DE69606707T2

DE69606707T2 - Abtrennung von nichtmodifiziertem hämoglobin aus vernetztem hämoglobin

Info

Publication number: DE69606707T2
Application number: DE69606707T
Authority: DE
Inventors: S. Gawryl; A. Houtchens; J. Laccetti; R. Light
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2000-11-16
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: JPH11507336A; EP0832131B1; CA2222679A1; US20050143565A1; US5952470A; JP3950477B2; DE69606707D1; WO1996040783A1; ATE189819T1; EP0832131A1; AU6094396A; US20030203350A1; ES2142590T3; CA2222679C

Description

Hintergrund der Erfindung

Es besteht ein Bedarf an Blutersatzmitteln zum Behandeln oder zum Verhindern von Hypoxie als Folge von Blutverlust (z. B. von akuter Hämorrhagie oder während operativer Eingriffe), als Folge von Anämie (z. B. perniziöse Anämie oder Sichelzellenanämie) oder als Folge von Schock (Volumenmangelkollaps, anaphylaktischer Schock, septischer Schock oder allergischer Schock).
Die Verwendung von Blut und Blutfraktionen in ihrer Eigenschaft als ein Blutersatzmittel ist mit Nachteilen behaftet. Zum Beispiel ist die Verwendung vollständigen Blutes oft mit Übertragungsrisiken von Hepatitis- hervorrufenden Viren und AIDS-hervorrufenden Viren begleitet, die die Heilung des Patienten erschweren können oder einen tödlichen Verlauf zur Folge haben. Zusätzlich wird bei der Verwendung vollständigen Blutes eine Blutgruppenbestimmung und eine Kreuzprobe zum Verhindern immunhämatologischer Probleme und Inkompatibilität zwischen Donoren benötigt.
Als ein Blutersatzmittel besitzt Hämoglobin eine osmotische Aktivität und die Fähigkeit Sauerstoff zu transportieren und zu übertragen. Dennoch, wässriges Hämoglo bin existiert aber in einem Gleichgewicht zwischen den tetrameren (MG 68.000) und dimeren (MG 34.000) Formen. Hämoglobin-Dimere werden von der Niere sezerniert und haben eine schnelle intravaskuläre Eliminierung der Hämoglobin-Lösungen zur Folge, wobei solche Lösungen typischerweise eine 2-4 stündige Plasma-Halbwertszeit besitzen.
Es wurden Anstrengungen aufgebracht, um die zugehörigen Beschränkungen von Hämoglobin-Lösungen durch molekulares Modifizieren des Hämoglobins zu überwinden. Intramolekulares und intermolekulares Vernetzen des Hämoglobins hat im allgemeinen eine renale Eliminierung verringert und intravaskuläre Retentionszeit erhöht.
Dennoch enthalten vernetzte Hämoglobin-Lösungen immernoch typischerweise einen signifikanten Anteil nichtmodifiziertes tetrameres Hämoglobin. Dieses nichtmodifizierte tetramere Hämoglobin kann sich in dimeres Hämoglobin umwandeln und dann aus dem Körper sezerniert werden, wobei die durchschnittliche intravaskuläre Retentionszeit für vernetzte Hämoglobin-Blutersatzmittel verringert wird. Desweiteren unterscheiden die gegenwärtigen Trennungsmittel, wie zum Beispiel Standardfiltrierung, nicht ausreichend zwischen nichtmodifiziertem tetrameren Hämoglobin und modifiziertem tetrameren Hämoglobin.
Somit bleibt trotz der neueren Fortschritte in der Präparation von vernetzten Hämoglobin-Blutersatzmitteln ein Bedarf für ein Verfahren bestehen, um effektiv nicht modifiziertes Hämoglobin aus einer Lösung intramolekular und/oder intermolekular vernetzter Hämoglobin- Blutersatzmittel abzutrennen, um die durchschnittliche intravaskuläre Retentionzeit des Blutersatzmittels zu verbessern und um signifikante renale Hämoglobin- Exkretionsgehalte zu verhindern. (siehe WO A-87/07832 und WO A-83/03408).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung nichtmodifizierten Hämoglobins von vernetztem Hämoglobin in einer Hämoglobin-Lösung. Das Verfahren beinhaltet In-Kontakt-Bringen der Hämoglobin-Lösung mit mindestens einem Dissoziierungsmittel, um eine Dissoziationslösung zu bilden, worin nichtmodifiziertes tetrameres Hämoglobin unter Bildung von Hämoglobin-Dimeren dissoziiert ist. Die Hämoglobin-Dimere werden dann aus der Dissoziationslösung unter Zurückhalten des vernetzten Hämoglobins in der Dissoziationslösung abgetrennt.
Die Vorteile dieser Erfindung schliessen die Bereitstellung eines Bluterstatzmittels mit einer verbesserten intravaskulären Retentionszeit, einer Verringerung oder Eliminierung signifikanter renaler Eliminierung von Hämoglobin und den damit verbundenen Nebenwirkungen, einem geeigneten oncotischen Druck und verringerten hypertensiven Wirkungen ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt ein schematisches Flussdiagramm eines Verfahrens zur Trennung nichtmodifizierten Hämoglobins von modifiziertem Hämoglobin-Blutersatzmittel gemäss der vorliegenden Erfindung dar,
Fig. 2 stellt die Molekulargewichtsverteilung eines modifizierten Hämoglobin-Polymers in Lösung dar, das gemäss dem Verfahren dieser Erfindung behandelt wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Für Hb-Lösungen dieser Erfindung geeignetes Hämoglobin (Hb) kann aus neuen, alten oder veralteten Blut aus Menschen oder anderen Vertebraten, wie zum Beispiel Rindern, Schweinen, Schafen oder Hühnern hergeleitet werden. Zusätzlich ist transgen-hergestelltes Hämoglobin, wie zum Beispiel transgen-hergestelltes Hb, beschrieben in BTO/TECHNOLOGY; 12: 55-59 (1994), und rekombinant hergestelltes Hämoglobin, wie zum Beispiel das rekombinant hergestellte Hämoglobin beschrieben in Nature, 356: 258- 260 (1992), ebenfalls für Hb-Lösungen dieser Erfindung geeignet.
Das Blut kann aus lebenden oder frisch geschlachteten Donoren gewonnen werden. Beispiele geeigneter Verfahren zum Erhalt von Hämoglobin, das von roten Blutzellen abstammt, sind in U.S. Patentnr. 5.084.558 und 5.296.465, erteilt an Rausch et al., beschrieben.
Hämoglobin wird aus roten Blutzellen oder rekombinanten Bakterien durch ein geeignetes Wasch- oder Lyseverfahren hergeleitet, die dem Fachmann bekannt sind.
Geeignete Hämoglobin-Lösungen umfassen wässrige Lösungen von gelöstem Hb, worin das gelöste Hb nichtmodifiziertes Hb zusätzlich zu modifiziertem tetrameren Hb und/oder polymerisiertem Hb einschliesst.
Nichtmodifiziertes Hämoglobin, wie hierin definiert, ist Hämoglobin in einer nichtdissoziierten tetrameren Form, das in wässriger Lösung in Hb-Dimere dissoziieren kann, und dissoziierte Hb-Dimere. Hb-Dimere können weiter in Hb-Untereinheiten (Monomere) dissoziieren. Nichtmodifiziertes Hb kann innerhalb einer Hb-Lösung frei (nicht polymerisiert) sein und/oder kann intermolekular in eine Polymerkette innerhalb der Hb-Lösung vernetzt sein.
Vernetztes Hämoglobin, wie hierin definiert, ist Hämoglobin, das modifiziert und/oder polymerisiert ist. Bei nichtmodifiziertem, in einer Hb-Polymerkette enthaltenen Hb können Dimere, die nicht intermolekular vernetzt sind, dissoziiert sein und durch das Verfahren der Erfindung abgetrennt werden.
Modifiziertes Hämoglobin, wie hierin definiert, ist Hb, das intramolekular vernetzt worden ist, um signifikante Dissoziation der Hb-Tetramere in Hb-Dimere in wässriger Lösung auszuschliessen.
In polymerisiertem Hämoglobin sind Hb-Tetramere zum Bilden einer Hb-Polymerkette intermolekular vernetzt. Ein Hämoglobin-Polymer kann modifiziertes Hämoglobin, nicht- modifiziertes Hämoglobin oder eine Kombination davon enthalten. In diesem Verfahren können Hb-Dimere von nichtmodifizierten Hb-Tetrameren innerhalb einer Polymerkette dissoziiert werden, in wässriger Lösung, wenn das Hb- Dimer nicht an andere Hb-Tetramere intermolekular gebunden ist.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird mindestens ein Dissoziierungsmittel in einer wässrigen Lösung mit Hämoglobin in Kontakt gebracht, um eine Dissoziationslösung zu bilden. Geeignete Dissoziierungsmittel sind wasserlösliche Agenzien in einer Konzentration innerhalb einer wässrigen Lösung, die bei Aussetzen mit nichtmodifizierten Hämoglobin-Tetrameren eine Spaltung von mindestens einem Teil der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Hb-Dimeren in den nichtmodifizierten Hb- Tetrameren zum Dissoziieren der nichtmodifizierten Hb- Tertramere in unabhängige α&sub1;β&sub1; und/oder α&sub2;β&sub2; Hb-Dimere zur Folge hat. Die Hb-Dimere können ebenfalls weiter dissoziieren, um Hb-Untereinheiten zu bilden (α&sub1;, α&sub2;, β&sub1; und β&sub2;).
Eine Dissoziationslösung enthält typischerweise eine Konzentration an gelösten Dissoziierungsmittel mit einer Normalität von etwa 1 gm-Äquivalent des Dissoziierungsmittels pro Liter Dissoziationslösung, oder mehr. Vorzugsweise ist die Konzentration des Dissoziierungsmittels innerhalb einer Dissoziierungslösung höher als etwa 1,4 N.
Dissoziierungsmittel müssen in wässriger Lösung ionisch oder stark polar sein. Beispiele geeigneter Dissoziierungsmittel schliessen wasserlösliche anorganische Salze (z. B. Natrium-, Calcium-, Magnesium- und Zinksalze), wasserlösliche organische Salze (z. B. Triethylaminchlorid) und wasserlösliche organische Amine (z. B. Guanidin) ein. Vorzugsweise ist ein Dissoziierungsmittel ein anorganisches Salz, oder Salze, die mindestens ein mehrwertiges Metallkation enthalten, wie zum Beispiel Ca&spplus;², Mg&spplus;² oder Zn&spplus;².
Wasserlöslich, wie hierin definiert, bedeutet, dass das Material bei Raumtemperatur in Wasser ausreichend löslich ist, um eine Lösung mit einer ausreichenden Konzentration zu bilden, um bei In-Kontakt-Bringen mit Hb, eine Spaltung von mindestens einem Teil der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Hb-Dimeren in nichtmodifizierten Hb-Tetrameren zur Folge zu haben.
