DE69636737T2

DE69636737T2 - Neues immunoregulatorisches protein lst-1

Info

Publication number: DE69636737T2
Application number: DE69636737T
Authority: DE
Inventors: Elisabeth Weiss
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-06-20
Filing date: 1996-06-20
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-06-21
Also published as: CA2224777C; AU6358096A; DE69636737D1; ES2276406T3; US6338950B2; JP4347412B2; US20010010926A1; JPH11507833A; CA2224777A1; EP0837936B1; ATE346920T1; WO1997000950A1; EP0837936A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues leukozytenspezifisches und immunregulatorisches Protein (LST-1) und das entsprechende durch rekombinante Verfahren hergestellte Protein sowie Nukleinsäuren, welche für Proteine mit LST-1-Aktivität kodieren, Verwendungs- und Herstellungsverfahren.
Zytokine sind Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 kD, welche den Austausch von autokrinen, parakrinen oder endokrinen Signalen zwischen den Zellbestandteilen von Gewebe oder zwischen verschiedenen Geweben vermitteln. Die bislang identifizierten Zytokine beinhalten Wachstumsfaktoren, Interleukine und Interferone und sie wirken auf Zellen in vielen Systemen des Körpers: dem hämatopoietischen System, dem Immunsystem, dem Nervensystem, dem Skelettsystem, Bindegeweben und vermutlich den meisten anderen Geweben und Organen des Körpers (zur Referenz siehe A. Thompson Hrsg. (1991), The Cytokine Handbook, London, Academic Press und A. Miyajima et al., Annual Reviews Immunol. 10 (1992) 295–331). Beispiele für Zytokine sind EGF, NGF, PDGF, FGF, IL-1 bis IL-7, GM-CSF, G-CSF, MCSF, IFN, TNF-α, TGF-α und -β.
Über 100 Zytokine sind bislang identifiziert worden; es besteht aber ein Bedarf an weiteren neuen Zytokinen, die für potentielle Fortschritte in der Gesundheitsfürsorge wichtig sein können.
Holzinger, I., et al. (Immunobiology 191 (1994) 149) sowie EMBL Primate Databank Accession-Nr. U00921 offenbaren die vollständige DNA-Sequenz von humanem LST-1. Die EMBL Primate Databank Accession-Nr. u67841 offenbart eine DNA-Sequenz, die 99,7% Identität über 2633 bp mit SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Zytokin bereitzustellen, das neue biologische Eigenschaften zeigt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, das neue Protein unter Verwendung von rekombinanten DNA-Molekülen bereitzustellen, die dazu in der Lage sind, das Protein zu exprimieren, sodass das Bindungsprotein leichter erhältlich wird. Diese und andere Ziele der Erfindung sind dadurch gelöst worden, dass ein gereinigtes erfindungsgemäßes Protein bereitgestellt wird, das ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Protein, das zu wenigstens 85% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 ist und Fragmenten davon, wobei das Protein zur Bindung an einen für das Protein spezifischen Antikörper oder an seinen Zelloberflächenrezeptor auf Leukozyten in der Lage ist.
Beschreibung spezieller Ausführungsformen
Die Erfindung umfasst insbesondere neue therapeutische Zusammensetzungen, welche rekombinante Proteine umfassen, die unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen hergestellt sind, die für Proteine mit LST-1-Aktivität kodieren. Die LST-1-cDNA, die für die Herstellung des rekombinanten Proteins verwendet werden kann, wurde ursprünglich aus U-937-Zellen (DSM ACC 5) isoliert, die mit IFN-γ stimuliert wurden. RT-PCR-Klonierung von mRNA dieser Zellen führte zu einem cDNA-Klon, der als pLST-1 bezeichnet wurde, mit einer Länge von 636 bp. Die Analyse der LST-1-cDNA ergibt, dass LST-1 aus sechs Exons besteht. Diese Exons werden bezeichnet als Exon 1A (bp 48–162), 1B (bp 544–652), 2 (bp 1044–1162), 3 (bp 1475–1567), 4 (bp 1775–1797) und 5 (bp-2325–2709). In Exon 5, nach Position 2345, befindet sich eine interne 5'-Donor-Splicestelle. Durch alternatives Splicing können so zwei Isoformen des LST-1-Proteins gebildet werden, die dementsprechend eine Länge von entweder 104 oder 97 Aminosäuren aufweisen (siehe SEQ ID NO: 3 und 4). Der humane pLST-1-cDNA-Klon enthält eine verlängerte 5'-Region, welche für Stopkodons codiert.
Die Erfindung beruht auf einem neuen Zytokin-ähnlichen Protein (im Folgenden als LST-1-Protein oder LST-1 bezeichnet), dessen Produktion in U-937-Zellen durch IFN-γ um einen Faktor von mehr als 100, vorzugsweise 1000 stimuliert wird, das an die Oberfläche von Leukozyten bindet und das

a) durch die in SEQ ID NR: 2 gezeigte DNA-Sequenz für das reife Protein oder durch die in SEQ ID NR: 1 gezeigte genomische Sequenz kodiert ist
b) durch DNA-Sequenzen kodiert ist, die mit den in SEQ ID NR: 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder mit Fragmenten dieser DNA-Sequenzen in der DNA-Region, die für das reife Protein kodiert, hybridisieren oder
c) durch DNA-Sequenzen kodiert ist, die, wenn es keine Degeneration des genetischen Codes gäbe, mit den in a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren würden und für ein Polypeptid mit Aminosäuresequenz kodieren,
d) und der Leserahmen des Proteins durch das an Position 1144 von SEQ ID NR: 1 beginnende ATG festgelegt ist, der sich unmittelbar an den Leserahmen in der Protein-kodierenden Region nach dem ATG anschließt.

