DE69434924T2 - Verbindungen zur photodekontamination von pathogenen erregern im blut - Google Patents

Verbindungen zur photodekontamination von pathogenen erregern im blut Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in Blutprodukten in der Anwesenheit von Ultraviolettlicht bereit, ohne dass die Blutproduktfunktion signifikant beeinträchtigt wird oder dass sich Mutagenese zeigt.
  • STAND DER TECHNIK
  • Eine Pathogenkontamination in der Blutversorgung bleibt ein wichtiges medizinisches Problem auf der gesamten Welt. Obschon verbesserte Testverfahren auf Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV) und Immunschwächevirus beim Menschen (HIV) merklich die Inzidenz der transfusionsbedingten Krankheiten reduziert haben, verliert die Öffentlichkeit das Vertrauen in die Sicherheit der Blutversorgung, weil Fälle bekannt sind, bei denen diese Viren bei einer Transfusion übertragen wurden.
  • Die neuere Einführung eines Bluttests auf HCV reduziert die Übertragung dieses Virus; dieser hat jedoch eine Empfindlichkeit von nur 67% zur Erfassung möglicher infektiöser Bluteinheiten. HCV ist verantwortlich für 90% der transfusionsbedingten Hepatitis. Melnick, J. L., Abstracts of Virological Safety Aspects of Plasma, Cannes, 3.–6. November (1992) (Seite 9). Mit dem etablierten Test ist das Infektionsrisiko schätzungsweise 1 von 3300 transfundierten Einheiten.
  • Es gibt zwar empfindlichere serologische Tests für HIV-1 und HBV, diese Mittel können aber entsprechend durch seronegative Blutspender übertragen werden. International Forum: Vox Sang 32: 346 (1977). Ward, J. W., et al., N. Engl. J. Med., 318: 473 (1988). Bis zu 10% der transfusionsbedingten Hepatitis und 25% der schweren ikterischen Fälle beruhen auf HBV, übertragen durch Spender, die für das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBasAg) negativ sind. Bisher sind 15 Fälle von transfusionsbedingten HIV-Infektionen vom Center for Disease Control (CDC) unter Empfängern von Blut beschrieben worden, das im Vortest auf Antikörper gegen HIV-1 negativ war.
  • Andere Viren, Bakterien und Erreger werden darüber hinaus nicht routinemäßig untersucht, und bleiben eine potentielle Bedrohung für die Transfusionssicherheit. Schmunis, G.A. Transfusion 31: 547–557 (1992). Zudem gewährleistet der Test keine Sicherheit der Blutzufuhr gegenüber zukünftigen unbekannten Pathogenen, die in eine Spender-Population übertreten können, was zu einer transfusionsbedingten Übertragung führt, bevor empfindliche Tests ausgeführt werden können.
  • Selbst wenn Serokonversionstests eine hinreichende Durchmusterung sind, können diese nicht praktisch in der Anwendung sein. Bei Menschen sind beispielsweise Cytomegalie-Virus (CMV – ein Herpesvirus) und Parvo-B19-Virus häufig. Wenn diese in gesunden immunkompetenten Erwachsenen vorkommen, führen sie fast immer zu einer asymptomatischen Serokonversion. Da ein solch großer Teil der Bevölkerung seropositiv ist, würde der Ausschluss der positiven Einheiten zu einer erheblichen Einschränkung der Blutversorgung führen.
  • Ein alternativer Ansatz zur Eliminierung der Übertragung von Viruserkrankungen durch Blutprodukte ist die Entwicklung einer Maßnahme zur Inaktivierung von Pathogenen in Transfusionsprodukten. Die Entwicklung einer wirksamen Technik zur Inaktivierung infektöser Pathogene in Blutprodukten bietet das Potential zur Verbesserung der Sicherheit der Blutversorgung, und vermutlich zur Verlangsamung der Einbringung neuer Tests, wie dem vor kurzem eingeführten HIV-2-Test auf seltene Pathogene. Schließlich kann eine Dekontaminationstechnologie signifikant die Kosten der Blutprodukte reduzieren und die Verfügbarkeit seltener Blutprodukte steigern.
  • Ein solches Inaktivierungsverfahren i) darf nicht nachteilig die Funktion beeinträchtigen, für die das Blutprodukt transfundiert wird, ii) muss bestehende Pathogene im Blutprodukt gründlich inaktivieren, und iii) darf die Empfänger des Blutproduktes nicht beeinträchtigen, damit es nutzbringend ist. Einige Verfahren wurden für die Inaktivierung oder Eliminierung viraler Mittel in erythrocytenfreien Blutprodukten beschrieben. Die meisten dieser Techniken sind aber vollständig inkompatibel mit der Erhaltung der Funktion der Blutplättchen, einem wichtigen Blutprodukt. Beispiele für diese Techniken sind: Wärme (Hilfenhous, J., et al., J. Biol. Std. 70: 589 (1987)), Lösungsmittel/Detergenz-Behandlung (Horowitz, B., et al., Transfusion 25: 516 (1985)), Gamma-Strahlung (Moroff, G., et al., Transfusion 26: 453 (1986)), W-Strahlung, kombiniert mit Betapropriolacton, (Prince A.M., et al., Reviews of Infect Diseases 5: 92–107 (1983)), sichtbares Laserlicht in Kombination mit Hämatoporphyrinen (Matthews J. L., et al., Transfusion 28: 81–83 (1988); North J., et al., Transfusion 32: 121–128 (1992)), Verwendung der photoaktiven Farbstoffe Aluminumphthalocyananin und Merocyanin 540 (Sieber F., et al., Blood 73: 345–350 (1989); Rywkin S., et al., Blond 78 (Suppl 1): 352a (Abstract) (1991)) oder UV allein (Proudouz, K. N., et al., Blood 70: 589 (1987)).
  • Andere Verfahren inaktivieren virale Mittel durch Behandlung mit Furocumarinen, wie Psoralenen, in der Anwesenheit von Ultraviolettlicht. Psoralene sind tricyclische Verbindungen, die durch lineare Fusion eines Furan-Rings mit einem Kumarin hergestellt werden. Psoralene können zwischen die Basenpaare doppelsträngiger Nukleinsäuren interkalieren, und bilden kovalente Addukte mit Pyrimidinbasen bei Absorption von langwelligem Ultraviolettlicht (UVA). G. D. Cimino et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 1151 (1985); Hearst et al., Quart. Rev. Biophys. 17: 1 (1984). Gibt es ein zweites Pyrimidin nächst dem Psoralen-Pyrimidin-Monoaddukt und auf dem gegenüberliegenden Strang, kann die Absorption eines zweiten Photons zur Bildung eine Diadduktes führen, das als Zwischenstrangvernetzung dient. S. T. Isaacs et al., Biochemistry 16: 1058 (1977); S. T. Isaacs et al., Trends in Photobiology (Plenum) S. 279–294 (1982); J. Tessman et al., Biochem. 24: 1669 (1985); Hearst et al., U.S. Pat. Nr. 4,124,598, 4,169,204, und 4,196,281, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Die kovalent gebundenen Psoralene wirken als Inhibitoren der DNA-Replikation und sie haben somit das Potential zur Beendigung des Replikationsverfahrens. Aufgrund dieser DNA-Bindungsfähigkeit sind die Psoralene von besonderem Interesse in Bezug auf die Lösung der Probleme, die bei der Erzeugung und Erhaltung der Pathogen-Blutzufuhr vorkommen. Einige bekannte Psoralene inaktivieren Befunden zufolge Viren in einigen Blutprodukten. H. J. Alter et al., The Lancet (ii:1446) (1988); L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989) (Dekontaminieren von Blutplättchenkonzentraten); G. P. Wiesehahn et al., U.S. Pat. Nr. 4,727,027 und 4,748,120, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschreiben die Verwendung einer Kombination von 8-Methoxypsoralen (8-MOP) und Strahlung. P. Morel et al., Blood Cells 18: 27 (1992) zeigen, dass 300 μg/ml 8-MOP zusammen mit 10 Std. Bestrahlung mit Ultraviolettlicht Viren in Humanserum effizient hemmen können. Ähnliche Untersuchungen mit 8-MOP und Aminomethyltrimethylpsoralen (AMT) wurden von anderen Forschern beschrieben. Dodd R. Y., et al., Transfusion 31: 483–490 (1991); Margolis-Nunno, H., et al., Thromb. Haemostas 65: 1162 (Abstract) (1991). Tatsächlich wurde die Photoinaktivierung eines breiten Spektrums von Mikroorganismen entwickelt, einschließlich HBV, HCV, und HIV, unter Bedingungen, die sich von denen, die erfindungsgemäß verwendet werden, unterscheiden, und die zuvor bekannte Psoralen-Derivate verwenden. [Hanson C. V., Blood Cells: 18: 7–24 (1992); Alter, H. J., et al., The Lancet ii:1446 (1988); Margolis-Nunno H. et al., Thromb Haemostas 65:1162 (Abstract) (1991).]
