DE69532994T3

DE69532994T3 - Verwendung eines von einem viralen vektor kodierten cytochrom p450 gens, in kombination mit einem chemotherapeutischen mittel, zur selektiven zerstörung neoplastischer zellen

Info

Publication number: DE69532994T3
Application number: DE69532994T
Authority: DE
Inventors: Antonio E. Chiocca; J. David WAXMAN; CNRS ERS 107-CER VI Ming X. WEI; O. Xandra BREAKEFIELD; Ling Chen
Original assignee: Boston University; General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Boston University; General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-15
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2015-08-16
Also published as: JP4509221B2; US5688773A; DE69532994D1; DE69532994T2; JPH10504308A; CA2197677A1; EP0776161B1; EP0776161B2; ATE266092T1; EP0776161A1; EP0776161A4; WO1996004789A1; CA2197677C

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfidung bezieht sich auf die Zerstörung von neoplastischen Zellen unter Verwendung viraler Vektoren. Spezieller gesagt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Zerstörung von neoplastischen Zellen mit Hilfe von viralen Vektoren, die Gene mit einer medikamentenbedingten „Abtötungsfunktion" tragen.
Beschreibung des Standes der Technik
Neoplasie ist ein Prozess, bei dem die normalen Kontrollmechanismen, die das Zellwachstum und die -differenzierung regulieren, beeinträchtigt sind, was zu fortschreitendem Wachstum führt. Bei der Neoplasie besteht ein charakteristischer Ausfall der Kontrolle über die biologische Zellerneuerung und das Zellwachstum. Dieser Mangel an Kontrolle verursacht, dass ein Tumor fortlaufend wächst, sich vergrößert und Raum in lebenswichtigen Bereichen des Körpers einnimmt. Wenn der Tumor in umgebendes Gewebe eindringt und zu entfernten Orten transportiert wird, führt dieser Tumor in der Tendenz zum Tod des Lebewesens.
Ein Drittel aller Personen in den Vereinigten Staaten von Amerika entwickeln Krebs (Jahresausblick der American Cancer Society für 1990). Die Fünf-Jahres-Überlebensrate für diese Patienten hat sich als Folge des Fortschritts und der Frühdiagnose und der Therapie der Krankheit auf nahezu 50 % erhöht (Jahresausblick der American Cancer Society für 1990). Jedoch steht Krebs nur den Herzkrankheiten als Todesursache in diesem Land nach (Jahresausblick der American Cancer Society für 1990). Nahezu 20 % aller Amerikaner, die in diesem Jahr sterben, sterben an Krebs (Jahresausblick der American Cancer Society für 1990). Die Hälfte dieser Todesfälle ist auf die drei häufigsten Krebsarten zurückzuführen: Lungen-, Brust- und Darmkrebs.
Vor kurzem hat eine schnelle Ausweitung der Krebsbehandlungen stattgefunden. Auch wenn derzeit sogar neue Behandlungen entwickelt werden, besteht immer noch ein Bedarf an verbesserten Methoden für die Behandlung der meisten Krebsarten.
Die Abtötung besonders der Krebszellen ohne negative Auswirkung auf normale Zellen ist das angestrebte Ziel in der Krebstherapie. In der Vergangenheit wurde dies mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren erreicht. Zu diesen Verfahren zählen die Verabreichung von Chemikalien, Chemotherapie, Strahlung, Strahlentherapie und Chirurgie.
Die Strahlentherapie ist eine regionale Form der Behandlung, die für die Beherrschung lokaler Krebse verwendet wird (siehe Devita, V.T., in Harrison's Principles of Internal Medicine, Braunwald et al., Hrsg., McGraw-Hill Inc., New York, 1987, S. 431-446). Die Strahlentherapie beruht auf der Tatsache, dass einige maligne Krankheiten empfänglicher für die Schädigung durch Strahlung sind. Dieser Unterschied in der Empfänglichkeit hängt davon ab, dass normale Zellen eine größere Kapazität für die intrazelluläre Reparatur als neoplastische Zellen besitzen, und von der Eigenschaft normaler Organe, weiter zu gut funktionieren, wenn sie nur in Bereichen geschädigt sind. Wenn das umgebende Gewebe eine doppelt so große Strahlungsdosis vertragen kann, wie die, die einem gegebenen Tumor verabreicht wurde, dann ist der Tumor strahlungsempfindlich. Andererseits können einige Tumoren nicht mit der Strahlentherapie behandelt werden. Krebs, der in großem Umfang beide Lungenflügel befallen hat, kann wegen der größeren Strahlenempfindlichkeit des umgebenden Lungengewebes nicht wirksam mit der Strahlentherapie behandelt werden (siehe Devita, V.T., in Harrison's Principles of Internal Medicine, Braunwald et al., Hrsg., McGraw-Hill Inc., New York, 1987, S. 431-446).
Die Chirurgie wird immer noch als primäre Behandlungsmethode für die meisten frühen Krebsarten angesehen, ebenda. Die meisten Krebse sind operabel, können jedoch nicht vollständig entfernt werden. Einige Tumoren, die als resezierbar erscheinen, weisen Mikrometastasen außerhalb des Tumorbereichs auf. Das führt zum Wiederauftreten des Krebses dicht beim ursprünglichen Auftrittsort. Jeder Krebs, der einen gewissen Grad von Metastasierung aufweist, kann durch chirurgische Maßnahmen nicht wirksam geheilt werden.
Es sind andere Arten von örtlicher (nicht-systemischer) Therapie erkundet worden. Dazu gehören lokale Hyperthermie (Saloman et al., J. Neuro-Oncol. 1:225-236 (1983)), photodynamische Therapie (Cheng et al., Surg. Neurol. 25:423-435 (1986)) und die interstitielle Bestrahlung (Gutin et al., J. Neurosurgery 67:864-873 (1987)). Bisher haben diese Therapien nur einen begrenzten Erfolg gehabt.
Die Strahlentherapie und die Chirurgie bieten Wege an, wie man die Tumormasse in speziellen Regionen des Körpers reduzieren kann, die durch chirurgische Verfahren oder hohe Dosen der Strahlentherapie zugänglich sind. Keine von beiden ist anwendbar für die Vernichtung von weit gestreuten oder zirkulierenden Tumorzellen, die charakteristischerweise bei den meisten Patienten mit Krebs vorhanden sind. Dies ist der Antrieb für die Entwicklung systemischer Behandlungen von Krebs, wie der Chemotherapie.
Die Verwendung von chemotherapeutischen Krebsmitteln, obwohl weit verbreitet in der Anwendung, hat sich als begrenzt wirksam bei der Behandlung der meisten Krebsarten erwiesen. Obwohl einige bemerkenswerte Erfolge bei der Behandlung spezieller Tumortypen (z.B. Leukämien im Kindesalter) mit der konventionellen Chemotherapie erreicht worden sind, war der Erfolg bei der Behandlung solider Tumoren stärker begrenzt. Dieses Versagen ist in erster Linie auf den geringen therapeutischen Index vieler Krebsmedikamente zurückzuführen sowie auf die inhärente oder erworbene Wirkstoffresistenz, die oft Tumorzellen charakterisiert. Bin weiterer Nachteil für die Verwendung von zytotoxischen Mitteln zur Krebsbehandlung sind ihre schweren Nebeneffekte. Dazu gehören Brechreiz, Erbrechen, Schwäche des Zentralnervensystems, lokale Schmerzen, Knochenmarkdepression, Blutung, Nierenschaden, Hypo- und Hyperglykämie und Überempfindlichkeitsreaktionen. Ein weiterer Nachteil ist, dass sie oft nur gegen sich schnell teilende Zellen wirksam sind.
Die organ-gerichtete Chemotherapie hält das Versprechen als Komponente der multimodalen Therapie, Wirkstoffe in höheren Konzentrationen über längere Zeitabschnitte zuzuführen. Jedoch hat eine solche kontinuierliche intravenöse Infusion zur Zeit noch keinen klaren Vorteil gezeigt.
Eine modernere Herangehensweise an die Chemotherapie besteht darin, toxische Mittel gegen die Krebszellen selbst zu richten. Dies wurde experimentell durch Verknüpfung des Chemotherapeutikums entweder mit Antikörpern oder toxischen Molekülen erreicht, die eine höhere Affinität zu den Tumorzellen als zu normalen Zellen besitzen. Diese gerichteten toxischen Kugeln befinden sich aber immer noch in einer frühen klinischen Phase der Entwicklung und sind nicht handelsüblich.
Es ist klar, dass neue Herangehensweisen benötigt werden, um die Wirksamkeit zu verstärken, mit der ein Chemotherapeutikum maligne Tumorzellen töten kann, während man gleichzeitig eine systemische Toxizität vermeidet.
Bestimmte Krebsarten, z. Gliome, die der häufigste im Gehirn entstehende Primärtumor sind, trotzen den aktuellen Modalitäten der Behandlung. Trotz Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie ist das Glioblastoma multiforme, das häufigste der Gliome, fast immer tödlich (Schoenberg, B.S., „The epidemiology of nervous system tumours", in Oncology of the Nervous System, M.D. Walker, Hrsg., Bosten, MA, Martinus Nijhoff (1983); Levin et al., „Neoplasms of the Central Nervous System", Kap. 46 in Cancer: Principles and pRactice of Oncology, Bd. 2, 3. Ausgabe, De Vita et al., Hrsg., Lippincott Press, Philadelphia (1989), S. 1557-1611).
Gliome stellen nahezu 40 % aller primären Hirntumoren dar, wobei Glioblastoma multiforme die bösartigste Form ist (Schoenberg, B.S., „The epidemiology of nervous system tumours", in Oncology of the Nervous System, M.D. Walker, Hrsg., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1983)). Die Fünf-Jahres-Überlebensrate für Personen mit diesem Typ von Astrozytom mit einem hohen Grad beträgt weniger als 5 % in Anbetracht der aktuellen Behandlungsmodalitäten der Chirurgie, Strahlentherapie und/oder Chemotherapie (Mahaley et al., Neurosurgery 71:826-836; Schoenberg, B.S., „The epidemiology of nervous system tumours", in Oncology of the Nervous System, Walker, M.D., Hrsg., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1983); Kim et al., J. Neurosurgery 74:27-37 (1991), Daumas-Duport et al., Cancer 62:2152-2165 (1988)).
Die Resistenz von Glioblastomen gegen die aktuelle Chemotherapie widerspiegelt vielleicht die proliferativen Merkmale dieses Tumortyps, die zwischen den niedrigeren Graden von Astrozytomen und anderen Typen von metastatischen Tumoren im Zentralnervensystem (ZNS) liegen (Nagashima und Hoshino, Acta Neuropathol. 66:12-17 (1985)). Der Bromdeoxyuridin-Markierungsindex, der den Prozentsatz von Zellen misst, die zu einem gegebenen Zeitpunkt in der S-Phase sind, beträgt 7,3 % bei Glioblastomtumoren, was 2 bis 7 mal größer ist als bei Astrozytomen mit niedrigem Grad, aber weniger als in metastatischen Tumoren (Nagashima und Hoshino, oben).
Ein verwandter Parameter, der zur Einschätzung der relativen Resistenz von Glioblastomen gegen die aktuellen therapeutischen Modalitäten nützlich ist, ist der Wachstumsanteil oder der relative Anteil von Zellen, die in einem Tumor zu einem Zeitpunkt proliferieren. Die Wachstumsfraktion beträgt bei diesem Tumortyp nur 30 %, wobei die restlichen 70 % der Zellen sich in G₀, einer Ruhephase, befinden (Zellen in G₀ können sterben oder wieder in den aktiven Zellzyklus eintreten; Yoshi et al., J. Neurosurg. 65:659-663 (1986)), während die 30 % der Glioblastomzellen, die sich aktiv teilen, verantwortlich für die Resistenz dieser Tumoren gegen eine Reihe von Chemotherapeutika sind, welche die aktiv proliferierenden Zellen zum Ziel haben.
Weiterhin werden chirurgische Modalitäten für Glioblastome durch das Fehlen ausgeprägter Grenzen zwischen dem Tumor und dem umgebenden Parenchym und durch die Migration von Tumorzellen in die Bereiche der weißen Substanz behindert, die sich vom primären Ort aus nach außen erstrecken (Burger et al., J. Neurosurg. 58:159-169 (1983)), welche ihr vollständiges Entfernen verhindern.
Die Strahlentherapie hat auf Grund der kleinen Wachstumsfraktion in diesen Tumoren sowie die Strahlenempfindlichkeit des benachbarten normalen Gewebes auch nur begrenzten Erfolg gehabt (Wowra et al., Acta neurochir. (Wien) 99:104-108 (1989); Zamorano et al., Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 46:90-93 (1989)).
Es werden neue Herangehensweisen zur Behandlung von Hirntumoren benötigt. Es ist vorgeschlagen worden, Gene mit einer wirkstoffbedingten „Abtötungsfunktion" zur Behandlung von Tumoren zu verwenden. Das ist der Gegenstand der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/895,365 , die durch Bezugnahme hier zur Gänze eingebracht wird. Speziell wurde angeregt, dass die Expression des Gens der Herpes simplex-Virus (HSV)-Thymidinkinase (TK) in proliferierenden Zellen diese empfindlich für das Deoxynukleosidanalogon, Ganciclovir, macht (Moolten et al., Cancer Res. 46:5276-5281 (1986); Moolten et al., Hum. Gene Ther. 1:125-134 (1990); Moolten et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:297-300 (1990); Short et al., J. Neurosci. Res. 27:427-433 (1990); Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991); Freeman et al., J. Cell. Biochem. 16F:47 (1992); Culver et al., Science 256:1550-1552 (1992); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503 (1992); Yamada et al., J. Cancer Res. 83:1244-1247 (1992); Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Oldfield et al., Hum. Gene Ther. 4:39-69 (1993); Takamiya et al., J. Neurosurg. 79:104-110 (1993); Caruso et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028 (1993); Boviatsis et al., Hum Gene Ther. 5:183-191 (1994); Chiocca et al., „Virus-Mediated Genetic Treatment of Rodent Gliomas" in Gene Therapeutics, Wolff; J.A., Hrsg., Birkhauser Publishers, Boston. MA (1994), S. 245-262). HSV-TK vermittelt die Phosphorylierung von Ganciclovir, das in die DNA-Stränge während der DNA-Replikation (S-Phase) im Zellzyklus eingebaut wird, was zu Beendigung der Kette und zum Zelltod führt (Elion, G.B., J. Antimicr. Chemother. 12, sup. B;9-17 (1983)).
Obwohl wirksam, kann die Abhängigkeit dieses Typs von Gentherapie von der DNA-Replikation während der Einwirkung des Wirkstoffs möglicherweise seine therapeutische Wirksamkeit begrenzen. Zum Beispiel befindet sich die Mehrzahl der Zellen in menschlichen malignen Hirntumoren zu einer bestimmten Zeit in G₀ (Ruhephase) (Nagashima et al., Acta Neuropathol. 66:12-17 (1985); Yoshi et al., J. Neurosurg. 65:659-663 (1986)). Weiterhin wurde Ganciclovir ursprünglich in die Klinik zur Behandlung von Herpesvirusinfektionen eingeführt (Smith et al., Antimicrob. Agents Chemother. 22:55-61 (1982); Smee et al., Antimicrob. Agents Chemother. 23:676-682 (1980)); es gibt daher wenige detaillierte biochemische oder pharmakologische Untersuchungen zur Anwendung von Ganciclovir in der Krebsbehandlung.
Ein zweites Beispiel für ein Gen mit einer wirkstoffbedingten „Abtötungsfunktion" ist das bakterielle Cytosindeaminase-Gen, welches ChemoSensibilität auf den relativ ungiftigen 5-Fluoruracil-Vorläufer 5-Fluorcytosin überträgt (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37 (1992); Huber et al., Cancer Res. 53:4619-4626 (1993); Mullen et al., Cancer Res. 54:1503- 1506 (1994)). Obwohl potentiell nützlich für die Krebsgentherapie, ist 5-Fluorcytosin ein Antipilzmittel (Bennet, J.E., „Antimicrobial Agents: Antifungal Agents" in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Gilman, A.G. et al., Hrsg., Bd. 8. Pergamon Press, New York (1990), S. 1165-1181). Daher haben wenige detaillierte pharmakologische Untersuchungen über die Anwendung dieses Medikamentes in der Krebsbehandlung berichtet.
Cyclophosphamid (CPA) und sein isomeres Analogon Ifosfamid (IFA) sind die Hauptstützen der Krebschemotherapie für mehrere Tumorarten (Colvin, O.M., „Alkylating Agents and Platinum Compounds", in Cancer Medicine, Holland et al., Hrsg., Lea and Febiger, Philadelphia, PA (1993), S. 733-734). Diese therapeutisch inaktiven Prodrugs erfordern eine Bioaktivierung durch leberspezifische Enzyme aus der Cytochrom P450-Familie. Eins dieser Enzyme, Cytochrom P450 2B1, das durch Phenobarbital induziert wird, aktiviert CPA und IFA mit hoher Wirksamkeit (Clarke et al., Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Weber and Waxman, Biochemical Pharmacology 45:1685-1694 (1993)). CPA und IFA werden durch Cytochrom P450 hydroxyliert, wodurch man die primären Metabolite 4-Hydroxycyclophosphamid bzw. 4-Hydroxyifosfamid erhält. Diese primären Metabolite sind instabil und zerfallen spontan in zytotoxische Verbindungen: Acrolein und Phosphoramid-(oder Ifosforamid-)Lost (Colvin et al., Cancer Treat. Rep. 65:89-95 (1981); Sladek, N.E. „Oxazaphosphorines", in Metabolism and Action of Anticancer Drugs, Powis et al., Hrsg., Taylor and Francis, New York (1987), S. 48-90). Die letztere verursacht Querverbindungen zwischen Strängen in der DNA ohne Rücksicht auf die Phase des Zellzyklus. Maximale Zytotoxizität wird auf Grund von Strangbrüchen während der nachfolgenden S-Phase und mitotischen (M-)-Phase des Zellzyklus erreicht (Colvin, O.M., (1993), oben). Die therapeutische Wirkung dieser Oxazaphosphorin-Krebsmittel wird durch die Wirtstoxizität begrenzt, die aus der systemischen Verbreitung von in der Leber gebildeten aktivierten Wirkstoffmetaboliten resultiert.
Leider ist Cyclophosphamid auf Grund des mangelhaften Transports der aktivierten Metabolite durch die Blut-Hirn-Schranke und in die Zellen (Genka et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 27:1-7 (1990)) und durch sehr niedrige Spiegel von Cytochrom P450 im Gehirn und in Tumorzellen (Hodgson et al., Mol. Cell. Biochem. 120:171-179 (1993)) bei der Behandlung von Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS) weitgehend unwirksam.
Auch in vielen Fällen von malignen Tumoren außerhalb des ZNS, wo es einen guten Zugang zu aus der Leber gewonnenen aktiven Wirkstoffmetaboliten gibt, kann man nicht ausreichend hohe Wirkstoffspiegel verabreichen, um den Tumor wirksam zu töten, ohne systemische Toxizität und möglicherweise den Tod des Patienten zu verursachen. Neue Herangehensweisen zur selektiven Verstärkung der Sensibilität des malignen Tumors für das Chemotherapeutikum werden benötigt.
Im Lichte des vorher Gesagten existiert also ein Bedarf an einer therapeutischen Methode, die die Sensibilität eines malignen Tumors für ein Chemotherapeutikum erhöht, um so selektiv Tumorzellen zu vernichten und gleichzeitig normale Zellen zu verschonen, und die mit Chemotherapeutika angewendet werden kann, wobei deren Wirkung nicht auf eine spezielle Phase des Zellzyklus begrenzt oder auf Grund von niedrigen Spiegeln der zur Aktivierung des Mittels Genprodukte eingeschränkt ist.
Zusammenfassung der Erfindung
In der ersten Erscheinungsform sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom P450-Gen trägt, in Verbindung mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Zentralnervensystem-Tumoren vor, wobei die Expression des Genproduktes, unabhängig vom Zellzyklus der genannten Tumorzellen, die genannten Tumorzellen des Zentralnervensystems empfindlich für das chemotherapeutische Mittel macht.
Zusätzlich sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom P450-Gen trägt, in Verbindung mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von malignen Tumoren vor, wobei das Expressionsprodukt des Gens das vorerwähnte chemotherapeutische Mittel zu einem zytotoxischen Metaboliten aktiviert.
Außerdem sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom P450-Gen trägt, in Verbindung mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von peripheren Tumoren vor, wobei die Expression des Genproduktes den peripheren Tumor, unabhängig vom Zellzyklus der vorerwähnten Tumorzellen, empfindlich für das vorerwähnte chemotherapeutische Mittel macht.
In einer anderen Erscheinungsform bietet die vorliegende Erfindung Produkte, die einen viralen, ein Cytochrom P450-Gen tragenden Vektor enthalten, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Präparation zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verwendung bei der Behandlung von Tumoren des Zentralnervensystems, wobei die Expression des Genproduktes die Tumorzellen des Zentralnervensystems empfindlich für das vorerwähnte chemotherapeutische Mittel macht.
Außerdem bietet die vorliegende Erfindung Produkte, die einen viralen, ein Cytochrom P450-Gen tragenden Vektor enthalten, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Präparation zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verwendung bei der Behandlung von malignen Tumoren, wobei das Expressionsprodukt des Gens das vorerwähnte chemotherapeutische Mittel zu einem zytotoxischen Metaboliten aktiviert.
In einer weiteren Erscheinungsform bietet die vorliegende Erfindung Produkte, die einen viralen Vektor enthalten, der ein Cytochrom P450-Gen trägt, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Präparation zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verwendung bei der Behandlung von peripheren Tumoren, wobei die Expression des Genproduktes, unabhängig vom Zellzyklus der vorerwähnten Tumorzellen, die peripheren Tumorzellen des Zentralnervensystems empfindlich für das chemotherapeutische Mittel macht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Cytochrom-Gen P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 oder P450 3A4, und das chemotherapeutische Mittel ist Cyclophosphamid oder Ifosfamid.
Die Erfindung liefert auch eine besonders bevorzugte Ausführungsform, wobei das Cytochrom-Gen P450 2B1 und das chemotherapeutische Mittel Cyclophosphamid ist.
Die Erfinder haben also entdeckt, dass durch die Einführung eines Cytochrom P450-Gens in Tumorzellen der zelluläre und anatomische Ort der enzymatischen Umwandlung des Krebsmittels wirksam auf den Tumorort beschränkt wird, wodurch die Wirksamkeit verstärkt wird, mit der die Tumorzellen abgetötet werden, während gleichzeitig unerwünschte Nebenwirkungen auf normale Zellen minimiert werden.
Es versteht sich, dass die vorhergehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung nur als Beispiel und Erläuterung dienen und dazu gedacht sind, weitere Erklärungen zur Erfindung wie beansprucht zu liefern.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, das eine in vivo-Untersuchung von Ganciclovir darstellt.
2 ist ein Diagramm, das die Ganciclovir-Sensibilitätsprüfung darstellt.
3 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von von C6 abgeleiteten Zellen in Kultur darstellt. Wachstumshemmung von C6VIK-, C6VIKWT-, C6BU1-, C6BAG-, C6BBAG-, C6AGWT- und C6BWT-Zellen durch Ganciclovir, wenn die Behandlung am Tag nach dem Ausplattieren begonnen wurde. Zellzahlen wurden vier Tage nach dem Ausplattieren bestimmt. Das Zellwachstum wird als Prozentsatz der Zellen mit Behandlung im Vergleich zur Zahl der Zellen ohne Behandlung (100 %) ausgedrückt. Die Balken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an.
4 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von von C6 abgeleiteten Zellen in Kultur darstellt. Die Ganciclovirbehandlung wurde 7 Tage nach dem Ausplattieren derselben Zelllinien begonnen, um die Ganciclovirsensibilität der Koloniebildung zu untersuchen. Die Ganciclovirbehandlung wurde 9-12 Tage fortgesetzt und dann wurden Kolonien gefärbt und gezählt. Überlebende Kolonien wurden als Prozentsatz im Vergleich zur Zahl der Kolonien ohne Behandlung (100 %) ausgedrückt. Die Untersuchungen wurden in dreifacher Ausführung mit weniger als 0,5 % Variation durchgeführt.
5 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen nach verzögerter Co-Kultivierung mit anderen von C6 abgeleiteten Linien darstellt. Sieben Tage nach dem Ausplattieren der C6BAG-Zellen wurden C6BU1-, C6BWT-, C6VIK- oder C6VIKWT-Zellen (Spender) mit ihnen im Verhältnis 1:2 aufgetragen. Die Ganciclovirbehandlung wurde drei Tage später begonnen und 9-12 Tage fortgesetzt. Zellen wurden dann auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt und nur positive Kolonien wurden gezählt. Koloniezahlen wurden als ProzeUntersuchungen wurden dreifach mit weniger als 0,5 % Variabilität ausgeführt.
6 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen nach verntsatz derjenigen ausgedrückt, die für Parallelkulturen ohne Ganciclovir erhalten wurden. Nur das Überleben von β-Galactosidase-positiven Kolonien wurde bewertet. zögerter Co-Kultivierung mit anderen von C6 abgeleiteten Linien darstellt. Diese Analyse wurde wie in 5 durchgeführt, außer dass C6BBAG-Zellen, denen endogenes TK fehlt, statt C6BAG verwendet wurden. Untersuchungen wurden dreifach mit weniger als 0,5 % Variabilität ausgeführt.
7 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen nach verzögerter Co-Kultivierung mit anderen von C6 abgeleiteten Linien darstellt. Gleichzeitige Co-Kultivierungsexperimente mit C6BAG-Zellen als Empfänger und C6VIK- und C6VIKWT-Zellen als Spender (1:100) wurden durchgeführt. Die Ganciclovirbehandlung wurde 7 Tage nach dem Ausplattieren begonnen und 14 Tage fortgesetzt. Nur β-Galactosidase-positive Kolonien wurde bewertet (siehe Bild 5 und 6). Untersuchungen wurden dreifach mit weniger als 0,5 % Variabilität ausgeführt.
8 ist ein Diagramm, das die Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen nach gleichzeitiger Co-Kultivierung mit anderen von C6 abgeleiteten Linien darstellt. Gleichzeitige Co-Kultivierungsexperimente mit C6BAG-Zellen wurden wie in 7 durchgeführt. Untersuchungen wurden dreifach mit weniger als 0,5 % Variabilität ausgeführt.
9 ist ein Diagramm, das die gleichzeitigen Co-Kultivierungsexperimente mit unterschiedlichen Verhältnissen von Spender-C6VIKWT- zu Empfängerzellen C6BAG darstellt.
Die Experimente wurden so wie in der Legende zu 7 und 8 beschrieben ausgeführt. Untersuchungen wurden dreifach mit weniger als 0,5 % Variabilität ausgeführt.
10 ist ein Diagramm, das das Wachstum von subkutanen C6VIKWT-Tumoren in nackten Mäusen zeigt. Die Behandlung wurde begonnen, nachdem der Tumor 1 cm Größe im Durchmesser (Tag 0) erreicht hatte, und wurde 14 Tage fortgesetzt. Die Tumorwachstumsrate (in %) wurde im Vergleich zum anfänglichen Volumen (100 % am Tag 0) berechnet. Tumoren wurden mit PBS (durchgezogene Linie) oder mit 50 mg/kg/d Ganciclovir (gepunktete Linie) behandelt. Balken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an.
11 ist ein Diagramm, das das Wachstum von Kombinationen von Tumorzellen in nackten Mäusen darstellt. Tumorzellen wurden gleichzeitig in verschiedenen Kombinationen in einem Verhältnis von 1:10 (Empfänger (C6BAG) zu Spender C6BU1 (n = 9), C6VIK (n = 9) oder C6VIKWT (n = 7)) inokuliert. Nachdem die Tumoren 1 cm im Durchmesser erreicht hatten, wurden die Tiere mit PBS 14 Tage lang behandelt und dann ohne Behandlung weitere 14 Tage lang gehalten. Balken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an.
12 ist ein Diagramm, das das Wachstum von Kombinationen von Tumorzellen in nackten Mäusen darstellt. Dieselbe Kombination von Zellen wie in Bild 11 wurde parallel dazu mit 50 mg/kg/d Ganciclovir 14 Tage lang behandelt. * = p < 0,01. Balken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes an.
13 ist eine schematische Darstellung, die die Wirkungen von C6VIKWT auf Tumorzellen zeigt. Im erwachsenen Gehirn teilen sich die meisten normalen Zellen nicht und sind daher resistent gegen die Integration von Retroviren und toxischen Ganciclovir-Metaboliten. Toxische Effekte von transplantierten C6VIKWT-Zellen auf die sich teilenden Tumorzellen können folgende sein: 1) schwächende Wirkungen (~>) der replikativen Infektion des wilden Typs MoMLV (Sechseck), 2) Expression von viralen Antigenen auf Zellen (|), die die Abstoßung durch Wirtsantikörper oder andere Immunmechanismen (λ) auslösen, 3) Integration des Retrovirus-Vektors (Δ), der das HSV-TK-Gen trägt und Umwandlung von Ganciclovir (G) in einen toxischen Metaboliten (X), der die Zellen vernichtet, die eine DNA-Replikation erfahren, und 4) Übertragung von X von infizierten Tumorzellen auf nicht infizierte Tumorzellen durch Zellkontakte.
14 ist ein Diagramm, das die Übernahme von CPA-Sensibilität nach der Transfektion des Cytochrom P450 2B1-Gens in Ratten-C6-Gliomzellen darstellt.
Das Wachstumsverhältnis ist für jede Zelllinie die Zahl der Zellen, die eine festgelegte CPA-Konzentration überlebten, geteilt durch die Zahl der Zellen, die ohne CPA überlebten.
15 ist eine Aufnahme einer immunzytochemischen Analyse von Cytochrom P450 2B1-Enzym in CPA-empfänglichen C450-8- und in CPA-unempfänglichen C6-, CNEO-1- und C450-19-Zellen.
Immunreaktives Protein erscheint als schwarzes Präzipitat in einem gitterartigen Muster in C450-8-Zellen (15a), während in CNEO-1-Zellen (15b) keine Färbung vorhanden ist.
16 ist eine Western Blot-Analyse mikrosomaler Fraktionen (20 μg Protein/Spur) aus C450-8-Zellen. Der Western Blot bestätigt das Vorliegen einer einzigen immunreaktiven Art (Spur 5), die dem Cytochrom 450 2B1 (als Cytochrom P450 2B1 bezeichnet) entspricht. Lebermikrosomen, aus phenobarbital-induzierter Rattenleber (PB-Leber, 2 μg Protein/Spur) isoliert, sind als positive Kontrolle in Spuren 1 und 6 enthalten. Mikrosomale Fraktionen von C6- (Spur 2), CNEO-1- (Spur 3) und C450-19-Zellen (Spur 4) wurden als negative Kontrollen aufgenommen.
17 ist ein Diagramm, das das subkutane Wachstum von C6- und C450-8-Tumoren in nackten Mäusen mit und ohne CPA-Therapie darstellt.
C6- oder C450-8-Zellen (10⁶ Zellen in 200 μl) wurden in die Flanken von nackten Mäusen subkutan injiziert. Tumore (5 Tiere pro Gruppe) erhielten an Tag 3 und 14 physiologische Kochsalzlösung (17A) oder CPA (17B) injiziert. Das durchschnittliche Tumorvolumen und die Standardabweichung sind für jede Gruppe gezeigt. Beachten Sie die den Unterschied in der Skalierung der Y-Achse zwischen Bild A und B.
18 ist eine Photographie, die die meningeale Neoplasie von C6-Gliomen in Mäusehirnen zeigt, denen Retrovirus-Produzenten-Fibroblasten und CPA injiziert wurden.
18a zeigt einen histopathologischen coronalen Schnitt aus dem Gehirn einer Kontrollnacktmaus, der C6-Rattengliomzellen eingepflanzt worden waren und die dann durch stereotaktische Injektion von lacZ-exprimierenden Mäusezellen (CRELacZ) in das Gehirn und in meningeale Räume behandelt wurde, gefolgt von der intratumoralen Verabreichung von CPA. Die umfangreiche Infiltration von Tumorgewebe in die Meningen wird durch einen dunklen Pfeil angezeigt. 18b zeigt einen histopathologischen kranzförmigen Schnitt aus dem Gehirn einer Nacktmaus, der C6-Rattengliomzellen eingepflanzt worden waren und die dann durch stereotaktische Injektion von Cytochrom P450 2B1 exprimierenden Mäusezellen (R450-2) in das Gehirn und in meningeale Räume behandelt wurde, gefolgt von der intratumoralen Verabreichung von CPA.
19 ist eine Mikrophotographie, die parenchymale Hirntumore aus Tieren zeigt, denen CRELacZ- oder R450-2-Zellen eingepflanzt worden waren, gefolgt von der intrathekalen/intratumoralen Verabreichung von CPA.
19a zeigt einen coronalen Schnitt aus dem Hirntumor einer Maus, die mit CRELacZ-Zellen und dann mit CPA behandelt wurde. Dieser spezielle Schnitt zeigt die Begrenzung zwischen normalem Gehirn auf der linken Seite der Aufnahme und dem Tumor (T) auf der rechten Seite. 19b zeigt einen coronalen Schnitt aus dem Hirntumor einer Maus, die mit R450-2-Zellen und dann mit CPA behandelt wurde. Dieser spezielle Schnitt zeigt die Begrenzung zwischen normalem Gehirn auf der linken Seite der Aufnahme und der Höhle auf der rechten Seite, die ursprünglich nekrotisches Tumorgewebe enthielt, welches auf Grund seiner Brüchigkeit nicht präpariert werden konnte. Einige nekrotische Tumorzellen (die eine ausgedehnte Kernfragmentierung zeigen) sind noch neben dem normalen Hirn sichtbar. Vergrößerung 100x.
20 ist ein Diagramm, das die Zellproliferationstests von C6, C6-Neo und C6-P450 zeigt. In Feld A wird die Proliferationsrate von C6-, C6-Neo- und C6-P450-Zellen bei Fehlen von CPA im Verlauf von 10 Tagen gezeigt. In Feld B wurde dasselbe Experiment in Gegenwart von CPA (0,5 mM) durchgeführt. Offene Quadrate: C6-P450-Zellen; Quadrate mit zentralen Punkten: C6-Zellen, gefüllte Dreiecke: C6-Neo-Zellen. Es wurden zweimal 10⁵ C6- oder C450-8-Zellen in eine 10 cm Schale in dreifacher Ausführung gebracht. Am nächsten Tag wurde allen Schalen 0,5 mM CPA oder Medium hinzugefügt. Zur angegebenen Zeit wurden Zellen mit Trypsin behandelt und gezählt. Die durchschnittliche Zellzahl wird angegeben (Mittelwert ± SEM).
21 ist ein Balkendiagramm, das den sekretorischen Effekt darstellt. In Feld A wurden C6- (3,5 × 10⁵ Zellen) gemeinsam mit C6- (3,5 × 10⁵ Zellen, gefüllter Balken, Säule 1), C6-Neo-(3,5 × 10⁵ Zellen, gestreifter Balken, Säule 2) oder C6-P450-Zellen (3,5 × 10⁵ Zellen, diagonale Balken, Säule 3) in einer Schale, getrennt durch ein 0,45 μm-Filter („Insert”-System von FALCON) in Gegenwart von 0,5 mM CPA kultiviert. Fünf Tage später wurde die Zahl der C6-Zellen durch Coulter-Zählung bestimmt. Auf Feld B wurden die aus dem vorherigen Experiment überlebenden C6-Zellen trypsiniert und mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Schale wieder ausplattiert. Die C6-Zellzahlen wurden dann neun Tage später gezählt.
22 ist eine Aufnahme eines 1 %igen Agarose-Elektrophoresegels, die die nukleosomale Leiterstruktur von C6-P450-Zellen zeigt, die mit CPA behandelt wurden. Genomische DNA (1 μg) von C6-P450-(Feld A) oder C6-(Feld B) Zellen wurden nach Einwirkung von CPA zu den angegebenen Zeiten gereinigt und auf einem 1 %igen Agarosegel durch Elektrophorese isoliert.
23 ist ein Balkendiagramm, das den zellvermittelten Effekt zeigt. In Feld A wurde die Proliferation von C6-Zellen in Gegenwart von 0,5 mM CPA getestet, wenn 0, 10, 50, 90 und 100 % das P450 2B1-Gen enthielten. Die Gesamtzahl der Zellen pro Schale zu Beginn des Experiments betrug 2 × 10⁶ Zellen. Zellen aus jeder Schale wurden 5 Tage später gezählt. Die Endwerte stellen den Durchschnitt von drei Platten dar (Mittelwert ± SE). Auf Feld B wurden C6-Zellen allein kultiviert (2 × 10⁶ Zellen) (Balken 1), zusammen mit C6-Zellen, die das Neo-Gen exprimierten (Balken 2), bestrahlte C6-Zellen (Balken 3), bestrahlte C6-Neo-Zellen (Balken 4), bestrahlte C6-Zellen, die das P450-Gen exprimierten (Balken 5). In allen Fällen betrug die Gesamtzahl der Zellen pro Schale 2 × 10⁶ Zellen, und die C6-Zellen machten 90 % der Zellen in der Schale zu Beginn des Experiments aus. Alle Zellen wuchsen vier Tage in Gegenwart von 0,5 mM CPA.
24 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Abtötungswirksamkeit zwischen zellvermittelten und sekretorischen Effekten darstellt. Das aufbereitete Medium aus jeder der vier Tage alten Co-Kultivierungstests, die in 23A gezeigt werden, wurde abgeerntet, gefiltert und wurde dann zu 2 × 10⁶ C6-Zellen hinzugefügt. Die C6-Zellzahl wurde dann 5 Tage später ermittelt. Die Zählungen stellen den Durchschnitt (± SE) aus drei Platten dar.
25 ist eine Western Blot-Analyse von Cytochrom P450 2B1 in 9L-Zellen der Elterngeneration und in 9L-Zellen, die Cytochrom P450 2B1 stabil exprimieren. Mikrosomale Proteine, aus kultivierten Zellen (20 μg Protein/Bande) präpariert, wurden der Elektrophorese auf 10 % SDS/Polyacrylamidgelen unterworfen, auf Nitrozellulose übertragen und mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Cytochrom P450 2B1-Antikörpern getestet, wie unter Methoden beschrieben. 9L-ZP1 (Spur 2) entspricht einem zweiten Klon, der aus derselben Auswahl wie 9L-ZP abgeleitet wurde. Es exprimiert Cytochrom P450 2B1 und weist eine Oxazaphosphorin-Sensibilität auf, die der von 9L-ZP sehr ähnlich ist. Phenobarbital-induzierte Rattenlebermikrosomen (0,5 oder 1 μg, Spuren 5 bzw. 6) wurden als Standard für Cytochrom P450 2B1 (untere Bande der Dublette in Spur 5 und 6) verwendet.
26 stellt Diagramme dar, die die Zytotoxizität von Oxazaphosphorinen gegenüber Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen (als Ausgang verwendete 9L und 9L-Z) und Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen (9L-ZP und L450-2) zeigen. Zellen (1 × 10⁵), doppelt auf 30 mm Gewebekulturplatten aufgetragen, wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Cyclophosphamid (CPA), Ifosfamid (IFA) oder 4-Hydroperoxycyclophosphamid (4HC) (Felder-A-C) behandelt. Die überlebenden Zellen wurden 5 Tage nach dem Beginn der medikamentösen Behandlung gezählt, wie unter Methoden beschrieben. Die Wirkung von Medikamenten auf das Zellüberleben wurde als Wachstumsverhältnis (in %) ausgedrückt, d.h. Zellzahl auf Platten, die das Medikament enthalten, als Prozentsatz der entsprechenden wirkstofffreien Kontrollen (Mittelwert ± Bereich für doppelte Bestimmungen). Endzellzahl (× 10⁴) in wirkstofffreien Kontrollen = 140 ± 8 (9L), 135 ± 7 (9L-Z), 140 ± 10 (9L-ZP), 130 ± 6 (L450-2) für jede der angegebenen Zelllinien.
27 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass der Cytochrom P450 2B1-Enzyminhibitor Metyrapon (MTP) die zytotoxischen Effekte von Cyclophosphamid (CPA) und Ifosfamid (IFA), aber nicht von 4-Hydroperoxycyclophosphamid (4HC) auf Cytochrom P450 2B1-exprimierende Zellen blockiert. 9L-Z- und 9L-ZP-Zellen (1 × 10⁵) wurden entweder mit 1 mM Cyclophosphamid, 2 mM Ifosfamid oder 10 μM 4-Hydroperoxycyclophosphamid in Abwesenheit oder in Gegenwart von 10 μg Metyrapon behandelt, wie angegeben. Kontrollen erhielten keine Wirkstoffbehandlung. Daten (Mittelwert ± Bereich für doppelte Bestimmungen) werden als Wachstumsverhältnis (in %) relativ zu den wirkstofffreien Kontrollen ausgedrückt.
28 ist ein Balkendiagramm, das die Zytotoxizität von Oxazaphosphorinen gegenüber gemischten Kulturen von 9L- und 9L-ZP-Zellen darstellt. Gleiche Zahlen von elterlichen 9L-Zellen wurden mit 9L-ZP-Zellen (Gesamtanfangszellzahl = 1 × 10⁵/30 mm Gewebekulturschale) gemischt. Die Zellen waren unbehandelt oder wurden entweder mit 1 mM Cyclophosphamid (CPA) oder 2 mM Ifosfamid bei Fehlen oder in Gegenwart von 10 μM Metyrapon (MTP) behandelt, wie angegeben. Die Zellzahlen wurden 5 Tage nach Beginn der Wirkstoffbehandlung ermittelt. Daten (Mittelwert ± Bereich für Duplikate) werden als Wachstumsverhältnis (in %) relativ zu den wirkstofffreien Kontrollen ausgedrückt. In Kontrollexperimenten zeigte Cyclophosphamid keine Zytotoxizität gegenüber gemischten Kulturen von 9L- und 9L-Z-Zellen (Daten nicht dargestellt).
29 ist eine histochemische Analyse von lacZ-markierten Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen und unmarkierten Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen in einer gemischten Zellpopulation. Gleiche Zahlen von elterlichen 9L-Zellen (1 × 10⁵) wurden mit lacZ-markierten Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-ZP-Zellen („9L/lacZ/2B1”) (Feld A) gemischt, und die Wirkung von Cyclophosphamid (CPA) (Feld B) oder Cyclophosphamid mit Metyrapon (MTP) (Feld C) auf die überlebenden Zellen wurde in 23 getestet. Es werden Zellen gezeigt, die fünf Tage nach dem Beginn der Wirkstoffbehandlung in 0,5 %igem Glutaraldehyd fixiert und dann mit X-Gal 4 Stunden lang gefärbt wurden, um die 9L-ZP-Zellen sichtbar zu machen, die hier durch die dunkle Färbung angezeigt werden.
30 besteht aus zwei Diagrammen, die zeigen, dass die löslichen Faktoren an der Bystander-Zytotoxizität von Cyclophosphamid gegenüber Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen beteiligt sind. In Feld A wurden die elterlichen 9L-Zellen (1 × 10⁵) in die Bodenvertiefung von 30 mm Kulturplatten gebracht. Die oberen Kammern von Falcon-Kultureinsätzen wurden mit 9L-Z- oder 9L-ZP-Zellen (1 × 10⁶) versehen, wie angegeben. Die zwei Zellpopulationen wurden daher durch eine Membran von 0,45 μm Porengröße getrennt, die den direkten Kontakt zwischen den zwei Zellpopulationen verhindert. Die Zellen wurden mit 1 mM Cyclophosphamid (CPA) mit oder ohne 10 μM Metyrapon (MTP) behandelt oder erhielten als Kontrolle keine Wirkstoffbehandlung. Zellzahlen wurden 5 Tage nach Beginn der Behandlung bestimmt. In Feld B ist das experimentelle System das gleiche wie in Feld A, außer dass die Anfangszahl der 9L-ZP-Zellen in der oberen Kammer (auf der x-Achse gezeigt) von 10⁴ bis 10⁶, d.h. in einem Verhältnis von 0,1 zu 10 relativ zur anfänglichen Zahl der 9L-Zellen in der unteren Kammer, variiert wurde. Auf der y-Achse wird die Endzahl von 9L-Zellen in der unteren Kammer 5 Tage nach dem Wachstum in Gegenwart von 1 mM Cyclophosphamid gezeigt. Daten (Mittelwert ± Bereich für Duplikate) werden als Wachstumsverhältnis (in %) relativ zu den wirkstofffreien Kontrollen ausgedrückt.
31 ist ein Diagramm, das den wachstumshemmenden Effekt von Cyclophosphamid auf 9L-Z- und 9L-ZP-Tumoren darstellt, die in vivo gewachsen waren. Weibliche Fisher 344-Ratten wurden mit 2 × 10⁶ 9L-Z- oder 9L-ZP-Zellen durch subkutane Injektion in den äußeren Oberschenkel inokuliert (9L-Z-Zellen in den rechten Oberschenkel und 9L-ZP-Zellen in den linken Oberschenkel). Sieben Tage nach Tumorimplantation erhielt jede Ratte eine einzige intraperitoneale Injektion von Cyclophosphamid (100 mg/kg Körpergewicht) oder physiologische Kochsalzlösung als Kontrolle. Tumorflächen wurden gemessen, bis die Ratten eingeschläfert wurden. Die gezeigten Daten sind Mittelwert ± Messfehler für n = 5 Tumoren pro Gruppe.
32 ist ein Diagramm, das die hohe Sensibilität von 6 Cytochrom P450 2B1-exprimierenden menschlichen MCF-7-Brustkrebs-Zelllinien für Cyclophosphamid in Kultur zeigt. Die experimentelle Anordnung ist dieselbe wie für 26 beschriebene.
33 ist ein Diagramm, das die Abtötung von Tumorzellen in vivo vergleicht, die bei vier P450-exprimierenden MCF-7-Tumoren (die als P3, P2, P9 und P26 bezeichnet werden) erhalten wurden, im Vergleich zu der von Kontrolltumoren MCF-7 Z3, die β-Galactosidase exprimieren. Weibliche homozygote nackte thymuslose Schweizer Mäuse (nu+/nu+), 20-25 g, wurden durch subkutane Injektion von 1 × 10⁷ Zellen in die äußeren Oberschenkel jeweils mit den einzelnen MCF-7- oder Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Tumoren inokuliert, die in 32 gezeigt werden. Gezeigt wird der Effekt von Cyclophosphamid (CPA) auf das Tumorwachstum in Tieren, die mit Cyclophosphamid behandelt wurden, das mit 100 mg/kg Körpergewicht × 2 durch intraperitoneale Injektion an Tag 0 und wieder an Tag 2 verabreicht wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist auf die selektive Abtötung von neoplastischen Zellen und insbesondere neoplastischen Zellen im Nervensystem gerichtet. Es werden virale Vektoren verwendet, die ein Gen trage, dessen Genprodukt in der Lage ist, sich auf die neoplastischen Zellen für den selektiven Zelltod zu richten.
Unter neoplastischen Zellen werden sich teilende Zellen, normalerweise sich schnell teilende Zellen verstanden. Für die Zwecke der Erfindung umfassen neoplastische Zellen Zellen von Tumoren, Neoplasmen, Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Lymphomen und dergleichen. Von besonderem Interesse sind Tumoren des Zentralnervensystems. Dazu gehören Astrozytome, Oligodendrogliome, Meningiome, Neurofibrome, Ependymome, Schwannome, Neurofibrosarkome, Glioblastome usw. Die neoplastischen Zellen, die für die Erfindung von besonderem Interesse sind, sind die Zellen von Hirntumoren. Hirntumoren von Erwachsenen sind einzigartig darin, dass sie Massen von sich teilenden Zellen vor dem Hintergrund von im wesentlich sich nicht teilenden Zellen darstellen. Daher nutzt die vorliegende Erfindung diese metabolischen Unterschiede für die Entwicklung eines gezielten Herangehens an die selektive Abtötung von neoplastischen Zellen.
Die Erfindung kann auch dazu genutzt werden, selektiv sowohl gutartige als auch bösartige neoplastische Zellen in der Peripherie sowie im Gehirn abzutöten. Wie hier verwendet, soll der Begriff Peripherie alle Teile des Körpers außerhalb des Gehirns bezeichnen. Ein peripherer Tumor soll daher einen Tumor in einem Teil des Körpers außerhalb des Gehirns bedeuten.
Unter viralen Vektoren werden DNA-Viren, wie z.B. adeno-assoziiertes Virus, Adenvirus, Herpesvirus, wie z.B. Herpes simplex-Virus und Epstein-Barr-Virus, und Retroviren, wie z.B. MoMLV, verstanden. Vorteilhafterweise können die retroviralen Vektoren der Erfindung sich nur in das Genom sich teilender Zellen integrieren. Daher stellen die Vektoren eine nützliches Vehikel für die selektive Ansteuerung sich teilender Zellen dar. Retrovirale Vektoren bieten weitere Vorteile, da es keine Beschränkungen im Wirtsbereich gibt, und diese Vektoren sind bereits erfolgreich dazu verwendet worden, viele verschiedene Zelltypen zu infizieren. Siehe zum Beispiel Cepko, C., „Lineage analysis and immortilization of neural cells via retrovirus vectors" in Neuromethods 16, The Humana Press, Clifton, NJ (1989), S. 177-219; Gilboa. E., BioEssays 5(6):252-257 (1987); Friedman, T., Science 244:1275-1281 (1989). Ein Nachteil von retroviralen Vektoren ist jedoch der niedrige Produktionstiter des Retrovirus.
Im allgemeinen sind retrovirale Vektoren im Fachgebiet gut bekannt. Siehe Breakefield et al., Molec. Neuro. Biol. 1:339 (1987) und Shih et al., in Vaccines 85, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1985), S. 177-180. Ferner richten sich auch die ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen Serien-Nr. 07/304,619 und 07/508,731 auf Herpes simplex-Virusexpressionsvektoren. Die Offenbarungen dieser Anmeldungen werden durch Verweis miteingeschlossen. Diese Anmeldungen liefern weitere Informationen über den Bau und die Verwendung von Retrovirusvektoren.
Wie oben angegeben, sind Retrovirusvektoren der vorliegenden Erfindung im allgemeinen replikationsdefekt und können in infektiöse retrovirale Teilchen durch transfizierte Zelllinien gepackt werden, die die retroviralen Sequenzen enthalten, welche die für die Verpackung der retroviralen RNA notwendigen Proteine codieren, aber nicht ihre eigene RNA verpacken können. Siehe Mann et al., Cell 33:153-159 (1983); Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988). Da sich Retroviren und die von ihnen abgeleiteten Vektoren in das Wirtsgenom integrieren, werden ihre Sequenzen auf alle Tochterzellen übertragen. Dieses Merkmal von Retroviren wurden erfolgreich verwendet, zum Beispiel zum Verfolgen von Zellabstammungen im Nervensystem (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987); Luskin et al., Neuron 1:635-647 (1988): Walsh and Cepko, Science 241:1342-1345 (1988)).
Gene für den Transfer durch die retroviralen Vektoren in die neoplastischen Zellen werden unter denen ausgewählt, die sich auf die Wirtszelle normalerweise durch die Expression eines Genproduktes in den neoplastischen Wirtszellen richten. „Genprodukt" bezieht sich im weiten Sinne auf Proteine, die durch das spezielle Gen codiert werden. Jedoch schließt für die Zwecke der Erfindung Genprodukt auch Transkriptionsprodukte des Gens ein, besonders für die Verwendung als Antisense-RNA. Die durch die vorliegenden Vektoren angegriffenen Wirtszellen sind diejenigen Zellen, die das Virus infiziert und in die das gewünschte Genprodukt exprimiert wird. Die Wirtszellen stellen somit neoplastische Zellen dar, die mit retroviralen Vektoren infiziert sind.
Es werden Gene ausgewählt, deren Genprodukte dazu dienen, Wirtszellen zu identifizieren, das Wirtszellwachstum zu verlangsamen oder zeitweilig zu stimulieren, um die Wirtszelle empfindlicher für chemotherapeutische Mittel zu machen und/oder deren Produkte die Wirtszellen für den Zelltod angreifen. Der Zelltod kann erreicht werden durch Kontaktieren von Wirtszellen, die das Genprodukt enthalten, und anschließende, entweder physikalische oder chemische, Behandlung. Alternativ können die Genprodukte selbst dazu dienen, die Wirtszellen abzutöten oder das Zellwachstum zu verlangsamen. Genprodukte, die zeitweilig das Zellwachstum stimulieren, sind zum Beispiel Wachstumsfaktoren, einschließlich beispielsweise des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF).
In dieser Beziehung enthält ein Beispiel eines nützlichen Genproduktes bildgebende Verbindungen, die zur Lokalisierung des Tumors genutzt werden können. Das Retrovirus wird also als Mittel zur Diagnose der Lage und des Ausmaßes des neoplastischen Wachstums verwendet. Siehe zum Beispiel Glatstein et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 11:299-314 (1985).
Es werden auch Gene ausgewählt, deren Produkte selbst in der Lage sind, Zellen selektiv abzutöten. Zum Beispiel kann das Genprodukt Antisense-Nukleinsäure für wesentliche Zellproteine, wie z.B. Replikationsproteine, enthalten, die dazu dienen, die Wirtszellen ihrer Fähigkeit zu weiterem Zellwachstum und Teilung berauben. Antisense-Regulation wurde von Rosenberg et al., Nature 313:703-706 (1985); Preiss et al., Nature 313:27-32 (1985); Melton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:144-148 (1985); Izant and Weintraub, Science 229:345-352 (1985); Kim and Wald, Cell 42:129-138 (1985); Pestka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7525-7528 (1984); Coleman et al., Cell 37:683-691 (1984) und McGarry and Lindquist, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:399-403 (1986) beschrieben.
Andere Gene, die zur Verlangsamung des Zellwachstums verwendet werden, umfassen Tumorsuppressorgene, Gene, die die Transkriptionsfaktoren zur Unterdrückung des Zellwachstums codieren, toxische Proteine, die von Zellen freigesetzt werden, und dergleichen. Siehe zum Beispiel Heinbrook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4697 (1990), die ein Fusionsprotein mit Toxin beschreiben, das an den EGF-Liganden angekoppelt ist. Es sind auch Toxingene beschrieben worden, zum Beispiel Barker et al., Gene 86:285-290 (1990); Ito et al., Microb. Pathog. 8:47-60 (1990); Gannon et al., J. Gen. Microbiol. 136:1125-1136 (1990). Es können auch Gene eingefügt werden, die die Zellwachstumskennwerte ändern oder das Zellwachstum modulieren, z.B. ein Tumorsuppressorgen, wie z.B. das Rb-Gen im Retinoblastom (Huang et al., Science 242:1563-1566 (1988)) oder das p53-Gen beim Coloncarcinom (Baker et al., Science 249:912-915 (1980)). Es können auch andere Suppressor- oder modulierende Gene verwendet werden.
Gene, deren Produkte dazu dienen, die Wirtszellen stärker antigen zu machen, finden in der Erfindung ebenfalls Verwendung. Dieser antigene Effekt kann durch Einbringen neuer Antigene auf der Oberfläche der Wirtszellen realisiert werden, wodurch das Immunsystem beim Erkennen des Tumors als Fremdkörper gestärkt wird. Das Einbringen neuer Antigene in die Oberfläche der Wirtszellen wird als Verfremdung der Zellen bezeichnet (Austin et al., Ad. in Cancer Res. 30:301-345 (1979); Kobayashi et al., Ad. in Cancer Res. 30:279-299 (1979)). Jedes nicht menschliche Oberflächenantigen kann verwendet werden, dazu gehören auch diejenigen, die in Araki et al., Gene 89:195-202 (1990); Tackle et al., Mol. Biochem. Parasitol. 37:57-64 (1989); Raney et al., J. Virol. 63:3919-3925 (1989); Tondravi, M.M., Curr. Genet. 14:617-626 (1988) und Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1-5 (1983) beschrieben sind.
Die Expression nicht menschlicher oder einmalig vorhandener Oberflächenantigene in neoplastischen Zellen kann auch dazu verwendet werden, solche neoplastischen Zellen durch nachfolgende Bindung an markierte Antikörper zu lokalisieren. Siehe zum Beispiel Le Doussal et al., Cancer Res. 50:3445-3452 (1990); Palabrica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1036-1040 (1989); Berends et al., Cancer Immunol. Immunother. 26:243-249 (1988) und Welt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4200-4204 (1987).
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Gen oder eine Codiersequenz ausgewählt werden, deren Genprodukt einen bedingten Abtötungsmechanismus für sich teilende Zellen bietet. Auf diese Weise ist die Expression eines bestimmten Proteins, gefolgt von der anschließenden Behandlung, wirksam bei der Abtötung der neoplastischen Zellen. Die anschließende Behandlung umfasst chemische und physikalische Behandlungen. Mittel für chemische Behandlungen enthalten die Verwendung von Enzymen oder anderen Verbindungen, die mit dem Genprodukt reagieren, um die Wirtszellen abzutöten. Physikalische Behandlungen umfassen die Einwirkung von Strahlung, UV-Licht und dergleichen auf die Zellen.
