (LDA) wird N-(Trimethylsilyl)-pyrrolidinon (0,265 mol) zugesetzt, und die Lösung wird 15 Minuten bei –70°C gerührt. Dieser Lösung wird Methyl-6-methylnikotinat (0,165 mol) in Diethylether (25 ml) zugesetzt, und die Mischung wird über Nacht auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen. Danach wird die Mischung in einem Eisbad gekühlt, Wasser (33 ml) wird zugesetzt und die etherische Schicht wird abdekantiert. Zusätzlicher Ether wird zugesetzt, und die Dekantierung wird zweimal wiederholt. Der wässerigen Schicht wird konz. Salzsäure zugesetzt, und die resultierende Lösung wird über Nacht am Rückfluss gehalten. Die saure Lösung wird mit Diethylether gewaschen, unter vermindertem Druck eingeengt, in einem Eisbad gekühlt und mit 50 % wässerigem Kaliumhydroxid basisch gemacht. Die wässerige Schicht wird mit Diethylether (3 × 150 ml) extrahiert, getrocknet (Na2SO4), unter vermindertem Druck eingeengt und durch Destillation unter vermindertem Druck gereinigt. Man erhält das gewünschte 6-Methylmyosmin.
  • iii) Herstellung des Ethylvalerat-Addukts von 6-Methylmyosmin.
  • Einer Lösung von 6-Methylmyosmin (10 mmol) in trockenem Toluol wird Natriumamid (15 mmol) zugesetzt. Nach 10 Minuten wird Ethyl-5-bromvalerat (20 mmol) zugesetzt, und die Mischung wird gerührt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt, mit trockenem Ethanol abgeschreckt, mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet (MgSO4) und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Reinigung unter Verwendung von Silicagel-Blitzchromatographie ergibt das gewünschte Produkt.
  • iv) Herstellung des Valeriansäureaddukts von 6-Methylnornicotin
  • Einer Lösung des Addukts (1 mmol) von (iii) oben in Methanol wird Natriumcyanoborhydrid (10 mmol), eine Spur von Bromkresol-grün-Indikator und genügend 2n HCl/Methanol zugesetzt, sodass die Farbe der Lösung von blau nach gelb wechselt und gelb bleibt. Die Lösung wird mehrere Stunden rühren gelassen, worauf 6n wässerige Salzsäure zugesetzt und die Mischung unter vermindertem Druck eingeengt wird. Nach basisch machen mit Natriumbicarbonatlösung, Extraktion mit Diethylether und Trocknen (MgSO4) wird das Material gereinigt, indem man unter vermindertem Druck destilliert; man erhält die gewünschte Verbindung.
  • v) Herstellung des Valeriansäureaddukts von 6-Methylnikotin
  • Einer Lösung des Nornikotin-addukts (10 mmol) von (iv) oben in diethylether wird Jodmethan (10 mmol) zugesetzt. Die Lösung wird unter Verwendung eines effizienten Kondensators unter Argon zum Rückfluss gebracht, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird durch Anwendung von Blitzchromatographie gereinigt; man erhält eine racemische Mischung der gewünschten Verbindung. Die Isomeren werden getrennt durch chirale HPLC; man erhält das gewünschte (S)-Isomer.
  • vi) Herstellung des Konjugats
  • Einer Lösung des (S)-Isomeren des 6-Methylnikotinderivats (1,53 × 10–5 mol) von (v) oben in DMF wird DIEA (3,06 × 10–5 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–5 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung rCTB (2 mg, 3,40 × 10–8 mol Protein; 1,53 × 10–6 mol Lysine) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M NaCl, pH 8,5 Puffer, zugesetzt. Nach einer Stunde bei Umgebungstemperatur wird die Lösung bei 4°C extensiv gegen PBS dialysiert, und die Anzahl der Haptene analysiert unter Anwendung von Massenspektralanalyse.