  • Die Psoralen-Photoinaktivierung ist nur realisierbar, wenn die Fähigkeit von Psoralen zur Inaktivierung von Viren zur Gewährleistung einer Sicherheitsspanne hinreicht, in der eine vollständige Inaktivierung erfolgt. Das Psoralen darf dagegen nicht derart sein, dass es die Blutprodukte schädigt. Die soeben beschriebenen Verfahren erfordern bei Einsatz bekannter Psoralene die Verwendung schwieriger und teurer Verfahren zur Vermeidung von Schäden an Blutprodukten. Einige Verbindungen und Protokolle erfordern die Entfernung von molekularem Sauerstoff aus der Reaktion vor dem Aussetzen gegenüber Licht, so dass der Schaden der Blutprodukte von Sauerstoffradikalen, die bei der Bestrahlung entstehen, verhindert wird. Siehe L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989); U.S. Pat. Nr. 4,727,027, an Wiesehahn. Dies ist ein teures und zeitaufwändiges Verfahren.
  • Schließlich weisen einige gemeinhin bekannte Verbindungen, die bei photochemischer Dekontamination (PCD) verwendet werden, eine unerwünschte Mutagenität auf, die scheinbar mit steigender Fähigkeit zum Abtöten von Virus steigt. Mit anderen Worten, je effizienter die bekannten Verbindungen Viren inaktivieren, desto schädlicher sind die Verbindungen für den Empfänger, und somit umso weniger nützlich sind sie an einer beliebigen Stelle in einem Inaktivierungssystem von Produkten für die In-vivo-Verwendung.
  • Es wird eine neue Psoralen-Verbindungen benötigt, welche eine verbesserte Fähigkeit zur Inaktivierung von Pathogenen und niedrige Mutagenität aufweist, ohne dass die Blutprodukte signifikant geschädigt werden, für die sie verwendet werden, und ohne dass man den Sauerstoff entfernen muss, wodurch eine sichere und vollständige Inaktivierung von Pathogenen in den Blutdekontaminationsverfahren ermöglicht wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und stellt ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in Blutprodukten und Blutprodukten in synthetischen Medien bereit.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in Blutpräparaten, umfassend in der folgenden Reihenfolge:
    • a) Bereitstellen in einer beliebigen Reihenfolge: i) von einer oder mehreren photoaktiven Verbindungen oder Salzen davon der folgenden Formel:
      Figure 00070001
      worin: X1 eine Kohlenwasserstoffkette mit einer Gesamtlänge von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, wobei 0 bis 6 dieser Kohlenstoffatome unabhängig durch NH oder O ersetzt sind, und die Austauschpunkte jeweils durch mindestens zwei Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, und sie von dem Psoralen durch mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt sind, und X2, X3 und X4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist; ii) von Photoaktivierungsvorrichtungen zum Photoaktivieren der Verbindungen oder von deren Salzen; und iii) von einem Blutpräparat, von dem vermutet wird, dass es durch einen Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure kontaminiert ist;
    • b) Zugeben der Verbindungen oder von deren Salzen zu dem Blutpräparat; und
    • c) Photoaktivieren der Verbindungen oder von deren Salzen unter Bedingungen, die zum Inaktivieren des Mikroorganismus hinreichen.
  • Es sind andere Ausführungsformen aufgenommen, wobei das Pathogen einzellige und mehrzellige Organismen umfasst, wie Bakterien, Pilze, Mycoplasmen und Protozoen, oder wobei das Pathogen ein Virus umfasst. Das Blutpräparat kann ebenfalls Blutplättchen oder Plasma umfassen. Bei einer Ausführungsform umfasst die Photoaktivierungsvorrichtung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Inaktivierung von Pathogenen eine Photoaktivierungsvorrichtung, die eine bestimmte Intensität eines Spektrums an elektromagnetischer Strahlung emittieren kann, einschließlich der Wellenlängen zwischen 180 nm und 400 nm. Bei einer Ausführungsform ist die Intensität zwischen 1 und 30 mW/cm2. Bei einer weiteren Ausführungsform wird das Blutpräparat der Intensität zwischen 1 sec und 30 min ausgesetzt. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung Wellenlängen zwischen 320 und 380 nm.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das Blutpräparat in einem synthetischen Medium. Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Verbindung bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,1 und 250 μM zu dem Blutpräparat gegeben oder spezifisch bis zu einer Endkonzentration zwischen 10 und 150 μM. Bei einer weiteren Ausführungsform wird der Schritt c ohne Einschränkung der Konzentration an molekularem Sauerstoff durchgeführt.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das 4'-primär-Amino-substituierte Psoralen: a) einen Substituenten X1 am 4'-Kohlenstoffatom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: -(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2,
    -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2 und
    -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4(CH2)z-NH2; wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus O oder NH, wobei w eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, y eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, und z eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, und b) die Substituenten X4, X2 und X3 an den Kohlenstoffatomen 4, 5' bzw. 8, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, umfassend H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist; oder ein Salz davon. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Verbindung in einer Lösung vor Schritt c, wobei die Lösung Wasser, Salzlösung oder ein synthetisches Medium umfassen kann. Bei einer Ausführungsform umfasst das synthetische Medium zudem Natriumacetat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Natriumcitrat, Natriumphosphat und Magnesiumchlorid. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das synthetische Medium mindestens einen Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannit und Glucose. Bei einer alternativen Ausführungsform umfasst das synthetische Medium zudem Natriumacetat, Natriumchlorid, Citrat und Natriumphosphat.
  • Bei einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist vor Schritt (b) das synthetische Medium in einem ersten Blutbeutel enthalten und das Plättchenpräparat ist in einem zweiten Blutbeutel enthalten. Bei einer weiteren Ausführungsform wird das synthetische Medium zu dem Plättchenpräparat in Schritt (b) gegeben, und zwar durch Ausdrücken des synthetischen Mediums aus dem ersten Blutbeutel in den zweiten Blutbeutel über eine sterile Verbindung.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung in einer trockenen Formulierung vor Schritt c. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure DNA oder RNA, doppelsträngig oder einzelsträngig.