Zum Beispiel bietet das Herpes simplex-Virus Typ I (HSV-1)-Thymidinkinase (TK)-Gen einen solchen bedingten Abtötungsmechanismus für sich teilende Zellen. Der selektive Vorteil der Verwendung von HSV-1-TK leitet sich aus der höheren Affinität ab, die das Enzym zu bestimmten Nukleosidanaloga besitzt, wie z.B. Acyclovir, Ganciclovir und FLAU, als Säugetier-TK (McLaren et al., in Herpes Virus and Virus Chemotherapy, R. Kono, Hrsg., Elsevier, Amsterdam (1985), S. 57-61. Diese Wirkstoffe werden in nuldeotidähnliche Präkursoren umgewandelt und in die DNA replizierender Zellen eingebaut, wodurch sie die Integrität des Genoms stören und letztendlich zum Zelltod füheren. Verschiedene Untersuchungen haben erfolgreich von der bedingten Toxizität von TK in Entwicklungsstudien mit transgenen Mäusen Gebrauch gemacht (Borrelli et al., Nature 339:538-541 (1989); Heyman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2698-2702 (1989)), als selektiver Marker bei nicht homologen Rekombinationsereignissen in kultivierten Zellen (Capecchi, M.R., Trends in Genetics 5(3):70-76 (1989)), zum Abtöten von Zellen, die Herpesviren vom Wildtyp beherbergen (Corey et al., N. Engl. J. Med. 314:686-691 (1986); Corey et al., N. Engl. J. Med. 314:749-756 (1986)), und bei der Auswahl von Herpesvirusmutanten, denen TK-Aktivität fehlt (Coen et al., Science 234:53-59 (1986)). Retrovirale Vektoren, die HSV-1-TK exprimieren, sind zur Sensibilisierung von zerebralen Gliomen gegenüber Ganciclovir verwendet worden (Culver et al., Sciences 256:1550-1552 (1992)). WO 95/05835 beschreibt eine Methode zur Behandlung solider Tumore, Papillome oder Warzen durch die Zufuhr eines Selbstmordgens, wie z.B. des HSV-1-TK-Gens, mittels eines adenoviralen Vektors. Ein Prodrug, wie z.B. Ganciclovir, wird dann dazu verabreicht, die Tumorzellen abzutöten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Cytochrom P450-Gen dazu verwendet, neoplastische Zellen für die zytotoxischen Wirkungen eines chemotherapeutischen Mittels zu sensibilisieren, das durch ein oder mehrere Cytochrom P450-Gene aktiviert wird. Der Begriff Cytochrom P450-Gen, wie er hier verwendet wird, soll ein Säugetier-Cytochrom P450-Gen, wie z.B. P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 oder P450 3A4, bedeuten. Jedes dieser Gene ist in Verbindung mit der Aktivierung der Krebsmedikamente Cyclophosphamid oder Ifosfamid gebracht worden (Clarke et al., Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Chang et al., Cancer Res. 53:5629-5637 (1993); Weber and Waxman, Biochemical Phramacology 45:1685-1694 (1993)), und die cDNA-Sequenzen dieser Gene sind auch veröffentlicht worden (Nelson et al., DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993) und die darin genannten Literaturzitate; Yamano et al. Biochem. 29:1322-1329 (1990); Yamano et al., Biochem., 28:7340-7348 (1989)). Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit zahlreichen anderen Krebsmitteln zu nutzen, die durch Enzyme der Cytochrom P450-Familie aktiviert werden (LeBlanc and Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989)), sowie mit wirkstoffmetabolisierenden Cytochrom P450-Genen aus anderen Arten (z.B. Maus, Kaninchen, Hamster, Hund usw.), die zu den Cytochromen P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 oder P450 3A4 homolog sind und deren cDNA-Sequenzen bekannt sind (Nelson et al., DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993)). Die Rolle von Cytochrom P450 bei der Verstoffwechselung von Mutagenen und Carcinogenen in eine aktive Form wurde untersucht, wobei retrovirale Vektoren, die P450-Enzyme exprimieren, zur Transfektion von Nagetierzellen eingesetzt wurden (Tiano et al., Carcinogenesis 14:1421-1427 (1993)).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Cytochrom P450 2B1-Gen zur Sensibilisierung von Tumorzellen des Zentralnervensystems für die zytotoxischen Wirkungen von Cyclophosphamid CPA) verwendet. Die meisten bösartigen Tumoren des Zentralnervensystems sprechen nicht gut auf Chemotherapie an. Das Krebsmedikament Cyclophosphamid (CPA) ist bei Neoplasmen des Zentralnervensystems weitgehend unwirksam, da seine Umwandlung in DNA-alkylierende, zytotoxische Metabolite primär auf die Leber beschränkt ist und diese Metabolite die Blut-Hirn-Schranke nicht ohne weiteres überqueren. Es ist jetzt gezeigt worden, dass Hirntumorzellen für die zytotoxischen Wirkungen von CPA sowohl in Kultur als auch in vivo durch die Einführung des Leberenzyms Cytochrom P450 2B1 sensibilisiert werden können, das für die Aktivierung des inerten Prodrugs, CPA, verantwortlich ist. Die stabile Transfektion von C6-Rattengliomzellen mit dem Cytochrom P450 2B1-Gen machte die Tumorzellen in Kultur empfindlich für CPA. Weiters waren C6-Zellen, die dieses Gen trugen, empfindlicher als elterliche Zellen für die zytotoxische Wirkung von CPA, wenn sie subkutan in den Flanken von thymuslosen Mäusen wuchsen. Mäuse-Fibroblasten, die einen Retrovirusvektor erzeugen, der P450 2B1 codiert und dieses Enzym exprimiert, wurden dann präpariert und in die Gehirne von thymuslosen Mäusen verpflanzt, denen C6-Rattengliome eingesetzt worden waren. Die intrathekale Verabreichung von CPA verhinderte die Entwicklung von meningealer Neoplasie und führte zur teilweisen Regression der parenchymalen Tumormasse. Im Gegensatz dazu wiesen Kontrollmäuse mit C6-Gliomen, die zuerst Fibroblasten erhielten, welche das E. coli lacZ-Gen exprimieren, und dann CPA, umfangreiche meningeale Tumoren und parenchymale solide Hirntumoren auf.
Zusammengefasst gesagt, wurde festgestellt, dass die Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens in C6-Gliomzellen nach CPA-Behandlung in Kultur zur Vernichtung von Tumorzellen und in subkutanen Tumoren in thymuslosen Mäusen fuhrt. Zusätzlich wurden experimentelle Hirntumore in Mäusen für CPA nach der Verpflanzung von Retrovirus produzierenden Fibroblasten, die P450 2B1 exprimieren, in die Tumormasse sensibilisiert. Vorherige Berichte haben auch gezeigt, dass Ovarialzellen von chinesischen Hamster, die stabil mit dem Cytochrom P450 2B1-Gen transfiziert wurden, eine Chemosensibilität gegenüber Cyclophosphamid, Ifosfamid und Aflatoxin B1 erhielten und dass diese zur Beurteilung der Toxizität dieser Mittel verwendet werden können (Doehmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5769-5773 (1988); Doehmer et al., Environ. Health Prospect 88:63-65 (1990)). Vorherige Berichte haben auch gezeigt, dass transgene Drosophila-Larven, die das P450-Gen exprimieren, hypersensibel für Cyclophosphamid sind (Jowett et al., EMBO J 10:1075-1081 (1991)), und dass menschliche lymphoblastenähnliche Zelllinien, die stabil Cytochrom P450 2B1 oder P450 2A6 exprimieren, chemosensibel für Cyclophosphamid und Ifosfamid sind (Chang et al., Cancer Res. 53:5629-5637 (1993)). Die Ergebnisse der Erfinder zeigen nun, dass das Cytochrom P450 2B1-Gen ein wirksames wirkstoffbedingtes Abtötungsgen für sich teilende Zellen ist, mit neuartigen Anwendungen für die Tumorgentherapie und für eine Vielzahl von Verfahren, die einen negativen Auslesemechanismus erfordern.
Die in situ-Aktivierung von CPA durch Cytochrom P450 2B1 bietet einen neuartigen Ansatz nicht nur für die Gentherapie von Hirntumoren, sondern auch für die negative, wirkstoffbedingte Auslese anderer definierter Zellpopulationen. Daher wird in einer anderen bevorzugten Ausführungsform das Cytochrom P450 2B1-Gen dazu genutzt, periphere Tumoren für die zytotoxischen Wirkungen von Cyclophosphamid zu sensibilisieren.
In dieser Beziehung nutzten die Erfinder 9L-Gliosarkomzellen, die zur Expression von Cytochrom P450 2B1 stabil transfiziert wurden, um das Cytochrom P450 2B1/Oxazaphosphorin-System für die Krebsgentherapie zu bewerten. In vitro-Experimente und eine in vivo-Untersuchung zur Verzögerung des Tumorwachstums, die die CPA-Sensibilität von elterlichen 9L-Zellen mit der von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-Tumorzellen verglich, zeigten, dass subkutane solide Tumoren für eine Oxazaphosphorin-Behandlung in den Fällen hoch empfindlich gemacht werden können, in denen die intratumorale Prodrug-Aktivierung durch die tumorale Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens erreicht werden kann. Außerdem haben die Erfinder gezeigt, dass menschliche MCF-7-Brustkrebszellen, die zur Expression von Cytochrom P450 2B1 transfiziert wurden, für Cyclophosphamid in Zellkultur und in einem Modell mit der nackten Maus sensibilisiert wurden.
Man kann vernünftigerweise glauben, dass das Verfahren gemäß der Erfindung eine höhere Tumortoxizität bei derselben Wirkstoffkonzentration ermöglicht, wodurch höhere Tumordosen ohne Erhöhung der Toxizität für normale Zellen möglich werden. Ferner kann die chemotherapeutische Behandlung von systemischen Tumorpopulationen ebenfalls durch die Verwendung der Methode der vorliegenden Erfindung verbessert werden kann, weil niedrigere Dosen des Wirkstoffs dank erhöhter Wirksamkeit möglich sein können.
Das Genprodukt kann auch eine Chemikalie oder ein Protein codieren, die die Wirtszellen strahlenempfindlich und damit sensibler für die Abtötung durch Strahlung machen. Daher werden die Wirtszellen bei nachfolgender Einwirkung von Strahlung selektiv abgetötet. Zum Beispiel kann die Kombination von HSV-TK-Gen und Ganciclovir verwendet werden. Zellen, die das HSV-TK-Gen tragen, zeigen eine erhöhte Sensibilität für Strahlung in der Gegenwart von Ganciclovir, da seine Metabolite die DNA-Reparatur und die DNA-Synthese stören. Siehe Snyderman et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:1147-1150 (1986) und Sealy et al., Cancer 54:1535-1540 (1984). Andere Strategien sind der selektive Transfer von antigenen Zelloberflächenmarkern in Kombination mit der Entwicklung von tumorspezifischen Immunkonjugaten zur Verbesserung der Zielausrichtung von chemotherapeutischen Mitteln. Siehe Reisfeld, R.A., in Molecular Probes Technology and Medical Applications, Albertini et al., Rauen Press, New York (1989).
Es wird anerkannt, dass das interessierende Gen durch jedes im Fachgebiet bekannte Verfahren verändert werden kann. Das Gen kann zum Beispiel unter die Kontrolle von heterologen Regulationsregionen gestellt werden, einschließlich der Verwendung von viralen Promotoren, Promotoren neoplastischer Zellen oder tumorspezifischen Promotoren und Kontrollelementen. Zum Beispiel kann das DF3-Gen, das in den meisten Brustkrebsen exprimiert wird, zur direkten Expression von „Selbstmordgenen" in Brustkrebszellen verwendet werden (Manome et al., Cancer Res. 54:5408-5413 (1994)). Diese Verfahren lassen sich leicht auf das Therapieparadigma mit dem Cytochrom P450 2B1-Gen anwenden, wie hier offengelegt. Auf diese Weise wird das Genprodukt weiter auf spezielle Zelltypen ausgerichtet. Verfahren zur Konstruktion solcher Expressionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt.
Allgemein gesagt, sind Methoden im Fachgebiet zur retroviralen Infektion der interessierenden Zellen bekannt. Das Virus kann in den Wirt oder in die Nähe des neoplastischen Wachstum injiziert werden. Größtenteils wird das Virus in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Infektion und Abtötung der Zielzellen bereitgestellt. Grundsätzlich wird das Virus in einer Konzentration im Bereich von 10¹ bis etwa 10¹⁰ plaquebildenden Einheiten (PFU) bereitgestellt, im allgemeinen etwa 5 × 10⁴ bis etwa 1 × 10⁶ PFU, noch allgemeiner etwa 1 × 10⁵ bis etwa 4 × 10⁵, obwohl die Bereiche schwanken können. Typischer ist es jedoch, dass die Verpackungszelllinie in die Nähe des Tumors oder in den Tumor verpflanzt wird, um so eine länger wirksame Virusquelle zu erhalten. Vor kurzem sind Retrovirusvektoren erfolgreich mit dem Hüllprotein des Bläschenstomatitisvirus (VSV) verpackt wurden. Diese Vektoren sind stabiler und können direkt injiziert werden, womit auch höhere Titer des Retrovirus erreicht werden. (Burns et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037 (1993)).
Diese selektive Abtötung des Retrovirus und die Abgabe des toxischen Gens kann durch die Co-Infektion mit einem Helfervirus verstärkt werden. Das heißt, das Helfervirus erhöht die Genlieferung. Auf diese Weise können die Verpackungszelllinien zur Herstellung von Viruspartikeln des Retrovirus gleichzeitig mit einem Helfervirus infiziert werden. Verpackungszellen oder virales Impfmaterial wird dann in den Wirt beim oder in der Nähe des Infektionsortes injiziert. (Siehe Cepko, C., (1989), oben; Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988) und Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)). Solche Helferviren sind ökotrope Wildtyp-Retroviren, z.B. MoMLV (siehe Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988); Cepko, C., in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Inc., Clifton, NJ (1989) und Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)).
Zur Nutzung eines Helfervirus kann die Verpackungslinie oder eine retrovirale vektorinfizierte Linie anschließend mit dem Wildtyp-Virus in Kultur infiziert werden, und diese Zellen können dann gepfropft werden. (Siehe Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988) und Wolff et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)). Die Verpackungszellen werden mit dem Helfer im Bereich der Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 bis etwa 20 infiziert.
Die Sensibilität der Tumorzellen für toxische Agenzien wird durch die Verwendung von Helferviren erhöht. Die Helferviren wandeln Zellen, die mit Retrovirusvektoren infiziert sind, in Verpackungszelllinien. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die gemeinsame Infektion mit einem Helfervirus die Retrovirusvektoren der Erfindung in der Lage sind, mehr Tumorzellen anzusteuern, und zwar selbst diejenigen Tumorzellen, die sich weit von der Tumormasse befinden. Weiterhin sterben die Tumorzellen schneller und zeigen mehr Empfindlichkeit für toxische Agenzien, wenn ein Helfervirus verwendet wird.
Die Erfindung findet speziell für die Behandlung von Glioblastomen Anwendung. Das Glioblastom stellt etwa 30 % oder 50 % aller primären Hirntumoren dar und ist trotz Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie fast immer tödlich. Die mittlere Überlebensdauer beträgt weniger als 1 Jahr, und die Fünf-Jahres-Überlebensrate beträgt nur 3 % oder 5 %. Nach der Behandlung tritt die Krankheit oft im Umkreis von 2 cm von der ursprünglichen Stelle wieder auf. Metastasen sind äußerst selten; neurologische Störungen und der Tod sind auf das lokale Wachstum und die zerebrale Invasion zurückzuführen. Daher wurde die mögliche Wirksamkeit lokaler (nicht-systemischer) Behandlungen erkundet. Ein paar davon schließen Untersuchungen zur lokalen Hypothermie, photodynamischen Therapie und interstitiellen Bestrahlung ein. Jedoch hat bis zur vorliegenden Erfindung keine therapeutische Modalität einen wesentlichen Einfluss auf das Schicksal von Patienten mit malignen Gliomen gehabt.
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung und in keinem Fall als Einschränkung gedacht.
Experimentelles Vergleichsbeispiel 1
Primäre menschliche Hirntumoren (maligne Gliome) sind nicht gekapselt, und daher ist es schwierig, ihre vollständige Entfernung auf chirurgischem Wege sicherzustellen. Viele dieser Tumoren sind nicht metastatisch und können gelegentlich nur ein paar Zentimeter in das umgebende Gewebe eindringen. Jedoch haben Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie bisher nur eine mäßige Auswirkung auf die Gesamtmorbidität und -mortalität der betroffenen Personen gehabt. Neuartige, zielgerichtete Ansätze für die Behandlung maligner Gliome sind eine Erkundung wert.
Hirntumoren sind einzigartig darin, dass sie Massen von sich teilenden Zellen vor dem Hintergrund von im wesentlichen sich nicht teilenden Zellen darstellen. Diese metabolischen Unterschiede können bei der Entwicklung von zielgerichteten Herangehensweisen an die Therapie ausgenutzt werden. Retrovirale Vektoren liefern ein nützliches Vehikel für das selektive Herangehen, da sie (1) sich nur in das Genom sich teilender Zellen integrieren können, und (2) diese Vektoren bereits erfolgreich verwendet wurden, um viele verschiedene Zelltypen zu infizieren (Überblick siehe Cepko, C., in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neubiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Clifton, N.J. (1989), S. 177-218; Gilboa, E., BioEssays 5:252-257 (1987); Friedmann, T., Science 244:1275-1281 (1989)). Die Retrovirusvektoren sind replikationsdefekt und können durch transfizierte Zelllinien, die retrovirale Sequenzen enthalten, welche die für die Verpackung retroviraler RNA notwendigen Proteine codieren, aber nicht ihre eigne RNA verpacken können, in infektiöse retrovirale Partikeln gepackt werden (z.B. Mann et al., Cell 33:153-159 (1983); Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988)). Da Retroviren und von ihnen abgeleitete Vektoren sich in das Wirtszellgenom integrieren, werden ihre Sequenzen auf alle Tochterzellen übertragen. Dieses Merkmal von Retroviren ist erfolgreich angewendet worden, zum Beispiel um Zellabstammungen im Nervensystem zu verfolgen (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987); Luskin et al., Neuron 1:635-647 (1988); Walsh et al., Science 241:1342-1345 (1988)).
Das Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-1)-Thymidinkinase (TK)-Gen bietet einen bedingten Abtötungsmechanismus für sich teilende Zellen. Der selektive Vorteil in der Verwendung von HSV-1-TK leitet sich aus der Tatsache ab, dass dieses Enzym eine höhere Affinität zu bestimmten Nukleosidanaloga, wie z.B. Ganciclovir, besitzt. Diese Wirkstoffe werden in nukleotidähnliche Präkursoren umgewandelt und in die DNA von replizierenden Zellen integriert, wobei sie die Integrität des Genoms zerstören und schließlich zum Zelltod führen.
Bei dieser Untersuchung wurden Ratten-C6-Gliomzellen als modellhafter primärer Hirntumortyp verwendet. C6-Zellen bilden schnell nach Injektion in das ZNS der adulten Ratte einen nicht gekapselten, nicht-metastatischen Tumor. Weiter stehen abgeleitete Zelllinien zur Verfügung, denen endogene TK-Aktivität fehlt (C6-BU1) oder die das lacZ-Gen tragen (C6-BAG), die experimentell nützlich sind. Es wurde ein retroviraler Vektor erzeugt, bei dem das HSV-1-TK-Gen durch den starken konstitutiven Retrovirus-LTR-Promotor reguliert wird. C6-BU1-Zellen wurden mit diesem Vektor infiziert und bezüglich der TK-Aktivität durch Wachstum im HAT-Medium ausgewählt. Elterliche und infizierte Zellen wurden auf ihre dosisabhängige Sensibilität für Ganciclovir in Kultur und in vivo getestet, gefolgt von der Inokulation unterhalb der Nierenkapsel der Ratte.
Material und Verfahren
Vektoraufbau: Ein 2,8 kb-BamHI-Fragment, das die vollständige Codiersequenz enthält, und 2 kb der nicht-codierenden 3'-Region (einschließlich der polyA-Additionsstelle) des HSV-1-TK-Gens (aus dem Plasmid pBRTK) wurden in die BamHI-Stelle eines retroviralen Plasmids, pL(X)RNL, geklont. Das sich ergebende Plasmid wird pLTKRNL genannt. Das pL(X)RNL-Plasmid wird aus dem Moloney-Mäuse-Leukämieretrovirus (MoMLV) und Moloney-Mäuse-Sarkomretrovirus (MoMSV) abgeleitet und enthält folgende Elemente: eine retrovirale Verpackungssequenz, psi: das Neomycin-Resistenz (neo^R)-Gen aus dem Transposon Tn5, das unter die transkriptionale Kontrolle eines Rous-Sarkomvirus (RSV)-Promotors gestellt wurde; den bakteriellen colE1-Ursprung der Replikation und das bakterielle Ampicillin-Resistenz-Gen. Das Plasmid ist im wesentlichen denjenigen ähnlich, über die in Wolff et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989); Short et al., Devel. Neurosci. 12:34-45 (1990) und Price et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987) berichtet wurde, außer dass es einen RSV-Promotor zum Antrieb von neo^R verwendet.
Der retrovirale BAG-Vektor enthält das Escherichia coli lacZ-Gen unter der Transkriptionskontrolle eines retroviralen LTR-Promotors, das Transposon Tn5 neo^R-Gen unter der Transkriptionskontrolle des SV40-Frühpromotor-Enhancerelement und andere Merkmale wie oben (Price et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987)).
Zellkultur: Es wurde eine ökotropische Retrovirus-Verpackungslinie, psi2, verwendet, die aus einer Maus-Fibroblastenlinie abgeleitet wurde (Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)). Die aus Ratten-C6-Gliomen abgeleiteten verwendeten Zelllinien waren: C6-BU1 (Amano et al., Exp. Cell Res. 85:399-408 (1974)), eine Linie, die in BUdR nach dem Verlust der Aktivität der endogenen Thymidinkinase ausgewählt wurde, und C6-BU1-BAG, ein Derivat von C6-BU1, das β-Galactosidase-Aktivität beim BAG-Virus exprimiert. Die aus psi2 abgeleitete Linie psi2-BAG-1-14 (Short et al., Dev. Neurosci. 12:34-45 (1990)) wurde dazu verwendet, das BAG-Virus zu gewinnen. Alle Zelllinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (GIBCO) kultiviert, das 10 % fötales bovines Serum (FBS-Marke), 100 Einheiten Penicillin und 100 μg Streptomycin pro ml enthält. Neomycin-resistente Zellen wurden ausgewählt und im selben Medium gehalten, das mit 1 mg/ml G418 (Neomycinanalogon, GIBCO) ergänzt wurde. Zellen, die HSV-1-TK exprimieren, wurden durch Einschluss von HAT (Hypoxanthinaminopterin-Thymidin, GIBCO) im Wachstumsmedium ausgewählt.
Transfektionen, Virusproduktion und Infektionen: Zur Herstellung von replikationsdefekten, HSV-1-TK-tragenden retroviralen Vektoren (v-TK), wurden 10 μg pLTKRNL-Plasmid-DNA in psi2-Zellen durch die Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode transfiziert, wobei der Glycerolschock nach Standardmethode verwendet wurde. Transfizierte psi2-Kolonien wurden im Medium gehalten, das G418 enthielt. Zur Anlage von Virusvorräten wurden Kulturen im Medium mit G418 gehalten, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichten, dann wurden sie mit einem Medium ohne G418 gefüttert, und 24 Stunden später wurde das virushaltige („konditionierte") Medium entfernt, durch ein Filter mit 0,45 μm Porenweite gefiltert und bei -70 °C gelagert.
Alle Infektionen erfolgten, indem das Medium in einer 100 mm Gewebekulturschale mit Empfängerzellen durch 2 ml Medium ersetzt wurde, das 4 μg/ml Polybrene (Sigma) und verschiedene Mengen Virusvorrat enthielt.
Die Virustiter der psi2-v-TK-Linie wurden durch Infektion von C6-BU1-Zellen und durch Ermitteln der Zahl der HAT-resistenten Klone bestimmt, die pro Volumeneinheit Virusvorrat erhalten wurden. Zwei HAT-resistente Klone, C6TK-vTK1 und 3, wurden für weitere Untersuchungen verwendet. Für die psi2-BAG-Linien wurden Virustiter auf dieselbe Weise bestimmt, wobei NIH3T3-Zellen verwendet wurden und auf G418-Resistenz ausgewählt wurde.
Histochemische Färbung für β-Galactosidase: Zur Sichtbarmachung der β-Galactosidase-Expression wurden Zellen in 0,5 %igem Glutaraldehyd in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,3, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und dann mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-B-D-galactosid 30 Minuten bis 4 Stunden lang bei 37 °C gefärbt (Turner and Cepko, Nature 328:131-136 (1987)).
Ganciclovirsensibilitätstests in Kultur: Die folgenden Zelllinien, C6, CC6-BU1, C6-VIK1 und 3, wurden auf dosisabhängige Toxizität des Nukleosidanalogons Ganciclovir getestet (Cytovene, Burroughs Wellcome). Die Zellen wurden mit einer Dichte von 100 pro 100 mm Schale ausplattiert. 72 Stunden später wurde Ganciclovir jeder Schale in wechselnden Konzentrationen hinzugefügt, und die Inkubation wurde 9 Tage fortgesetzt, wobei das Ganciclovir enthaltende Medium alle 3 Tage gewechselt wurde. Die getesteten Konzentrationen von Ganciclovir waren: 0, 3, 10, 30, 100 und 300 μm in dreifacher Ausführung. Am 9. Tag wurde das Medium entfernt, die Schalen wurden mit PBS gewaschen, mit 100 % Methanol 10 Minuten lang fixiert, mit einer 1:10-Verdünnung von Giemsa (Fisher) in destilliertem Wasser weitere 10 Minuten gefärbt, wieder mit Wasser gewaschen, dann getrocknet (Freshney, R.I., Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique, 2. Ausgabe, New York, Alan R. Liss, Inc. (1987)). Die Kolonien wurden gezählt und die Zahl in Schalen ohne Ganciclovir wurde als 100 % Überleben gewertet.
Ergebnisse
Vektoraufbau: Die Integrität und Ausrichtung des HSV-1-TK-Gens im Plasmid pLTKRNL wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Bei Spaltung bei BamHI wurden zwei Banden von etwa 2,8 kb und 6,7 kb erhalten, wie aus den entsprechenden Größen des HSV-1-TK-Gens und des pL(X)RNL-Vektor erwartet wurde. Auf der Grundlage der Sequenz des HSV-1-TK-Gens (McKnight, S.L., Nucleic Acids Res. 8(24):5949-5964 (1980)) wurden Fragmente der erwarteten Größen auch bei Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen, PstI und SmaI, erhalten. Einfügung des HSV-1-TK-Gens an der BamHI-Stelle des pL(X)RNL-Vektors brachte es unter die Kontrolle des MoMLV-LTR-Promotors.
Transfektion, Infektion: Die Verpackungslinie, psi2-TK, erzeugte 10⁴ CFU/ml. Es konnte keine Helfervirusproduktion durch diesen Klon festgestellt werden. Virus von psi2-TK wurde dazu verwendet, von C6 abgeleitete (C6-vTK) Zelllinien aufzubauen, die im HAT-Medium wuchsen.
Ganciclovirsensibilität in Kultur: Die Zelllinien, die bei der Sensibilitätsprüfung verglichen wurden, waren C6, C6-BU1 und C6VIK-1 und -3.
Ganciclovirsensibilität in vivo: Neun Ratten wurden C6VIK-Zellen unterhalb der Nierenkapsel implantiert. Vier überlebten das Verfahren für weitere Untersuchungen. 5 Tage nach der Implantation wurden die Tumoren gemessen. Zwei Tiere wurden mit Ganciclovir (20 mg/kg täglich intraperitoneal) behandelt und zwei täglich mit physiologischer Kochsalzlösung. Die Tumorgröße wurde im Verlauf eines Zeitabschnitts von 16 Tagen erneut beurteilt. Die zwei Kontrolltumoren wuchsen auf das Vier- bis Zwölffache. Im Gegensatz dazu waren die zwei mit Ganciclovir behandelten nach der Behandlung kleiner als vorher.
Diskussion
Bei diesen Beispielen wird demonstriert, dass ein Retrovirus, das das HSV-1-TK-Gen trägt, dazu verwendet werden kann, Wirkstoffsensibilität auf C6-Gliomzellen in Kultur und in vivo zu übertragen. Dies ist der erste beschriebene Retrovirusvektor, der ein aktives HSV-1-TK-Gen trägt. Dafür müsste es eine Reihe von möglichen Anwendungen geben. Wie im Detail unten beschrieben, müsste er sich erstens bei der selektiven Übertragung dieses „Killergens" auf Tumorzellen im Gehirn als nützlich erweisen. Ein klarer Vorteil des HSV-1-TK-Gens im Vergleich zu anderen toxischen Genprodukten ist, dass ein zweiter Treffer, die Behandlung mit einem Nuldeosidanalogon, erforderlich ist, um den Zelltod herbeizuführen. Ferner ist eine zelluläre DNA-Replikation für die Toxizität erforderlich, daher können nur sich teilende Zellen abgetötet werden. Zweitens müsste es möglich sein, dieses Retrovirusvektor zum Einbau des HSV-1-TK-Gens in genetisch modifizierte Zellen, die für die Implantation verwendet werden, zu nutzen (z.B. Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988)). Das würde die Elimination der implantierten Zellen an einem definierten Punkt im Experiment ermöglichen, um die Wirkungen dieser Zellen auf das umgebende Gewebe einzuschätzen. Drittens müsste sich dieser Vektor als nützlich für die Infektion von embryonischen Vorläuferzellen erweisen, um die Art und Funktion ihrer Nachkommenschaft in späteren Stadien der Entwicklung und über das ganze Leben hinweg zu beurteilen. Dieser Vektor bietet dann ein Werkzeug zur wirksamen Infektion sich teilender Zellen in Kultur und in vivo und zum Einfügen eines Gens, das zu ihrem Abtöten oder zum Abtöten ihrer Nachkommenschaft zu einer festgelegten Zeit durch Anwendung eines Wirkstoffs verwendet werden kann, in ihr Genom.
Primäre Hirntumoren befallen etwa 12.000 Patienten neu in den Vereinigten Statten pro Jahr. 25 % der primären Hirntumoren sind Glioblastome, die nur zeitweilig auf alle Formen gegenwärtig verfügbarer Therapien ansprechen oder vollkommen resistent gegen sie sind. Glioblastome sind fast immer tödlich; Heilungen erscheinen nur in beiläufigen Berichten mit lediglich 3-5 % der Patienten, die länger als 5 Jahre nach der Diagnose leben. Jedoch sind Metastasen vom Glioblastom äußerst selten. Glioblastome töten durch lokales Wachstum und in vielen Fällen treten Tumoren nach Behandlung mit Strahlen oder Chemotherapie wieder innerhalb eines Umkreises von 2 cm vom Ursprungsort wieder auf. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass einige Tumoren vielleicht mit einem lokalen zielgerichteten Herangehen behandelt werden können. Es wurden verschiedene Versuche mit lokalen Therapien unternommen, dazu gehören die photodynamische Therapie (Salcman et al., J. Neuro. Virol. 1:225-236 (1983)), lokale Hyperthermie (Cheng et al., Surg. Neurol. 28:423-435 (1986)), Herdbestrahlung mit interstitiellen Radioisotop-Implantaten (Ortin et al., J. Neurosurg. 67:864-873 (1987)). Bis heute hatten alle diese Verfahren nur einen begrenzten Erfolg und hatten nur eine geringfügige Auswirkung auf die Behandlung von Glioblastomen.
Wegen dieses begrenzten Erfolgs wurden Retrovirusvektoren als neuer Weg der potenziellen Therapie erkundet. Retroviren nutzen die Tatsache aus, dass ein malignes Gliom eine sich teilende Zellpopulation innerhalb der Population der sich nicht teilenden Zellen darstellt, die das adulte Gehirn bilden. Daher können Retroviren einen Modus der Selektivität für die Hirntumorzellen durch die Einbringung eines toxischen Gens in sie bieten. Drei toxische Genprodukte sind für Ablationsuntersuchungen in transgenen Mäusen verwendet worden (Bernstein and Breitman, Mol. Biol. Med. 6:523-530 (1989)). Zwei davon, Ricin und Diphtherietoxin, könnten allerdings nach der Freisetzung in das Nervensystem Toxizität für Gehirn, Blutgefäße, Knochenmark oder andere Gewebe verursachen, und Zellen, die sie enthalten, könnten nicht gestoppt werden. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, eine Strategie der Tumorzellvernichtung zu erkunden, die das HSV-1-TK-Gen verwendet, das selbst nicht schädlich ist, welches aber Zellen für von außen verabreichte Wirkstoffe, wie z.B. Ganciclovir, sensibilisiert. Auf diesem Wege kann die Zellzerstörung gesteuert werden.
Es wurde gezeigt, das das HSV-1-TK-Gen in Ratten-C6-Gliomzellen eingefügt werden kann und dass diese Zellen dadurch empfindlich für Ganciclovir gemacht werden. Um zu demonstrieren, dass C6-Gliomzellen, die das HSV-1-TK-Gen exprimieren, in vivo abgetötet werden können, wurde der subrenale Kapseltest in Ratten verwendet, weil er die direkte Messung des Tumorvolumens ermöglicht, den Nachweis kleiner Volumenänderungen (<1 mm) gestattet, und weil Tumorvascularisierung beobachtbar ist, und weil er die Eingabe parenteral verabreichter pharmazeutischer Mittel erlaubt. Dieses Modell überwindet das Problem, dass man die Größe eines intrazerebralen Tumorimplantants nicht direkt beobachten kann, und die Schwierigkeiten mit der Zufuhr von Ganciclovir durch die intakte Blut-Hirn-Schranke. Bei diesem subrenalen Kapselmodell wird demonstriert, dass intraperitoneal verabreichtes Ganciclovir wachsende C6-Gliomzellen abtötet.
Vergleichsbeispiel 2
Glioblastome stellen etwa 30 % der primären Hirntumoren bei Erwachsenen dar (Schoenberg, B.S., in Oncology of the Nervous System, Walker, M.D., Hrsg., Martinus Nijhoff, Boston, MA (1983)). Sie sind invasiv, malign und gegen konventionelle Behandlungsmodalitäten resistent und werden daher als praktisch unheilbar angesehen (DeVita et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Bd. 2, 3. Ausg., Lippincott Press, Philadelphia (1989); Shapiro et al., J. Neurosurg. 71:1-9 (1989); Onomaya et al., Am J. Roentgenol. 126:481-492 (1976); Salazar et al., Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 5:1733-1740 (1979); Walker et al., N. Engl. J. Med. 303:1323-1329 (1980)). Die rezidivierende Krankheit tritt oft innerhalb von 2 cm vom Ursprungsort wieder auf (Hochberg et al., Neurol. 30:907-911 (1980)). Mit einem Mittelwert des Überlebens von weniger als 1 Jahr und mit weniger als 5 % der Patienten, die nach 5 Jahren nach der Diagnose trotz zahlreicher multimodaler Ansätze noch leben (Mahaley et al., J. Neurosurg. 71:826-836 (1989); Schoenberg, B.S., in Oncology of the Nervous System, Walker, M.D., Hrsg., Boston, MA: Marinus Nijhoff (1983); Kim et al., J. Neurosurg. (im Druck); Daumas-Duport et al., Cancer 62:2152-2165 (1988)), kann die Notwendigkeit neuartiger Behandlungsstrategien nicht überbetont werden.
Eine Strategie ist die Verwendung von viralen Vektoren zur Zuführung fremder Gene, um Gliomzellen zu modulieren oder zu zerstören. Retroviren liefern ein potenzielles Mittel für die selektive Infizierung von Tumorzellen im adulten Gehirn, weil sie sich nur in das Genom von sich teilenden Zellen integrieren können und die meisten adulten Hirnzellen sich in einem stillen, unempfänglichen Stadium des Zellwachstums befinden (für einen Überblick über Retroviren siehe Varmus, H., Science 240:1427-1435 (1988). Diese RNA-Viren sind umfangreich als Vektoren für die Zufuhr von Genen zu sich teilenden Zellen in Kultur und in Embryos verwendet worden (für einen Überblick siehe Cepko, C., in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ (1989); Gilboa et al., BioTechniques 4:504-512 (1986)). Fremde Gene und Promotor-Elemente können in Plasmid-DNA-Äquivalente des retroviralen Genoms eingefügt werden, die das Verpackungssignal, psi, beibehalten. Diese Plasmide werden dann in Verpackungszelllinien transfiziert, die Wildtyp-Retrovirussequenzen tragen, welchen das für die Verpackung ihrer eigenen RNA in Virionteilchen benötigte psi-Element fehlt (Coe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353 (1984); Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986); Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)). Diese Verpackungslinie kann die psi-tragende RNA, die in den Retrovirussequenzen mit dem fremden Gen codiert ist, in Virionteilchen einfügen. Diese Linien entlassen dann in das Medium nur replikationsdefekte Viruspartikel, die fremde Gensequenzen enthalten, und keine Viruspartikel mit Replikationskomponente. Diese replikationsdefekten Viruspartikel können andere sich teilende Zellen wirksam infizieren und fremde Gene in ihr Genom einfügen.
Ein Reihe von retroviralen Vektoren sind für neurowissenschaftliche Anwendungen entwickelt worden, dazu gehören einige, die Gene für histochemische Markierungen tragen, lacZ (Price et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987)), Nervenwachstumsfaktor (Wolf et al., Mol. Biol. Med. 5:43-59 (1988); Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988)), Tyrosinhydroxylase (Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989); Horellou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7233-7237 (1989)) und andere Proteine (Fredricksen et al., Neuron 1:439-448 (1988); Cepko, C., in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ (1989); Cepko, C., Arm. Rev. Neurosci. 12:47-65 (1989)). Die direkte Injektion von lacZ-tragenden Retroviren (z.B. BAG) in embryonale Gewebe in vivo kann zur Genzufuhr zu Neuroblasten und ihren differenzierten Tochterzellen führen, wie beobachtet wurde, zum Beispiel in Epithel, Retina und zerebralem Cortex (Gray, G.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7356-7360 (1988); Turner et al., Nature (Lond.) 328:131-136 (1987); Walsh et al., Science 241:1342-1345 (1988); Luskin et al., Neuron 1:635-647 (1988)). Nach Injektionen dieser Art von Vektor in adulte Nervenzellen wurde über keine Markierung von Zellen berichtet, wie aus dem niedrigen mitotischen Index dieser Zellen und der relativ kurzen Halbwertszeit von Retrovirusteilchen zu erwarten war (4 h in Kultur; Cepko, C. in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ (1989)). Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass es möglich ist, ihre Retrovirusvektoren für die indirekte „Genzufuhr" zu adulten Nagetiergehirnen durch Infektion sich teilender Zellen in Kultur zu verwenden und dann diese genetisch modifizierten Zellen in das Gehirn zu verpfropfen (Gage et al., Neuroscience 23:795-807 (1987)). Dieses Verfahren ist mit dem lacZ-Vektor dazu verwendet worden, das Schicksal der gepfropften Ratten-C6-Gliomzellen und Fibroblasten zu verfolgen (Shimohama et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)). Rattenfibroblastenlinien, die mit NGF- und TH-tragenden Vektoren infiziert wurden, Ratten-Phäochromozytomzellen, die mit dem NGF-Vektor infiziert wurden, und eine Maus-Hypophysenlinie, die mit einem TII-Vektor infiziert wurde, sind zur Zufuhr von biologisch aktivem NGF und/oder L-Dopa und Dopamin zu Regionen von adulten Rattenhirnen verwendet worden (Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988); Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989); Horellou et al., Eur. J. Neurosci. 2:116-119 (1990)). Verschiedene neue multipotente Nervenzelllinien sind nach Infektion mit Retrovirusvektoren, die myc- und SV40T-Onkogene tragen, entwickelt worden (Snyder et al., Neurosci. Abst. 9:9 (1989); Lendahl et al., Cell 60:585-595 (1990); Ryder et al., J. Neurobiol. 21:356-375 (1990)).
Es wurde ein Nagetier-Gliommodell dazu verwendet, die mögliche Verwendung von Retrovirusvektoren zur Zufuhr von fremden Genen zu Tumorzellen in vivo zu erkunden. Der BAG-Retrovirusvektor wurde dazu benutzt, das Reportergen lacZ in Rattengliomzellen, die in das adulte Rattenhirn verpflanzt wurden, zu übertragen. Die Erfinder haben die Infektion von endogenen Hirnzellen und C6-Gliomzellen nach direkter Injektion des BAG-Retrovirus oder Implantation der psi2-BAG-Verpackungslinie, die diesen Virusvektor freisetzt, beurteilt. Kultivierte Zellen und Gewebsschnitte wurden durch histochemische Färbung auf bakterielle β-Galactosidase als Maß für eine erfolgreiche Genzufuhr und durch Immunfärbung auf gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 als Marker für Gliomzellen und Astrozyten (Bignami et al., Brain Res. 43:429-435 (1972)) auf Fibronectin als Marker für die von Fibroblasten abgeleiteten Verpackungslinie beurteilt.
Material und Methoden
Zellkultur, Retrovirusinfektion und β-Galactosidasefärbung: Die ökotrope Retrovirus-Produzentenlinie, psi 2-BAG 2-14, die über M. Rosenberg (UCSD) von C. Cepko (Harvard Medical School) erhalten wurde (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12:34-45 (1990)), wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, 10 % fötalem Kälberserum mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (D10 P/S) und 500 μg/ml Neomycinanalogon, G418, gezüchtet. Alle Zellkulturmaterialien wurden von GIBCO bezogen. Das Virus wurde durch Ersetzen des darüber liegenden Mediums von nahezu zusammenfließenden Kulturen durch ein verringertes Volumen von frischem Medium ohne G418 geerntet. Die aufbereiteten Medien, die virale Teilchen enthielten, wurden 24-48 h später entfernt, durch Celluloseacetat-Membranen (Porengröße 0,45 μm) gefiltert und bei -70 °C gelagert. Das Virus wurde als koloniebildende Einheiten (CFU) auf 3T3-Zellen in Gegenwart von G418 titriert. Die viralen Titer betrugen 1-3 × 10⁴ CFU/ml. In einigen Fällen wurde der Virusvorrat durch Zentrifugieren auf 1-3 × 10⁵ CFU/ml konzentriert (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987)).
Die Rattengliomzelllinie, C6 (Benda et al., Science 161:370-371 (1968)), wurde auf D10 P/S gezüchtet. Eine C6-BAG-Linie wurde durch Infizierung von C6-Gliomzellen mit dem BAG-Vektor und Isolieren einzelner Zellsubklone und G418-Auswahl hergestellt. Die Zellen wurden durch histochemische Analyse auf β-Galactosidaseaktivität getestet (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987)). Ein Subklon (C6-BAG B2-10), in dem nach mindestens 6 Durchläufen >99 % der Zellen β-Galactosidase-positiv waren, wurden in nachfolgenden Experimenten bei Durchlauf 2 oder 3 verwendet.
Zellpfropfung und Retrovirusinokulation in adulte Rattenhirne: Adulte Fischer-Ratten, die zwischen 151 und 175 g wogen, wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Equithesin (Short, C., Principles and Practice of Veterinary Medicine, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)), anästhesiert. Zwei von fünf Tieren wurden für jedes experimentelle Paradigma verwendet, und alle Experimente wurden mindestens zwei Mal durchgeführt. Die stereotaktischen Koordinaten für die intrazerebrale Injektion wurden aus einem stereotaktischen Atlas der adulten Ratte entnommen (Paxinos et al., in Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 2. Ausg., Academic Press, New York (1986)). Zellen und Virus wurden mit 8 μg/ml Polybrene oder Kontrollmedium mit einer 10 μl-Hamilton-Spritze mit einer abgeschrägten 25 gauge Nadel, injiziert. Injektionen (5 μl) wurden über ein Intervall von 5 min ausgeführt, und die Nadel wurde an Ort und Stelle weitere 2 min gelassen, bevor sie entfernt wurde. Der chirurgische Eingriff wurde von den meisten Tieren gut vertragen; nur ein paar Tiere starben während der Anästhesie.
Für Pfropfexperimente wurden zusammenlaufende Kulturen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ gespült und in 0,05 % Trypsin inkubiert. Zellen wurden in D10 verteilt und durch Zentrifugieren über 5 Minuten bei 1200 g pelletiert. Zellpellets wurden in PBS resuspendiert und durch Zentrifugieren eingesammelt. Die endgültigen Zellsuspensionen wurden mit einer Dichte von 10⁵ Zellen/μl in vollständigem PBS (PBS, das 1 μg/ml jeweils von MgCl₂ und CaCl₂, 0,1 % Glucose und 5 % Rattenserum (GIBCO) enthält) und bis zur Implantation bei 4 °C gehalten.
Gewebspräparation: Vor der Perfusion wurden Ratten mit Equithesin (Short, C., Principles and Practice of Veterinary Medicine, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)), anästhesiert. Die Perfusion erfolgte über die aufsteigende Aorta mit 50 ml kalter PBS, die 10.000 Einheiten/ml Heparin-Natrium enthielt, gefolgt von 250 ml kalter 3 %iger Paraformaldehydlösung in PBS. Nach der Nachfixierung über Nacht bei 4 °C wurden die Gehirne in aufsteigenden Prozentsätzen (15, 20, 30) von Saccharose bei 4 °C galten, bis sie sanken. Gehirne wurden auf Trockeneis gefroren und bis zum Schneiden bei -80 °C aufbewahrt. Schnitte wurden entweder mit 40 μm auf einem Gefriermikrotom geschnitten und bei 4 °C in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, mit 0,1 % Natriumazid in 33 % Polyethylenglycol bis zum Färben aufbewahrt; oder mit 10-15 μm auf einem Kryostaten geschnitten und direkt auf gelatinebeschichteten (Fisher; 100 Bloom) Glasträgern fixiert und mit Trocknungsmittel bis zum Färben bei 4 °C aufbewahrt.
Histologie: Für die β-Galactosidasehistochemie von Geweben (und Zellen) wurde eine Modifikation der Methode von Turner und Cepko (Turner et al., Nature (London) 328:131-136 (1987)) verwendet. Kurz gesagt, wurde 5-Brom-4-chor-3-indolyl-B-D-galactosid (X-Gal, Boeringer Mannheim) als 4 %ige Vorratslösung in DMSO hergestellt. Frei schwimmende oder fixierte Schnitte (oder Zellen in Gewebekulturschalen) wurden bei 37 °C in einer Lösung von PBS inkubiert, die 2 μM MgCl₂, 35 μM K₃Fe(CN)₆, 35 μM K₄Fe(CN)₆, 0,01 % Natriumdeoxycholat und 0,02 % NP₄O, pH 7,3, enthielt; 0,1 % X-Gal wurde unmittelbar vor der Inkubation hinzugefügt. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden kultivierte Zellen direkt betrachtet, und Schnitte wurden mit PBS gespült, auf beschichtete Träger aufgebracht und dann mit Hämatoxylin und Eosin oder Neutralrot gegengefärbt. Dann wurden sie in Wasser gespült, in steigenden Konzentrationen von Alkohol geklärt und vor dem Abdecken mit wässrigen Abdeckungsmedien, Crystal Mount (Biomedia), in Wasser gebracht oder vor dem Abdecken mit Permount (Fisher) in Xylol, gelegt.
Einige Schnitte wurden auch immunozytochemisch gefärbt, um GFAP, S100 oder Fibronectin zu indentifizieren. Die Schnitte wurden in PBS gespült, 30 Minuten lang mit blockierendem Serum und dann über Nacht bei Raumtemperatur mit den folgenden Antikörpern inkubiert: monoklonale Mausantikörper gegen menschliches GFAP (Boehringer Mannheim), verdünnt 1:3, polyklonale Kaninchen-Antikörper, gegen bovines S100 (Dako), verdünnt 1:750; oder monoklonale Maus-Antikörper gegen menschliches Fibronectin (Cappell), verdünnt 1:80; von denen alle mit ihren jeweiligen Rattenantigenen kreuzreagieren. Antikörper wurden in 10 μM Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,9 % NaCl, 0,25 % TRITON-X-100 und 3 % blockierendes Serum enthält, verdünnt. Nach gründlichem Spülen wurden die Schnitte 2 Stunden lang entweder mit biotinyliertem Pferde-Antimaus-IgG, biotinyliertem Ziegen-Antikaninchen-IgG oder Kaninchen-Antiziegen-IgG (Vectastain), verdünnt 1:200 in Puffer inkubiert, gefolgt von mehreren Spülungen in PBS. Die Schnitte wurden dann 30 Minuten lang mit einem Komplex von Avidin und biotinylierter Meerrettichperoxidase (Vectastain, ABC Elitekit), verdünnt 1:5:100 in Puffer, inkubiert. Die Peroxidase wurde durch Reaktion mit 0,05 % 3,3-Diaminobenzidintetryhydrochlorid, 0,04 % NiCl₂ und 0,01 % H₂O₂ in 50 μM Tris-HCl, pH 7,3, 5-10 min. bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. In einigen Fällen wurden die Schnitte zu Anfang histochemisch für β-Galactosidaseaktivität gefärbt und dann für GFAB immungefärbt. In anderen Fällen wurden Serienauswahlen alternativ für β-Galactosidase und GFAP oder S100 gefärbt.
Ergebnisse
Die histochemische Färbung von psi 2-BAG-Zellen in Kultur demonstrierte die nahezu 100 %ige positive Färbung für β-Galactosidase und keine Färbung für GFAP, wogegen die meisten C6-Zellen bei GFAP-Antigen positiv gefärbt wurden, und alle bei den verwendeten neutralen Bedingungen bei β-Galactosidasefärbung negativ waren. Die Fähigkeit der psi 2-BAG-Zellen, das BAG-Virus freizusetzen, das C6-Zellen infizieren könnte, wurde durch Platzieren von Abdeckungen, die jede der zwei Zelltypen an bekannten Orten enthielten, innerhalb derselben Kulturschale demonstriert. In Gegenwart von psi 2-BAG-Zellen wurde ein ständig steigender Prozentsatz von Zellen auf der Abdeckung, die C6 Zellen trugen, positiv auf β-Galactosidase während des Zeitabschnitts von 96 Stunden gefärbt. Im wesentlichen waren auch alle Zellen auf der Gliomabdeckung GFAP-positiv. Das steht im Einklang mit der erfolgreichen Integration des BAG-Virus, das von psi 2-BAG-Zellen freigesetzt wurde, in das Gliomzellgenom.
Die Wirksamkeit des Gentransfers auf endogene Hirnzellen in vivo wurde durch direkte Inokulation von 5 μl BAG-Retrovirusvektor (90 bis 900 CFU) in den adulten Rattenhippocampus oder Nucleaus caudatus getestet. Kontrolltiere wurden mit vollständiger PBS auf ähnliche Weise inokuliert. Tiere wurden 7 Tage nach den Injektionen eingeschläfert. Bei den Tieren, die direkte Injektionen des Virus erhielten, sowie bei den Kontrolltieren wurden keine β-Galactosidase-positive Zellen innerhalb des Parenchyms gesehen. Einige Schnitte aus beiden Gruppen zeigten eine schwache positive Färbung auf β-Galactosidase innerhalb des Plexus chorioideus, wie vorher bemerkt (Shimohama et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)). Bei diesen Kontrollschnitten war die Färbung qualitativ anders als bei Tieren, bei denen positiv färbende Zellen innerhalb der Tumormasse vorhanden sind (siehe unten).
Die Wirksamkeit der direkten Inokulation von Tumorzellen im Gehirn wurde in unterschiedlichen Intervallen zwischen dem Zeitpunkt der C6-Zellimplantatitionen und der Injektion des Virus getestet, unter der Annahme, dass die Gliomzellen eine Wachstumsverzögerung nach der Inokulation erfahren könnten und daher anfänglich sich nicht in einem Stadium der Zellteilung befinden, die für die virale Integration geeignet ist. Der Ort der Implantation und der Infektion war der rechte Stirnlappen. Für gleichzeitige Injektionen von Gliomzellen und BAG-Virus wurden C6-Zellen (5 × 10⁵) in 5 μl Virusvorrat (90-900 CFU) suspendiert. Andere Tiere erhielten verzögerte Injektionen von Virusvorrat in die vorherige Stelle des C6-Zellimplantats. 5 μl aliquote Teile vom Virusvorrat wurden mittels derselben stereotaktischen Koordinaten injiziert, mit denen die C6-Zellen 3 und 5 Tage vorher implantiert worden waren. Die Kontrolltiere erhielten Implantate von C6- oder C6-BAG-Zellen ohne Virus. Alle Tiere wurden 7 bis 10 Tage nach der letzten Virusinjektion eingeschläfert. Bei gleichzeitigen Injektionen von C6-Zellen und BAG-Virus färbten sich nur ein paar Tumorzellen (weniger als 0,1 %) auf β-Galactosidaseaktivität. In einigen Fällen wurden auch gefärbte Endothelzellen in Gefäßen innerhalb der Tumormasse und um diese herum festgestellt. Bei Tieren, bei denen eine Verzögerung zwischen der Tumorimplantation und der Virusinjektion bestand, wurden nur ein paar positive Zellen festgestellt. Es gab keine bemerkenswerte Differenz zwischen der Zahl der positiv färbenden Zellen in Tieren, die eine Verzögerung vor der Virusinjektion erfahren hatten, im Vergleich zu denjenigen, gleichzeitige Injektionen von C6 und BAG-Virus erhalten hatten. Injektionen von C6- und C6BAG-Zellen ließen Tumoren mit ähnlicher Größe entstehen. Bei den C6-Zellinjektionen ohne Virus wurden keine blauen Zellen festgestellt; bei den C6BAG-Injektionen waren alle Tumorzellen positiv für β-Galactosidase, wie vorher bemerkt (Shimohama et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)).
Zur Untersuchung des Schicksals von psi 2-BAG-Verpackungszellimplantaten erhielten Tiere psi 2-BAG-Zellen (5 × 10⁵ Zellen) in den rechten Stirnlappen injiziert. Tiere wurden zu verschiedenen Zeiten nach der Implantation eingeschläfert. Nach einem Tag wurde eine kompakte Masse von β-Galactosidase-positiven Zellen am Ort der Injektion rechts vorn festgestellt. Auf der linken Seite wurden am Tag 1 keine positiv gefärbten Zellen festgestellt; auf keiner Seite wurde bei Schnitten, die von eingeschläferten Tieren an den Tagen 5, 9, 14 und 21 nach der Implantation angefertigt wurden, positiv gefärbte Zellen festgestellt. Es gab keine Anzeichen von Tumorbildung oder anderen degenerativen Veränderungen im Gehirn über diesen Zeitraum hinweg.
Dann wurde die Wirksamkeit des in situ-Gentransfers des lacZ-Gens in C6 durch Mitverpflanzung der Verpackungslinie, psi 2-BAG, getestet. Für die gleichzeitige Mitverpflanzung enthielt die Zellsuspension eine Mischung von Zellen in einem Verhältnis von einer C6-Zelle zu fünf psi 2-BAG-Zellen. Der Ort der Implantation war wieder der rechte Stirnlappen. Für verzögerte Injektionen erhielten die Tiere Implantate von C6-Zellen (2 × 10⁵ Zellen) an Tag 1, gefolgt von Injektionen von 5 μl psi 2-BAG-Zellen (5 × 10⁵ Zellen) an Tag 3 oder 7. In allen Fällen wurden die Tiere sieben Tage nach der Implantation der psi 2-BAG-Zellen eingeschläfert. Kontrollen von psi 2-BAG und C6 allein wurden anderen Tieren parallel dazu injiziert. In histochemisch gefärbten Schnitten von Tieren, die gleichzeitige Verpflanzungen von C6- und psi 2-BAG-Zellen erhielten, wurden sowohl blaue als auch nicht blaue Zellen innerhalb der Tumormasse festgestellt. Einige der β-Galactosidase-positiven Zellen färbten sich auch auf GFAB oder S100, was anzeigte, dass sie C6-Gliomzellen waren. Es gab auch viele GFAB- oder S100-positive Zellen innerhalb der Tumormasse, die nicht positiv für β-Galactosidase waren. Einige der anderen β-Galactosidase-positiven Zellen könnten C6-Zellen ohne oder nur mit geringer Expression von GFAB oder S100 sein. Tatsächlich war bei C6-Zellen, die ins Gehirn verpflanzt wurden, nur etwa die Hälfte der Zellen in der resultierenden Tumormasse S100-positiv, und noch weniger waren GFAB-positiv. Einige der β-Galactosidasepositiven Zellen könnten auch psi 2-BAG-Zellen sein, die innerhalb der Tumormasse im Vergleich zum Hirnparenchym länger überlebt haben; jedoch ergab die Immunfärbung für Fibronectin nach 7 Tagen keine psi 2-BAG-Zellen in gemeinsamen Verpflanzungen. Die Untersuchung der Serienschnitte dieser Tumoren zeigte viele Schnitte ohne alle β-Galactosidasepositive Zellen, und unsere beste Schätzung ist, dass etwa 1 % der Zellen im Tumor das lacZ-Gen in Tieren exprimierte, die die gleichzeitige Injektion von psi 2-BAG-Zellen und C6-Zellen erhalten hatten. Im Gegensatz dazu enthielten Schnitte, die von Tieren gewonnen wurden, welche verzögerte Injektionen der Verpackungslinie in die Tumormasse erhalten hatten, viele Zellen, die positiv für β-Galactosidase in allen Schnitten durch den ganzen Tumor hindurch gefärbt waren, wobei bis zu 10 % der Zellen positiv waren und die meisten positiven Zellen an der Peripherie des Tumors lagen. Die Mitfärbung für das gliaspezifische Antigen S100 und β-Galactosidase zeigte, dass viele Zellen innerhalb des Tumors von Glia abgeleitet waren und dass einige der Zellen auch positiv für die β-Galactosidaseaktivität waren. Es erscheint daher, dass Tumorzellen effizienter infiziert worden sind, wenn die Verpackungslinie nach der Bildung der Tumorzellen verpflanzt wurde, als wenn der Tumor und die Verpackungslinie gleichzeitig injiziert wurden. Es scheint keine signifikante Differenz zwischen Tieren zu geben, bei denen die Verzögerung zwischen den Injektionen drei Tage statt sieben Tagen betrug.
Diskussion
Bei dieser Untersuchung haben wir die Wirksamkeit eines replikationsdefekten retroviralen Vektors bei der Zufuhr des Reportergens, lacZ, zu Rattengliomzellen in Kultur und Rattenhirn demonstriert. In Kultur setzte der BAG-Retrovirusvektor aus psi 2-BAG-Zellen erfolgreich infizierte C6-Zellen in derselben Schale frei, wie durch Färbung für β-Galactosidaseaktivität demonstriert. Die Morphologie und Immunreaktivität auf GFAB bestätigte die Identität der β-Galactosidase-positiven Zellen als Gliomzellen. Die Wirksamkeit des Transfers des lacZ-Gens in endogene Hirnzellen oder in C6-Zellen in vivo wurde dann mit zwei Verfahren verglichen: direkte Injektion des BAG-Virus oder Verpflanzung der Verpackungslinie, die das Virus freisetzt. Die höchste Wirksamkeit in vivo wurde durch Verpflanzung der Retrovirus-Verpackungslinie in ein bestehendes Bett von C6-Zellen erhalten.
