DE69624121T2 - Membranen possierende second messengers - Google Patents

Membranen possierende second messengers

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Description

    1. Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf biologisch wichtige Phosphate wie second messengers. Spezieller bezieht sie sich auf das Modifizieren von second messengers zur Bildung von Derivaten, die in die Zelle eingeführt werden können, ohne dass die Zellmembran zerstört wird. In der Zelle wird das Derivat zurück in den biologisch aktiven second messenger umgewandelt.
    • 2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
  • Die hierin zitierten Veröffentlichungen und anderen Zitatstellen beschreiben den technischen Hintergrund der Erfindung und geben zusätzliche Einzelheiten hinsichtlich ihrer Ausführung. Zur Vereinfachung sind die Zitate mit Bezugszahlen versehen und in der beigefügten Bibliographie zusammengestellt.
  • Second messengers sind Ionen oder kleine Moleküle, die Information von der Zellmembran zu Zielen innerhalb der Zelle befördern. Sie spielen eine Hauptrolle bei der biologischen Übertragung und Verstärkung von Signalen (1). Ein gemeinsames Merkmal der meisten bekannten second messengers, wie zyklisches Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) (2,3), zyklisches Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) (4), myo-Inosit- 1,4,5-triphosphat (1,4,5IP&sub3;) oder myo-Inosit-1,3,4,5- tetrakisphosphat (1,3,4,5IP&sub4;) (5), ist die Anwesenheit von Phosphatgruppen. Die richtige Anzahl und Stellung der Phosphatgruppen ist für die biologische Spezifität essentiell und bedingt auch extreme Hydrophilität (6,7).
  • Die Hydrophilität der second messengers hindert endogen erzeugte Moleküle daran, aus der Zelle auszutreten. Demzufolge wird in der reagierenden Zelle eine hohe Empfindlichkeit aufrechterhalten und erreicht, dass sich benachbarte Zellen nicht gegenseitig stören. Die Impermeabilität der Membran für second messengers erschwert jedoch auch die beabsichtigte extrazelluläre Anwendung oder macht sie unwirksam (2, 4, 8), obwohl eine solche Einwirkung für die Forschung oder die Therapie sehr nützlich wäre.
  • Ein Weg zur Einführung von phosphathaltigen Verbindungen in Zellen bezieht die Verwendung von Schutzgruppen zur reversiblen Umwandlung der negativ geladenen Phosphatverbindungen in neutrale Verbindungen zum Transport durch die Zellmembran ein. Die Schutzgruppe wird so gewählt, dass sie von der Phosphatverbindung innerhalb der Zelle unter Bildung der ursprünglichen Phosphatverbindung enzymatisch abgespalten wird. Beispielsweise waren lipophile, intrazellulär hydrolysierbare Derivate für Amino-, Hydroxyl- und Carboxylatgruppen nützlich (9-12). Acetoxymethyl(AM)-ester von Polycarboxylat-Kationindikatoren und -komplexbildnern wurden ebenfalls verwendet (12-14). Analoge, auf Phosphate angewendete Acyloxyalkylester sind bekannt, wurden aber nur in geringerem Maße ausgenutzt (15).
  • Bei einfachen Modellphosphaten war die Anwendung von AM- estern beschränkt auf potentiell therapeutische Wirkstoffe wie Phosphonoformiat (Foscamet) (16), antivirale Nucleotide wie 5-Fluor-2'-desoxyuridinmonophosphat (17,18) und einen 3-Phosphonat enthaltenden Inhibitor der Insulinrezeptorkinase (19). Die Phosphonoformiatester erwiesen sich als biologisch nicht brauchbar, weil sie nicht zu den richtigen Produkten hydrolysierten (16). Es wurde jedoch gefunden, dass die Veresterung die Wirksamkeit der antiviralen Nucleotide und des Kinaseinhibitors verstärkte (17-19).
  • o-Nitrobenzylester als photolysierbare ("caged") Derivate von ATP (20), zyklischen Nucleotiden (21,22) und Inositphosphaten (23) wurden in beträchtlichem Maße bearbeitet. Der Schwerpunkt lag jedoch darauf, eine kinetisch schnelle und vollständige Umwandlung vom Monoester zum aktiven freigesetzten Metaboliten (24, 25) und nicht eine allgemeine Maßnahme zum Erreichen einer Membranpermeabilität hervorzubringen. Außerdem wird (die Arbeit) mit Nitrobenzylestern beschwerlich, wenn zum Maskieren der negativen Ladungen mehr als eine (Gruppe) benötigt werden, weil mehrere Gruppen eine beträchtliche Sperrigkeit hinzufügen und hohe UV-Dosen für die Abspaltung aller Gruppen erfordern.
  • Obwohl zahlreiche verschieden myo-Inositpolyphosphate möglich sind, wurden in Zellen nur etwa ein Dutzend gefunden. Ihre intrazellulären Funktionen sind umstritten oder unbekannt, ausgenommen myo-Inosit-1,4,5-triphosphat (IP&sub3;), dessen Rolle als intrazellulärer second messenger zur Freisetzung von Ca²&spplus; aus internen Speichern außer Frage steht (26). Das nächsthäufig untersuchte Inositpolyphosphat ist myo-Inosit- 1,3,4,5-tetrakisphosphat (IP&sub4;), von dem man annimmt, dass es mit IP&sub3; bei der Öffnung von Ca²&spplus;-Kanälen in der Plasmamembran (27-30), oder um das von IP&sub3; freigesetzte Ca²&spplus; wieder zu komplexieren (31,32), zusammenwirkt. Diese Hypothesen bleiben jedoch umstritten (33-37).
  • Über die intrazelluläre Funktion der anderen Inositpolyphosphate weiß man fast nichts. Wenn sie endogen als Reaktion auf Agonisten erzeugt werden, ist eine eingehende Analyse der Rolle der Inositpolyphosphate oft schwierig, weil eine solche Anregung viele Rezeptoren, G-Proteine, Bildung von Diacylglycerin, viele Inositpolyphosphate und noch andere Transduktionswege beeinflussen kann. Oft ist die direkte Einführung von Inositpolyphosphaten zu bevorzuge.
  • Aufgrund der hohen negativen Ladung der Inositpolyphosphate ist ihre passive Permeabilität durch Membranen vernachlässigbar. Zu den vorhandenen Verfahren zur Einführung von Inositphosphaten gehören Mikroinjektion, Patch-Clamp-Techniken und Permeabilisierung durch Elektroporation, Detergentien wie Saponin oder Entfernen von extrazellulärem Ca²&spplus;. Alle diese Verfahren brechen die Plasmamembran auf und gefährden die komplizierteren Funktionen und die Langzeit- Lebensfähigkeit der Zellen. Außerdem können Mikroinjektion und Patch-Techniken nur auf wenige Zellen zur gleichen Zeit angewendet werden.
  • Dies vorausgeschickt besteht ein Bedürfnis nach Bereitstellung eines Verfahrens zur Steigerung der Membranpermeabilität von second messengers, sodass diese wirksam und in Mengen, die für Zwecke der Untersuchung und der Therapie brauchbar sind, in die Zellen eingeführt werden können.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Steigerung der Permeabilität von phosphathaltigen second messengers in eine Zelle ohne Zerreißen der Zellmembran bereitgestellt. Die Erfindung umfasst die Veresterung der im Molekül des second messenger vorhandenen Phosphatgruppen unter Bildung eines Acyloxyalkylesterderivats. Der Acyloxyalkylester des second messenger hat eine neutrale Ladung und kann daher ohne Zerreißen der Zellmembran in die Zelle eindringen. In der Zelle werden dann die Ester gespalten, um das Molekül zurück in die biologisch aktive Form umzuwandeln. Acetoxymethylester funktionierten gut als Ester zyklischer Nucleotide, erwiesen sich jedoch als ungenügend hydrophob bei Inositphosphaten. Für die letztere Klasse werden Propionyloxymethyl- und Butyryloxymethylester bevorzugt.
  • Als weiteres optionales Merkmal der vorliegenden Erfindung werden im Molekül des second messenger vorhandene Hydroxylgruppen zur Unterstützung der Synthese der Derivate und zur weiteren Steigerung der Permeabilität des Derivats des second messenger in die Zelle maskiert. Die Hydroxylgruppen werden mit einer Acylgruppe (1-4 Kohlenstoffatome) maskiert, die nach dem Eintreten des modifizierten second messenger in die Zelle leicht abgespalten werden kann. Es wurde gefunden, dass Butyrylgruppen eine optimale Maskierung liefern und von den Zellenzymen noch leicht abgespalten werden können.