Das Protein kann durch seine DNA-Sequenz (vorzugsweise durch seine von SEQ ID NR: 1 abgeleitete cDNA-Sequenz) und durch die davon abgeleitete Aminosäuresequenz definiert werden. Das LST-1-Protein kann in natürlichen allelischen Variationen auftreten, die sich von Individuum zu Individuum unterscheiden. Solche Variationen der Aminosäuren sind üblicherweise Aminosäuresubstitutionen. Sie können jedoch auch Deletionen, Insertionen oder Additionen von Aminosäuren zu der Gesamtsequenz sein. Das erfindungsgemäße LST-1-Protein – welches sowohl im Hinblick auf Größe als auch Art von der Zelle und der Art der Zelle, in der es exprimiert wird, abhängt – kann in glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form vorliegen. Die LST-1-Proteine gemäß SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 sind bevorzugt.
LST-1-mRNA wird konstitutiv in T-Zellen, Makrophagen, U-937 und in geringen Mengen in humaner Tonsilla, Lunge und Leber exprimiert, was auf die vorhandenen Lymphozyten und Makrophagen zurückzuführen sein kann, in diesen Geweben zeigt das Protein eine immunregulatorische Wirkung. Die Transkription kann durch IFN-γ in U-937-Zellen stark erhöht werden. Bei Stimulation der Jurkat-T-Zelllinie (ATCC TIB 152) mit TPA (12-o-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) wurde nur eine kurze Induktion von LST-1-mRNA beobachtet. Eine Erhöhung der mRNA-Expression beginnt nach vier Stunden mit einem Peak nach 8 Stunden Stimulation und einem weiteren Abfall nach 24 Stunden Simulation.
"Immunregulatorische Wirkung" bedeutet, dass das Protein direkt oder indirekt die Zusammenwirkung von T-Zellen mit Makrophagen moduliert.
Die Bindung an die Oberfläche von Leukozyten wird vorzugsweise in vitro beurteilt. Solche Verfahren sind im Fachbereich bekannt.
Die Bezeichnungen "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" bedeutet, dass zwei Nukleinsäurefragmente in der Lage sind, miteinander zu hybridisieren unter Standardbedingungen, die in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47–9.62 und 11.45–11.61 beschrieben sind.
Stringente Bedingungen beziehen sich wie hierin verwendet insbesondere auf eine Hybridisierung in 1 mol/l NaCl, 1% SDS und 10% Dextransulfat. Anschließend erfolgt zweimaliges Waschen des Filters bei Raumtemperatur für 5 Minuten in 2 × SSC und ein letztes Waschen für 30 Minuten. Dieses letzte Waschen kann mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS, weiter bevorzugt mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS und am meisten bevorzugt mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS erfolgen, wobei das letzte Waschen bei 65°C erfolgt. Ein Fachmann wird erkennen, dass andere Bedingungen denselben Grad an Stringenz ermöglichen können und von der Formulierung "unter stringenten Bedingungen" umfasst sind und hierin eingeschlossen sind.
LST-1 ist ein Protein, das in seiner glykosylierten oder unglykosylierten Form aktiv ist. Die unglykosylierte Form kann durch rekombinante Verfahren in prokaryotischen Zellen hergestellt werden.
"Proteine mit LST-1-Aktivität" bedeutet auch Proteine mit kleineren Aminosäurevariationen, aber mit im Wesentlichen derselben LST-1-Aktivität. Im Wesentlichen dieselbe bedeutet, dass die Aktivitäten dieselben biologischen Eigenschaften und vorzugsweise wenigstens 85% Homologie der Aminosäuresequenz aufweisen. Weiter bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen zu wenigstens 90% identisch. LST-1 kann aus U-937-Zellen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen LST-1 aufgereinigt werden. Es ist auch bevorzugt, andere bekannte Proteinaufreinigungstechniken zu verwenden, einschließlich Immunpräzipitation, Gelfiltration, Ionenaustausch, Chromatographie, Chromatofokussierung, isoelektrisches Fokussieren, selektive Präzipitation, Elektrophorese und dergleichen. Die während der Reinigungsvorgänge isolierte Fraktion kann auf das Vorhandensein von LST-1-Aktivität analysiert werden, indem LST-1-spezifische Antikörper verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Protein kann auch auf rekombinante Weise hergestellt werden. Nicht-glykosyliertes LST-1-Protein wird erhalten, wenn es rekombinant in Prokaryoten hergestellt wird. Mit der Hilfe der durch die Erfindung bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen ist es möglich, in Genomen beliebiger gewünschter Zellen (z.B. abgesehen von humanen Zellen auch in Zellen anderer Säuger) nach dem LST-1-Gen oder dessen Varianten zu suchen, diese zu identifizieren und das gewünschte Gen zu isolieren, welches für das LST-1-Protein codiert. Solche Verfahren und geeignete Hybridisierungsbedingungen sind einem Fachmann bekannt und sie sind beispielsweise beschrieben von Sambrook, J. et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, und von B. D. Hames, S. G. Higgins, Nucleic acid hybridisation – a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England. Im vorliegenden Fall werden die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Standardprotokolle für die Experimente verwendet.
Die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie ermöglicht die Produktion zahlreicher LST-1-Proteinderivate. Solche Derivate können beispielsweise in einzelnen oder mehreren Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition modifiziert sein. Die Derivatisierung kann beispielsweise mittels seitengerichteter Mutagenese durchgeführt werden. Solche Variationen können leicht von einem Fachmann durchgeführt werden (J. Sambrook, B. D. Hames, oben zitiert). Es muss bloß sichergestellt werden, dass die charakteristischen Eigenschaften des LST-1-Proteins (Hemmung der zuvor genannten Zelllinien) konserviert sind. Die Erfindung betrifft daher außerdem ein LST-1-Protein, welches ein Produkt einer prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer exogenen DNA ist.
Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül zur Verwendung für die Gewährleistung der Expression eines LST-1-Proteins in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle und ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) die in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder die komplementären Sequenzen,
b) Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Sequenzen aus a) hybridisieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die, wenn es keine Degeneration des genetischen Codes gäbe, mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden,
d) und der Leserahmen des Proteins ist durch das an Position 1144 von SEQ ID NO: 1 beginnende ATG festgelegt, wobei keine Verschiebung des Leserahmens in der für das Protein codierenden Region nach diesem ATG erfolgt.