  • Methode H Herstellung von PS-52
  • i) Herstellung von Methyl-5-methylnikotinat
  • 5-Methylnikotinat (0,375 mol) werden einer unter Rückfluss befindlichen Lösung von konz. Schwefelsäure (25 ml) in Methanol (250 ml) zugesetzt und bei Rückfluss 3 Stunden lang gerührt. Methanol (250 ml) wird dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wird zusätzliche 18 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und unter vermindertem Druck zu einem Schlamm eingeengt, der dann einer Lösung von Natriumbicarbonat (80 g) in Wasser (450 ml) zugesetzt wird. Die Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das meiste Methanol zu entfernen. Die resultierende trübe Mischung wird mit Methylenchlorid extrahiert, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das resultierende Rohprodukt wird durch Destillieren unter vermindertem Druck gereinigt, sodass man den gewünschten Ester erhält.
  • ii) Herstellung von 5-Methylmyosmin
  • Einer Lösung von Diisopropylamin (0,33 mol) in Diethylether (500 ml) wird unter Argon bei –70°C n-Butyllithium (0,247 mol einer 1,6 M Lösung in Hexan) zugesetzt. Dem so hergestellten Lithium-diisopropylamin (LDA) wird N-(Trimethylsilyl)-pyrrolidinon (0,265 mol) zugesetzt, und die Lösung wird 15 Minuten bei –70°C gerührt. Dieser Lösung wird 6-Methylnikotinat (0,165 mol) in Diethylether (25 ml) zugesetzt, und die Mischung wird über Nacht auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen. Danach wird die Mischung in einem Eisbad gekühlt, Wasser (33 ml) wird zugesetzt, und die etherische Schicht wird abdekantiert. Weiterer Ether wird zugesetzt und das Dekantieren wird zweimal wiederholt. Der wässerigen Schicht wird konz. Salzsäure zugesetzt, und die resultierende Lösung wird über Nacht am Rückfluss gehalten. Die saure Lösung wird mit Diethylether gewaschen, unter vermindertem Druck eingeengt, in einem Eisbad gekühlt und mit 50 % wässerigem Kaliumhydroxid basisch gemacht. Die wässerige Schicht wird mit Diethylether extrahiert (3 × 150 ml), getrocknet (Na2SO4), unter vermindertem Druck eingeengt und durch Destillation unter vermindertem Druck gereinigt; man erhält das gewünschte 5-Methylmyosmin.
  • iii) Herstellung des Ethylvalerat-Addukts von 5-Methylmyosmin
  • Einer Lösung von 5-Methylmyosmin (10 mmol) in trockenem Toluol wird Natriumamid (15 mmol) zugesetzt. Nach 10 Minuten wird Ethyl-5-bromvalerat (20 mmol) zugesetzt, und die Mischung wird gerührt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt, mit trockenem Ethanol abgeschreckt, mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet (MgSO4) und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Reinigung unter Anwendung von Silicagel-Blitzchromatographie ergibt das gewünscht Produkt.
  • iv) Herstellung des Valeriansäureaddukts von 5-Methylnornikotin
  • Einer Lösung des Addukts (10 mmol) von (iii) oben in Methanol wird Natriumcyanoborhydrid (10 mmol), eine Spur von Bromkresolgrün-Indikator und genügend 2n HCl/Methanol zugesetzt, dass die Farbe der Lösung von blau zu gelb wechselt und gelb bleibt. Die Lösung wird mehrere Stunden rühren gelassen, worauf wässerige 6n Salzsäure zugesetzt und die Mischung unter vermindertem Druck eingeengt wird. Nach dem basisch machen mit Natriumbicarbonatlösung, Extraktion mit Diethylether und Trocknen (MgSO4) wird das Material gereinigt durch Destillation unter vermindertem Druck; man erhält die gewünschte Verbindung.
  • v) Herstellung des Valeriansäureaddukts von 5-Methylnikotin
  • Einer Lösung des Nornikotin-addukts (10 mmol) von (iv) in Diethylether wird Jodmethan (20 mmol) zugesetzt. Die Lösung wird unter Argon zum Rückfluss gebracht, indem ein effektiver Kondensator verwendet wird, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird unter Anwendung von Blitzchromatographie gereinigt; man erhält eine racemische Mischung der gewünschten Verbindung. Die Isomeren werden getrennt durch chirale HPLC; man erhält das gewünschte (S)-Isomer.