Das Dissoziierungsmittel kann, bevor es mit der Hb- Lösung in Kontakt gebracht wird, in einer wässrigen Lösung gelöst sein, oder umgekehrt kann das Dissoziierungsmittel bei in Kontakt-Bringen mit einer wässrigen Hb- Lösung ein Feststoff in Puder- oder Partikelform sein, worin sich das Dissoziierungsmittel dann lösen wird.
Entweder kann das Dissoziierungsmittel oder die Hb- Lösung zu jeweils dem anderen hinzugefügt werden, oder sie können zusammen hinzugegeben werden. Das Dissoziierungsmittel und die Hb-Lösung werden unter Bedingungen mit relativ geringen Scherkräften vermischt.
Beispiele geeigneter Hämoglobin-Lösungen schliessen Hämoglobin-Lösungen ein, die einen stabilisierten 2,3- Diphosphoglycerat-Gehalt haben, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 3.864.478, erteilt an Bonhard; vernetztes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 3.925.344, erteilt an Mazur, oder in U.S. Patentnr, 4.001.200, 4.001.401 und 4.053.590, erteilt an Bonsen et al., oder in U.S. Patentnr. 4.061.736, erteilt an Morris et al., oder in U.S. Patentnr. 4.473.496, erteilt an Scannon; Stroma-freies Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentur. 3.991.181 erteilt an Doczi, oder in U.S. Patentnr. 4.401.652 erteilt an Simmonds et al, oder in U.S. Patentnr. 4.526.715, erteilt an Kothe et al.; mit einem Polysaccharid gekoppeltes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.064.118, erteilt an Wong; mit Pyridoxalphosphat kondensiertes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.136.093, erteilt an Bonhard et al.; Dialdehyd-gekoppeltes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.336.248, erteilt an Bonhard et al.; kovalent an Inulin gebundenes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.377.512, erteilt an Ajisaka et al.; Hämoglobin oder ein Hämoglobin-Derivat, das an ein Polyalkylenglycol oder ein Polyalkylenoxid gekoppelt ist, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.412.989, erteilt an Iwashi ta et al., oder U.S. Patentnr. 4.670.417, erteilt an Iwasaki et al., oder U.S. Patentnr. 5.234.903, erteilt an Nho et al.; Pyrogen- und Stroma-freie Hämoglobin-Lösung, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.439.357, erteilt an Bonhard et al.; Stroma-freies, nicht-Häm Protein-freies Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.473.494, erteilt an Tye; modifiziertes vernetztes Stroma-freies Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.529,719, erteilt an Tye; Stroma-freies, vernetztes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.584.130, erteilt an Bucci et al.; α-vernetztes Hämoglobin, wie beschreiben in U.S. Patentnr. 4.598.064 und Re. 34.271, erteilt an Walder et al.; stabiles Aldehyd-polymerisiertes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.857.636, erteilt an Hsia; an Sulfatglycosaminglycane kovalent verknüpftes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4.920.194, erteilt an Feller et al.; modifiziertes Hämoglobin, das mit einem hochmolekularen Polymer mit reaktiven Aldehyd-Komponenten reagiert hat, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 4. 900.780, erteilt an Cerny; bei Vorhandensein von Natriumtripolyphosphat vernetztes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 5.128.452, erteilt an Hai et al.; stabiles, Polyaldehyd-polymerisiertes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr. 5.189.146, erteilt an Hsia; und β-vernetztes Hämoglobin, wie beschrieben in U.S. Patentnr, 5.250.665, erteilt an Kluger et al.; andere Bei spiele geeigneter Hb-Lösungen sind in U.S. Patentnr. 5.296.465, erteilt an Rausch et al., beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in dem Verfahren der Erfindung verwendete Hämoglobin in der Form eines polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzmittels. Beispiele geeigneter polymerisierter Hämoglobin- Blutersatzmittel sind beschrieben in U.S. Patentnr. 5.084.558 und 5.217.648, erteilt an Rausch et al..
Die für eine Verwendung in dem Verfahren der Erfindung bevorzugte Zusammensetzung der Hb-Blutersatzmittel sind sterile wässrige Lösungen mit weniger als 0,5 Endotoxin Einheiten/ml, einem Methämoglobingehalt, der nicht eine signifikante Verringerung der Sauerstofftransport/Übertragungs-Kapazität zur Folge hat, einer Gesamthämoglobin-Konzentration zwischen etwa 1 bis etwa 25 g Hb/dl, einem physiologischen pH und einer Chroridionen- Konzentration von weniger als 35 meq/l.
Der Begriff "Endotoxin" betrifft die zell-gebundenen Lipopolysaccharide, die als ein Teil der äusseren Schicht der Bakterienzellwand hergestellt werden, die unter vielen Bedingungen toxisch sind. Eine Endotoxin-Einheit (EU) ist durch die Pharmacopeial Convention der Vereinigten Staaten von 1983, Seite 3013, als die in 0,1 Nanogramm der U.S. Referenzstandardmenge EC-5 enthaltene Aktivität definiert worden. Eine Phiole EC-5 enthält 10.000 EU.
Die Bedingungen innerhalb der Dissoziationslösung, wie zum Beispiel pH und Temperatur, sind innerhalb des Bereiches, der nicht die Fähigkeit von Hb signifikant verringert, Sauerstoff zu transportieren und freizusetzen, wie es durch eine Denaturierung von Hb geschehen würde. Solche geeigneten Bedingungen sind die einem Fachmann bekannten klassischen Bedingungen.
Der pH der Dissoziationslösung muss niedrig genug für das Vorkommen der Hb-Tetramer-Dissoziation sein und hoch genug sein, um eine signifikante Säureinduzierte Denaturierung des Hb auszuschliessen. Typischerweise wird der pH zwischen etwa 4,5 und etwa 9,5 gehalten. Vorzugsweise ist der pH der Dissoziationslösung sauer.
In einer anderen Ausführungsform enthält die Dissoziationslösung ebenfalls einen Puffer, um die Dissoziationslösung innerhalb eines geeigneten pH-Bereiches zu halten, typischerweise etwa 4,5 bis etwa 9,5. Der Puffer kann aus einer oder mehreren chemischen Verbindungen bestehen.
Ein bevorzugter Puffer enthält 2,2-Bis(hydroxymethyl)-2,2',2"-nitriltriethanol (Bis-Tris) mit einem pH zwischen 5,5 und 8,0.
Die Dissoziationslösung kann durch Hinzufügen eines Feststoff-(Puder oder Partikulat)puffers oder einer wässrigen Pufferlösung zu der Hb-Lösung gepuffert werden. Ausserdem kann der Puffer zu der wässrigen Lösung des Dissoziierungsmittels vor dem In-Kontakt-Bringen mit der Hb-Lösung hinzugefügt werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform enthält die Dissoziationslösung ausserdem ein Stabilisierungsmittel in einer geeigneten Menge, um die Bildung von Methämoglobin durch Autooxidation zu minimieren. Ein Beispiel einer geeigneten Menge eines Stabilisierungsmittels ist eine 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung.
In diesem Verfahren verwendete Hämoglobin-Lösungen werden typischerweise unter Bedingungen gehalten, die ausreichen, um ein mikrobiologisches Wachstum oder Biobelastung zu minimieren, wie zum Beispiel durch Halten der Temperatur bei weniger als etwa 20ºC und über 0ºC. Vorzugsweise wird die Temperatur bei einer Temperatur von etwa 15ºC oder weniger gehalten. Bevorzugter wird die Temperatur bei etwa 10ºC bis etwa 12ºC gehalten.
Die Dissoziationslösung wird dann zum Reinigen der Hb-Lösung durch Trennen dissoziierter Hb-Dimere von modifiziertem Hb und/oder polymerisiertem Hb filtriert. Geeignete Filter schliessen Ultrafilter ein, die in das Filtrat Komponenten mit einem Molekulargewichtsausschluss zwischen etwa 40.000 Dalton und 100.000 Dalton durchtreten lassen. Während der Filtration treten Komponenten der Hb-Lösung, die einen geringeren Durchmesser als modifiziertes tetrameres Hb haben, oder die flüssig oder gelöst sind, mit dem Filtrat durch den Filter. Dennoch, die modifizierten Hb-Tetramere und das polymerisierte Hb verbleiben im allgemeinen im Rückstand.
Ein 50.000 Dalton Ultrafilter wird bevorzugt, da er eine Abtrennung der Hb-Dimere aus der Hb-Lösung ohne einen signifikanten Ertragsverlust an modifizierten Hb- Tetrameren oder polymerisiertem Hb erlaubt.
In einer Ausführungsform wird die Dissoziationslösung nur einmal filtriert. Alternativ kann die Dissoziationslösung durch einen Filter und dann noch einen Filter in Reihe gereinigt werden, worin der Rückstand des vorhergehenden Filters durch einen nachfolgenden Filter weiter gereinigt wird.
Vorzugsweise wird der Hb-Rückstand kontinuierlich durch einen oder mehrere Filter rezirkuliert, wie in Fig. 1 gezeigt, wobei kontinuierlich Dimere entfernt werden, da nichtmodifiziertes Hb mit der Zeit weiter in der Dissoziationslösung dissoziiert.
In einer anderen Ausführungsform wird Wasser oder eine wässrige Elektrolyt- oder vorzugsweise Dissoziierungsmittel-Lösung zu der Dissoziationslösung vor und/oder während der Filtration hinzugefügt, um mindestens teilweise den Flüssigkeitsvolumenverlust als Filtrat während der Filtration auszugleichen. Das Wasser oder wässrige Lösung kann chargenweise oder kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit hinzugefügt werden, die der Geschwindigkeit des Filtratsvolumenverlustes durch den Filter entspricht.