    wobei ein Pathogen mit Nukleinsäure in einem zweiten Blutbeutel enthalten ist; b) Zugeben des synthetischen Mediums zum Plättchenpräparat durch Ausdrücken des synthetischen Mediums aus dem ersten Blutbeutel in den zweiten Blutbeutel über eine sterile Verbindungsvorrichtung; und c) Photoaktivierung der Verbindung, damit die Replikation von im Wesentlichen der gesamten Pathogen-Nukleinsäure verhindert wird, ohne dass die biologische Aktivität des Plättchenpräparates signifikant verändert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Synthese verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen. Bei einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 4'-(ω-Amino-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von 4'-(ω-Hydroxy-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen; b) Behandeln von 4'-(ω-Hydroxy-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit einer Base und Methansulfonylchlorid, so dass 4'(ω-Methansulfonyloxy-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen hergestellt wird; c) Behandeln von 4'-(ω-Methansulfonyloxy-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit Natriumazid, so dass 4'-(ω-Azido-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen hergestellt wird, und d) Reduzieren von 4'-[(ω-Azido-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen, so dass 4'-[(ω-Amino-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird. Bei einer Ausführungsform dieses Syntheseverfahrens ist das 4'-[(ω-Amino-2-oxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen 4'-[(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird in Schritt (d) 4'-[(4-Azido-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit Triphenylphosphin reduziert. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine Psoralen-Verbindung, die durch das oben beschriebene Syntheseverfahren hergestellt wird, umfassend 4'-[(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese einer weiteren Psoralen-Verbindung, mit einem Substituenten R1 am 4'-Kohlenstoffatom, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend -(CH2)-O-(CH2)x-O-(CH2)z-NH2, wobei x = z, und den Substituenten R5, R6, und R7 an den 4'-, 5'- und 8-Kohlenstoffatomen, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, umfassend H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralens, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und 4'-Iodmethyl-4,5',8-trimethylpsoralen; b) Behandeln von 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit HO(CH2)xO(CH2)zOH, so dass 4'-(ω-Hydroxy-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen hergestellt wird, wobei n = x + 3 ist; c) Behandeln von 4'-(ω-Hydroxy-2,3-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit einer Base und Methansulfonylchlorid, so dass 4'-(ω-Methansulfonyloxy-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen hergestellt wird; d) Behandeln von 4'-(ω-Methansulfonyloxy-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit Natriumazid, so dass 4'-(ω-Azido-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird; und e) Reduzieren von 4'-(ω-Azido-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen, so dass 4'-(ω-Amino-2,n-dioxa)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird. In einer alternativen Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralens, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und 4'-Iodmethyl-4,5',8- trimethylpsoralen; b) Behandeln des 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralens mit Diethylenglykol, so dass 4'-(7-Hydroxy-2,5-dioxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird; c) Behandeln von 4'-(7-Hydroxy-2,5-dioxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit einer Base und Methansulfonylchlorid, so dass 4'-(7-Methansulfonyloxy-2,5-dioxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird; d) Behandeln von 4'-(7-Methansulfonyloxy-2,5-dioxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit 1,4-Diaminobutan, so dass 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wird.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 4'-(ω-Amino-2-aza)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen, umfassend: a) das Bereitstellen von 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Brommethyl-4,5'8-trimethylpsoralen, und 4'-Iodmethyl-4,5',8-trimethylpsoralen; b) Behandeln des 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralens mit 1, ω-Diaminoalkan zur Herstellung von 4'-(ω-Amino-2-aza)alkyl-4,5',8-trimethylpsoralen. Bei einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5'8-trimethylpsoralen, umfassend: a) das Bereitstellen von 4,5',8-Trimethylpsoralen-4'-carboxaldehyd; b) das Behandeln von 4,5',8-Trimethylpsoralen-4'carboxaldehyd mit Spermin und einem Reduktionsmittel, so dass man 4'-(14-Amino-2,6,11-triaza)tetradecan-4,5',8-trimethylpsoralen erhält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese von 5-(ω-Amino-2-aza)alkyl-4,4',8- trimethylpsoralen, umfassend a) das Bereitstellen eines 5'-Halogenmethyl-4,4',8-trimethylpsoralens, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 5'-Chlormethyl-4,4',8-trimethylpsoralen, 5'-Brommethyl-4,4',8-trimethylpsoralen, und 5'-Iodmethyl-4,4',8-trimethylpsoralen; b) Behandeln des 5'-Halogenmethyl-4,4',8-trimethylpsoralens mit einem 1,ω-Diaminoalkan, so dass man 5'-(ω-Amino-2-aza)alkyl-4,4',8-trimethylpsoralen erhält. Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Synthese von 4,8-Dialkyl-5'brommethyl-4'-methylpsoralenen, umfassend: a) das Bereitstellen von 4,8-Dialkyl-7-(1-methyl-2-oxopropyloxy)psoralen; d) Rühren von 4,8-Dialkyl-4',5'-dimethylpsoralen in Tetrachlorkohlenstoff, so dass man 4,8-Dialkyl-5'-brommethyl-4'-methylpsoralen erhält. Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Synthese von 4,8-Dialkyl-4'-brommethyl-4'methylpsoralenen, umfassend: a) das Bereitstellen von 4,8-Dialkyl-7-(1-methyl-2-oxopropyloxy)psoralen; d) Rühren von 4,8-Dialkyl-4',5'-dimethylpsoralen in Methylenchlorid, so dass man 4,8-Dialkyl-4'-brommethyl-5'-methylpsoralen erhält.
  • Die Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel:
    Figure 00130001
    oder ein Salz davon. Die Erfindung betrifft auch eine Psoralen-Verbindung, umfassend: a) einen Substituenten R1 am 4'-Kohlenstoffatom, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend -(CH2)u-NH2-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2 und -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2; wobei R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus O und NH, wobei u eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, w eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, x eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, y eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist; und z eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; und b) die Substituenten R5, R6 und R7 am 4-, 5' – bzw. 8-Kohlenstoffatom unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, oder ein Salz davon. Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere Ausführungsformen dieser Verbindung, einschließlich: wobei der Substituent R1 -CH2-O-(CH2)2-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind, wobei der Substituent R1 -CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind; wobei der Substituent R1 -CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-(CH2)4-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind; wobei der Substituent R1 CH2-NH-(CH2)4-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind, und wobei der Substituent R1 -CH2-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind.
  • In einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Psoralenverbindung, umfassend: a) einen Substituenten R1 am 5'-Kohlenstoffatom, ausgewählt aus der Gruppe: -(CH2)uNH2, -(CH2)w-R2-(CH2)zNH2, -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2, und -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4(CH2)z-NH2 wobei R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend O and NH, und wobei u eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, w eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis -5 ist, y eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, und z eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist; und b) die Substituenten R5, R6, und R7 an den 4-, 4'-, bzw. 8-Kohlenstoffatomen unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, wobei wenn R1 -(CH2)u-NH2 ist, R7 dann (CH2)CH3 ist und wobei wenn R5, R6, und R7 (CH2)vCH3 sind, u eine ganze Zahl von 3 bis 10 ist; oder ein Salz davon. Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere Ausführungsformen dieser Verbindung einschließlich: wobei der Substituent R1 -CH2-NH-(CH2)4-NH2 ist, und die Substituenten R5, R6, und R7 jeweils CH3 sind und wobei der Substituent R1 CH2-O-(CH2)2-NH2 ist und die Substituenten R5, R6 und R7 jeweils CH3 sind.
  • Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung mehrere Ausführungsformen eines synthetischen Blutplättchenspeichermediums. Bei einer Ausführungsform umfasst das synthetische Blutplättchenspeichermedium eine wässrige Lösung von: 45–100 mM Natriumchlorid; 4–5 mM Kaliumchlorid; 10–15 mM Citrat; 20–27 mM Natriumacetat; 0–2 mM Glucose; 0–30 mM Mannit; etwa 20 mM Natriumphosphat; 2–3 mM Magnesiumchlorid; und ein Psoralen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 4'-primär-Aminopsoralen und 5'-primär-Aminopsoralen, bei einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 250 μM. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das wässrige Blutplättchenspeichermedium eine wässrige Lösung von: 45–100 mM Natriumchlorid; 8–15 mM Citrat; 20–35 mM Natriumacetat; etwa 26 mM Natriumphosphat; ein Psoralen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 4'-primär-Aminopsoralen und 5'-primär-Aminopsoralen, bei einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 250 μM. Bei einer Ausführungsform umfasst dieses Medium insbesondere 86 mM Natriumchlorid, 10 mM Citrat, 30 mM Natriumacetat, etwa 26 mM Natriumphosphat, und 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen bei einer Konzentration zwischen etwa 1 und 250 μM.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung mit antiviralen Eigenschaften, umfassend eine wässrige Lösung von 4'-primär-Amino-substituiertem Psoralen und Plättchen, die sich für die In vivo-Verwendung eignen. Bei einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung zudem ein synthetisches Medium, umfassend Natriumacetat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Natriumcitrat, Natriumphosphat und Magnesiumchlorid. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das synthetische Medium zudem mindestens einen Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannit und Glucose. Bei einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung mit antiviralen Eigenschaften, umfassend eine wässrige Lösung eines 5'-primär-Amino-substituierten Psoralens und Blutplättchen, die sich für die in vivo-Verwendung eignen. Bei einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung zudem.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Es zeigt:
  • 1 Einzelheiten des Verbindungssyntheseschemas der beiden Isomere von Brommethyl-trialkylpsoralen;
  • 2 Einzelheiten des Verbindungssyntheseschemas mehrerer 4'-primär-Amino-substituierter Psoralene;
  • 3 Einzelheiten des Verbindungssyntheseschemas mehrerer 4'-primär-Amino-substituierter Psoralene;
  • 4 Einzelheiten des Verbindungssyntheseschemas mehrerer Psoralene mit einem an der 4'-Position über eine Alkylkette am Psoralen gebundenen terminalen Amin;
  • 5 Einzelheiten des Verbindungssyntheseschemas mehrerer 5'-primär-Amino-substituierter Psoralene;
  • 6 eine Perspektivansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
  • 7 einen Querschnitt der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linie 2-2;
  • 8 einen Querschnitt der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linie 3-3;
  • 9 einen Querschnitt der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linie 4-4;
  • 10A ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen 8, 13, und 14;
  • 10B ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen 2, 4, und 7;
  • 10C ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen 1, 5, 6, 9, und 10;
  • 10D ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen 12 und 15;
  • 10E ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindung 3;
  • 10F ein Diagramm der Synthesewege und chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen 16 und 17;
  • 11 die Auswirkung der Konzentration der log Abtötung von R17, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen 1–3 photoaktiviert werden;
  • 12 die Auswirkung der Konzentration der log Abtötung von R17, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen 3–6 photoaktiviert werden;
  • 13 die Auswirkung der Konzentration der log Abtötung von R17, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen 2 und 6 photoaktiviert werden;
  • 14 die Auswirkung der Konzentration der log Abtötung von R17, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen 6 und 18 photoaktiviert werden;
  • 15 die Auswirkung der Konzentration der log Abtötung von R17, wenn die erfindungsgemäße Verbindung 16 photoaktiviert wird;
  • 16 die Auswirkung variierender Joules/cm2 (Wattsekunde/cm2) der Strahlung auf den log Titer von R17 für die erfindungsgemäße Verbindung 6;
  • 17 die Auswirkung variierender Joules/cm2 der Strahlung auf den log Titer von R17 für die erfindungsgemäßen Verbindungen 7, 9 und 10;
  • 18 die Auswirkung variierender Joules/cm2 der Strahlung auf den log Titer von R17 für die erfindungsgemäßen Verbindungen 7 und 12;
  • 19 die Auswirkung variierender Joules/cm2 der Strahlung auf den log Titer von R17 für die erfindungsgemäße Verbindung 15;
  • 20 die Auswirkung variierender Joules/cm2 der Strahlung auf den log Titer von R17 für die erfindungsgemäße Verbindung 17;
  • 21 bis 23 nicht verwendete Nummerierung;
  • 24 die Auswirkung der Konzentrationsveränderung der erfindungsgemäßen Verbindungen 2 und 6 in synthetischem Medium.