  • Als weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung werden 8- substituierte zyklische Nucleotide verestert und acyliert, um ihre Permeabilität in Zellen hinein zu steigern. Diese synthetischen Nucleotide sind für Zwecke der Untersuchung und der Therapie brauchbar. Der erfindungsgemäß bereitgestellte Anstieg der Permeabilität in die Zelle liefert ein bequemes Verfahren zur Einführung der 8-substituierten zyklischen Nucleotide in die Zellen.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung werden die Phosphat- und Hydroxylgruppen von zyklischen Nucleotiden wie cAMP und cGMP unter Bildung neutraler Derivate verestert und acyliert. Es wurde gefunden, dass diese neutralen Derivate die Zellmembran durchdringen und dann innerhalb der Zelle in ihre aktive Form umgewandelt werden. Die Einführung von cAMP und/oder cGMP in eine Zelle ist sowohl für Zecke der Untersuchung als auch der Therapie brauchbar.
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bezieht die Veresterung von second messengers wie Inosittriphosphat und Inosittetraphosphat ein. Es wurde gefunden, dass auch die so entstehenden neutralen Derivate in die Zellen eindringen und innerhalb der Zelle zurück in ihre aktive Form umgewandelt werden. Die Einführung von Inositphosphaten in eine Zelle ist sowohl für Zecke der Untersuchung als auch der Therapie brauchbar.
  • Wir haben entdeckt, dass die Veresterung von Inositphosphaten mit Acetoxymethylgruppen keinen hinreichenden Anstieg der Zellpermeabilität ergab, um brauchbar zu sein. Der Ersatz der Acetoxymethyl- durch Propionyloxymethyl- und Butyryloxymethylgruppen bringt Inositphosphatester mit viel größeren Zellpermeationsgeschwindigkeiten hervor, die noch der intrazellulären Spaltung zur Bildung der aktiven Inositphosphate zugänglich sind. Inositphosphate mit diesem hohen Grad an Zellpermeabilität umfassen jene mit der Formel
  • worin A&sub1; bis A&sub6; H, OH, F ist oder
  • worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H oder CH&sub3; ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist und worin mindestens einer der Reste A&sub1; bis A&sub6; ein Phosphorsäureester der oben angegebenen Formel ist.
  • Die oben beschriebenen und viele andere erfindungsgemäße Merkmale und damit zusammenhängende Vorteile werden mit Bezug auf die folgende Beschreibung besser verständlich, wenn sie zusammen mit den beigegebenen Zeichnungen gesehen werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 besteht aus vier graphischen Darstellungen der Versuchsergebnisse, welche die Fähigkeit des Bt&sub2;cAMP/AM zur Aktivierung der Kinase im Vergleich zu anderen Derivaten zeigen.
  • Fig. 2A ist eine graphische Darstellung der Versuchsergebnisse, welche die Initiierung der Cl&supmin;-Sekretion durch Bt&sub2;cAMP/AM zeigen.
  • Fig. 2B ist ein Graph, der einen Vergleich der durch Bt&sub2;cAMP/AM und andere Derivate initiierten Chloridsekretion zeigt.
  • Fig. 3A zeigt Versuchsergebnisse, welche die Fähigkeit von Bt&sub2;cAMP/AM zum Dispergieren von Fischhautchromatophoren zeigt.
  • Fig. 3B ist ein Graph mit Versuchsergebnissen, welche die Reversibilität der in Fig. 3A dargestellten Dispersion zeigen.
  • Fig. 4 veranschaulicht das Syntheseschema zur Herstellung von Acetoxymethylester des zyklischen 3',5'- Adenosinmonophosphats.
  • Fig. 5 ist eine schematische Darstellung der Synthese von beispielhaften Estern der Inositphosphate.
  • Fig. 6 veranschaulicht Versuchsergebnisse, welche das Eindringen von Inosittriphosphatpropionyloxymethylester (IP&sub3;/PM) in REF-52-Fibroblastenzellen zeigen.
  • Fig. 7 veranschaulicht Versuchsergebnisse, welche das Eindringen von IP&sub3;/PM in Astrocytomzellen bei einer Dosierung von 20 umol/l in ein Medium mit extrazellulärem Ca²&spplus; zeigen.
  • Fig. 8 veranschaulicht Versuchsergebnisse, welche das Eindringen von IP&sub3;/PM in Astrocytomzellen bei einer Dosierung von 60 umol/l in ein Medium ohne extrazelluläres Ca²&spplus; zeigen.
  • Fig. 9 veranschaulicht Versuchsergebnisse, welche das Eindringen von Inosittriphosphatbutyryloxymethylester (IP&sub3;/BM) in Astrocytomzellen bei einer Dosierung von 2 umol/l in einem Medium mit extrazellulärem Ca²&spplus; zeigen.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Modifizierung von second messengers und deren phosphathaltigen Derivaten gerichtet, sodass diese leicht in eine Zelle ohne Zerreißen der Zellmembran eingeführt werden können. Die Erfindung umfasst die Veresterung der in den second messengers vorhandenen Phosphatgruppen zur Bildung eines neutralen Acyloxyalkylderivats, das leicht durch die Zellmembran diffundieren kann. Die Acylgruppe kann bis zu 6 Kohlenstoffatome umfassen und ist an der 1-Stellung der Alkylgruppe lokalisiert. Die Alkylgruppe kann bis zu 7 Kohlenstoffatome umfassen. Für cAMP und cGMP wurde gefunden, dass Acetoxymethylester optimalen Transport durch die Zellmembran ergeben und nach dem Eintritt in die Zelle noch der Abspaltung vom second messenger zugänglich sind. Es wurde gefunden, dass Acetoxymethylester von Inositphosphaten nicht optimal zellpermeabel sind. Bei second messengers mit mehreren Phosphatgruppen ist es bevorzugt, dass alle Phosphatgruppen als Propionyloxymethyl- oder Butyryloxymethylester maskiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung kann zur Steigerung der Zellpermeabilität einer breiten Vielfalt von phosphathaltigen second messengers und deren Derivaten angewendet werden. Bevorzugte beispielhafte phosphathaltige second messengers umfassen cAMP, cGMP, 1,4,5-IP&sub3;, 1,3,4,5-IP&sub4; und myo-Inosit-3,4,5,6- tetrakisphosphat. Die vorliegende Erfindung kann auch auf Derivate von zyklischen Nucleotiden angewendet werden. Beispielhafte Derivate umfassen die 8-substituierten Derivate des cAMP oder cGMP. Zu den 8-substituierten Derivaten gehören 8-Brom-cAMP oder -cGMP, 8-Chlor-cAMP oder -cGMP und 8-p- Chlorphenylthio(pCPT)-cAMP oder -cGMP.
  • Bei cAMP und cGMP werden die Hydroxylgruppen der phosphathaltigen second messengers während der Synthese bevorzugt maskiert oder geschützt. Bevorzugt ist die Maskierung durch Acylgruppen mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen. Größere Acylgruppen sind nicht bevorzugt, weil sie durch die Zelle schwerer vom second messenger abspaltbar sind.
  • Die Synthese und die Verwendung von erfindungsgemäßen cAMP/cGMP-Acetoxymethylestern zeigenden Ausführungsbeispiele sind wie folgt:
  • Protonen- und ³¹P-NMR-Spektren wurden in CDCl&sub3; aufgenommen, wobei übriges CHCl&sub3; (δ = 7,26) als interner Standard für die ¹H-Spektren diente. Für die ³¹P-Spektren wurde 85%ige Phosphorsäure als externer Standard verwendet. Alle NMR-Spektren wurden entweder mit einem Varian Gemini-200- (200 MHz) oder einem General Electric QE-300-(300 MHz) Spektrometer aufgenommen und werden mit folgenden Abkürzungen mitgeteilt: s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; dd, Dublett aus Dubletts; m, komplexes Multiplett. Die Massenspektroskopie mit Beschuss durch schnelle Atome (mit Glyzerin als Matrix) und die genauen Massenbestimmungen wurden vom Laboratorium für Massenspektroskopie der Universität von Kalifornien, Riverside, durchgeführt. Die Kapillarelektrophorese wurde auf einem Dionex CES durchgeführt.
  • Das bei der Synthese verwendete Pyridin und Acetonitril wurde mindestens 3 Tage über aktiviertem Molekularsieb (3 Å) aufbewahrt. Alle anderen Lösungsmittel wurden in der höchsten erhältlichen Reinheit gekauft und wie erhalten verwendet. N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) wurde von CaH&sub2; destilliert. Acetoxymethylbromid (AM-Br) wurde nach bekannten Verfahren (38) hergestellt. Alle Nucleotide waren von Sigma. Phenylphosphonsäure war von Fluka, Schweiz. 4- Methylumbelliferylphopsphat war von Boehringer, BRD. Alle anderen Reagentien waren von Aldrich. Tabelle I Strukturen der Acetoxymethylester verschiedener organischer Phosphate
  • (a) M&spplus; bezeichnet das Gegenion des phosphathaltigen Ausgangsmaterials; HDIEA&spplus; = Diisopropylethylammonium;
  • (b) Gewichtsausbeute soweit nicht anders angemerkt;
  • (c) Shiftwerte für beide Diastereomere.