In dem Verfahren verwendetes Wasser kann destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser, Wasser-für-Injektion (WFI) und/oder Wasser mit geringem Pyrogengehalt (LPW) sein. WFI, das bevorzugt ist, ist entionisiertes, destilliertes Wasser, das den U.S. Pharmacological Spezifications für Wasser-für-Injektion entspricht. WFI ist ausserdem in Pharmaceutaical Engineering, 11, 15-23 (1991) beschrieben. LPW, das noch bevorzugter ist, ist entionisiertes Wasser, das weniger als 0,002 EU/ml enthält.
Typischerweise sind etwa 99% oder mehr des nichtmodifizierten Hb von dem modifizierten Hb und polymeren Hb im Hb-Rückstand abgetrennt worden, wenn das von der Hb- Lösung entfernte Filtratvolumen etwa 500% des Volumens der Hb-Lösung vor der Zugabe des Dissoziierungsmittels entspricht.
Wenn die Hb-Lösung als ein Blutersatzmittel verwendet wird, dann wird das Hämoglobin im Hb-Rückstand gewaschen und durch Diafiltration mit einem physiologischen Puffer äquilibriert, um die physiologische Verträglichkeit des Blutersatzmittels sicherzustellen. Geeignete physiologische Puffer schliessen Puffer mit physiologisch verträglichen Elektrolytgehalten (z. B. NaCl, KCl und CaCl&sub2;) in WFI ein. Vorzugsweise ist der Puffer von Pyrogen befreit, wie zum Beispiel durch Filtration mit einem 10.000 Dalton Ultrafilter, und von Sauerstoff befreit.
Eine Pufferlösung kann ausserdem ein gelöstes, nichttoxisches reduzierendes Agens, wie zum Beispiel N- Acetyl-L-cystein, Cystein, Natriumdithionit oder Ascorbat einschliessen, um zum Verringern einer Methämoglobinbil dung chemisch Sauerstoff in dem Blutersatzmittel auszuspülen. Bei Hb-Blutersatzmitteln wird ein Methämoglobingehalt von etwa 25% oder mehr typischerweise eine signifikante Verringerung der Sauerstoff-Lieferkapazität zur Folge haben. Es wird bevorzugt, dass der Methämoglobingehalt geringer als etwa 15% ist. Am bevorzugtesten ist der Methämoglobingehalt in einem Hb-Blutersatzmittel geringer als oder gleich etwa 10%.
Ein Sauerstoffbeladen von Hb wird, ähnlich wie Dissoziationspuffer, ebenfalls nichtmodifiziertes Hämoglobin in Hb-Dimere dissoziieren, wie in Beispiel III gezeigt. Dennoch fördert ein Sauerstoffbeladen von Hb ebenfalls Methämoglobinbildung.
Es wird angenommen, dass der physiologische Puffer und das reduzierende Agens getrennt oder zusammen in einer Charge oder durch kontinuierliche Zufuhr zu dem Hb- Rückstand hinzugefügt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Hb- Rückstand durch Diafiltration gegen einen physiologischen Puffer gewaschen, bis die Hb-Lösung für Menschen und/oder andere Vertebraten physiologisch verträglich ist.
Typischerweise wird Diafiltration fortgesetzt, bis der Flüssigkeitsvolumenverlust durch Diafiltration durch den Diafilter etwa das 5-fache oder mehr des anfänglichen Volumens des Hb-Rückstands vor dem Waschvorgang ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird Diafiltration fortgesetzt, bis etwa 10 Volumen der Flüssigkeit ausgetauscht worden sind.
Eine weitere Beschreibung der Verwendung von diesem Verfahren zum Entfernen von nichtmodifiziertem Hb aus polymeren Hb-Lösungen wird in den Beispielen I und II bereitgestellt.
In diesem Verfahren werden Teile der Komponenten für den Vorgang für eine Präparation eines stabilen polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzmittels ausreichend sterilisiert, um ein steriles Produkt herzustellen. Steril ist definiert, wie einem Fachmann bekannt, spezifischer, dass die Lösung den Anforderungen der Pharmacopeia der Vereinigten Staaten für Sterilität, bereitgestellt in USP XXII, Abschnitt 71, Seiten 1483-1488 entspricht. Desweiteren werden Teile der Komponenten, die dem Verfahrensweg ausgesetzt werden, gewöhnlicherweise aus einem Material hergestellt oder verkleidet, das nicht mit dem Verfahrensweg reagiert oder diesen kontaminiert. Solche Materialien können Edelstahl und andere Stahllegierungen, wie zum Beispiel Inconel einschliessen.
Die in diesem Verfahren verwendete Pumpe kann der Art nach eine peristaltische Pumpe, Diaphragmapumpe, Zahnradpumpe, Kolbenpumpe oder Drehkolbenpumpe sein. Diaphragmapumpen sind von Branne Lubbem Inc., Buffalo Grove, IL. erhältlich. Geeignete Drehkolbenpumpen schliessen die Albin SLP 110 P51 B1 sanitäre Drehkolbenpumpe von Albin Pump Inc., Atlanta, GA ein. Drehkolbenpumpen können ebenfalls von Waukesha Pumps, Waukesha, WS erhalten werden.
Eine Ausführungsform eines zum Praktizieren des Verfahrens der Erfindung zum Trennen nichtmodifizierten Hämoglobins von einer Hb-Lösung, die modifizierte Hb- Tetramere und/oder polymerisiertes Hb enthält, geeigneten Systems 10 ist in Fig. 1 veranschaulicht. Das System 10 schliesst Tank 12, Pumpe 14, Reinigungsfilter 16 und Diafilter 18 ein. Die Pumpe 14 übt eine Sogkraft auf Tank 12 aus und rezirkuliert Hb-Lösung durch den Reinigungsfilter 16 und/oder Diafilter 18. Es wird angenommen, dass der Reinigungsfilter 16 und Diafilter 18 in parallelen oder seriellen Anordnungen betrieben werden können. Der Tank 12 enthält Hb-Lösung, die innerhalb Tank 12 gebildet werden kann, oder die vor der Überführung in Tank 12 gebildet werden kann.
Eine für eine Dissoziation von tetrameren Hb-Molekülen in Hb-Dimere geeignete Menge des Hb-Dissoziierungsmittels wird dann zum Bilden einer Dissoziationslösung mit der Hb-Lösung in System 10 in Kontakt gebracht. Das Dissoziierungsmittel wird typischerweise von Dissoziierungsmittelvorrat 20 in Tank 12 eingeführt. Dennoch, es wird angenommen, dass das Dissoziierungsmittel an anderen Stellen im System 10 zugefügt werden kann. Es wird ebenfalls angenommen, dass das Dissoziierungsmittel zu der Hb-Lösung in einer Charge oder durch kontinuierliche Zufuhr zugegeben werden kann.
Das Dissoziierungsmittel und die Hb-Lösung in der Dissoziationslösung werden dann durch Vermischen mit geringen Scherkräften vermischt, spezifischer durch einen statischen Mischer 22. Das Dissoziierungsmittel und die Hb-Lösung werden durch Rezirkulieren der Dissoziationslösung aus Tank 12, durch Pumpe 14 durch eine Öffnung, nicht dargestellt, und dem statischen Mischer 22 vermischt.
Der statische Mischer 22 befindet sich typischerweise stromabwärts von der Pumpe 14 und stromaufwärts vom Reinigungsfilters 16, dennoch, der statische Mischer 22 kann sich alternativ an anderen Stellen im System 10 befinden.
Das nichtmodifizierte Hämoglobin in der Dissoziationslösung beginnt dann von nichtmodifizierten Hb- Tetrameren zu Hb-Dimere zu dissoziieren. Die Hb-Dimere haben je ein Molekulargewicht von etwa 32.000 Dalton.
Die Dissoziationslösung wird dann durch den Reinigungsfilter 16 zum Entfernen von Hb-Dimeren im Filtrat und zum Halten von modifiziertem Hb und polymeren Hb im Hb-Rückstand rezirkuliert. Während der Filtration treten Komponenten der Dissoziationslösung, die einen geringeren Durchmesser als stabilisiertes tetrameres Hb haben, oder die flüssig sind, mit dem Filtrat durch den Reinigungsfilter 16. Beispiele geeigneter Reinigungsfilter schliessen Ultrafilter mit einem Molekulargewichtsausschluss zwischen etwa 40.000 Dalton und etwa 100.000 Dalton ein.
Bei kontinuierlicher Zufuhr wird ein flüssiges oder gelöstes Dissoziierungsmittel kontinuierlich als Ausgleich hinzugegeben, bei einer Geschwindigkeit, die der Geschwindigkeit des Filtratverlustes durch Reinigungsfilter 16 entspricht. In einer anderen Ausführungsform wird das durch den Reinigungsfilter 16 ausgeschiedene Filtratvolumen durch eine Filtratpumpe 24 kontrolliert.
Eine Trennung nichtmodifizierten Hbs vom Hb- Rückstand wird typischerweise beendet, wenn das vom Reinigungsfilter 16 abgeflossene Filtratvolumen etwa 500% des Volumens der in Tank 22 vor der Zugabe des Dissoziierungsmittels zum System 10 enthaltenen Hb-Lösung entspricht.
In einer anderen Ausführungsform wird der Hb- Rückstand dann gewaschen und durch Diafiltration mit einem physiologischen Puffer äquilibriert, um den Hb- Rückstand physiologisch verträglich als Blutersatzmittel zu machen. Ein physiologischer Puffer wird in Tank 12 aus dem physiologischen Puffervorrat 26 eingeführt. Dennoch wird angenommen, dass der physiologische Puffer an jedem Ort im System 10 zugegeben werden kann. Es wird ebenfalls angenommen, dass der physiologische Puffer zu dem Hb- Rückstand in einer Charge oder durch kontinuierliche Zufuhr hinzugefügt werden kann.
Ein bevorzugter Puffer schliesst 27 mM Natriumlactat, 12 mM N-Acetyl-L-cystein, 115 mM NaCl und 1,36 mM CaCl&sub2;, in WFI (pH 8) ein.
Der Hb-Rückstand wird dann durch Rezirkulieren des Hb-Rückstandes und physiologischen Puffers von Tank 12 durch Pumpe 14 durch den statischen Mischer 22 und Diafilter 18 diafiltriert. Der Diafilter 18 befindet sich stromabwärts vom statischen Mischer 22 und stromaufwärts von Tank 12. Eine Diafiltration wird fortgesetzt, bis das Blutersatzmittel physiologisch verträglich ist. Typischerweise ist das Blutersatzmittel physiologisch verträglich, wenn der Flüssigkeitsvolumenverlust durch Diafiltration durch den Diafilter 18 mindestens das fünffache des anfänglichen Volumens des Hb-Rückstandes in System 10 ist.
Während der Hb-Dissoziierung und Hb-Rückstand Diafiltration wird die Hb-Temperatur bei annähernd 8ºC bis 12ºC in Tank 14 gehalten. Ein Beispiel eines geeigneten Kontrollmittels der Hb-Temperatur ist das Kühlen der Aussenseite des Tanks 14 durch Verwendung eines Ethylenglycol ummantelten Kühlsystems, nicht dargestellt.
Die Erfindung soll in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen weiter veranschaulicht werden.

