DE69534438T2

DE69534438T2 - Verbindungen für Ceramid-vermittelter Signalübertragung

Info

Publication number: DE69534438T2
Application number: DE69534438T
Authority: DE
Inventors: Dennis A. Carson; Howard B. Cottam; D. Bruce Wasson
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1995-12-18
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2015-12-19
Also published as: AU717243B2; EP0801568A1; DE69527438T2; DE69534438D1; DE69527438D1; EP0801568B1; CA2208580A1; ATE303994T1; ATE220549T1; AU4601996A; JPH11502193A; WO1996020710A1; EP0801568A4

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft Verbindungen, welche bei der Modulierung von zellulären Antworten, die durch Ceramid-vermittelte Signalübertragung, insbesondere in Antwort auf einen Stimulus durch das Cytokin Tumornekrosefaktor α (TNFα), stimuliert werden, wirksam sind. Genauer gesagt, betrifft sie Verbindungen, welche die Entwicklung von Leiden, die mit einem Zell-Stimulus über den Ceramid-vermittelten Signalübertragungsweg assoziiert sind, inhibieren.
2. Geschichte des Stands der Technik.
Der Sphingomyelin-Weg ist ein zellulärer Signalübertragungsweg, von dem man annimmt, dass er bei der Vermittlung von zellulären Antworten auf mehrere Cytokine (einschließlich TNFα und IL-1β) und Wachstumsfaktoren (z. B. Blutplättchen-entstammender (Platelet derived) Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor) beteiligt ist (siehe z. B. Dressler et al., Science, 259: 1715–1718, 1992; und Jacobs und Kester, Amer. J. Physiol., 265: 740–747, 1993). Es wird angenommen, dass die Wechselwirkung derartiger Moleküle mit Zelloberflächenrezeptoren die Aktivierung einer Plasmamembran-Sphingomyelinase auslöst. Sphingomyelinase katalysiert ihrerseits die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphocholin. Man nimmt an, dass Ceramid als ein "Second Messenger" durch die Aktivierung einer Prolin-gerichteten Serin/Threonin-Kinase (Ceramid-aktivierte Proteinkinase oder "CaPK") wirkt. Ceramid interagiert auch mit MAP-Kinase und Proteinkinase C zeta (siehe z. B. Rivas et al., Blood, 83: 2191–2197, 1993) und mit einer Serin/Threonin-Protein-Phosphatase (siehe Hannun et al., TIBS, 20: 73–77, 1995).
Jüngere Untersuchungen haben Beweise erbracht, dass der Sphingomyelin-Weg Zellseneszenz und Apoptose (programmierter Zelltod) in Antwort auf TNF-α (siehe z. B. Jayadev et al., J. Biol. Chem., 270: 2047–2052, 1994; und Dbaibo et al., J. Biol. Chem., 268: 17762–17766, 1993) und Strahlung (Haimovitz-Friedman et al., J. Exp. Med., 180: 525–535, 1994) vermitteln kann. In dieser Hinsicht ist vermutet worden, dass Ceramid die Effekte von TNF-α auf intrazelluläre Prozesse nachahmt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung richtet sich auf die Entwicklung und Verwendung von Verbindungen, welche zelluläre Antworten auf Ceramid-Metabolite des Sphingomyelin-Signalübertragungsweges, wie Entzündung, Fibrose, Ultraviolettlicht-induzierte Immunsuppression in der Haut, Zellseneszenz und Apoptose, inhibieren.
In einem Aspekt besteht die Erfindung in neuen Verbindungen, aufgebaut aus heterocyclischen Molekülen mit biologisch aktiven Seitenketten (die "Verbindungen der Erfindung"). Verbindungen auf Isochinolon-Basis sind in der Erfindung eingeschlossen.
Die Verbindungen der Erfindung inhibieren die Aktivität von cAMP-Phosphodiesterase nicht und bringen daher keine Gefahr von Nebenwirkungen, welche mit anderen TNF-α-Inhibitoren (z. B. Pentoxifyllin) assoziiert sind, wie Schlaflosigkeit und Angst, mit sich. Überraschenderweise besaß einer der wirkungsvolleren, hierin beschriebenen Inhibitoren der TNF-α-Aktivität (Verbindung 37) tatsächlich den geringsten inhibitorischen Effekt auf Phosphodiesterase-Typ IV, das vorherrschende Phosphodiesterase-Isoenzym in Monozyten und Neutrophilen. Dies beruht auf der Tatsache, dass Verbindungen, wie 37, keine Methylxanthin-Struktur aufweisen. Viele übliche Phosphodiesterase-Inhibitoren (wie Theophyllin, Theobromin und Koffein) sind Methylxanthin-Verbindungen.
Darüber hinaus inhibieren alle Verbindungen der Erfindung die Apoptose und verlangsamen zelluläre Antworten auf TNF-α in vitro und in vivo mit größerer Wirksamkeit als Pentoxifyllin. Unerwarteterweise scheint die Wirksamkeit wenigstens der Nicht-Isochinolon-Verbindungen teilweise von der Gegenwart von Ring-Stickstoffatomen (verschieden von Pyrimidin-Stickstoffen) abhängig zu sein, was nahe legt, dass die Bindung an den für die beobachtete Inhibition der Aktivität von TNF-α verantwortlichen Zielre zeptor ebenfalls zu einem gewissen Ausmaß durch das Vorhandensein solcher Ring-Stickstoffatome reguliert wird. Ferner scheinen die Effekte von allen Verbindungen ohne jede Beziehung zur Phosphodiesterase-Inhibition zu sein. Dies ist besonders interessant angesichts der Tatsache, dass Erhöhungen der cAMP-Spiegel in Zellen eine Apoptose in B-Zellen induzieren können (siehe z. B. Lømo et al., J. Immunol., 154: 1634–1643, 1995).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung der neuen Verbindungen in der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren von Ceramid-aktivierten zellulären Antworten auf Stimuli, insbesondere Stimuli für Zellseneszenz und Apoptose. Dieser Aspekt der Erfindung besitzt potenzielle therapeutische Bedeutung in der Behandlung von mit Zelltod assoziierten Leiden, wie Schlaganfall, Herz-Ischämie, Nervenschädigung und der Alzheimer-Krankheit.
Ein anderer Aspekt der Erfindung nutzt die Fähigkeit der Verbindungen der Erfindung, UV-Strahlung zu absorbieren. Dieser Aspekt der Erfindung besitzt potenzielle therapeutische Bedeutung für die Behandlung und Prävention von Strahlendermatosen, einschließlich derjenigen, welche mit Therapie-Schemata zur Behandlung von Krebs assoziiert sind.
Von den Verbindungen der Erfindung wird erwartet, besonders nützlich bei der Verringerung der Auswirkungen der Alterung der Haut sowie des Ausbruchs und des Fortschreitens von Strahlendermatitis zu sein.
Weitere Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung, welche darin eingeschlossen sind, werden aus der folgenden Offenbarung offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine Balkengrafik, welche die Inhibition der Zellwachstums-Arretierung in 3T3-Fibroblasten gemäß der Erfindung darstellt, nachdem die Wachstumsarretierung herbeigeführt wurde, indem den Zellen das Serum entzogen wurde. Die Zellen wurden inkubiert und bis zu 90% Konfluenz in Serum herangezogen. Dann wurde das Medium entfernt und durch serumfreies Medium ersetzt. Um den Effekt einer Verbindung (Nr. 37, ein Pteridin) auf die Zellseneszenz in Gegenwart von Ceramid zu untersuchen, wurden Aliquots der Zellen mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen davon inkubiert. Die Konzentrationen an Verbindung Nr. 37 sind durch die eingefügte Legende angegeben, während die Konzentrationen an Ceramid entlang der x-Achse angegeben sind. Inhibitorische Effekte wurden über eine Messung der DNA-Synthese bewertet; die Detektion des [³H]-Thymidin-Einbaus ist entlang der y-Achse angegeben.
Die 2 ist eine Balkengrafik, welche die Inhibition der Zellapoptose gemäß der Erfindung in humanen (Jurkat) T-Lymphozyten darstellt. Die inhibitorische Aktivität von zwei Verbindungen (Nr. 37 und 6 (ein Purin)) wurde im Vergleich zur gleichartigen Aktivität von Pentoxyfillin und einer Kontrollverbindung, Ro 20-1724, getestet. Die Aktivierung des Sphingomyelin-Signalübertragungsweges wurde durch Inkubation der Zellen mit einem monoklonalen Anti-FAS-Antikörper stimuliert (welcher CD95 bindet, einen Zelloberflächenrezeptor, der Zellapoptose auslöst). Die prozentuale Inhibition wurde als eine Funktion der Anzahl von Zellen gemessen, welche den Vitalfarbstoff Erythrosin B ausschlossen. Die prozentuale Inhibition ist entlang der y-Achse angegeben, wohingegen die Konzentration der getesteten Verbindungen entlang der x-Achse angegeben ist.
Die 3 ist eine Balkengrafik, welche die Inhibition der Aktivität aufgrund der Beteiligung von CaPK gemäß der Erfindung in Jurkatzellen zeigt. Die inhibitorische Aktivität einer Verbindung (Nr. 37) wurde in Gegenwart von entweder Ceramid oder Anti-FAS gestestet. Die Inhibition der CaPK-Aktivität wurde als eine Funktion der Phosphorylierung gemessen und durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Verbindungen, mit denen die Zellen inkubiert wurden, sind entlang der y-Achse angegeben, während der Prozentsatz der Kontrolle (d. h. Inhibition von CaPK) entlang der x-Achse angegeben ist. Kürzere Balken zeigen eine größere relative Inhibition an.