  • 25A schematisch den Standard-Blutprodukttrennungsansatz, der derzeit in Blutbanken verwendet wird;
  • 25B schematisch eine erfindungsgemäße Ausführungsform, wodurch das synthetische Medium in das wie in 25A hergestellte Blutplättchenkonzentrat eingebracht wurde;
  • 25C schematisch eine erfindungsgemäße Ausführungsform des Dekontaminationsansatzes, der spezifisch auf das Blutplättchenkonzentrat angewendet wurde, das wie in 25B mit synthetischem Medium verdünnt wurde;
  • 26A, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 2 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die Plättchenzahl gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 26B, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 2 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die Plättchenaggregation gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 26C, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 2 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die GMP140-Expression gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 26D, ein Schaubild, den vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 2 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch den pH-Wert gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 27A, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 6 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion wie es durch die Plättchenzahl gemessen wurde. "n" veran schaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 27B, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 6 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die Plättchenaggregation gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 27C, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 6 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die GMP140-Expression gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 27D, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 6 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch den pH-Wert gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 28A, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 17 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion wie es durch die Plättchenzahl gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 28B, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 17 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die Plättchenaggregation gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 28C, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 17 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die GMP140-Expression gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 28D, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 17 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch den pH-Wert gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 29A, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 18 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion wie es durch die Plättchenzahl gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 29B, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behand lung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 18 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die Plättchenaggregation gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 29C, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 18 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch die GMP140-Expression gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • 29D, ein Schaubild, den Vergleich einer Tag-1-Kontrolle (C1), einer 5 Tage lang aufbewahrten Kontrolle (D5), Ultraviolettlicht allein (uv) und Behandlung mit Ultraviolettlicht und Verbindung 18 bei 100 μM (PCD) über ihre Wirkungen auf die Plättchenfunktion, wie es durch den pH-Wert gemessen wurde. "n" veranschaulicht die Anzahl der Experimente, die durch den Datenpunkt veranschaulicht werden;
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in Blutprodukten bereit, die in vivo und in vitro verwendet werden sollen, ohne dass die Blutproduktfunktion signifikant beeinträchtigt wird oder dass sie Mutagenität aufweisen.
  • Die erfindungsgemäßen Inaktivierungsverfahren stellen Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen bereit, und insbesondere Viren, in Blutprodukten, vor der Verwendung in vivo oder in vitro. Gegenüber den vorhergehenden Ansätzen erfordert das Verfahren nur kurze Bestrahlungszeiten und man braucht die Konzentration von molekularem Sauerstoff nicht einzuschränken.
  • Die erfindungsgemäße Beschreibung ist unterteilt in die folgenden Abschnitte: I) Photoaktivierungsvorrichtungen, II) Synthese der Verbindungen, III) Bindung der Verbindungen an Nukleinsäure, IV) Inaktivierung von Kontaminanten, und V) Wahrung der biochemischen Eigenschaften des behandelten Materials.
  • I. PHOTOAKTIVIERUNGSVORRICHTUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Photoaktivierungsverfahren, insbesondere zur Photoaktivierung von photoreaktiven Nukleinsäure-bindenden Verbindungen. Im Allgemeinen umfasst eine Photoaktivierungsvorrichtung zum Behandeln photoreaktiver Verbindungen: a) Vorrichtungen zum Bereitstellen von elektromagnetischer Strahlung mit geeigneten Wellenlängen, so dass eine Photoaktivierung von mindestens einer photoreaktiven Verbindung erfolgt; b) Vorrichtungen zum Halten einer Reihe von Proben in einer festen Beziehung zur Strahlungsquelle bei der Photoaktivierung, und c) Vorrichtungen zum Erhalten der Temperatur der Proben in einem gewünschten Temperaturenbereich während der Photoaktivierung.
  • Die Hauptmerkmale einer Ausführungsform der Vorrichtung beinhalten: A) eine kostengünstige Quelle für Ultraviolettstrahlung in einer festen Beziehung mit der Vorrichtung zum Halten der Probenbehälter, B) rasche Photoaktivierung, C) große Probenverarbeitung, D) Temperatursteuerung der bestrahlten Proben und E) inhärente Sicherheit.
  • A. Elektromagnetische Strahlungsquelle
  • Viele Quellen für ultraviolette Strahlung können erfolgreich bei Dekontaminationsprotokollen mit Psoralenen verwendet werden. Einige Gruppen haben beispielsweise eine Probe von oben und unten mit fluoreszieren den UVA-Glühbirnen vom General-Electric Typ F20T12-BLB mit Elektrogebläse bestrahlt, das vorsichtig über die Lampen bläst, so dass der Bereich gekühlt wird. Alter, H.J. et al., The Lancet, 24–1446 (1988). Eine weitere Gruppe verwendete eine langwellige Ultraviolettlampe Typ A405-TLGW/05, hergestellt von P.W. Allen Co., London, die oberhalb der Virusprobe in direktem Kontakt mit den Deckeln der Petrischalen untergebracht war, die die Proben enthielten, und bei Raumtemperatur angeschaltet wurde. Die an die Proben unter diesen Bedingungen übermittelte Gesamtintensität war 1,3 × 1015 Photonen/sec cm2 (oder 0,7 mW/cm2 oder 0,0007 J/cm2 sec) in der Petrischale. Hearst, J.E. und Thiry, L. Nucleic Acids Research 4: 1339 (1977).
  • Eine bevorzugte Photoaktivierungsvorrichtung hat eine kostengünstige Quelle für Ultraviolettstrahlung in einer festen Beziehung mit der Vorrichtung zum Halten der Probengefäße. Ultraviolettstrahlung ist eine Form der Energie, die einen Teil des elektromagnetischen Strahlungsspektrums abdeckt (das elektromagnetische Strahlungsspektrum reicht von kosmischen Strahlen bis hin zu Radiowellen). Ultraviolettstrahlung kann von vielen natürlichen und künstlichen Quellen stammen. Je nach der Quelle für Ultraviolettstrahlung, kann diese mit anderen (Nicht-Ultraviolett)-Typen der elektromagnetischen Strahlung einhergehen (beispielsweise sichtbares Licht).
  • Bestimmte Typen der Ultraviolettstrahlung sind hier in Bezug auf die Wellenlänge beschrieben. Die Wellenlänge ist hier in Nanometern ("nm", 10–9 m) ausgedrückt. Für die erfindungsgemäßen Zwecke reicht die Ultraviolettstrahlung von etwa 180 nm bis 400 nm. Ermöglicht eine Strahlungsquelle mittels Filter oder anderen Einrichtungen keine Strahlung unter einer bestimmten Wellenlänge (beispielsweise 320 nm), hat diese somit ein "Cut-Off" am unteren Ende bei dieser Wellenlänge (beispielsweise einen "Wellenlängen-Cutoff bei 300 nm"). Ermöglicht entsprechend eine Strahlungsquelle nur Strahlung unterhalb einer bestimmten Wellenlänge (beispielsweise 360 nm), hat diese ein sogenanntes "Cut-Off" am oberen Ende bei dieser Wellenlänge (beispielsweise "einen Wellenlängen-Cut-Off bei 360 nm").
  • Für jede photochemische Reaktion möchte man jegliche schädlichen Nebenreaktionen eliminieren oder zumindest minimieren. Einige dieser Nebenreaktionen können durch die Anregung endogener Chromophore verursacht werden, die während des Photoaktivierungsverfahren vorhanden sein können. In einem System, bei dem nur Nukleinsäure und Psoralen zugegen sind, sind die endogenen Chromophore die Nukleinsäurebasen selbst. Die Restriktion des Photoaktivierungsverfahrens auf Wellenlängen über 320 nm minimiert die direkte Nukleinsäure-Beschädigung, da Nukleinsäuren oberhalb von 313 nm nur wenig absorbieren.
