JPH11508240A

JPH11508240A - 膜透過性第２メッセンジャー

Info

Publication number: JPH11508240A
Application number: JP9502088A
Authority: JP
Inventors: ワイ．ツイエン，ロジャー; シュルツ，カーステン; リ，ウェンホング
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-21
Also published as: AU6109996A; DE69624121D1; US5834436A; AU709883B2; EP0842181A1; WO1996040695A1; EP0842181A4; EP0842181B1; CA2220994A1; ATE225355T1; DE69624121T2

Abstract

(57)【要約】細胞膜を透過しうるホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステル。細胞内に入るとエステル誘導体は第２メッセンジャーの生物学的活性形に酵素転換される。アシルオキシアルキルエステルは式（Ｉ）を有し、式中Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（II）であり、式（II）中Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃であり、またはＲはCH₃およびＲ′はCH₃であり、およびＡ₁〜Ａ₆のうち少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである。

Description

【発明の詳細な説明】膜透過性第２メッセンジャー発明の背景これは１９９３年４月９日提出の同時係属出願番号０８／０４５，５８５号である。本発明はナショナルインスティテュートオブヘルスにより授与された許可番号ＮＳ−２７１７７号下で政府の支持により作成された。政府は本発明についてある程度の権利を有する。１．発明の分野本発明は一般に第２メッセンジャーのような生物学的に重要なホスフェートに関する。特に、本発明は第２メッセンジャーを改変して細胞膜を破壊せずに細胞中に導入できる誘導体を形成することに関する。細胞内に入ると、誘導体は生物学的に活性の第２メッセンジャーに転換復帰する。２．関連技術の記載発明の背景を記載し、その実施に関し付加的詳細を供するためにここに引用した刊行物および他の参考物質は参考のために加える。便宜上、参考物質は番号を付し、添付参考文献に類別する。第２メッセンジャーは細胞膜から細胞の内部の目標に情報を運ぶイオンまたは小分子である。これらは生物学的シグナル形質導入および増幅に主要な役割を演ずる（１）。アデノシン３′，５′−環状モノホスフェート（ｃＡＭＰ）（２，３）、グアノシン３′，５′−環状モノホスフェート（４）（ｃＧＭＰ）、ミオ −イノシトール−１，４，５−トリホスフェート（１，４，５）ＩＰ₃）またはミオ−イノシトール−１，３，４，５−テトラキスホスフェート（１，３，４，５）ＩＰ₄）（５）のような大部分の既知第２メッセンジャーの通常の特徴はホスフェートの存在である。これらのホスフェートの正確な数および位置は生物学的特異性に必須であり、極端な親水性も付与する（６，７）。第２メッセンジャーの親水性は内因的に発生する分子が細胞から漏出することを防止する。結果として、高感受性は応答細胞内に維持され、隣接細胞間で物質が自由に流通できる。しかし第２メッセンジャーの膜不透過性は、たとえこのようなものの介在がしばしば研究または治療理由に対しきわめて有用であるとしても、計画的細胞外適用を困難または無効にする（２，６，８）。ホスフェートは含有化合物を細胞中に導入する１つのアプローチはマイナス荷電のホスフェート化合物を細胞膜を通して輸送する場合中性の化合物に可逆的に転換する保護基の使用を含む。保護基は細胞内でホスフェート化合物から酵素的に開裂して初めのホスフェート化合物を生成するように選択される。例えば、親油性で、細胞内で加水分解できる誘導体はアミノ、ヒドロキシルおよびカルボキシレート部分に対し有用であった（９〜１２）。ポリカルボキシレートのアセトキシメチル（ＡＭ）エステルカチオン指示薬およびキレート剤も使用されている（１２〜１４）。ホスフェートに適用される類似のアシルオキシアルキルエステルは既知であるが、これらの開発は少なかった（１５）。簡単なモデルのホスフェートに対し、ＡＭエステルの使用はホスフォノホルメート（ホスカーネット）（１６）のような可能な治療薬剤、５−フルオロ−２′ −デソキシウリジンモノホスフェート（１７，１８）のような抗ウイルス性ヌクレオチド、およびインスリンレセプターキナーゼ（１９）の３−ホスフォネート含有阻害剤に限定された。ホスフォノホルメートエステルは正しい生成物（１６）に加水分解できなかったため生物学的に有用でないことが証明されたが、エステル化は抗ウイルス性ヌクレオチドおよびキナーゼ阻害剤（１７〜１９）の効力を高めることが分かった。かなりの研究はＡＴＰの光分解性（「ケージド」（caged））誘導体（２０）、環状ヌクレオチド（２１，２２）およびイノシトールホスフェート（２３）としてＯ−ニトロベンジルエステルに対し行なわれた。しかし膜透過性を得る一般的方法としてよりもむしろ、モノエステルから遊離した活性ホスフェート代謝物（２４，２５）に動力学的に速く、かつ完全な転移が行われることが強調された。さらに、ニトロベンジルエステルはマイナス荷電をマスクするのに１つ以上が必要である場合やっかいである。これは複数基はかなりの嵩高さを増し、すべての基を開裂させるにはＵＶの高用量を必要とするからである。多数の異るミオ−イノシトールポリホスフェートは可能であるが、僅かに約１２種が細胞に見出されている。その細胞内機能ではミオ−イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ₃）を除いて論争があり、または未知である。ＩＰ₃は細胞内第２メッセンジャーとして内部貯蔵からCa²⁺を遊離する役割を有することは疑いがない（２６）。次のもっとも研究されたイノシトールポリホスフェートはミオ−イノシトール１，３，４，５−テトラキスホスフェート（ＩＰ₄ ）であり、これはＩＰ₃と共同してプラズマ膜にCa²⁺チャネルを開け（２７〜３０）またはＩＰ₃が遊離したCa²⁺を再捕捉する（３１，３２）とされる。しかし、これらの仮説は尚論争の中にある（３３〜３７）。他のイノシトールポリホスフェートに対しては細胞内機能について全く未知である。イノシトールポリホスフェートの役割の詳細な論述は、これらがアゴニストに応答して内因的に発生する場合、このような刺激は複数のレセプター、Ｇタン白、ジアシルグリセロール形成、複数のイノシトールポリホスフェートおよび尚他の形質導入径路に影響を与えるのでしばしば困難である。特異的イノシトールポリホスフェートの直接導入はしばしば好ましい。高マイナス荷電のイノシトールポリホスフェートは無視しうる受動的膜透過性を生ずる。イノシトールホスフェートを導入する現存方法はマイクロインジェクション、パッチ−クランプ手法、およびエレクトロポレーション (electroporation)による透過、サポニンのような洗浄剤、または細胞外Ca²⁺の除去を含む。すべてのこれらの方法は細胞膜を破壊し、一層複雑な機能および長期の細胞生存能力を危険にする。さらに、マイクロインジェクションおよびパッチ技術は一度に数個の細胞にのみ適用できる。上記の観点から、第２メッセンジャーが調査または治療目的に有用の量で細胞に有効に導入できるように第２メッセンジャーの膜透過性を増加する方法を供する必要がある。発明の要約本発明によれば、ホスフェート含有第２メッセンジャーの細胞透過性を細胞膜を破壊せずに増加する組成物および方法が供される。発明は第２メッセンジャー分子に含まれるホスフェート基をエステル化してアシルオキシアルキルエステル誘導体を形成することを含む。第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルは中性荷電を有し、従って細胞膜を破壊せずに細胞に透過できる。細胞内に入ると、エステルは開裂して分子をその生物学的活性形に転換、復帰させる。