  • vi) Herstellung des Konjugats
  • Einer Lösung des (S)-Isomers des 5-Methylnikotinderivats (1,53 × 10–5 mol) von (v) oben in DMF wird DIEA (3,06 × 10–5 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–5 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wir die blassgelbe Lösung rCTB (2 mg, 3,40 × 10–8 mol Protein; 1,53 × 10–6 mol Lysin) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M NaCl, Ph8,5 Puffer, zugesetzt. Nach 1 Stunde bei Umgebungstemperatur wird die Lösung extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert, und die Anzahl an Haptenen unter Anwendung von Massenspektralanalyse analysiert.
  • Methode I Herstellung von PS-53
  • (i) Herstellung von Methyl-4-methylnikotinat
  • 4-Methylnikotinat (0,375 mol) wird einer rückfließenden Lösung von konz. Schwefelsäure (25 ml) in Methanol (250 ml) zugesetzt und am Rückfluss 3 Stunden gerührt. Methanol (250 ml) wird dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wird weitere 18 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und unter vermindertem Druck zu einem Schlamm eingeengt, der einer Lösung von Natriumbicarbonat (80 g) in Wasser (450 ml) zugesetzt wird. Die Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das meiste Methanol zu entfernen. Die resultierende trübe Mischung wird mit Methylenchlorid extrahiert, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Destillieren unter vermindertem Druck gereinigt, und man erhält den gewünschten Ester.
  • (ii) Herstellung von 4-Methylmyosmin
  • Einer Lösung von Diisoproylamin (0,33 mol) in Diethylether (500 ml) unter Argon bei –70°C wird n-Butyllithium (0,247 mol einer 1,6 M Lösung in Hexan) zugesetzt. Dem hergestellten Lithium-diisopropylamin (LDA) wird N-(Trimethylsilyl)-pyrrolidinon (0,265 mol) zugesetzt, und die Lösung wird 15 Minuten bei –70°C gerührt. Dieser Lösung wird Methyl-6-methylnikotinat (0,165 mol) in Diethylether (25 ml) zugesetzt, und die Mischung wird über Nacht auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen. Danach wird die Mischung in einem Eisbad gekühlt, Wasser (33 ml) wird zugesetzt, und die Schicht wird abdekantiert. Weiterer Ether wird zugesetzt, und das Dekantieren wird zweimal wiederholt. Der wässerigen Schicht wird konz. Salzsäure zugesetzt, und die erhaltene Lösung wird über Nacht unter Rückfluss gehalten. Die saure Lösung wird mit Diethylether gewaschen, in einem Eisbad gekühlt und mit 50 % wässerigem Kaliumhydroxid alkalisch gemacht. Die wässerige Schicht wird mit Diethylether (3 × 150 ml) extrahiert, getrocknet (Na2SO4), unter vermindertem Druck eingeengt und durch Destillieren unter vermindertem Druck gereinigt; man erhält das gewünschte 4-Methylmyosmin.
  • BEISPIEL 4:
  • Herstellung von Heroin-Konjugaten
  • Herstellung von PS-61
  • i) Herstellung von Norheroin
  • Einer Lösung von Heroin (10 mmol) in Wasser bei 0°C wird Kaliumpermanganat (12 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, wird die Suspension auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen. Das Mangandioxid wird dann abfiltriert, und die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt; man erhält Norheroin als das gewünschte Produkt.
  • ii) Herstellung des Konjugat-Vorläufers
  • Einer Lösung des Norheroins (10 mmol) in THF wird 5-Ethyl-bromvalerat (20 mmol) tropfenweise zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird dann auf Silicagel unter Anwendung von Blitzchromatographie gereinigt; man erhält das gewünschte Esteraddukt von Norheroin.
  • iii) Herstellung des Konjugats
  • Der Ester (15 mmol) wird in 5 % wässerigem Methanol gelöst, und diesem wird Natriumhydroxid (15 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angedeutet, wird der pH durch vorsichtige Zugabe von 1 M wässeriger Salzsäure auf pH 2 gebracht und dann mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen (MgSO4) und Entfernung der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird das Produkt mittels Silicagel-Blitzchromatogaphie gereinigt; man erhält die gewünschte freie Säure.