  • Die in Tabelle I gezeigten Verbindungen wurden wie unten ausgeführt synthetisiert: Die Verbindungen 1-3 wurden zum Zweck des Vergleichs synthetisiert. Die Verbindungen 4 a/b (cAMP/AM) und 5 a/b (cGMP/AM) sind bevorzugte erfindungsgemäße Beispielverbindugen.
    • Synthese von 4-Methylumbelliferylphosphatbis(acetoxymethyl)ester (1):
  • Das Dilithiumsalz des 4-Methylumbelliferylphosphats (200 mg, 0,74 mmol) wurde in Wasser gelöst und eine konzentrierte Lösung von Silberacetat zugefügt. Das Disilbersalz des 4- Methylumbelliferylphosphats fiel sofort aus und wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und zu einem glänzend silberweißen Pulver getrocknet (Ausbeute 277 mg, 79%). Das Silbersalz (60 mg, 0,13 mmol) wurde in 1 ml trockenem CH&sub3;CN suspendiert und 50 mg (0,33 mmol) AM-Br zugefügt. Mit häufigen Pausen wurde das Gemisch jeweils 2 min mit einem Ultraschallbad (Branson B-220) behandelt. Häufige Beobachtung mit ¹H-NMR zeigte, dass die Reaktion nach 4 h abgeschlossen war. Der Überstand wurde zur Trockne eingedampft und man erhielt 38 mg (72%) 4-Methylumbelliferylphosphat- bis(acetoxymethyl)ester (1); ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ 2,12 (s, 6H), 2,43 (s, 3H), 5,73 (dAB, 4H, JAB = 5,5 Hz, JPH = 14,2 Hz, -CH2-), 6,27 (s, 1H, H3), 7,17-7,25 (m, 2H, H6, H8), 7,59 (m, 1H, H5); ³¹P-NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) δ -9,1; MS m/z (M + H)&spplus; ber. 401,0638, gem. 401,0625.
    • Synthese von Phosphat-tris(acetoxymethyl)ester (2):
  • Silberphosphat (30 mg, 71 umol) wurde in 0,5 ml trockenem CH&sub3;CN suspendiert und AM-Br (22 mg, 145 umol) zugesetzt. Nach häufiger Ultraschallbehandlung über 20 h bei Raumtemperatur wurden weitere 15 mg (100 umol) AM-Br zugefügt. Nachdem der suspendierte Feststoff seine gelbe Farbe verloren hatte, wurde das Gemisch zentrifugiert (1000 U/min. 1 min) und der Überstand zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit trockenem Toluol gewaschen und ergab Phosphattris(acetoxymethyl)ester (2) als klares Öl (Ausbeute 98%); ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ 2,15 (s, 9H), 6,45 (d, 6H, JPH = 13,5 Hz); ³¹P-NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) δ -2,25; MS m/z 241 (M- CH&sub2;OAc)&supmin;.
    • Synthese von Phenylphosphonat-bis(acetoxymetyl)ester (3):
  • Phenylphosphonsäure (31,6 mg, 0,2 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 130 mg, 1,0 mmol) wurden in 1 ml trockenem CH&sub3;CN gelöst. AM-Br (77 mg, 0,5 mmol) wurde zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der feste Rückstand mit trockenem Toluol extrahiert. Die Reinigung des Rohprodukts 3 erfolgte auf einer Si60-Säule (10 · 40 mm) mit 75% Toluol/25% Ethylacetat. Man erhielt 52 mg 3 (86%) als klares Öl. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ 1,95 (s, 6H), 5,66 (dAB, 4H, JAB = 5,3 Hz, JPM = 13,8 Hz, -CH&sub2;-), 7,30-7,55 (m, 3H), 7,70 (m, 2H). ³¹P- NMR (Toluol-de, 121,5 MHz) δ 18,70.
    • Synthese von zyklischem N&sup6;,O2'-Dibutyryladenosin-3',5'- monophosphatacetoxymethylester - Bt&sub2;cAMP/AM (4a/4b):
  • Zur Synthese von Bt&sub2;cAMP/AM wurden zwei verschiedene Verfahren angewendet.
  • Verfahren A: Das Natriumsalz von N&sup6;,O2'-Dibutyryl-AMP (12,5 mg, 25 umol) wurde in 1 ml MeOH-H&sub2;O (1 : 1) gelöst und durch eine Dowex 50 W-X8-Säule (10 · 40 mm, H&spplus;-Form) gegeben. Die freie Säure wurde mit 15 ml 50% MeOH eluiert. Nach Eindampfen zur Trockne wurden DIEA (6 mg, 50 umol) und 1 ml trockenes CH&sub3;CN zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von AM- Br (16 mg, 94 umol) gestartet. Nach 4d Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch direkt auf einer Si60- Säule (10 · 40 mm, 230-400 mesh) mit 95% CH&sub3;CN/5% Hexan als Elutionsmittel unter leichtem Druck chromatographiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5 ml gesammelt. Die Fraktionen 5-7 enthielten 5,3 mg (38%) des schneller eluierenden Diastereomers des Dibutyryl-cAMP-acetoxymethylesters (4a) in hoher Reinheit. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 1,05 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,12 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,74 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,51 (m, 2H), 2,95 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 4,36 (ddd, 1H, J = 2,7, 10,1, 10,1 Hz, H4'), 4,49 (dd, 1H, J -10,0, 10,0 Hz, H5'ax), 4,66 (dddd, 1H, J = 2,7, 10,0, 10,0, 22,1 Hz, H5'eq), 5,67-5,95 (m, 4H, -CH&sub2;-, Hz', H3'), 6,04 (s, 1H, H1'), 8,01' (s, 1H, H2), 8,49 (breit s, 1H, N&sup6;H), 8,78 (s, 1H, H8); ³¹P-NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) δ -5,0 ppm.
  • Die Fraktionen 8 + 9 ergaben 8,7 mg eines klaren Öls, das Diisopropylethylammoniumbromid und das langsamer eluierende Diastereomer 4b enthielt (2 : 1 w/w nach Bestimmung durch NMR, Ausbeute 2,9 mg 4b, 21% bezogen auf Dibutyryl-cAMP). ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz), δ 0,99 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,05 (t, 3H, J -7,5 Hz), 1,70 (m, 4H), 2,18 (s, 3H), 2,45 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,89 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 4,40-4,70 (m, 3H, H4', H5'eq, H5'ax), 5,62-5,78 (AB-Teil von ABX, 2H, JAB = 5,1 Hz, -CH&sub2;-), 5,83 (m, 2H, H2', H3'), 6,01 (s, 1H), 8,02 (breites s, 1H, H2), 8,51 (breites s, 1H, N&sub6;H), 8,69 (s, 1H, H8); ³¹P- NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) 5-8,0 ppm; MS (4a/4b 1 : 1 Gemisch) m/z (M + H)&spplus; ber. 542,1652, gem. 542,1681.
  • Verfahren B: 58 mg (0,12 mmol) des Natriumsalzes von Bt&sub2;cAMP wurden in 0,5 ml H&sub2;O gelöst und 300 ul AgNO&sub3; (1,8 mol/l) zugesetzt. Der resultierende weiße Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und ergab 30,5 mg (45%, 54 umol) des Silbersalzes von Bt&sub2;cAMP. Das weiße Pulver wurde in 1 ml trockenem CH&sub3;CN suspendiert und 51 mg (330 umol) AM-Br zugefügt. Die Suspension wurde über 4 h bei Raumtemperatur häufig mit Ultraschall behandelt. Die beiden resultierenden diastereomeren Acetoxymethylester 4a und 4b wurden wie für das Verfahren A beschrieben gereinigt und es ergaben sich 2,8 mg des schnell eluierenden Isomers 4a (10% Ausbeute) und 9,6 mg (35%) des langsam eluierenden Diastereomers 4b. Die NMR- und MS-Analysendaten der Produkte beider Verfahren waren identisch.