Beispiel I

Diafiltration der von Sauerstoff befreiten, einen Dissoziationspuffer höherer Konzentration enthaltenden Hb-Lösung

Eine polymerisierte Hb-Lösung wurde nach dem in Beispiel 1 der U.S. Patentnr. 5.084.558, erteilt an Rausch et al., beschriebenen Verfahren gebildet. Diese Hb-Lösung wurde durch Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) analysiert und gefunden, dass die Lösung etwa 45% Hb-Dimere, etwa 15% nichtmodifizierte Hb-Tetramere und etwa 40% polymerisierte Hb-Moleküle, die grösser als die nichtmodifizierten Tetramere waren, umfasste.
Ein Liter eines Dissoziationspuffers, der 1,5 M MgCl&sub2;, 0,1 M Bis-Tris und 0,2 mM EDTA (pH 6,5) enthielt, wurde zu einem Liter der Hb-Lösung gegeben. Diese Mischung wurde dann durch einen 100 kD Polysulfon- Ultrafilter (Millipore Katalog Nr. PTHK OOOCS) rezirkuliert, um die Mischung auf ein Volumen von einem Liter zu konzentrieren. Die konzentrierte Mischung wurde anschliessend mit 11 Volumen eines Dissoziationspuffers diafiltriert, der 0,7 M MgCl&sub2;, 0,05 M Bis-Tris und 0,1 mM EDTA (pH 6,5) enthielt. Die filtrierte Hb-Lösung wurde dann gewaschen und mit einem von Sauerstoff befreiten Puffer, der 27 mM Natriumlactat, 12 mM N-Acetylcystein, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI enthielt, äquilibriert. Die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Hb-Lösung wurde dann durch GPC analysiert.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Fig. 11 dargestellt. Es wurde dann gefunden, dass die Hb-Lösung eine Endzusammensetzung von etwa 5% Hb-Dimeren, etwa 10% Hb- Tetrameren und etwa 85% polymerisierte Hb-Moleküle, die grösser als die Tetramere waren, hatte.