Die 4(a)–(c) sind Kopien von Spektralaufzeichnungen, welche die Absorption der Verbindungen Nr. 37, Nr. 6, Nr. 37 in Kombination mit Nr. 6, Oxo-Varianten von Nr. 37 und 6 sowie, zum Vergleich, PABA (p-Aminobenzoesäure, ein übliches Sonnenschutz-Additiv) und Isochinolon anzeigen. Die Verbindungen Nr. 37, Nr. 6 und Oxo-Varianten davon absorbierten über den Großteil des UVB-Wellenlängenbereichs hin weg, wohingegen eine Mischung aus den Verbindungen Nr. 37 und 6 über den gesamten UVB-Wellenlängenbereich absorbierte.
Die 5(a) bzw. (b) zeigen die Ergebnisse eines Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assays (ELISA) für die TNF-α-Erzeugung durch mit bakteriellem Lipopolysaccharid (Endotoxin) stimulierte humane Monozyten, welche mit den hierin beschriebenen Verbindungen und einer Kontrollverbindung (RO-1724, welche ein bekannter und spezifischer Inhibitor von Phorsphodiesterase-Typ-IV ist [der vorherrschenden Isoform von Phosphodiesterase, welche in Monozyten und Neutrophilen gefunden wird]) inkubiert wurden. Die getesteten Verbindungen sind durch die an sie zugewiesene Nummer in der Tabelle 1 identifiziert. Die horizontale Achse jeder Grafik zeigt die Menge jeder getesteten Verbindung (in μM), während die vertikale Achse die IC₅₀-Werte für die TNF-α-Erzeugung als einen Prozentsatz der Erzeugung in Gegenwart von lediglich der Kontrollverbindung zeigt.
Die 6 ist eine Balkengrafik, welche die Ergebnisse eines ELISA-Assays für die Inhibition der Aktivität von Phosphodiesterase-Typ-IV durch die Kontrollverbindung (Ro 20-1724) und mehrere der Verbindungen der Erfindung darstellt. Die horizontale Achse identifiziert das Ausmaß der erreichten Inhibition in pMol Substrat/Minuten Kontakt/mg Phosphodiesterase Typ IV. Die Mengen jeder getesteten Verbindung sind entlang der vertikalen Achse angegeben. Die getesteten Verbindungen werden durch die Nummer, welche ihnen in der Tabelle 1 zugewiesen ist, identifiziert.
Die 7 ist eine Grafik, welche die Ergebnisse eines Assays auf in vivo-Leukopenie in Mausblut in Antwort auf Lipopolysaccharid (LPS) zeigt. Durch LPS induzierte Leukopenie wird durch TNF vermittelt. Somit untersucht dieses Modell sowohl TNF-Erzeugung als auch -Wirkung. Hinsichtlich der Inhibition von Leukopenie getestete Verbindungen werden durch die an sie in der Tabelle 1 zugewiesene Nummer identifiziert. Entlang der x-Achse der Grafik entsprechen die Zahlen der Anzahl an weißen Blutzellen, welche als Zellen/ml Flüssigkeit nachgewiesen werden. Die Ergebnisse (gezeigt durch Balken) werden als ein Prozentsatz der Leukopenie-Antwort (basierend auf dem Neutrophilen-Gehalt) auf reines LPS in Abwesenheit von anderen Verbindungen ausgedrückt.
Die 8 zeigt die Ergebnisse eines Assays auf durch hierin beschriebene Verbindungen (Nr. 37 und 6) verursachte Inhibition der Effekte eines zellpermeablen Ceramid-Analogs (C₂-Ceramid), von Dihydroceramid und von Diacylglycerol auf die TNF-α-Produktion von humanen Monozyten. Die Inhibition der TNF-α-Produktion wurde mittels ELISA gemessen; die Ergebnisse sind in pg/ml TNF-α entlang der x-Achse angegeben.
Die 9 zeigt die Ergebnisse eines Assays auf Inhibition durch eine hierin beschriebene Verbindung (Nr. 37), um die stimulatorischen Effekte von C₂-Ceramid oder Proteinkinase-C-Aktivität in humanen Lymphozytenextrakten zu verhindern. Inhibitorische Effekte wurden über eine Messung der DNA-Synthese bewertet; der [³H]-Thymidin-Einbau-Nachweis ist entlang der y-Achse angegeben.
Die 10 zeigt die Ergebnisse eines Assays auf in vitro-TNF-α-Produktion durch humane Makrophagen in Antwort auf Lipopolysaccharid (LPS) und Inhibition dieser Produktion durch eine Pteridinverbindung und durch eine Isochinolonverbindung der Erfindung (Nr. 37 und 1I-49). Entlang der x-Achse der Grafik entsprechen die Zahlen der Konzentration an nachgewiesenem TNF-α in pg/ml.
Die 11 zeigt die Inhibition der PDGF-induzierten Fibroblastenproliferation unter 3T3-Fibroblasten in Antwort auf hierin beschriebene Verbindungen. Die getesteten Verbindungen werden entlang der x-Achse durch die Nummern, welche ihnen in der Tabelle 1 zugeordnet sind, identifiziert. Inhibitorische Effekte wurden als ein Maß der DNA-Synthese bewertet; der [³H]-Thymidineinbau-Nachweis ist entlang der y-Achse angegeben.
Die 12 zeigt die Inhibition der EGF-induzierten Fibroblastenproliferation unter 3T3-Fibroblasten in Antwort auf hierin beschriebene Verbindungen. Die getesteten Verbindungen werden entlang der x-Achse durch die Nummern, welche ihnen in der Tabelle 1 zugeordnet sind, identifiziert. Inhibitorische Effekte wurden über eine Messung der DNA-Synthese bewertet; der [³H]-Thymidineinbau-Nachweis ist entlang der y-Achse angegeben.
Die 13 zeigt Daten, welche die vor Apoptose schützenden Eigenschaften einer hierin beschriebenen Verbindung (IC-261) und einer Verbindung der Erfindung, wie sie durch die Verbindung 1I-49 repräsentiert wird, aufzeigen. Humane Lymphozyten wurden in Serumaliquots mit den Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die entlang der x-Achse der FIGUR angegeben sind, kultiviert. Schützende Effekte wurden über 4 Tage als eine Funktion der Länge des Überlebens der kultivierten Zellen in Gegenwart der Verbindungen, im Vergleich zum Überleben der Zellen in Abwesenheit der Verbindungen, gemessen. Ein 100%iges Überleben (y-Achse) bedeutet, dass eine Anzahl behandelter Zellen vollständig während der gesamten Testdauer überlebte, wohingegen eine gleiche Anzahl an unbehandelten Zellen abstarb.
Die 14 zeigt die Struktur von kommerziell erhältlichen Isochinolin-Strukturen, deren inhibitorischer Effekt in Hinsicht auf die Produktion von TNF-α durch humane Monozyten vor einer Modifikation zur Anfügung von Seitenketten-Substituenten gemäß der Erfindung getestet wurde. Außer der Verbindung S52 626-6 (6,7-Dimethoxy-1(2H)-isochinolin, welches eine milde inhibitorische Aktivität besaß, wie in der 10 gezeigt) besaß keine der getesteten Verbindungen irgendeine derartige inhibitorische Aktivität vor ihrer Modifikation gemäß der Erfindung, sogar bei Konzentrationen von bis zu 500 μM.
I. Verbindungen
Die hierin beschriebenen Verbindungen umfassen im Allgemeinen Purine, Pteridine, Thiadiazolopyrimidine und Chinazoline, welche gemäß den untenstehend beschriebenen Schemata hergestellt werden. Zur Bezugnahme sind die bei der Synthese der Verbindungen angewandten Techniken Adaptationen des gut bekannten Traube-Syntheseprotokolls (Lister, "Purines" (Wiley-Interscience, 1971, auf S. 220), wobei mit 4,5-Diaminopyrimidinen begonnen wird; d. h.: (1) für die Purine im Allgemeinen, siehe Brown, "The Chemistry of Heterocyclic Compounds: Fused Pyrimidines", Teil II, The Purines, 1971, auf S. 31–90; (2) für die 9-Dieazapurine insbesondere siehe Fox. et al., J. Org. Chem., 43: 2536, 1978; (3) für die Pteridine siehe für eine Beschreibung der standardmäßigen Timmis-Reaktion, Nishigaki, et al., Heterocycles, 15: 757–759, 1981; Timmis, Nature, 164: 139, 1949 (oder andere standardmäßige Traube-ähnliche Protokolle für die Herstellung von Pteridinen durch Ringschluss von Diamino-Pyrimidinen unter Verwendung eines Zwei-Kohlenstoff-Reagenz); und (4) für die Pyrimidine, siehe Schrage und Hitchings, J. Org. Chem., 16: 207, 1951.
Verbindungen, Intermediate und Verbindungen, welche zum Vergleich der Aktivität mit den hierin beschriebenen Verbindungen getestet wurden, sind in der nachstehenden Diskussion durch die Nummern identifiziert, welche jeder Verbindung in Tabelle 1 zugeordnet werden.

dec: = Zersetzung

dec: = Zersetzung

B. Purin-Synthese
Die hierin beschriebenen Purine besitzen folgende allgemeine Formel (I):
worin Z N oder CH ist;
R₂ (CH₂)_nA ist, worin:
A NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist;
n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen;
und vorzugsweise R₁ ein ω-Carboxyalkyl, ω-Carboxyalkenyl oder ω-Carboxyaryl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, worin die aromatische Gruppe ferner einen Substituenten A (wie oben definiert) aufweist;
R₂ H, ein Alkyl (einschließlich aliphatischen und alicyclischen und heteroalicyclischen Formen), Alkenyl, Aralkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist;
R₃ das gleiche wie R₂ ist; und
X H, ein beliebiges Halogen, OH, SH, OR' oder SR' ist, worin R' ein Alkyl, Alkenyl, Phenyl oder Benzyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Diese Verbindungen werden mittels des unten stehenden Synthese-Schemas synthetisiert (welches detaillierter in den Beispielen beschrieben wird).