Anfängliche Versuche, das Reportergen durch direkte Injektion des Virus in das Parenchym eines normalen adulten Rattenhirns einzubringen, erzeugte im wesentlichen keine β-Galactosidase-positiven Zellen. Bei diesen Tieren sowie bei den Kontrollen, die mit dem vollständigen PBS inokuliert wurden, wurde eine schwache positive Färbung im Plexus chorioideus gesehen, aber nicht im Parenchym. Über diese endogene positive Färbung von lysosomaler Galactosidase wurde vorher berichtet (Shimohama et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)), sie wurde maskiert, wenn Schnitte mit Neutralrot gegengefärbt wurden. Die nicht erfolgreiche direkte Einbringung des Gens durch den viralen Vektor war nicht überraschend, da ja die Mehrzahl der Zellen in adulten Ratten, selbst in jungen postnatalen Tieren, post-mitotisch sind und die Zellteilung für die retrovirale Integration notwendig ist. Der Ort der Inokulation, der Hippocampus, wurde gewählt, um die Wahrscheinlichkeit der erfolgreichen Integration zu erhöhen, da Zellen in dieser Region die letzten sind, die nach der Geburt aufhören sich zu teilen (Das et al., Brain Research 22:122-127 (1970)). Bei Tieren, die mit dem BAG-Virus entweder gleichzeitig mit Gliomzellen oder nach einer Verzögerung im Anschluss an die Gliomimplantation inokuliert worden waren, wurden nur ein paar isolierte Tumorzellen erfolgreich infiziert. Dies widerspiegelt wahrscheinlich die relativ kurze Halbwertszeit des Retrovirus in vivo und den Teilungszustand der Gliomzellen. Von den wenigen β-Galactosidasepositiven Zellen wurden die meisten an den Rändern des Tumors gefunden, wo man die höchste mitotische Aktivität annimmt. Es wurden gelegentlich gefärbte Endothelzellen beobachtet, was man erwarten würde, da Endothelzellen sich weiterhin innerhalb der Blutgefäße des Gehirns teilen, besonders innerhalb in einem vaskularisierten Tumorbett.
Sowohl der virale Titer als auch das Volumen des Inokulums stellen signifikante Beschränkungen für das Erreichen eines höheren Grades der erfolgreichen Integration durch direkte Virusinjektion dar. Versuche, den viralen Titer durch Zentrifugieren zu erhöhen, erhöhten den Titer nur um das 10- bis 100fache. Bei der Inokulation eines glialen Tumors, der mit etwa 10⁵ Zellen begann, mit 5 μl eines Virusvorrats von 10⁴-10⁶ CFU/ml ist das Verhältnis von Virus zu Zelle viel kleiner als 1:1 (Infektionsmultiplizität (MOI) ≤ 0,01). Bei unseren Möglichkeiten beträgt die Effizienz der Infektion von sich schnell teilenden C6-Zellen in Kultur mit dem BAG-Retrovirusvektor bei einer MOI von 3 etwa 30 %. Daher ist es nicht überraschend, dass die direkte Inokulation des Tumors in vivo ineffizient war.
Die Implantation der Verpackungslinie scheint einige der Beschränkungen der direkten Inokulation durch die Freisetzung des Virus innerhalb des Tumors über einen längeren Zeitraum zu überwinden. Dieses Beispiel demonstriert, dass die gemeinsame Verpflanzung der Verpackungslinie, psi 2-BAG- und Gliomzellen, dazu dient, das Reportergen, lacZ, wirksamer als durch die direkte virale Inokulation diesen Tumorzellen zuzuführen. Die Wirksamkeit war größer bei Tieren, denen Gliomzellen 3 oder 7 Tage vor der Implantation von psi 2-BAG-Zellen implantiert worden waren, als bei der gleichzeitigen Verpflanzung dieser beiden Zelltypen. Die histochemischen Analysen von Schnitten, die von Gehirnen der Tiere angefertigt wurden, welche verzögerte Injektionen erhalten hatten, zeigten, dass große Bereiche des Tumors erfolgreich infiziert worden waren. Die Gehirne wurden eine Woche nach der psi 2-BAG-Implantation untersucht, weil sie in einem getrennten Experiment nach der alleinigen Implantation von psi 2-BAG-Zellen fünf Tage später nicht festzustellen waren. Weiters zeigte die Immunfärbung von Co-Implantaten nach 7 Tagen keine Fibronectin-positive Zellen. Dies weist darauf hin, dass entweder das psi 2-BAG-Implantat wegen eines Unterschieds in Rattenstämmen immunologisch abgestoßen wurde oder dass das retrovirale codierte Gen, falls vorhanden, nicht mehr exprimiert wurde (Palmer et al., persönliche Mitteilung). Mittels Immunzytochemie haben wir ermittelt, dass einige der Zellen innerhalb des Tumors sich sowohl für β-Galactosidaseaktivität als auch GFAB- oder S100-Antigene färben, was die erfolgreiche Infektion der Gliomzellen durch das aus psi 2-BAG-Zellen freigesetzte BAG-Virus bestätigt. Jedoch gibt es GFAB- und S100-positive Zellen innerhalb des Tumors, die β-Galactosidase-negativ sind, was auf die unvollständige Infektion der Tumorzellen hinweist.
Man kann sich mehrere Mittel vorstellen, mit denen die Wirksamkeit der Infektion von Gliomzellen im Gehirn durch Mitverpflanzung der Retrovirus-Verpackungslinie erhöht wird. Ein Weg würde darin bestehen, eine Reihe von Injektionen der Verpackungslinie auszuführen, um die Zahl der Zellen erhöhen, die das Virus innerhalb des Tumorbetts über einen längeren Zeitraum freisetzen. Ein anderer Weg, um die Menge und Dauer der Retrovirusfreisetzung zu erhöhen, würde in der Entwicklung einer Verpackungslinie bestehen, die immunkompatibel zum Wirt wäre und daher nach der Implantation länger überleben würde. Die Freisetzung in einen größeren Bereich, einschließlich des Hirnparenchyms, das den Tumor umgibt, könnte auch durch die Verwendung einer aus Astrozyten abgeleiteten Verpackungslinie erreicht werden. Es wurde gezeigt, dass verpflanzte Astrozyten von Neugeborenen und Embryos in der Lage sind, bis zu 5 mm vom ursprünglichen Injektionsort zu wandern und vielleicht besser als Fibroblasten infiltrierende gliale Tumorzellen erreichen können (Jacque et al., Dev. Neurosci. 8:142-149 (1986); Zhou et al., J. Corp. Neurol. 292:320-330 (1990); Hatton et al., Soc. for Neurosci. Abstracts 15:1369 (1989)). Außerdem kann bei einer aus Glia abgeleiteten Verpackungslinie, die endogene Hirnzellen darstellt, ein verlängertes Überleben bestehen, und diese kann stärker auf in situ-Signale reagieren. Im Fall von spontanen Hirntumoren könnte man sich ein Schema vorstellen, bei dem die Tumormasse entfernt wird, wobei einige Tumorzellen zurückgelassen werden, und die Verpackungslinie direkt in die Läsion verpflanzt wird. Dies würde dazu dienen, die Zahl der Verpackungszellen, welche übertragen werden können, sowie das Verhältnis von Verpackungszellen zu Tumorzellen zu erhöhen und somit die Fähigkeit zu vergrößern, Tumorzellen zu infizieren.
Dieses Beispiel stellt ein Modellsystem dar, das dazu verwendet werden könnte, Gene mit therapeutischem Potenzial auf maligne gliale Tumoren des Zentralnervensystem (ZNS) zu übertragen, die derzeit weiterhin eine einzigartige Herausforderung in der Onkologie darstellen. Die vollständige chirurgische Extirpation ist unmöglich, da ja die Tumorzellen in das normale Hirn eindringen. Die Strahlentherapie ist durch die Sensibilität des normalen Gehirns für Strahlenschäden begrenzt. Die Chemotherapie wird durch die Anwesenheit einer Blut-Hirn-Schranke behindert, die die Wirkung von Mitteln verringert, welche diese Schranke nicht überwinden und so infiltrierende Tumorzellen nicht erreichen können. Retroviren stellen potenzielle therapeutische Mittel dar, die eine genetische Empfänglichkeit auf Tumorzellen übertragen können. Ein Beispiel wäre eine Retrovirus-Verpackungslinie, die Virusteilchen mit dem Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase(HSV-TK)-Gen freisetzen (Moolten et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:297-300 (1990)). Bei Integration in das Säugetierzell-Genom überträgt das HSV-TK-Gen Sensibilität für chemotherapeutische Agenzien, wie z.B. die Nuldeosidanaloga Acyclovir, Ganciclovir und FLAU. Zellkulturen haben gezeigt, dass C6-Gliomzellen und andere Zellen, die mit diesem Retrovirus infiziert sind, bei Konzentrationen von Ganciclovir abgetötet werden, die 100fach kleiner sind als diejenigen, die zum Abtöten von nicht infizierten Zellen benötigt werden (Moolten et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:297-300 (1990)).
Es ist auch möglich, C6-Gliomzellen durch nachfolgende Mitverpflanzung der HSV-TK-Virus-Verpackungslinie und Behandlung der Tiere mit einem Nuldeosidanalogon abzutöten. Weiterhin können Tumorgefäße ein zusätzliches Ziel für das vorgeschlagene System zur Abtötung unter Verwendung des HSV-TK-Gens sein.
Vergleichsbeispiel 3
Retrovirale Vektoren können zur Übertragung von Genen in das Genom von sich teilenden Zellen verwendet werden. Um die Wirksamkeit der Genzufuhr und den Abtötungseffekt von Ganciclovir zu erhöhen, wurde eine neue Verpackungslinie (C6VIK-WT) durch Infektion von C6VIK-Zellen mit einem ökotropen Wildtyp-Retrovirus (MoMLV) entwickelt. Siehe Mann et al., Cell 33:153-159 (1983); Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987) und Cepko, C., in Neuromethods, Bd. 16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ (1989), S. 177-219. Weil Tumorzellen tief in das Hirnparenchym wandern können, sollten sie in der Lage sein, den Vektor an Tumorzellen in einer Entfernung von der Tumormasse zu liefern. In Kultur wurden 50 % der C6VIK-WT-Zellen bei 0,024 μM GCV abgetötet, während 7,3 μM GCV benötigt wurden, um 50 % der C6VIK-Zellen abzutöten. Dies weist darauf hin, dass C6VIK-WT-Zellen auf Grund von Mehrfachintegration des HSV-TK-Gens oder auf Grund einer erhöhten Sensibilität von C6VIK-WT-Zellen für toxische GCV-Produkte eine höhere HSV-TK-Aktivität besitzen als C6VIK-Zellen. Als C6VIK und C6VIK-WT mit C6BAG-Zellen (die mit dem lacZ-Gen markiert und daher durch β-Galactosidase-Histochemie feststellbar sind) kultiviert wurden, wurden nach GCV-Behandlung wesentlich mehr C6BAG-Zellen abgetötet, wenn sie gemeinsam mit C6VIK-WT kultiviert wurden, als mit C6VIK-Zellen. Vermutlich erzeugen C6VIK-WT-Zellen sowohl Wildtyp-Retrovirus- als auch Retrovirusvektoren, die das HSV-TK-Gen enthalten (keiner davon wird von C6VIK-Zellen produziert), und der Tod der C6BAG-Zellen könnte durch die Retrovirusinfektion und/oder selbst erzeugte toxische GCV-Produkte vermitteltet werden. Die in vivo-GCV-Behandlung verursachte die Regression von Tumoren in den meisten nackten Mäusen, die subkutan mit C6VIK-WT-Zellen oder mit C6VIK-WT und C6BAG-Zellen gleichzeitig, aber nicht mit C6BAG-Zellen allein inokuliert wurden. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Wirksamkeit der retrovirusvermittelten Genzufuhr und die Sensibilität für toxische Mittel von Tumorzellen mit Hilfe von Helfervirus erhöht werden können, das Zellen, die mit Retrovirusvektoren infiziert sind, in Verpackungszelllinien umwandelt.
Die Verwendung von retroviralen Vektoren für die Genzufuhr braucht nicht auf Gensysteme beschränkt zu sein, die für die Tumorzerstörung ausgelegt sind. Die Zufuhr von Genen, die an der Tumorgenese oder Tumormodulation beteiligt sind, kann auch eine nützliche Strategie sein, die man erkunden kann. Der Verlust der Heterozygotie für DNA-Marker auf Chromosom 17, 10 oder, weniger häufig, auf Chromosom 22 in glialen Tumoren weist darauf hin, dass Tumorsuppressionsgene in diesen chromosomalen Region sitzen (Eigner et al., Hereditas 101:103-113 (1984); Eigner et al., Cancer Res. 88:405-411 (1988); James et al., Cancer Res. 48:5546-5551 (1988); E1-Azouzi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7186-7190 (1989)). Es wurde gezeigt, dass die Wiederherstellung der Retinoblastom-Genfunktion das Wachstum von Retinoblastom- und Osteosarkomzellen in Kultur hemmt (Huang et al., Science 242:1563-1566 (1988)).
Vergleichsbeispiel 4
Zur Übertragung von Chemosensibilität auf empfangende Tumorzellen bei therapeutisch nützlichen Spiegeln wurde eine C6VIK-Gliomlinie, die mit dem Wildtyp-Moloney-Mäuseleukämievirus (WT MoMLV) infiziert war, als vektorproduzierende oder „Spender"-Zelllinie verwendet. Gliomzellen, die neoplastisch sind, überleben länger in vivo und vermischen sich mit anderen Tumorzellen. Weiters vermittelt das Wildtyp-Helfervirus eine umfassendere Infektion von „Empfänger"-Tumorzellen mit dem VIK-Vektor, als dies mit einem defekten Helfer erreicht werden könnte. Die infizierte Zelllinie (C6VIKWT) setzte sowohl den replikationsdefekten VIK-Vektor als auch das Wildtypvirus frei. C6VIKWT-Zellen sensibilisieren Empfänger-C6BAG-Tumorzellen für die Ganciclovirbehandlung sowohl in Kultur als auch in vivo.
Methoden
Retrovirus: Der VIK-Retrovirusvektor enthält ein 2,8 kb BamHI-Fragment, das die volle Codiersequenz, und 2 kb der 3' nicht-codierenden Region (einschließlich der polyA-Additionsstelle) des HSV-1-TK-Gens umfasst, das in die BamHI-Stelle des Retrovirusplasmids, pLRNL, kloniert wurde (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, 1991). Der BAG-Retrovirusvektor trägt lacZ, das aus 5'-LTR transkribiert wurde, und das neo^R-Gen, das von einem SV40-Promotor-Verstärkerelement transkribiert wurde (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160, 1987). Es wurde die Produzenten-Zelllinie „sup", die den infektiösen Wildtyp MoMLV freisetzt, verwendet (Reik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1141-1145, 1985).
Zellkultur und Infektion: Die Ratten-C6-Gliomlinie wurde aus einem durch Nitrosomethylharnstoff induzierten Hirntumor abgeleitet (Benda et al., Science 161:370-371, 1969). Die C6BAG-Zelllinie wurde durch Infektion von C6-Gliomzellen (Benda et al., 1969) mit dem BAG-Retrovirus und Klonen unter Auswahl in G418 (siehe unten) erzeugt; die Zellen in diesem Klon exprimieren einheitlich E. coli-β-Galactosidase (Shimohama et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)).
Die C6BU1-Zelllinie wurde von C6-Rattengliomzellen durch Mutagenese und Auswahl nach Bromdeoxyuridin auf Verlust der endogenen TK-Aktivität abgeleitet (Amano et al., Exp. Cell. Res. 85:399-408, 1974). C6BU1-Zellen wurden entweder mit dem Retrovirusvektor, VIK (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, 1991), oder mit dem Retrovirusvektor, BAG ((Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160, 1987), der durch psi-2-Produzentenlinien erzeugt wurde, infiziert und wurden unter Auswahl in Gegenwart von HAT (10 mM Natrium-Hypoxanthin, 40 μM Aminopterin und 116 mM Thymidin, GIBCO) bzw. dem Neomycinanalogon, G418 (1 mg/ml, GIBCO) geklont, um die Linien C6BVIK und C6BBAG zu erhalten. C6BU1- und C6VIK-Zellen wurden mit dem Wildtyp-MoMLV-Virus (WT), das von der Produzentenlinie, „sup", freigesetzt wurde, infiziert, um C6BWT- bzw. C6VIKWT-Zellen herzustellen. Andere Zelllinien, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren NIH3T3 und TK-negative NIH3T3.
Alle Zelllinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium gezüchtet (320-1965, GIBCO), das 10 % fötales bovines Serum (GIBCO), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt. Alle Infektionen wurden in Gegenwart von Polybrene (Sigma), wie beschrieben (Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)) vorgenommen.
Der virale Vorrat wurde aus Kulturen gewonnen, die bis nahezu 80 % Zusammenfließen im Auswahlmedium gezüchtet wurden, dann 24 Stunden in Medien gehalten wurden, denen G418 oder HAT fehlte. Das Kulturmedium wurde entfernt, durch ein 0,45 μm-Filter (Nalgene) gefiltert und bei -70 °C gelagert (Virusvorrat).
Die viralen Titer der Produzenten-Zelllinien wurden durch Infektion der NIH3T3(TK-) oder NIH3T3-Zellen mit Virusvorrat und Bestimmung der Zahl der HAT-resistenten bzw. G418-resistenten Zellen pro Volumeneinheit des Vorrats gemessen. Es wurde gezeigt, dass dem Kulturmedium aus C6V1K-Zellen bei derselben Passage wie hier verwendet die Helfervirusaktivität fehlte (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, (1991)).
Ganciclovirsensibilitätstests in Kultur: Zur Messung der Sensibilität isolierter Zellen wurden Zellen in 24-Vertiefungen-Platten mit einer Dichte von 10⁴ Zellen pro Vertiefung gebracht. Am nächsten Tag wurde das Medium durch ein Ganciclovir (Cytovene, Burroughs Wellcome) in wechselnden Konzentrationen (0-1 μM) enthaltendes Medium in vierfacher Ausführung ersetzt. Vier Tage später wurden Zellen mittels Trypsin geerntet und mit einem Zellzähler (Coulter Electronics Ltd., Luton. Großbritannien) gezählt. Das Zellwachstum wird als Prozentsatz der Zellen im Vergleich zur Zahl der Zellen ohne Behandlung (100 %) ausgedrückt.
Zur Messung der Ganciclovirsensibilität der Koloniebildung wurden Zellen in doppelter Ausführung mit einer Dichte von 500 Zellen pro 25 cm² Kulturkolben ausplattiert. Sieben Tage später wurde Ganciclovir in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 300 μM) in vierfacher Ausführung hinzugefügt, und die Inkubation dauerte 9-12 Tage, mit einem Wechsel des Mediums alle 3-5 Tage. Die Zellen wurden dann mit 100 % Methanol fixiert und mit Giemsa gefärbt (Freshney, R.I., Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique, 2. Ausgabe, New York, Alan R. Liss, Inc., S. 170-171 (1987)), und Kolonien ≥ 2 mm im Durchmesser wurden gezählt.
Co-Kulturexperimente: Für verzögerte Co-Kulturexperimente wurden C6BAG- oder C6BBAG-Zellen (Empfänger) mit einer Zelldichte von 10³ Zellen pro 25 cm² Kulturkolben in doppelter Ausführung ausplattiert und sieben Tage lang kultiviert; zu diesem Zeitpunkt zeigte die Probenahme, dass ihre Zahlen sich auf 5 × 10⁴ Zellen pro Kolben erhöht hatten. Spender-C6VIK- oder C6VIKWT-Zellen wurden dann den Kulturen in einem Verhältnis von 1:2 (5 × 10⁴ Empfängerzellen: 10⁵ Spenderzellen) hinzugefügt. Kontrollkulturen bestanden aus C6BAG- oder C6BBAG-Zellen allein oder C6BAG- oder C6BBAG-Zellen, die gemeinsam mit „Spender"-C6BU1- oder C6BWT-Zellen, nach Verzögerung, wie oben angegeben auf die Platten ausplattiert wurden. Nach 10 Tagen wurde Ganciclovir in verschiedenen Konzentrationen (0-300 μM) hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 9-12 Tage mit dem Wirkstoff inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 0,5 % Glutaraldehyd fixiert und histochemisch für β-Galactosidaseaktivität gefärbt, wie beschrieben (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1141-1145 (1987)), und Kolonien wurden gezählt.
Für gleichzeitige Co-Kulturexperimente wurden 10³ Empfängerzellen, C6BAG und C6BBAG, wurden zusammen mit 10⁵ C6VIK- oder C6VIKWT-Spenderzellen in doppelter Ausführung auf Platten ausplattiert. Die Kontrollen waren C6BAG- oder C6BBAG-Zellen, die zusammen mit C6BU1-Zellen in einem ähnlichen Verhältnis (1:100) ausplattiert wurden. Nach sieben Tagen wurde Ganciclovir in verschiedenen Konzentrationen (0 bis 300 μM) hinzugefügt, und die Kultur wurde wie oben angegeben verarbeitet. Zur Beurteilung der Wirkungen des Verhältnisses der Spenderzellen zu den Empfängerzellen wurden simultane Co-Kulturexperimente auch mit Variation des Verhältnisses der Spenderzellen, C6VIKWT, zu den Empfängerzellen, C6BAG, im Bereich von 0,1 bis 100 durchgeführt.
Toxizitätstest: Zur Prüfung auf Erzeugung eines diffundierbaren Zytotoxins aus den Spenderzellen, die mit Wildtypvirus und/oder toxischen Metaboliten aus mit Ganciclovir behandelten Zellen infiziert sind, die das HSV-TK-Gen tragen, wurde das Medium aus den Co-Kulturen von C6BAG- und C6VIKWT-Zellen vor und während der Behandlung mit 300 μM Ganciclovir über 7 Tage geerntet. Kontrollmedium wurde von C6BAG Zellen geerntet. Die Medien wurden gefiltert (wie oben) und auf Zytotoxizität für native C6BU1-Zellen geprüft, die mit 10⁴ Zellen pro 25 cm² Kulturkolben in doppelter Ausführung ausplattiert wurden. Die Volumina der Medien reichten von 0,1 bis 1 ml in einem Gesamtvolumen von 4 ml pro Kolben. Nach sieben Tagen wurden die Zellen mit 100 % Methanol fixiert und Giemsa-gefärbt, und die Kolonien wurden gezählt.
Ganciclovirsensibilität von Tumoren in vivo: C6VIKWT-Zellen (5 × 10⁵ Zellen in 200 μl Medien) wurden subkutan in die Flanken von weiblichen nackten Mäusen (NCr/Sed, nu/nu; MGH-Brutkolonie) (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991)) injiziert. Es gab drei Behandlungsgruppen; 25 mg/kg Ganciclovir intraperitoneal zweimal pro Tag über 14 Tage, n = 5; 25 mg/kg Ganciclovir intraperitoneal einmal pro Tag über 14 Tage, n = 4; und 12,5 mg/kg Ganciclovir intraperitoneal zweimal pro Tag über 14 Tage, n = 4. Die Ganciclovirtherapie wurde begonnen, wenn die mit Lehren gemessene Tumorgröße 1 cm im Durchmesser erreichte, und zwar durch Verabreichung von intraperitonealer Injektionen von bis zu 25 mg/kg täglich über 14 Tage durchgeführt. Die Kontrollgruppe erhielt phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 310-4200AJ, GIBCO) intraperitoneal in ähnlichen Dosierungsschemata über 14 Tage. Die Tumorvolumina wurden zweimal die Woche während der Behandlung über einen 24-Stunden-Zeitraum gemessen und wurden als Prozentsatz im Verhältnis zum Volumen zu Beginn der Behandlung ausgedrückt.
Aufeinander folgende Injektionen von 10⁵ C6BAG-Zellen, unmittelbar gefolgt von 10⁶ C6BU1-Zellen, C6VIK-Zellen oder C6VIKWT-Zellen an derselben Injektionsstelle, wurden ausgeführt, wie oben angegeben, wobei 20 Tiere für jede Kombination verwendet wurden. Nachdem die Tumoren 1 cm im Durchmesser erreicht hatten, begann die Ganciclovirbehandlung über 14 Tage, 25 mg/kg zweimal täglich intraperitoneal für die Hälfte jeder Gruppe, wobei die andere Hälfte PBS intraperitoneal als Kontrolle erhielt. Das Tumorvolumen wurde als prozentualer Zuwachs über dem Volumen zu Beginn der Behandlung über 17 Tage bewertet.
Ergebnisse
1. Kulturuntersuchungen
Ganciclovirsensibilität: Die dosisabhängige Sensibilität verschiedener Zelllinien für Ganciclovir wurde durch Zellproliferations- und Koloniebildungstests bewertet. Von den zwei HSV-TK-tragenden Linien waren die C6VIKWT-Zellen empfindlicher für Ganciclovir als die C6VIK-Zellen beim Proliferationstest (3). Fünfzig Prozent Wachstumshemmung über einen Zeitraum von vier Tagen wurde für die C6VIK-Zellen bei 10 nM festgestellt und für die C6VIKWT-Zellen bei 0,3 nM. Für die C6BU1-Zellen (HSV-TK-negativ), C6BAG-, C6BWT-, C6BBAG- oder C6BAGWT-Zellen wurde bei 100 nM Ganciclovir keine Wachstumshemmung gefunden. Für das Überleben der Kolonien wurde die Wirkstoffbehandlung sieben Tage nach dem Ausplattieren begonnen, dann wurden die überlebenden Kolonien 9 bis 12 Tage später gezählt. Die Zelllinie C6VIKWT war 300fach empfindlicher für die toxischen Effekte von Ganciclovir als die elterliche Linie C6VIK, wenn die Bewertung auf dem Niveau von 50 % überlebenden Kolonien durchgeführt wurde (Bild 4). Die sehr viel höhere Empfindlichkeit von C6VIKWT im Vergleich zu C6VIK steht im Zusammenhang mit der Anwesenheit des HSV-TK-Gens, da es keinen signifikanten Unterschied in der Empfindlichkeit von C6BAGWT- und C6BWT-Linien gab, die in ähnlicher Weise mit dem Wildtypvirus infiziert worden waren, wenn sie mit nicht infizierten C6BAG- und C6BU1-Zellen verglichen werden (4).
Co-Kulturexperimente wurden ausgeführt, um festzustellen, ob ganciclovir-empfindliche „Spender"-Zellen, die das HSV-TK-Gen tragen, die Wirkstoffsensibilität auf HSV-TK-negative „Empfänger"-Zellen übertragen könnten. Die Sensibilisierung von Empfängerzellen wurde nach Co-Kultur entweder mit C6VIK oder C6VIKWT (im Verhältnis 1:2) beobachtet (5), die letztere war aber wirksamer, was zur fast vollständigen Ablation der Empfängerzellen führte, wie durch den Prozentsatz der überlebenden β-Galactosidase-positiven Kolonien festgestellt wurde. In einem Kontrollexperiment parallel dazu, bei dem C6BAG-Zellen entweder mit C6BU1- oder C6BWT-Zellen (Verhältnis 1:2) co-kultiviert wurden, wurde keine signifikante Sensibilisierung gegen Ganciclovir beobachtet. In einem ähnlichen Experiment demonstrierten C6BBAG-Empfängerzellen eine vergleichsweise höhere Ganciclovirsensibilität, wenn sie mit C6VIKWT-Zellen co-kultiviert wurden, als mit C6VIK-Zellen. Jedoch war die Ganciclovir-Dosis, die zur Hemmung der Koloniebildung durch C6BBAG-Zellen benötigt wurde, höher als für C6BAG-Zellen (6). Zum Beispiel wuchsen 50 % der C6BBAG-Zellen in Co-Kulturen mit C6VIKWT-Zellen, wenn dies in Gegenwart von 3 μM Ganciclovir erfolgte, während 50 % der C6BBAG-Zellen bei 30 μM Ganciclovir wuchsen. Diese höhere Sensibilität von C6BAG-Zellen ist auf ihre endogene Thymidinkinaseaktivität zurückzuführen, die in C6BBAG-Zellen fehlt.
In Co-Kulturexperimenten, bei denen C6BAG-Empfängerzellen (7) oder C6BBAG-Zellen (8) gleichzeitig mit C6VIK-Spenderzellen oder C6VIKWT-Zellen (im Verhältnis 1:100) implantiert wurden, wurde eine höhere Sensibilisierung von C6BAG-Zellen gegen Ganciclovir in Gegenwart von C6VIKWT-Zellen im Vergleich zu C6VIK-Zellen (7) festgestellt. Bei diesen gleichzeitig ausplattierten Co-Kulturen schien die Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen 10fach höher als in verzögerten Kulturen zu sein. Dies kann das Verhältnis von Spenderzellen zu Empfängerzellen widerspiegeln, das in den simultanen Experimenten 50fach größer war. Die Wirkung der Zellverhältnisse wurde durch Ändern der Proportion von Spenderzellen (C6VIKWT) zu Empfängerzellen (C6BAG) untersucht. Bei 100 μM Ganciclovir in Verhältnissen von 0,1 und 1 gab es keinen signifikanten Unterschied in der Ganciclovirsensibilität von C6BAG-Zellen im Vergleich zu Kulturen von C6BAG-Zellen allein. Bei Verhältnissen von 10 und 100 gab es eine „Dosisreaktionskurve" von größerer Sensibilität von C6BAG-Zellen gegenüber 100 μM Ganciclovir bei steigenden Zahlen von C6VIKWT- Zellen (9). In nachfolgenden in vivo-Experimenten wurde ein Verhältnis von 10:1 für Spenderzellen zu Empfängerzellen verwendet.
Tests des Gentransfers: Das Medium aus der wildtypinfizierten Linie, C6VIKWT, wurde zum Titrieren der Übertragung des HSV-TK-Gens auf NIH3T3-(TK-)Zellen und des neo^R-Gens auf NIH3T3-Zellen verwendet. Der Titer für die G418-Resistenz betrug 5 × 10⁵ CFU/ml auf NIH3T3-Zellen. Der Titer der Übertragung des TK-Gens betrug bei Bewertung durch die HAT-Resistenz von LMTK-Zellen 3,2 × 10³ CFU/ml. Der höhere Titer des Vektors, der die G418-Resistenz erreicht, im Vergleich zu der der HAT-Resistenz widerspiegelt die höhere Sensibilität dieses Tests und/oder die größere Expression des neo^R-Gens. Dieser hohe Titer zeigt an, dass das WT-Virus, das nicht direkt beurteilt wurde, tatsächlich C6-VIKWT-Zellen replizierte.
Toxizitätstest: Das präparierte Medium, das aus C6VIKWT-Kulturen vor und während der 300 μM-Ganciclovirbehandlung erhalten wurde, wurde an naiven C6BU1-Zellen mittels der Kolonieüberlebensmethode bewertet. Es wurde keine wahrnehmbare Wachstumshemmung bemerkt, was anzeigt, dass toxische Substanzen gegen diese naiven Zellen nicht wirksam wären, wenn toxische Substanzen in das Medium freigesetzt werden würden.
2. In vivo-Experimente
Ganciclovirsensibilität von C6VIKWT: Die subkutane Injektion von C6VIKWT-Zellen in die Flanke von nackten Mäusen erzeugte Tumormassen, deren Volumen sich während des 24-Tage-Zeitraums durchschnittlich mehr als 27fach erhöhte (10). Die Wachstumsrate war langsamer für Zellen, die mit Wildtypvirus infiziert waren, als die, welche vorher für nicht infizierte C6VIK-Zellen beobachtet wurde (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991)). Die Behandlung von C6VIK-Tumoren mit Ganciclovir über 14 Tage, die begann, als der Tumor eine Größe von 1 cm im Durchmesser erreicht hatte, hemmte das anschließende Wachstum vollständig (10). Es gab keinen wahrnehmbaren Unterschied in der Hemmungskinetik in den drei getesteten Ganciclovirregime; Regime 50 mg/kg/d Ganciclovir in zwei Injektionen pro Tag, Regime 50 mg/kg/d in einer Injektion pro Tag oder Regime 25 mg/kg/d in zwei Injektionen pro Tag (Daten nicht dargestellt). Bei allen 13 Tieren, bei denen die Ganciclovirbehandlung nach 14 Tagen gestoppt wurde, trat ein langsames Neuwachstum von Tumoren während der folgenden zwei Wochen auf (Daten nicht dargestellt).
Wenn verschiedene Kombinationen von Zellen getestet wurden, gab es keinen wahrnehmbaren Unterschied im Volumen der Tumoren bei Tieren, die sowohl C6BAG- als auch C6BU1-Zellen oder C6BAG- und C6VIK-Zellen während der 14 Tage der Behandlung mit PBS erhielten (11). Tumore, die eine Kombination von C6BAG- und C6VIKWT-Zellen (1:10) darstellten, waren jedoch zu allen Zeitpunkten in diesem Zeitabschnitt kleiner. Parallel dazu erhielten Tiere, die solche Tumore trugen, eine 14tägige Ganciclovirbehandlung. Es gab eine signifikante Verringerung in der Größe derjenigen Tumore, die aus C6BAG- und C6VIK-Zellen zusammengesetzt waren, im Vergleich zu denen, die C6BAG- und C6BU1-Zellen über diesen Zeitraum enthielten, und eine noch stärkere Verringerung der Größe von C6BAG- und C6VIKWT-Tumore (12). Die histologische Untersuchung der letzteren Tumore am Tag 17 zeigte eine umfangreiche Nekrose, und es war nicht möglich, die Identität jeglicher Tumorrestzellen zu bestimmen. Wieder gab es ein langsames Neuwachstum dieser letzteren Tumorzellkombination über die nachfolgende Periode von zwei Wochen, und dieses Neuwachstum wurde durch eine Ganciclovirbehandlung von weiteren 2 Wochen nicht blockiert. Der überlebende Tumor könnte aus C6BAG-Zellen bestehen, die das HSV-TK-Gen nicht erhalten haben, oder aus von C6 abgeleiteten Zellen, die dieses Gen tragen, bei dem die Expression „abgeschaltet" ist.
Diskussion
Es ist demonstriert worden, dass die Wirksamkeit des retrovirusvermittelten Gentransfers und der Chemosensibilität gegen das Nuldeosidanalogon, Ganciclovir, in Gliomzellen durch die kombinierte Infektion mit einem Retrovirusvektor erhöht werden kann, der das HSV-TK-Gen und den Wildtyp MoMLV enthält. Diese Behandlung war beim Abtöten von Tumorzellen in Kultur und in vivo wirksam.
Die Gentherapie ist eine neue und potenziell leistungsfähige Herangehensweise an die Behandlung von Krebs und anderen Störungen (Gansbacher et al., Cancer Res. 50:7820-7825 (1990); Rosenberg, Cancer Res. 51:5074s-5079s (1991); Gilboa, E., „Retroviral Gene Transfer: Applications to Human Therapy", in: Biology of Hematopoiesis, Wiley-Liss Inc. S. 301-311 (1990)). Tumorzellen, die mit Retrovirusvektoren infiziert sind, welche das HSV-TK-Gen tragen, können durch Verabreichen von Ganciclovir abgetötet werden (Moolten, Cancer Res. 46:5276-5281 (1986); Moolten et al., Human Gene Ther. 1:125-134 (1990); Moolten and Wells, J. Natl. Cancer Inst. 82:297-300 (1990); Plautz et al., New Biol. 3:709-715 (1991)). Die Retrovirusinfektion erfordert Zellteilung, und es wird berichtet, dass die Zielzellen im normalen adulten ZNS Glia und Endothelzellen sind (Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1281-1285 (1991)). Neuronen können nur in der pränatalen Periode infiziert werden, wenn Neuroblasten sich aktiv teilen (Sharpe et al., Nature 346:181-183 (1990)). Hirntumore stellen Massen von sich teilenden Zellen vor einem Hintergrund von meistens sich nicht teilenden Wirtszellen dar und sollten die idealen Kandidaten für die zielgerichtete Gentherapie durch Retrovirusvektor sein. Es ist über die selektive Chemosensibilisierung von Ratten-C6-Gliomzellen in Kultur und in vivo unter Verwendung eines ähnlichen Retrovirusvektors, VIK, berichtet worden (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991)). Ratten-C6-Gliomzellen, die mit diesem Vektor infiziert und in Kultur geklont wurden, C6VIK-Zellen, wurden subkutan in nackte Mäuse eingebracht. Die nachfolgende Behandlung der Tiere mit Ganciclovir hemmte das Tumorwachstum von C6VIK-Zellen, hatte aber keine Wirkung auf das Tumorwachstum der elterlichen C6-Zellen.
Es ist gezeigt worden, dass die Chemosensibilität gegen das Nukleosidanalogon, Ganciclovir, in Gliomzellen durch kombinierte Infektion mit einem Retrovirus, das das HSV-TK-Gen trägt, und dem Wildtyp MoMLV erhöht werden kann. Diese Behandlung war wirksam beim Abtöten von C6-Tumorzellen in Kultur und in vivo. Noch bemerkenswerter ist, dass dieser Effekt auf „naive" (d.h. nicht infizierte) C6-Gliomzellen übertragen werden kann.
Um einen realen Tumor zu behandeln, muss der Transfer des Gens in vivo stattfinden. Vorher wurde eine Produzenten-Zelllinie (aus Mäusefibroblasten abgeleitet), die den Reporter-Retrovirusvektor, BAG, freisetzt, in der Nähe des Tumorbettes von C6-Gliomzellen im adulten Rattenhirn implantiert. Dies ergab ein Niveau des Gentransfers auf Tumorzellen von etwa 10 %. Jedoch wurde die Zeitdauer der Genzufuhr durch die Immunabstoßung der vektorproduzierenden Linie verkürzt.
Die Dauer der vektorvermittelten Genzufuhr zu Tumorzellen ist auf zweierlei Weise erweitert worden. Erstens wurden C6VIKWT-Gliomzellen mit einem „Helfer"-Wildtyp MoMLV superinfiziert. Diese C6VIKWT-Zellen setzen Wildtypvirus- und replikationsdefekte Virusvektoren frei, die das HSV-TK-Gen enthalten, wobei beide benachbarte Tumorzellen infizieren können, vorausgesetzt, die letzteren sind proliferativ aktiv. Die Proliferation ist eine Voraussetzung für die Retrovirusintegration (Miller et al., Mol. Cell Biol. 10:4239-4242 (1990)).
Wenn benachbarte Zellen, entweder nacheinander oder gleichzeitig, mit dem Vektor und dem Wildtypvirus infiziert werden, können sie wiederum „Produzentenzellen" werden, die in der Lage sind, das Wildtypvirus und den Vektor auf weitere Zellen zu übertragen. Dies ermöglicht die verstärkte Ausbreitung der Vektorproduktion durch sich teilende Tumorzellen im Gehirn, die retrovirale DNA in das Genom integrieren können. Diese vom Gliom abgeleiteten „Produzentenzellen" können in das Gehirn wandern, wie es die Gliomzellen (Burger et al., J. Neurosci. 58:159-169 (1983)) und Astrozyten (Jacque et al., Dev. Neurosci. 8:142-149 (1986); Zhou et al., J. Corp. Neurol. 292:320-330 (1990); Hatton et al., Soc. for Neurosci. Abstracts 15:1369 (1989)) tun, und sich mit anderen Tumorzellen vermischen.
Ein weiteres Mittel zur Verbesserung der Wirksamkeit des Gentransfers auf gliale Tumoren ist die Entwicklung einer aus Glia abgeleiteten Verpackungslinie aus demselben Stamm, in die der Tumor implantiert wird oder in der er entsteht. Solche Zellen besitzen erhöhte Langlebigkeit innerhalb des ZNS und erübrigen auch die Notwendigkeit für das WT-Virus. Das Fehlen des WT-Virus erhöht die Sicherheit der Therapie. Es beseitigt auch eine mögliche Barriere für die universelle Infektion von Empfängerzellen durch den Vektor, da Zellen, die mit dem Wildtypvirus infiziert sind, auf Grund der Expression des Hüllglycoproteins an ihrer Oberfläche gegen die nachfolgende Infektion mit dem Wildtypvirus oder mit dem Vektor resistent sind (Kabat, D., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 148:1.42 (1989)).
C6VIKWT-Zellen (C6-Gliomzellen, die das HSV-TK-Gen tragen, mit dem MoMLV-Virus superinfiziert) waren signifikant empfindlicher für Ganciclovir als die elterlichen C6VIK-Zellen. Dieser Effekt ist spezifisch für die Anwesenheit des HSV-TK-Gens, da C6BU1-Zellen, die mit dem MoMLV-Virus infiziert waren, keine höhere Empfindlichkeit als die elterliche Linie, C6BU1, zeigten. Dieser Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen C6VIK und C6VIKWT war sogar noch größer, wenn er mit dem Kolonietest bewertet wurde. Der Unterschied in der Empfindlichkeit, der zwischen diesen beiden Tests festgestellt wurde, widerspiegelt möglicherweise die niedrigere Empfindlichkeit isolierter Zellen im Vergleich zu der in Kolonien. Enge Zellkontakte zwischen den Zellen in Kolonien können die Übertragung des HSV-TK-Gens verstärken, was mehrfache Integration pro Zelle ermöglicht, oder die intrazelluläre Konzentration von Ganciclovir oder von davon abgeleiteten toxischen Metaboliten erhöhen. Die Wirksamkeit von C6VIKWT-Zellen war auch an ihrer Fähigkeit erkennbar, Empfängerzellen für Ganciclovir zu sensibilisieren, wie durch Co-Kultur von Empfängerzellen, die mit dem lacZ-Gen markiert sind, C6BAG- oder C6BBAG-Zellen, oder Spenderzellen, C6VIK oder C6VIKWT, nachgewiesen. Da es keine signifikante Differenz in der Ganciclovirsensibilität von C6BU1- und C6BWT-Zellen gab, ist die Übertragung des HSV-TK-Gens in Gegenwart des Wildtypvirus, und nicht das Wildtypvirus allein, für diesen Abtötungseffekt verantwortlich. Es wurde jedoch ein gewisser Transfer von Ganciclovirsensibilität auf Empfängerzellen beim C6VIK-Spender (d.h. auch in Abwesenheit des Wildtypvirus) beobachtet. Als Konsequenz wurden mehrere Tests ausgeführt, um zu bestimmen, ob die erhöhte Empfindlichkeit von Empfängerzellen für Ganciclovir auf die Übertragung des TK-Gens, die Infektion mit dem Wildtyp-Retrovirus und/oder die Freisetzung eines toxischen Metaboliten zurückzuführen ist. Das Medium aus Co-Kulturen wurde auf VIK-Retrovirus getitert und auf Toxizität für naive Zellen getestet. Die Tests für den Gentransfer, der durch Medien aus C6VIKWT-Zellen vermittelt wurde, dokumentierte die Anwesenheit von Vektoren, die das Neomycin-Resistenz-Gen und das TK-Gen tragen. Es wurde keine Toxizität festgestellt, wenn naive C6BU1-Zellen Medien aus Kulturen von C6VIKWT-Zellen mit oder ohne Ganciclovirbehandlung ausgesetzt wurden. Dies schließt nicht die Möglichkeit aus, dass die Empfindlichkeit in der Abwesenheit des Wildtypvirus durch den direkten Transfer toxischer Metabolite von Spenderzellen auf Empfängerzellen durch Zell-Zell-Kontakte vermittelt werden könnte, weist aber daraufhin, dass diese Metabolite nicht über das Medium ausgetauscht werden.
Die außerordentliche Chemosensibilität von C6VIKWT-Zellen für Ganciclovir war sowohl in vivo als auch in Kultur erkennbar. Die Anwesenheit des Wildtypvirus trug zur Empfindlichkeit dieser Zellen bei, da die Behandlung von subkutanen C6VIKWT-Tumore mit Ganciclovir das Tumorwachstum vollständig blockierte, während in vorherigen Untersuchungen C6VIK-Tumore, die mit Ganciclovir behandelt wurden, weiterhin langsam wuchsen (Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991)). C6VIKWT-Tumore wachsen langsamer als C6VIK-Tumore, was darauf hinweist, dass das Wildtyp-Retrovirus selbst das Wachstum von Tumorzellen stören kann. Jedoch scheint die Injektion des WT MoMLV in subkutane C6-Tumore keinen Effekt auf das Tumorwachstum zu haben (Y. Takamiya, unveröffentlichte Daten). Es ist gezeigt worden, dass die Wildtypretrovirus-Infektion den differenzierten Phänotyp kultivierter menschlicher Gliomzelllinien beeinträchtigen kann (Macchi et al., Acta Neuropathol. 81:670-674 (1991)), es ist aber unklar, ob dies die Onkogenität dieser Zellen ändert. Die Co-Injektion von C6BAG- und C6VIKWT-Zellen, gefolgt von der Behandlung mit Ganciclovir, zeigte eine deutlich verringerte Rate des Tumorwachstums im Vergleich mit Kombinationen von C6BAG-Zellen und entweder C6BU1- oder C6VIK-Zellen, wobei keine restlichen Tumorzellen histologisch nach der Behandlung gesehen wurden. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Übertragung des HSV-TK-Gens auf C6BAG-Empfängerzellen, die durch die Produktion des VIK-Vektors durch benachbarte C6VIKWT-Zellen vermittelt wird.
Obwohl Wildtyp-MoMLV Leukämie und neuropathologische Effekte bei jungen Mäusen verursachen kann (Sharpe et al., Nature 346:181-183 (1990); Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1281-1285 (1991)), sind immunkompetente adulte Mäuse ziemlich resistent gegen die Pathogenität dieses Virus. Die vorliegenden in vivo-Daten, die hier angeführt werden, wurden unter Verwendung nackter immunschwacher Mäuse gewonnen (Gullino et al., Institute Lab Animal Resources (ILAR) News 19:M1-M20 (1976)), obwohl bei dieser Untersuchung die gesamte Pathogenität bei Tieren in Beziehung zum Tumorwachstum im Gehirn zu stehen schien.
Die Ganciclovirsensibilität der Gliomzellen, welche sowohl mit einem das HSV-TK-Gen tragenden Retrovirusvektor als auch mit dem Wildtyp-MoMLV-Virus infiziert waren, sowie ihre Fähigkeit, die Empfindlichkeit auf „naive" Zellen in ihrer Nähe zu übertragen, könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, wie schematisch in 13 dargestellt. Dazu gehören die zellulären schwächenden Effekte der Wildtypretrovirus-Infektion, die Wirtsproduktion von Antikörpern als Reaktion auf virale und Tumorantigene (in immunkompetenten Tieren), die Integration und Expression das HSV-TK-Gens in Tumorzellen, die es den Zellen ermöglicht, toxische Metabolite aus Ganciclovir zu erzeugen, und die mögliche Übertragung dieser toxischen Metabolite auf Nachbarzellen. Eine Gentherapiestrategie, die dieses System nutzt, liefert somit vier getrennte und zusätzliche Mittel zum Abtöten von Tumorzellen, die alle keine Wirkung auf endogene Hirnzellen besitzen. Zellen, die das HSV-TK-Gen tragen, zeigen auch eine erhöhte Empfindlichkeit für Strahlung in Gegenwart von Ganciclovir, da seine Metabolite die DNA-Reparatur sowie die DNA-Synthese beeinträchtigen. Zusätzlich kann die Abtötung durch die Erzeugung von Vektoren erweitert werden, die Gene für sezernierbare Proteine, welche Tumorzellen selektiv töten oder ihr Wachstum selektiv hemmen, oder für Oberflächenproteine tragen, die die Immunabstoßung von Tumorzellen stimulieren. Es könnten also mehrere verschiedene Vektoren gemeinsam und kombiniert mit traditionelleren Therapien verwendet werden.
Beispiel 5
Methoden
Plasmidkonstruktionen: Eine Ratten-cDNA, die die volle Länge der codierenden Sequenz für das Ratten-Cytochrom P450 2B1 enthält, wurde durch Aufschließung mit Ncol und EcoRI aus dem Plasmid pSR-P450 isoliert (Vallette et al., Nucl. Acid Res. 17:723-733 (1989)) (von Dr. Milton Adesnik, NYU Medical School, bereitgestellt). Dieses Fragment wurde stromabwärts vom MoMLV-LTR nach Aufschließung mit Ncol und BamHI unter Verwendung eines 15 bp EcoRI-BamHI-Adaptors (New England Biolabs) in das Plasmid pMFG eingefügt (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-3543 (1993)) (von Dr. Richard Mulligan, MIT, bereitgestellt). Das resultierende Plasmid war pM450.
Zellkultur, Transfektion und Isolation von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Zellen: Zellen wurden in Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) mit hohem Glucoseanteil (Kat.Nr. 10-013-LM, CELLGRO), ergänzt durch 10 % fötales Kälberserum, 100.000 E/1 Penicillin und 100 mg/l Streptomycin (Sigma) in einem Inkubator mit 5 % CO₂ gezüchtet. Das pM450-Konstrukt wurde in C6-Gliom- und ΨCRE-Zellen (Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988)) zusammen mit pRSVneo (das freundlicherweise von Dr. Michael Comb, MGH bereitgestellt wurde), einem Plasmid, das das Gen für die Resistenz gegen Neomycin codiert, in einem molaren Verhältnis von 10:1 unter Verwendung von LIPOFECTIN gemäß den Herstelleranweisungen (GIBCO) transfiziert. Stabile Transfektanten wurden unter Auswahl in 1 mg/ml G418 (GIBCO) geklont. Neomycin-resistente C6-Gliom- und CRE-Zellklone wurden auf Cytochrom P450 2B1-Aktivität durch Wachstum in Gegenwart von 500 μM Cyclophosphamid (CPA), das 24 Stunden nach dem Ausplattieren mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/100 mm Schale hinzugefügt wurde, bewertet. Ein von C6 abgeleiteter Klon (C450-8) und ein von ΨCRE abgeleiteter Klon (R450-2) wurden nach vier Tagen bei dieser Konzentration des Prodrug vollständig zerstört. Diese Klone wurden in weiteren Untersuchungen verwendet. Andere CPA-resistente Klone, CNEO-1 und C450-19, wurden als Kontrollen verwendet. Die Titer der Retrovirusproduktion wurden nicht bestimmt, da das Fehlen eines wählbaren Markers im MFG-Retrovirusvektor das Titrieren durch Zählen wirkstoffresistenter Klone nach der Infektion mit retroviralen Überständen ausschloss (Cepko, C., in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., Wiley and Sons, New York (1992), S. 9.11.1-9.11.12). Die vorbereitenden Experimente wiesen darauf hin, dass die Retrovirustiter durch die Verwendung der Übernahme von CPA-Sensibilität durch naive Zellen, die den R450-2-Überständen ausgesetzt wurden, quantitativ bestimmt werden könnten.
Cyclophosphamid-Dosis-Wirkungstest: Für Dosis-Wirkungs-Kurven wurden Zellen mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/100 mm Schale (Corning) in vierfacher Ausführung ausplattiert. Zwei Tage später wurde CPA bis zu Endkonzentrationen von 0-1000 μM hinzugefügt. Fünf Tage nach dem Ausplattieren wurden die einlagigen Schichten zweimal mit Hanks gepufferter Kochsalzlösung (GIBCO) gespült, um tote Zellen zu entfernen. Einlagige Schichten wurden mit Trypsin-EDTA (GIBCO) dispergiert, und die Zellzahlen wurden mit einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics Inc.) ermittelt.
Immunzytochemie und Western Blots: Ein polyklonales Kaninchen-Antiserum, das auf Ratten-P450 2B1 gezüchtet wurde (Waxman, D.J., J. Biol. Chem. 259:15481-15490 (1984); Waxman et al., J. Biol. Chem. 257:10446-10457 (1982)), wurde zur Durchführung der Immunhistochemie unter Verwendung der Methode der alkalischen Phosphatase durchgeführt, wie für das Vectastain-Reagenzkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) beschrieben. Die Western Blot-Analyse erfolgte an mikrosomalen Fraktionen (20 μg Protein/Bande), aus kultivierten Zellen: C450-8, C6, CNEO-1 und C450-19, isoliert. Lebermikrosomen, die aus phenobarbital-induzierter Rattenleber isoliert wurde (2 μg Protein/Bande), wurden als positive Kontrollen verwendet. Proteine wurden durch Elektrolyse in 10 % SDS/Polyacrylamidgelen analysiert, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem Kaninchen-Anti-P450 2B1-Antikörper sondiert (Waxman, D.J., (1984), oben).
Bestimmung der Cytochrom P450 2B1-Aktivität: Die enzymatische Aktivität wurde für jede klonale Link durch Prüfung der 16β-Hydroxylierung von [4-¹⁴C]-Androstendion (6 mCi/mmol; Amersham), wie beschrieben bestimmt (Waxman, D.J., Methods in Enzymology 206:249-267 (1991)); Waxman et al., J. Biol. Chem. 258:11937-11947 (1983)). Kurz gesagt, wurden in einlagiger Schicht gezüchtete Zellen geerntet, und Zellpellets wurden bei -80 °C bis zur nachfolgenden Präparation der Mikrosomen gelagert. Enzymaktivitätsmessungen erfolgten über 30 Minuten bei 37 °C in 100 mM HEPES, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 50 AM ¹⁴C-markiertes Androstendion, 100 μg mikrosomales Protein und 1 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 200 μl. Die Mischung wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert, auf einer Silicagel-Dünnschicht-Chromatographieplatte chromatographiert und nacheinander in mehreren Lösungsmittelsystemen entwickelt (Waxman, D.J., (1991), oben). Die Metabolite wurden durch Autoradiographie lokalisiert und dann durch Flüssigkeitsszintillationszählung quantifiziert.
Tieruntersuchungen: Für die Tierinjektionen wurden kultivierte Zellen im proliferativen Stadium 24 Stunden vor der Abschöpfung neu ausplattiert, dann trypsinisiert, bei niedriger Drehzahl zentrifugiert, einmal durch erneute Suspendierung in Hanks gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, zentrifugiert und dann in DMEM ohne Serum bei einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml neu suspendiert. Für subkutane Injektionen wurden 10⁵ C450-8- oder C6-Zellen in 200 μl in die Seiten thymusloser Mäuse injiziert (NCY/Sed., nu/nu; MGH-Zuchtkolonie; fünf Tiere pro Gruppe). Nach 3 Tagen, als der Tumor ein Volumen von etwa 0,01 cm³ erreicht hatte (bei Messung mit externen Lehren) (Lee et al., Neurosurgery 26:598-605 (1990)), und erneut nach 14 Tagen, wurden 100 μl-Injektionen entweder von 20 mg CPA (Sigma) pro ml Kochsalzlösung oder 100 μl Kochsalzlösung direkt in die Tumormasse ausgeführt. Die Tiere wurden nach 17 Tagen eingeschläfert.
Für die intrazerebralen Injektionen wurden Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg pro kg Körpergewicht) (Parke Davis, NJ) und Xylazin (20 mg pro kg Körpergewicht) (Mobay Corp., KS) anästhesiert. Chirurgische Arbeiten wurden steril ausgeführt. Nach Immobilisierung des Nagetiers in einem stereotaktischen Apparat (Kopf), wurde ein kleiner Einschnitt in die Haut über dem Schädel vorgenommen. C6-Gliomzellen (10³ Zellen in 2 μl) wurden stereotaktisch ungefähr 0,5 mm frontal und 0,5 mm seitlich rechts vom Bregma mittels einer Hamilton-Spritze inokuliert. Die Inokulationsperiode betrug 5 Minuten, wobei 2 Minuten zum Zurückziehen der Nadel vorgesehen waren. Drei Tage später wurde dasselbe Trepanationsloch für die stereotaktische Verpflanzung von 5 × 10⁶ CRELacZ-Zellen (eine Zelllinie, die freundlicherweise von Dr. R. Mulligan zur Verfügung gestellt wurde) oder 5 × 10⁶ R450-2-Zellen in 25 μl DMEM verwendet. Vier, acht und elf Tage nach dieser letzten Injektion wurde CPA (0,3 mg in 5 μl) stereotaktisch durch dieselbe Schädelöffnung in den Tumor und meningealen Raum von Mäusen aus beiden Gruppen, CRELacZ und R450-2, verabreicht. Injektionen wurden stereotaktisch über einen Zeitraum von zehn Minuten ausgeführt, wobei fünf Minuten für das Zurückziehen der Nadel vorgesehen waren. Die Tiere wurden zehn Tage nach der Injektion der letzten Dosis des Prodrug eingeschläfert, indem durch den linken Ventrikel etwa 3-5 ml von 100 mM Natriumphosphat in 0,9 % Natriumchloridlösung, pH 7,3, perfundiert wurden, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd in 100 mM Natriumphosphat, pH 7,3. Die Gehirne wurden sorgfältig vom Schädel und den Kiefern der Tiere abgelöst, bevor sie über Nacht in 4 % Paraformaldehyd in 100 mM Natriumphosphat, pH 7,3, gelegt wurden. Zur Kältekonservierung wurden die Gehirne in 20 % Glycerol/10 % Dimethylsulfoxid in 100 mM Natriumphosphat, pH 7,3 gebracht und dann mit einem Schlittenmikrotom in 50 μm-Schnitte geschnitten. Jeder sechste Schnitt wurde auf gelatinebeschichteten Trägern montiert und mit Cresylviolett gefärbt. Zur Berechnung der Volumina der Hirntumoren wurde ein computergestützter Bildanalysator dazu eingesetzt, die Tumorflächen in jedem Schnitt abzuscannen. Diese Analyse wurde blind ausgeführt. Das manuelle Umreißen wurde vorgenommen, um den Tumor von normalen Hirnzysten oder Verarbeitungsartefakten zu unterscheiden. Die Tumorvolumina wurden durch Multiplikation der durchschnittlichen Tumorfläche aus allen Schnitten in einem Gehirn mit dem Abstand (0,3 mm) zwischen den Schnitten einschließlich jedes Schnitts berechnet.
Ergebnisse
Cyclophosphamidsensibilität von C6-Gliomzellen in Kultur: Die cDNA für Ratten-Cytochrom P450 2B1 (Vallette et al., oben) wurde in Plasmidsequenzen für den MFG-Retrovirusvektor (Dranoff et al., oben) eingefügt. Das sich ergebende Plasmid (pM450) wurde dann mit einem Expressionsvektor, der das Neomycin(neo)-Resistenzgen in C6-Gliomzellen trägt, co-transfiziert (Benda et al., J. Neurosurg. 34:310-323 (1971)). Zwei stabil transfizierte neoresistente Klone wurden für die weitere Untersuchung gewählt: 1) C450-8-Zellen, die die größte Empfindlichkeit für CPA zeigten, und 2) CNEO-1-Zellen, die wie die elterlichen C6-Zellen relativ unempfindlich für diesen Wirkstoff erschienen. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve zeigte, dass 27 μM CPA die Zahl der C450-8-Zellen in einem Zellproliferationstest um 50 % verringerten (Bild 14). Im Gegensatz dazu überlebten mindestens 80 % der C6- und CNEO-1-Zellen die Inkubation mit bis zu 1 mM CPA. Daher haben C6-Zellen die Chemosensibilität für das Prodrug CPA nach der Transfektion mit dem Cytochrom P450 2B1-Expressionsplasmid erworben.
Expression und mikrosomale Lokation von Cytochrom P450 2B1 in C450-8-Zellen: Cytochrom P450 2B1 ist ein integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums des Hepatozyten (Monier et al., J. Cell. Biol. 107:457-470 (1988)). Ein polyklonales Kaninchen-Antiserum, das auf Cytochrom P450 2B1 kultiviert wurde (Waxman, D.J., (1984), oben), wurde zur Feststellung eingesetzt, ob der Erwerb der CPA-Sensibilität mit der Cytochrom P450 2B1-Expression verbunden war. Ein immunreaktives Protein war in C450-8-Zellen (15a), aber nicht in CNEO-1-Zellen (15b) vorhanden. Das gitterähnliche Netzmuster in C450-8-Zellen wies darauf hin, dass dieses immunreaktive Protein richtigerweise mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiert wurde (Monier et al., oben). Weiterhin bestätigte die Western Blot-Analyse die Anwesenheit einer einzelnen immunreaktiven Proteinart in mikrosomalen Fraktionen, die aus C450-8-Zellen, aber nicht aus C6- oder CNEO-1-Zellen gewonnen wurde (16).
Die NADPH-abhängige Androstendion-16β-Hydroxylaseaktivität, die spezifisch für das Cytochrom P450 2B1-Enzym ist (Waxman, D.J., (1991), oben; Waxman et al., (1983), oben) wurde in mikrosomalen Präparationen aus diesen Zellen getestet. Diese Aktivität war nicht in C6- und/oder CNEO-1-Zellen feststellbar, während C450-8-Zellen etwa 1 % der Aktivität von phenobarbital-induzierten Rattenlebermikrosomen besaßen (Tabelle I), die hoch angereichert mit dieser P450-Form sind (vgl. 16). Der Zusatz von exogener gereinigter NADPH-P450-Reduktase (Waxman et al., (1982), oben), dem mikrosomalen Flavinenzym, das eine obligatorische Elektronenübertragung von NADPH auf alle mikrosomalen P450-Enzyme katalysiert, vergrößerte die Enzymaktivität etwa zweifach in C450-8-Zellen.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass C450-8-Zellen enzymatisch aktives Cytochrom P450 2B1 exprimierten, welches im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert zu sein schien. Tabelle I Cytochrom P450 2B1-vermittelte Androstendion-16β-Hydroxylaseaktivität ^a