Mit Hilfe solcher Nukleinsäuren, die für ein LST-1-Protein kodieren, kann das erfindungsgemäße Protein auf eine reproduzierbare Art und Weise und in großen Mengen erhalten werden. Für die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen, wie beispielsweise prokaryotischen Wirtszellen oder eukaryotischen Wirtszellen, wird die Nukleinsäure in geeignete Expressionsvektoren eingefügt, gemäß Verfahren, mit denen ein Fachmann vertraut ist. Ein solcher Expressionsvektor enthält vorzugsweise einen regulierbaren/induzierbaren Promotor. Diese rekombinanten Vektoren werden dann für die Expression in geeignete Wirtszellen eingebracht, wie zum Beispiel E. coli als prokaryotische Wirtszelle oder Saccharomyces cerevisiae, Terato carcinoma-Zelllinie PA-1 sc 9117 (Büttner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573–3583), Insektenzellen, CHO- oder COS-Zellen als eukaryotische Wirtszellen, und die transformierten oder transduzierten Wirtszellen werden unter solchen Bedingungen kultiviert, die eine Expression des heterologen Gens ermöglichen. Die Isolierung des Proteins kann gemäß bekannten Verfahren aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturüberstand der Wirtszelle durchgeführt werden. Solche Verfahren sind beispielsweise von Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New York, beschrieben. Es kann auch eine In vitro-Reaktivierung des Proteins erforderlich sein.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen eines LST-1-Proteins durch Isolierung aus dem Kulturüberstand der U-937-Zelllinie mittels einer gelchromatographischen Trennung und Aufreinigung einer Fraktion.
Die Detektion von transformierten oder transduzierten Wirtszellen, welche rekombinant das LST-1-Protein produzieren und die Reinigung des Proteins werden vorzugsweise mittels Antikörpern durchgeführt, welche an dieses Protein binden. Solche Antikörper können auf einfache Art und Weise entsprechend bekannter Verfahren erhalten werden, indem das erfindungsgemäße Protein als ein Antigen oder ein Immunogen verwendet wird.
Die Erfindung betrifft daher außerdem die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins mit LST-1-Aktivität zur Herstellung von Antikörpern, welche an dieses Protein binden.
Anti-LST-1-Antikörper werden durch Immunisierung und geeignete Wirbeltier-Wirte mit gereinigten LST-1 oder Polypeptid-Derivaten von LST-1, vorzugsweise mit einem Hilfsstoff hergestellt. Diese Techniken sind in der Literatur gut bekannt und beispielsweise beschrieben von Harlow und Lane, Hrsg., Antibodies: A laboratory manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratories Press.
Zu diesem Zweck werden Tiere, die üblicherweise für diesen Zweck verwendet werden, wie beispielsweise Schafe, Kaninchen oder Mäuse, mit dem erfindungsgemäßen Protein immunisiert und anschließend wird das Antiserum aus den immunisierten Tieren gemäß bekannter Verfahren isoliert, oder Milzzellen der immunisierten Tiere werden mit immortalisierten Zellen, wie beispielsweise Myelomzellen, gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) 495–497) fusioniert. Solche Zellen, die einen monoklonalen Antikörper gegen das LST-1-Protein produzieren, werden aus den auf diese Weise erhaltenen Hybridomzellen ausgewählt und kloniert. Die auf diese Weise erhaltenen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper können an ein Trägermaterial, wie beispielsweise Cellulose, gebunden werden, für eine immunabsorptive Reinigung des Melanom-hemmenden Proteins. Ferner können derartige Antikörper für den Nachweis des LST-1-Proteins in Proben, wie beispielsweise Gewebeschnitten oder Körperflüssigkeiten, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft daher außerdem Antikörper gegen das LST-1-Protein, die durch Immunisierung eines Tiers mit einem LST-1-Protein und Isolierung der Antikörper aus dem Serum oder aus Milzzellen der immunisierten Tiere erhältlich sind.
Es hat sich außerdem herausgestellt, dass das LST-1-Protein eine immunregulatorische Aktivität aufweist.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins für die Herstellung eines therapeutischen Mittels, das in der Tumortherapie oder als immunregulatorisches Mittel verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäße Protein wird, falls gewünscht, zusammen mit den üblicherweise verwendeten Hilfsmitteln, Füllstoffen und/oder Additiven zu einer pharmazeutischen Formulierung für diese therapeutischen Anwendungen verarbeitet.
Die Erfindung betrifft daher außerdem eine therapeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes LST-1-Protein enthält und, falls gewünscht, zusammen mit den Hilfsmitteln, Füllstoffen und/oder Additiven, die üblicherweise verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Sequenzen des LST-1-Gens, vorzugsweise Nukleinsäuremolekülen, welche für ein Protein mit LST-1-Aktivität kodieren, oder aktivierenden Polynukleotiden von der 5'-untranslatierten Region, in der Gentherapie, und insbesondere für die Herstellung von Medikamenten für die Gentherapie.
Gentherapie von Körperzellen kann bewerkstelligt werden, indem z.B. retrovirale Vektoren oder andere virale Vektoren verwendet werden, oder durch nicht-viralen Gentransfer (zur Klarheit siehe T. Friedmann, Science 244 (1989) 1275; Morgan 1993, RAC DATA MANAGEMENT REPORT, Juni 1993).
Für die Gentherapie geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise Retroviren (Mulligan, R. C. (1991) in Nobel Symposium 8: Ethiology of human disease at the DNA level (Lindsten, J. und Pattersun Herausgeber) 143–189, Raven Press), Adeno-assoziierte Viren (McLughlin, J. Virol. 62 (1988), 1963), Vakzine Viren (Moss et al., Ann. Rev. Immunol. 5 (1987) 305), Rinderpapillomavirus (Rasmussen et al., Methods Enzymol. 139 (1987) 642) oder Viren aus der Gruppe der Herpesviren, wie beispielsweise Epstein-Barr-Virus (Margolskee et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 2937) oder Herpes Simplex-Virus.
Es sind auch nicht-virale Zufuhrsysteme bekannt. Dafür wird üblicherweise eine "nackte" Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, verwendet oder eine Nukleinsäure zusammen mit einem Hilfsstoff, wie beispielsweise Transferreagenzien (Liposomen, Dendromere, Polylysin-Transferrin-Konjugate (Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 7413).
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Gentherapie beruht auf homologer Rekombination. Dabei kann entweder das Gen, welches für das LST-1-Protein codiert, in ein oder mehreren Kopien in das Genom von Körperzellen eingefügt werden und/oder das endogen in den Zellen vorhandene LST-1-Gen kann moduliert, vorzugsweise aktiviert werden.