Schema I
(PURINE)
Es wurden 3 grundlegende Syntheseprotokolle im Schema I angewandt; d. h.:
Verfahren A
Im Allgemeinen wurde Theobromin als das Ausgangsmaterial unter Bedingungen angewandt, um sicherzustellen, dass eine N-1-Alkylierung an Stelle von O-6-Alkylierung stattfand. Die Verbindungen 4 bis 8, 10 und 11 (Tabelle 1) wurden durch dieses Verfahren hergestellt. Die Verbindungen 10 und 11 insbesondere wurden durch eine Variation des Alkylierungsverfahrens hergestellt, in welchem Theobromin zuerst bromiert wurde, um 8-Bromtheobromin (Verbindung 9) zu erhalten, und dann alkyliert wurde. Der 8- Brom-Substituent wurde auch durch NaSH verdrängt, um die entsprechenden 8-Thioxo-Derivate, Verbindungen 12 und 13, zu erhalten.
Verfahren B
Dieses Verfahren beruht im Wesentlichen auf dem Traube-Purinsynthese-Protokoll, auf welches oben stehend Bezug genommen wurde. Das Verfahren wurde eingesetzt, um 1,3,8-trisubstituierte Xanthine herzustellen, welche keine Alkylgruppe an der N-7-Position tragen. In dieser Verfahrensweise wurde das N-1-substituierte Pyrimidin an der Position N-3 alkyliert. Die Bildung des Purinrings war durch Nitrosierung, Reduktion des Nitroso zum Amin durch katalytische Hydrierung, danach Ringschluss unter Verwendung von Harnstoff oder Kaliumethylxanthat vollständig, wodurch die Verbindungen 24 und 25 vorgesehen wurden (8-Oxo- bzw. 8-Thioxo-Derivate). Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in den Beispielen zur Verfügung gestellt.
Verfahren C
Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um die N-3-Propylpurine herzustellen. Das verwendete Ausgangsmaterial war n-Propylharnstoff, der mit Ethylcyanoacetat in Gegenwart von Natriumethoxid kondensiert wurde, wodurch man das 6-Amino-1-propylpyrimidindion in einer mäßigen Ausbeute erhielt. Kommerziell erhältliches 3-n-Propylxanthin konnte ebenfalls als das Ausgangsmaterial verwendet werden.
Der Ringschluss wurde wie beschrieben in Beispiel A bewerkstelligt, außer, dass Diethoxymethylacetat als die Quelle für den Kohlenstoff in dem Ringschließungsschritt eingesetzt wurde. Dann wurden sequenzielle Alkylierungen unter Verwendung von Alkylhalogeniden durchgeführt, um die letztendliche Verbindung 31 zu ergeben (Ethyl-4-(2,3,6,7-tetrahydro-2,6-dioxo-7-methyl-3-n-propyl-1H-purin-1-yl)butansäure). Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in den Beispielen angegeben.
C. Synthese von Pteridinen
Die hierin beschriebenen Pteridine besitzen die allgemeine Formel (II):
R₁ ist (CH₂)_nA, worin:
A NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist;
n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen;
und, vorzugsweise R₁ ein ω-Carboxyalkyl, ω-Carboxyalkenyl oder ω-Carboxyaryl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, worin die aromatische Gruppe ferner einen Substituenten A (wie oben stehend definiert) aufweist;
R₂ H, ein Alkyl (einschließlich aliphatischen und alicyclischen und heteroalicyclischen Formen), Alkenyl, Aralkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist;
R₄ das Gleiche wie R₂, OH oder ein O-Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist;
R₅ das Gleiche wie R₂, OH oder ein O-Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; und
Z N oder CH ist.
Diese Verbindungen werden durch das unten stehende Syntheseschema synthetisiert (welches in weiterer Ausführlichkeit in den Beispielen beschrieben ist).
Schema II
(PTERIDINE)
Das Verfahren C (oben stehend) wurde als ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung von N-Alkylen in Bevorzugung gegenüber O-Alkylen in dieser Gruppe gewählt. Das Verfahren C wurde zu diesem Zweck wie folgend modifiziert:
Die Synthese der Pteridine basierte auf Orthodiaminopyrimidinen als Vorläufern. Der Ringschluss der Orthodiamine (Verbindungen 33 und 28) wurde mit einer Zwei-Kohlenstoff-Quelle (z. B. Glyoxal) unter Herstellung der Verbindungen 34 und 35 (N-1-substituierte Pteridine) bewerkstelligt. Die Alkylierung am N-3, wie beschrieben in Hinsicht auf Verfahren A, erzeugte die gewünschten Pteridine (Verbindungen 36–38). Ferner erzeugte die Verwendung von 3,4-Hexandion in dem Ringschlussschritt ein li pophileres Derivat (Verbindung 41; 6,7-Diethylpteridin). Die Kondensation von Verbindung 22 mit Dimethylacetylendicarboxylat bildete die Verbindung 39 (1,3-Dialkylpteridin), während die Behandlung von Verbindung 27 mit Phenethylamin, gefolgt von Alkylierung, die Verbindung 43 (6-Phenyldialkylpteridin) bereitstellte. Beide der letztgenannten Protokolle verwendeten eine Timmis-Reaktion, um die gewünschten Produkte herzustellen. Eine ausführliche Beschreibung dieser Protokolle ist in den Beispielen vorgesehen.
D. Thiadiazolo-Pyrimidin-Synthese.
Die hierin beschriebenen Thiadiazolo-Pyrimidine besitzen die allgemeine Formel (III):
R₁ ist (CH₂)_nA, worin:
A NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist;
n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen;
und vorzugsweise R₁ ein ω-Carboxyalkyl, ω-Carboxyalkenyl oder ω-Carboxyaryl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, worin die aromatische Gruppe ferner einen Substituenten A (wie oben definiert) aufweist; und
R₂ H, ein Alkyl (einschließlich aliphatischen und alicyclischen und heteroalicyclischen Formen), Alkenyl, Aralkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist.
Diese Verbindungen werden mittels des unten stehenden Synthese-Schemas synthetisiert (welches detaillierter in den Beispielen beschrieben ist).
Schema III
(THIADIAZOLOPYRIMIDINE)
Das Verfahren C (oben stehend) wurde als ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung von N-Alkylen in Bevorzugung gegenüber O-Alkylen in dieser Gruppe gewählt. Das Verfahren C wurde für diesen Zweck wie folgend modifiziert:
Die Synthese der Pyrimidine basierte auf Orthodiaminopyrimidinen als Vorläufern. Der Ringschluss der Orthodiamine wurde durch Behandlung mit Thionylchlorid in Gegenwart von Pyridin bewerkstelligt. Die Alkylierung dieser Intermediate erzeugte die Verbindungen 47 und 48 (disubstituierte Pyrimidine). Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in den Beispielen angegeben.
E. Isochinolin-Synthese
Die Isochinoline der Erfindung zur Verwendung in der medizinischen Therapie besitzen die folgende allgemeine Formel (IV):
R₂ ist (CH₂)_nA, worin:
A H, NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist;
n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen;
und vorzugsweise R₂ ein ω-Carboxyalkyl, ω-Carboxyalkenyl oder ω-Carboxyaryl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, worin die aromatische Gruppe ferner einen Substituenten A (wie oben definiert) aufweist; und
R₃ H, ein Alkyl (einschließlich aliphatischen und alicyclischen und heteroalicyclischen Formen) oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist;
R₄ H, OH, NH₂ oder O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen ist;
R₆ H, OH, NO, NO₂, NH₂, ein O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen oder X ist, worin:
X H, ein beliebiges Halogen, OH, SH, OR' oder SR' ist, worin R' ein Alkyl, Alkenyl, Phenyl oder Benzyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; und
R₇ H, OH, NO, NO₂, NH₂, ein O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen oder X ist, worin:
X H, ein beliebiges Halogen, OH, SH, OR' oder SR' ist, worin R' ein Alkyl, Alkenyl, Phenyl oder Benzyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist.
Die vorliegende Erfindung sieht des Weiteren eine Verbindung der oben stehenden allgemeinen Formel IV vor, worin jedoch, wenn R₃, R₄, R₆ und R₇ jeweils Wasserstoff sind und A COOR ist, worin R Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, n dann nicht ... ist.
Diese Verbindungen wurden durch Erwerben von Isochinolinen von Aldrich Chemical (siehe 14) und Anfügen von Seitenketten an die Ringstruktur synthetisiert, wie oben stehend und in den Beispielen in Hinsicht auf die hierin beschriebenen Purin-, Pteridin- und Thiadiazolopyrimidin-Verbindungen beschrieben. Nur die 6,7-Dimethoxy-1(2H)-isochinolin-Verbindung (Aldrich # S52.626-6) besaß irgendeinen inhibitorischen Effekt auf die TNF-α-Herstellung vor der obenstehend beschriebenen Addition der Seitenketten (siehe Beispiel 7).
F. Chinazolin-Synthese
Hierin beschriebene Chinazoline werden gemäß des folgenden Schemas synthetisiert und werden hinsichtlich der Struktur durch Verbindung 52 repräsentiert:
Schema IV
(DIDEAZAPTERIDINE ODER CHINAZOLINE)
Die Verbindung 52 (ein Chinazolin-Derivat; Ethyl-4-(1-methyl-2,4-dioxochinazol-3-yl)butansäure) wurde wie folgend hergestellt:
Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll war N-Methylisatosäureanhydrid. Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in den Beispielen angegeben.