    • Synthese von zyklischem N²,O2'-Dibutyrylguanosin-3',5'- monophosphatacetoxymethylester - Bt&sub2;cGMP/AM (5a/5b):
  • Das Natriumsalz von Bt&sub2;cGMP (24 mg, 47 umol) wurde durch Dowex 50W-X8 (H&spplus;-Form) gegeben und die freie Säure mit 15 ml 50% MeOH eluiert. Nach Eindampfen zur Trockne wurden 1 ml trockenes Acetonitril, 13 mg (100 umol) DIEA und 21 mg (135 umol) AM-Br zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, zur Trockne eingedampft, in CH&sub3;CN/Hexan (95 : 5, v/v) gelöst und über eine Si60-Säule (10 · 40 mm) eluiert. Es ergaben sich 11 mg (40 %) der beiden Diastereomeren des Dibutyryl-cGAMP (5a, 5b) als Gemisch. ¹H-NMR (nur 5a, CDCl&sub3;, 200 MHz) δ 1,00 (m, 6H), 1,74 (m, 4H), 2,38 (s, 3H), 2,42 (m, 2H), 2,48 (m, 2H), 4,18 (ddd, 1H, J = 4,0, 10,0, 10,0 Hz, H4'), 4,30- 4,54 (m, 2H, H5'ax H5'eq), 5,13 (ddd, 1H, J = 1,8, 4,1, 10,0 Hz, H3'), 5,56 (dd, 1H, J = 4,1, 4,1 Hz, H2'), 5,71 (dAB, 2H, J = 12,5, 9,1 Hz, -CH&sub2;-), 6,04 (d, 1H, J = 4,0 Hz, H1'), 7,65 (breites s, 1H, N²H), 10,14 (s, 1H, H8), 12,30 (breites s, 1H, N¹H) ³¹P-NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) δ -5,5 und -8,5 ppm; MS m/z (M + H)&spplus; ber. 558,1601, gem. 558,1611.
  • Als allgemeinster und wirtschaftlichster Syntheseweg für Acetoxymethylphosphatester wird die Alkylierung der Anionen der Ausgangsphosphate durch Acetoxymethylhalogenide angenommen. Die Instabilität des Acetoxymethanols schließt seine Phosphorylierung aus. Vorläufige Syntheseversuche, ähnlich zu denen von Srivasta und Farquhar (15), wurden mit 4- Methylumbelliferylphosphat und Phenylphosphonat ausgeführt, weil dies leicht erhältliche und mit UV-Absorption nachweisbare Modellverbindungen sind, die keine konkurrierenden nukleophilen Zentren aufweisen. 4-Methylumbelliferylphosphatbis(acetoxymethyl)ester (Tabelle I - 1) wurde erfolgreich mit 73% Ausbeute hergestellt, indem das Disilbersalz des 4- Methylumbelliferylphosphats in trockenem Acetonitril suspendiert, Acetoxymethylbromid (AM-Br) (38) zugesetzt und das heterogene Gemisch mit häufigen Pausen 24 h lang mit Ultraschall behandelt wurde. Die ¹H-NMR des Überstands zeigte ein AB-Dublett bei 5,7 ppm für die Methylengruppe des Acetoxymethylesters, ein typisches Muster aller hier mitgeteilten Phosphatacetoxymethylester. Die Synthese des Phosphat-tris(acetoxymethyl)esters (Tabelle I - 2) bot eine bot eine Möglichkeit, den Fortgang der Reaktion direkt zu beobachten. Gelbes Ag&sub3;PO&sub3; wurde mit AM-Br wie oben beschrieben umgesetzt. Das Verschwinden der Farbe nach 36 h zeigte den Abschluß der Reaktion an. Das Produkt war die einzige Verbindung in der organischen Phase (98% Ausbeute).
  • Für Polyphosphate oder Moleküle mit oxidierbaren funktionellen Gruppen ist eine Alternative zu Silbersalzen wünschenswert. Die direkte Behandlung von Phenylphosphonsäure mit einem Überschuss der sterisch gehinderten Base Diisopropylethylamin (DIEA) und AM-Br ergab schließlich eine Ausbeute von 86% des Phenylphosphonat-bis(acetoxymethyl)esters (Tabelle I - 3).
  • Analoge Reaktionen gingen, obwohl mit geringerer Ausbeute, für zyklischen N&sup6;,O2'-Dibutyryladenosin-3',5'- monophosphatacetoxymethylester (Bt&sub2;cAMP/AM, 4a/4b) und zyklischen N²,O2'-Dibutyrylguanosin-3',5'- monophosphatacetoxymethylester (Bt&sub2;cGMP/AM, 5a/5b). Die im Handel erhältlichen Natriumsalze von Bt&sub2;cAMP und Bt&sub2;cGMP wurden auf Dowex 50W-X8 in die freien Säuren und dann in die DIEA-Salze umgewandelt. Die Reaktion fand in trockenem CH&sub3;CN mit einem Überschuss von DIEA und AM-Br über 5d bei Raumtemperatur statt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurden beide Nucleotid-AM-ester auf Silicagel 60 gereinigt (CH&sub3;CN/Hexan 19 : 1 v/v). Die beiden Diastereomeren des Bt&sub2;cAMP/AM (4a/4b) wurden in Ausbeuten von 37% und 21% für das schnell und das langsam eluierende Isomer isoliert, wobei das letztere zusammen mit dem restlichen DIEA eluierte. Die ³¹P-NMR-Resonanzen waren -5,0 ppm bzw. -8,0 ppm; absolute Konfigurationen wurden jedoch nicht bestimmt. Die analogen beiden Diastereomeren des Bt&sub2;cGMP/AM (5a/5b) konnten unter den beschriebenen Bedingungen nicht getrennt werden, waren jedoch frei von DIEA. Bt&sub2;cAMP/AM wurde auch durch Alkylierung des Silbersalzes von Bt&sub2;cAMP mit AM-Br in CH&sub3;CN mit häufiger Ultraschallbehandlung über 24 h hergestellt. Durch diese heterogenen Bedingungen wurde die enantiomere Präferenz umgekehrt und die schnell und langsam wandernden Isomere ergaben sich in Ausbeuten von 10% und 35%.
  • Die oben beschriebene Synthese von cAMP und cGMP benutzt Butyrylgruppen, um die Hydroxylgruppen zu maskieren oder zu schützen, weil die direkte Umwandlung von cAMP oder cGMP in deren Acetoxymethylester nur geringe Mengen des Produkts ergibt. Es wurde gefunden, dass auch Trimethylsilylgruppen (TMS) gut als Schutzgruppen funktionieren. Die Syntheseschemata für die direkte und die TMS-geschützte Synthese sind in Fig. 8 gezeigt.
  • Die Synthese des Acetoxymethylesters von cAMP mit Hilfe von TMS ist im Folgenden angegeben:
  • Allgemeine Verfahren: Protonen- und ³¹P-NMR-Spektren wurden in CDCl&sub3; aufgenommen, wobei restliches CHCl&sub3; (δ = 7,26) als interner Standard für die ¹H-Spektren diente. Für die ³¹P- Spektren wurde 85%ige Phosphorsäure als externer Standard verwendet. Alle NMR-Spektren wurden entweder mit einem Varian Gemini-200- (200 MHz) oder einem General Electric QE-300- (300 MHz) Spektrometer aufgenommen und werden mit den gleichen Abkürzungen wie in den vorangehenden Beispielen mitgeteilt.
  • Acetonitril wurde mindestens 3 Tage über aktiviertem Molekularsieb (3 Å) aufbewahrt. Alle anderen Lösungsmittel wurden in der höchsten erhältlichen Reinheit gekauft und wie erhalten verwendet. N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) wurde von CaH&sub2; destilliert. Acetoxymethylbromid (AM-Br) wurde nach bekannten Verfahren hergestellt. Alle anderen Nucleotide waren von Sigma. Alle anderen Reagentien waren von Aldrich.
  • Die folgende dreistufige Synthese ist in Fig. 4 umrissen.