アセトキシメチルエステルは環状ヌクレオチドに対し十分に作用するが、イノシトールホスフェートに対しては疎水性が十分でないことが分かった。プロピオニルオキシメチルおよびブチリルオキシメチルエステルは後者の種類に対し好ましい。本発明のさらに任意の特徴として、第２メッセンジャー分子に含まれるヒドロキシル基は誘導体の合成においてマスクされ、さらに第２メッセンジャー誘導体の細胞透過性を増加する。ヒドロキシル基はアシル基（１〜４個の炭素原子）でマスクする。このアシル基は、改変第２メッセンジャーが細胞中に入ると容易に開裂できる。ブチリル基は最適マスキングを供することが分かったが、一方尚細胞酵素により容易に開裂される。本発明のそれ以上の特徴として、８−置換環状ヌクレオチドをエステル化およびアシル化してその細胞透過性を増加する。これらの合成ヌクレオチドは調査および治療目的に対し有用である。本発明により供された透過性の増加は８−置換環状ヌクレオチドを細胞に導入する有利な方法を供する。本発明の１面として、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのような環状ヌクレオチドのホスフェートおよびヒドロキシ基はエステル化し、アシル化して中性誘導体を形成する。これらの中性誘導体は細胞膜を横切り、細胞内に入るとその活性形に転換することが分かった。ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの細胞中への導入は調査および治療目的の双方に有用である。本発明の他の面は、イノシトールトリホスフェートおよびイノシトールテトラホスフェートなどの第２メッセンジャーのエステル化を含む。形成中性誘導体は細胞中に透過し、細胞内に入るとその活性形に転換、復帰することが分かった。イノシトールホスフェートの細胞中への導入は調査および治療目的の双方に有用である。アセトキシメチル基を有するイノシトールホスフェートのエステル化は有用である細胞透過性の十分な増加を与えないことが分かった。一層疎水性のエステルが必要であることが分かった。アセトキシメチル基をプロピオニルオキシメチルおよびブチリルオキシメチル基で置換することによりイノシトールホスフェートエステルを生成し、これは細胞透過割合がはるかに大きく、一方尚細胞内開裂して活性イノシトールホスフェートを形成しやすい。この高度の細胞透過性を有するイノシトールホスフェートは式〔式中、Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃ であり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）であり、Ａ₁〜Ａ₆のうち少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである〕を有するものを含む。本発明の上記および多くの他の特徴および付随利点は、添付図面と関連させる場合、以下の記載を引用することにより一層よく理解されるであろう。図面の簡単な記載図１はＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭのキナーゼ活性能力を他の誘導体と比較して示す試験結果の４つのグラフである。図２ＡはＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭのCl 分泌開始を示す試験結果のグラフである。図２ＢはＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭおよび他の誘導体により開始されたクロリド分泌の比較を示すグラフである。図３Ａは魚の皮膚の色素細胞を分散させるＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭの能力を実証する試験結果を示す。図３Ｂは図３Ａに示す分散の可逆性を実証する試験結果を示すグラフである。図４は３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステルを製造する合成図を示す。図５は模範的イノシトールホスフェートエステルの合成図である。図６はイノシトールトリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステル（ＩＰ₃／ＰＭ）のＲＥＦ−５２線維芽細胞中への透過を示す試験結果である。図７は細胞外Ca²⁺を含有する媒体で２０μモル（μｍ）用量でＩＰ₃／ＰＭのアストロサイトーマ細胞中への透過を示す試験結果である。図８は細胞外Ca²⁺を欠く媒体で６０μモル用量でＩＰ₃／ＰＭのアストロサイトーマ細胞中への透過を示す試験結果である。図９は細胞外Ca²⁺を含有する媒体で２μモル用量でイノシトールトリホスフェートブチリルオキシメチルエステル（ＩＰ₃／ＢＭ）のアストロサイトーマ細胞中への透過を示す試験結果である。好ましい態様の記載本発明は第２メッセンジャーおよびホスフェートを含むその誘導体をこれらが細胞膜を破壊せずに容易に細胞中に導入できるように改変することを目的とする。本発明は第２メッセンジャーに含まれるホスフェート基をエステル化して細胞膜を通して容易に拡散できる中性アシルオキシアルキル誘導体を形成することを含む。アシル基は６個までの炭素原子を含有でき、アルキル基の１位置に位置する。アルキル基は７個までの炭素原子を含有できる。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの場合アセトキシメチルエステルは最適細胞膜輸送を供する一方で、尚細胞中に入った後第２メッセンジャーから開裂しやすいことが分かった。イノシトールホスフェートのアセトキシメチルエステルは最適の細胞透過性でないことが分かった。複数ホスフェート基を有する第２メッセンジャーの場合、すべてのホスフェート基はプロピオニルオキシメチルまたはブチリルオキシメチルエステルとしてマスクすることが好ましい。本発明は広範囲のホスフェート含有第２メッセンジャーおよびその誘導体の細胞透過性を増加するために適用できる。好ましい模範的ホスフェート含有第２メッセンジャーはｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、１，４，５ＩＰ₃、１，３，４，５ＩＰ₄およびミオ−イノシトール３，４，５，６−テトラキスホスフェートを含む。本発明は環状ヌクレオチド誘導体にも適用できる。模範的誘導体はｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの８−置換誘導体を含む。８−置換誘導体は８−ブロモ−ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ、８−クロロ−ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰおよび８−パラ−クロロフェニルチオ（ｃＣＰＴ）ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰを含む。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの場合ホスフェート含有第２メッセンジャーのヒドロキシル基は合成中マスクまたは保護することが好ましい。４個までの炭素原子を有するアシル基によるマスキングが好ましい。より大きいアシル基はこれらは細胞が第２メッセンジャーから開裂することが一層困難であるので好ましくない。本発明によるｃＡＭＰ／ｃＧＭＰアセトキシメチルエステルの合成および使用を示す実施例は次の通りである：プロトンおよび³¹ＰＮＭＲスペクトルをCDCl₃で得た。残留CHCl₃（δ＝７. ２６）は¹Ｈスペクトルに対する内部標準として使用する。８５％リン酸は³¹Ｐスペクトルに対する外部標準として使用した。すべてのＮＭＲスペクトルはバリアンジェミニー２００(２００MHz)またはゼネラルエレクトリックＱＥ−３００( ３００MHz)分光光度計で記録し、次の略語で報告する：ｓ，単線；ｄ，二重線；ｔ，三重線；dd，二重線のうちの二重線；ｍ，コンプレックス多重線。急速原子衝撃マス分光分析法（マトリックスとしてグリセロール）および正確なマス測定をカリホルニアリバサイドの大学のマス分光分析設備により行なった。