II. Verfahren zur Verwendung der Verbindungen der Erfindung
Die Verbindungen der Formeln I bis IV können an einen Säuger-Wirt verabreicht werden, um mit TNF-α- und IL-1-Produktion und Aktivierung des Ceramid-vermittelten Signalübertragungsweges assoziierte zelluläre Antworten zu verzögern. Insbesondere können die hierin beschriebenen Verbindungen an einen Säuger verabreicht werden, um die Aktivierung von Ceramid-abhängigen intrazellulären biochemischen Wegen in Zielzellen zu verlangsamen, ohne die Aktivität von Phosphodiesterase in den Zielzellen zu inhibieren oder die Spiegel von Diacylglycerol darin zu beeinflussen. Wie hierin beispielhaft aufgeführt, wird erwartet, dass die hierin beschriebenen Verfahren bei der Bereitstellung von Schutz gegen Entzündung und übermäßige Bildung von fibrotischem Gewebe durch Verringerung der Produktion von TNF-α durch stimulierte Monozyten von besonderem Nutzen sind. Wie ferner hierin beispielhaft veranschaulicht, wird ebenfalls erwartet, dass die hierin beschriebenen Verbindungen (insbesondere die Isochinoline der Erfindung und Pteridine) wirksam bei der Bereitstellung von Schutz gegen Zellseneszenz oder Zell-Apoptose sind, wie sie als ein Ergebnis von Verletzung (z. B. Strahlendermatitis) und Alterung (z. B. der Haut und anderer Organe) stattfinden. In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "Bereitstellen von Schutz gegen" die klinisch signifikante Inhibition von zellulären Antworten auf Stimuli (Signale), deren Übertragung an die Zelle zur Gänze oder zum Teil durch den Ceramid-vermittelten Sphingomyelin-Signalübertragungsweg erleichtert wird.
Für die Zwecke dieser Offenbarung werden deshalb Entzündung, Fibroblastenproliferationen, Zellseneszenz und Zellapoptose in Antwort auf Ceramid-vermittelte Signalübertragung über den Sphingomyelinweg als "Ceramid-assoziierte" Leiden betrachtet. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird mit der Identität und den klinischen Anzeichen von spezifischen Ceramid-assoziierten Leiden vertraut sein oder kann diese ohne weiteres feststellen und kann klinische Anzeichen einer Verbesserung davon (wie Reduktionen der Serumspiegel von TNF-α und eine Verbesserung der klinischen Gesundheit) zusätzlich zu denjenigen, welche hierin beispielhaft angegeben sind, identifizieren.
Für die Verabreichung werden die hierin beschriebenen Verbindungen vorzugsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert. Solche Träger schließen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele von nicht-wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholisch/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferten Medien, ein.
Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Lactat-Ringer oder gehärtete Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Fluid- und Nährstoff-Ergänzer, Elektrolyt-Ergänzer (wie diejenigen, basierend auf Ringer-Dextrose) und dergleichen ein. Konservierungsstoffe und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und Inertgase und dergleichen.
Beispielhaft für feste Träger sind Lactose, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pectin, Acacia, Magnesiumstearat, Stearinsäure, mikrokristalline Zellulose, Polymer-Hydrogele und dergleichen. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel jedwedes dem Fachgebiet gut bekannte Zeitverzögerungsmaterial, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs, Mikrokapseln, Mikrosphären, Liposomen und Hydrogelen einschließen. Zur weiteren Bezugnahme könnte der Fachmann wünschen, die Standard-Referenz Remington's Pharmaceutical Sciences zu konsultieren (welche hierin als Bezugstelle einbezogen ist, um den Kenntnisstand im Fachgebiet in Hinsicht auf geeignete pharmazeutische Träger zu veranschaulichen).
Eine große Vielzahl von pharmazeutischen Formen kann angewandt werden. Bei Verwendung eines festen Trägers kann die Präparation daher tablettiert, in eine harte Gelatine-Kapsel, in Pulver- und Pelletform oder in die Form einer Tablette, Pastille oder eines Suppositoriums gebracht werden. Bei Verwendung eines flüssigen Trägers kann die Präparation in der Form einer Flüssigkeit, wie einer Ampulle, oder als eine wässrige oder nicht-wässrige flüssige Suspension vorliegen. Eine topische Verabreichung über Zeitverzögerungs-Hautpflaster ist ebenfalls eine geeignete pharmazeutische Form.
Dosierungen der hierin beschriebenen Verbindungen werden abhängig vom Alter, Gewicht und dem vorliegenden Zustand des zu behandelnden Wirtes sowie von der Wirksamkeit der verabreichten jeweiligen Verbindung variieren. Solche Variablen werden vom Durchschnittsfachmann auf dem klinischen Gebiet ohne weiteres berücksichtigt werden. Insbesondere werden Dosierungen für jeden Empfänger, basierend auf der Schwere des zu behandelnden Leidens und der Zugänglichkeit der Zielzellen für die pharmazeutischen Formulierungen der Erfindung, nach oben oder nach unten angepasst. Falls möglich, wird es bevorzugt, die pharmazeutischen Formulierungen der Erfindung lokal an der Stelle der Zielzellen zu verabreichen; z. B. auf entzündete Haut oder mittels Infusion an ein anderes Organ des Wirtes. Somit werden die Dosierungen ebenfalls in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und dem Ausmaß variieren, zu welchem erwartet wird, dass die Formulierungen der Erfindung Zielzellen vor Verdünnung oder Clearance der Formulierung erreichen. Bevorzugte Verabreichungswege sind durch topische Verabreichung, lokale Injektion oder parenterale Infusion, obwohl orale und intravaskuläre Wege ebenfalls angewandt werden können.
Basierend auf der Erfahrung mit anderen Inhibitoren von intrazellulären Antworten auf externe Stimuli (wie Pentoxifyllin) und den hierin vorgesehenen Daten, kann man erwarten, dass im Allgemeinen gute Ergebnisse im einem erwachsenen Wirt von etwa 60 kg Körpergewicht in einem Dosierungsbereich von etwa 500 bis etwa 4000 mg/Tag, vorzugsweise zwischen etwa 1000 und etwa 3500 mg/Tag erzielt werden (d. h. eine "therapeutisch wirksame Dosierung"). Diese Dosierungen können mit anderen herkömmlichen pharmazeutischen Therapien für Entzündung und Fibrose; z. B. Verabreichung von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Medikamenten, kombiniert werden.
Die hierin beschriebenen Verbindungen variieren hinsichtlich der Wirksamkeit. Eine Zusammenfassung der Wirksamkeit jeder Verbindung (welche als Prozentsatz der Inhibition der intrazellulären Antworten auf LPS, nämlich der Herstellung von TNF-α, ausgedrückt wird, wobei Antworten auf reines LPS = 100% sind, und als die Konzentration der Verbindung der Erfindung gemessen werden, welche benötigt wird, um die TNF-α-Herstellung um 50% zu inhibieren) ist in der Tabelle 1, oben stehend, vorgesehen. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass niedrigere oder höhere Dosierungen der hierin beschriebenen Verbindungen erfordert sein können, abhängig von der Wirksamkeit der jeweiligen Verbindung, welche verabreicht wird.
III. Verfahren zur Identifizierung von therapeutisch wirksamen Analoga der hierin beschriebenen Verbindungen
Dem Durchschnittsfachmann werden Methoden geläufig sein, um Analoga zu den hierin spezifisch beschriebenen Verbindungen zu entwickeln, welche, obwohl sie nicht strukturell identisch dazu sind, die gleiche biologische Aktivität besitzen. Solche Verbindungen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung und können gemäß der Protokolle identifiziert werden, welche nachstehend und in den Beispielen beschrieben sind.
Durch Exposition von Zellen an die hierin beschriebenen Verbindungen unter regulierten Bedingungen, können das Ansprechen von Zellen auf Entzündungs-Agenzien und die intrazellulären Mechanismen hierfür untersucht werden. Diese Information wird nicht nur die intrazellulären Wege besser aufklären, welche für zelluläre Antworten auf bestimmte Stimuli verantwortlich sind, sondern wird auch bei der Identifikation von therapeutischen Anti-Entzündungs- und Anti-Fibrose-Verbindungen helfen.
Um therapeutische Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Ceramid-assoziierten Leiden, wie Entzündung und Fibrose, zu identifizieren und zu selektieren, werden Zellen (oder intrazelluläre Komponenten wie Mikrosomen), welche nicht an ein entzündliches oder Fibroblastenproliferation-induzierendes Agens (z. B. LPS, TNF-α, IL-1, PDGF) exponiert worden sind, an ein solches Agens und die therapeutische Kandidatenverbindung ausgesetzt. Spezifisch gesagt, wird eine Kontrollgruppe von Zellen mit einer bekannten Menge des entzündungsfördernden oder Fibroblastenproliferation-induzierenden Agens inkubiert. Behandlungsgruppen von Zellen werden an die gleiche Menge an entzündungsförderndem oder Fibroblastenproliferation-induzierendem Agens sowie an Aliquots der therapeutischen Kandidatenverbindung exponiert. Entzündungs-Antworten oder Fibroblastenproliferation in jeder Gruppe werden durch dem Fachmann bekannte, herkömmliche Methoden nachgewiesen (wie den in den Beispielen beschriebenen Assay-Schritten) und verglichen.
Um therapeutische Verbindungen zur Verwendung beim Behandeln von Ceramid-assoziierten Leiden wie Zellseneszenz und Apoptose zu identifizieren und selektieren, werden Zellen (oder intrazelluläre Komponenten, wie Mikrosomen), welche nicht an ein Seneszenz oder Apoptose induzierendes Agens (z. B. Cytokine, wie TNF-α, und exogene Stimuli, wie Wärme, Strahlung und chemische Mittel) exponiert worden sind, an ein derartiges Agens und an die therapeutische Kandidaten-Verbindung exponiert. Die Inhibition von Seneszenz oder Apoptose wird als eine Funktion des Zellwachstums gemessen. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird mit Techniken zum Erhalten derartiger Messungen vertraut sein, für welche Beispiele nachstehend angegeben sind.