Verfahren zur homologen Rekombination sind z.B. beschrieben in Kucherlapati, Proc. in Nucl. Acids Res. und Mol. Biol. 36 (1989) 301; Thomas et al., Cell 44 (1986) 419–428; Thomas and Capecchi, Cell 51 (1987) 503–512; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8583–8587 und Doetschman et al., Nature 330 (1987) 576–578. In diesen Verfahren ist ein Teil der DNA, die an einer speziellen Stelle in das Genom integriert werden soll (Genfragment von LST-1) an eine zielsteuernde DNA gebunden. Die zielsteuernde DNA ist eine DNA, die komplementär (homolog) zu einer Region (vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe des LST-1-Gens) der genomischen DNA ist. Wenn zwei homologe Abschnitte einer einzelsträngigen DNA (zum Beispiel die zielsteuernde DNA und die genomische DNA) dicht beieinander sind, so werden sie hybridisieren und eine doppelsträngige Helix bilden. Dann können das LST-1-Genfragment und die zielsteuernde DNA in das Genom über das Auftreten von Rekombination eingefügt werden. Diese homologe Rekombination kann sowohl in vitro als auch in vivo (in dem Patienten) durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird eine DNA, die für ein Protein mit LST-1-Aktivität codiert, ein Fragment, welches die LST-1-Expression hemmt (Knock-Out-Sequenz) oder ein Fragment, das dazu in der Lage ist, nach Integration des Genoms einer Zelle, die Expression eines Proteins mit LST-1-Aktivität in dieser Zelle zu aktivieren, verwendet. Ein solches Fragment kann beispielsweise eine Promotor- und/oder Enhancerregion sein, die heterolog zu der korrespondierenden LST1-Region ist oder die nach Integration in das LST-1-Gen das eigentlich stille oder in geringem Maß exprimierte LST-1-Gen transkriptorisch und/oder translatorisch aktiviert.
Somit werden mittels dieser DNA ein oder mehrere LST-1-Gene neu in die Zielzelle eingefügt oder das im Wesentlichen transkriptorisch stille Gen in dem Genom einer Säugerzelle wird auf solche Weise aktiviert, dass die Säugerzelle in die Lage versetzt wird, endogenes LST-1-Protein zu produzieren. Gemäß der Erfindung wird ein DNA-Konstrukt durch homologe Rekombination in das Genom eingefügt, wobei das DNA-Konstrukt folgendes umfasst: Ein regulatorisches DNA-Element, das in der Lage ist, die Expression dieses Gens zu stimulieren, wenn es operativ damit verknüpft ist; und ein oder mehrere DNA-Zielsegmente, die homolog zu einer Region in diesem Genom sind, wobei die Region sich innerhalb oder proximal zu diesem Gen befindet. Dieses Konstrukt wird so in das Genom der Säugerzelle eingefügt, dass das regulatorische Segment operativ mit dem Gen verknüpft ist, welches für das Protein mit LST-1-Aktivität codiert. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt weiterhin amplifizierende Sequenzen, insbesondere dann, wenn Gene, welche für Proteine mit LST-1-Aktivität kodieren, in die Zelle eingefügt werden.
Für die Insertion von LST-1-Genen in die Zielzellen umfasst das Konstrukt ein regulatorisches Element, ein oder mehrere LST-1-Gene und ein oder mehrere Zielsegmente. Die Zielsegmente werden so ausgewählt, dass sie mit einer entsprechenden Region in dem Genom hybridisieren, wobei nach homologer Rekombination die eingefügten exogenen LST-1-Gene exprimiert werden.
Es sind zahlreiche Verfahren bekannt, durch die eine homologe Rekombination ausgelöst werden kann. Vorzugsweise erfolgt die homologe Rekombination während der DNA-Replikation oder Mitose der Zellen. Eine derartige DNA kann für die Herstellung eines Mittels zur therapeutischen Behandlung von Tumoren verwendet werden oder für die Herstellung eines homologen oder heterologen LST-1-Proteins in einem Wirtsorganismus.
Es ist möglich, auf Grundlage der Nukleinsäuresequenzen des durch die Erfindung bereitgestellten LST-1-Proteins einen Test zur Verfügung zu stellen, der verwendet werden kann, um Nukleinsäuren nachzuweisen, welche für LST-1-Proteine kodieren. Ein solcher Test kann beispielsweise in Zellen oder Zelllysaten und mittels Nukleinsäurediagnostik durchgeführt werden. In diesem Fall wird die zu untersuchende Probe mit einer Sonde in Kontakt gebracht, die mit der für das LST-1-Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Eine Hybridisierung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren aus der Probe zeigt das Vorhandensein von exprimierten LST-1-Proteinen an. Solche Verfahren sind einem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in WO 89/06698, EP-A 0 200 362, USP 2915082, EP-A 0 063 879, EP-A 0 173 251, EP-A 0 128 018. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure der Probe, die für ein LST-1-Protein codiert, vor dem Test amplifiziert, z.B. durch die gut bekannte PCR-Technik. Auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik wird üblicherweise eine derivatisierte (markierte) Nukleinsäuresonde eingesetzt. Diese Sonde wird mit einer trägergebundenen denaturierten DNA oder RNA aus der Probe in Kontakt gebracht und in diesem Verfahren werden die Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert und andere Pufferbedingungen so gewählt, dass die markierte DNA oder RNA – in Abhängigkeit von der Menge der Nukleinsäureprobe und der resultierenden Schmelztemperatur des erwarteten Hybrids – an homologe DNA oder RNA binden kann (Hybridisierung siehe auch Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503–517; Wahl, G. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 3683–3687). Geeignete Träger sind Membranen oder Trägermaterialien auf Basis von Nitrocellulose (z.B. Schleicher und Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), verstärkte oder gebundene Nitrocellulose in Pulverform oder Nylonmembranen, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen (z.B. Nitrogruppen) derivatisiert sind (z.B. Schleicher und Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M.; Pall Biodyne).
Die hybridisierte DNA oder RNA wird anschließend detektiert, indem der Träger nach sorgfältigem Waschen und Sättigung zur Verhinderung von unspezifischer Bindung mit einem Antikörper oder Antikörperfragment inkubiert wird. Der Antikörper oder das Antikörperfragment ist gegen die während der Derivatisierung in die Nukleinsäuresonde eingefügte Substanz gerichtet. Der Antikörper ist selbst markiert. Es ist jedoch auch möglich, eine direkt markierte DNA zu verwenden. Nach Inkubation mit den Antikörpern wird sie erneut gewaschen, um nur spezifisch gebundene Antikörperkonjugate zu detektieren. Die Bestimmung wird anschließend über die Markierung des Antikörpers oder Antikörperfragments nach gut bekannten Verfahren durchgeführt.
Die Detektion der LST-1-Expression kann beispielsweise durchgeführt werden durch:

– In situ-Hybridisierung mit immobilisierten Gesamtzellen unter Verwendung von immobilisierten Gewebeabstrichen und isolierten Metaphasechromosomen,
– Kolonienhybridisierung (Zellen) und Plaquehybridisierung (Phagen und Viren),
– Northern-Hybridisierung (RNA-Detektion),
– Serumanalyse (z.B. Zelltyp-Analyse von Zellen in Serum durch Slot-Blot-Analyse),
– Nachampflikation (z.B. PCR-Technik).

Die Erfindung umfasst daher ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die für ein LST-1-Protein kodieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die zu untersuchende Probe mit einer Nukleinsäuresonde inkubiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend

a) die in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder eine zu diesen komplementäre Sequenz,
b) Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der Sequenzen aus a) hybridisieren,

Somit ist LST-1 ein wertvoller prognostischer Marker in der Tumordiagnostik (Metastasierung, Fortschreiten) und ein Aktivitätsmarker für die Zellproliferation, insbesondere für T-Zell-leukämische Zellen.
Die humane histiozytische Lymphomzelllinie U-937 wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 5 hinterlegt und war seit dem 3. April 1990 frei zugänglich in der öffentlichen Sammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig enthalten.
Plasmid pLST-1, welches das LST-1-Gen enthält, wurde von Boehringer Mannheim GmbH bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, am 24. Mai 1995 hinterlegt und die Nummer DSM 10011 wurde zugeteilt.