毛管電気泳動はダイオネクスＣＥＳで行なった。合成に使用したピリジンおよびアセトニトリルは少なくとも３日間（３ｄ）活性化分子篩（３Å）に置いた後貯蔵した。すべての他の溶媒は入手しうる最高純度のものを購入し、受け入れた時使用した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はCaH₂から蒸留した。アセトキシメチルブロミド（ＡＭ−Ｂｒ）は既知方法により製造した（３８）。ヌクレオチドはすべてシグマからのものであった。フェニルホスフォン酸はフルカ、スイスからであった。４−メチルウンベリフェリルホスフェートはベーリンガー、ＦＲＧからであった。他の試薬はすべてアルドリッチからであった。 ^aＭ⁺ ホスフェート含有出発材料に対する対イオンの特定、ＨＤＩＥＡ⁺＝ジイソプロピルエチルアンモニウム、^b収量特記しない限り重量収量、^c双方のジアステレオマーに対するシフト値。表Ｉに示す化合物は下記のように合成した。化合物１〜３は比較目的のため合成した。化合物４ａ／ｂ（ｃＡＭＰ／ＡＭ）および５ａ／ｂ（ｃＧＭＰ／ＡＭ）は本発明による好ましい模範的化合物である。４−メチルウンベリフェリルホスフェートビス（アセトキシメチル）エステル（１）の合成：４−メチルウンベリフェリルホスフェートのジリチウム塩（２００mg、０．７４ミリモル）を水に溶解し、酢酸銀の濃溶液を添加した。ジ銀４− メチルウンベリフェリルホスフェートがすぐに沈澱し、濾過し、水洗し、光る銀 −白色粉末に乾燥した（収量：２７７mg、７９％）。銀塩（６０mg、０．１３ミリモル）は１mlの乾燥CH₃CNに懸濁し、５０mg（０．３３ミリモル）のＡＭ−Ｂｒを添加した。頻繁に混合物を超音波浴（ブランソンＢ−２２０）で一度に２分処理した。¹ＨＮＭＲによる頻繁な検査により４時間後反応が完了したことが分かった。上澄は蒸発乾燥して３８mg（７２％）の４−メチルウンベリフェリルホスフエートビス（アセトキシメチル）エステル（１）を収得した：¹H NMR(CDC l₃,200MHz)δ2.12(s,6H),2.43(s,3H),5.73(dAB,4H，J_AB=5.5Hz,J_PH=14.2Hz,-CH₂ -),6.27(s,1H,H3),7.17-7.25(m,2H,H6,H8),7.59(m,1H,H5);³¹P NMR(CDCl₃,121.5 MHz)δ-9.1;MS m/z(M+H)⁺計算値401.0638，測定値401.0625. ホスフェートトリス（アセトキシメチル）エステル（２）の合成：銀ホスフェート（３０mg、７１μモル）を０．５mlの乾燥CH₃CNに懸濁し、ＡＭ−Ｂｒ（２２mg、１４５μモル）を添加した。室温で２０時間頻繁な音波処理後、別の１５ mg（１００μモル）のＡＭ−Ｂｒを添加した。懸濁固体の黄色が消失すると混合物を遠心分離（１０００rpm、１分）し、上澄は蒸発乾燥し、残留物は乾燥トルエンで洗浄してホスフェートトリス（アセトキシ−メチル）エステル（２）を透明油として得た（収量９８％）。¹H NMR(CDCl₃,200MHz)δ2.15(s,9H),6.45(d,6H ,J_PH=13.5Hz);³¹P NMR(CDCl₃,121.5MHz)δ-2.25;MS m/z 241(M-CH₂OAc)^-. フェニルホスフォネートビス（アセトキシ−メチル）エステル（３）の合成：フェニルホスフォン酸（３１．６mg、０．２ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３０mg、１．０ミリモル）を１mlの乾燥CH₃CNに溶解した。ＡＭ−Ｂｒ（７７mg、０．５ミリモル）を添加し、溶液は室温で一夜攪拌した。溶媒の蒸発後、固体残留物は乾燥トルエンで抽出した。粗生成物（３）の精製は７５％トルエン／２５％酢酸エチルによりSi６０カラム（１０×４０mm）で行ない、透明油として５２mgの３（８６％）を得た。¹H NMR(CDCl₃,200MHz)δ 1.95(s,6H),5.66(dAB,4H,J_AB=5.3Hz,J_PH=13.8Hz,-CH₂-),7.30-7.55(m,3H),7.70( m,2H).³¹P NMR(トルエン-d₈,121.5MHz)δ18.70. Ｎ⁶，Ｏ²'−ジブチリルアデノシン３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステル−ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭ（４ａ／４ｂ）の合成：異る２方法を使用してｂｔ²−ｃＡＭＰ／ＡＭを合成した。方法Ａ：Ｎ⁶，Ｏ²'−ジブチリルｃＡＭＰ（１２．５mg、２５μモル）を１mlのMeOH−H₂O（１：１）に溶解し、ダウエクス５０Ｗ−Ｘ８カラム（１０×４０mm、Ｈ⁺形）に通した。遊離酸は１５mlの５０％MeOHで溶離した。乾燥蒸発後、ＤＩＥＡ（６mg、５０μモル）および１mlの乾燥CH₃CNを添加した。反応はＡＭ−Ｂｒ（１６mg、９４μモル）を添加して出発させた。室温で４日間溶液を攪拌後、反応混合物はSi６０カラム（１０×４０mm、２３０〜４００メッシュ）で微加圧下に溶離液として９５％CH₃CN ／５％ヘキサンにより直接クロマトグラフした。溶離液は５ml画分で集めた。５〜７の画分は溶離の速い５．３mg（３８％収量）のジブチリルｃＡＭＰアセトキシメチルエステル（４ａ）のジアステレオマーを高純度で含有した。¹H NMR(CDC l₃,300MHz)δ1.05(t,3H,J=7.0Hz),1.12(t,3H,J=7.0Hz),1.74(m,2H)，1.84(m,2H) ,2.20(s,3H),2.51(m,2H),2.95(t,2H,J=7.0Hz),4.36(ddd,1H,J=2.7，10.1,10.1Hz ,H4'),4.49(dd,1H,J=10.0,10.0Hz，H5’_ax),4.66(dddd,1H,J=2.7，10.0,10.0,22 .1Hz,H5’_eq),5.67-5.95(m,4H,-CH₂-,H2',H3'),6.04(s,1H,H1')，8.01(s,1H,H2) ,8.49（ブロードs,1H,N⁶H),8.78(s,1H,H8);³¹P NMR(CDCl₃,121.5MHz)δ-5.0ppm. ８＋９の画分は８．７mgの透明油を得、これはジイソプロピルエチルアンモニウムブロミドおよび溶離の遅い４ｂのジアステレオマー（２：１ｗ／ｗ，ＮＭＲにより測定、収量２．９mg４ｂ、ジブチリル−ｃＡＭＰから２１％）を含有した。¹H NMR(CDCl₃,200MHz)，δ0.99(t,3H,J=7.0Hz),1.05(t,3H,J=7.5Hz),1.70(m,4 H),2.18(s,3H),2.45(t,2H,J=7.0Hz),2.89(t,2H,J=7.5Hz),4.40-4.70(m,3H,H4'， H₅’_eq,H5'_ax),5.62-5.78(AB-部分of ABX,2H,J_AB=5.1Hz,-CH₂-),5.83(m,2H,H2', H3'),6.01(s,1H),8.02(ブロードs,1H,H2),8.51(ブロードs,1H,N⁶H),8.69(s,1H,H 8);³¹P NMR(CDCl₃,121.5MHz)δ-8.0ppm;MS(4a/4b 1:1混合物)m/z(M+H)⁺計算値54 2.1652，測定値542.1681. 方法Ｂ：５８mg（０．１２ミリモル）のＢｔ₂ｃＡＭＰのナトリウム塩を０．５mlのH₂Oに溶解し、３００μＬの１．８M AgNO₃溶液を添加した。生成した白色沈澱を濾別し、水洗し、乾燥して３０．５mg（４５％、５４μモル）のＢｔ₂ｃＡＭＰの銀塩を得た。白色粉末は１mlの乾燥CH₃CNに懸濁し、５１mg（３３０ μモル）のＡＭ−Ｂｒを添加した。懸濁液は室温で４時間頻繁に音波処理した。２種の生成したジアステレオマーアセトキシメチルエステル４ａおよび４ｂは、方法Ａに記載のように精製して２．８mgの溶離の速いアイソマー４ａ（１０％収量）および９．６mg（３５％）の溶離の遅いジアステレオマー４ｂを得た。Ａ，Ｂ両方法の生成物のＮＭＲおよびＭＳ分析は同一であった。