  • Einer Lösung der freien Säure (1,55 × 10–4 mol) in DMF (0,4 ml) wird DIEA (3,1 × 10–4 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–4 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 mol [15,5 × 10–6 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, Puffer bei pH 8,5, zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gehalten, neutralisiert und dann extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert; man erhält PS-61. Das Konjugat wird mittels Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, analysiert, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • BEISPIEL 5:
  • Herstellung von PS-62 und PS-63
  • i) Herstellung von Vorläufern
  • Einer Lösung von Heroin (10 mmol) in trockenem THF bei 0°C wird Butyllithium (1,5 mmol einer 1,6 M Lösung in Hexan) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei 0°C gehalten, und dann wird Ethyl-4-brombutyrat (22 mmol) in THF tropfenweise während 10 Minuten zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird dann erhitzt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Danach wird die Reaktionsmischung auf 0°C gekühlt und 10 % wässerige Salzsäure wird vorsichtig zugesetzt. Die beiden Schichten werden getrennt, und die wässerige Schicht wird mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden dann sequentiell mit 1 M wässeriger Natriumhydroxidlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen (MgSO4) werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird mittels Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt; man erhält zwei Produkte, eines in ortho- und das andere in meta-Stellung zur aromatischen Acetatgruppe.
  • ii) Herstellung von PS-62
  • Der Ester des ortho-Addukts wird in 5 % wässerigem Methanol gelöst, und diesem wird Natriumhydroxid (5 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, wird der pH durch vorsichtige Zugabe von wässeriger 1 M Salzsäure auf pH 2 gebracht und dann mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen (MgSO4) und Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird das Produkt mittels Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt, und man erhält die gewünschte freie Säure.
  • Einer Lösung der freien Säure (1,55 × 10–4 mol) in DMF (0,4 ml) wird DIEA (3,1 × 10–4 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–4 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 mol [15,5 × 10–4 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid als Puffer auf pH 8,5 zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gehalten, neutralisiert und dann extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert; man erhält PS-62. Das Konjugat wird mittels Laserdesorptions-Massenspektralanalyse analysiert, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • (iii) Herstellung von PS-63
  • Der Ester des meta-Addukts (5 mmol) wird in 5 % wässerigem Methanol gelöst, und dieser Lösung wird Natriumhydroxid (5 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, wird der pH durch vorsichtige Zugabe von wässeriger 1 M Salzsäure auf pH 2 gebracht, worauf mit Ethylacetat extrahiert wird. Nach Trocknen (MgSO4) und Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird das Produkt mittels Silicagelblitzchromatographie gereinigt; man erhält die gewünschte freie Säure.
  • Einer Lösung der freien Säure (1,55 × 10–4 mol) in DMF (0,4 ml) wird DIEA (3,1 × 10–4 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–4 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung tropfenweise zu rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 mol [15,5 × 10–4 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, Puffer bei pH 8,5, zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde neutralisiert und dann extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert; man erhält PS-63. Das Konjugat wird mittels Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, analysiert, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • BEISPIEL 6:
  • Herstellung von PS-64
  • i) Herstellung von acyliertem Codein
  • Einer Lösung von Codein (10 mmol) in Methylenchlorid wird Triethylamin (12 mmol) und anschließend Essigsäureanhydrid (12 mmol) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mittels Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt; man erhält das gewünschte acetylierte Produkt.
  • ii) Dimethylierung von Acetylcodein
  • Einer Lösung des acetylierten Produkts (10 mmol) in Methylenchlorid wurde tropfenweise Bortribromid (12 mmol einer 1,0 M Lösung in Methylenchlorid) zugesetzt. Nach Verbrauch des Ausgangsmaterials, wie durch TLC angezeigt, wird wasserfreies Methanol vorsichtig zugesetzt, und die Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, nochmals unter vermindertem Druck eingeengt und dann mittels Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt; man erhält den gewünschten Alkohol.
  • iii) Succinylierung von demethyliertem Codein
  • Einer Lösung von Alkohol (10 mmol) in Methylenchlorid wird Triethylamin (20 mmol) und anschließend Bernsteinsäureanhydrid (20 mmol) zugesetzt. Die resultierende Mischung wird zum Rückfluss erhitzt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, wie durch TLC angezeigt. Danach werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wird mittels Silicagel-Blitzchromatographie gereinigt; man erhält das gewünschte Hemisuccinat.