Die Erfindung wird durch das Sequenzprotokoll in Verbindung mit den nachstehenden Beispielen ausführlicher erläutert. Hier bedeutet

SEQ ID NO: 1	die Nukleotidsequenz der genomischen LST-1 Region. Eine polymorphe Pvu II-Restriktionsstelle befindet sich an Position 2841. Die TATA-Box, die IFN-γ-aktivierte Stelle (FcγR1) und das Interferon-stimulierte Gen Faktor-2-Responsivelement (ISGF-2) beginnen an den Positionen 279, 1509 bzw. 1814. Die DNA-Sequenz wurde bei der GenBank-Datenbank (Accession-Nummer 000921) hinterlegt.
SEQ ID NO: 2	bezeichnet Protein und cDNA von LST-1.
SEQ ID NO: 3	bezeichnet die LST-1-Proteinsequenz (104 Aminosäuren).
SEQ ID NR 4	bezeichnet die LST-1-Proteinsequenz (Isoform 97 Aminosäuren).
Abkürzungen:	BAT, HLA-B-assoziiertes Transkript; MHC, Haupthistokompatibilitätskomplex; LST-1, Leukozyten-spezifisches Transkript-1; pLst1, LST-1-cDNA-Klon; MER, mittlere Reiterationsfrequenzwiederholung; TNF-α, Tumornekrosefaktor-α; TNFA, Gen kodierend für TNF-α; TNFB, Gen kodierend für Tumornekrosefaktor-β; LTB, für Lymphotoxin-β codierendes Gen.