Ｎ²，Ｏ²'−ジブチリルグアノシン３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステルｂｔ₂ＧＭＰ／ＡＭ（５ａ／５ｂ）の合成：Ｂｔ₂ｃＧＭＰ（２４mg、４７μモル）のナトリウム塩をダウエクス５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ⁺形）に通し、遊離酸を１５mlの５０％MeOHで溶離した。乾燥蒸発後、１mlの乾燥アセトニトリル、１３mg（１００μモル）のＤＩＥＡおよび２１mg（１３５μモル）のＡＭ−Ｂｒを添加した。溶液は一夜攪拌し、蒸発乾燥し、CH₃CN／ヘキサン（９５：５、ｖ／ｖ）に溶解し、Si６０カラム（１０×４０mm）上で溶離して混合物としてジブチリルｃＧＭＰ−ＡＭ（５ａ／５ｂ）の２つのジアステレオマーを１１mg（４０％）得た。¹H NMR(5aのみ,CDCl₃,200MHz)δ1.00(m,6H),1.74(m,4H),2 .38(s,3H),2.42(m,2H),2.48(m,2H),4.18(ddd,1H,J=4.0,10.0,10.0Hz,H4'),4.30- 4.54(m,2H,H5’_ax,H5'_eq),5.13(ddd,1H,J=1.8,4.1,10.0HZ,H3'),5.56(dd,1H,J=4 .1,4.1Hz,H2'),5.71(dAB,2H,J=12.5,9.1Hz,-CH₂-),6.04(d,1H,J=4.0Hz,H1'),7.6 5(ブロードs,1H,N²H),10.14(s,1H,H8),12.30(ブロードs,1H,N¹H)；³¹P NMR (CD Cl₃,121.5MHz)δ-5.5および-8.5ppm; MS m/z(M+H)⁺計算値558.1601，測定値558. 1611. アセトキシメチルホスフェートエステルに対するもっとも一般的かつ経済的合成ルートはアセトキシメチルハライドによる出発ホスフェートアニオンのアルキル化であるとされる。アセトキシメタノールの不安定性はそのリン酸化を妨げる。 SrivastaおよびFarquhar（１５）の試験と同様の予備合成試験は、ＵＶ吸収により検知でき、かつ競争求核中心を有しない容易に入手しうるモデル化合物として４−メチルウンベリフェリルホスフェートおよびフェニルホスフォネートに対し行なった。４−メチルウンベリフェリルホスフェートビス（アセトキシメチル）エステル（表Ｉ−１）は４−メチルウンベリフェリルホスフェートのジ銀塩を乾燥アセトニトリルに懸濁し、アセトキシメチルブロミド（ＡＭ−Ｂｒ）（３８）を添加し、次いで２４時間に頻繁に不均質混合物を音波処理することにより７３％収量で製造に成功した。上澄の¹ＨＮＭＲによりアセトキシメチルエステルのメチレン基に対し５．７ppmでＡＢ二重線が示され、ここで報告したすべてのホスフェートアセトキシメチルエステルの代表的パターンであった。ホスフェートトリス（アセトキシメチル）エステル（表Ｉ−２）の合成は反応の進行を直接監視する可能性が与えられた。黄色Ag₃PO₄は上記のようにＡＭ−Ｂｒと反応した。３６時間後色の消失により反応の完了が分かった。生成物は有機相において唯一の化合物であった（９８％収量）。銀塩の別法は、ポリホスフェートまたは酸化官能基を有する分子が望ましい。過剰のヒンダードベースジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびＡＭ− Ｂｒによるフェニルホスフォン酸の直接処理により最終的にフェニルホスフォネートビス（アセトキシ−メチル）エステル（表Ｉ−３）を８６％収量で得る。低収量であるが、類似反応をＮ⁶，２′−Ｏ−ジブチリルアデノシン３′，５ ′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステル（Ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭ、４ａ／４ｂ）およびＮ²，２′−Ｏ−ジブチリルグアノシン３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステル（Ｂｔ₂ｃＧＭＰ／ＡＭ、５ａ／５ｂ）に対し行なった。商品として入手しうるＢｔ₂ｃＡＭＰおよびＢｔ₂ｃＧＭＰのナトリウム塩をダウエクス５０Ｗ−Ｘ８上で遊離酸に、次いでＤＩＥＡ塩に転換した。反応は室温で５日間乾燥CH₃CN中で過剰のＤＩＥＡおよびＡＭ−Ｂｒにより行なった。双方のヌクレオチドＡＭ−エステルは溶媒の蒸発後シリカゲル６０（CH₃CN／ヘキサン１９：１ｖ／ｖ）上で精製した。Ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭ（４ａ／４ｂ）の２つのジアステレオマーを溶離の速いおよび遅いアイソマーに３７％および２１％の収量で単離した。遅いアイソマーは残留ＤＩＥＡと同時に溶離した。³¹Ｐ−ＮＭＲ共鳴はそれぞれ−５．０ppmおよび−８．０ppmであったが、絶対的配置は決定されなかった。Ｂｔ₂ｃＧＭＰ／ＡＭ（５ａ／５ｂ）の類似の２つのジアステレオマーは上記條件下で分離できなかったが、ＤＩＥＡは含まれなかった。Ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭも２４時間に頻繁に音波処理してＢｔ₂ｃＡＭＰの銀塩をCH₃CN中のＡＭ−Ｂｒによりアルキル化することにより製造した。これらの不均質條件はエナンチオマーの選択を逆転し、移行性の速いアイソマーを１０％および遅いアイソマーを３５％収量で得た。上記ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの合成はブチリル基を利用してヒドロキシル基をマスクまたは保護する。これはｃＡＭＰまたはｃＧＭＰをそのアセトキシエステルに直接転換することはごく微量の生成物しか得られないからである。トリメチルシリル（ＴＭＳ）基も保護基として十分に作用することが分かった。直接およびＴＭＳ保護合成の合成図は図８に示す。ＴＭＳを使用するｃＡＭＰアセトキシエステルの合成は下記する：一般法−プロトンおよび³¹ＰＮＭＲはCDCl₃で得た。残留CHCl₃（δ＝７．２６）は¹Ｈスペクトルに対し内部標準として使用する。８５％リン酸は³¹スペクトルに対し外部標準として使用した。すべてのＮＭＲスペクトルはバリアンジェミニー２００(２００MHz)またはゼネラルエレクトリックＱＥ−３００(３００MH z)分光光度計で記録し、上記例におけるように同じ略語で報告する。アセトニトリルは少なくとも３日間活性化分子篩（３Å）後貯蔵した。他のすべての溶媒は入手しうる最高純度のものを購入し、受け入れた時使用した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はCaH₂から蒸留した。アセトキシメチルブロミド（ＡＭ−Ｂｒ）は既知方法に従って製造した。ｃＧＭＰはＩＣＮまたはカルバイオケムからのものであった。他のすべてのヌクレオチドはシグマからであった。他のすべての試薬はアルドリッチからであった。次の合成の３工程は図４に概述する。２′−Ｏ−トリメチルシリルアデノシン３′，５′−環状ホスフェートの合成（図４−Ａ）ｃＡＭＰの遊離酸（５０mg、０．１５ミリモル）を３mlの乾燥ＤＩＥＡに懸濁した。１mlのヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）および０．５mlのトリメチルシリルクロリド（ＴＭＳ−Cl）をAr下に添加し、混合物は１００℃で３時間加熱した。室温に冷却後、すべての揮発性成分は高真空で蒸発除去した。残留油は２× ２mlの乾燥トルエンで抽出した。Ｎ⁶，２′−Ｏ−ジ（トリメチルシリル）アデノシン３′，５′−環状モノホスフェートトリメチルシリルエステルを独占的に含有する抽出試料は蒸発乾燥し、ＮＭＲにより分析した：¹H NMR(トルエン-d_g， 200MHz)ジアステレオマー１(80%)δ0.32(s,9H),0.45(s,9H),0.47(s,9H),4.15- 4.61(m,3H,H4'，H5’_eq，H5'_ax),4.98(d,1H,J=4.7Hz,H2'),5.60(s,1H,N⁶H),5.74 (ddd,1H,J=1.6,4.7,9.5Hz,H3'),5.83s,1H,H1',7.64(s,1H,H2),8.6(s,1H,H8).ジアステレオマー2(20%)δ4.65(d,1H,J=4.2Hz,H2'),5.20(m,1H,H3'),5.66(s,1H,N⁶ H),6.05(s,1H,H1'),7.77(s,1H,H2),8.58(s,1H,H8). トルエン抽出物は１２μＬのMeOH（０．