  • In Humanserum oder Plasma ist beispielsweise die Nukleinsäure gewöhnlich zusammen mit zusätzlichen biologischen Bestandteilen zugegen. Ist das biologische Fluid nur ein Protein, ist der 320 nm-Cut-Off adäquat zur Minimierung der Nebenreaktionen (aromatische Aminosäuren absorbieren nicht oberhalb von 320 nm). Umfasst das biologische Fluid andere Analyten, können dies Bestandteile sein, die gegenüber bestimmten Lichtwellenlängen empfindlich sind. Angesichts des Vorhandenseins dieser endogenen Bestandteile möchte man, dass die Vorrichtung derart ausgelegt ist, dass Strahlung innerhalb eines engen Bereichs spezifischer und gewünschten Wellenlängen möglich ist, und somit die Schädigung von Blutkomponenten vermieden wird. Der bevorzugte Bereich der gewünschten Wellenlängen ist zwischen 320 und 350 nm.
  • Eine gewisse Selektivität kann durch Auswahl kommerzieller Strahlungsquellen erzielt werden. Typische Fluoreszenzröhrenemissionswellenlängen emittieren zwar von 300 nm bis über 400 nm (mit einem breiten Peak um 360 nm), jedoch sind BLB-Fluoreszenzlampen so ausgelegt, dass sie Wellenlängen über 400 nm entfernen. Dies schafft jedoch nur ein Cut-Off am oberen Ende.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung eine zusätzliche Filtervorrichtung. Bei einer Ausführungsform umfasst die Filtervorrichtung einen Glas-Cut-Off-Filter, wie ein Stück Kobaltglas. Bei einer Ausführungsform ist die Filtervorrichtung BK-7-Glas, erhältlich von Schott Glass Technologies, Inc. Duryea, PA. Bei einer weiteren Ausführungsform umfassen die Filtervorrichtungen eine Flüssigkeitsfilterlösung, die nur einen spezifischen Bereich des elektromagnetischen Spektrums durchlässt, wie eine wässrige Co(NO3)2-Lösung. Die Salzlösung ergibt ein Transmissionsfenster von 320 bis 400 nm. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die wässrige Co(No3)2-Lösung in Kombination mit NiSO4 verwendet, um die 365 nm-Komponente des Emissionsspektrums der eingesetzten fluoreszierenden oder Bogenquelle zu entfernen. Die Co-Ni-Lösung bewahrt die anfängliche Transmission selbst nach 10 Std. Exposition gegenüber direktem Licht von hohen Energiequellen bemerkenswert gut.
  • Mehrere anorganische Salze und Gläser erfordern die notwendigen Anforderungen. Kupfersulfat ist beispielsweise ein höchst nützlicher allgemeiner Füllstoff zum Entfernen des Infrarotlichts, wenn nur das Ultraviolettlicht isoliert werden soll. Seine Stabilität in starken Quellen ist recht gut. Andere Salze sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Öffnungs- oder Reflektorlampen können ebenfalls zur Erzielung spezifischer Wellenlängen und Intensitäten verwendet werden.
  • Ultraviolettstrahlung wird hier als Bestrahlung beschrieben. Sie wird ausgedrückt als Intensitätsfluss (Milliwatt pro Quadratcentimeter oder mW/cm2 oder J/cm2s). "Ausgang" ist hier so definiert, dass es sowohl die Emission der Strahlung (ja oder nein, an oder aus) als auch den Grad der Strahlung umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Intensität an 4 Stellen überwacht; 2 für jede Seite der Strahlungsebene.
  • Eine bevorzugte Quelle für Ultraviolettstrahlung ist eine fluoreszierende Quelle. Fluoreszenz ist ein spezieller Fall von Lumineszenz. Lumineszenz beinhaltet die Absorption der elektromagnetischen Strahlung durch eine Substanz und die Umwandlung der Energie in Strahlung einer anderen Wellenlänge. Über die Fluoreszenz kehrt die durch die elektromagnetische Strahlung angeregte Substanz in ihren Grundzustand zurück, indem ein Quant der elektromagnetischen Strahlung emittiert wird. Fluoreszierende Quellen haben zwar wahrscheinlich eine zu niedrige Intensität, als dass sie für die Photoaktivierung geeignet sind, bei einer Ausführungsform setzt die vorliegende Erfindung jedoch fluoreszierende Quellen ein, damit Ergebnisse erzielt werden, die bisher nur durch teure Ausrüstung erzielbar waren.
  • Wie hier verwendet, ist feste Beziehung definiert als feste Distanz und Geometrie zwischen der Probe und der Lichtquelle bei der Probenbestrahlung. Distanz betrifft den Abstand zwischen der Quelle und der Probe, wie sie gehalten wird. Es ist bekannt, dass Lichtintensität von einer Punktquelle umgekehrt proportional zum Quadrat des Abstandes von der Punktquelle ist. Somit können kleine Änderungen des Abstandes von der Quelle einen starken Einfluss auf die Intensität haben. Da Änderungen der Intensität die Photoaktivierungsergebnisse schädigen können, werden Änderungen der Distanz in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen vermieden. Dies schafft Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit.
  • Die Geometrie betrifft die Positionierung der Lichtquelle. Man kann sich beispielsweise vorstellen, dass die Lichtquelle auf vielerlei Arten um den Probenhalter untergebracht wird (an den Seiten, am Boden, in einem Kreis, usw.). Die in einer bevorzugten Ausführungsform verwendete Geometrie ermöglicht die gleichförmige Lichteinwirkung einer geeigneten Intensität für rasche Photoaktivierung. Die Geometrie einer erfindungsgemäßen bevorzugten Vorrichtung beinhaltet vielfache Quellen linearer Lampen gegenüber einzelnen Punktquellen. Zudem gibt es mehrere reflektierende Oberflächen und mehrere absorbierende Oberflächen. Aufgrund dieser komplizierten Geometrie müssen Änderungen der Unterbringung oder Anzahl der Lampen relativ zu der Stelle der zu bestrahlenden Proben insofern vermieden werden, als solche Änderungen zu Intensitätsänderungen führen.
  • B. Rasche Photoaktivierung
  • Die Lichtquelle der bevorzugten Ausführungsform ermöglicht eine rasche Photoaktivierung. Die Intensitätseigenschaften der Strahlungsvorrichtung wurde derart ausgewählt, dass sie geeignet sind unter der Annahme, dass viele Sätze von mehrfachen Proben verarbeitet werden müssen. Unter dieser Annahme ist eine Einwirkzeit von 15 min oder weniger ein praktisches Ziel.
  • Bei der Anordnung der Vorrichtungen kann die relative Position der Elemente der bevorzugten Vorrichtung optimiert werden, so dass eine Strahlungsdauer von etwa 15 min ermöglicht wird, so dass wenn für die Wellenlängen zwischen 320 und 350 nm gemessen wird, ein Intensitätsfluss von mehr als etwa 1 mW/cm2 (0,001 J/cm2sec) bei den Probengefäßen bereitgestellt wird.
  • C. Verarbeitung großer Mengen Proben
  • Wie erwähnt ist ein weiteres wichtiges Merkmal der Photoaktivierungsgeräte, dass sie die Verarbeitung großer Mengen Proben bereitstellen. Diesbezüglich ist ein Element der Vorrichtungen eine Vorrichtung zum Halten einer Vielzahl von Blutbeuteln. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst die Haltevorrichtung eine Blutbeutelhalterung, die sich zwischen zwei Lichtbänken befindet. Durch Aufnahme der gemeinhin verwendeten kommerziell verfügbaren Beutel ermöglicht die Vorrichtung eine geeignete Verarbeitung großer Probenmengen.
  • D. Temperatursteuerung
  • Wie bereits erwähnt, ist eine der wichtigen Eigenschaften der Photoaktivierungsvorrichtungen eine Temperatursteuerung. Die Temperatursteuerung ist wichtig, weil die Temperatur der Probe in der Probe zum Zeitpunkt der Lichteinwirkung die Ergebnisse drastisch beeinflussen kann. Die Bedingungen, die die Sekundärstruktur in Nukleinsäuren fördern, steigern beispielsweise auch die Affinitätskonstanten vieler Psoralenderivate für Nukleinsäuren. Hyde und Hearst, Biochemistry, 17, 1251 (1978). Diese Bedingungen sind eine Mischung aus Lösungsmittel-Zusammensetzung und Temperatur. Bei einzelsträngiger 5S-Ribosomen-RNA steigert die Strahlung bei niedrigen Temperaturen die kovalente Bindung von HMT an 5S-rRNA um das Doppelte bei 4°C verglichen mit 20°C. Thompson et al., J. Mol. Biol. 147: 417 (1981). Noch stärkere temperaturinduzierte Steigerungen der Psoralenbindung wurden mit synthetischen Polynukleotiden beschrieben. Thompson et al., Biochemistry 21: 1363 (1982).
  • E. Inhärente Sicherheit.