Beispiel 11

Diafiltration der von Sauerstoff befreiten, einen Dissozationspuffer geringerer Konzentration enthaltenden Hb-Lösung

Einhundertsiebzig ml eines Dissoziationspuffers, der 0,75 M MgCl&sub2;, 0,05 M Bis-Tris und 0,1 mM EDTA (pH 7,5) enthielt, wurden zu 15 ml der ursprünglichen polymerisierten Hb-Lösung von Beispiel I gegeben, und dann wurden 15 ml eines zweifach-Konzentrates des Dissoziationspuffers hinzugefügt. Die Kb-Lösung wurde dann durch einen Chemineer, Inc./Kenics statischen Mischer rezirkuliert und dann durch einen 100 kD Ultrafilter (Amicon YM 100, Katalog Nr. 14451) zum Erhalt von 200 ml der Mb-Lösung diafiltriert.
Die Hb-Lösung wurde dann mit 3 Austauschvolumen des Dissoziationspuffers diafiltriert und zum Schluss mit einem von Sauerstoff befreiten Puffer, der 27 mM Natriumlactat, 12 mM N-Acetylcystein, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI enthielt, gewaschen und äquilibriert. Die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Hb-Lösung wurde dann mit GPC analysiert.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Fig. 11 dargestellt. Es wurde gefunden, dass die Hb-Lösung eine Endzusammensetzung von etwa 15% Hb-Dimeren, etwa 15% Hb- Tetrameren und etwa 70% polymerisierten Hb-Molekülen, die grösser als die Tetramere waren, hatte. Somit zeigte das Verfahren der Erfindung die Wirkung, den Gehalt an nichtmodifiziertem Hämoglobin in den polymerisierten Hb- Lösungen zu verringern.

Beispiel III

Synthese und Diafiltration der sauerstoffbeladenen und von Sauerstoff befreiten Hb-Lösungen ohne Dissoziationspuffer