３ミリモル）で３分処理し、次いで溶媒を急速蒸発させた。残留白色固体のかなりの純度の２′−Ｏ−ＴＭＳ−ｃＡＭＰ（１）を得た。¹H NMR(CD,OD,200MHz)δ0.80(s,9H,TMS),4.32(m,3H,H4',H5'),4. 65(d,1H,J=8.2Hz,H2'),4.95(m,1HH3'),6.12(s,1H,H1'),7.16(ブロードs,2H,NH₂) ,8.40,8.45(2s,1H each,H2,H8).³¹H-NMR O. ２′−Ｏ−トリメチルシリルアデノシン３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステルの合成（図４−Ｂ）。２５mg（０．０６２ミリモル）の２′−ＴＭＳ−ｃＡＭＰ（１）をAr下に０．０５mlのＤＩＥＡ（０．２８ミリモル）を含有する０．５mlの乾燥CH₃CNに溶解し、次いで０．０２８ml（０．２８ミリモル）のＡＭＢｒを添加した。混合物は室温で３日間攪拌し、次いで蒸発乾燥した。粗生成物はSi６０カラム（４×１．５ cm）上で溶離液としてヘキサン飽和の乾燥CH₃CNにより精製した。分離前カラムは０．１％酢酸を含有する同じ溶離液により、次に溶離液のみで洗浄した。ＨＤＩＥＡ⁺Ｂｒ直前に溶離した大部分の２′−Ｏ−ＴＭＳ−ｃＡＭＰ／ＡＭ（２）は２０．５mg（０．０４２ミリモル、６８％）の収量を得た。生成物は³¹ＰＮＭＲにより測定して９０％のＲ_p／Ｓ_pジアステレオマーの１つから成っていた。¹ H NMR(CDCl₃,300MHz)δ0.22(s,9H,TMS),2.16(s,3H,-OCCH₃),4.43(m,2H,H4',H5 ’_ax)，4.64(m,1H,H5’_eq),4.85(d,1H,J=5.2HZ,H2'),5.34(m,1H,H3'),5.74(d,2H ,J=13.1Hz,-CH₂-OAc),4.86(ブロードs,2H,NH₂),5.91(s,1H,H1'),7.87および8.41 (2s,1H each,H2およびH8)．³¹PN MR(CDCl₃,121.5MHz)δ-7.58(90%),-4.62(10%). アデノシン３′，５′−環状モノホスフェートアセトキシメチルエステルの合成（図４−Ｃ）。１４mg（０．０２９ミリモル）の２を１mlの１：１（ｖ／ｖ）CHCl₃／CH₃CN混合物に溶解し、次いで２μＬのＨＦ（４９％）を添加した。混合物は渦巻状に２分攪拌し、次いで溶媒は蒸発除去し、白色固体としてｃＡＭＰ／ＡＭ（３）を定量的に得た。¹H NMR(CD₃OD,300MHz)δ2.17(s,3H,-OAc),4.48(ddd,1H,J=3.6,9.5, 9.5Hz,H4'),4.50(m,1H,H5'_ax)，4.74(m,1H,H5'_eq),5.33(ddd,1H,J=1.0,4.8,12.3 Hz,H3'),5.75(m,2H,-CH₂-OAc),6.15(s,1H,H1'),8.41および8.42(2s,1H each,H2, H8).³¹P NMR(CD₃OD,121.5MHz)δ-6.85. 次の生物学的試験を行なって細胞内に入った後のｃＡＭＰ誘導体の生物学的活性を実証した。細胞内タン白キナーゼＡの活性。大部分の細胞内のｃＡＭＰの第一の目標はｃＡＭＰ−依存性タン白キナーゼ（ＰＫＡ）（４５）である。この酵素がＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭの細胞外適用により活性化できることを示すために、１個の細胞中のＰＫＡ活性化のために最近開発されたアッセー（３９）を使用した。ＰＫＡは、触媒サブユニットにフルオレセインおよび正規のサブユニットにローダミンで二重に標識してＦＩＣＲｈＲを生成させる場合、フルオレセインからローダミンへの蛍光エネルギーの移行がホロ酵素複合体に生じるが、サブユニットが活性化および解離すると破壊される。フルオレセイン対ローダミン比の変化はキナーゼ活性の増加と平行して現れ、１個の細胞中に非破壊的に映し出される。ＲＥＦ−５２線維芽細胞にＦＩＣＲｈＲをマイクロ注入し、上記のように（２７）室温で放出比の像を記録した。注入後３０分で、０．１、１または１０μMのＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭを細胞外に添加した（図１−グラフＡ）。最高用量で１５分内に蛍光比に最大の変化を生じた。中間用量は一層浅い勾配および最大変化の５０％を僅かに超える一層低い平坦さとなった。ＦＩＣＲｈＲの正規および触媒サブユニットの分離はｃＡＭＰ誘導体の添加後およそ２分で起こった。ほとんど同じ遅れおよび全体の時間経過は非エステル化Ｂｔ₂ｃＡＭＰにより生じたが、はるかに高濃度、１ミリモルが必要であった（図１−グラフＢ）。他の広く使用され、親油性と推定されるｃＡＭＰ誘導体は初めに遅れを全く示さずＰＫＡを活性化したが、尚ミリモル濃度が必要であった（図１−グラフＣおよびＤ）。エステル基の細胞内酵素加水分解が必要であることを示すために、試験管内でＦＩＣＲｈＲに対するＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭおよびＢｔ₂ｃＡＭＰの結合性を試験した。他のアッセイで使用する最高濃度のＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭ（１０μモル）はサブユニットの分離を生じなかったが、一方Ｂｔ₂ｃＡＭＰは、おそらく供給者（シグマ）が特定した１％モノブチリルｃＡＭＰによる汚染のためｃＡＭＰと同じ約１／１００の効力であった（表II参照）。 ^aＢｔ₂ｃＡＭＰの僅かな残留活性は多分供給者が特定したＮ⁶−モノブチリルｃＡＭＰ（１％）に基くものであろう。^b２００μモルｃＡＭＰはＦＩＣＲｈＲを完全に解離するために必要な最高用量と考えられた。^c標識ｃＡＭＰ依存性キナーゼＩ型（ＦＩＣＲｈＲ）。この標識イソ形は標識したII型よりこのアッセイで使用する低酵素濃度でｃＡＭＰが存在しない場合サブユニットの解離に対し一層安定である。ｃＡＭＰにより調整される多数の周知の細胞機能の１つは腸上皮からのCl^-分泌である（４６）。有利な試験システムは腸細胞ラインＴ₈₄であり、ここでクロリドの分泌はUssing室（４２）で細胞の合流単層を合着することにより連続的に監視できる。図２Ａは細胞を横切る短時間循環流（Ｉ_sc）として測定したCl 分泌を示す。漿膜浴溶液に３μモル濃度でＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭを添加すると２０分後Ｉ_scの増加は最高になる。誘導体の濃度を高くすると速さを増すが、有利に大きい応答はない。一方低濃度ではＩ_sc最高値が低くくなる。任意の中間時間、各種ｃＡＭＰ誘導体の添加後１２分で得たＩ_sc値は用量依存性の測定に使用した（図２Ｂ）。用量応答曲線はＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭおよびＢｔ₂ｃＡＭＰではそれぞれ２μモルおよび４００μモルのＥＣ₅₀値で平行であった。従ってホスフェートにアセトキシメチル基の導入は透過性障壁を包囲することによりこのアッセーで２００倍だけ効力を増加した。さらに、アセトキシメチルエステルは有意な遅れを出さずにＴ₈₄細胞の内部で開裂するらしい。２つの剤は本質的に区別できない活性化動力学を与えるからである。ｃＡＭＰ誘導体８−Br−ｃＡＭＰおよび８−ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰによる試験でそれぞれ１．５ミリモルおよび１００μモルのＥＣ₅₀値を有するCl 分泌活性が示された。魚の皮膚の色素細胞は内部では強く凝集した中心マス中に、または外部では細胞全体に色素を分散させ、しっかり調整された色素粒子の移動を示す。エンジェルフィッシュ(Ptero-phyllum scalare)のメラニン細胞ではこの移動は微細管ベースであり、ｃＡＭＰは調整されるが（４４，４７）外部のｃＡＭＰ同族体に対しては比較的制御し難い。メラニン細胞はｃＡＭＰ誘導体が細胞に入り、ｃＡＭＰ作用をまねる能力に対し可視的シングル−セルアッセーを行なうことができる。