"Therapeutisch wirksame Verbindungen" werden diejenigen sein, welche bei Verabreichung gemäß der Erfindung und angemessenen medizinischen Praktiken Zellen einen Schutz gegen Ceramid-assoziierte Leiden im Vergleich zu Kontrollwerten für zelluläre Reaktionen auf ein Mittel, welches ein Ceramid-assoziiertes Leiden induziert, gewähren.
Nachdem die Erfindung vollständig beschrieben worden ist, werden nachstehend Beispiele dargelegt, welche ihre Ausführung veranschaulichen.
In den Beispielen bezieht sich die Abkürzung "min." auf Minuten, "hrs" und "h" bezieht sich auf Stunden, und Maßeinheiten (wie "ml") werden durch die standardmäßigen Abkürzungen angegeben. "Schmp." bezieht sich auf den Schmelzpunkt.
Beispiel 1
Inhibition von Zellseneszenz nach Serumentzug in serumabhängigen Zellen
Viele Zelltypen sind von Serumfaktoren für das Wachstum abhängig. Daher sieht der Entzug von Serum bei solchen Zellen ein Modell zur Untersuchung von Verbindungen vor, um Zellantworten auf intrazelluläre Ceramid-vermittelte Signalübertragung zu modulieren. Insbesondere erzeugt der Entzug von Serum aus serumabhängigen Zellkulturen erhöhte intrazelluläre Spiegel an endogenem Ceramid und kann auch die intrazellulären Spiegel an endogenem Diacylglycerol erhöhen (siehe z. B. Jayadev, et al., J. Biol. Chem., 270: 2047–2052, 1995).
Um den inhibitorischen Effekt der hierin beschriebenen Verbindungen auf Ceramid-assoziierte Leiden in vitro zu erfassen, wurde das Serumentzug-Modell eingesetzt. Spezifisch wurden 3T3-Fibroblastenzellen in 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten in DMEM in der Gegenwart von 10% fötalem Rinderserum ausgesät. Die Zellen wurden bis zu 90% Konfluenz inkubiert.
Das Medium wurde entfernt, die Zellen gewaschen und in serumfreiem DMEM erneut inkubiert. Verbindung Nr. 37 und zellpermeables Ceramid wurden den Vertiefungen bei jeweiligen Konzentrationen von 0, 4, 40 oder 400 μM Verbindung Nr. 37 bzw. 0, 5 oder 10 μM Ceramid zugesetzt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden 0,5 μCi [³H]-Thymidin für 2 Stunden lang in jede Vertiefung zugegeben. Die DNA-Synthese in der getesteten Zellpopulation wurde durch herkömmliche Techniken zum Nachweisen von [³H]-Thymidin-Einbau überprüft. Die Ergebnisse dieses Assays sind in der 1 angegeben und untermauern die Zellseneszenz inhibierende Wirksamkeit der beschriebenen Verbindungen (wie repräsentiert durch Verbindung Nr. 37).
Beispiel 2
Inhibition der Zellapoptose nach CD95-Stimulation
Ein Aktivierung des Zelloberflächenrezeptors CD95 (ebenfalls bekannt als Fas/Apo-1-Antigen) löst eine Zellapoptose aus. DX2 ist ein funktioneller Anti-FAS(CD95)-Antikörper, welcher, nach Bindung an CD95, die SMase-Katalyse der Sphingomyelin-Hydrolyse und die Herstellung von Ceramid aktivieren wird (siehe, re DX2, Cifone, et al., J. Exp. Med., 177: 1547–1552, 1993, dessen Beschreibung hierin als Bezugstelle zur Verwendung beim Zugang zum DX2-Antikörper einbezogen ist). Somit ist die Bindung an CD95 ein Modell für die Induktion von Apoptose über den Sphingomyelin-Signalübertragungsweg.
Um den inhibitorischen Effekt der hierin beschriebenen Verbindungen auf die Ceramid-vermittelte Zellapoptose zu untersuchen, wurden humane T-Lymphoblasten (Jurkat) bei 2 × 10⁶ Zellen pro ml in RPMI-1640 suspendiert, welches mit Insulin, Transferrin, Selen und Glutamin ergänzt worden war. Nach 2 Stunden langer Inkubation bei Raumtemperatur entweder mit Verbindung Nr. 37, Verbindung Nr. 6, Pentoxifyllin oder einer Kontrollverbindung (Ro-1724) wurden 25 ng/ml Anti-FAS-Antikörper zu jeder Suspension zugesetzt. Nach weiteren 2 Stunden wurde die Zellapoptose als eine Funktion der Anzahl von Zellen (gezählt mittels Hämozytometer), welche den Vitalfarbstoff Erythrosin B ausschlossen, gemessen. Die Ergebnisse des Experiments sind in der 2 angegeben und belegen die Apoptose-inhibierende Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen (wie repräsentiert durch die Verbindungen Nr. 6 und 37, insbesondere der letztgenannten).
Um den inhibitorischen Effekt der hierin beschriebenen Verbindungen auf den Tod von humanen Lymphozyten zu untersuchen, wurden humane Lymphozyten des peripheren Blutes aus normalem menschlichen Blut isoliert und durch Adhäsion an ein Kunststoffsubstrat von Monozyten befreit. Die Lymphozyten wurden dann in RPMI-1640-Medium mit 10% autologem Plasma bei einer Anfangskonzentration von 2 × 10⁶ Zellen pro ml kultiviert. Aliquots der Zellproben wurden aufgeteilt, und eine Hälfte der Proben wurde entweder mit Verbindung 37 oder Verbindung 1L-49 (ein Isochinolon, dessen Struktur in Beispiel 7 gezeigt wird) vier Tage lang inkubiert. Die verbleibende Hälfte der Proben ließ man 4 Tage lang ruhen. Die Zelllebensfähigkeit nach vier Tagen wurde durch Erythrosin-B-Farbstoffausschluss in einem Hämocytometer bestimmt.
Wie in der 13 gezeigt, schützten die Verbindungen der Erfindung (wie repräsentiert durch Verbindung 1L-49), bei zunehmenden Konzentrationen, die Zellprobenpopulation um bis zu 100% im Vergleich zur Überlebensrate von unbehandelten Lymphozyten vor dem Tod.
Beispiel 3
Inhibition der Aktivität von Ceramid-aktivierter Proteinkinase
Ceramid-aktivierte Proteinkinase (CaPK) ist ein 97 kDa großes Protein, welches ausschließlich membrangebunden vorliegt, und von welchem angenommen wird, eine Rolle im Sphingomyelin-Signalübertragungsweg zu spielen. Es wird insbesondere angenommen, dass CaPK die Phosphorylierung eines Peptids vermittelt, welches von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist, die Thr⁶⁶⁹ des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors umgibt (d. h. Aminosäuren 663–681). Diese Stelle wird auch von der Mitogen-aktivierten Kinase MAP (ebenfalls bekannt als eine Familie von extrazellulären Signal-regulierten Kinasen) erkannt. Somit gibt der Effekt der hierin beschriebenen Verbindungen auf die CaPK-Aktivität in Zellen Hinweise für den Effekt, welchen die Verbindungen auf die Signalübertragung im Sphingomyelin-Weg ausüben.
In dieser Absicht wurden Jurkat-Zellen bei 2 × 10⁶ Zellen pro ml in RPMI-1640-Medium suspendiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Nach 2 Stunden langer Inkubation wurden entweder Verbindung 37, 20 μM Ceramid oder 25 ng/ml Anti-FAS-Antikörper DX2 zu jeder Suspension zugesetzt und 15 Minuten lang inkubiert. Nach Zentrifugation und Waschen wurden die Zellen in einem "Dounce"-Homogenisator getrennt homogenisiert.
Die Ceramid-Kinase-Spiegel in jeder Testprobe wurden bestimmt, wie beschrieben von Liu et al., J. Biol. Chem., 269: 3047–3052, 1994 (dessen Beschreibung hierin zur Bezugnahme und Verwendung beim Assay auf Ceramid-Kinase einbezogen ist). Kurz gesagt, wurde die Membranfraktion aus jeder Testprobe von behandeltem Zellhomogenat durch Ultrazentrifugation isoliert und auf einem 10%igem PAGE-Gel laufen gelassen. Das Gel wurde mit Guanidin-HCl gewaschen und in HEPES-Puffer renaturiert. Dann wurde [³²P]-ATP zu dem Gel zugesetzt und 10 Minuten dort belassen. Danach wurde das Gel gründlich mit 5% TCA gewaschen. Autophosphorylierte Kinase wurde durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Ergebnisse dieses Assays sind in der 3 angegeben und belegen die CaPK-inhibierende Wirkung der hierin beschriebenen Verbindungen (wie repräsentiert durch Verbindung 37).