Wie in U.S. Patentnr. 5.296.465 beschrieben, wurden Proben vollständigen Rinderblutes gewonnen, mit einem Natriumcitrat-Antikoagulanz zum Bilden einer Blutlösung vermischt und dann bezüglich der Endotoxingehalte analysiert.
Jede Probe der Blutlösung wurde nach Erhalt bei einer Temperatur von etwa 2ºC gehalten und dann zum Entfernen grosser Aggregate und Partikel mit einem 600er Maschensieb filtriert.
Vor dem Vereinigen wurde der Penicillingehalt in jeder Blutlösungsprobe mit einem von Difco, Detroit, Michigan erworbenen Testkit unter Verwendung des Verfahrens mit dem Titel "Schnelle Detektion von Penicillin in Milch" untersucht, um sicherzustellen, dass die Penicillingehalte in den Blutlösungen ≤ 0,008 Einheiten/ml waren.
Die Blutlösungsproben wurden dann vereinigt und mit einer von Pyrogen befreiten wässrigen Natriumcitratlösung zum Bilden einer 0,2 gewichtsprozentigen Natriumcitratlösung in vollständigem Rinderblut vermischt (nachfolgend 0,2% Natriumcitrat-Blutlösung).
Die 0,2% Natriumcitrat-Blutlösung wurde dann zum Entfernen grosser Blutlösungsbruchstücke mit einem Durchmesser von annähernd 50 um oder mehr durch seriell angeordnete 800 um und 50 um Polypropylen-Filter, gegeben.
Die RBCs wurden dann zum Abtrennen extracellulärer Plasmaproteine von den RBCs, wie zum Beispiel BSA oder IgG, gewaschen. Um die in der Blutlösung enthaltenen RBCs zu waschen, wurde das Volumen der Blutlösung im Diafiltrationstank anfänglich durch Zugabe eines gleichen Volumens einer filtrierten isotonischen Lösung in den Diafiltrationstank Verdünnt. Die isotonische Lösung wurde mit einer Millipore (Cat # CDUF 050 G1) 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran filtriert. Die isotonische Lösung bestand aus 6,0 g/l Natriumcitratdihydrat und 8,0 g/l Natriumchlorid in Wasser-für-Injektion (WFI). Die ver dünnte Blutlösung wurde dann durch Diafiltration durch einen 0,2 um Hohlfaser-(Microgen Krosflo II Microfiltrationsmodul)diafilter auf ihr ursprüngliches Volumen ankonzentriert. Gleichzeitig wurde kontinuierlich filtrierte isotonische Lösung bei einer der Geschwindigkeit des Filtratverlusts durch den 0,2 um Diafilter entsprechenden Geschwindigkeit als Ausgleich zugegeben. Während der Diafiltration traten Komponenten der verdünnten Blutlösung, die einen signifikant kleineren Durchmesser als die RBCs hatten oder Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Plasma waren, durch die Wände des 0,2 um Diafilters mit dem Filtrat durch. RBCs, Blutplättchen und grössere Teilchen der verdünnten Blutlösung, wie zum Beispiel weisse Blutzellen, wurden mit kontinuierlich zugefügter isotonischer Lösung zurückgehalten, um eine dialysierte Blutlösung zu bilden.
Während des RBC Waschvorganges wurde die verdünnte Blutlösung bei einer Temperatur zwischen etwa 10 bis 25 ºC mit einem Flüssigkeitsdruck am Diafiltereinlass zwischen etwa 120 N/m² (25 psi) und etwa 140 N/m² (30 psi) zum Verbessern der Verfahrenseffizienz gehalten.
Der RBC Waschvorgang wurde beendet, als das Volumen des aus dem Diafilter abgeflossenen Filtrats etwa 600% des Volumens der Blutlösung vor dem Verdünnen mit der filtrierten isotonischen Lösung entsprach.
Die dialysierte Blutlösung wurde dann kontinuierlich bei einer Geschwindigkeit von annährend 4 lpm in eine Sharples Super Centrifuge, Modell # As-16, ausgestattet mit einem #28 Ringdamm, gepumpt. Die Zentrifuge wurde bei gleichzeitiger Zufuhr von dialysierter Blutlösung betrieben, um die RBCs von den weissen Blutzellen und Blutplättchen abzutrennen. Während dem Vorgang rotierte die Zentrifuge bei einer ausreichenden Geschwindigkeit, um die RBCs in eine schwere RBC-Phase abzutrennen, während ebenfalls ein wesentlicher Teil der weissen Blutzellen (WBCs) und Blutplättchen in eine leichte WBC-Phase bei etwa 15.000 upm abgetrennt wurde. Eine Fraktion der RBC- Phase und der WBC-Phase wurde während des Vorganges getrennt und kontinuierlich aus der Zentrifuge abgelassen.
Im Anschluss an die Abtrennung der RBCs wurden die RBCs zum Bilden einer Hämoglobin-enthaltenden Lösung lysiert. Ein wesentlicher Anteil der RBCs wurde während des Abfliessens der RBCs aus der Zentrifuge mechanisch lysiert. Die Zellmembranen der RBCs zerbrachen infolge des Auftreffens auf die Wand der RBC-Phasen-Ablussleitung schräg zur Strömung der RBC-Phase aus der Zentrifuge, wobei Hämoglobin (Hb) aus den RBCs in die RBC-Phase freigesetzt wurde.
Die lysierte RBC-Phase floss dann durch die RBC- Phasen-Abflussleitung in einen statischen Mischer (Kenics ½ Zoll mit 6 Elementen, Chemineer, Inc.). Gleichzeitig mit der Übertragung der RBC-Phase in den statischen Mischer wurde auch eine gleiche Menge an WFI in den statischen Mischer injiziert, worin sich das WFI mit der RBC- Phase vermischte. Die Fliessgeschwindigkeiten der RBC- Phase und des WFI in den statischen Mischer sind jeweils etwa 4 · 10&supmin;&sup6; m³/sec (0,25 lpm).
Durch Vermischen der RBC-Phase mit WFI in dem statischen Mischer wurde ein lysiertes RBC-Kolloid hergestellt. Das lysierte RBC-Kolloid wurde dann aus dem statischen Mischer in eine zum Abtrennen von Hb aus nicht- Hämoglobin Komponenten geeignete Sharples Super Centrifuge (Modell # As-16, Sharples Division of Alfa-Laval Separation, Inc.) überführt. Die Zentrifuge wurde bei einer ausreichenden Geschwindigkeit rotiert, um das lysierte RBC-Kolloid in eine leichte Hb-Phase und eine schwere Phase zu trennen. Die leichte Phase bestand aus Hb und enthielt ebenfalls nicht-Hämoglobin Komponenten mit einer gleichen oder geringeren Dichte als die Dichte von Hb.
Die Hb-Phase floss kontinuierlich aus der Zentrifuge durch eine 0,45 um Millipore Pellicon Cassette, Cat # HVLP 000 C5 Mikrofilter, und in einen Auffangbehälter in Vorbereitung auf die Hb-Reinigung ab. Zellstroma wurden dann mit dem Rückstand aus dem Mikrofilter in den Lagertank zurückgeführt. Während der Mikrofiltration wurde die Temperatur innerhalb des Lagertankes bei 10ºC oder weniger gehalten. Zum Verbessern der Effizienz wurde die Mikrofiltration beim Mikrofiltereinlass bei Anstieg des Flüssigkeitsdruckes von einem Anfangsdruck von etwa 48 N/m² (19 psi) auf etwa 120 N/m² (25 psi) beendet. Das Hb- Mikrofiltrat wurde dann aus dem Mikrofilter in den Mikrofiltrattank überführt.
Anschliessend wurde das Hb-Mikrofiltrat durch einen 100.000 Millipore Cat # CDUF 050 H1 Ultrafilter gepumpt. Ein wesentlicher Anteil des in dem Hb-Mikrofiltrat enthaltenden Hb und Wassers durchdrang den 100.000 Dalton Ultrafilter zum Bilden eines Hb-Ultrafiltrats, während grössere Zellbruchstücke, wie zum Beispiel Proteine mit einem Molekulargewicht über etwa 100.000 Dalton zurückgehalten wurden und zurück in den Mikrofiltrattank rezirkulierten, Gleichzeitig wurde als Ausgleich für den Wasserverlust in dem Ultrafiltrat kontinuierlich WFI in den Mikrofiltrattank zugegeben. Im allgemeinen schliessen Zellbruchstücke alle ganzen und fragmentierten zellulären Komponenten, mit der Ausnahme von Hb, kleineren Zellproteinen, Elektrolyten, Coenzymen und organische metabolische Zwischenprodukte ein. Die Ultrafiltration wurde fortgesetzt, bis die Hb-Konzentration in dem Mikrofiltrattank geringer als 8 Gramm/Liter (g/l) war. Während der Ultrafiltration von Hb wurde die Innentemperatur des Mikrofiltrattanks bei etwa 10ºC gehalten.
Das Hb-Ultrafiltrat wurde in einen Ultrafiltrattank überführt, worin das Hb-Ultrafiltrat dann durch einen 30.000 Dalton Millipore Cat # CDUF 050 T1 Ultrafilter zum Entfernen von kleineren Zellbestandteilen, wie zum Beispiel Elektrolyte, Coenzyme, metabolische Zwischenprodukte und Proteine mit einem geringeren Molekulargewicht als etwa 30.000 Daltons und mit Wasser aus dem Hb- Ultrafiltrat rezirkuliert wurde, wobei eine konzentrierte Hb-Lösung, die etwa 100 g Hb/l enthielt, gebildet wurde.
Die konzentrierte Hb-Lösung wurde dann zum Abtrennen von Hb durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie von dem Ultrafiltrattank auf das in parallelen chromatographischen Säulen (2 Fuss lang mit einem Innendurchmesser von 8 Zoll) enthaltene Medium überführt. Die chromatographischen Säulen enthielten ein Anionenaustauschmedium, das zum Abtrennen von Hb von nicht-Hämoglobin- Proteinen geeignet war. Das Anionaustauschmedium wurde aus Silicagel gebildet. Das Silicagel wurde zum Bilden von aktiven Epoxidgruppen γ-Glycidoxy-Propylsilan ausgesetzt und dann zum Bilden eines quartiären Ammoniumaustauschmediums C&sub3;H&sub7;(CH&sub3;)NCl ausgesetzt. Dieses Verfahren der Silicagel-Behandlung ist im Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976) beschrieben.
Jede Säule wurde durch Spülen der chromatographischen Säulen zum Erleichtern der Hb-Bindung mit einem ersten Puffer vorbehandelt. Dann wurden 4,52 Liter der konzentrierten Hb-Lösung in jede chromatographische Säule injiziert. Nach Injektion der konzentrierten Hb-Lösung wurden dann die chromatographischen Säulen gewaschen, indem hintereinanderfolgend drei verschiedene Puffer durch die chromatographischen Säulen gerichtet wurden, um ein Hb-Eluat durch Herstellen eines pH-Gradienten innerhalb der Säulen herzustellen. Die Temperatur von jedem Puffer war während der Verwendung etwa 12,4ºC. Die Puffer wur den vor der Injektion auf die chromatographischen Säulen durch eine 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran vorfiltriert.
Der erste Puffer, 20 mM Tris-hydroxymethylaminomethan (Tris) (pH etwa 8,4 bis etwa 9,4), transportierte die konzentrierte Hb-Lösung zum Binden von Hb in das Medium in den chromatographischen Säulen. Der zweite Puffer, eine Mischung des ersten Puffers und einem dritten Puffer, wobei der zweite Puffer einen pH von etwa 8,3 hat, stellte den pH innerhalb der chromatographischen Säulen ein, um kontaminierende nicht-Hämoglobin Komponenten aus den chromatographischen Säulen unter Zurückhalten von Hb zu eluieren. Äquilibrierung mit dem zweiten Puffer dauerte für etwa 30 Minuten bei einer Fliessgeschwindigkeit von annähernd 5,93 · 10&supmin;&sup5; m³/sec (3,56 lpm) pro Säule an. Das Eluat des zweiten Puffers wurde verworfen. Der dritte Puffer, 50 mM Tris (pH etwa 6,5 bis etwa 7,5) eluierte dann das Hb aus den chromatographischen Säulen.
Das Hb-Eluat wurde dann durch einen 0,22 u Sartobran Cat # 5232507 GIPH Filter in einen Tank überführt, worin das Hb-Eluat gesammelt wurde. Die ersten 3- bis -4% des Hb-Eluats und die letzten 3- bis -4% des Hb-Eluats wurden verworfen.
Enthielt das Eluat weniger als 0,05 EU/ml Endotoxin und weniger als 3,3 nmol/ml Phospholipide, wurde das Hb- Eluat weiterverwendet. Zu 60 Litern des Ultrapur-Eluates, das eine Konzentration von 100 g Hb/l hatte, wurden 9 l 1,0 M NaCl, 20 mM Tris (pH 8,9) Puffer gegeben, wobei eine Hb-Lösung mit einer Ionenstärke von 160 mM gebildet wurde, um die Sauerstoffaffinität des Hb in der Hb-Lösung zu verringern. Die Hb-Lösung wurde dann durch Rezirkulieren durch den Ultrafilter, genauer einen 10.000 Dalton Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 Filter, bei 10ºC konzentriert, bis die Hb-Konzentration 110 g/l war.
Die Hb-Lösung wurde dann von Sauerstoff befreit, bis der pO&sub2; der Hb-Lösung auf den HbO&sub2;-Gehalt von etwa 10% verringert wurde, indem die Hb-Lösung bei 12 lpm durch eine 0,05 um Hoechst-Celanese Corporation Cat # G-240/40) Polypropylen Mikrofilter Phasentransfermernbran rezirkuliert wurde, um eine von Sauerstoff befreite Hb-Lösung zu bilden (im Folgenden "deoxy-Hb"). Gleichzeitig wurde eine 60 lpm Stickstoffgas-Strömung auf die Gegenseite der Phasentransfermembran gerichtet. Während dem Befreien von Sauerstoff wurde die Temperatur der Hb-Lösung zwischen etwa 19ºC und etwa 31ºC gehalten.