  • Die Ultraviolettstrahlung kann schwere Verbrennungen verursachen. Je nach der Beschaffenheit der Einwirkung kann sie auch krebserregend sein. Die Lichtquelle einer bevorzugten Ausführungsform ist gegenüber dem Verbraucher abgeschirmt. Dies steht den kommerziellen Hand-Ultraviolettquellen sowie den großen Hochintensitätsquellen gegenüber. Bei einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Strahlungsquelle in einem Gehäuse aus einem Material, das die Übertragung der Strahlungsenergie blockiert (d.h. ein lichtundurchlässiges Gehäuse). Keine Strahlung darf zu dem Benutzer gelangen. Dies gewährleistet eine inhärente Sicherheit für den Benutzer.
  • II. SYNTHESE DER VERBINDUNGEN
  • A. Photoaktivierungs-Verbindungen im Allgemeinen.
  • "Photoaktivierungs-Verbindungen" (oder "photoreaktive Verbindungen") definiert eine Familie von Verbindungen, die eine chemische Änderung in Reaktion auf die elektromagnetische Strahlung durchlaufen. Die Tabelle 1 ist eine partielle Liste von Photoaktivierungs-Verbindungen. Tabelle 1. Photoaktivierungs-Verbindungen Aktinomycine, Anthracyclinone, Anthramycin, Benzodipyrone, Fluorene und Fluorenone. Furocumarine, Mitomycin, Monostral Fast Blue Norphilin A. Viele organische Farbstoffe, die nicht speziell aufgeführten Phenanthridine, Phenazathionium-Salze, Phenazine, Phenothiazine, Phenylazide, Chinoline, Thiaxanthenone. Die bevorzugten Spezies von photoreaktiven Verbindungen, die hier beschrieben sind, werden gemeinhin als Furocumarine bezeichnet. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere solche Verbindungen, die als Psoralene beschrieben sind: [7H-Furo(3,2-g)-(1)-benzo-pyran-7-on oder β-Lacton von 6-Hydroxy-5-benzofuranacrylsäure], die linear sind:
    Figure 00310001
    und in denen die beiden Sauerstoffreste, die an der zentralen aromatischen Einheit anhängen, eine 1,3-Orientierung aufweisen, und wobei weiter die Furanring-Einheit an der 6-Position des Zweiring-Cumarinsystems gebunden ist. Psoralen-Derivate werden hergeleitet von der Substitution des linearen Furocumarins an den 3-, 4-, 5-, 8-, 4'- oder 5'-Positionen.
  • Methoxypsoralen (in der Literatur unter verschiedenen Bezeichnungen bekannt, beispielsweise Xanthotoxin, Methoxsalen, 8-MOP) ist ein natürlich vorkommendes Psoralen mit relativ schwacher photoaktivierter Bindung an Nukleinsäuren und schwacher Mutagenität im Ames-Test, der im nachfolgenden Experimental-Abschnitt beschrieben ist. 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (AMT) ist eines der reaktivsten nukleinsäurebindenden Psoralen-Derivate, welches bis zu 1 AMT Addukt je 3,5 DNA-Basenpaare liefert. S.T. Isaacs, G. Wiesehahn und L.M. Hallick, NCI Monograph 66: 21 (1984). AMT weist auch signifikante Mutagenitätslevel auf. Eine neue Gruppe von Psoralenen wurde gewünscht, die die besten Eigenschaften von 8-MOP und AMT haben: niedrige Mutagenität und hohe Nukleinsäurebindungsaffinität, so dass eine sichere und sorgfältige Inaktivierung von Pathogenen gewährleistet wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als solche Verbindungen ausgelegt.
  • "4'-primär-Amino-subsitutierte Psoralene" sind definiert als Psoralen-Verbindungen, die eine NH2-Gruppe besitzen, die über eine Kohlenwasserstoff-Kette mit einer Gesamtlänge von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen an die 4'-Position von Psoralen gebunden ist, wobei 0 bis 6 dieser Kohlenstoffatome unabhängig durch NH oder O ersetzt sind, und jeder Austauschpunkt ist von jedem anderen Austauschpunkt um mindestens 2 Kohlenstoffatome getrennt und ist von dem Psoralen um mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt. 4'-primär-Amino-substituierte Psoralene können zusätzliche Substitutionen an den 4'-, 5'- und 8-Positionen des Psoralens haben, wobei die Substitutionen umfassen, aber nicht eingeschränkt sind auf die folgenden Gruppen: H und (CH2)nCH3, wobei n = 0 bis 6 ist.
  • B. Synthese der Psoralene
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Syntheseverfahren für die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, sowie neue Syntheseverfahren für bekannte Zwischenprodukte. Spezifisch sind die neuen Verbindungen mono-, di- oder trialkylierte 4'- oder 5'-primär-Amino-substituierte Psoralene. Mehrere Beispiele der in diesem Abschnitt erörterten Schemata sind in den 10A–10F erörtert. Für einen leichteren Bezug offenbart die Tabelle 2 die Nomenklatur, die für die hier erörterten Psoralenderivate verwendet wird. Die Strukturen der Verbindungen 1 bis 18 sind ebenfalls in den 10A–10F aufgeführt. Man beachte, dass in diesem Abschnitt (mit dem Titel "B. Synthese der Psoralene") die römischen Ziffern, die zur Identifikation von Verbindungen verwendet werden, nur mit den Schemata 1 bis 6 korrelieren, und nicht mit den Verbindungs-Nummern, die in der Tabelle 1 oder in den 10A–10F aufgeführt sind. Die Verbindungen 16 bis 18 bilden keinen Teil der Erfindung.
  • TABELLE 2
  • # VERBINDUNG
    • 1 4'-(4-Amino-2-aza)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 2 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 3 4'-(2-Aminoethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 4 4'-(5-Amino-2-oxa)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 5 4'-(5-Amino-2-aza)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 6 4'-(6-Amino-2-aza)hexyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 7 4'-(7-Amino-2,5-oxa)heptyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 8 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 9 4'-(13-Amino-2-aza-6,11-dioxa)tridecyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 10 4-(7-Amino-2-aza)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen
    • 11 4'-(7-Amino-2-aza-5-oxa)heptyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 12 4'-(9-Amino-2,6-diaza)nonyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 13 4'-(8-Amino-5-aza-2-oxa)octyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 14 4'-(9-Amino-5-aza-2-oxa)nonyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 15 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5',8- trimethylpsoralen
    • 16 5'-(4-Amino-2-aza)butyl-4,4',8-trimethylpsoralen
    • 17 5'-(6-Amino-2-aza)hexyl-4,4',8-trimethylpsoralen
    • 18 5'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,4',8-trimethylpsoralen
  • Es ist am logischsten, zuerst die Synthese der Zwischenprodukte zu beschreiben, die sich zur Synthese vieler Verbindungen eignen. Einige wichtige Zwischenprodukte umfassen Tri- und Tetramethylpsoralene, 4'-Halogenmethyl-4,5',8-trimethylpsoralene und 5'-Halogenmethyl-4,4',8-trimethylpsoralene. Die Herstel lung dieser wichtigen Zwischenprodukte bietet schwierige Herausforderungen.
  • Synthese von Zwischenprodukten
  • Die vorherigen Synthesen von 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (4'-CMT) und 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (4'-BrMT) beginnen bei 4,5',8-Trimethylpsoralen (5'-TMP), das kommerziell erhältlich ist (Aldrich Chemical Co., Milwaukee; WI) oder in vier Schritten wie nachstehend beschrieben für andere alkylierte Psoralene hergestellt werden kann. 5'-TMP wird in 4'-CMT umgewandelt, wobei ein großer Überschuss (20 bis 50 Äquivalente) hoch krebserregender und flüchtiger Chlormethylmethylether verwendet wird. Die Halogenmethylierung der 4,5',8-Trialkylpsoralene mit Chlormethylmethylether oder Brommethylmethylether ist in US-Patent Nr. 4,124,598 von Hearst beschrieben. Die Brom-Verbindung 4'-BrMT wird entsprechend hergestellt mittels Brommethylmethylether, der etwas weniger flüchtig ist. Die Ausbeuten von nur 30 bis 60% des gewünschten Zwischenproduktes werden erhalten. Das 5'-Chlormethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (5'-CMT) und 5'-Brommethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (5'-BrMT) werden ähnlich hergestellt, wobei die isomere Ausgangsverbindung 4,4',8-Trimethylpsoralen (4'-TMP) verwendet wird [US-Patent Nr. 4,294,822 von Kaufman; McLeod, et al., "Synthesis of Benzofuranoid Systems. I. Furocoumarins, Benzofurans and Dibenzofurans, "Tetrahedron Letters 237 (1972)]. Einige der Figuren, auf die in der folgenden Synthese-Diskussion Bezug genommen wird, enthalten römische Ziffern, die zur Markierung von Strukturen verwendet werden, die mehr als eine Verbindung umfassen. Dieses Nummerierungssystem unterscheidet sich von und sollte nicht nicht verwechselt werden mit dem Nummerierungs system von Tabelle 1, oben, das zur Identifizierung mehrerer spezifischer Verbindungen verwendet wurde.