Beispiel 4
Absorption von UVB-Strahlung durch die hierin beschriebenen Verbindungen
Strahlung (insbesondere in dem UVB-Wellenlängenbereich) ist eine Hauptursache für Hautschaden (einschließlich Apoptose) bei Menschen. Wie oben stehend an anderer Stelle angegeben, nimmt man an, dass der Sphingomyelin-Signalübertragungsweg zumindest an den frühen Stufen der Entwicklung von strahlungsinduzierten Dermatosen beteiligt ist (einschließlich Strahlendermatitis, Sonnenbrand und UVB-induzierte Immunsuppression durch Strahlungsschaden an Langerhans-Zellen in der Haut; siehe z. B. Haimovitz-Friedman et al., J. Exp. Med., 180: 525–535, 1994 [zelluläre Antworten auf ionisierende Strahlung]; und Kurimoto und Streilein, J. Immunol., 145: 3072–3078, 1992 [kutane Immunsuppression durch UVB-Exposition]). Daher wäre eine Verbindung, welche Zellantworten auf die Stimulierung des Sphingomyelin-Signalübertragungswegs durch Strahlung inhibieren wird, und topisch an der Stelle der Exposition verabreicht werden kann, von großem Nutzen bei der Verzögerung des Schadens, der mit einer Strahlungsexposition assoziiert ist (z. B. durch Exposition an Sonnenlicht oder Strahlung).
Um die strahlungsabsorbierenden Fähigkeiten der hierin beschriebenen Verbindungen zu untersuchen, wurden die Ultraviolettspektren von hierin beschriebenen Verbindungen (Nr. 6 und 37, allein, in Kombination und als 8-Oxo-Derivate) ausgewertet und mit denjenigen eines kommerziell erhältlichen Sonnenschutz-Additivs (PABA) und Isochinolin verglichen. Die Spektren wurden unter Verwendung eines KONTRON-Analysegeräts identifiziert. Wie in der 4 angegeben, absorbierten die hierin beschriebenen Verbindungen (wie repräsentiert durch die Verbindungen Nr. 6 und 37) über den Großteil des UVB-Bereichs hinweg, was Wirksamkeit bei der Absorbierung von Strahlung anzeigte. Überraschenderweise zeigte sich, dass eine Mischung aus den Verbindungen Nr. 6 und 37 über den gesamten UVB-Bereich hinweg absorbierte. Angesichts der etwas größeren Absorptions-Charakteristika von Verbindung 37 verglichen mit Verbindung 6 kann man daher vernünftigerweise erwarten, dass Mischungen der zwei in Verhältnissen von 1 : 1 oder größer (zu Gunsten von Verbindung 37) eine substanzielle synergistische Wirksamkeit bei der Absorbierung von Strahlung und der Verlangsamung ihrer Effekte auf Zellen aufweisen werden.
Beispiel 5
Inhibition von TNF-α-Herstellung durch die hierin beschriebenen Verbindungen
Wie in der 5(a) gezeigt, sind hierin beschriebene Verbindungen mit N-1-Kettenlängen von 2–5 Kohlenstoffatomen besonders nützlich zur Inhibierung der TNF-α-Herstellung in vitro, wohingegen N-1-Kettenlängen von etwa 4 Kohlenstoffen (mit einem terminalen Ester) in dieser Hinsicht optimal zu sein scheinen (im Vergleich zu einer Kontrollverbindung; 5(b)). Ferner waren die veresterten Verbindungen signifikant wirksamere Inhibitoren der TNF-α-Herstellung als ihre Carboxyl-Gegenstücke. Diese Daten wurden wie folgend erhalten:
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden aus normalem humanem Blut auf Hypaque-Ficoll-Dichtegradienten isoliert. Ein Teil der isolierten Zellen wurde durch Adhäsion an Gelatine-beschichtete Flaschen weiter gereinigt.
100-μl-Aliquots von Monozyten wurden auf 96-Loch-Mikrotiterplatten bei einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI-1640-Medium eingebracht, welches 10% fötales Rinderserum enthielt. Nach 24 Stunden langer Inkubation wurden verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen (5) zu den plattierten Zellen in einem Volumen von 100 μl zugegeben und eine Stunde lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde 1 μg/ml LPS in jede Vertiefung gegeben.
18 Stunden nach der Exposition der plattierten Zellen an LPS wurden 100 μl Medium aus jeder Vertiefung abgenommen und (mittels ELISA) auf Freisetzung von TNF-α getestet, wobei rekombinantes humanes TNF als ein Standard verwendet wurde. Die Empfindlichkeit des Assays lag im Bereich von 10–100 pg/ml.
Beispiel 6
Relativ niedrige Inhibition von Phosphodiesterase-IV-Aktivität durch hierin beschriebene Verbindungen
Wie in der 6 gezeigt, scheint es eine geringe Korrelation zwischen der Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen hinsichtlich der Inhibierung der Aktivität von Phosphodiesterase und der Inhibierung der Aktivität von TNF-α zu geben. Zum Beispiel war die wirkungsvollste Pteridinverbindung bei der Inhibierung der TNF-α-Herstellung in vitro (# 37) ein sehr schwacher Inhibitor von Phosphodiesterase IV, sogar bei mikromolaren Konzentrationen.
Diese Daten bestätigen, dass die beschriebenen Verbindungen nicht auf Phosphodiesterase abzielen, um die TNF-α-Herstellung zu regulieren. Die Daten wurden wie folgend erhalten:
Die Reaktion wurde mit der Zugabe von PDE begonnen und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert und danach durch 2 Minuten langes Kochen beendet. 500 μl 0,1 M HEPES/0,1 M NaCl (pH 8,5) wurden in jedes Röhrchen gegeben und dann wurde die Reaktionsmischung auf eine Boronat-Säule aufgetragen. Nicht umgesetztes cAMP wurde mit Hepes/NaCl abgewaschen, und die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure eluiert. Die Ausbeute wurde mithilfe von [¹⁴C]-AMP bestimmt.
Beispiel 7
In vivo- und in vitro-Leukopenie in Antwort auf LPS und Inhibition der selbigen durch die hierin beschriebenen Verbindungen
Wie in den 7 bis 9 und der Tabelle I gezeigt, reduzieren die hierin beschriebenen Verbindungen effektiv die zelluläre Antwort auf LPS, einem bekannten Induktor der TNF-α-Herstellung. In Gegenwart von Ceramid wurde die inhibitorische Aktivität der Verbindungen der Erfindung auf LPS-induzierte Leukopenie (ein Phänomen, welches abhängig ist von TNF-α-induzierter Oberflächenexpression der P-Selektions-Klasse von Adhäsionsmolekülen) verstärkt (7). Allerdings war die inhibitorische Aktivität der hierin beschriebenen Verbindungen im Wesentlichen von Diacylglycerol unbeeinflusst (8), was darauf hinweist, dass die Wirkungsweise der beschriebenen Verbindungen nicht von der Hydrolyse von Phosphatidinsäure abhängig ist. Die Daten wurden wie folgend erhalten:
Die Leukopenie inhibierende Fähigkeit der Testverbindungen wurde durch intraperitoneale Verabreichung von 0,5 μg LPS in Kochsalzlösung an weibliche ICR-Mäuse (Alter 6–8 Wochen; Gewicht 19–23 g) bestimmt. Eine Stunde vor Empfangen des LPS erhielten die Mäuse die Testverbindung durch intraperitoneale Injektion bei einer Dosis von 50 mg/kg (in isotonischer Kochsalzlösung). Zwei Stunden nach der Injektion von LPS wurden 200 μl Blut aus jeder Maus in ein heparinisiertes Röhrchen hinein abgenommen, und die Gesamtzählung an nukleierten Zellen wurde in einem Hämozytometer bestimmt (7 und 9).
Die calciumunabhängige Proteinkinaseaktivität wurde unter Verwendung eines 1%igen Triton-X-100-Extraktes von Jurkat-Zellen (5 × 10⁸/ml) gemessen. Die Reaktionsmischung bestand aus 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 20 μM ATP, enthaltend 200 000 cpm [γ³²P]-ATP und 50 μM Myelin-Basisches-Protein. Der Extrakt wurde während 15 Minuten mit A) Verbindung 37, B) Verbindung 37 mit oder ohne 10 μM Ceramid, C) Ceramid oder D) Dihydroceramid präinkubiert, gefolgt von der Zugabe von Substrat und ATP und 5 Minuten langer Inkubation bei 30°C. Die Gesamtzählung an nukleierten Zellen wurden in einem Hämozytometer gemessen (9). Das gleiche Protokoll wurde befolgt, um die in der 8 gezeigten Ergebnisse zu erhalten (mit der Zugabe von Diacylglycerol zu manchen der Testmischungen).
Auch eine Isochinolinverbindung der Erfindung wurde in vitro hinsichtlich ihrer inhibitorischen Wirksamkeit in Bezug auf LPS-induzierte TNF-α-Herstellung in menschlichen Zellen getestet.
Humane Makrophagen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten kultiviert und mit LPS inkubiert. Aliquots der stimulierten Zellen wurden dann jeweils mit 0,1, 1, 10, 100 oder 1 000 μM 1I-49, Verbindung 37 bzw. einem kommerziell erhältlichen Isochinolin (6,7-Dimethoxy-1(2H)-Isochinolin von Aldrich Chemical; gekennzeichnet als S52-626-6 in der 10), welches, wie die Verbindungen der Erfindung, ein Sauerstoffatom in ortho-Stellung zu einem Ringstickstoffatom aufweist, aber, anders als die Verbindungen der Erfindung, keinen Seitenkettensubstituenten, wie oben stehend beschrieben, aufweist, inkubiert (1L-49 ist stellvertretend für die Isochinolon-Verbindungen der Erfindung, welche die Seitenkettensubstituenten, welche an anderer Stelle oben stehend beschrieben wurden, aufweisen). Die inhibierende Wirksamkeit jeder Verbindung wurde als eine Funktion der TNF-α-Reduktion in pg/ml gemessen. Die Ergebnisse des Experiments sind in der 10 angegeben und belegen, dass die Verbindungen der Erfindung (repräsentiert durch 1I-49) eine inhibitorische Wirksamkeit in Hinsicht auf die Reduktion der LPS-induzierten TNF-α-Herstellung durch menschliche Zellen aufweisen. Andere getestete Isochinoline (14) übten keine inhibitorische Aktivität in Abwesenheit der hinzugefügten Seitenkettensubstituenten gemäß der Erfindung auf.