Mikrosomen	Enzymaktivität (pmol/min/mg Protein)
C6	0
CNEO-1	0
C450-8	53
C450-8 plus exogene, gereinigte NADPH-P450-Reduktase^b	90
CRE^c	0
R450-2	20
Phenobarbital-induzierte Rattenlebermikrosomen	5845

^a Die Enzymaktivität wurde in mikrosomalen Fraktionen gemessen, die aus der angegebenen Zelllinie präpariert wurde, oder aus phenobarbital-induzierten Rattenlebermikrosomen, wie unter Methoden beschrieben.
^b Die NADPH-Reduktase aus Rattenleber wurden den mikrosomalen Inkubationen unter Bedingungen hinzugefügt, bei denen das endogene mikrosomale P450 bezüglich der NADPH-Reduktase gesättigt wird, wie in den Methoden beschrieben.
^c Die Aktivität von CRELacZ-Zellen wurde nicht bestimmt, da sie durch Transfektion elterlicher CRE-Zellen (deren Cytochrom P450 2B1-Aktivität null ist) erzeugt wurden. Außerdem verloren allgemein kultivierte Zellen jegliche P450-Aktivität (Jefferson et al., Mol. Cell. Biol. 4:1929-1934 (1984)), die Möglichkeit weiter minimiert, dass CRELacZ-Zellen die P450 2B1-Aktivität erwerben könnten.