  • Hier ist ein sehr verbessertes Verfahren beschrieben worden, das die Synthese von beiden Isomeren der Brommethyl-Trialkylpsoralene aus der gleichen Psoralen-Vorstufe durch sorgfältige Kontrolle der Reaktionebedingungen ermöglicht. Siehe 1. In der 1 sind A1 und A2 unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, umfassend H und eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Die Reaktion des 4,8-Dialkyl-7-hydroxycumarins mit dem 2-Chlor-3-butanol unter üblichen basischen Bedingungen liefert 4,8-Dialkyl-7-(1-methyl-2-oxo)propyloxycumarin (I). Dieses Material wird durch Erwärmen in wässrigem NaOH zyklisiert, so dass 4,8-Dialkyl-4,5'-dimethylpsoralen (II) erhalten wird. Die Behandlung des tetrasubstituierten Psoralens und N-Bromsuccinimid (NBS) in einem Lösungsmittel bei Raumtemperatur bis zu 150°C führt zur Bromierung an der 4'- oder 5'-Position, und zwar je nach den eingesetzten Bedingungen. Ein Katalysator, wie Dibenzoylperoxid kann hinzu gegeben werden, ist aber nicht nötig. Ist das verwendete Lösungsmittel Tetrachlorkohlenstoff unter Rückfluss, wird 4,8-Dialkyl-5'-brommethyl-4'methylpsoralen (IV) in Ausbeuten von 50% oder mehr erhalten. Wenn Methylenchlorid bei Raumtemperatur verwendet wird, wird nur 4,8-Dialkyl-4'-brommethyl-5'-methylpsoralen (III) in ≥80%iger Ausbeute erhalten. Die Benzylbromierung in anderen Lösungsmitteln kann ebenfalls erfolgen, wobei eines der isomeren Produkte allein oder in einem Gemisch verwendet wird. Diese Lösungsmittel umfassen sind, aber nicht eingeschränkt auf, 1,2-Dichlorethan, Chloroform, Bromtrichlormethan und Benzol.
  • Allgemeines syntheseschema von 4'-substituierten psoralenen
  • Bei der Synthese einer Unterklasse der linearen Psoralene, können 4,5',8-Trialkylpsoralene wie folgt hergestellt werden. Die 4,8-Dialkylcumarine werden aus 2-Alkylresorcinolen und einem 3-Oxoalkanoatester durch die Pechmann-Reaktion hergestellt (Organic Reactions Bd. VII, Kap. 1, Hrsg. Adams et al., Wiley, NY. (1953)). Die Hydroxygruppe wird mit einem Allylierungsmittel, CH2=CHX-CH(R)-Y, behandelt, wobei Y ein Halogenid oder Sulfonat ist, und R H oder (CH2)vCH3 ist, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. Die Claisen-Umlagerung des resultierenden Allylethers ergibt 4,8-Dialkyl-6-allyl-7-hydroxycumarin. Die Cumarine werden in die 4,5',8-Trialkylpsoralen mittels Verfahren umgewandelt, ähnlich einem von verschiedenen vorher beschriebenen Verfahren (d.h. siehe Bender et al. J. Org. Chem. 44: 2176 (1979); Kaufman, US-Patent Nr. 4,235,781 und 4,216,154. 4,5',8-Trimethylpsoralen ist ein Naturprodukt und ist kommerziell erhältlich (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI).
  • Längerkettige 4'-(ω-Halogenalkyl)trialkylpsoralene (hier bezeichnet als längerkettiges 4'-HATP), wobei die Alkylgruppen ausgewählt sind aus der Gruppe (CH2)2 bis (CH2)10, können unter Friedel-Crafts-Bedingungen hergestellt werden, wie an anderer Stelle erörtert (Olah und Kuhn, J. Org. Chem. 1964, 29, 2317; Friedel-Crafts and related Reactions, Bd. II, Teil 2, Olah, Hrsg. Interscience, NY, 1964, S. 749). Die Reaktionen der Halogenmethyl-Zwischenprodukte mit Aminen (beispielsweise Hearst et al., US-Patent Nr. 4,124,598) und Alkoholen (beispielsweise Kaufman, US-Patent Nr. 4,269,852) wurden zwar beschrieben, jedoch gibt es nur zwei ursprüngliche Berichte über die Bildung der verlängerten primä ren Aminketten. Sie beschreiben die Reaktion von 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit H2N-(CH2)n-NH2 (wobei n = 2, 4, 6) (Lee, B. et al., "Interaction of Psoralen-Derivatized Oligodesoxyribonukleosid. Methylphosphonates with Single-Stranded DNA," Biochemistry 27: 3197 (1988) und mit H2NCH2CH2SSCH2CH2NH2 (Goldenberg, M. et al., "Synthesis and Properties of Novel Psoralen Derivatives" Biochemistry 27: 6971 (1988)). Der Nutzen der resultierenden Verbindungen für die Nukleinsäure-Photoreaktion wurde zuvor nicht beschrieben. Die Eigenschaften dieser Materialien, wie die verringerte Mutagenität, sind auf der Grundlage von dem, was bekannt ist über vorher beschriebene Verbindungen, wie AMT, unerwartet.
  • In der 2 sind mehrere Synthesewege bekannt. Ausgehend von 4'-HATP (wobei w eine Zahl von 1 bis 5 ist; A1, A2 und A3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend H und (CH2)vCH3, wobei v eine Zahl von 0 bis 5 ist, und wobei X = Br, Cl oder I ist), ergibt die Reaktion mit einem Überschuss einer Bis-hydroxy-Verbindung, HO-(B)-OH, wobei B entweder eine Alkylkette (beispielsweise HO-(B)-OH ist 1,3-Propandiol), ein Monoether (beispielsweise Diethylenglykol) oder ein Polyether (beispielsweise Tetraethylenglykol) ist; das kleiner oder gleich 18 Kohlenstoffatome lang ist, entweder rein oder mit einem Lösungsmittel, wie Aceton bei 20 bis 80°C, und einer Base für die Kohlenstoffketten, die länger als Halogenmethyl sind, ein (ω-Hydroxyalkoxy)alkyl-Psoralen. Die terminale Hydroxygruppe kann unter einer Reihe von Bedingungen in eine Aminogruppe umgewandelt werden (siehe beispielsweise Larock, "Comprehensive Organic Transformations" VCH Publishers, NY, 1989). Insbesondere kann die Hydroxygruppe in die Ester von Methansulfonsäure (Struktur VI) in der Anwesenheit von Methansulfonylchlorid (CH3SO3Cl) umgewandelt werden. Dies kann anschließend durch Rückfluss von Ethanol und Azid, reduziert zu dem endgültigen Amin, Struktur VII in das Azid umgewandelt werden (die Beispiele sind die Verbindungen 2, 4 und 7). Das hier verwendete Verfahren nutzt Triphenylphosphin und Wasser in Tetrahydrofuran (THF) für die Reduktion, jedoch werden andere Verfahren vorgeschlagen.
  • Ein bevorzugtes Herstellungsverfahren der Struktur VII verwendet die Reaktion von 4'-HATP mit einem primären linearen Alkohol, der ein geschütztes Amin (beispielsweise Phthalimidogruppe) an der terminalen Position enthält, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie DMF bei 25 bis 150°C, so dass V erhalten wird. Die Schutzgruppe des Amins wird dann unter Standard-Bedingungen entfernt (beispielsweise Hydrazin oder wässriges MeNH2, so dass die Schutzgruppe einer Phthalimidogruppe entfernt wird [höhere Alkylhydrazine, wie Benzylhydrazine, werden ebenfalls vorgeschlagen]), so dass VII erhalten wird.