    • Synthese von zyklischem 2'-O-Trimethylsilyladenosin-3',5'- phosphat (Fig. 4-A):
  • Die freie Säure des cAMP (50 mg, 0,15-mmol) wurde in 3 ml trockenem DIEA suspendiert. Ein (1) ml Hexamethyldisilazan (HMDS) und 0,5 ml Trimethylsilylchlorid (TMS-Cl) wurden unter Argon zugesetzt und das Gemisch 3 h lang auf 100ºC erhitzt. Nach Abkühlen auf RT wurden alle flüchtigen Bestandteile im Hochvakuum abgedampft. Das zurückbleibende Öl wurde mit 2 · 2 ml trockenem Toluol extrahiert. Eine Probe des Extrakts, der ausschließlich den zyklischen N&sup6;,2'-O-Di- (trimethylsilyl)adenosin-3',5'-phosphattrimethylsilylester enthielt, wurde zur Trockne eingedampft und mit ¹H-NMR analysiert: ¹H-NMR (Toluol-de, 200 MHz) Diastereomer 1 (80%) δ 0,32 (s, 9H), 0,45 (s, 9H), 0,47 (s, 9H), 4,15-4,61 (m, 3H, H4', H5'eq, H5'ax), 4,98 (d, 1H, J = 4,7 Hz, H2'), 5,60 (s, 1H, N&sup6;H), 5,74 (ddd, 1H, J = 1,6, 4,7, 9,5 Hz, H3'), 5,83 (s, 1H, H1'), 7,64 (s, 1H, H2), 8,6 (s, 1H, H8). Diastereomer 2 (20%) δ 4,65 (d, 1H, J = 4,2 Hz, H2'), 5,20 (m, 1H, H3'), 5,66 (s, 1H, N&sup6;H), 6,05 (s, 1H, H1'), 7,77 (s, 1H, H2), 8,58 (s, 1H, H8). Der Toluolextrakt wurde 3 min mit 12 ul MeOH (0,3 mmol) behandelt und danach die Lösungsmittel rasch abgedampft. Der zurückbleibende weiße Feststoff war ziemlich reines 2'-O-TMS-cAMP (1). ¹H-NMR (CD&sub3;OD, 200 MHz) δ 0,80 (s, 9H, TMS), 4,32 (m, 3H, H4', H5'), 4,65 (d, 1H, J = 8,2 Hz, H2'), 4,95 (m, 1H, H3'), 6,12 (s, 1H, H1'), 7,16 (breites s, 2H, NH&sub2;), 8,40, 8,45 (25, 1H jedes, H2, H8). ³¹P- NMR 0.
    • Synthese von zyklischem 2'-O-Trimethylsilyladenosin-3',5'- monophosphatacetoxymethylester (Fig. 4-B):
  • 25 mg (0,062 mmol) 2'-TMS-cAMP (1) wurden unter Argon in 0,5 ml trockenem CH&sub3;CN, das 0,05 ml DIEA (0,28 mmol) enthielt, gelöst und 0,028 ml (0,28 mmol) AM-Br zugesetzt. Das Gemisch wurde 3d bei RT gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf einer Si60-Säule (4 · 1,5 cm) mit trockenem, mit Hexan gesättigtem CH&sub3;CN als Elutionsmittel gereinigt. Vor der Trennung wurde die Säule mit dem gleichen Elutionsmittel, das 0,1% Essigsäure enthielt und danach mit dem Elutionsmittel allein gewaschen. Das meiste 2'-O-TMS- cAMP/AM (2) eluierte kurz vor dem HDIEA&spplus;Br und die Ausbeute war 20,5 mg (0,042 mmol, 68%). Wie durch ³¹P-NMR bestimmt, bestand das Produkt zu 90% aus einem der RP/SP- Diastereomeren. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 0,22 (s, 9H, TMS), 2,16 (s, 3H, OCCH&sub3;), 4,43 (m, 2H, H4', H5'ax), 4,64 (m, 1H, H5'eq), 4,85 (d, 1H, J = 5,2 Hz, H2'), 5,34 (m, 1H, H3'), 5,74 (d, 2H, J = 13,1 Hz, -CH&sub2;-OAc), 4,86 (breites s, 2H, NH&sub2;), 5,91 (s, 1H, H1'), 7,87 und 8,41 (2s, 1H jedes, H2 und H8). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;, 121,5 MHz) δ -7,58 (90%), -4,62 (10%).
    • Synthese von zyklischem Adenosin-3',5'-monophosphatacetoxymethylester (Fig. 4-C):
  • 14 mg (0,029 mmol) der Verbindung 2 wurden in 1 ml eines 1 : 1 (v/v)-Gemischs aus CHCl&sub3;/CH&sub3;CN gelöst und 2 ul HF (49%) zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 min leicht geschwenkt und dann die Lösungsmittel abgedampft und es ergab sich cAMP/AM (3) quantitativ als weißer Feststoff. ¹H-NMR (CD&sub3;OD, 300 MHz) δ 2,17 (s, 3H, -OAc), 4,48 (ddd, 1H, J = 3,6, 9,5, 9,5 Hz, H4'), 4,50 (m, 1H, H5'ax), 4,74 (m, 1H, H5'eq), 5,33 (ddd, 1H, J = 1,0, 4,8, 12,3 Hz, H3'), 5,75 (m, 2H, -CH&sub2;-OAC), 6,15 (s, 1H, H1'), 8,41 und 8,42 (2s, 1H jedes, H2, H8). ³¹P-NMR (CD&sub3;OD, 121,5 MHz) δ -6,85.
  • Um die biologische Aktivität der cAMP-Derivate nach dem Eintritt in die Zelle zu zeigen, wurden die folgenden biologischen Tests durchgeführt.
  • Aktivierung der intrazellulären Proteinkinase A. Das erste Ziel des cAMP in den meisten Zellen ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) (45). Um zu zeigen, dass dieses Enzym durch extrazelluläre Anwendung von Bt&sub2;cAMP/AM aktiviert werden kann, benutzten wir eine kürzlich entwickelte Bestimmungsmethode für die PKA-Aktivierung in Einzelzellen (39).
  • Wenn PKA doppelt, mit Fluorescein an seinen katalytischen Untereinheiten und mit Rhodamin an seinen regulatorischen Untereinheiten, unter Bildung von FICRhR markiert ist, erfolgt Übergang von Fluoreszenzenergie vom Fluorescein zum Rhodamin im Holoenzymkomplex, wird jedoch nach Aktivierung und Dissoziation der Untereinheiten unterbrochen. Die Änderung des Verhältnisses zwischen den Emissionen des Fluoresceins und des Rhodamins folgt dem Anstieg der Kinaseaktivität und kann in einzelnen Zellen zerstörungsfrei abgebildet werden. REF-52-Fibroblasten wurde FlCRhR mikroinjiziert und Bilder des Emissionsverhältnisses wurden bei Raumtemperatur wie früher beschrieben (27) aufgenommen. 30 min nach der Injektion wurden extrazellulär 0,1, 1 oder 10 umol/l Bt&sub2;cAMP/AM zugefügt (Fig. 1 - Graph A). Die höchste Dosierung ergab eine maximale Änderung des Fluoreszenzverhältnisses innerhalb von 15 min. Die mittlere Dosierung ergab einen flacheren Anstieg und ein niedrigeres Plateau bei etwas über 50% der maximalen Änderung. Der Beginn der Trennung der katalytischen und der regulatorischen Untereinheiten des FlCRhR erfolgte ungefähr 2 min nach der Zugabe des cAMP-Derivats. Fast die gleiche Verzögerung und der gleiche Gesamt- Zeitverlauf erfolgte mit nicht verestertem Bt&sub2;cAMP, jedoch waren viel höhere Konzentrationen, 1 mmol/l, erforderlich (Fig. 1 - Graph B). Andere weithin verwendete, vermutlich lipophile cAMP-Derivate zeigten keine Verzögerung beim Beginn der PKA-Aktivierung, jedoch waren auch Millimolarkonzentrationen erforderlich (Fig. 1 - Graphen C und D).
  • Um zu zeigen, dass die Estergruppen intrazellulär enzymatisch hydrolysiert werden müssen, untersuchten wir die Bindungseigenschaften von Bt&sub2;cAMP/AM und Bt&sub2;cAMP an FlCRhR in vitro. Die höchste bei den anderen Bestimmungen angewendete Konzentration an Bt&sub2;cAMP/AM (10 umol/l) ergab keine Trennung der Untereinheiten, während Bt&sub2;cAMP ungefähr 1/100 so wirksam war wie cAMP, wahrscheinlich wegen der Verunreinigung durch 1% Monobutyryl-cAMP, wie vom Lieferanten (Sigma) angegeben (siehe Tabelle II). Tabelle II In vitro-Bestimmung der cAMP-abhängigen Kinaseaktivierung
  • (a) Die geringe Restaktivität des Bt&sub2;cAMP ist wahrscheinlich durch eine Verunreinigung mit N&sup6;-Monobutyryl-cAMP (1%), wie vom Lieferanten angegeben, bedingt.
  • (b) 200 umol/l cAMP wurde als für die vollständige Dissoziation des FlCRhR maximal notwendige Dosierung angesehen.
  • (c) Markierte cAMP-abhängige Kinase Typ I (FlCRhR). Dieses markierte Isoenzym ist in Abwesenheit von cAMP bei den niedrigen für diese Bestimmung verwendeten Enzymkonzentrationen stabiler gegen Dissoziation in Untereinheiten als der markierte Typ II.