Cyclophosphamidsensibilität von subkutanen C6-Gliomtumoren: Die CPA-Empfindlichkeit von Tumoren, die von C6- oder C450-8-Zellen gebildet wurden, wurde durch das subkutane Wachstum in den Flanken nackter Mäuse beurteilt (17). Drei und vierzehn Tage nach der Anlage der subkutanen Tumore wurden den Tieren intratumoral entweder physiologische Kochsalzlösung oder 2 mg CPA injiziert. Drei Tage nach der letzten CPA-Dosis (siebzehn Tage nach der Anlage des Tumors) bestand keine statistisch signifikante Differenz zwischen den Volumina von C6- und C450-8-Tumoren, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (C6-Tumoren = (0,747 ± 0,325) cm³; C450-8-Tumoren = (0,447 ± 0,213) cm³, p > 0,1). Im Gegensatz dazu wurde eine statistisch signifikante Differenz zwischen den Volumina von C6- und C450-8-Tumoren festgestellt, die mit CPA behandelt wurden (C6-Tumore = (0,093 ± 0,035) cm³; C450-8-Tumore = (0,016 ± 0,003) cm³, p < 0,01). Diese Differenz war auch signifikant, wenn das Verhältnis der mittleren Volumina von CPA-behandelten zu mit Kochsalzlösung behandelten C450-8-Tumore gerechnet wurde (0,124 vs. 0,035; p < 0,05). Die erhöhte Empfänglichkeit von C450-8-Tumore für CPA im Vergleich zu C6-Tumore weist darauf hin, dass CPA in seine aktiven Metabolite innerhalb des Tumors selbst sowie von der Leber umgewandelt wurde.
In vivo-Erwerb der Cyclophosphamidsensibilität durch Hirntumore: Mäuse-ΨCRE-Fibroblasten wurden mit Plasmiden, pM450 und pRSVneo, co-transfiziert. Ein neo-resistenter Klon, als R450-2 bezeichnet, wurde auf Grund seiner Chemosensibilität für CPA und seiner hohen P450 2B1-abhängigen Andostendion-16β-Hydroxylaseaktivität (Waxman, D.J.,)1991), oben; Waxman et al., (1982), oben) im Vergleich zu elterlichen ΨCRE-Fibroblasten ausgewählt (Tabelle 1). Diese Zellen wurden dann in einem Hirntumormodell getestet.
C6-Gliomzellen wurden stereotaktisch in die Gehirne von thymuslosen Mäusen inokuliert, drei Tage später gefolgt von der stereotaktischen Inokulation von Mäusefibroblasten, die das lacZ-Gen aus E. coli exprimieren, CRELacZ-Zellen oder R450-2-Zellen. Vier, acht und elf Tage später wurde CPA durch dieselbe Schädelöffnung in den Tumor und den meningealen Raum von Mäusen aus beiden Gruppen, CRELacZ und R450-2, injiziert. Die Tiere wurden zehn Tage nach der Injektion der letzten Prodrug-Dosis eingeschläfert. Der ausgedehnte und bröckelige Tumor wurde in der meningealen Abdeckung der Gehirne von 8/8 Tieren gefunden, die Injektionen von C6- plus CRELacZ-Zellen, gefolgt von der Verabreichung von CPA, erhalten hatten (18a). Es war nicht möglich, die meningeale Tumormasse quantitativ zu bestimmen, da das Abtrennen vom Schädel und von den Kiefern der Tiere schwierig war und das Schneiden/Fixieren des Gewebes zu einem umfangreichen Verlust an bröckeligem meningealem Tumorgewebe führte. Im Gegensatz dazu zeigten 7/8 Tieren, die Injektionen von C6- plus R450- 2-Zellen, gefolgt von der Verabreichung von CPA, erhalten hatten, keine Zeichen eines meningealen Tumors (18b), wobei 1/8 eine kleine Restmasse aufwies. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die in situ-Umwandlung von CPA in seine aktiven Metabolite durch benachbarte Fibroblasten und wahrscheinlich durch Tumorzellen, die mit P450 2B1-Retrovirusvektoren infiziert waren, die Ausbreitung des meningealen Tumors drastisch hemmte, wenn das Prodrug intrathekal/intratumoral verabreicht wurde.
Die stereotaktischen Injektionen von C6-Tumorzellen, die oben beschrieben wurde, führte auch zur Bildung von soliden Tumoren innerhalb des Hirnparenchyms. Die histopathologische Analyse solider Tumoren aus jeder Gruppe zeigte im wesentlichen keine Tumornekrose in den Kontrollen. CRELacZ-behandelte Tiere (19a) zeigten jedoch eine ausgedehnte Tumornekrose in 3/6 Gehirnen aus der Gruppe, die die R450-2-Fibroblasten erhielt (19b). Um eine quantitative Bewertung des Ausmaßes der Tumorregression zu erhalten, wurden parenchymale solide C6-Gliomvolumina aus Serienschnitten berechnet, wozu eine computergestützte Bildanalyse verwendet wurde. Tabelle II zeigt, dass die Hirntumorvolumina bei drei der Tiere, die die R450-2-Retrovirus-Produzentenzellen erhalten hatten, 1/20, 1/5 und ½ des durchschnittlichen Hirntumorvolumens in Ratten waren, die die lacZ-Retrovirus-Produzentenzellen erhalten hatten. Die anderen drei R450-2-behandelten Tiere hatten Tumore innerhalb desselben Größenbereiches wie die bei den Kontrolltieren gesehenen. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Kombination der Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Produzentenzellen und CPA, das intrathekal/intratumoral verabreicht wurde, auch eine gewisse Regression des parenchymalen soliden Anteils des Hirntumors erzeugt. Tabelle II Volumina von parenchymalen Hirntumoren nach R450-2- oder CRELacZ-Implantationen und Cyclophosphamid-Verabreichung^a