Beispiel 1
Isolierung der genomischen LST-1-Region
Die humane B-Zelllinie CAH wurde von einem homozygoten Individuum gebildet, mit der Bezeichnung HLA-A3, -Bw47, -Cw6 und -DR7. Genomische DNA wurde verwendet, um, wie zuvor beschrieben, die Cosmidbibliothek cah in dem Vektor pTCF zu erzeugen (E. H. Weiss et al., Immunobiology 170 (1985) 367–380). Verschiedene Cosmide wurden durch Hybridisierung an eine TNFA-Sonde isoliert. Ein von dem Cosmid cah5 abgeleiteter Subklon, welcher die Region stromaufwärts des LTB-Gens enthält, wurde durch HindIII-Endonukleaseverdau von cah5 erhalten. Die Religierung des Verdaus führte zu einem trunkierten Klon (cah5dH3) mit einer Länge von 18 kb. Fünf benachbarte PstI-Fragmente mit 1,5 kb, 0,8 kb, 3,1 kb, 0,4 kb und 0,7 kb, bezeichnet als Pst6, Pst4 und Pst11, Pst400 bzw. Pst700, wurden isoliert und in den Vektor pUC19 subcloniert.
Beispiel 2
Bestimmung der Nukleotidsequenz
Die Subklone Pst4, Pst6 und Pst11 und zwei weitere 5'-PstI-Fragmente mit 400 bzw. 700 bp (Pst400 und Pst700) wurden in beiden Richtungen mit dem Didesoxynukleotidkettenterminationsverfahren sequenziert, wobei entweder Sequenase 2.0 (USB, Braunschweig, Deutschland) oder T7-Polymerase (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) verwendet wurde. Die genomische Organisierung dieser Fragmente wurde durch direkte Sequenzierung von cah5dH3 über die PstI-Restriktionsstellen unter Verwendung von Oligonukleotiden bestimmt. Dies bestätigte die Reihenfolge und schloss die Möglichkeit aus, dass sich irgendein kleines Fragment zwischen den Restriktionsfragmenten Pst6, Pst4, Pst11, Pst400 und Pst700 befindet.
Beispiel 3
Zellkultur und Stimulierungsexperimente
Nicht-adhärente humane Jurkat-T-Zellen, die humane histiozytische Zelllinie U-937 und die humane monozytische Zelllinie MonoMac6 wurden in RPMI 1640-Medium gezüchtet. Die adherenten A431 und HeLa-Epithelkarzinomlinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet. Für beide Medien wurde 10% Wärme-inaktiviertes fötales Kälberserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin (jeweils bezogen von Gibco-BRL, Berlin, Deutschland) als Ergänzung verwendet. Alle Zellen wurden bei 5 CO₂ und 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre kultiviert. Die Stimulierung der Jurkat-Zellen wurde mit 50 ng/ml 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) und mit 5 μg/ml Phytohemagglutinin (PHA) (Sigma) durchgeführt. Die humane monozytische Zelllinie MonoMac6 wurde mit 1 mg/ml Lipopolysacchariden (hergestellt aus Salmonella minnesota; Sigma) für 4 Stunden stimuliert. Die histiozytische Zelllinie U-937 wurde für 48 Stunden mit 200 U/ml Interferon-γ stimuliert.
Beispiel 4
Klonierung, Charakterisierung und Expression der LST-1-cDNA
Reverse Transkription von RNA und anschließende Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) der aus mit Interferon-γ stimulierten U-937-Zellen isolierten mRNA führte zu einem cDNA-Klon mit der Bezeichnung pLst1 mit einer Länge von 636 bp. Dies ist eine gute Übereinstimmung mit der Größe der durch Northern Blot detektierten mRNA von etwa 800 bp Länge, angesichts einer erwarteten Länge des Poly(A)-Schwanzes von etwa 200 bp. Die cDNA-Sequenz von pLst1 war identisch zu den codierenden Regionen der genomischen Sequenz, die aus einer anderen humanen Zelllinie kloniert wurde. Die Sequenzanalyse ergab drei Regionen, die zwischen dem humanen LST-1 und dem Maus-B144-Transkript gut konserviert sind, und sie konnten dem Exon 2–4 des humanen Gens zugeschrieben werden.
Ebenso wie die anderen Gene in der TNF-Region umfasst LST-1 sechs Exons (1A, 1B, 2, 3, 4, 5) und fünf Introns. Seine Transkriptionsrichtung ist die selbe wie für TNFA und TNFB, aber entgegengesetzt zu dem benachbarten LTB-Gen. Dieses Ergebnis stimmt nicht überein mit der Richtung des Maus-B144-Gens, wie angegeben in der von J. M. Wroblewski et al. Veröffentlichten Organisation der H-2D^b-Region, Immunogenetics 32 (1990) 200–204. Der humane pLst1-cDNA-Klon enthält eine verlängerte 5'-Region, die für Stopcodons codiert in allen drei Leserahmen und kann daher als gesamte Länge angesehen werden. Die LST-1-cDNA codiert möglicherweise ein Transmembranprotein.
Die LST-1-cDNA kann in Prokaryoten, vorzugsweise in E. coli, unter Verwendung eines geeigneten Vektors (z.B. pBR 322) exprimiert werden. Das Protein kann entweder nach Sekretion oder aus zytoplasmischen akkumulierten Inclusion Bodies und anschließender Naturierung isoliert werden.
Beispiel 5
Expression von LST-1
LST-1-mRNA wird konstitutiv exprimiert in T-Zellen, Makrophagen, U-937 und in geringen Mengen in humanen Tonsillen, Lunge und Leber, was auf die in diesen Geweben vorhandenen Lymphozyten und Makrophagen zurückzuführen sein kann. In Epithelzelllinien, wie HeLa- und A431-Zellen, waren keine LST-1-Transkripte nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Dieses Expressionsmuster führte uns dazu, das entsprechende Gen Leukozyten-spezifisches Transkript-1 (LST-1) zu nennen. Transkriptionsmengen können in U-937-Zellen durch Stimulation mit Interferon-γ stark erhöht werden, aber nicht durch Lipopolysaccharide in der Makrophagenzelllinie MonoMac6. Die Stimulation der Jurkat-T-Zelllinie mit TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) induzierte die transiente Expression von LST-1-mRNA oberhalb des konstitutiven Wertes. Nach der Induktion erhöhte sich die mRNA-Expressionsmenge nach 4 Stunden mit einem Peak bei 8 Stunden und verringerte sich 24 Stunden nach Stimulation.
Verzeichnis der Literaturstellen

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Wroblewski, J. M., et al., Immunogenetics 32 (1990) 200–204