  • iv) Herstellung von PS-64
  • Einer Lösung des Hemisuccinats (1,55 × 10–4 mol) in DMF (0,4 ml) wird DIEA (3,1 × 10–4 mol) und anschließend HATU (1,86 × 10–4 mol) zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur wird die blassgelbe Lösung tropfenweise rCTB (2 mg, 3,4 × 10–8 mol [15,5 × 10–6 mol Lysine]) in 4 ml 0,1 M Natriumborat, 0,15 M Natriumchlorid, Puffer bei pH 8,5, zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gehalten, neutralisiert und dann extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert; man erhält PS-64. Das Konjugat wird mittels Laserdesorptions-Massenspektralanalyse, analysiert, um die Anzahl von Haptenen zu bestimmen.
  • BEISPIEL 7:
  • Untersuchungen, um die funktionelle Aktivität von CTB zu ermitteln
  • Um die funktionelle Aktivität von CTB allein zu ermitteln, wurden zwei Tests entwickelt. Erstens wurde die Bindung von CTB an Zellen mittels Durchflusszytometrie gemessen. Zellen wurden mit CTB, anschließend mit einem kommerziellen anti-CTB Ziegenantiserum und einem mit Fluorescein-isothiocyanat (FITC) markierten zweiten anti-Ziegenantikörper beimpft (13). Natürliches, an die Zellen gebundenes pentameres CTB verursacht eine dramatische Veränderung in der Intensität der Fluoreszenz. Monomeres CTB war unfähig, Zellen in diesem Versuch zu binden. Zweitens wurde ein ELISA angesetzt, um die Fähigkeit des CTB, an Gangliosid GM1 zu binden, zu messen. ELISA Platten wurden mit GM1-Gangliosid überzogen und mit variierenden Konzentrationen von CTB beimpft. Die Bindung wurde detektiert mittels eines anti-CTB Antikörpers (oder Salzlösung als Kontrolle) und anschließend eines enzymmarkierten zweiten Antikörpers und Entwicklung mit Substrat. Der Versuch ergab eine quantitative und extrem empfindliche Messung der Fähigkeit von pentamerem CTB GM1 Ganglioside zu binden. Diese Versuche wurden eingesetzt, um die funktionelle Aktivität von rekombinanten und haptenierten CTB-Konjugaten vor Experimenten in vivo aufzuzeichnen.
  • BEISPIEL 8:
  • Induktion der Schleimhautantwort
  • Die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) zeigte in vielen Systemen, dass sie die Aktivität von intaktem Choleratoxin beibehält, einschließlich der Induktion einer Antikörperantwort der Schleimhaut. Dieser Carrier sollte daher eine starke anti-Heroin oder anti-Nikotin IgA Antikörperantwort induzieren. Außerdem sollte eine orale Erstimpfung eine starke systemische IgG Antikörperantwort hervorrufen.
  • Eine effektive Methode, eine Grund-Immunantwort im Atmungstrakt hervorzurufen, besteht darin, das Antigen direkt an diese Stellen zu bringen. Das Antigen wird in Salzlösung verabreicht, wobei CTB als sein eigenes Vehikel agiert. Um die Stabilität von CTB bei der Grundimmunisierung durch Verabreichung an eine IgA Oberfläche der Schleimhaut zu bestätigen, werden zuerst Experimente mit dem Carrier allein ausgeführt. Mäuse werden mit 50 μg des CTB oder Heroin-CTB- oder Nikotin-CTB-Konjugats auf drei Wegen erstgeimpft: oral, nasal oder intratracheal. Für die orale Verabreichung an Mäuse werden 250 μg entweder des Heroin-CTB- oder Nikotin-CTB-Konjugats oder CTB allein intragastrisch oder direkt in den Magen mittels einer stumpfen 23G Nadel eingebracht. Vierzehn Tage nach der Grundimpfung werden die Mäuse nach demselben Muster nachgeimpft. Die nasale Verabreichung ist ein einfacher und üblicher Weg für die Impfung. Antigen wird jedem Nasenloch einer leicht betäubten Maus entsprechend einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Maus zugeführt. Vierzehn Tage nach der Grundimpfung werden die Mäuse nach demselben Muster nachgeimpft. Die nasale Verabreichung ist leicht an die Humanapplikation als Nasenspray anzupassen. Die nasale Impfung wurde erfolgreich mit Lebendimpfstoff gegen Influenza angewendet (Walker et al. 1994) Vaccine 12: 387-399).