C6 + CRELacZ (mm³) C6 + R450-2 (mm³)

47,5 3,2

51,5 14,2

54,7 28,4

62,4 87,4

72,6 105,3

85,1 171,4

^a Die Tumorvolumina wurden mittels computergestützter Umrissbegrenzung gemessen, wie in den Methoden beschrieben.

Diskussion
Während der letzten Jahre ist gezeigt worden, dass mehrere experimentelle Ansätze, zu denen die Expression therapeutischer Gene gehört, die Regression von experimentellen Hirntumoren vermittelt haben (Moolten et al., Hum. Gene Ther. 1:125-134 (1990); Moolten et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:297-300 (1990); Short et al., J. Neurosci. Res. 27:427-433 (1990); Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991); Culver et al., Science 256:1550-1552 (1992); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503 (1992); Yamada et al., J. Cancer Res. 83:1244-1247 (1992); Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Oldfield et al., Hum. Gene Ther. 4:39-69 (1993); Takamiya et al., J. Neurosurg. 79:104-110 (1993); Caruso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028 (1993); Boviatsis et al., Hum. Gene Ther. 5:183-191 (1994); Chiocca et al., „Virus-mediated Genetic Treatment of Rodent Gliomas", in Gene Therapeutics, Wolff, J.A., Hrsg., Birkhauser Publishers, Boston, MA (1994), S. 245-262; Trojan et al., Science 259:94-97 (1993); Yu et al., Cancer Res. 53:3125-3128 (1993)).
Bei diesem Beispiel verwendeten die Erfinder das „Abtötungsgen", Cytochrom P450 2B1, das die Zellen empfindlich für CPA macht, für die Gentherapie von Neoplasmen des Zentralnervensystems. Die wirkstoffbedingte Abtötungswirkung von P450 2B1 ist nicht notwendigerweise auf die Gentherapie von Neoplasmen des Zentralnervensystem beschränkt, sondern könnte für die negative Auslese anderer Zellpopulationen in Kultur oder in vivo verwendet werden. Weiters ist das therapeutische Paradigma, das hier vorgestellt wird, nicht auf die Verwendung des Cytochrom P450 2B1-Gens mit CPA beschränkt. Dieser Ansatz kann auf andere Cytochrom P450-Enzyme angewendet werden, die an der Biotransformation anderer chemotherapeutischer Agenzien beteiligt sind (LeBlanc and Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989)).
Der Ansatz der Gentherapie mit dem Cytochrom P450 2B1/CPA-Gen scheint Merkmale zu haben, die vorteilhafter als die aktuellen Behandlungsansätze sind, welche ein pharmakologisches Analogon von Cyclophosphamid, 4-Hydroxyperoxycyclophosphamid (4-HC), nutzen.
Dieses Analogon zerfällt spontan in 4-Hydroxycyclophosphamid, das dann Phosphoramid-Lost (PM) ohne die Notwendigkeit einer enzymatischen Bioaktivierung erzeugt (Peter et al., Can. Treat. Rep. 60:429-435 (1976); Colvin et al., (1981), oben); Friedman et al., Cancer Res. 46:2827-2833 (1986); Sladek, N.E., oben; Friedman et al., Cancer Res. 48:4189-4195 (1988)). Obwohl 4-HC therapeutische Wirksamkeit bei Tiermodellen von meningealer Neoplasie (Arndt et al., Cancer Res. 47:5932-5934 (1987); Fuchs et al., Cancer Res. 50:1954- 1959 (1990); Phillips et al., Cancer Res. 52:6168-6174 (1992); Friedman et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 34:269 (1993)) und parenchymalen soliden Hirntumoren (Schuster et al., Cancer Res. 53:2338-2343 (1993a); Schuster et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 34:269 (1993b)) zeigte, ist es in Verbindung mit beträchtlicher Neurotoxizität gebracht worden (Schuster et al., (1993a und b), oben), da seine Konversion in zytotoxische Metabolite keine anatomische oder zelluläre Selektivität besitzt.
In Gegensatz dazu setzt das hier beschriebene Behandlungsregime ein stabiles, inertes, lipophiles Prodrug (CPA) ein, das die enzymatische Konversion erfordert, um seinen potenten Antikrebseffekt auszuüben. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass durch die Einführung des P450 2B1-Gens in Tumorzellen die zelluläre und anatomische Lokalisation der enzymatischen Konversion von CPA wirksam auf das Neoplasma begrenzt wird, wodurch die unerwünschten Nebenwirkungen auf normale Zellen im Gehirn und in der Peripherie minimiert werden.
Bei dem hier beschriebenen Ansatz weist die Verwendung von genetisch veränderten Zellen Merkmale auf, die analog zu biologisch abbaubaren implantierbaren Polymeren für die lokale kontrollierte Zufuhr von aktivierten Krebsmitteln, wie z.B. BCNU und 4-HC, sind (Brem et al., J. Neurosurg. 80:283-290 (1994); Buahin et al., Polymer. Adv. Tech. 3:311-316 (1992); Tamargo et al., Cancer Res. 53:329-333 (1993)). Sowohl die Polymer- als auch die Methode der genetisch veränderten Zellen sollte anhaltende, hohe und lokale aktivierte Wirkstoffspiegel innerhalb des Tumors mit minimaler systemischer und ZNS-Toxizität ermöglichen. Außerdem sollte die Erzeugung eines Retrovirusvektors aus den genetisch veränderten Zellen eine zusätzliche therapeutische Verstärkung im Vergleich zum Ansatz mit implantierbaren Polymeren bieten, indem der Umfang der Tumorzellen, die für das chemotherapeutische Agens empfindlich sind, anatomisch erweitert wird.
Im Gegensatz zu anderen Genen, die eine wirkstoffbedingte Letalität übertragen, d.h. das HSV-TK-Gen, das E. coli-Cytosindeaminase-Gen (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37 (1992); Huber et al., Cancer Res. 53:4619-4626 (1993) und das E. coli-gpt-Gen (Mroz et al., Hum. Gene Ther. 4:589-595 (1993)), müsste die Abtötung des Tumors mit dem P450 2B1-Gen unabhängig von der Zellzyklusphase erfolgen, da die aktiven, von CPA abgeleiteten Metabolite Zellen durch Querverbindungen zwischen den Strängen in der DNA „markieren". Maximale Zytotoxizität trat auf, wenn die „markierte" Tumorzelle ihre DNA repliziert, was zur Zeit der Wirkstoffbehandlung oder danach auftreten könnte. Das kann einen Vorteil im Vergleich zu den Gentherapieparadigmen darstellen, die Metabolite verwenden, welche zum Erreichen der zytotoxischen Effekte in replizierende DNA-Stränge eingebaut werden müssen.
Zum Beispiel erzeugt HSV-TK phosphorylierte Ganciclovir-(oder Acyclovir-)Moleküle, die als Nukleotidanaloga fungieren und in replizierende DNA-Ketten eingebaut werden (Fyfe et al., J. Biol. Chem. 253:8721-8727 (1978)). Diese Nuldeotide sind am wirksamsten für Tumorzellen, wenn sie in der S-Phase des Zellzyklus erzeugt werden, da sie eine relativ kurze Halbwertszeit haben (Elion, G.B., oben). Die große Mehrheit der Zellen in malignen Hirntumoren befindet sich nicht in der S-Phase (Nagashima et al., oben; Yoshii et al., oben) und sind eventuell keine idealen Ziele für HSV-TK-/Ganciclovir-Genbehandlungen. Man glaubt auch, dass die Cytochrom P450-Gene eine „Gedächtnis"-Komponente insofern besitzen, dass sich Metabolite von CPA fest an DNA binden und alle sterben, wenn es später nach Wirkstoffbehandlung versucht zu replizieren. Da außerdem der P450/CPA-Mechanismus der Zellzerstörung sich von dem von HSV-TK/Ganciclovir und anderen therapeutischen Genen unterscheidet (Trojan et al., oben; Yu et al., oben), ist es möglich, diese zu kombinieren, um additive Wirkungen zu erhalten. Die Verwendung von viralen Vektoren, die keine DNA-Replikation für die Genexpression benötigen, könnte ein weiteres Mittel liefern, um Hirntumorzellen, die sich gerade nicht aktiv teilen, zu infizieren. Die Behandlung durch Zufuhr mehrerer Chemosensibilitätsgene zu Tumoren müsste weitere Verfeinerungen in aktuellen klinischen Regime der Chemotherapie menschlicher Tumore ermöglichen.
Die Mausfibroblastenlinie (R450-2), die für unsere Untersuchungen verwendet wurde, exprimiert P450 2B1-Aktivität. Es wird auch angenommen, dass sie defekte Retrovirusvektoren erzeugt, die das Cytochrom P450 2B1-Gen tragen. Es ist zur Zeit nicht klar, ob die Tumorregression, die durch die Verpflanzung dieser Zellen in den Tumor vermittelt wird, durch die Freisetzung toxischer CPA-Metabolite aus den P450 2B1-exprimierenden Fibroblasten und/oder durch die retrovirusvermittelte Übertragung des P450 2B1-Gens auf Nachbarzellen verursacht wird. Vermutlich könnten Tumorzellen entweder durch die Aufnahme aktiver Metabolite oder durch die intrazelluläre Erzeugung dieser Metabolite abgetötet werden. In jedem Fall müsste es möglich sein, das Cytochrom P450 2B1-Gen in eine Vielzahl von peripheren und Hirntumoren durch die Verwendung viraler und nicht-viraler Vektoren zu übertragen (Short et al., oben); Boviatsis et al., oben; Chiocca et al., oben). Die intrazelluläre Erzeugung von aktiven CPA-Metaboliten scheint einen sehr potenten „Tumorabtötungseffekt" zu produzieren; es wurde in Beispiel 5 demonstriert, dass die Aktivierung von CPA in den P450 2B1-exprimierenden Zellen Zytotoxizität auf Nachbarzellen in einer Weise übertragen kann, die analog zum „Bystander"-Effekt ist, welcher bei HSV-TK beobachtet wird (Moolten et al., (1990), oben; Ezzedine et al., oben; Takamiya et al., (1992), oben; Freeman et al., J. Cell. Biochem. 16F:47 (1992), und Freeman et al., Cancer Res. 53:5274-5283 (1993); Culver et al., oben; Li Bi et al., Hum. Gene Ther. 4:725-731 (1993)).
Die Einführung von Fibroblasten, die das Cytochrom P450 2B1-Gen exprimieren, in parenchymale gliomatöse Tumoren war äußerst wirksam gegen meningeale Neoplasien im Mäusehirn. Die meningeale Ausbreitung von Tumorzellen peripheren (Melanome, Lungen- und Brustkarzinome), hämatologischen (Lymphom) und glialen Ursprungs (Ependymom und Glioblastom) ist ein schnell tödlich wirkender Typ von Krebs, der als meningeale Neoplasie und/oder Karzinomatose bezeichnet wird (Beerman, W.F., JAMA 58:1437-1439 (1912); Olson et al., Arch. Neurol. 30:122-137 (1974)). Während das Wachstum parenchymaler solider Tumoren zeitweilig durch Chirurgie und/oder Strahlung eingeschränkt werden kann, ist die Tumorausbreitung in die Meningen durch diese therapeutischen Modalitäten nicht gut zu beherrschen. Wirkstofftherapien haben auf Grund der systemischen Toxizität und der für das Zentralnervensystem, des mangelhaften Durchgangs durch die Blut-Hirn-Schranke und der Entwicklung von zellulärer Resistenz einen begrenzten Erfolg gehabt (Henson et al., „Meningeal Carcinomatosis", in Cancer Medicine, Holland et al., Hrsg., Lea and Febiger, Philadelphia, PA (1993), S. 2268-2286). Die Hirntumoren, die sich in dem in unseren Untersuchungen verwendeten Tiermodell entwickelten, bestanden in erster Linie aus C6-Gliomen, weil keine Tumoren von CRELacZ-Fibroblasten, die allein in das Parenchym thymusloser Mäuse verpflanzt wurden, gebildet wurden (unveröffentlichte Ergebnisse). Bei unseren Experimenten resultierte die relative Differenz in der Fähigkeit von CPA, eine Regression von meningealen im Vergleich zu parenchymalen Hirntumoren herbeizuführen, wahrscheinlich aus zwei Faktoren: 1) die flüssigkeitsgefüllten und verstreuten Räume, die von den Schichten der Piamater, Arachnoidea und Dura der meningealen Abdeckung des Gehirns umschlossen sind, ermöglichten eine wirksamere Wechselwirkung von Tumorzellen mit Fibroblasten, Retrovirusvektoren, CPA und/oder sezernierten Cyclophosphamidmetaboliten, und 2) der erhöhte interstitielle Druck innerhalb des parenchymalen Hirntumors behinderte die wirksame Zufuhr von Produzentenzellen und Prodrug. Es ist wahrscheinlich, dass Ausweichmodi der Verabreichung von CPA, wie z.B. durch die Arterien, die den Tumor versorgen, zu einer effektiveren Behandlung eines parenchymalen soliden Hirntumors führen können. Eine bessere „Mischung" zwischen Tumorzellen und Produzentenzellen könnte durch die chirurgische Verringerung der soliden Tumormasse oder durch eine Konvektionszufuhr des viralen Vektors erreicht werden.
Die Verwendung des Cytochrom P450 2B1-Gens als bedingtes Abtötungsgen in der Krebsgentherapie sollte die therapeutische Wirksamkeit von CPA verstärken, indem es ermöglicht, hohe Spiegel von zytotoxischen Metaboliten im Tumor selbst zu erzeugen, wobei minimale Spiegel von zytotoxischen Metaboliten innerhalb anderer Zellen erzeugt werden. Dieser Ansatz kann möglicherweise mit der Hemmung der Leber-Cytochrom P450 2B1-katalysierten CPA-Aktivierung kombiniert werden, um die Einwirkung systemischer Toxizität aus den Metaboliten des Prodrug auf den Patienten zu minimieren. Weiters sollte es wirksamer als das gegenwärtig verwendete HSV-TK-Gen bei der Abtötung von Tumorzellen sein, die sich am Ende der Behandlung gerade nicht teilen.
Beispiel 6
Bei diesem Beispiel wurden die Beteiligung des programmierten Zelltodes (PCD) und das Ausmaß zusätzlicher zytotoxischer Effekte in kultivierten C6-Gliomzellen, die dem Therapieparadigma von CPA/Cytochrom P450 2B1 ausgesetzt waren, bewertet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass CPA zum PCD von Zellen führt, die das Cytochrom P450 2B1-Gen exprimieren. Toxizität tritt auch in benachbarten C6-Gliomzellen auf, die das CPA-aktivierende P450 2B1-Genprodukt nicht exprimieren. Dieser zytotoxische „Bystander"-Effekt (Umgebungs-Effekt) resultiert aus zwei Mechanismen: 1) einem „zellvermittelten" Mechanismus, der die Nähe von P450-exprimierenden Zellen und naiven Tumorzellen erfordert, und 2) einem „sekretorischen" Mechanismus, der von P450-exprimierenden Zellen durch das Medium auf naive Tumorzellen übertragen wird.
Weiters wurde durch Verwendung pharmakologischer Analoga von CPA, die entweder in Phosphoramid-Lost (PM) oder in Acrolein konvertiert werden, festgestellt, dass der PM erzeugende Stoffwechselweg den Hauptteil an durch Zellnähe vermittelter Zytotoxizität beitrug, während der Acrolein erzeugende Stoffwechselweg primär für die Zytotoxizität verantwortlich war, die durch Absonderung in das Medium vermittelt wurde.
Material und Methoden
Chemikalien und Zelllinien: Cyclophosphamid (CPA) wurde von Sigma gekauft. CPA-Analoga, frans-4-Phenylcyclophosphamid (T4P) und Didechlorcyclophosphamid (DCPA) (Cox, P.J., Biochem. Phramacol. 628:2045-2049 (1979); Plowchalk et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 107:472-481 (1991)) wurden freundlicherweise von Dr. Susan M. Ludeman (The Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore, Maryland) zur Verfügung gestellt. Die Zelllinien, C6-Neo (vorher in Beispiel 5 CNEO-1 genannt, oben) und C6-P450 (vorher in Beispiel 5 C450-8 genannt, oben), wurden durch Transfektion von Ratten-C6-Gliomzellen (Benda et al., Science 161:370-371 (1969)) mit Plasmiden, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen trugen, und mit der cDNA für Ratten-Cytochrom P450 2B1 erzeugt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Cytochrom P450 ist am aktivsten bei der Metabolisierung von CPA unter den getesteten elf anderen Rattenleber- P450-Enzymen (Clarke et al., Cancer Res. 49:2344-2350 (1989)). Die Zellen wurden in Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) mit einem hohen Glucosewert (Kat.-Nr. 10-013-LM, CELLGRO^TM) gezüchtet, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 100.000 E/l Penicillin und 100 mg/l Streptomycin (Sigma) in einem Inkubator mit 5 % CO₂ ergänzt wurde.
Koloniebildungstest: Für Koloniebildungstests wurden Zellen mit einer Dichte von 1.000 Zellen/10 cm Schale in dreifacher Ausführung auf Platten aufgetragen. Die Klonierungseffizienz betrug etwa 25 % für Kontrollkulturen. Am nächsten Tag wurden 0,5 mM CPA hinzugefügt, und die Inkubation wurde über sechs Tage durchgeführt. Die Zellen wurden dann einmal mit Hanks gepufferter Kochsalzlösung (GIBCO) gespült, mit Giemsa gefärbt (Fisher Diagnostics), und Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm wurden gezählt.
Zellproliferationstests: Für Zellproliferationstests wurden Zellen (2 × 10⁵ pro Schale, wenn nicht anders angegeben) in 10 cm Schalen ausplattiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden CPA, T4P oder DCPA bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzugefügt. Die Inkubation wurde vier Tage lang fortgesetzt, und Zellzahlen wurden nach dem Abschöpfen in Trypsin-EDTA mittels Coulter-Zähler (Coulter Electronics Inc.) analysiert.
Trypsinierung und Wiederausplattierungstest: Zur Bestimmung der zeitlichen Kinetik der CPA-vermittelten Zytotoxizität wurden 2 × 10⁶ Zellen auf jede 10 cm-Schale ausplattiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden 0,5 mM CPA hinzugefügt, und die Zellen wurden für die in den Abbildungen angegebenen Dauer inkubiert. Die Zellen wurden dann trypsiniert und mit einer Dichte von 2 × 10³ Zellen/10 cm Schale ausplattiert. Neun Tage später wurden die Zellen mittels Coulter-Zählung bewertet.
Test des sekretorischen Effektes: Zur Bewertung des Effektes des konditionierten Mediums wurden Zellen in Schalen mittels des „Einfügesystems" (Falcon) co-kultiviert. Dieses besteht aus Gewebskulturschalen (Durchmesser = 3,5 cm), die eine Mikroporenmembran enthalten (Porendurchmesser = 0,45 μm), welche die Zellpopulationen in der oberen und unteren Kammer physisch trennt, aber den Austausch von Komponenten im Medium ermöglicht. C6-Zellen (3,4 × 10⁵ Zellen) wurden in die untere Kammer ausplattiert, während C6-P450-Zellen (3,4 × 10⁵ Zellen) in die obere Kammer (oben auf dem Filter) in einem Gesamtvolumen von 5 ml Medium ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht wurden 0,6 mM CPA dem Medium zugesetzt. Vier Tage später wurde die Membran, auf der die C6-P450- oder C6-Neo-Zellen wuchsen, entfernt, und dann wurde die Zahl der C6-Gliomzellen in der unteren Kammer durch Zählen mit einem Coulter-Apparat ermittelt. Die überlebenden C6-Zellen wurden dann mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro 10 cm Schale ohne CPA wieder ausplattiert. Neun Tage später wurden diese Zellen trypsiniert und mit einem Coulter-Apparat gezählt.
Co-Kulturtest: Co-Kulturen von C6-P450- und C6-Zellen wurden in dreifacher Ausführung in verschiedenen Verhältnissen (wobei 0, 10, 50, 90 und 100 % der Zellen C6-P450-Zellen waren) inkubiert, um eine Gesamtzahl von 2 × 10⁶ Zellen pro 10 cm Schale zu erreichen. Nach 24 Stunden wurden 0,5 mM CPA hinzugefügt, und vier Tage später wurden die Zellen gezählt, wie vorher beschrieben. Um die Abtötung, die durch Zellkontakt erreicht wurde, mit der zu vergleichen, die durch Einwirkung des konditionierten Mediums erhalten wurde, wurde der Überstand aus jeder Co-Kultur geerntet, durch 0,45 μm-Membranfilter gefiltert, 1:1 mit 5 ml frischem Medium gemischt und über Nacht gelagerten Kulturen von C6-Zellen (2 × 10⁶ Zellen pro 10 cm Schale in dreifacher Ausführung) hinzugefügt. Vier Tage später wurden C6-Zellen gewaschen, geerntet und gezählt. Um die Spezifität des zellvermittelten Abtötungseffektes aus Co-Kulturtests zu bestimmen, wurden C6-Zellen über Nacht mit C6-Zellen, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen (C6-Neo) exprimierten, mit bestrahlten C6-Zellen, mit bestrahlten C6-Neo-Zellen und mit bestrahlten C6-P450-Zellen inkubiert. Die γ-Bestrahlung wurde dadurch durchgeführt, dass die Zellen insgesamt 6000 rad ausgesetzt wurden, die von einer ⁵¹Chrom-Quelle emittiert wurden. Zellen, die einer Strahlung in dieser Höhe ausgesetzt waren, proliferierten nicht, blieben aber an den Gewebskulturschalen sieben Tage lang haften, bevor sie sich ablösten und ihre Lebensfähigkeit verloren.
Genomische DNA-Analyse: Die genomische DNA wurde aus C6- und aus C6-P450-Zellen extrahiert, die CPA verschieden lang ausgesetzt gewesen waren, wozu ein handelsübliches Set (Nucleon^TM, ScotLab) verwendet wurde. Die DNA wurde aus den Zellen, die anhafteten, und aus den Zellen, die ihre Lebensfähigkeit verloren hatten und im Überstand schwammen, gewonnen. DNA (1 μg) von jedem Zeitpunkt wurde durch Elektrophorese auf 1 % Agarosegel analysiert.
Statistische Tests: Alle Signifikanztests wurden mit Hilfe der Software Sigmastat (Jandel Corporation, San Rafael, CA) durchgeführt.
Ergebnisse
Wirkung von CPA auf die Proliferation von C6-Zellen, die das Cytochrom P450 2B1-Gen exprimieren: Die Erzeugung der Zelllinien C6-P450 (vorher als C450-8 bezeichnet) und C6-Neo (vorher als CNeo-1 bezeichnet) ist beschrieben worden (Wei et al., Hum. Gene Ther. 5:969-978 (1994)). Diese Zelllinien wurden von C6-Gliomzellen abgeleitet, welche stabil mit dem Ratten-Cytochrom P450 2B1-Gen bzw. dem Neomycin-Phosphotransferase-Gen transfiziert wurden. 20A zeigt, dass C6-, C6-P450- und C6-Neo-Gliomzellen mit ähnlichen Raten bei Fehlen von CPA proliferieren. In Gegenwart von 0,5 mM CPA jedoch gab es eine selektive und vollständige Wachstumshemmung der C6-P450-Zellen im Verlaufe von 10 Tagen.
Der Tod der Zellen, die das Cytochrom P450 2B1-Gen exprimieren, tritt innerhalb von Stunden nach der Einwirkung von CPA ein: Um den Zeitverlauf der Abtötungswirkung von CPA zu untersuchen, wurde ein Trypsinierungs- und Wiederausplattierungstest durchgeführt: 2 × 10⁶ Zellen wurden 0,5 mM CPA über verschiedene Zeitdauern ausgesetzt (Impulsperiode). Die Zellen wurden dann gewaschen und trypsiniert, um überschüssiges Prodrug und/oder Metabolite zu entfernen, und mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro 10 cm Schale wieder ausplattiert. Die Zellen wurden neun Tage später gezählt. Tabelle III zeigt, dass ein 3-Stunden-Impuls von CPA ausreichend war, um das Wachstum der wieder ausplattierten C6-P450-Zellen vollständig zu hemmen. Die Proliferation der wieder ausplattierten elterlichen C6-Gliomzellen war unbeeinflusst durch das CPA, selbst nach einer 96stündigen Einwirkung des Wirkstoffs. Dieser Nachweis, dass der Abtötungseffekt von CPA auf Zellen innerhalb von 3 Stunden vollständig ist, zeigt an, dass CPA in den C6-P450-Zellen schnell in einen oder mehrere seiner zytotoxischen Metabolite konvertiert wird.
Übertragung zytotoxischer Metabolite auf naive C6-Zellen durch Medium, das von C6-P450-Zellen abgeschöpft wurde: Die Erzeugung von toxischen Metaboliten könnte einen zytotoxischen Effekt auf benachbarte Zellen ausüben. Die Erfinder haben daher versucht zu bestimmen, ob konditioniertes Medium den zytotoxischen Effekt von CPA, das von C6-P450-Zellen metabolisiert wurde, auf elterliche C6-Zellen übertragen konnte. Das konditionierte Medium wurde von C6- oder C6-P450-Zellen geerntet, die dem CPA über die in Tabelle IV angegebenen Zeiten ausgesetzt waren, und wurde dann den C6-Gliomzellen hinzugefügt, um ihre Koloniebildungsfähigkeit zu beurteilen. Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, dass eine 3stündige Einwirkung von CPA auf C6-P450-Zellen ausreichend war, um ein konditioniertes Medium zu erzeugen, das bei Hinzufügen zu C6-Zellen deren Klonierungseffizienz um etwa 45 % verringerte. Die Hemmaktivität dieses konditionierten Mediums erhöhte sich mit der Zeit der Einwirkung von CPA auf die C6-P450-Zellen. Die vollständige Hemmung der Koloniebildung von C6-Zellen wurde durch Inkubation mit dem abgeschöpften Medium aus C6-P450-Zellen erreicht, die dem CPA 24 Stunden lang ausgesetzt gewesen waren (Tabelle IV). Dies zeigt an, dass die mit CPA behandelten C6-P450-Zellen lösliche toxische Metabolite abgeben, die sich im Medium ansammeln. Da der CPA-Metabolit, PM, nicht gut durch die Zellmembranen diffundiert (Genka et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 27:1-7 (1990)), ist es wahrscheinlich, dass die aktiven Metabolite in diesem Medium die diffundierbaren Metabolite waren, d.h. 4-HCPA und/oder Acrolein. Die Abtötung von C6-Zellen durch das Medium, das durch CPA-behandelte C6-P450-Zellen konditioniert wird, wird hier als „sekretorischer Effekt" bezeichnet.
Um weiter die Anwesenheit von einem oder mehreren sezernierten zytotoxischen Metaboliten zu demonstrieren, wurden C6- und C6-P450-Zellen (Verhältnis 1:1) kultiviert, wobei Falcon-Co-Kultureinsätze verwendet wurde, die für die physische Trennung der zwei Zelltypen durch Verwendung eines Mikroporenfilters sorgen, dabei jedoch die freie Diffusion ihrer Überstände ermöglichen. Als Kontrolle wurden C6- und C6-Neo-Zellen (Verhältnis 1:1) ebenfalls mit dieser Anordnung ausplattiert. Dem Kulturmedium wurde CPA hinzugefügt, und die Zahl der C6-Zellen im unteren Kulturkompartiment wurde vier Tage später ermittelt. Bei diesen Kulturbedingungen gab es eine etwa 50 %ige Verringerung der Zahl der C6-Zellen, die unter diesen Bedingungen mit C6-P450-Zellen in Gegenwart von CPA co-kultiviert wurden (21A) im Vergleich zu C6-Zellen, die mit C6-P450-Zellen bei Fehlen von CPA co-kultiviert wurden, oder C6-Zellen, die mit C6-Neozellen co-kultiviert wurden. Wenn diese C6-Zellen durch Trypsinierung und Wiederausplattierung angeregt wurden, sich zu vermehren, wurden die toxischen Wirkungen von CPA-Metaboliten, die von C6-P450-Zellen erzeugten wurden, verstärkt, was zu einer etwa 90 %igen Verringerung der Zahl der C6-Zellen führte. Daher können ein oder mehrere kleine lösliche zytotoxische Faktoren oder Metabolite durch das Kulturmedium von P450-positiven auf P450-negative Tumorzellen übertragen werden.
Endonukleolytische Spaltung von DNA in C6-P450-Zellen nach Einwirkung von CPA: Die Erfinder wollten als nächstes bestimmen, ob ein programmierter Zelltod (PCD) zu den wachstumshemmenden Wirkungen des Therapieparadigmas der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie beitrug. Eines der Kennzeichen des CPD ist die endonukleolytische Spaltung chromosomaler DNA (Wyllie, A.H., Nature 284:555-556 (190)). Genomische DNA wurde aus C6- oder C6-P450-Zellen isoliert, die unterschiedlich lange CPA ausgesetzt waren. 22A zeigt, dass genomische DNA aus C6-P450-Zellen die Nuldeosom-Leiterbildungskennzeichen des PCD, 72 Stunden nach der Einwirkung von CPA, aufwies. Im Gegensatz dazu war genomische DNA aus C6-Zellen selbst 4 Tage nach Einwirkung von CPA intakt. PCD ist daher am zellulären Tod beteiligt, der beim Therapieparadigma der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie beobachtet wurde.
Ein zellvermittelter Effekt trägt ebenfalls zur Zytotoxizität bei: Die Erfinder versuchten zu bestimmen, ob ein zellvermittelter Effekt zum Therapieparadigma der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie beitrug. 23A zeigt, dass eine 75 %ige Verringerung der Proliferation von C6-Zellen (von 28 × 10⁶ auf 8 × 10⁶ Zellen) als Reaktion auf CPA im Verlauf von 4 Tagen auftrat, wenn die Co-Kultivierung von C6- und C6-P450-Zellen so durchgeführt wurde, dass 10 % der Zellen in einer Schale das P450-Gen exprimieren. Wenn die Zahl der co-kultivierten Zellen, die das P450-Gen enthalten, auf 50 % erhöht wurde, gab es einen proportionalen Anstieg der Verringerung der C6-Zellproliferation auf etwa 85 % (von 28 × 10⁶ auf 2 × 10⁶ Zellen) als Reaktion auf das CPA. Wenn die Zahl der C6-P450-Zellen weiter erhöht wurde, so dass sie 90 % der Zellen in einer Schale ausmachten, gab es eine vollständige Hemmung der Proliferation der restlichen C6-Zellen über den 4-Tage-Zeitraum der Einwirkung von CPA. Die Erfinder schließen daraus, dass das Wachsen der zwei Zellpopulationen in enger Nachbarschaft zueinander ein starker Vermittler der transzellulären Toxizität im Therapieparadigma der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie ist.
In einer Kontrolluntersuchung stellen C6-Zellen 90 % der Zellen in der Schale dar, während die restlichen 10 % der Zellen aus folgenden bestand: a) C6-Neo-Zellen, b) bestrahlte C6-Zellen, c) bestrahlte C6-Neo-Zellen oder d) bestrahlte C6-P450-Zellen (23B). Es war offensichtlich, dass die Co-Kultur mit C6-Neo-Zellen die Proliferation von C6-Zellen nicht beeinträchtigt hat (Spalte 2). Es war auch offensichtlich, dass die Abtötung von C6-Zellen durch Bestrahlung keine Toxizität für die übrigen naiven C6-Zellen vermittelt hat (Spalte 3). Es gab eine kleine, aber statistisch nicht signifikante Verringerung (p > 0,1, Student'scher t-Test) in der Proliferation von C6-Zellen, die mit bestrahlten C6-Neo-Zellen co-kultiviert wurden (Spalte 4). Es gab jedoch eine statistisch signifikante Verringerung (30 %) in der Proliferation von C6-Zellen, die mit bestrahlten C6-P450-Zellen co-kultiviert wurden (Spalte 5) (p < 0,01, Student'scher t-Test). Dies wies darauf hin, dass die bestrahlten C6-P450-Zellen in der Lage waren, CPA so stark zu aktivieren, dass dies zur Vermittlung von Toxizität an benachbarte C6-Zellen ausreichte.
Der Überstand aus der zellvermittelten Abtötung ist zytotoxisch: Zur Beurteilung, ob toxische Metabolite im Medium der in 23A beschriebenen Co-Kulturen vorhanden waren, wurden die Überstände aus jeder Co-Kultur nach der viertägigen Einwirkung von CPA abgeschöpft und naiven C6-Zellen (2 × 10⁶ Zellen) hinzugefügt. Vier Tage später wurden diese Zellen gezählt. 24 zeigt, dass es keine Hemmung der Proliferation von C6-Zellen gab, die dem konditionierten Medium aus den Co-Kulturtests ausgesetzt wurden, bei denen 0, 10 oder 50 % der Zellen das P450 2B1-Gen enthielten. Es gab eine etwa 30 %ige Verringerung in der Proliferation von C6-Zellen, die dem konditionierten Medium nach Ernten aus den Tests ausgesetzt wurden, bei denen 90 oder 100 % der Zellen das P450-Gen enthielten (p < 0,05, Student'scher t-Test). Diese Ergebnisse zeigen an, dass zytotoxische Faktoren im Medium von Co-Kulturtests vorhanden waren, bei denen es eine große Mehrzahl von C6-P450-Zellen gab, und weisen darauf hin, dass nach vier Tagen CPA-Behandlung sezernierte zytotoxische Metabolite zum zellvermittelten Tod von C6-Zellen beitrugen. Jedoch zeigte das Ergebnis, dass dieses Medium nur dann zytotoxisch war, wenn 90 % der Zellen in der Schale C6-P450-Zellen waren, dass das Züchten der zwei Zellpopulationen in unmittelbarer Nähe über vier Tage zu einer wirksameren CPA-vermittelten Abtötung der naiven C6-Zellen führte. Die Varianz in der wachstumshemmenden Stärke des sekretorischen Effekts, die in den Ergebnissen von 24 beschrieben wird, im Vergleich zu der von Tabelle IV und 21 kann durch die relative Instabilität des in das Medium abgegebenen 4-HCPA und Acroleins erklärt werden. In den in Tabelle IV und 21 aufgeführten Experimenten wurden diese Metabolite frisch von den P450 2B1-positiven Tumorzellen erzeugt, und das konditionierte Medium hat wahrscheinlich eine stärkere Toxizität an die P450 2B1-negativen Tumorzellen abgegeben. Bei dem in diesem Abschnitt aufgeführten Experiment wurde das Medium aus vier Tage alten Kulturen geerntet, und die meisten Metabolite hatten sich wahrscheinlich zersetzt, was das Ausmaß des sekretorischen Effektes verringerte.
Charakterisierung der verschiedenen CPA-Bioaktivierungswege: Die Bioaktivierung von CPA durch Cytochrom P450 2B1 erzeugt 4-Hydroxycyclophosphamid (4-HCPA), eine instabile Verbindung, die weniger lipophil ist als der Ausgangswirkstoff. 4-HCPA zerfällt dann und erzeugt Acrolein und Phosphoramid-Lost (PM). Um die relativen Beiträge der Acrolein- und PM-erzeugenden Stoffwechselwege in der zellvermittelten und sekretorischen Toxizität von CPA einzuschätzen, benutzten wir CPA-Analoga, die bei biologischer Aktivierung nur den einen oder den anderen toxischen Metaboliten erzeugen: T4P wird in PM ohne Bildung von Acrolein metabolisiert, während DCPA in Acrolein ohne Bildung von PM konvertiert wird (Cox, P.J., Biochem. Pharmacol. 28:2045-2049 (1979); Plowchalk and Mattison, Toxicol. Appl. Pharmacol. 107:472-481 (1991)). In einem Zellproliferationstest übertrug T4P Zytotoxizität auf C6-Gliomzellen (20 % Hemmung der Zellproliferation im Vergleich zu unbehandelten C6-Zellen, Tabelle V – Teil A, p < 0,05, Student'scher t-Test), während CPA und DCPA keinen Effekt auf die Proliferation von C6-Zellen hatten. Jedoch hatte T4P einen noch größeren Effekt auf C6-P450-Zellen, wobei ihre Proliferation um 79 % im Vergleich zu unbehandelten C6-P450-Zellen gehemmt wurde (p < 0,001, Student'scher t-Test). DCPA hatte keinen Effekt auf die C6-P450-Zellproliferation, während CPA den größten Effekt aufwies, da es nicht nur die Zellproliferation vollständig hemmte, sondern zu einer tatsächlichen Verringerung der Zellzahl führte (von 2 × 10⁶ auf 1,15 × 10⁶ restliche Zellen im gezeigten Experiment).
Um den wachstumshemmenden Effekt von T4P und CPA weiter zu bestätigen, wurde der Trypsinierungs- und Wiederausplattierungstest verwendet (Tabelle V – Teil B). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Proliferation von C6-Zellen festgestellt, die mit den oben genannten Verbindungen behandelt worden waren. Im Gegensatz dazu wurde die Proliferation von C6-P450-Zellen, die mit CPA oder T4P behandelt wurden, vollständig gehemmt. DCPA hatte unter diesen Bedingungen keinen Effekt.