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immunregulatorisches Protein, das eine Größe von etwa 97–104 Aminosäuren aufweist, dessen Produktion in U-937 Zellen durch INF-γ um einen Faktor von mehr als 100 stimuliert wird, das an die Oberfläche von Leukozyten bindet und das a) durch die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte DNA-Sequenz für das reife Protein oder durch die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte genomische Sequenz codiert ist, oder b) durch DNA-Sequenzen codiert ist, die mit den in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder mit Fragmenten dieser DNA-Sequenzen in der DNA-Region, die für das reife Protein codiert, hybridisieren.
Protein nach Anspruch 1, welches aus dem Überstand der Zellkultur der Zelllinie U-937 nach Stimulation der Zelllinie durch INF-γ und Reinigung mittels Gelchromatographie und Reversphasen-HPLC erhältlich ist.
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei a) es ein Produkt einer prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer exogenen DNA ist, b) es codiert ist durch i) die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte DNA-Sequenz für das reife Protein oder für das Protein mit einer N-terminalen pre-Sequenz oder durch die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte genomische Sequenz, ii) die DNA-Sequenzen, die mit den in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen in der DNA-Region, die für das reife Protein codiert, hybridisieren, oder iii) die DNA-Sequenzen, die, wenn es keine Degeneration des genetischen Codes gäbe, mit den in i) bis ii) definierten Sequenzen hybridisieren würden, und die für ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz codieren, c) und an die Oberfläche von Leukozyten bindet, d) und der Leserahmen des Proteins durch das an Position 1144 von SEQ ID Nr. 1 beginnende ATG festgelegt ist.
Protein nach Anspruch 1 bis 3, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 oder 4.
cDNA-Molekül, zur Verwendung für die Gewährleistung der Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, wobei die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: a) die in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenzen oder die komplementären DNA-Sequenzen, b) Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der Sequenzen aus a) hybridisieren, c) Nukleinsäuresequenzen, die, wenn es keine Degeneration des genetischen Codes gäbe, mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden, und wobei der Leserahmen des Proteins durch das an Position 1144 von SEQ ID Nr. 1 beginnende ATG festgelegt ist.
Plasmid DSM 10011.
DNA-Molekül mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz.
Rekombinanter Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für ein Protein nach Anspruch 1 bis 4 codiert, und der die für das Protein codierende Nukleinsäure in einem transformierten Mikroorganismus oder einer transformierten eukaryotischen Zelle exprimiert.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einer cDNA transfiziert ist, die für ein Protein nach Anspruch 1 bis 4 codiert und die das Protein produzieren kann.
Wirtszelle nach Anspruch 9, welche E. coli oder eine Säuger-Zelllinie ist.
Verwendung eines cDNA-Moleküls, das für ein Protein nach Anspruch 1 bis 4 codiert, zur Transfektion einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle.
Verfahren zum Erhalten eines Proteins nach Anspruch 1, das an die Oberfläche von Leukozyten bindet, durch Isolieren aus dem Kulturüberstand der Zelllinie U-937, die mit INF-γ stimuliert ist, gelchromatografische Trennung und Reinigung einer Fraktion des Überstands, die einem Protein mit etwa 97 bis 104 Aminosäuren entspricht.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Proteins, das an die Oberfläche von Leukozyten bindet, durch Exprimieren einer cDNA nach einem der Ansprüche 5 oder 7 in einer geeigneten Wirtszelle und Isolieren des Proteins aus der Wirtszelle oder dem Kulturüberstand der Wirtszelle.
Verwendung eines Proteins, das an die Oberfläche von Leukozyten bindet, nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Antigen oder Immunogen für die Herstellung von Antikörpern, die an dieses Protein binden.
Antikörper gegen ein Protein nach Anspruch 1 bis 4, welcher erhältlich ist, durch Immunisieren eines Tiers mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und Isolieren der Antikörper aus dem Serum oder aus den Milzzellen der immunisierten Tiere.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die für ein Protein nach Anspruch 1 bis 4 codieren, wobei die zu untersuchende Probe mit einer Nukleinsäuresonde inkubiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: a) DNA mit in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigten Sequenzen oder deren komplementären Sequenzen, b) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Sequenzen aus a) hybridisieren, die Nukleinsäuresonde mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert wird und die Hybridisierung der Nukleinsäure der Probe und der Nukleinsäuresonde nachgewiesen wird, gegebenenfalls über einen weiteren Bindungspartner.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die nachzuweisende Nukleinsäure vor dem Nachweis amplifiziert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 bis 4, umfassend die Schritte: Exprimieren des endogenen Gens für dieses Protein in einer Säugerzelle durch Einbringen eines DNA-Konstrukts in das Genom der Zelle durch homologe Rekombination, wobei das DNA-Konstrukt ein regulatorisches DNA-Element umfasst, das in der Lage ist, die Expression des Gens zu stimulieren, wenn es operativ damit verknüpft ist, und das Konstrukt ferner ein oder mehrere DNA-Zielsegmente umfasst, die homolog zu einer Region in diesem Genom sind, wobei die Region in dem Gen oder in dessen Nähe liegt, Kultivieren der Zellen und Gewinnen des Proteins aus den Zellen oder dem Überstand der Zellkultur.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 bis 4, umfassend die Schritte: Exprimieren wenigstens eines exogenen Gens, das für dieses Protein codiert, in einer Säugerzelle durch Einbringen eines DNA-Konstrukts in das Genom der Zelle durch homologe Rekombination, wobei das DNA-Konstrukt ein regulatorisches DNA-Element umfasst, das in der Lage ist, die Expression des Gens zu stimulieren, wenn es operativ damit verknüpft ist, ein DNA-Element, das für das Protein codiert und ferner ein oder mehrere DNA-Zielsegmente, die homolog zu einer Region in diesem Genom sind, umfasst, Kultivieren der Zellen und Gewinnen des Proteins LST-1 aus den Zellen oder dem Überstand der Zellkultur.
Verwendung eines DNA-Konstrukts, das durch homologe Rekombination in das Genom von Säugerzellen eingebracht werden kann, wobei das DNA-Konstrukt umfasst: • ein regulatorisches DNA-Element, das in der Lage ist, die Expression eines Gens zu modulieren, wenn es operativ damit verknüpft ist, wobei das Gen für ein Protein nach Anspruch 1 bis 4 codiert, • und ein oder mehrere DNA-Zielsegmente, die homolog zu einer Region in diesem Genom sind, wobei die Region in dem Gen oder in dessen Nähe liegt, und wobei das Konstrukt in das Genom der Säugerzelle auf eine solche Weise eingebracht werden kann, dass das regulatorische Element mit dem Gen, das für das Protein codiert, operativ verknüpft ist, zur Herstellung eines Tumortherapeutikums oder eines immunregulatorischen Mittels.