  • Die intestinale transepitheliale Cl&supmin;-Sekretion ist eine der vielen gut bekannten, durch cAMP gesteuerten Zellfunktionen (46). Ein bequemes Testsystem ist die intestinale Zellinie T&sub8;&sub4;, bei der die Chloridsekretion durch Anbringen konfluenter Zellmonoschichten in Ussing-Kammern kontinuierlich beobachtet werden kann (42). Fig. 2A zeigt die als Kurzschlussstrom (ISC) durch die Zellen gemessene Cl&supmin;-Sekretion. Zugabe von Bt&sub2;cAMP/AM in einer Konzentration von 3 umol/l zur serösen Badlösung verursachte eine Steigerung des TSC mit einem Maximum nach 20 min. Höhere Konzentrationen des Derivats riefen schnellere, aber nicht wesentlich größere Antworten hervor, während bei kleineren Konzentrationen niedrigere maximale ISC-Werte erreicht wurden. Die bei einer willkürlich gewählten Zwischenzeit, 12 min nach Zugabe der verschiedenen cAMP-Derivate, erhaltenen ISC-Werte wurden zur Bestimmung der Dosisabhängigkeit verwendet (Fig. 2B). Die dosisabhängigen Kurven waren parallel, wobei die EC&sub5;&sub0;-Werte für Bt&sub2;cAMP/AM bzw. Bt&sub2;cAMP 2 umol/l bzw. 400 umol/l betrugen. Daher steigerte die Einführung der Acetoxymethylgruppe in das Phosphat bei dieser Bestimmung durch Umgehung der Permeabilitätsschranke die Wirksamkeit um das Zweihundertfache. Außerdem scheint der Acetoxymethylester in den T&sub8;&sub4;-Zellen ohne wesentliche Verzögerung gespalten zu werden, da beide Wirkstoffe eine im Wesentlichen nicht unterscheidbare Aktivierungskinetik ergaben. Versuche mit dem cAMP-Derivaten 8-Br-cAMP und 8-pCPT-cAMP zeigten eine Aktivierung der Cl&supmin;-Sekretion mit EC&sub5;&sub0;-Werten von 1,5 mmol/l bzw. 100 umol/l.
  • Hautchromatophore von Fischen zeigen eine straff geregelte Bewegung der Pigmentgranula entweder nach innen in eine hoch aggregierte Zentralmasse oder nach außen, wobei das Pigment über die Zelle dispergiert wird. In Melanophoren des Meerengels (Pterophyllum scalare) beruht diese Bewegung auf Microtubuli und ist durch cAMP reguliert (44, 47), jedoch relativ widerstandsfähig gegenüber externen cAMP-Analoga. Melanophore erlauben in einer einzelnen Zelle eine visuelle Bestimmung der Fähigkeit des cAMP-Analogons, in die Zelle einzutreten und die Wirkungen des cAMP nachzubilden. Die Melanophore auf Schuppen des Meerengels wurden isoliert und die Epidermis abgeschält. Die 60-100 Melanophoren einer jeden Schuppe wurden mit einem α&sub2;-adrenergen Agonisten vorbehandelt, um das endogene cAMP zu vermindern und mit vollständiger Aggregation zu beginnen. Extrazelluläres Bt&sub2;cAMP/AM verursachte dann eine dosisabhängige Dispersion des Pigments (Fig. 3A). Für eine im Wesentlichen vollständige Dispersion reichte eine Konzentration von 100 umol/l Bt&sub2;cAMP/AM aus, jedoch ergab 1 mmol/l ein etwas schnelleres Einsetzen der Wirkung, die nicht leicht durch Entfernen des extrazellulären Bt&sub2;cAMP/AM und Verabreichen von Epinephrin rückgängig gemacht werden konnte, während die Wirkung von 100 umol/l leicht rückgängig gemacht wurde (Fig. 3B). Bei 1 umol/l war die Dispersion gerade noch nachweisbar und betrug bei 10 umol/l die Hälfte des Maximums (Fig. 3A). Im Vergleich konnte 1 mmol/l Bt&sub2;cAMP keine nachweisbare Dispersion hervorrufen. Daher steigerte die AM-Estergruppe die Wirksamkeit bei dieser Bestimmung um mehr als 1000. Die Wirksamkeit des Bt&sub2;cAMP/AM zeigt, dass die Wirkungslosigkeit des Bt&sub2;cAMP durch die schlechte Permeabilität und nicht durch seine Empfindlichkeit gegenüber Phosphodiesterasen oder die Selektivität der Kinase-Bindungsstellen für die cAMP-Substitution (48) bedingt ist. Die vorstehenden Beispiele sind in (64) zusammengefasst.
  • Es wurde gefunden, dass die vorstehend beschriebene Strategie der Permeabilitätssteigerung für cAMP und cGMP, d. h. die Acetoxymethylveresterung in Kombination mit der Butyrylmaskierung der Hydroxylgruppen, bei Inositphosphaten nicht erfolgreich war. Die Actetoxymethylester der Inosittriphosphate, deren Hydroxylgruppen mit Butyrylgruppen blockiert worden waren, hatten relativ geringe Wirksamkeit, vielleicht weil die sich zwischen den sperrigen Phosphatgruppen befindenden Butyrylgruppen durch intrazelluläre Enzyme nicht abgespalten werden können. Wenn man jedoch die Hydroxylgruppen unverestert ließ und die Phosphate mit Acetoxymethylgruppen veresterte, hatten die resultierenden Verbindungen eine zum Eindringen in die Zelle unzureichende Membranpermeabilität. Wir fanden, dass es zusätzlich auch notwendig war, die Acetoxymethylgruppen durch hydrophobere Gruppen zu ersetzen, um eine annehmbare Zellpermeabilität und nachfolgende Esterspaltung zu erhalten, wenn man die Hydroxylgruppen unverestert ließ. Wir entdeckten, dass hydrophobere Ester, wie Propionylmethyl(PM)-ester (R = Ethyl, R' = H) oder Butyryloxymethyl(BM)-ester (R = Propyl, R' = H), die Zellmembran mit größerer Geschwindigkeit durchdringen und doch noch der Spaltung beim Eintritt in die Zelle zugänglich sind.
  • Erfindungsgemäße Inositphosphatester haben die Formel
  • worin A&sub1; bis A&sub6; H, OH, F oder
  • ist, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H oder CH&sub3; ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist und worin mindestens einer der Reste A&sub1; bis A&sub6; ein Phosphorsäureester der oben angegebenen Formel ist.
  • Bevorzugte Ester sind die Propionyloxymethyl- und Butyryloxymethylester von: Inosit-1,4,5-triphosphat; 3-Desoxyinosit- 1,4,5-triphospaht; 3-Fluorinosit-1,4,5-triphosphat; Inosit- 1,3,4-triphosphat; Inosit-1,3,4,5-tetrakisphosphat und Inosit-3,4,5,6-tetrakisphosphat.
  • Beispiele für Synthese und Verwendung bevorzugter beispielhafter erfindungsgemäßer Inositpolyphosphatester sind wie folgt:
  • Das allgemeine Syntheseschema, das zur Herstellung von einer Anzahl verschiedener erfindungsgemäßer Ester angewendet werden kann, ist in Fig. 5 angegeben.
  • Die Synthese von Phosphotriestern mit benachbarten ungeschützten Hydroxylgruppen ist schwierig, weil die Phospatgruppen leicht an die freien Hydroxylgruppen wandern oder zyklisieren. Der Schlüssel liegt darin, in möglichst vielen Stufen Benzylgruppen zum Schutz der Hydroxylgruppen zu verwenden und Bedingungen zu finden, unter denen sich die Benzylgruppen in der letzten Stufe entfernen lassen, ohne die Phosphatacyloxyalkylester zu schädigen (Fig. 5). Daher werden bei der Synthese von beispielsweise Inosittriphosphatpropionyloxymethylester (IP&sub3;/PM) die Hydroxylgruppen in 2-, 3- und 6-Stellung zunächst als Benzylgruppen geschützt. Phosphorylierung von 1 mit bis (β-Cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit, Oxidation der Phosphite und Ammonolyse der Cyan-Schutzgruppen liefert 2,3,6-Tri-O-benzyl-IP&sub3; (2a). Veresterung mit Brommethylpropionat (3, R = Et, R' = H) ergibt vollständig geschütztes Inosittriphosphat (4a). Schließlich liefert katalytische Hydrierung über Palladiumacetat in Essigsäure IP&sub3;/PM (5a, R = Et, R' = H) ohne Wanderung oder Zyklisierung der Phosphatgruppen. Dieses allgemeine Verfahren kann zur Synthese von anderen membranpermeablen, intrazellulär hydrolysierbaren IP&sub3;-Estern und anderen wichtigen Inositpolyphosphaten, wie 3-Desoxy-1,4,5-IP&sub3;, 3- Fluor-1,4,5-IP&sub3;, 1,3,4,5-IP&sub3; und 3,4,5,6-IP&sub3; angewendet werden.