Ein Koloniebildungstest wurde dazu benutzt, den sekretorischen Effekt zu untersuchen (Tabelle V – Teil C). Konditioniertes Medium aus jeder der behandelten Gruppen (in Tabelle V – Teil A) wurde C6-Zellen zugesetzt. Neun Tage später zeigte die Zählung der C6-Kolonien, dass das konditionierte Medium, welches von DCPA- oder CPA-behandelten C6-P450-Zellen geerntet wurde, hoch toxisch für das Wachstum von C6-Zellen war. Im Gegensatz dazu hatte das konditionierte Medium, das von T4P-behandelten C6-P450-Zellen geerntet wurde, minimale Effekte auf die C6-Koloniebildung. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse an, dass der Acrolein erzeugende Stoffwechselweg (der durch DCPA repräsentiert wird) in erster Linie am sekretorischen Effekt beteiligt ist, mit minimaler Beteiligung des PM-erzeugenden Stoffwechselweges (der durch T4P repräsentiert wird). Jedoch entspricht bei einem Zellproliferationstest, bei dem es einen stärkeren Zell-Zell-Kontakt gibt als in einem Koloniebildungstest, der PM-aktivierende Stoffwechselweg dem signifikanteren operativen Mechanismus der Wachstumshemmung. Dies weist darauf hin, dass der letztere Stoffwechselweg eventuell einen wichtigen Beitrag zur zellvermittelten Zytotoxizität von CPA leistet.

Tabelle V: Wirkungen verschiedener CPA-Analoga auf C6-P450-Zellen ^a
		Kontrolle	CPA	T4P	DCPA
A	Zellproliferationstest ^b
	C6	20,73 ± 0,66	21,10 ± 1,37	16,6 ± 0,87*	21,51 ± 0,43
	C6-P450	26,67 ± 1,39	1,15 ± 0,11*	5,59 ± 0,07*	22,57 ± 0,44
B	Trypsinierungs- und Wiederausplattierungstest ^c
	C6	21,65 ± 0,34	21,48 ± 0,38	19 ± 1,03	20,58 ± 0,33
	C6-P450	22,27 ± 0,32	0,11 ± 0,01*	0,31 ± 0,07	21,29 ± 0,17
C	Sekretionseffekt: CM aus ^d
	C6	310 ± 10,7	271 ± 14,2	277 ± 1,8	301 ± 4,6
	C6-P450	296 ± 6,2	0	279 ± 3	5 ± 0,9*
a: 2 × 10⁶ C6- oder C6-P450-Zellen wurden in eine 10 cm Schale in dreifacher Ausführung ausplattiert. Am nächsten Tag wurden 0,5 mM CPA, T4P, DCPA oder Kontrollmedium jeder Schale hinzugefügt. Nach vier Tagen Inkubation wurden die Zellen trypsiniert und gezählt. b: In Teil A wurde die Zahl der C6- oder C6-P450-Zellen in jeder Schale vor her bestimmt und als Mittelwert (× 10⁶) ± SE ausgedrückt. c: In Teil B wurde ein Trypsinierungs und Wiederausplattierungstest durch Trypsinieren der überlebenden Zellen am Ende des Experiments in Teil A und dann durch ihr Wiederausplattieren mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro 10 cm Schale in frisches Medium in dreifacher Ausführung durchgeführt. Neun Tage später wurden die Zellen trypsiniert und gezählt. d: In Teil C wurde ein Test des sekretorischen Effekts durch Abschöpfen der konditionierten Medien aus jeder Kultur am Ende des Experimentes in Teil B und durch ihr Hinzufügen zu über Nacht aufbewahrten Kulturen von 1000 C6-Zellen pro 10 cm Schale aus geführt. Die Koloniezahl wurde als Mittelwert ± SE ausgedrückt. * Werte stellen eine statistisch signifikante Änderung dar.

Diskussion
Cytochrom P450 2B1-Gentherapie für Krebs: Die Erfinder haben entdeckt, dass die Einfügung des Ratten-Cytochrom P450 2B1-Transgens in Tumorzellen, um sie empfindlich für die antitumorale Wirkung von Cyclophosphamid zu machen, das Versprechen als neuartige therapeutische Strategie gegen Tumoren hält. Beispiel 5 zeigt, dass Fibroblasten, die genetisch so verändert wurden, dass sie einen Retrovirusvektor erzeugen, der das oben genannte Gen trägt, eine Tumorregression in Tiermodellen von peripheren und Hirntumoren induzieren.
In diesem Beispiel haben die Erfinder versucht, die zytotoxischen Mechanismen aufzuklären, die zur Wirksamkeit dieser Gentherapiestrategie beitragen. Die Hauptziele dieser Untersuchung waren a) die Feststellung, ob die Cyclophosphamid-induzierte Toxizität von P450 2B1-positiven Tumorzellen mit dem programmierten Zelltod verbunden war, b) die Einschätzung, ob die Expression des P450 2B1-Gens in Tumorzellen auch P450 2B1-negative Tumorzellen für Cyclophosphamid empfindlich machen würde („Bystandereffekt"), und c) die Charakterisierung der CPA-aktivierenden Stoffwechselwege, die zu dieser „Bystander"- Sensibilisierung beitragen. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Zytotoxizität auf naive Tumorzellen sowohl durch das konditionierte Medium („sekretorischer” Effekt) als auch durch das Wachstum in unmittelbarer Nähe („zellvermittelter” Effekt) übertragen wird und dass diese Zytotoxizität schließlich mit PCD verbunden ist. Die aktuellen Gentherapieverfahren ermöglichen keine Übertragung eines therapeutischen Gens in alle Tumorzellen und daher sorgen die Ergebnisse dieses Berichts für die Unterstützung für einen Gentherapieansatz, der das CPA/Cytochrom P450 2B1-Paradigma verwendet.
Drei Tests des Zellwachstums wurden verwendet, um diese Mechanismen zu bewerten: ein Zellproliferationstest, ein Koloniebildungstest und ein Trypsinierungs- und Wiederausplattierungstest. Der erste Test ist wahrscheinlich der unempfindlichste, da Tumorzellen mit einer relativ hohen Dichte ausplattiert wurden und innerhalb von 2-4 Tagen ein Zusammenfließen erreichen, was wenig Zeit für die effektive antitumorale Wirkung eines Wirkstoffs lässt, dessen zytotoxisches Potenzial während der Zellteilung manifest wird. Der zweite Test ist empfindlicher, da Zellen in äußerst niedrigen Dichten (1000 Zellen pro 10 cm Schale) ausplattiert werden und zur Bildung einer Kolonie die einzelnen Zellen proliferieren und der zytotoxischen Wirkung über mehrere Tage widerstehen müssen. Beim dritten Test werden die Zellen dem Prodrug für einen kurzen Zeitraum ausgesetzt und werden dann in niedriger Dichte bei Fehlen des Prodrug wieder ausplattiert, was die Messung der Fähigkeit der behandelten Zellen erlaubt, sich vom zytotoxischen Effekt des Wirkstoffs zu erholen.
Zellvermittelte Toxizität: Die Toxizität von CPA kann auf Tumorzellen übertragen werden, die kein Cytochrom P450 2B1 exprimieren, sowohl durch Zellkontakt (zellvermittelter Effekt) als auch durch das Medium (sekretorischer Effekt). Der zellvermittelte Effekt ist als Abtötungseffekt definiert, der erreicht wird, wenn naive Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu Prodrug-metabolisierenden Zellen gezüchtet werden. Der sekretorische Effekt ist als Abtötungseffekt definiert, der durch die Einwirkung mediumkonditionierter oder Prodrugmetabolisierender Zellen auf reine Populationen naiver Tumorzellen erreicht wird.
Mehrere Eigenschaften scheinen den zellvermittelten Effekt zu bestimmen. Dieser Effekt erfordert die Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens, da die Co-Kultur mit bestrahlten C6- oder C6-Neo-Zellen in Gegenwart von CPA keine Zytotoxizität verleiht. Dieser zellvermittelte Effekt ist insofern inkremental, als die vollständige Hemmung der Zellproliferation und eine Verringerung der Zahl der Tumorzellen durch Erhöhen des Prozentsatzes der Zellen erreicht werden kann, die das Cytochrom P450 2B1-Gen exprimieren. Dieser Effekt scheint auch irreversibel zu sein, insofern als Zellen sogar nach einem kurzen CPA-Impuls, gefolgt von Waschung und Wiederausplattierung, um überschüssiges Prodrug zu entfernen, weiterhin sterben.
Der sekretorische Effekt: Das Vorhandensein des sekretorischen Effekts unterscheidet das Therapieparadigma der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie von anderen Arten, wie z.B. von der Therapiestrategie mit dem Ganciclovir/Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK-)Gen (Moolten, F.L., Cancer Res. 46:5276-5281 (1986); Freeman et al., Cancer Res. 53:5247-5283 (1993); Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614 (1991)). Im Fall der letzteren Gentherapiestrategie ist das konditionierte Medium aus Ganciclovir-behandelten Tumorzellen, die das HSV-TK-Gen enthalten, nicht zytotoxisch für unbehandelte, naive Tumorzellen (Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-450 (1992)), obwohl die toxischen Metabolite über Zellkontakte hinweg übertragen werden können (Li Bi et al., Hum. Gene Ther. 4:725-731 (1993)). Die Erfinder stellen die Hypothese auf, dass die Bildung von sezernierten zytotoxischen Metaboliten in der CPA/Cytochrom P450 2B1-Gentherapie eine therapeutische Verstärkung der Wirkung gegen Tumoren liefert. Auch wenn die sezernierten Metabolite zu einer unerwünschten Toxizität für normale Zellen führen kann, sollte ihre ausschließliche Erzeugung innerhalb des Tumors durch gezielte Genzufuhr die Abtötung von neoplastischen Zellen maximieren und schädigende Wirkungen auf normale Zellen minimieren.
Vergleich des zellvermittelten und des sekretorischen Effekts: Es ist offensichtlich, dass der sekretorische Effekt teilweise zur Zytotoxizität des zellvermittelten Effekts beiträgt. Der letztere ist in Co-Kulturen mit hoher Dichte wirksam, wenn 10 % der Tumorzellen das P450 2B1-Gen tragen, während der erstere im Medium erkennbar wird, in dem die meisten Tumorzellen das P450 2B1-Gen exprimieren. Der zellvermittelte Effekt erzeugt eine vollständige Hemmung des Zellwachstums in Zellproliferationstests (siehe 20B und Tabelle V (A)), selbst nach einer lediglich dreistündigen Einwirkung von CPA (siehe Tabelle III). Der sekretorische Effekt ist nur im empfindlicheren Koloniebildungstest erkennbar, und vollständige Hemmung der Zellproliferation kann durch Einwirkung des Mediums von C6-P450-Zellen, die mehr als 24 Stunden mit CPA behandelt wurden, auf Zellen erreicht werden (siehe Tabelle IV). Weiters gab es nur eine 50 %ige Hemmung der Proliferation von C6-Zellen im Verlauf eines Zeitraums von 4 Tagen, wenn die Einwirkung des Mediums durch Co-Kultivierung von C6- und C6-P450-Zellen in Umgebungsbereichen maximiert wurde, die durch Filter getrennt waren (siehe 21A). Daraus wurde geschlossen, dass der zellvermittelte Effekt ein allgemeinerer Mechanismus der Abtötung von Tumorzellen ist und dass der sekretorische Effekt teilweise zu dieser zellvermittelten Zytotoxizität beiträgt.
Schließlich müsste die Fähigkeit, die onkologische Chemotherapie durch die Zufuhr von Genen zu verstärken, die die intrazelluläre Konversion von Prodrugs in aktive Wirkstoffe ermöglichen, das Erreichen des Ziels maximaler Zytotoxizität für die Tumorzellen bei minimalen Effekten auf normale Zellen ermöglichen. Die Kombination mehrerer Prodrug-Gen-Therapiesysteme, die verschiedene Wirkungsmodi besitzen (zum Beispiel Ganciclovir/HSV-TK-Zielzellen in der S-Phase, während Cyclophosphamid/Cytochrom P450 2B1 auf Zellen in allen Phasen ausgerichtet ist), sowie die Expression von Cytokinen, die die Immunreaktion erweitern, wie z.B. Interleukin-4 (Yu et al., Cancer Res. 53:3125-3128 (1993)), GM-CSF (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-3543 (1993)), und Antisense-RNAs, die den Tumorzell-Metabolismus verändern, wie z.B. IGF-2 (Trojan et al., Science 259:94-97 (1993)), sollte die antitumorale Wirksamkeit der Krebsgentherapie erweitern.
Beispiel 7
In diesem Beispiel wurde die Cyclophosphamid (CPA)-Sensibilität von Ratten-9L-Tumorzellen, die stabil transfiziert wurden, so dass sie Cytochrom P450 2B1 exprimieren, in Kultur und auch nach subkutaner Implantation und Wachstum eines soliden Tumors in den äußeren Oberschenkeln von Fisher-Ratten untersucht. Die CPA-Behandlung von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Tumoren führt zur vollständigen Hemmung des Tumorwachstums. Die Ergebnisse demonstrieren, dass ein systemischer solider, in der Peripherie wachsender Tumor in vivo hoch empfindlich für die Oxazaphosphorin-Behandlung gemacht werden kann, wobei die intratumorale Prodrug-Aktivierung durch die tumorale Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens erreicht wurde.
Material und Methoden
Abkürzungen: 9L-Z, 9L-Zellen, die stabil E. coli-β-Galactosidase exprimieren; 9L-ZP, 9L-Zellen, die stabil E. coli-β-Galactosidase und Ratten-Cytochrom P450 2B1 exprimieren; L450-2, 9L-Zellen, die stabil Cytochrom P450 2B1 exprimieren.
Chemikalien: Cyclophosphamid und Ifosfamid wurden von der Drug Synthesis and Chemistry Branch des National Cancer Institute (Bethesda, MD) bezogen. 4-Hydroperoxycyclophosphamid wurde von Nova Pharmaceutical Corporation (Baltimore, MD) bezogen. Metyparon wurde von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) gekauft.
Stabile Transfektion von 9L-Zellen: Ratten-9L-Gliosarkomzellen (Barker et al., Cancer Res. 33:976-986 (1973)) wurden in Alpha Minimum Essential Medium (GIBCO/BRL, Inc.) gezüchtet, das 10 % fötales Kälberserum, 10 Einheiten/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin enthielt. Die Zellen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂/95 % Luft gehalten. Die 9L-Zellen wurden mit einem Ratten-Cytochrom P450 2B1-Expressionsplasmid (pMT2-Cytochrom P450 2B1, von Dr. Milton Adesnik und Dr. Allison Reiss, NYU Medical Scholl, zur Verfügung gestellt) und dem Plasmid pCMV-βgal.Neo (einem Geschenk von Dr. H. Li, Dana Farber Cancer Institute) in einem molaren Verhältnis von 10:1 unter Verwendung von Lipofectin (GIBCO/BRL, Inc.) entsprechend den Anweisungen des Herstellers co-transfiziert. Das Plasmid pCMV-βgal.NEO enthält ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das Resistenz auf G418 überträgt, und auch das lacZ (β-Galactosidase)-Gen von Escherichia coli, das als Kontrolle dient und einen geeigneten Zellmarker liefert. Stabile Transfektanten wurden unter Auslese in 1 mg/ml G418 (GIBCO/BRL, Inc.) geklont. Es wurden Zelllinien, die gegen G418 resistent sind, geklont, fortgepflanzt und bewertet. L450-2, eine weitere Cytochrom P450 2B1-exprimierende vom 9L Gliosarkom abgeleitete Zelllinie wurden mit anderen Methoden präpariert.
Zur Prüfung auf Wirkstoffsensibilität wurden 1 × 10⁵ Zellen in 30 mm-Gewebskulturplatten (Falcon 3046) in doppelter Ausführung ausplattiert. Wirkstoffe wurden 18-24 Stunden nach dem Beimpfen hinzugefügt. Zellen konnten in Zeiträumen wachsen, die bis zu 5 Tagen nach der Wirkstoffbehandlung umfassten, und dann wurde die Endzellzahl bestimmt. Die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder mit Hanks gepufferter Kochsalzlösung gespült, mit Trypsin-EDTA (GIBCO/BRL, Inc.) dispergiert und dann mit einer Blutzählkammer gezählt. Die Ergebnisse werden als Wachstumsverhältnis ausgedrückt, d.h. als Zahl der Zellen auf Platten, die den Wirkstoff enthalten, als Prozentsatz der entsprechenden wirkstofffreien Kontrollen (Mittelwert ± Bereich der doppelten Bestimmungen).
Co-Kulturexperimente: Elterliche 9L-Zellen wurden in die unteren Container von Kulturplatten (Falcon 3502) ausplattiert, und Cytochrom P450 2B1-negative oder Cytochrom P450 2B1-positive Zellen wurden in 25 mm-Zellkultureinsätze (0,45 μm Porengröße, Falcon 3090) ausplattiert. Die Kulturmedien wurden 18-24 Stunden später durch Absaugen entfernt. Das Kulturmedium ohne Wirkstoff (1,0 ml) wurden zum unteren Container hinzugefügt, und 1,0 ml des Mediums, das den Wirkstoff enthielt, wurde zum oberen Zellkultureinsatz hinzugefügt. Die Zellzahlen wurden 5 Tage später ermittelt, wie oben beschrieben.
Tumorwachstumsverzögerungsuntersuchungen: 9L-Zellen wurden subkutan (s.c.) als solide Tumoren in weiblichen Fischer 344-Ratten gezüchtet. Adulten weiblichen Fischer 344-Ratten (120-150 g) wurden 2 × 10⁶ Zellen pro s.c.-Stelle inokuliert; Cytochrom P450 2B1-negative Zellen (elterliche 9L- oder 9L-Z-Zellen) wurden in einen Oberschenkel injiziert, und Cytochrom P450 2B1-positive Zellen (9L-ZP- oder L450-2-Zellen) wurden in den anderen Oberschenkel injiziert. Diese Strategie wurde dazu verwendet, mögliche Effekte zu kontrollieren, die das subkutane Wachstum des 9L-Tumors auf die Leber-Cytochrom P450-abhängige Cyclophosphamid-Aktivierungsaktivität ausüben könnten. Die Wirkstoffbehandlung wurde sieben Tage nach der Tumorimplantation begonnen. Die Ratten wurden randomisiert und in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe wurde mit Cyclophosphamid mit 100 mg/kg Körpergewicht behandelt, das in einer einzigen intraperitonealen Injektion verabreicht wurde. Einer anderen Gruppe wurde Kochsalzlösung als Kontrolle injiziert. Die Tumorgröße wurde durch Messung mit Lehren nach Zeiträumen überwacht, die bis zu 7-8 Wochen reichten; zu diesen Zeitpunkten wurden die Tiere eingeschläfert.
Western Blot und Cytochrom P450 2B1-Aktivitätsanalyse: Mikrosomale Proteine, die aus kultivierten 9L-Zellen durch Differentialzentrifugierung präpariert worden waren, wurden der Elektrophorese mit 10 % Natriumdodecylsulfat-/Polyacrylamidgel (20 μg Protein/Bande) unterzogen, auf Nitrozellulose übertragen und dann mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Cytochrom P450 2B1-Antikörpern (Waxman and Walsh, J. Biol. Chem. 257:10446-10457 (1982); Waxman, D.J. Methods Enzymol. 206:249-267 (1991)) untersucht. Phenobarbitalinduzierte Rattenlebermikrosomen (1 μg) wurden als positive Kontrolle verwendet. Die Cytochrom P450 2B1-abhängige Enzymaktivität wurde durch Überwachung der 7-Ethoxykumarin O-Deethylierung (Waxman and Walsh, Biochemistry 22:4846-4855 (1983)) und Testosteron-16β-Hydroxylierung (Waxman, D.J., Methods Enzymol. 206:249-267 (1991)) in isolierten mikrosomalen 9L-Fraktionen gemessen.
Ergebnisse
Stabile Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens in 9L-Gliosarkomzellen: 9L-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid, das Ratten-Cytochrom P450 2B1 codiert, und einem β-Galactosidase-Expressionsplasmid, das ein Neomycin-Resistenz-Gen enthält, in einem molaren Verhältnis von 10:1 co-transfiziert. Die Zelllinien, die gegen G418 resistent sind, wurden ausgewählt und geklont. Die Western Blot-Analyse isolierter 9L-Zellmikrosomen, die einen polyklonalen Kaninchenantikörper verwendet, welcher spezifisch für Cytochrom P450 2B1 ist, zeigte ein einziges Proteinband von etwa 52 kD, was der molekularen Masse des gereinigten Cytochrom P450 2B1 in Proben entspricht, die aus den klonalen, als 9L-ZP und L450-2 bezeichneten Zelllinien präpariert wurden. In den elterlichen 9L- oder 9L-ZP-Zellen, von denen demonstriert wurde, dass sie β-Galactosidase (X-Gal-Färbung), aber kein Cytochrom P450 2B1 exprimieren, wurde kein Cytochrom P450 2B1-Protein gefunden (25). Die klonalen Zelllinien 9L, 9L-Z, 9L-ZP und L450-2 wurden für weitere Untersuchungen verwendet. Die Analyse der Cytochrom P450 2B1-abhängigen Enzymaktivität (siehe Methoden) überprüfte, dass beide Cytochrom P450 2B1-Transformanten 9L-ZP und L450-2 Cytochrom P450 2B1 in einer enzymatisch aktiven Form und auf einem Niveau exprimieren, das bis auf 1-2 % dem von phenobarbital-induzierter Rattenleber entspricht, während die Cytochrom P450 2B1-Aktivität (Testosteron-16β-Hydroxylierung) in den Ausgangs-9L-Zellen oder in 9L-Z-Zellen nicht nachweisbar war.
Effekte von Oxazaphosphorinen auf kultivierte 9L- und 9L-ZP-Zellen: Die Erfinder prüften zuerst, ob 9L-Zellen, die Cytochrom P450 2B1 exprimieren, empfindlich für die zytotoxischen Effekte von Cyclophosphamid und Ifosfamid sind. Cytochrom P450 2B1-positive Zellen (9L-ZP und L450-2) und Cytochrom P450 2B1-negative Zellen (als Ausgang verwendete 9L und 9L-Z) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Cyclophosphamid und Ifosfamid kultiviert. Dann wurde die Zahl der lebensfähigen Zellen, die 5 Tage nach der Wirkstoffbehandlung vorhanden waren, bestimmt. Wie in 26A gezeigt, hemmte Cyclophosphamid das Wachstum von Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise (IC₅₀ ≈ 70 μM). Das Wachstum von Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen wurde auch durch Ifosfamid gehemmt, dies erforderte jedoch eine etwas höhere Wirkstoffkonzentration (IC₅₀ ≈ 145 μM) (26B). Diese Ergebnisse sind im Einklang mit unseren früheren Beobachtungen, dass Cytochrom P450 2B1 Ifosfamid mit einer 3-4fach niedrigeren katalytischen Effizienz aktiviert (Vmax/Km) als Cyclophosphamid (Weber and Waxman, Biochem. Pharmacol. 45:1685-1694 (1993)). Im Gegensatz dazu zeigten elterliche 9L-Zellen und 9L-Z-Zellen keine negativen Effekte, wenn sie in Gegenwart von Konzentrationen von Cyclophosphamid oder Ifosfamid im Millimolbereich gezüchtet wurden. Bei Kontrollexperimenten wurde ermittelt, dass Cytochrom P450 2B1-positive und Cytochrom P450 2B1-negative Zellen inhärent empfindlich für aktiviertes Cyclophosphamid sind, das den Zellen in der Form von 5-Hydroperoxycyclophosphamid präsentiert wurde (26C).
Wirkungen der P450-Enzymhemmung auf die Oxazaphosphorin-Sensibilität von Cytochrom P450 2B1-positiven 9L-Zellen: Um zu verifizieren, dass die Expression von P450 2131 für sich allein für die Chemosensibilität der Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen gegenüber Cyclophosphamid und Ifosfamid verantwortlich ist, wurde ein Cytochrom P450 2B1-selektiver Enzyminhibitor, Metyrapon (Waxman and Walsh, Biochemistry 22:4846-4855 (1983)), zur Hemmung der Cytochrom P450 2B1-Aktivität verwendet. In Gegenwart von 10 μM Metyrapon wurden die zytotoxischen Wirkungen von Cyclophosphamid und Ifosfamid gegenüber 9L-ZP-Zellen nahezu beseitigt (27). Im Gegensatz dazu blockierte Metyrapon den zytotoxischen Effekt des chemisch aktivierten Abkömmlings, 4-Hydroperoxycyclophosphamid, nicht (27), ein Ergebnis, das im Einklang mit dem Metyrapon-Schutz vermittels der Hemmung der Cytochrom P450 2B1-kazalysierten Metyraponaktivierung steht. Daher hängt die Chemosensibilität von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Zellen gegenüber Cyclophosphamid und Ifosfamid von der Anwesenheit eines funktionstüchtigen Cytochrom P450 2B1-Enzyms innerhalb dieser Zellen ab.
Analyse des „Bystander"-[„Umgebungs"-]Zytotoxizitätseffekts: Die Erfinder untersuchten als nächstes, ob Cytochrom P450 2B1-negative 9L-Zellen gegenüber der Zytotoxizität von Cyclophosphamid empfindlich gemacht werden können, wenn sie mit Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Tumorzellen co-kultiviert wurden. Elterliche 9L-Zellen und Cytochrom P450 2B1-positive 9L-ZP-Zellen wurden für diese Experimente verwendet, da sie ähnliche Verdopplungszeiten in Kultur besitzen. Gleiche Zahlen von 9L- und 9L-ZP-Zellen wurden gemischt, und die Mischkultur wurde dann mit Cyclophosphamid behandelt. Es wurde erwartet, dass die Gesamtzellzahl sich um etwa 50 % im Vergleich zu den wirkstofffreien Kontrollen verringern würde, wie auf der Grundlage der selektiven, aber nahezu vollständigen (>90 %) Zytotoxizität von Cyclophosphamid gegenüber 9L-ZP-Zellen vorhergesagt wird, die die Hälfte der gemischten Zellpopulation ausmachen, wenn die Cyclophosphamid-Zytotoxizität auf die Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen beschränkt sein sollte. Andererseits sollten sich beide Zelltypen nach Behandlung der Co-Kultur mit Cyclophosphamid eliminieren, wenn die Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen die benachbarten Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen sensibilisieren.
Wie in 28 gezeigt, wurden nahezu 80 % der Gesamtzellpopulation ausgelöscht, wenn die Mischkultur mit Cyclophosphamid behandelt wurde. Außerdem konnte der Cytochrom P450 2B1-Enzyminhibitor, Metyrapon, diesen Effekt im wesentlichen aufheben. Die Zellen in der Mischkultur zeigten ein ähnliches Muster der Sensibilität gegenüber Ifosfamid, wenn auch bei einer etwas höheren Wirkstoffkonzentration. Im Gegensatz dazu gab es keine Abtötung irgendeiner Zellpopulation, wenn 9L-ZP-Zellen mit als Ausgang verwendeten 9L-Zellen gemischt wurden. Diese Untersuchungen demonstrieren, dass Cytochrom P450 2B1-positive Zellen einen Bystander-Abtötungseffekt auf benachbarte P450 2B1-negative Zellen durch einen Mechanismus übertragen, der die Cytochrom P450 2B1-Enzymaktivität einschließt.
Dann wurde die Wirkung der Cyclophosphamidbehandlung auf Cytochrom P450 2B1-negative und Cytochrom P450 2B1-positive Zellen in der gemischten Zellpopulation überwacht. Zellen, die mit dem lacZ-Gen (β-Galactosidase) markiert waren, die nach Färbung der Kulturen mit dem β-Galactosidase-Substrat X-Gal als blaue Zellen identifiziert wurden, wurden zur Unterscheidung der zwei Zellarten in der Kultur verwendet. Gleiche Zahlen von Ausgangs-9L-Zellen wurden mit lacZ-markierten Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen, 9L-ZP, gemischt. Nach der Cyclophosphamidbehandlung wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt, was die Zytotoxizität von Cyclophosphamid auf die zwei Zellpopulationen zeigte. Wie in 29 erläutert, hemmte Cyclophosphamid das Wachstum der Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen (blau gefärbte Zellen) drastisch. Es wurde eine wesentliche, wenn auch etwas niedrigere Hemmung des Wachstums der Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen (ungefärbte Zellen) beobachtet. Die wenigen übrig bleibenden Zellen zeigten deutliche morphologische Anomalien, und die Lebensfähigkeit der übrigen Zellen war fraglich. Der Cytochrom P450 2B1-Inhibitor Metyrapon schützte beide Zellarten vor der Abtötung durch Cyclophosphamid; jedoch zeigte die mikroskopische Untersuchung morphologische Verformungen in einigen Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen, aber nicht in den Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass 9L-Zellen, die Cytochrom P450 2B1 exprimieren, empfindlicher für die Cyclophosphamid-Zytotoxizität als Folge der Prodrug-Aktivierung sind, die innerhalb der Tumorzelle auftritt, aber dass auch gegenüber benachbarten Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen eine beträchtliche Zytotoxizität auftritt.
Die Erfinder beurteilten als nächstes, ob diese Bystander-Abtötung von Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen durch benachbarte Cytochrom P450 2B1-positive Zellen den direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert, in Analogie zum Fall der HSV-TK-positiven und HSV-TK-negativen Tumorzellen und der Ganciclovirbehandlung (Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Culver et al., Science 256:1550-1552 (1992); Freeman et al., Cancer Res. 53:5274-5283 (1993); Bi et al., Human Gene Therapy 4:725-731 (1993)). Für diese Experimente wurden Eltern-9L-Zellen in die untere Kammer von Falcon-Co-Kultureinsätzen eingeimpft und Cytochrom P450 2B1-positive Zellen (9L-ZP) oder Cytochrom P450 2B1-negative Zellen (9L-Z) wurden in die obere Kammer der Co-Kultureinsätze eingebracht. Die beiden Zellpopulationen wurden physisch in diesem Co-Kultursystem getrennt, nutzten aber dasselbe Kulturmedium.
Wie in 30A gezeigt, tötete die Cyclophosphamidbehandlung über 5 Tage nicht nur die Cytochrom P450 2B1-positiven 9L-Zellen in der oberen Kammer, sondern auch die Eltern-9L-Zellen, die in der unteren Kammer kultiviert wurden. Die Abtötung beider Zellpopulationen kann durch den Cytochrom P450 2B1-Inhibitor Metyrapon wirksam blockiert werden. Im Gegensatz dazu gab es keine Abtötung einer der beiden Zellpopulationen, wenn die 9L-Z-Zellen mit Ausgangs-9L-Zellen co-kultiviert wurden.
Zur Beurteilung, ob die Bystander-Abtötung von co-kultivierten Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen von der Zahl der co-kultivierten Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen abhängt, wurde eine variable Zahl von 9L-ZP-Zellen (die von 10⁴ bis 10⁶ Zellen reichte) in Falcon-Kultureinsätze gebracht und mit 10⁵ Ausgangs-9L-Zellen co-kultiviert. 30B demonstriert, dass die Zytotoxizität von Cyclophosphamid gegenüber den 9L-Zellen in der unteren Kulturkammer (auf der y-Achse angezeigt) in direkter Korrelation zur anfänglichen Zahl der 9L-ZP-Zellen in der oberen Kammer (x-Achse) steht. Daher ist im Fall von Cytochrom P450 2B1/Cyclophosphamid der Bystander-Abtötungseffekt zumindest teilweise auf die Übertragung der löslichen zytotoxischen Metabolite, die über den Cytochrom P450-katalysierten Wirkstoffmetabolismus gebildet werden, auf die nicht-Cytochrom P450-exprimierenden Zellen zurückzuführen. Dieser Bystandereffekt unterscheidet sich daher von dem des HSV-TK-/Ganciclovir-Systems, wo der enge Zell-Zell-Kontakt notwendig für das Auftreten der Bystander-Zytotoxizität ist (Freeman et al., Cancer Res. 53:5274-5283 (1993); Bi et al., Human Gene Therapy 4:725-731 (1993)).
Wirkungen der Cytochrom P450 2B1-Expression auf die Cyclophosphamidsensibilität von 9L-Tumoren in vivo: Die oben beschriebenen Untersuchungen beweisen, dass 9L-Gliosarkomzellen, die stabil transfiziert werden, um Cytochrom P450 2B1 zu exprimieren, hoch empfindlich für die Zytotoxizität von Cyclophosphamid und Ifosfamid werden. Die Erfinder nutzten als nächstes diese Zellen als ex vivo-Gentransfermodell, um in vivo die Verwendbarkeit des Cytochrom P450 2B1/Oxazaphosphorin-Systems für die Krebsgentherapie zu bewerten. Eine in vivo-Tumorwachstumsverzögerungsuntersuchung wurde ausgeführt, um die Cyclophosphamidsensibilität von Cytochrom P450 2B1-negativen 9L-Tumoren mit der von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-Tumoren zu vergleichen. Cytochrom P450 2B1-negative Zellen (9L und 9L-Z) und Cytochrom P450 2B1-exprimierende Zellen (9L-ZP und L450-2) wurden subkutan als solide Tumore in weiblichen Fischer 344-Ratten gezüchtet. Die Cyclophosphamidbehandlung von Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Tumoren führte zur vollständigen Hemmung des Tumorwachstums (Tabelle VI und 31). 9L-Tumore zeigten eine gewisse Wachstumsverzögerung nach Cyclophosphamidbehandlung, aber dieser antitumorale Effekt war kurzzeitig, wonach wieder ein aggressives Tumorwachstum auftrat. Die zeitweilige Wachstumsverzögerung der Ausgangs-9L-Tumore resultiert aus der Aktivierung von Cyclophosphamid durch das in der Leber vorhandene Cytochrom P450, welches im Fall der adulten weiblichen Ratten in erster Linie durch die Cytochrom P450-Form 2C6 katalysiert wird (Clarke and Waxman, Cancer Res. 49:2344-2350 (1989)). Diese in vivo-Tumormodelluntersuchungen beweisen, dass die intratumorale Expression des Cytochrom P450 2B1-Gens und die damit verbundene intratumorale Aktivierung des Prodrug periphere solide Tumore hoch empfindlich für die Oxazaphosphorin-Behandlung in vivo machen können. Tabelle IV: Wirkung von Cyclophosphamid auf Cytochrom P450 2B1-negative und Cytochrom P450 2B1-positive 9L Tumore, die subkutan in Fischer 344 Ratten gewachsen sind