  • Die intratracheale Immunisierung appliziert das Antigen direkt in dem unteren Atmungstrakt, wodurch die Immunität in den Lungen erhöht wird. Mäuse wurden mit einem Cocktail aus Ketamine und Xylazine anästhesiert. Die Tiere wurden an einem Apparat befestigt, der ihr Maul offen hält und die Luftröhre bloßlegt; die Luftröhre wird mit einer faseroptischen Lichtsonde sichtbar gemacht. Mittels einer stumpfen Nadel Nr. 23 werden 50 μl Lösung in die Lungen eingebracht. Vierzehn Tage nach der Grundimpfung werden die Mäuse nach demselben Muster nachgeimpft.
  • Die Tiere werden durch Ersticken mit CO2 zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Nachimpfung (14, 21 oder 28 Tage) geopfert, und Waschflüssigkeiten aus der Nase und den Lungenbläschen werden gesammelt und untersucht auf für das verabreichte Konjugat spezifische IgA. Nasale Waschflüssigkeit wird erhalten, indem die Nasenhöhle viermal mit insgesamt 1 ml PBS wie beschrieben (Tamura et al. (1989) Vaccine 7: 257-262) gewaschen wird. Waschflüssigkeit aus den Lungenbläschen wird erhalten, indem die Trachea chirurgisch freigelegt, 0,5 ml PBS in die Lungen injiziert und dreimal wie beschrieben (Nedrud et al (1987) J. Immunol. 139: 3484-3492) gespült wird. Nach dem Zentrifugieren, um Zellen zu entfernen, werden die Proben mittels ELISA unter Verwendung eines zweiten IgA spezifischen Antikörpers auf Antigen-spezifische IgA untersucht. Heroin-spezifische oder Nikotin-spezifische IgG wird in den Waschflüssigkeiten aus Nase und Lunge gemessen, da berichtet wurde, dass IgG häufig sowohl nachweisbar als auch wesentlich in der Lunge ist (Cahill et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 107: 211-216)
  • Die orale Immunisationsroute wird auf ihre Fähigkeit, Heroin-spezifische oder Nikotin-spezifische IgA in intestinalen Waschflüssigkeiten zu erzeugen, bewertet und verglichen mit anderen Routen auf ihre Fähigkeit, für Heroin oder Nikotin spezifische Serum Ig zu erzeugen. Die orale Verabreichung wird beim Menschen besonders bevorzugt wegen der Einfachheit der Verabreichung. Die intranasale und intratracheale Verabreichungsroute werden direkt auf ihre Fähigkeit, eine IgA-Antwort sowohl in der Lungen- als auch in der Nasen-Waschflüssigkeit zu induzieren, verglichen. Die Route, von der festgestellt wird, dass sie die potenteste ist, wird bevorzugt und für die restlichen Experimente gewählt. Wenn zwei Routen von vergleichbarer Effektivität sind, wird die nasale Immunisierung wegen ihrer Einfachheit bevorzugt.
  • Für einen maximalen Schutz gegen Heroin oder Nikotin, können systemische IgG-Reaktionen und IgA-Reaktionen in der Schleimhaut maximiert werden. Daher werden sowohl eine systemische Injektion mit dem Heroin-CTB- oder Nikotin-CTB-Konjugat in Alum (oder einem anderen Vehikel) als auch eine Anregung der Schleimhaut mit dem Konjugat bevorzugt, um in beide Abteilungen eine effektive Grundimmunisierung zu erzielen. Drei Gruppen werden verglichen. Erstens werden Mäuse systemisch grundimmunisiert und anschließend nach 14 Tagen über die Schleimhaut angeregt. Zweitens werden die Mäuse über die Schleimhaut grundimmunisiert, und die systemische Anregung folgt nach 14 Tagen. Drittens werden sie gleichzeitig sowohl systemisch als auch über die Schleimhaut grundimmunisiert, gefolgt von einer identische Nachimpfung nach 14 Tagen. Kontrollmäuse werden nur über die Schleimhaut oder nur systemisch grundimmunisiert. In jedem Fall wird die Effektivität der Erregung durch Messung der Antikörpertiter sowohl von IgG als auch IgA gemessen.