Auch während der Befreiung von Sauerstoff und anschliessend während des gesamten Vorganges, wurde das Hb in einer Umgebung mit geringem Sauerstoff gehalten, um die Sauerstoffabsorption durch das Hb zu minimieren und einen geringeren sauerstoffbeladenen Hb (Oxyhämoglobin oder HbO&sub2;)-Gehalt als 10% im deoxy-Hb zu halten.
Das deoxy-Hb, 60 l, wurde dann durch einen Ultrafilter mit 180 l eines Lagerpuffers, der 0,2 gew-.% N- Acetylcystein, 33 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) mit einem geringeren pO&sub2; als 6,7 · 10³ N/m² (50 Torr) enthielt, diafiltriert, um ein Oxidation-stabilisiertes deoxy-Hb zu bilden. Vor dem Mischen mit dem deoxy-Hb wurde der Lagerpuffer mit einem 10.000 Dalton Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 von Pyrogen befreienden Filter von Pyrogen befreit.
Der Lagerpuffer wurde kontinuierlich bei einer Geschwindigkeit, die annährend dem Flüssigkeitsverlust durch den Ultrafilter entsprach, zugegeben. Die Diafiltration dauerte an, bis der Flüssigkeitsvolumenverlust durch Diaflitration durch den Ultrafilter etwa das dreifache des anfänglichen Volumens des deoxy-Hb war. Das Material kann an dieser Stelle gelagert werden.
Vor der Überführung des Oxidation-stabilisierten deoxy-Hb in ein Polymerisationsapparat wurde Sauerstoffdepletiertes WFI in den Polymerisationsreaktor gegeben, um den Polymerisationsapparat zum Verhindern eines Sauerstoffbeladens des Oxidation-stabilisierten deoxy-Hb von Sauerstoff zu reinigen. Die in den Polymerisationsapparat zugegebene WFI-Menge war die Menge, die in einer Hb- Lösung mit einer Konzentration von etwa 40 g Hb/l resultieren würde, wenn das Oxidation-stabilisierte deoxy-Hb in den Polymerisationsreaktor gegeben werden wurde. Das WFI wurde dann durch den Polymerisationsapparat rezirkuliert, um das WFI durch Fliessen durch eine 0,05 um Polypropylen-Mikrofilter Phasentransfermembran (Hoechst- Celanese Corporation Cat # 5PCM-108, 7,4 m² (80 sq. ft.)) gegen einen Gegenfluss von unter Druck befindlichen Stickstoff von Sauerstoff zu befreien. Die Fliessgeschwindigkeiten von WFI und Stickstoffgas, durch die Phasentransfermembran betrugen etwa 3 · 10&supmin;&sup4; bis 3,3 · 10&supmin;&sup4; m³/sec (18 bis 20 lpm) und beziehungsweise 6,7 · 10&supmin;&sup4; m³/sec bis 1 · 10&supmin;³ m³/sec (40 bis 60 lpm).
Nachdem der pO&sub2; von WFI im Polymerisationsapparat auf weniger als etwa 2 Torr pO&sub2; verringert wurde, wurde der Polymerisationsreaktor mit Stickstoff durch einen Stickstofffluss von etwa 3,33 · 10&supmin;&sup4; m³/sec (20 lpm) in den Kopfraum des Polymerisationsreaktors gespült. Das Oxidation-stabilisierte deoxy-Hb wurde dann in den Polymersationsreaktor überführt.
Die Polymerisation wurde in einem 12 mM Phosphatpuffer mit einem pH von 7,8 mit einer Chloridkonzentration von weniger oder gleich etwa 35 mmolar durchgeführt, der durch Vermischen der Hb-Lösung mit WFI hergestellt wurde.
Das Oxidation-stabilisierte deoxy-Hb und N- Acetylcystein wurden nacheinanderfolgend mit dem Vernetzungsmittel Glutaraldehyd, genauer 29,4 Gramm Glutaraldehyd für jedes Kilogramm Hb über einen fünfstündigen Zeitraum unter Erhitzen auf 42ºC und Rezirkulieren der Hb- Lösung durch einen Kenics 1 - 1/2 Zoll statischen Mischer mit 6 Elementen (Chemineer, Inc.) zum Bilden einer polymerisierten Hb (poly(Hb))-Lösung langsam vermischt.
Ein Rezirkulieren des Oxidation-stabilisierten deoxy-Hb und des Glutaraldehyds durch den statischen Mi scher bedingte turbulente Flussbedingungen mit im allgemeinen gleichförmigen Vermischen des Glutaraldehyds mit dem Oxidation-stabilisierten deoxy-Hb, wobei das Bildungspotential von deoxy-Hb-Taschen, die hohe Glutaraldehyd-Konzentrationen enthalten, verringert wurde. Im allgemeinen verringerte ein gleichförmiges Vermischen des Glutaraldehydes und deoxy-Hb die Bildung von hochmolekularem poly(Hb) (mit einem Molekulargewicht über 500.000 Dalton) und erlaubte ebenfalls ein schnelleres Vermischen von Glutaraldehyd und deoxy-Hb während der Polymerisation.
Zusätzlich erfolgte während der Hb-Polymerisation signifikant intramolekulare Hb-Vernetzung als eine Folge des Vorhandenseins von N-Acetylcystein bei der Hb- Polymerisation.
Nach der Polymerisation wurde die Temperatur der poly(Hb)-Lösung in dem Polymerisationsreaktor auf eine Temperatur zwischen etwa 15ºC bis etwa 25ºC verringert.
Die poly(Hb)-Lösung wurde dann durch Rezirkulieren der poly(Hb)-Lösung durch den Ultrafilter ankonzentriert, bis die Konzentration der poly(Hb)-Lösung auf etwa 85 g/l erhöht wurde. Ein geeigneter Ultrafilter ist ein 30.000 Dalton Filter (Z. B. Millipore Helicon, Cat # CDUF050LT).
Anschliessend wurde die poly(Hb)-Lösung dann mit 66,75 g Natriumborhydrid vermischt und dann wieder durch den statischen Mischer rezirkuliert. Spezifischer wurden pro je neun Liter der poly(Hb)-Lösung ein Liter 0,25 M Natriumborhydrid-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,12 lpm hinzugefügt.
Vor der Zugabe von Natriumborhydrid zu der poly(Hb)- Lösung wurde der pH der poly(Hb)-Lösung durch Einstellen des pHs auf einen pH von etwa 10 basisch gemacht, um das Natriumborhydrid zu konservieren und Wasserstoffgas- Bildung zu verhindern. Der pH der poly(Hb)-Lösung wurde durch Diafiltration der poly(Hb)-Lösung mit annährend 215 1 von Pyrogen befreiten, von Sauerstoff befreiten 12 mM Natriumboratpuffer auf einem pH von etwa 10,4 bis etwa 10,6 eingestellt. Die poly(Hb)-Lösung wurde durch Rezirkulieren der poly(Hb)-Lösung aus dem Polymerisationsreaktor durch den 30 kD Ultrafilter diafiltriert. Der Natriumboratpuffer wurde zu der poly(Hb)-Lösung bei einer der Geschwindigkeit des Flüssigkeitsverlustes durch den Ultrafilter bei Diafiltration entsprechenden Geschwindigkeit hinzugefügt. Diafiltration wurde fortgesetzt, bis der Flüssigkeitsvolumenverlust durch den Ultrafilter bei Diafiltration etwa dem dreifachen des anfänglichen Volumens der poly(Hb)-Lösung in dem Polymerisationsreaktor entsprach.
Im Anschluss an die pH-Einstellung wurde Natriumborhydrid-Lösung in den Polymerisationsreaktor zum Reduzieren der Iminbindungen in der poly(Hb)-Lösung zu Ketiminbindungen und zum Bilden von stabilem poly(Hb) in Lösung gegeben. Während der Natriumborhydrid Zugabe wurde die poly(Hb)-Lösung in dem Polymerisationsreaktor konti nuierlich durch den statischen Mischer und die 0,05 um Polypropylen Mikrofilter Phasentransfermembran zum Entfernen von gelöstem Sauerstoff und Wasserstoff rezirkuliert. Ein Fliessen durch einen statischen Mischer stellte ebenfalls turbulente Natriumborhydrid Flussbedingungen bereit, die das Natriumborhydrid mit der poly(Hb)-Lösung schnell und wirkungsvoll vermischten. Die Fliessgeschwindigkeiten der poly(Hb)-Lösung und des Stickstoffgases durch die 0,05 um Phasentransfermembran waren zwischen etwa 3,3 · 10&supmin;&sup5; bis 6,7 · 10&supmin;&sup5; m³/Sec (2,0 bis 4,0 lpm) und beziehungsweise etwa 2 · 10&supmin;&sup4; bis 3 · 10&supmin;&sup4; m³/sec (12 bis 18 lpm). Nach Beenden der Natriumborhydrid Zugabe wurde die Reduktion in dem Polymerisationsreaktor fortgesetzt, während ein darin enthaltender Rührer mit annährend 75 Umdrehungen pro Minute rotierte.
Etwa eine Stunde nach der Natriumborhydrid Zugabe wurde die stabile poly(Hb)-Lösung aus dem Polymerisationsreaktor durch den 30.000 Dalton Ultrafilter rezirkuliert, bis die stabile poly(Hb)-Lösung Konzentration 110 g/l betrug. Im Anschluss an die Konzentrierung wurden der pH und Elektrolyte der stabilen poly(Hb)-Lösung auf physiologische Gehalte wiederhergestellt, um ein stabiles polymerisiertes Hb-Blutersatzmittel zu bilden, wobei die stabile poly(Hb)-Lösung durch den 30.000 Dalton Ultrafilter, mit einem filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffer mit niedrigem pH, der 27 mM Natriumlactat, 12 mM NAC, 115 NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI (pH 5,0) ent hielt, diafiltriert wurde. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis der Flüssigkeitsvolumenverlust durch Diafiltration durch den Ultrafilter etwa dem sechsfachen des Präfiltrationsvolumens des konzentrierten Hb-Produktes entsprach.
Nachdem der pH und Elektrolyte auf physiologische Gehalte wiederhergestellt worden sind, wurde das stabile polymerisierte Hb-Blutersatzmittel dann auf eine Konzentration von 5,0 g/dl durch Zugabe des filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffers mit niedrigem pH in den Polymerisationsreaktor verdünnt. Das verdünnte Blutersatzmittel wurde dann durch Rezirkulieren aus dem Polymerisationsreaktor durch den statischen Mischer und einen 100.000 Dalton Reinigungsfilter gegen einen filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffer, der 27 mM Natriumlactat, 12 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI (pH 7,8) enthielt, diafiltriert. Die Diafiltration wurde fortgesetzt bis das Blutersatzmittel weniger als oder gleich etwa 10% modifizierte tetramere und nichtmodifizierte tetramere Arten durch GPC unter dissoziierenden Bedingungen enthielt.
Der Reinigungsfilter wurde unter Bedingungen mit geringem transmembranen Druck mit einer eingeschränkten Durchflussleitung betrieben. Im Anschluss an das Entfernen wesentlicher Mengen modifizierten tetrameren Hbs und nichtmodifizierten tetrameren Hbs dauerte das Rezirkulieren des Blutersatzmittels durch den 30.000 Dalton Ultra filter an, bis die Konzentration des Blutersatzmittels etwa 130 g/l betrug.
Das stabile Blutersatzmittel wurde dann in einem geeigneten Behälter mit einer niedrigen Sauerstoffumgebung und geringem Sauerstoffeinbruch gelagert.
Diese Hb-Lösung wurde anschliessend durch GPC untersucht und befunden, dass sie etwa 3,5% Hb-Dimere, 31% nichtmodifizierte Hb-Tetramere und etwa 65,5% polymerisierte Hb-Moleküle, die grösser als nichtmodifizierte Tetramere waren, enthielt.
Zwei Liter der Hb-Lösung wurde durch eine Sauerstoffbeladungs-Kartusche mit einer Gasmischung, die 98% Sauerstoff und 2% Kohlendioxid enthielt, mit Sauerstoff beladen, bis 95% sauerstoffbeladene Hb-Ventile durch ein Cooximeter (Co-Oximeter Modell #482; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) erhalten wurden.
Die sauerstoffbeladene Hb-Lösung wurde dann mit 7 Volumen einer sauerstoffbeladenen Pufferlösung, die 27 mM Natriumlactat, 12 mM N-Acetyl-L-Cystein, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,4 mM CaCl&sub2; in WFI enthielt, gegen einen 100 kD Ultrafilter diafiltriert. Innerhalb dieses Arbeitsschrittes wurde die Hb-Lösung nicht mit einem Dissoziationspuffer in Kontakt gebracht.
Die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Hb-Lösung wurde dann durch GPC untersucht. Die Molekulargewichtsverteilung war 0,5% Dimere und 2,7% nichtmodifizierte Tetramere und etwa 96,8% polymerisierte Hb- Moleküle, die grösser als nichtmodifizierte Tetramere waren.
Dieses gesamte Verfahren wurde dann mit einer anderen Probe der gleichen polymerisierten Hb-Lösung wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Hb-Lösung nicht vor der Diafiltration sauerstoffbeladen wurde. Die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Hb-Lösung wurde mit GPC bei 2,2% Dimeren, 2,5% nichtmodifizierte Tetrameren und etwa 95,3% polymerisierten Hb-Molekülen, die grösser als nichtmodifizierte Tetramere waren, bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigen, dass eine Sauerstoffbeladung von Hämoglobin wahrscheinlich die Dissoziation nichtmodifizierter Hb-Tetramere zu Hb-Dimere fördert. Dennoch fördert eine Sauerstoffbeladung die Bildung von nichterwünschtem Methämoglobin.