メラニン細胞はエンジェルフィッシュの鱗で単離され、表皮ははぎ取られた。６０〜１００個／鱗のメラニン細胞はａ₂−アドレナリンアゴニストにより予備処理して内因性ｃＡＭＰを減少させ、完全な凝集で出発した。細胞外Ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭは用量依存方法で色素を分散させた（図３Ａ）。１００μモル濃度のＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭにより本質的に完全に分散させることができた。しかし、１ミリモルでは作用の開始が僅かに速いが、細胞外のＢｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭの除去およびエピネフリンの投与により容易に逆転できなかった。これに対し１００ μモルの結果は容易に逆転された（図３Ｂ）。分散は１μモルで正に検知でき、１０μモルで最高の半分に近かかった（図３Ａ）。比較では、１ミリモルのＢｔ₂ ｃＡＭＰは検知しうる分散を生ずることはできなかった。従ってＡＭエステル基はこのアッセーで１０００以上だけ効力を増加した。Ｂｔ₂ｃＡＭＰ／ＡＭの有効性は、メラニン細胞のＢｔ₂ｃＡＭＰの不活性がホスフォジエステラーゼに対するＢｔｃＡＭＰの感受性またはｃＡＭＰ置換に対するキナーゼ結合部位の選択以上にむしろ貧弱な透過性に基くことを示す（４８）。この上記例は（６４）に要約される。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの透過性を増加する上記戦略、すなわちヒドロキシル基をマスクするブチリル基と協力するアセトキシメチルエステル化はイノシトールホスフェートには有効でないことが分かった。そのヒドロキシ基をブチリル基でブロックしたイノシトールトリホスフェートのアセトキシメチルエステルは比較的低い効力を有することが分かった。恐らく嵩高いホスフェート基間に位置するブチリルエステルは細胞内酵素により開裂できないからであろう。しかし、ヒドロキシル基がエステル化されずに残され、ホスフェートがアセトキシメチル基によりエステル化される場合、形成化合物は細胞に入る膜透過性が不十分であった。エステル化されないヒドロキシル基を残すことの他に、許容しうる細胞透過性および次のエステル開裂を得るためにアセトキシメチル基を一層疎水性の強い基で置換することが必要であることも分かった。プロピオニルオキシメチル（ＰＭ）エステル（Ｒ＝エチル、Ｒ′＝Ｈ）、またはブチリルオキシメチル（ＢＭ）エステル（Ｒ＝プロピル、Ｒ′＝Ｈ）のような疎水性の一層強いエステルは一層高い割合で細胞膜を透過し、一方尚細胞中に入ると開裂されやすいことが分かった。本発明によるイノシトールホスフェートエステルは式〔式中、Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃ であり、またはＲはCH₃であり、そしてＲ′はCH₃である）であり、およびＡ₁〜Ａ₆のうち少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである〕を有する。好ましいエステルは、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート、３−デオキシ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェート、３−フルオロ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェート、イノシトール−１，３，４−トリホスフェート、イノシトール−１，３，４，５−テトラホスフェート、およびイノシトール−３，４，５，６−テトラホスフェートのプロピオニルオキシメチルおよびブチリルオキシメチルエステルである。本発明による好ましい模範的イノシトールポリホスフェートの合成および使用の例は次の通りである：本発明による多数の異るエステルの製造に使用できる一般的合成図は図５に示す。隣接する未保護ヒドロキシルを有するホスフォトリエステルの合成はホスフェートが非常に容易に移動し、または遊離ヒドロキシル中に環状化するので困難である。鍵はできるだけ多くの工程に対しベンジルエーテルをヒドロキシルの保護に使用すること、およびホスフェートアシルオキシアルキルエステルに影響を与えずに最後の工程でベンジルを除去する條件を見出すことである（図５）。こうして、例えばイノシトールトリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステル（ＩＰ₃／ＰＭ）の合成では、２，３および６位置のヒドロキシルを初めにベンジル基として保護する。ビス（β−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミドによる１のリン酸化、ホスファイトの酸化およびシアノエチル保護基のアンモノリシスにより２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル-ＩＰ₃（２ａ）を得る。ブロモメチルプロピオネート（３，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ）によるエステル化により完全に保護されたイノシトールトリホスフェート（４ａ）を得る。最後に、酢酸中の酢酸パラジウム上の触媒水添分解によりホスフェートの移動または環状化のないＩＰ₃／ＰＭ（５ａ，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ）を得る。この一般的方法は他の膜透過性で、細胞内で加水分解できるＩＰ₃のエステルおよび３−デオキシ−１，４，５−ＩＰ₃、３−フルオロ−１，４，５−ＩＰ₃、１，３，４−ＩＰ₃ 、１，３，４，５−ＩＰ₄および３，４，５，６−ＩＰ₄のような他の重要なイノシトールポリホスフェートの合成に使用できる。合成の詳細な記載は次の通りである：既知化合物（６５，６６）であるＤ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−ミオ −イノシトール１ａおよびＤ−２，６−ジ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール１ｄは改変方法（１ａに対し）または刊行された方法（１ｄに対し）によりミオ −イノシトールから合成される。Ｄ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−３−デオキシ −ミオ−イノシトール１ｂおよびＤ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−３−デオキシ −３−フルオロ−ミオ−イノシトール１ｃは既知前駆体（６７，６８）、Ｄ−１，４，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ベンジル−３−デオキシ−ミオ−イノシトール（参考文献６７の化合物１０）またはＤ−１，４，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ベンジル−３−デオキシ−３−フルオロ−ミオ−イノシトール（参考文献６８の化合物５ｂ）のそれぞれから２工程で製造できる。これらの出発物質は触媒量のトリフルオロメタンスルホン酸の存在でベンジルトリクロロアセトイミデートによりベンジル化できる。メタノール中で一晩炭酸カリによりベンゾイル保護基を除去すると、それぞれ１ｂおよび１ｃを得る。図５に概述した試験手順は５ａ，５ｂ，５ｃおよび５ｄでも同様である。ここでは例として５ａを使用する。すべての反応は特定しない限りアルゴン雰囲気下で行なう。Ｄ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェート（２ａ）アンモニウム塩：６５mg１ａ（０．１４４ミリモル）を１mlのジクロロメタンおよび１mlのアセトニトリルに溶解した。ビス（β−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト（６９）（１８０μＬ、０．６５ミリモル）を添加し、次いで４８mgのテトラゾール（０．６９ミリモル）を１．２mlのアセトニトリルに溶解した。