Beispiel 8
Fibroblasten-Proliferation in Antwort auf LPS und Inhibition derselben durch die hierin beschriebenen Verbindungen
Wie in der 11 gezeigt, wurde die PDGF-induzierte Fibroblasten-Proliferation selektiv durch die hierin beschriebenen Verbindungen inhibiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Verbindungen nicht cytostatisch oder cytotoxisch sind, insoweit sie nicht die EGF-ausgelöste Mitogenese in den getesteten Zellen veränderten (12). Diese Daten wurden wie folgend erhalten:
Zellen der Mausfibroblastenlinie 3T3 (American Type Culture Collection #CCL 92) wurden in 96-Loch-Platten in Vollmedium eingesät und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Das Medium wurde dann durch serumfreies Medium ersetzt, und die Zellen wurden 24 Stunden lang inkubiert.
Die Testverbindungen wurden dann 1 Stunde lang mit den Zellen vor Zugabe von 5 ng/ml humanem PDGF, oder bevor EGF zu jeder Vertiefung zugesetzt wurde, inkubiert. Nach weiteren 24 Stunden wurde 1 μCi [³H]-Thymidin in jede Vertiefung zugesetzt. 4 Stunden später wurden die Zellen auf Glasfaserfiltern geerntet, und der zelluläre Einbau von [³H]-Thymidin wurde durch Flüssigkeits-Szintillationszählung (11 und 12) gemessen.
Beispiel 9
Synthese der Verbindungen 2, 4–8 und 10–13
Allgemeines Alkylierungsvorgehen für Verbindungen 4–8, 10, 11 (Verfahren A):
Theobromin oder 8-Bromtheobromin (2 mmol) wurde mit wasserfreiem K₂CO₃ (2,5 mmol) und trockenem DMF (15 ml) vereinigt, und die Mischung wurde auf 75°C gebracht. Das passende Alkylhalogenid (2,5 mmol) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 2–18 Stunden lang bei 75°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, in Wasser (125 ml) gegossen und mit Ethylacetat (2 × 75 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, um ein farbloses Öl oder einen weißen Feststoff, welcher mit Ethylether trituriert wurde, zu erhalten. Der oftmals analysenreine, resultierende Feststoff kann nach Bedarf durch Kristallisation aus einer kleinen Menge an Ethanol weiter gereinigt werden. Ausbeuten 58–89%. Die Verbindungen 15–17, 31, 36–38, 41, 43, 47 und 48 (nachstehend beschrieben) wurden durch dieses selbige Vorgehen hergestellt, wobei lediglich die geeigneten Vorläufer anstelle von Theobromin verwendet wurden.
Allgemeines Thionierungs-Vorgehen für die Verbindungen 12 und 13:
Das 8-Bromxanthin 10 oder 11 (0,25 mmol) wurde in wasserfreiem Ethanol (10 ml) suspendiert und bis zum Rückfluss erhitzt. NaSH·H2O_x (2,5 mmol) wurde zugegeben, und die Mischung wurde fast unverzüglich durchsichtig grün. Die Mischung wurde 30 Minuten lang unter Rückfluss gerührt, abgekühlt und auf Siliziumdioxidgel eingedampft. Eine Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von 5–7% MeOH in CH₂Cl₂ ergab eine Ausbeute von 63% und 75% an 12 bzw. 13 als weiße Feststoffe. Anmerkung: Durch ¹H-NMR wurde festgestellt, dass die Verbindung 13 der Ethylester aufgrund von Umesterung unter den Reaktionsbedingungen war.
¹H-NMR-Spektren und Elementanalysen oder exakte Massendaten standen in Übereinstimmung mit den zugeordneten Strukturen (siehe die Tabelle 2 im Anschluss an Beispiel 13).
Beispiel 10
Synthese von Verbindungen 24, 25, 31 und Intermediaten
Allgemeines Vorgehen für die C-Nitrosierung von Pyrimidinen (Verbindungen 18–20, 27 und 32):
Das Pyrimidin (15 mmol) wurde in 1 N HCl (30 ml) suspendiert, und eine wässrige Lösung von Natriumnitrit (20 mmol in 10 ml) wurde unter Rühren über 10 Minuten hinweg eingetropft. Die Suspension veränderte sich fast unverzüglich von weißlich zu purpur. Das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt, der pH-Wert wurde mit Ammoniak-Wasser auf 5 eingestellt, und das purpurne Feststoffprodukt wurde aufgefangen, um eine Ausbeute von 75–90% nach der Trocknung vorzusehen. Das charakteristische Fehlen des C-5-Protons in der ¹H-NMR war für jede Verbindung offensichtlich (Tabelle 2).
Allgemeines Vorgehen für die Reduktion von 5-Nitroso- zu 5-Aminopyrimidinen (Verbindungen 21–23, 28 und 33):
Das 5-Nitrosopyrimidin (15 mmol) wurde in Wasser (50 ml) suspendiert und auf 80–90°C erwärmt. Unter Rühren wurde Natriumhydrosulfit (45 mmol) in Portionen über 5 Minuten hinweg zugesetzt. Die Farbe änderte sich rasch von purpur zu hellgrün, und das Rühren wurde zusätzliche 10 Minuten lang fortgesetzt. Die Mischung wurde in Eis gekühlt und filtriert. Der filtrierte Feststoff wurde mit kaltem Wasser, EtOH und Et₂O ge waschen, um das Orthodiamin in einer Ausbeute von 70–88% als einen bräunlichen bis blassgrünen Feststoff vorzusehen.
Synthese des 1-n-Hexyl-3-methylharnsäure-Intermediates (24):
Das Nitrosopyrimidin 19 (270 mg, 1,06 mmol) wurde in Ethanol (20 ml) unter Erwärmen gelöst, und Palladium-auf-Kohlenstoff (75 mg, 10%) wurde unter Argon zugesetzt. Eine Hydrierung wurde bei Raumtemperatur und 15 psi 2 Stunden lang durchgeführt, es wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit Harnstoff (600 mg, 10 mmol) vereinigt und pur auf der heißen Platte unter Rühren erwärmt. Die Temperatur erreichte 140°C, was eine klare Schmelze erzeugte, und wurde etwa 10 Minuten lang aufrechterhalten, wobei zusätzlicher Harnstoff (1 g) zugesetzt wurde. Nach Abkühlen verfestigte sich die Schmelze und wurde in 1 N NaOH (25 ml) gelöst und mit Entfärbungs-Kohle 10 Minuten lang gekocht, filtriert und im heißen Zustand auf pH 3–4 angesäuert. Das resultierende Präzipitat wurde nach dem Abkühlen gesammelt und mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch man 160 mg (57%) an 24 als weißlichen Feststoff mit den folgenden Charakteristika erhielt: Schmp. > 290°C m. Zersetzung. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) d 11,80 und 10,73 (2s, 2H, N-7 H, N-9 H), 3,78 (t, 2H, N-CH₂), 3,30 (s, 3H, N-CH₃, unter H₂O-Signal), 1,48 (m, 2H, 2'CH₂), 1,24 (m, 6H, 3', 4', 5' CH₂), 0,85 (t, 3H, CH₃). Analyse: C₁₂H₁₈N₄O₃ (C, H, N; Tabelle 2).
Synthese von 3-Methyl-8-thioharnsäure (25)-Intermediat:
Das Pyrimidindiamin 33 (100 mg, 0,63 mmol) wurde mit Kaliumethylxanthat (810 mg, 5 mmol) und DMF (10 ml) vereinigt und bei 100°C erwärmt. Die Suspension wurde nahezu unverzüglich grün, und die Reaktion war, mittels TLC, nach 30 Minuten vollständig. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 1 Stunde wurde die Mischung gekühlt, filtriert und mit Et2O gewaschen und getrocknet, um einen weißlichen Feststoff (310 mg) zu ergeben, welcher vermutlich das nicht-umgesetzte Kaliumethylxanthat und das Kaliumsalz des gewünschten Produkts enthielt. Der Feststoff wurde in Wasser (5 ml) suspendiert und zur Auflösung erwärmt. Eisessig wurde bis zu einem pH-Wert von 5 zugegeben, und ein heftiges Aufbrausen wurde bemerkt. Ein weißer Feststoff bildete sich, welcher in warmem Zustand filtriert wurde und mit Wasser und danach Ethanol gewaschen und getrocknet wurde, wodurch man 99 mg (79%) der Titelverbindung erhielt. ¹H-NMR (DMSO-d₆) d 13,40, 12,92 und 11,80 (3br s, 3H, NHs), 3,28 (s, 3H, CH₃). Analyse: C₆H₆N₄O₂S (C, H, N; Tabelle 2).
Synthese von 3-n-Propylxanthin (29)-Intermediat:
Das Pyrimidindiamin 28 (750 mg) wurde mit Diethoxymethylacetat (7 ml) vereinigt und 2 Stunden lang bei 80°C erwärmt. Die Mischung wurde bis zur Trockenheit eingedampft, und Wasser (5 ml) wurde zugegeben, und die Mischung wurde 20 Minuten lang fast bis zum Sieden erwärmt. Die resultierende Lösung wurde dann langsam eindampfen gelassen, um weißliche Kristalle zu ergeben. Ausbeute 680 mg (86%); Schmp. 282–284°C, Lit.¹³ 291–292°C.