  • Eine eingehende Beschreibung der Synthese ist wie folgt:
  • Die bekannten (65, 66) Verbindungen D-2,3,6-Tri-O-benzyl- myo-inosit 1a und D-2,6-Di-O-benzyl-myo-inosit 1d werden aus myo-Inosit nach einem modifizierten Verfahren (für 1a) oder wie veröffentlicht (für 1d) synthetisiert. D-2,3-Di-O- benzyl-3-desoxy-myo-inosit 1b und D-2,3-Di-O-benzyl-3- desoxy-3-fluor-myo-inosit 1c können in zwei Stufen aus bekannten Vorstufen (67, 68) hergestellt werden: D-1,4,5-Tri- O-benzoyl-6-O-benzyl-3-desoxy-3-fluor-myo-inosit (Verbindung 10 in (67)) bzw. D-Tri-O-benzoyl-6-O-benzyl-3-desoxy-3- fluor-myo-inosit (Verbindung 5b in (68)). Diese Ausgangsmaterialien können mit Benzyltrichloracetimidat in Gegenwart einer katalytischen Menge Trifluormethansulfonsäure benzyliert werden. Die Entfernung der Benzoylschutzgruppen mit Kaliumcarbonat in Methanol über Nacht liefert 1b bzw. 1c. Die in Fig. 5 umrissene Arbeitsvorschrift ist für 5a, 5b, 5c und 5d gleich. Hier verwenden wir 5a als Beispiel. Wenn nicht anders angegeben, werden alle Reaktionen unter Argonatmosphäre durchgeführt.
    • D-2,3,4-Tri-O-benzyl-myo-inosit-1,4,5-triphosphat (2a), Ammoniumsalz:
  • 65 mg 1a (0,144 mmol) wurden in 1 ml Dichlormethan und 1 ml Acetonitril gelöst. Bis-(β-Cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit (69) (180 ul, 0,65 mmol) und danach 48 mg Tetrazol (0,69 mmol), gelöst in 1,2 ml Acetonitril, wurden zugesetzt. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgefäß in einem Eisbad gekühlt. Ein Überschuss von t-Butylhydroperoxid (300 ul einer 5-molaren Lösung in Dichlormethan) wurde auf einmal zugegeben. 30 min später wurde das Eisbad entfernt und 1 h bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der zurückbleibende Sirup wurde in der minimalen Menge Dichlormethan/Methanol (12 : 1) wieder suspendiert. Man erhielt 130 mg eines klaren Glases. Dieses Material wurde in 1,5 ml Methanol gelöst und mit 6 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid gemischt. Es wurde 3 h am Rückfluss auf 60ºC erwärmt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die zurückbleibende Substanz wurde ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.
    • D-2,3,4-Tri-O-benzyl-myo-inosit-1,4,5-triphosphatpropionyloxymethylester (4a):
  • Das oben genannte Material (2a) wurde in 1 ml Acetonitril und 0,2 ml Diisopropylethylamin (DIEA) suspendiert. Es wurde dann über einen kurzen Zeitraum mit Ultraschall behandelt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Dieser Vorgang wurde noch einige Male wiederholt, bis nach Zugabe von Acetonitril und DIEA eine homogene Lösung erhalten wurde, was anzeigte, dass die Ammonium-Gegenionen der Phospatgruppen durch Diisopropylethylammonium ausgetauscht worden waren. Ein Überschuss ( 150 ul) Brommethylpropionat (3, R = Et, R' = H, hergestellt wie in (70)) wurde zugesetzt und man ließ 48 h reagieren. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der zurückbleibende Sirup zunächst durch Blitzchromatographie auf einer Silicagelsäule und Elution mit Ethylacetat gereinigt. Das nach Eindampfen erhaltene blassgelbe Glas wurde mittels HPLC auf einer C18- Umkehrphasesäule und Elution mit 78 % Methanol in Wasser weiter gereinigt. Man erhielt 15 mg eines klaren Glases, Gesamtausbeute 10% bezogen auf 1a. ¹H-NMR(CDCl&sub3;): δ = 1,1 (m, 18H), 2,2-2,45 (m, 12H), 3,5 (dd, 1H, J = 12 Hz, 2 Hz), 4,05 (t, 1H, J = 11,2 Hz), 4,3-4,5 (m, 3H), 4,7-4,9 (m, 7H), 5,3-5,7 (m, 12H), 7,2-7,5 (m, 15H), FAB-MS m/z (M + Cs)&spplus; ber. 1339,2293; gem. 1339,2261.
  • D-myo-Inosit-1,4,5-triphosphatpropionyloxymethylester (5a, R = Et, R' = H):
  • 15 mg 4a wurden in 2 ml Eisessig gelöst. 20 mg Palladiumacetat und eine katalytische Menge Trifluoressigsäure wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur von unter 20ºC (um die Wanderung am Phosphattriester zu minimieren) unter Wasserstoff von 1 atm gerührt. Nach 4 h Hydrierung wurde der Katalysator abfiltriert und die Essigsäure durch Gefriertrocknung entfernt. Man erhielt 10 mg klares Glas. ¹H- NMR (CD&sub3;OD): δ = 1,2 (m, 18H), 2,4 (m, 12H), 3,7 (dd, 1H, J = 9,9 Hz, 2,4 Hz), 4,0 (t, 1H, J = 9,3 Hz), 4,2-4,4 (m, 3H), 4,65 (q, 1H, J = 8,4 Hz), 5,7 (m, 12H).
  • D-myo-Inosit-1,4,5-triphosphatbutyryloxymethylester (5a, R = Pr, R' = H) wurde auf gleiche Weise aber mit Brommethylbutyrat (3, R = Pr, R' = H) anstelle von Brommethylpropoinat hergestellt. ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ = 0,95 (m, 18H), 1,7 (m, 12H), 2,4 (m, 12H), 3,7 (dd, 1H, J = 9,9 Hz, 2,4 Hz), 4,0 (t, 1H, J = 9,3 Hz), 4,2-4,4 (m, 3H), 4,65 (q, 1H, J = 8,4 Hz), 5,7 (m, 12H). FAB-MS m/z (M + Cs)&spplus; ber. 1153,1824, gem. 1153, 1850.
    • Biologische Anwendungen von IP&sub3;/PM und IP&sub3;/BM
  • Die bestgesicherte biologische Wirkung des IP&sub3; ist die Freisetzung von Ca²&spplus; aus internen Speichern (26). Daher wurde IP&sub3;/PM durch Abbildung des freien Ca²&spplus;-Gehalts im Cytosol in einzelnen REF-52-Fibroblasten nach Standardmethoden (58) geprüft. Die Zellen wurden mit dem Ca²&spplus;-Indikator FURA-2 beladen und mittels Verhältnisbildung der Flureszenzanregung beobachtet. IP&sub3;/PM (40 umol/l) wurde extrazellulär angewendet und dabei die Konzentrationen des Ca²&spplus; im Cytosol verfolgt. Wie in Fig. 6 gezeigt, stieg die Ca²&spplus;-Konzentration nach Zugabe des IP&sub3;/PM rasch an (senkrechte punktierte, mit 1 bezeichnete Linie). Nachfolgende Zugabe von Vasopressin (senkrechte punktierte, mit 2 bezeichnete Linie), einem wohlbekannten Ca²&spplus; freisetzenden Hormon (59), hatte eine wesentlich geringere als normale Wirkung. Diese Hemmung zeigt, dass IP&sub3;/PM bereits die auch von einem physiologischen Agonisten, Vasopressin, benutzten Wege zur Anhebung von Ca²&spplus; teilweise ausgeschöpft hatte.
  • Biologische Tests an 1321N1-Astrocytomzellen wurden auf gleiche Weise wie an den REF-52-Zellen (71) durchgeführt. Die Ergebnisse der Versuche sind in Fig. 7 gezeigt. Die Konzentration des freien Ca²&spplus; im Cytosol (Ordinate, in umol/l) von FURA-2-beladenen 1321N1-Astrocytomzellen ist als Funktion der Zeit (Abszisse, in s) aufgetragen. Bei der mit 1 bezeichneten senkrechten punktierten Linie wurde 20 umol/l Inosit-1,4,5-triphosphatpropionyloxymethylester (5a, R = Et, R' = H) zugesetzt. Eine beträchtliche Anhebung des Ca²&spplus; im Cytosol wurde nach einer Verzögerungszeit von etwa 100 s beobachtet. Danach konnten die Zellen auf Carbachol (200 umol/l, zugegeben bei der mit 2 bezeichneten senkrechten punktierten Linie), einen Wirkstoff, der die endogene Erzeugung von Inosit-1,4,5-triphosphat anregt, reagieren. Die Reaktion auf Carbachol wird jedoch durch die vorausgehende Behandlung mit dem Inosit-1,4,5-triphosphatpropionyloxymethylester vermindert. Gleichermaßen wird die Ca²&spplus;- Reaktion auf Thapsigargin (100 nmol/l, zugegeben bei der mit 3 bezeichneten senkrechten punktierten Linie), einen anderen gespeichertes Ca²&spplus; freisetzenden Wirkstoff, vermindert.