  • Als eine Ausgangsmessung der Effektivität von Antiheroin- oder Antinikotin-Antikörpern in der Schleimhaut in vivo wird die Änderung der pharmakokinetischen Reaktionen auf die Droge für über die Schleimhaut verabreichtes Heroin bzw. Nikotin gemessen.
  • BEISPIEL 9:
  • Passiver Transfer von immunem Immunoglobulin in Menschen
  • Ein Pool menschlicher Spender wird mit einem erfindungsgemäßen Kunjugat immunisiert unter Nutzung optimaler Immunisierungsanleitungen wie in den Beispielen beschrieben. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird den Spender venöses Blut abgenommen und die Titer der Anti-Hapten Antikörper werden mittels ELISA untersucht. Hyperimmunes Plasma von mehreren Spender wird gesammelt, und die IgG-Fraktion wird durch kalte Alkohol-Fraktionierung isoliert. Die Antikörper-Zubereitung wird gepuffert, stabilisiert, konserviert und standardisiert, wie für hyperimmune Antikörperpräparate für den menschlichen Gebrauch nötig. Der Antihapten-Antikörper-Spiegel wird durch ELISA oder einen anderen Test auf Antikörper-Basis standardisiert.
  • Eine entsprechende Dosis von gereinigtem Antikörper wird an 20 Patienten intramuskulär oder intravenös mit oder ohne den Hapten-CTB-Impfstoff, aber nicht in dieselbe anatomische Stelle wie der Impfstoff verabreicht. Die entsprechende Dosis wird bestimmt durch Untersuchung der Serumspiegel von Empfängern in einer Population von Versuchspatienten mittels ELISA oder irgendeinem anderen auf Antikörpern basierenden Test 24 Stunden oder zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt nach Injektion der hyperimmunen Antikörperzubereitung und/oder Untersuchung der Effektivität verschiedener Dosen in der Hemmung der Effekte von Heroin oder Nikotin.
  • Das passiv übertragene Immunoglobulin hemmt die Effekte von Heroin oder Nikotin in den Patienten. Der Einsatz von humanen Spender, polyklonalen Antikörpern, und die große Anzahl von Spender im Spenderpool schränkt die Möglichkeit einer Immunantwort der Patienten auf den übertragenen Antikörper ein.
  • BEISPIEL 10:
  • Vorbereitende Reinigung von rCTB
  • rCTB von V. cholerae, geliefert von SBL Vaccin AB, in 0,22 M Phosphat pH 7,3, 0,9% NaCl Puffer wurde diafiltriert in 20 mM Natriumphosphat, pH 6,5. Eine Probe wurde dann gereinigt mittels Kationenaustauscherchromatographie auf Pharmacia SP Sepharose Fast Flow Harz mit Puffer A: 20 mM Natriumphosphat pH 6,5 und Puffer B: 10 mM Natriumphosphat pH 6,5, 1,0 M NaCl als Elutionspuffer. Die gereinigten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, Färbung mit Daichi Silver Stain. Die gereinigte Probe wurde durch ein 0,22 Mikron Filter filtriert und steril bei 4°C gelagert.
  • BEISPIEL 11:
  • Methode A (Analytisch) Proben für die analytische Umkehrphasen HPLC (RP HPLC) wurden nach folgender Methode hergestellt: 100 μl Konjugat CTB-5 200 wurde gefällt, indem 1,0 ml abs. Ethanol zugesetzt und über Nacht auf –80°C gekühlt wurde. Das Konjugat wurde mit 14000 U/min 20 Minuten bei 4°C geschleudert, und dann wurde das Ethanol abdekantiert und das Pellet luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 25 μl 20 % Acetonitril mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) resuspendiert, und die Proteinkonzentration wurde mittels des Pierce Micro BCA Tests gemessen.