Beispiel 11
Synthese von Verbindungen 36–39, 41 und 43 und Intermediaten
Allgemeines Vorgehen für den Ringschluss von Pyrimidin-Diaminen zu Pteridinen:
Das Orthodiamin 28 oder 33 (2 mmol) wurde in Wasser (20 ml) suspendiert und auf über 70°C erwärmt, bevor eine Lösung von Glyoxal-Natriumbisulfit-Additionsprodukt (10 mmol in 25 ml Wasser) unter Rühren zugegeben wurde. Die blassgrüne Suspension wurde langsam leicht bernsteinfarben und klar. Nach 5 Minuten langem Erwärmen zeigte die TLC, dass die Reaktion vollständig war. Die Mischung wurde gekühlt und mit Ethylacetat (5 × 40 ml) extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, um das 1-Methyl (34) oder 1-n-Propylpteridin (35) bei 71 bzw. 78% zu ergeben. ¹H-NMR zeigte das Auftreten von zwei aromatischen Signalen bei etwa 8,74 und 8,55 als Dubletten (J = 2,5 Hz) für beide Verbindungen.
Synthese von 6,7-Diethyl-1-methylpteridin-2,4-dion (40)-Intermediat:
Die Verbindung 33 (200 mg, 1,27 mmol) wurde in Acetonitril (5 ml) suspendiert, und 3,4-Hexandion (185 μl, 1,52 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 70°C bei einer minimalen Produktbildung aufgrund der Unlöslichkeit von 33 erwärmt. Deshalb wurden DMF (3 ml) und Wasser (3 ml) zugegeben, und die Temperatur wurde auf 100°C angehoben. Nach 90 Minuten Gesamtreaktionszeit wurde die Mischung gekühlt und in Wasser (100 ml) gegossen und mit Ethylacetat (3 × 75 ml) extra hiert. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, um das farblose kristalline Produkt vorzusehen. Ausbeute 240 mg (81%); Schmp. 218–222°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) d 11,78 (br s, 1H, NH), 3,46 (s, 3H, NCH₃), 2,95 und 2,93 (2q, 4H, 2CH₂ von Ethylen), 1,28 und 1,23 (2t, 6H, 2CH₃ von Ethylen). Analyse: C₁₁H₁₄N₄O₂ (C, H, N; Tabelle 2).
Synthese von 1-Methyl-6-phenylpteridin-2,4-dion (42)-Intermediat:
Das Nitrosopyrimidin 32 (220 mg, 1,28 mmol) wurde gründlich mit Phenethylaminhydrochlorid (1,5 g, 9,5 mmol) vermischt und in einem offenen Becherglas auf der heißen Platte erwärmt. Nach wenigen Minuten bei etwa 160°C verschmolz die purpurne Reaktionsmischung zu einer braunen Paste. Eine TLC zeigte viele Produkte an, daher wurde Sulfolan (1 ml) zugegeben und das Erwärmen wurde 15 Minuten lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser (10 ml) erwärmt und dann mit 50 ml Wasser verdünnt und mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert, die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wurde auf Silicagel unter Verwendung von 4% MeOH in CH₂Cl₂ flash-chromatographiert. Ausbeute 75 mg (23%) 42 als blassgelb-oranger Feststoff. Schmp. > 307°C m. Zersetzung; ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) d 11,95 (br s, 1H, NH), 9,37 (s, 1H, C-7 H), 8,17 (m, 2H, 2', 6' Phenyl), 7,55 (m, 3H, 3', 4', 5' Phenyl), 3,51 (s, 3H, NCH₃). Anal. C₁₃H₁₀N₄O₂ (C, H, N).
Beispiel 12
Synthese der Verbindungen 44, 47 und 48
Allgemeines Verfahren für den Ringschluss von Pyrimidinen zu Thiadiazolo-Pyrimidinen (Verbindungen 44–46):
Das Orthodiamin 23, 27 oder 32 (2,3 mmol) wurde in trockenem Acetonitril (5 ml) suspendiert, und trockenes Pyridin (1,5 ml) wurde zugesetzt. Thionylchlorid (1 ml, 13,7 mmol) wurde rasch zugegeben, und die Mischung, welche klar wurde und sich verdunkelte, wurde 10 Minuten lang bei 60°C erwärmt. Die Mischung wurde dann gekühlt und unter Rühren in 1 N HCl (40 ml) gegossen. Die resultierende gelbe Lösung wurde mit Ethylacetat (3 × 40 ml) extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, um einen blassgelben Feststoff zu ergeben, welcher mit Ether trituriert wurde. Ausbeute 65–74%.
Eine Alkylierung dieser Intermediate ergab die disubstituierten Produkte 47 und 48.
Beispiel 13
Synthese der Verbindungen 50 und 52
Ethyl-4-[(2-methylamino)benzoyl]aminobutanoat (51):
Eine Mischung von N-Methylisatosäureanhydrid (3,5 g, 19,8 mmol) wurde mit 4-Aminobuttersäure (2,5 g, 24,3 mmol) in trockenem DMF (50 ml) vereinigt und 2 Stunden lang bei 100°C erwärmt. Eine TLC zeigte an, dass die Reaktion vollständig ist, und das DMF wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde direkt für die Veresterung verwendet, welche durch Auflösen des Rückstands in 100% Ethanol (50 ml) und Zugeben von Chlortrimethylsilan (2,5 ml, 20 mmol) bewerkstelligt wurde. Die Mischung wurde 6 Stunden lang bei 65°C erwärmt und dann eingedampft, um einen braunen Sirup zu ergeben. Roh-Ausbeute 87% aus Isatosäureanhydrid. Eine kleine Probe wurde zur Charakterisierung und zum biologischen Testen mittels präparativer TLC unter Verwendung von 7% MeOH in CH₂Cl₂ gereinigt. Der Rest des Materials wurde direkt für die Herstellung von Verbindung 52 verwendet. Analyse: C₁₄H₂₀N₂O₃ (C, H, N; Tabelle 2).
Ethyl-1-methyl-1,4-dihydro-2,4-dioxo-3(2H)-chinazolinbutanoat (52):
Der Rückstand von 51 wurde mit Ethylchlorformiat (10 ml) vereinigt und eine Stunde lang bei 90°C erwärmt. Die Mischung wurde gekühlt und mit Rühren in gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat (50 ml) gegeben und nach 10 Minuten mit Ethylacetat (2 × 75 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, wodurch man einen braunen Sirup erhielt. Das Roh-Produkt wurde auf Silica unter Verwendung von 3% MeOH in CH₂Cl₂ flash-chromatographiert, um g (%) an 52 als ein dickes Öl zu ergeben. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) d 7,27–7,42 (2m, 4H, C-5,6,7,8), 4,04 (t, 2H, CH₂ von Ethyl), 3,88 (m, 2H, NCH₂), 3,11 (s, 3H, NCH₃), 2,33 (t, 2H, 2'CH₂), 1,71 (m, 2H, 3'CH₂). Analyse: C₁₅H₁₈N₂O₄ (C, H, N; Tabelle 2).
Tabelle 2 ANALYSE VON AUSGEWÄHLTEN VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG UND INTERMEDIATEN (Verbrennungs-Elementanalyse)

Claims

Verbindung der Formel:
R₂ ist (CH₂)_nA, worin: A NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist; und n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen; R₃ H, ein Alkyl oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; R₄ H, OH, NH₂ oder O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen ist; R₆ und R₇ unabhängig H, OH, NO, NO₂, NH₂, ein O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen oder X sind, worin: X Halogen, OH, SH, OR' oder SR' ist, worin R' ein Alkyl, Alkenyl, Phenyl oder Benzyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; mit der Maßgabe, dass, wenn R₃, R₄, R₆ und R₇ jeweils Wasserstoff sind und A COOR ist, worin R Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, n nicht 1 ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₂ ω-Carboxyalkyl oder ω-Carboxyalkenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei A COOR ist und R Et ist; R₃ und R₄ jeweils H sind; und R₆ und R₇ jeweils OCH₃ sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei die medizinische Therapie Entzündungen, Fibrose, Zellseneszenz, Apoptosis, Strahlendermatitis, Sonnenbrand oder UV-induzierte Immunsuppression in der Haut behandelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4 für die Verwendung in der medizinischen Therapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die medizinische Therapie Entzündungen, Fibrose, Zellseneszenz, Apoptosis, Strahlendermatitis, Sonnenbrand oder UV-induzierte Immunsuppression in der Haut behandelt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Entzündungen, Fibrose, Zellseneszenz, Apoptosis, Strahlendermatitis, Sonnenbrand oder UV-induzierte Immunsuppression in der Haut.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Medikament einen physiologisch annehmbaren Träger einschließt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibierung eines TNF-α-assoziierten Leidens.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das TNF-α-assoziierte Leiden Entzündung, Fibrose, Zellseneszenz, Apoptosis, Strahlendermatitis, Sonnenbrand oder UV-induzierte Immunsupression in der Haut ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament einen physiologisch annehmbaren Träger einschließt.
Verbindung der Formel:
R₂ ist (CH₂)_nA, worin: A H, NH₂, Acyloxy, SO₃H, PO₄H₂, NNO(OH), SO₂NH₂, PO(OH)NH₂, SO₂R oder COOR ist, worin R H, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Tetrazolyl oder Benzyl ist; und n eine beliebige Zahl von Atomen von 1 bis 7 mit gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Bindungen ist, wobei die Atome ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom an Stelle eines Kohlenstoffatoms einschließen können zur Bildung von Ether- bzw. Aminoverknüpfungen; R₃ H, ein Alkyl oder ein ω-Hydroxyalkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; R₄ H, OH, NH₂ oder O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen ist; R₆ und R₇ unabhängig H, OH, NO, NO₂, NH₂, ein O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen oder X sind, worin: X Halogen, OH, SH, OR' oder SR' ist, worin R' ein Alkyl, Alkenyl, Phenyl oder Benzyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; zur Verwendung in der medizinischen Therapie.