Beispiel IV

Molekulargewichtsanalyse

Molekulargewichtsanalyse wurde durch Durchführen von. Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) unter dissoziierenden Bedingungen bestimmt. Dieses Analyseverfahren resultiert in der Abtrennung von Hämoglobinpolymeren auf der Basis der Grösse, wobei grössere Moleküle schneller als kleinere Moleküle eluieren. Durch Vergleich mit Protein- Molekulargewichtsstandards ist es möglich die Elutions dauer mit den Molekuargewichten der Hämoglobinprodukte zu vergleichen.
In dieser Analyse wurde eine repräsentative Probe des Hämoglobinproduktes bezüglich der Molekulargewichtsverteilung untersucht. Das Hämoglobinprodukt wurde auf 4 mg/ml innerhalb einer mobilen Phase von 50 mM Bis-Tris (pH 6,5), 750 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM EDTA verdünnt. Die verdünnte Probe wurde auf eine HPLC TosoHaas G3000SW Säule injiziert. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min und ultraviolette Detektion erfolgte bei 280 nm.

Claims

1. Ein Verfahren zur Trennung nichtmodifizierten Hämoglobins von vernetztem Hämoglobin in einer Hämoglobin-Lösung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen der Hämoglobin-Lösung mit mindestens einem Dissoziierungsmittel, um eine Dissoziationslösung zu bilden, worin nicht- modifiziertes tetrameres Hämoglobin unter Bildung von Hämoglobin-Dimeren dissoziiert ist und

b) Trennen der Hämoglobin-Dimeren aus der Dissoziationslösung unter Zurückhalten des vernetzten Hämoglobins in besagter Dissoziationslösung.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens ein Teil des Hämoglobins in der Hämoglobin-Lösung polymerisiert ist.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Dissoziationsmittel ein wasserlösliches anorganisches Salz ist.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, worin das anorganische Salz (a) ein Natriumsalz ist; oder (b) ein mehrwertiges Kation einschließt, das zum Beispiel aus Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Zn²&spplus; und Kombinationen davon ausgewählt ist.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Dissoziationsmittel ein wasserlösliches organisches Salz, z. B. Salz eines Amins, ist.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Dissoziationsmittel ein wasserlösliches organisches Amin, z. B. Guanidin, ist.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das außerdem den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Hämoglobin-Lösung mit einem Puffer, z. B. 2,2- Bis(hydroxymethyl)-2,2',2"-nitrilotriethanol, umfasst.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das außerdem den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Hämoglobin-Lösung mit einem Stabilisierungsmittel, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure, umfasst.

9. Ein Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin das nichtmodifizierte Hämoglobin von der Dissoziationslösung durch Filtrieren der Dissoziationslösung getrennt wird.

10. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das außerdem den Schritt des Waschens des vernetzten Hämoglobins mit einem physiologisch geeigneten Puffer nach Trennen des nichtmodifizierten Hämoglobins von der Dissoziationslösung umfasst, zur Herstellung eines physiologisch verträglichen Hämoglobin- Blutersatzmittels.

11. Ein Verfahren zur Trennung nichtmodifizierten Hämoglobins von vernetztem Hämoglobin in einer Hämoglobin-Lösung, zur Herstellung eines physiologisch verträglichen Blutersatzmittels, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen der Hämoglobin-Lösung mit einem Dissoziierungsmittel, zur Bildung einer Dissoziationslösung, worin nichtmodifiziertes tetrameres Hämoglobin zur Bildung von Hämoglobin- Dimeren dissoziiert ist;

b) Filtrieren der Hämoglobin-Dimeren von der Dissoziationslösung, unter Zurückhalten vernetzten Hämoglobins im Rückstand; und

c) Waschen des vernetzten Hämoglobins mit einem physiologischen Puffer zur Herstellung eines physiologisch verträglichen Blutersatzmittels.

12. Ein Verfahren nach Anspruch 11, worin der Puffer Natriumlactat und N-Acetyl-L-cystein enthält.

13. Ein Verfahren zur Trennung nichtmodifizierten Hämoglobins von vernetztem Hämoglobin in einer Hämoglobin-Lösung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Mischen der Hämoglobin-Lösung mit einem Dissoziationsmittel, einem Puffer und einem Stabilisierungsmittel zur Bildung einer Dissoziationslösung, worin das nichtmodifizierte Hämoglobin dissoziiert, zur Bildung von Hämoglobin-Dimeren in der Dissoziationslösung;

b) Filtrieren der Dissoziationslösung zur Trennung der Hämoglobin-Dimeren von dem vernetzten Hämoglobin; und

e) Waschen der Lösung des vernetzten Hämoglobins mit einer von Sauerstoff befreiten Lösung, die Natriumlactat, N-Acetyl-L-cystein und physiologische Elektrolyte enthält.

14. Ein Blutersatzmittel, das ein Hämoglobin-Produkt umfaßt, das mit einem Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche hergestellt oder herstellbar ist.

15. Ein Blutersatzmittel, das ein Produkt gemäß Anspruch 14 zur therapeutischen Anwendung umfasst.

16. Verwendung eines Produkts, das durch ein Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche 1 bis 13 erhältlich ist, zur Herstellung eines Blutersatzmittels zur in vivo Anwendung.