  • Das Konjugat wurde mittels einer C18 Umkehrphasensäule (Vydac No. 218TP5215 narrow bore) 2,1 × 150 mm analysiert; Partikelgröße 5 U, Durchflussrate: 200 μl/min; Puffer A: 100 % Wasser 0,1 % TFA; Puffer B 80 % Acetonitril, 0,08 % TFA. Der Gradient startete bei 16 %, stieg über einen Zeitraum von 50 Minuten auf 56 %, stieg auf 80 % bei 60 Minuten und wurde 10 Minuten gehalten.
  • Methode B (Semi-präparativ) Proben für RP HPLC im semi-päparativen Umfang wurden wie folgt hergestellt. Zwei Ampullen CTB-5 200, gefriergetrocknet, wurden in 20 % Acetonitril 0,1 % TFA resuspendiert, sterilfiltriert und quantitativ untersucht mittels des Pierce Micro BCA. Zwei Injektionen von je 1,24 mg wurden vorgenommen an einem semi-präparativen RP HPLC System unter Verwendung einer C18 Säule (Vydac No. 218TP1520) 10 × 50 mm, Partikelgröße 5 U1; Durchflussrate 1,8 ml/min; Puffer A: 0,1 % TFA in Wasser; Puffer B: 0,08 % TFA in 80 % Acetonitril. Ein stufenweiser Gradient wurde angewendet wie folgt: 20 % B während 10 Minuten, 35 % B während 40 Minuten; 55 % B während 5 Minuten; Abschluss mit 5 Minuten Auswaschen bei 100 % B. Die Peaks wurden gesammelt und sofort gefriergetrocknet.

Claims (11)

  1. Ein Hapten-Carrier-Konjugat, umfassend zumindest ein Hapten, abgeleitet von Nikotin, und zumindest einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier und worin das Hapten und der Carrier vernetzt sind durch den CJ11 Zweig, wie in der Anmeldung als YCO(CH2)nCOQ identifiziert, und worin Y ausgewählt ist aus S, O und NH und Q ist der Carrier und n ist eine ganze Zahl von 2 bis 20.
  2. Ein Hapten-Carrier-Konjugat nach Anspruch 1, worin n des CJ11 Zweiges, wie in der Anmeldung als YCO(CH2)nCOQ identifiziert, ist 2 und worin Y ist NH.
  3. Ein Hapten-Carrier-Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin der Carrier ausgewählt ist aus: Proteinen oder Peptiden, bakteriellen Toxinen oder Produkten, Subviralen, Phytagglutininen, Allergenen und Fragmenten von Allerginen, Malaria-Protein-Antigen, künstlichen multi-antigenen Peptiden und deren Modifikationen.
  4. Das Hapten-Carrier-Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mehr als ein Hapten an den Carrier gekuppelt ist.
  5. Verwendung eines Hapten-Carrier-Konjugats, umfassend zumindest ein von Nikotin abgeleitetes Hapten und zumindest einen ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carrier, und worin das Hapten und der Carrier durch den CJ11 Zweig vernetzt sind, wie in der Anmeldung als YCO(CH2)nCOQ identifiziert, und worin Y ausgewählt ist aus S, O und NH und Q ist der Carrier und n ist eine ganze Zahl von 2 bis 20, zur Herstellung eines therapeutischen Präparats für die Behandlung von Drogenmissbrauch beim Menschen.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das pharmazeutische Präparat ein pharmazeutisch zulässiges Vehikel umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin das pharmazeutische Präparat durch die Schleimhaut verabreicht werden kann und Copolymer-Mikrokügelchen, wahlweise aus Poly(lactid-co-glycolid)-Copolymer, umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin das pharmazeutische Präparat topisch angewendet werden kann und welches Präparat wahlweise eine dynamische Viskosität größer als Wasser hat.
  9. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin das pharmazeutische Präparat als injizierbare, sterile Lösung angewendet werden kann.
  10. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin das pharmazeutische Präparat einen Hilfsstoff umfasst.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach Anspruch 1, umfassend das Verbinden des Haptens und des ein T-Zell-Epitop enthaltenden Carriers durch Vernetzen mit einer Verbindung, ausgewählt aus: einem von einer Carbonsäure abgeleiteten aktiven Ester, einem gemischten Anhydrid, einem Acylazid, einem Acylhalogenid, einem Iminoester.
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