室温で２時間攪拌後、反応フラスコを氷浴で冷却した。過剰のｔ−ブチルハイドロパーオキシド（３００μＬの５モルジクロロメタン溶液）を一回で添加した。３０分後、氷浴から取り出し、室温で更に１時間攪拌を続けた。溶媒は減圧下に除去した。残留シロップは最少量のジクロロメタン／メタノール（１２：１）に懸濁した。１３０mgの透明ガラスを得た。この物質は１．５mlメタノールに溶解し、６mlの濃水酸化アンモニウムと混合した。６０℃で３時間還流し、溶媒を減圧下で除去した。残留物質はさらに精製せずに直接次の工程に対し使用した。Ｄ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステル（４ａ）：上記物質（２ａ）を１mlのアセトニトリルおよび０．２mlのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）に懸濁した。次に短かい間隔で音波処理し、溶媒は減圧下で除去した。この方法はアセトニトリルおよびＤＩＥＡの添加後ホスフェート基に対する対イオンがアンモニウムからジイソプロピルエチルアンモニウムに交換されたことを示す均質溶液の得られるまでさらに数回反復した。次に過剰（〜１５０μＬ）のブロモメチルプロピオネート（３，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ，参考文献７０記載のように製造）を添加し、４８時間反応させた。溶媒は真空除去し、残留シロップは先づシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより酢酸エチルで溶離して精製する。蒸発して得た淡黄色ガラスはＣ１８逆相カラムでＨＰＬＣにより７８％メタノール水溶液で溶離してさらに精製した。１５mgの透明ガラスを得た。１ａから全体の１０％収量であった。¹H-NMR(CDCl₃)：δ=1.1(m,18H) ,2.2-2.45(m,12H),3.5(dd,1H,J=12Hz,2Hz),4.05(t,1H,J=11.2Hz),4.3-4.5(m,3H) ,4.7-4.9(m,7H),5.3-5.7(m,12H),7.2-7.5(m,15H),FAB MS m/z(M＋Cs)⁺.計算値:1 339.2293，測定値:1339.2261. Ｄ−ミオーイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステル（５ａ，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ）：１５mgの４ａを２mlの氷酢酸に溶解した。２０mgの酢酸パラジウムおよび触媒量のトリフルオロ酢酸を添加した。混合物は２０℃以下の温度で１気圧水素ガス下で攪拌してホスフェートトリエステルの移動を最少にした。４時間の水添後、触媒は濾別し、酢酸は凍結した。１０mgの透明ガラスを得た。¹H-NMR(CD₃OD)：δ= 1.2(m,18H),2.4(m,12H),3.7(dd,1H,J=9.9Hz,2.4Hz),4.0(t,1H,J=9.3Hz),4.2-4.4 (m,3H),4.65(q,1H,J=8.4Hz),5.7(m,12H). Ｄ−ミオ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェートブチリルオキシメチルエステル（５ａ，Ｒ＝Ｐｒ，Ｒ′＝Ｈ）は同じ方法で製造したが、ブロモメチルプロピオネートの代りにブロモメチルブチレート（３，Ｒ＝Ｐｒ，Ｒ′＝Ｈ）を使用した。¹H-NMR(CD₃OD):δ=0.95(m,18H),1.7(m,12H),2.4(m,12H),3.7(dd,1H ,J=9.9Hz,2.4Hz),4.0(t,1H,J=9.3Hz),4.2-4.4(m,3H),4.65(q,1H,J=8.4Hz),5.7(m , 12H)．FAB MS m/z(M+Cs)⁺．計算値:1153.1824，測定値:1153.1850.ＩＰ₃／ＰＭおよびＩＰ₃／ＢＭの生物学的適用最善の定着したＩＰ₃の生物学的効果は内部貯蔵（２６）からCa²⁺を遊離することであるので、ＩＰ₃／ＰＭ（５ａ，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ）を標準方法論（５８）を使用して単−ＲＥＦ−５２線維芽細胞の細胞質ゾルの遊離Ca²⁺を映し出て試験した。細胞にはCa²⁺指示薬フラ−２を添加し、蛍光励起割合により判断した。ＩＰ₃／ＰＭ（４０μモル）は細胞外に適用し、その間細胞質ゾルのCa²⁺濃度を監視した。図６に示すように、Ca²⁺濃度はＩＰ₃／ＰＭの添加後急速に増加した（標識１の垂直点線）。周知のCa²⁺−遊離ホルモン（５９）であるバゾプレッシンの次の添加（標識２の垂直点線）では通常よりはるかに低い効果であった。この吸収はＩＰ₃／ＰＭが生理学的アゴニスト、バゾプレッシンにより利用されるものと同じCa²⁺開裂径路を既に一部使い切ったことを実証する。１３２１Ｎ１アストロサイトーマに対する生物学的試験をＲＥＦ−５２細胞（７１）に対する試験と同様に行なった。試験結果は図７に示す。フラ−２−添加１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞の細胞質ゾル遊離Ca²⁺濃度（縦座標、μモル単位）は時間の関数として示す（横座標、秒の単位）。標識１の垂直点線で、２０μモルのイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステル（５ａ，Ｒ＝Ｅｔ，Ｒ′＝Ｈ）を添加した。細胞質ゾルCa²⁺のかなり大きい上昇が約１００秒後に観察された。次に細胞はカルバコール（２００ μモル、標識２の垂直点線で加える）、これはイノシトール−１，４，５−トリホスフェートの内因性発生を刺激する薬剤である、に応答することができた。しかし、カルバコールに対する応答はイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステルによる前処理により低下する。同様にサプシガルジン（１００ｎモル、標識３の垂直点線で添加）、貯蔵Ca²⁺を遊離する別の薬剤、に対するCa²⁺の応答は低下する。図７に示すものと同様の試験は細胞外Ca²⁺を欠く媒体およびイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステルを６０μモルの用量で標識１の垂直点線で添加したことを除いて行なった。試験結果は図８に示す。細胞質ゾルのCa²⁺のかなりの上昇を約５０秒後に観察した。細胞外Ca²⁺が存在しないので、この応答は細胞内貯蔵Ca²⁺からの遊離を表わすものでなければならない。次にカルバコール（２００μモル、標識２の垂直点線で添加）に対する細胞の応答はイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステルによる前処理により非常に低下した。前の試験（図７）と比較してカルバコール応答の非常に大きい阻害度はイノシトール−１，４，５−トリホスフェートプロピオニルオキシメチルエステルの高用量および貯蔵Ca²⁺の再充填を低下させる細胞外Ca²⁺を欠くことに因る。それ以上の例では、上記と同じ試験を２μモルのイノシトール−１，４，５− トリホスフェートブチリルオキシメチルエステル（５ａ，Ｒ＝Ｐｒ，Ｒ′＝Ｈ）をプロピオニルオキシメチルエステルの代りに使用したことを除いて、アストロサイトーマ細胞で行なった。試験結果は図９に示す。ブチリルオキシメチルエステルはいくらか効力が高いが、その効果は発現が遅く、遅れる。上記生物学的結果は、イノシトールホスフェートの中性、疎水性、膜透過性誘導体は合成できることおよび完全なＲＥＦ−５２線維芽細胞およびアストロサイトーマ細胞に細胞外で適用する場合予期された生物学的活性を示すことを示す。ＩＰ₃／ＰＭはＩＰ₃を模倣した剤に予期されるように内部貯蔵からCa²⁺を遊離した。上記透過性イノシトールポリホスフェート誘導体は細胞質ゾル〔Ca²⁺〕₁を通して中介されない細胞に対する長期的効果を調査するために有用である。例えば、タン白合成、リン酸化、増殖（４９）、または形質発現に対する可能な効果はマイクロ注入、パッチ−クランプ、または透過性化細胞に対する研究では比較的困難である。