Tumor Vollständige Tumorwachstumshemmung ^a

Kochsalzlösung Cyclophosphamid

9L 0/11 0/11

9L-Z 0/9 0/9

9L-ZP 0/9 8/9

L450-2 0/11 11/11

^a Den Ratten wurden 2 × 10⁶ Cytochrom P450 2B1-negative Tumorzellen (9L oder 9L-Z) oder Cytochrom P450 2B1-positive Tumorzellen (9L-ZP oder L450-2) injiziert. Cyclophosphamid wurde als einzige intraperitoneale Injektion mit 100 mg/kg Körpergewicht 7 Tage nach der Tumorimplantation verabreicht. Die Vollständigkeit der Tumorwachstumshemmung in den Cyclophosphamid-behandelten 9L-ZP- und L450-2-Tumoren wurde durch Palpation oder durch anatomische Untersuchung 7-8 Wochen nach der Cyclophosphamidbehandlung bewertet. Die Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten kombiniert und werden als Zahl der Tumoren dargestellt, die vollständige Tumorwachstumshemmung zeigen,/Gesamtzahl der untersuchten Tumoren. Repräsentative Tumorwachstumskurven für ein Experiment, das 9L-Z- und 9L-ZP-Tumore beinhaltet, sind in 26 angeführt.

Diskussion
Ratten-9L-Gliosarkomzellen wurden als Modell zur Beurteilung des Nutzens des Cytochrom P450-Gentransfers als Paradigma für die Chemosensibilisierung von Tumoren durch Einführung von Genen für wirkstoffmetabolisierende Enzyme, die bekannte, eingeführte Krebs-Chemotherapeutika aktivieren, verwendet. 9L-Zellen, die aus einem Rattenhirntumor stammen (Banker et al., Cancer Res. 33:976-986 (1973)), können in Kultur gezüchtet werden oder können subkutan oder intrakranial in Fischer 344-Ratten verpflanzt werden. 9L-Zellen exprimieren Cytochrom P450-Reduktase, die die für alle mikrosomalen Cytochrom P450-abhängigen Enzymreaktionen benötigten Elektronen überträgt, die aber wenig oder keine endogene Cytochrom P450-Enzymaktivität enthalten, was sie als Empfänger-Zelllinie für Experimente gut geeignet macht, die einen Cytochrom P450-Gentransfer beinhalten. Die primären Ziele der aktuellen Untersuchungen waren a) die Einschätzung, ob die Expression von Cytochrom P450 2B1 in dieser Tumorzelllinie die Tumorzellen für Oxazaphosphorine sensibilisiert, b) die Feststellung, ob benachbarte, nicht-Cytochrom P450-enthaltende Tumorzellen wirkstoffempfindlich über einen „Bystandereffekt" werden, und c) die Ermittlung, ob diese Chemosensibilisierung in vitro sich in einen therapeutischen Vorteil in vivo im Fall eines peripheren Tumors und im Kontext eines intakten Lebersystems übersetzt, das die Oxazaphosphorin-Aktivierung mit einer Rate katalysiert, die in großem Maße die des Tumors selbst übersteigt. Die Übertragung des Oxazaphosphorin-aktivierenden Cytochrom P450 2B1-Gens in die 9L-Tumorzellen macht diese Zellen tatsächlich vorzugsweise für Cyclophosphamid und Ifosfamid empfindlich, sowohl in vitro als auch in vivo, und ist daher wahrscheinlich nützlich zur Anwendung in der Krebstherapie.
Die in vitro- und in vivo-Untersuchungen des HSV-TK-/Ganciclovirsystems haben gezeigt, dass HSV-TK-transduzierte Zellen, die mit Ganciclovir behandelt wurden, eine „Bystanderabtötung" von nicht-HSV-TK-transduzierten Zellen vornehmen, mit denen sie in Kontakt stehen (Rain et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Culver et al., Science 256:1550-1552 (1992); Freeman et al., Cancer Res. 53:5274-5283 (1993); Bi et al., Human Gene Therapy 4:725-731 (1993)). Die präzise mechanistische Basis für den Bystanderabtötungseffekt bleibt unklar, aber sie scheint die Übertragung der aktivierten Ganciclovirmetabolite oder anderer toxischer Substanzen durch Zell-Zell-Kontakt zu beinhalten. Dieser Bystandereffekt kann von großer therapeutischer Bedeutung sein, weil er angibt, dass die Vernichtung des Tumors im Prinzip selbst dann erreicht werden kann, wenn nur eine Teilmenge einer Tumorzellpopulation mit dem Wirkstoffsensibilisierungsgen wirksam transduziert wird.
Daher wurden Experimente ausgeführt, um festzustellen, ob die Übertragung des Cytochrom P450-Gens mit dem Bystandereffekt verknüpft ist, d.h. ob die Cytochrom P450 2B1-exprimierenden Tumorzellen benachbarte Tumorzellen für Cyclophosphamid sensibilisieren können. Es wurde beobachtet, dass die Cytochrom P450 2B1-positiven Zellen eine Bystanderabtötung von Cytochrom P450 2B1-negativen Zellen durch einen Mechanismus übertragen, der enzymatisch aktives Cytochrom P450 2131 erfordert. Dieser Bystanderabtötungseffekt beinhaltet zumindest teilweise den intrazellulären Transfer von einem oder mehreren löslichen zytotoxischen Metaboliten, wie dies durch die Chemosensibilität angezeigt wird, die von 9L-ZP-Zellen auf die als Ausgang verwendeten 9L-Zellen selbst dann übertragen wird, wenn der Zellkontakt zwischen den beiden Zellpopulationen verhindert wird. Es ist denkbar, dass die beobachtete Bystanderabtötung auch zusätzliche Zell-Zell-Kontaktmechanismen einschließen könnte. Man glaubt, dass 4-Hydroxycyclophosphamid, das von Cytochrom P450 2B1 gebildet wird, leicht durch Zellmembranen diffundieren kann (Sladek, N.E., Pharmacol. Ther. 37:301-355 (1988)), und es ist wahrscheinlich, dass die Freisetzung dieses primären Metaboliten oder vielleicht seiner zytotoxischen Zersetzungsprodukte, Phosphoramid-Lost und Acrolein, zum tödlichen Effekt von Cyclophosphamid auf Cytochrom P450 2B1-negative Zellen beitragen. Andere Mechanismen, wie z.B. die Übertragung von apoptotischen Signalen von absterbenden 9L-ZP-Zellen auf 9L-Zellen, könnten ebenfalls eine Rolle spielen.
Dass ein Zell-Zell-Kontakt nicht erforderlich ist, um eine Cytochrom P450 2B1/Cyclophosphamid-Bystandertoxizität zu erreichen, kann einen wichtigen therapeutischen Vorteil der Cytochrom P450-Gentherapie gegenüber dem HSV-TK-/Ganciclovirsystem darstellen, indem sie für eine weiter reichende Verteilung des aktivierten Wirkstoffs innerhalb der Tumormasse sorgt. Zusätzlich erzeugt das Cytochrom P450 2B1/Oxazaphosphorin-System, anders als HSV-TK/Ganciclovir, welches aktivierte Metabolite erzeugt, deren Zytotoxizität auf Zellen in der DNA-Synthese (S-Phase) des Zellzyklus beschränkt ist, Metabolite, die bei der Abtötung von Tumorzellen unabhängig vom Zellzyklus wirksam sind. Daher wird die Toxizität für Tumorzellen von aus Phosphoramid-Lost abgeleiteten DNA-Querverbindungen zwischen den Strängen erkennbar, unabhängig davon, an welchem Punkt die Tumorzellen anfangen zu replizieren, was zu einem höheren Anteil der Abtötung von Tumorzellen führt.
Ein weiterer potenzieller Vorteil der auf Cytochrom P450 2B1 beruhenden Krebs-Gentherapie ist die Möglichkeit, den lokalen antitumoralen Effekt des Wirkstoffs über den Cytochrom P450-Gentransfer in Kombination mit der selektiven Hemmung der Leber-Cytochrom P450-Enzyme, die an der systemischen Prodrug-Aktivierung beteiligt sind, zu erhöhen. Da die Cytochrom P450-Katalysatoren der Oxazaphosphorin-Aktivierung in der menschlichen Leber (Chang et al., Cancer Res. 53:5629-5637 (1993)) sich biochemisch vom Ratten-Cytochrom P450 2B1 unterscheiden, kann die Hemmung von Leber-Cytochrom P450 durch die Verwendung geeigneter Cytochrom P450-Isoforminhibitoren erreicht werden (Chang et al., Cancer Res. 53:5629-5637 (1993); Guengerich et al., Chem. Res. Toxicol. 4:391-407 (1991); Chang et al., Arch. Biochem. Biophys. 311:437-442 (1994)). Dies würde einen bedeutenden therapeutischen Vorteil durch Minimierung der Wirtsgewebstoxizität erbringen, die aus der Leber-Cytochrom P450-vermittelten systemischen Einwirkung von aktivierten Metaboliten resultiert und bei der konventionellen Chemotherapie immer auftritt.
Eine wichtige Erkenntnis ist, dass Cytochrom P450 2B1/Cyclophosphamid in Bezug auf sein chemotherapeutisches Potenzial in vivo im Fall eines soliden, in der Peripherie gewachsenen Tumors hoch wirksam und daher ein guter Kandidat für die weitere vorklinische Entwicklung als Ziel für die Krebs-Gentherapie ist. Der bemerkenswerte therapeutische Vorteil, der durch die intratumorale Cytochrom P450 2B1-Expression erreicht wird (31 und Tabelle VI), ist aus mehreren Gründen überraschend und hätte nicht aus den Ergebnissen von Hirntumor-Gentherapieuntersuchungen, die an anderer Stelle in dieser Patentanmeldung zitiert werden, vorher gesagt werden können.
Erstens werden endogene Cytochrom P450-Enzyme, die im Cyclophosphamid-Metabolismus aktiv sind, bereits mit hohen Spiegeln im Lebergewebe exprimiert. Außerdem waren die 9L-Tumoren in dieser Untersuchung zur Zeit der Cyclophosphamidbehandlung, 7 Tage nach der Tumorimplantation, gerade fühlbar und waren daher im Vergleich zur Leber klein.
Weiterhin ist der spezifische Gehalt von Cytochrom P450-Protein in den Cytochrom P450 2B1-transfizierten Tumorzellen gering im Vergleich zur Leber (vgl. 25). Daher ist der Hauptteil des aktivierten, im Umlauf befindlichen Cyclophosphamids in den 9L-ZP- und den L450-2-tumortragenden Ratten zweifellos aus der Leber und nicht aus dem Tumor. Trotzdem wurde eine vollständige Tumorregression nach Cyclophosphamidbehandlung bei diesen 9L/Cytochrom P450 2B1-Tumoren, nicht aber bei den Cytochrom P450 2B1-negativen 9L- und 9L-Z-Tumoren beobachtet. Dies zeigt an, dass es wahrscheinlich im Fall der intratumoralen Cyclophosphamid-Aktivierung einen sehr bedeutenden „Nachbarschaftseffekt" gibt. Das kann anzeigen, dass der primäre Metabolit 4-Hydroxycyclophosphamid/Aldophosphamid oder vielleicht sein plasmaprotein-stabilisiertes Sulfhydroaddukt (Hohorst et al., Adv. Enzyme Regul. 25:99-122 (1986)) einen geringeren Zugang zur Tumorgefäßversorgung oder einen geringeren Grad von Zellmembranpermeabilität besitzt, wenn er in der Leber gebildet wird, als dies auf der Basis früherer Untersuchungen erwartet werden würde (Sladek, N.E., Pharamcol. Ther. 37:301-355 (1988); Hong et al., Drug Metab. Dispos. 19:1-7 (1991)). Im anderen Falle kann, in Anbetracht der kurzen wahren Halbwertszeit von 4-Hydroxycyclophosphamid [t_1/2 = 5,2 min und 3,3 min in Ratten- bzw. menschlichem Plasma; ebenda] eine beträchtliche Zersetzung dieses primären Metaboliten auftreten, bevor er den Tumor von seinem Entstehungsort in der Leber aus erreicht. Daher kann die wirksame intratumorale Konzentration von alkylierenden Metaboliten im Fall der Cytochrom P450 2B1-eprimierenden 9L-Tumore wesentlich höher sein im Vergleich zu den nicht Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-Tumoren, trotz der viel höheren inhärenten metabolischen Kapazität der Leber bei diesen Ratten.
Ein weitere Möglichkeit ist, dass die bedeutend verstärkte Zytotoxizität von Cyclophosphamid gegenüber Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-Tumoren aus der Sensibilisierung der Tumorzellen gegen Phosphoramid-Lost, den primären DNA-alkylierenden Metaboliten, durch den Protein-alkylierenden Metaboliten Acrolein resultiert. Acrolein, das durch chemische Zersetzung aus 4-Hydroxycyclophosphamid/Aldophosphamid abgeleitet ist, wird in gleichen molaren Mengen mit Phosphoramid-Lost gebildet und ist ein wichtiger Faktor, der zur Cyclophosphamid-assoziierten Kardiotoxizität (Friedman et al., Cancer Res. 50:2455-2462 (1990)) und zu Formen der endokrinen Toxizität beiträgt, die Cyclophosphamid besitzen kann, wie durch die Verringerung der Serumtestosteronspiegel und die Modulation von Leber-Cytochrom P450- und Steroid metabolisierenden Enzymprofilen nach Cyclophosphamidbehandlung angezeigt wird (Chang and Waxman, Cancer Res. 53:2490-2497 (1993)). Obwohl Acrolein, das aus der Aktivierung von Leber-Cyclophosphamid stammt, nicht die Antitumoraktivität des Ausgangstumors vermittelt (Sladek, N.E., (1988), oben), ist es vorstellbar, dass in unserem Cytochrom P450-Gentransfer-/intratumoralen Cyclophosphamid-Aktivierungsmodell lokal gebildetes Acrolein die zytotoxischen Effekte von Phosphoramid-Lost potenziert, vielleicht durch einen Glutathionverarmungsmechanismus (vgl. Friedman et al., Cancer Res. 50:2455-2462 (1990); Gurtoo et al., Cancer Res. 41:3584-3591 (1981)).
Zum Abschluss demonstriert dieses Beispiel den therapeutischen Nutzen der Übertragung von Oxazaphosphorin aktivierenden Cytochrom P450-Genen in periphere Tumorzellen. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Abtötung peripherer Tumorzellen effizient ablaufen kann, selbst wenn nur eine Teilmenge einer Tumorzellpopulation wirksam mit dem Wirkstoff aktivierenden Cytochrom P450-Gen transfiziert wird. Eine wesentliche Verbesserung in der therapeutischen Aktivität von Cyclophosphamid oder Ifosfamid sowie von N-, N'-, N''-Triethylenthiophosphoramid (thio-TEPA), Procarbazin, Dacarbazin und anderen gegen Tumore wirkenden Agenzien, die durch dieses oder andere Cytochrom P450-Gene aktiviert werden (LeBlanc and Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989); Ng and Waxman, International Journal of Oncology 2:731-738 (1993); Ng and Waxman, Cancer Res. 51:2340-2345 (1991); Ng and Waxman, Cancer Research 50:464-471 (1990)), gegen periphere Tumoren kann daher erwartet werden, wenn diese Wirkstoffe mit dem Cytochrom P450-Gentransfer kombiniert werden. Dies wird vorhergesagt, auch wenn der Wirkungsgrad des Cytochrom P450-Gentransfers, der mit viralen Vektoren oder anderen neuartigen Gentransferansätzen, einschließlich der Verwendung tumorspezifischer Promotor-DNA-Sequenzen, erreicht werden kann, weniger als 100 % bezüglich der Gentransduktion in Tumorzellen beträgt. Daher schließt der Nutzen der vorliegenden Erfindung das Erreichen einer höheren Wirkstoffeffektivität durch die Erhöhung von Spezifität und Selektivität der gegen den Krebs gerichteten Wirkstoffe ein, wie z.B. Oxazaphosphorine, während gleichzeitig die systemische Toxizität, die üblicherweise mit der Verwendung dieser Wirkstoffe verbunden ist, minimiert wird.
Abschließend können die Chemotherapie-/Gentherapiekonzepte und -strategien, die in dieser Erfindung entwickelt wurden, möglicherweise auf andere bestehende krebschemotherapeutische Agenzien (LeBlanc and Waxman, (LeBlanc and Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989); Ng and Waxman, International Journal of Oncology 2:731-738 (1993); Ng and Waxman, Cancer Res. 51:2340-2345 (1991); Ng and Waxman, Cancer Research 50:464-471 (1990)) und andere Cytochrom P450-Gene erweitert werden (Nelson et al., DNA Cell Biol. 12:1-51 (1993)).
Beispiel 8
Um festzustellen, ob die Empfindlichkeit für Cyclophosphamid, die durch die Cytochrom P450 2B1-Genexpression im Fall von Ratten-9L-Gliosarkomzellen übertragen wird, sich in eine erhöhte therapeutische Aktivität in anderen Tumorzellarten umsetzt, wurde ein Panel von menschlichen MCF-7-Brustkarzinom-Zelllinien, die Cytochrom P450 2B1 stabil exprimieren, präpariert und dann auf Sensibilität gegenüber Cyclophosphamid in vitro und in vivo mittels eines Nacktmausmodells bewertet.
Methoden
MCF-7 ist eine Brustkarzinom-Zelllinie, die aus dem Pleuraerguss einer nulliparen Frau postmenopausal gewonnen wurde. Diese menschliche Tumorzelllinie kann sowohl in Zellkultur als auch in nackten Mäusen gezüchtet und passagiert werden, bei denen sie als solider Tumor wächst. Es ist ein weitgehend untersuchtes Modell für menschlichen Brustkrebs, das denen im Fachgebiet Tätigen bekannt ist (Soule et al., J. Natl. Cancer Inst. 51:1409-1413 (1973)).
MCF-7-Zellen wurden als Monoschicht in Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % durch Wärme inaktiviertem fetalem Kälberserum, 100 Einheiten Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml, 2 mM L-Glutamin und 0,25 Einheiten Insulin/ml gezüchtet.
Transfektion der MCF-7-Zellen mit dem Cytochrom P450 2B1-Expressionsplasmid, Auslese der Neomycin-resistenten Klone, Charakterisierung des exprimierten Cytochrom P450 2B1-Proteins und Sensibilität der Zelllinien gegenüber Wirkstoffen wurden ausgeführt, wie in Beispiel 7 für die Cytochrom P450 2B1-exprimierenden 9L-Zelllinien beschrieben.
Weibliche homozygote (nu+\nu+) nackte thymuslose Schweizer Mäuse (Soule et al., Cancer Letters 10:177-189 (1980)), 20-25 g, wurden von der Taconic Inc. (Germantown, NY) bezogen.
MCF-7-Zellen oder stabile MCF-7-Zelltransfektanten, die Cytochrom P450 2B1 oder E. coli-β-Galactosidase (lacZ) exprimierten, wurden in Zellkultur gezüchtet. Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase wurden geerntet und dann subkutan (1 × 10⁷ Zellen in 0,2 ml) in die Flanken nackter Mäuse injiziert. Ein einzelnes 17β-Estradiol-Pellet (Pellet mit Freigabe von 1,7 mg Hormon in 60 Tagen, Innovative Research, Toledo, OH) wurde einen Tag vor der Tumorinokulation implantiert. Einen Monat nach Tumorinokulation wurde die Größe jedes Tumors mit Schieblehren gemessen.
Die nackten Mäuse wurden dann mit Cyclophosphamid behandelt, das in Höhe von 100 mg/kg Körpergewicht × 2 durch intraperitoneale Injektion verabreicht wurde, die an Tag 0 und wieder an Tag 2 gegeben wurde. Die Messungen der Tumorgröße wurden dann wieder mit der Schieblehre vorgenommen, und die Daten wurden relativ zu den Tumorgrößen am Tag 0, dem Tag der ersten Cyclophosphamid(CPA)-Injektion, ausgedrückt.
Ergebnisse
32 zeigt, dass die als Ausgang verwendeten MCF-7-Zellen sowie eine als MCF-7-transfizierte Kontroll-Zelllinie, die das bakterielle Enzym β-Galactosidase exprimiert, MCF-7-Z3, beide unempfindlich für hohe Konzentrationen von Cyclophosphamid sind. Im Gegensatz dazu waren sechs einzelne Cytochrom P450 2B1-exprimierende MCF-7-Zellinien, die als P2, P3, P5, P8, P9 und P26 bezeichnet werden, hoch empfindlich für Cyclophosphamid-Zytotoxizität. Weiters wurden die P450 exprimierenden Zellen vorzugsweise nach Cyclophosphamidbehandlung abgetötet, wenn die Cytochrom P450 2B1-exprimierenden MCF-7-Zellen subkutan in vivo in einem Nacktmausmodell gezüchtet wurden.
23 vergleicht die Abtötung von Tumorzellen in vivo, die bei vier der P450 exprimierenden MCF-7-Tumoren (welche als P3, P2, P9 und P26 bezeichnet wurden) erreicht wurde, mit der des Kontrolltumors MCF-7 Z3, welcher nur eine mäßige Cyclophosphamidsensibilität aufwies, die von der des als Ausgang verwendeten MCF-7-Tumors nicht zu unterscheiden war.
Diskussion
Diese Experimente belegen, dass der therapeutische Vorteil des Cytochrom P450 2B1-Gentransfers nicht auf das 9L- oder C6-Modellsystem beschränkt ist, sondern in anderen Tumoren beobachtet wird, die ihren Ursprung nicht im Zentralnervensystem haben. Weiters zeigen die Ergebnisse in diesem Beispiel, dass die zytotoxischen Effekte, die bei der Verwendung des Cytochrom P450 2B1/CPA-Krebstherapieparadigmas beobachtet werden, nicht nur bei Tumoren von Nagetieren festgestellt werden, sondern auch bei menschlichen, in vivo gewachsenen Tumoren erhalten werden. Abschließend zeigen diese Experimente wieder, dass das Cytochrom P450/CPA-System für die Krebsgentherapie verwendet werden kann, und zwar nicht nur für Tumore des Zentralnervensystems, sondern auf für periphere Tumore oder periphere metastatische Tumore.

Claims

Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren des zentralen Nervensystems, wobei die Expression des Genproduktes Tumorzellen des zentralen Nervensystems gegenüber dem chemotherapeutischen Mittel unabhängig vom Zellzyklus der Tumorzellen empfindlich macht.
Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bösartigen Tumoren, wobei das Expressionsprodukt des Gens das chemotherapeutische Mittel zu einem zytotoxischen Stoffwechselprodukt aktiviert.
Verwendung eines viralen Vektors, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von peripheren Tumoren, wobei das Expressionsprodukt des Genproduktes Zellen peripherer Tumore gegenüber dem chemotherapeutischen Mittel unabhängig von dem Zellzyklus der Tumorzellen empfindlich macht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Cytochrom-Gen P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 oder P450 3A4 ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Cytochrom-Gen P450 2B1 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das chemotherapeutische Mittel Cyclophosphamid oder Ifosphamid ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das chemotherapeutische Mittel Cyclophosphamid ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der virale Vektor ein Retrovirus ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 8, wobei die Tumorzellen des zentralen Nervensystems Astrozytome, Oligodendrogliome, Meningiome, Neurofibrome, Glioblastome, Ependymome, Schwannome oder Neurofibrosarkome sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 oder 4 bis 8, wobei sich der bösartige Tumor im zentralen Nervensystem befindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Zellen peripherer Tumore Brusttumorzellen sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der virale Vektor für die Verabreichung vor dem chemotherapeutischen Mittel vorgesehen ist.
Erzeugnis, welches einen viralen Vektor, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Zubereitung zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung bei der Behandlung von Tumoren des zentralen Nervensystems enthält, wobei die Expression des Genproduktes Tumorzellen des zentralen Nervensystems gegenüber dem chemotherapeutischen Mittel unabhängig vom Zellzyklus der Tumorzellen empfindlich macht.
Erzeugnis, welches einen viralen Vektor, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Zubereitung zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung bei der Behandlung von bösartigen Tumoren enthält, wobei das Expressionsprodukt des Gens das chemotherapeutische Mittel zu einem zytotoxischen Stoffwechselprodukt aktiviert.
Erzeugnis, welches einen viralen Vektor, der ein Cytochrom-P450-Gen trägt, und ein chemotherapeutisches Mittel als kombinierte Zubereitung zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung bei der Behandlung von peripheren Tumoren enthält, wobei die Expression des Genproduktes die Zellen peripherer Tumore gegenüber dem chemotherapeutischen Mittel unabhängig vom Zellzyklus der Tumorzellen empfindlich macht.
Erzeugnis nach Anspruch 13, wobei die Tumorzellen des zentralen Nervensystems Astrozytome, Oligodendrogliome, Meningiome, Neurofibrome, Glioblastome, Ependymome, Schwannome oder Neurofibrosarkome sind.
Erzeugnis nach Anspruch 14, wobei sich der bösartige Tumor im zentralen Nervensystem befindet.
Erzeugnis nach Anspruch 15, wobei die Zellen peripherer Tumore Brusttumorzellen sind.
Erzeugnis nach einem der Ansprüche 13 bis 18, das durch die Merkmale von einem der Ansprüche 4 bis 8 modifiziert ist.