  • Ein Versuch wurde ähnlich dem in Fig. 7 gezeigten durchgeführt, bei dem jedoch dem Medium extrazelluläres Ca²&spplus; fehlte und eine Dosis von 60 umol/l Inosit-1,4,5- triphosphatpropionyloxymethylester bei der mit 1 bezeichneten senkrechten punktierten Linie zugegeben wurde. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Fig. 8 gezeigt. Man beobachtete eine beträchtliche Steigerung des Ca²&spplus; im Cytosol nach einer Verzögerungszeit von 50 s. Da kein extrazelluläres Ca²&spplus; zugegen war, muss diese Reaktion eine Freisetzung aus intrazellulären Ca²&spplus;-Speichern darstellen. Danach war die Reaktion der Zelle auf Carbachol (200 umol/l, zugegeben bei der mit 2 bezeichneten senkrechten punktierten Linie) durch die vorangegangene Behandlung mit dem Inosit-1,4,5- triphosphatpropionyloxymethylester stark vermindert. Das viel größere Ausmaß der Hemmung der Reaktion auf Carbachol im Vergleich zum vorigen Beispiel (Fig. 7) ist bedingt durch die höhere Dosis Inosit-1,4,5- triphosphatpropionyloxymethylester und die Abwesenheit von extrazellulärem Ca²&spplus;, wodurch das Auffüllen der Ca²&spplus;-Speicher vermindert wird.
  • In einem weiteren Beispiel wurde der gleiche Test wie oben angegeben mit Astrocytomzellen durchgeführt, jedoch wurde 2 umol/l Inosit-1,4,5-triphosphatbutyryloxymethylester (5a, R = Pr, R' = H) anstelle des Propionyloxymethylesters verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Der Butyryloxymethylester ist etwas wirksamer, jedoch sind seine Wirkungen im Auftreten und Abklingen langsamer.
  • Die obigen biologischen Ergebnisse zeigen, dass neutrale, hydrophobe, membranpassierende Derivate von Inositphosphaten synthetisiert werden können und die erwartete biologische Aktivität zeigen, wenn sie extrazellulär auf intakte REF-52- Fibroblasten und Astrocytomzellen angewendet werden. IP&sub3;/PM setzte Ca²&spplus; aus internen Speichern frei, wie man es von einem Agens, das IP&sub3; nachahmt, erwarten würde.
  • Passierende Inositphosphatderivate wie oben beschrieben sind nützlich zur Untersuchung von Langzeitwirkungen bei Zellen, die nicht von [Ca²&spplus;]i im Cytosol als Mediator gesteuert werden. Beispielsweise sind mögliche Effekte auf die Proteinsynthese, die Phosphorylierung, die Proliferation (49) oder die Genexpression an mikroinjizierten, Patch-Clamp-fixierten oder permeabilisierten Zellen nur vergleichsweise schwer zu untersuchen.
  • Inositpolyphosphate gehören zu den meist verbreiteten und wichtigsten intrazellulären second messengers. Sie sind unumgänglich für die Sekretion und Wirkung der Hormone, die Kontraktion der glatten Muskeln, die Immunaktivierung, die Befruchtung und die Funktion der Neuronen. Wie vorstehend erwähnt ist das bestbekannte Inositpolyphosphat das myo- Inosit-1,4,5-triphosphat (IP&sub3;), welches durch Freisetzen von Ca²&spplus; aus intrazellulären Speichern wirkt. IP&sub3; erfährt einen weiteren Metabolismus zu einer Reihe von Inositpolyphosphaten von weitgehend unbekannter biochemischer Funktion. Ein Hauptproblem bei der Untersuchung der biologischen Funktionen von Inositpolyphosphaten ist deren Impermeabilität durch Membranen. Alle bestehenden Verfahren zum Einbringen exogener Inositpolyphosphate in Zellen erfordern das Durchlöchern ihrer Zellmembranen mittels Verfahren, welche die Lebensfähigkeit der Zellen gefährden und oft nur auf einzelne Zellen anwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Inositpolyphosphatderivate bieten eine Lösung dieses Problems, weil sie Membranen passieren und sich innerhalb der Zelle zu biologisch aktiven Inositpolyphosphaten regenerieren.
  • Die erfindungsgemäßen Acyloxyalkylester der phosphathaltigen second messengers können überall dort angewendet werden, wo die Einführung der second messengers in eine Zelle ohne Durchlöchern der Zellmembran oder anderweitigen ungünstigen Einfluss auf die Zelle erwünscht ist. Die vorliegende Erfindung kann die bestehenden Verfahren, die auf Mikroinjektions-, Patch-Clamp- oder Elektroporationstechnik zur Einführung von second messengers in Zellen beruhen, ersetzen.
  • Die Acyloxyalkylester werden in die ausgewählten Zellen eingeführt, indem man diese einfach den Estern in einem Nährboden oder einer anderen geeigneten Lösung aussetzt. Die Menge des in die Zelle eingeführten Esters kann durch Vermindern oder Erhöhen der im Nährboden vorhandenen Esterkonzentration gesteuert werden. Die Menge des in die Zelle eindringenden Esters kann auch durch Begrenzung der Zeitdauer, während der die Zelle dem Ester ausgesetzt ist, gesteuert werden.
  • Nachdem so beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, sollte der Fachmann verstehen, dass die darin enthaltene Offenbarung nur beispielhaft ist und die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt ist.
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Claims (21)

1. Stoffzusammensetzung mit dem Acyloxyalkylester eines phosphathaltigen second messenger der Formel
worin A&sub1; bis A&sub6; H, OH, F oder
ist, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H oder CH&sub3; ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist und worin mindestens einer der Reste A&sub1; bis A&sub6; ein Phosphorsäureester der oben angegebenen Formel ist.
2. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin A&sub1;, A&sub4; und A&sub5;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
3. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin A&sub1;, A&sub3;, A&sub4; und A&sub5;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
4. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin A&sub3;, A&sub4;, A&sub5; und A&sub6;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
5. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 2, worin R Ethyl oder Propyl und R' H ist.
6. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 3, worin R Ethyl oder Propyl und R' H ist.
7. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 2, worin A&sub3; H und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
8. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 3, worin A&sub3; F und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
9. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 5, worin A&sub3; H und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
10. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 5, worin A&sub3; F und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
11. Verfahren zur Steigerung der Permeabilität eines phosphathaltigen second messenger durch eine Zellmembran, umfassend den Schritt der Veresterung einer oder mehrerer der im second messenger vorhandenen Phosphatgruppen unter Bildung eines Acyloxyalkylesters des phosphathaltigen second messenger der Formel
worin A&sub1; bis A&sub6; H, OH, F oder
ist, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H oder CH&sub3; ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist und worin mindestens einer der Reste A&sub1; bis A&sub6; ein Phosphorsäureester der oben angegebenen Formel ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin A&sub1;, A&sub4; und A&sub5;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, worin A&sub1;, A&sub3;, A&sub4; und A&sub5;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, worin A&sub3;, A&sub4;, A&sub5; und A&sub6;
sind, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist.
15. Verfahren nach Anspruch 12, worin R Ethyl oder Propyl und R' H ist.
16. Verfahren nach Anspruch 13, worin R Ethyl oder Propyl und R' H ist.
17. Verfahren nach Anspruch 12, worin A&sub3; H und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
18. Verfahren nach Anspruch 12, worin A&sub3; F und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
19. Verfahren nach Anspruch 15, worin A&sub3; H und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
20. Verfahren nach Anspruch 15, worin A&sub3; F und A&sub2; und A&sub6; OH ist.
21. Verfahren zur Einführung von phosphathaltigen second messengers in eine Zeile ohne Zerstörung der Zellmembran, umfassend die Schritte
- Veresterung einer oder mehrerer der im second messenger vorhandenen Phosphatgruppen unter Bildung eines Acyloxyalkylesters des phosphathaltigen second messenger der Formel
worin A&sub1; bis A&sub6; H, OH, F oder
ist, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R' H oder CH&sub3; ist oder R CH&sub3; und R' CH&sub3; ist und worin mindestens einer der Reste A&sub1; bis A&sub6; ein Phosphorsäureester der oben angegebenen Formel ist
- Einführung dieses Acyloxyalkylesters des phosphathaltigen second messengers in die Zelle ohne Zerstörung der Zellmembran; und
- Ermöglichen der Spaltung des Acyloxyalkylesters des phosphathaltigen second messenger in der Zelle unter Bildung des phosphathaltigen second messenger.
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