イノシトールポリホスフェートはもっとも遍在する、重要な細胞内第２メッセンジャーのうちに含まれる。これらはホルモン分泌および作用、滑かな筋肉収縮、免疫活性化、受精、および神経単位機能に必須である。上記のように最良の既知イノシトールポリホスフェートはミオ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ₃）であり、これは細胞内貯蔵からCa²⁺を遊離することにより作用する。ＩＰ₃は大部分が未知の生化学的機能を有する一連のイノシトールポリホスフェートにさらに代謝される。イノシトールポリホスフェートの生物学的機能を調査する場合の主要な問題はその膜不透過性である。外因性イノシトールポリホスフェートを細胞に受け渡すすべての現存技術は細胞の生存能力を危険にさらし、しばしば単一細胞にのみ適用できる技術によりそのプラズマ膜に孔をあけることが必要である。本発明によるイノシトールポリホスフェート誘導体は、これらが膜透過性であり、細胞内に入ると生物学的に活性のイノシトールポリホスフェートに再生するのでこの問題を解決する。本発明によるホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルは細胞膜に孔を開けずに細胞に第２メッセンジャーを導入したい場合、または別の場合細胞に悪影響のある場合の任意の状況で使用できる。本発明はマイクロインジェクション、パッチ−クランプおよびエレクトロポレーション手法に依存する現存技術に対しホスフェート含有第２メッセンジャーを細胞中に導入する代替法として有用である。アシルオキシアルキルエステルは細胞生育媒体または他の適当な溶液中のエステルに単に細胞をさらすことにより選択された細胞中に導入される。細胞に導入されるエステル量は細胞生育媒体に含まれるエステル濃度を下げ、または上げることにより調整できる。細胞中に透過するエステル量は細胞がエステルに暴露される時間量を限定することによっても調整できる。本発明の模範的態様をこのように記載したが、模範のみが開示内にあり、本発明は次の請求範囲によってのみ限定されることは当業者には理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シュルツ，カーステンドイツ連邦共和国ディー − 28211 ブレーメン，オルレアンシュトラーセ 34 (72)発明者リ，ウェンホングアメリカ合衆国 92037 カリフォルニア州ラジョラ，ミラマーストリート 403，アパートメトノジー

Claims

【特許請求の範囲】１．式〔式中、Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃ であり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）であり、およびＡ₁〜Ａ₆のうち少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである〕を有するホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルを含む化合物。２．Ａ₁，Ａ₄およびＡ₅は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨでありまたはＲはCH₃であり、そしてＲ′はCH₃である）である請求項１記載の化合物。３．Ａ₁，Ａ₃，Ａ₄およびＡ₅は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨであり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）である請求項１記載の化合物。４．Ａ₃，Ａ₄，Ａ₅およびＡ₆は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨであり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）である請求項１記載の化合物。５．Ｒはエチルまたはプロピルであり、Ｒ′はＨである、請求項２記載の化合物。６．Ｒはエチルまたはプロピルであり、Ｒ′はＨである、請求項３記載の化合物。７．Ａ₃はＨであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項２記載の化合物。８．Ａ₃はＦであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項２記載の化合物。９．Ａ₃はＨであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項５記載の化合物。 10．Ａ₃はＦであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項５記載の化合物。 11．ホスフェート含有第２メッセンジャーに含まれる１個以上のホスフェート基をエステル化して式〔式中、Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃ であり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）であり、およびＡ₁〜Ａ₆のうちの少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである〕を有するホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルを形成する工程を含む、ホスフェート含有第２メッセンジャーの細胞膜透過性の増加方法。 12．Ａ₁，Ａ₄およびＡ₅は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨであり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）である、請求項１１記載の方法。 13．Ａ₁，Ａ₃，Ａ₄およびＡ₅は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨであり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）である請求項１１記載の方法。 14．Ａ₃，Ａ₄，Ａ₅およびＡ₆は（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨであり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）である、請求項１１記載の方法。 15．Ｒはエチルまたはプロピルであり、Ｒ′はＨである、請求項１２記載の方法。 16．Ｒはエチルまたはプロピルであり、Ｒ′はＨである、請求項１３記載の方法。 17．Ａ₃はＨであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項１２記載の方法。 18．Ａ₃はＦであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項１２記載の方法。 19．Ａ₃はＨであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項１５記載の方法。 20．Ａ₃はＦであり、Ａ₂およびＡ₆はＯＨである、請求項１５記載の方法。 21．ホスフェート含有第２メッセンジャーに含まれるホスフェート基をエステル化して式〔式中、Ａ₁〜Ａ₆はＨ、ＯＨ、Ｆまたは（式中、Ｒは２〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ′はＨまたはCH₃ であり、またはＲはCH₃であり、Ｒ′はCH₃である）であり、およびＡ₁〜Ａ₆のうちの少なくとも１つは上記式を有するホスフォエステルである〕を有するホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルを形成し、ホスフェート含有第２メッセンジャーのアシルオキシアルキルエステルを細胞膜を破裂させずに細胞中に導入し、ホスフェート基からアシルオキシアルキルエステルを開裂して細胞内にホスフェート含有第２メッセンジャーを形成させる、工程を含む、細胞膜を破壊せずにホスフェート含有第２メッセンジャーを細胞中に導入する方法。