  • Umgekehrt kann die Struktur VI mit Diaminen, H2N-(B')-NH2 umgesetzt werden, wobei B' eine Alkylkette ist (beispielsweise 1,4-Butandiamin), ein Monoether (beispielsweise 3-Oxa-1,5-pentandiamin) oder ein Polyether (beispielsweise 3,6-Dioxa-1,8-octandiamin) ist, so dass das Endprodukt, Verbindung VII, erhalten wird (Beispiele für Verbindungen in dieser Strukturgruppe sind die Verbindungen 8, 13 und 14). Diese Reaktion erfolgt mit einem Überschuss an Diamin in Acetonitril unter Rückfluss, aber andere Lösungsmittel und Temperaturen sind gleichermaßen möglich
  • Einige endgültige Verbindungen sind gewünscht, in denen die Kohlenstoffkette an die 4'-Position des Psoralenringes über eine Aminoalkylgruppe [NH(CH2)w] und nicht über eine Oxyalkylgruppe [O(CH2)w] gebunden ist. Synthesewege für diese Verbindungen sind in der 3 gezeigt. Enthält die Bindung zwischen diesem Stickstoff und dem abschließenden Stickstoffatom nur CH2-Untereinheiten und Sauerstoff, aber keine anderen Stickstoffatome (Struktur X) (Beispiele sind die Verbindungen 1, 5, 6, 9, 10 und 11), kann das Produkt geeignet aus dem 4'-HATP und dem geeigneten Diamin der Struktur IX hergestellt werden. Dieses Verfahren ist ebenfalls anwendbar auf Endprodukte, die mehr als 2 Stickstoffatome in der Kette enthalten (Struktur XIII) (Beispiele sind die Verbindungen 12 und 15), ausgehend von den Polyaminen der Struktur XII (beispielsweise Norspermidin oder Spermidin [kommerziell erhältlich von Aldrich, Milwaukee, WI]), jedoch werden in diesem Fall ebenfalls isomere Strukturen in erheblichen Mengen gebildet. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Struktur XIII ist die reduktive Aminierung des Psoralen-4'-alkanals (XI) mit einem Polyamin der Struktur XII und einem Reduktionsmittel, wie Cyanborhydrid. Diese reduktive Aminierung ist auch anwendbar auf die Synthese der Verbindungen X. Die Carbonsäurealdehyde (Struktur XI, w = 0) wurden zuvor durch Hydrolyse der 4'-Halogenmethyl-Verbindungen und die anschließende Oxidation der resultierenden 4'-Hydroxymethyl-Verbindung hergestellt (Isaacs et al., J. Labelled Compounds. Radiopharm., 1982, 345). Diese Verbindungen können ebenfalls durch Formylierung der 4'-Hydrido-Verbindungen mit einem Formamid und POCl3 oder mit einem Hexamethylentetraamin in Säure geeignet hergestellt werden. Längerkettige Alkanale können aus den 4'-HATP-Verbindungen durch Umwandlung der terminalen Halogengruppe in eine Aldehydfunktionalität (beispielsweise Durst, Adv. Org. Chem. 6: 285 (1969)). hergestellt werden Bei anderen Endprodukten ist ein terminales Amin an das Psoralen über eine Alkylkette gebunden. Wie in der 4 gezeigt werden diese Verbindungen (Strukturen XIV) (ein Beispiel ist die Verbindung 3) hergestellt entweder 1) durch Umsetzung von 4'-HATP mit Kaliumphthalimid oder Azid und die anschließende Freisetzung des gewünschten Amins wie zuvor, beispielsweise mit Hydrazin, oder 2) Umwandlung des 4'-HATP in die Cyanid-Verbindung, gefolgt von Reduktion beispielsweise mit NaBH4-CF3CO2H.
  • Die Erörterung der Umwandlung von 4,5',8-Trialkylpsoralenen in 4'-Amino-funktionalisierte 4,5',8-Trialkylpsoralene trifft gleichermaßen gut zu, wenn die 4- und/oder 8-Position nur mit Wasserstoff substituiert ist, wodurch 4'-primär-Aminosubstituierte-5' (4 oder 8)-Dialkylpsoralene und 4'-primär-Amino-substituierte 5'-Alkylpsoralene bereitgestellt werden.
  • III. BINDUNG DER VERBINDUNGEN AN NUKLEINSÄURE
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Bindung neuer und bekannter Verbindungen an Nukleinsäure, wie u.a. (aber nicht eingeschränkt auf) virale Nukleinsäure und bakterielle Nukleinsäure. Ein erfindungsgemäßer Ansatz zur Bindung der Photoaktivierungs-Verbindungen an die Nukleinsäure ist Photobindung. Die Photobindung ist definiert als die Bindung photobindender Verbindungen in der Anwesenheit von photoaktivierenden Lichtwellenlängen. Photobindende Verbindungen sind Verbindungen, die in der Anwesenheit von photoaktivierenden Lichtwellenlängen an Nukleinsäure binden. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Photobindung mit den erfindungsgemäßen photobindenden Verbindungen.
  • IV. INAKTIVIERUNG VON PATHOGENEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung eines Blutproduktes mit einer Photoaktivierungs- Verbindung und Bestrahlen zur Inaktivierung kontaminierender Pathogen-Nukleinsäuresequenzen vor der Verwendung des Blutproduktes.
  • A. Inaktivierung im Allgemeinen
  • Der Begriff "Inaktivierung" ist hier definiert als die Veränderung der Nukleinsäure einer Pathogeneinheit, damit sich die Pathogeneinheit nicht mehr replizieren kann. Dies unterscheidet sich von der "vollständigen Inaktivierung", wobei sich sämtliche vorhandenen Pathogeneinheiten in einer bestimmten Probe nicht mehr replizieren können, und der "wesentlichen Inaktivierung", wobei sich die meisten vorhandenen Pathogeneinheiten nicht mehr replizieren können. "Inaktvierungseffizienz" einer Verbindung ist definiert als das Ausmaß der Inaktivierung, die die Verbindung bei einer bestimmten Konzentration einer Verbindung oder Strahlendosis erzielen kann. Wenn beispielsweise 100 μM einer hypothetischen Verbindung X 5 log HIV-Virus inaktivieren, wohingegen unter den gleichen Bedingungen die gleiche Konzentration der Verbindung Y nur 1 log Virus inaktiviert, hat die Verbindung X eine bessere "Inaktivierungseffizienz" als Verbindung Y.
  • Zur Gewährleistung, dass ein "Inaktivierungs"verfahren eine vollständige "Inaktivierung" erzielen kann oder nicht, betrachtet man am besten ein spezifisches Beispiel. Eine Bakterienkultur ist inaktiviert, wenn ein Aliquot der Kultur bei Überführen und Züchten in einer frischen Kulturplatte nach einem bestimmten Zeitraum nicht nachweisbar ist. Eine minimale Anzahl von lebensfähigen Bakterien darf nicht auf die Platte angewendet werden, damit ein Signal nachweisbar wird. Mit dem optimalen Nachweisverfahren ist diese minimale Anzahl = 1 Bakterienzelle. Mit einem suboptimalen Nachweisverfahren kann eine Minimalzahl von Bakterienzel len, die so aufgebracht wird, dass ein Signal beobachtet wird, viel größer als 1 sein. Das Nachweisverfahren bestimmt eine "Schwelle", unter der das "Inaktivierungsverfahren" vollständig effizient zu sein scheint (und über der die "Inaktivierung" tatsächlich nur partiell effizient ist).
  • B. Inaktivierung potentieller Pathogene
  • Die gleichen Überlegungen bezüglich Nachweisverfahren und Schwelle existieren bei der Bestimmung der Empfindlichkeitsgrenze eines Inaktivierungsverfahrens für eine Nukleinsäure. "Inaktivierung" bedeutet, dass sich eine Pathogeneinheit nicht mehr replizieren lässt.
  • Bei Inaktivierungsverfahren für Material, das bei Menschen verwendet werden soll, unabhängig davon, ob in vivo oder in vitro, kann das Nachweisverfahren theoretisch als Messung des Ausmaßes der Infektion mit einer Krankheit als Ergebnis der Einwirkung des Materials herangezogen werden. Die Schwelle, unterhalb der das Inaktivierungsverfahren beendet wird, wird dann als Ausmaß der Inaktivierung verwendet, die zur Verhinderung der Erkrankung aufgrund des Kontakts mit dem Material ausreicht. Es wird erkannt, dass es in diesem praktischen Szenario nicht wesentlich ist, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zu einer "Totalinaktivierung" führen. D.h. eine "wesentliche Inaktivierung" ist solange angemessen, wie der überlebensfähige Abschnitt für eine Krankheitsverursachung unzureichend ist. Somit wird "im Wesentlichen das gesamte" Pathogen inaktiviert, wenn ein lebensfähiger Abschnitt des verbleibenden Pathogens nicht zum Hervorrufen einer Krankheit ausreicht. Das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren inaktiviert eine Nukleinsäure in Pathogenen im Wesentlichen. Bei einer Ausführungsform macht das Inaktivie rungsverfahren die Pathogen-Nukleinsäure in Blutpräparaten im Wesentlichen inaktiv.
  • Man möchte nicht auf ein beliebiges Verfahren eingeschränkt werden, durch das die Verbindungen die Pathogene inaktivieren, jedoch nimmt man an, dass die Inaktivierung auf der lichtinduzierten Bindung der Psoralene an Pathogen-Nukleinsäure beruht. Man möchte zwar zudem nicht, dass das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren durch die Natur der Nukleinsäure eingeschränkt ist, jedoch wird vorgeschlagen, dass das Inaktivierungsverfahren alle Formen von Nukleinsäuren (wie u.a. DNA, mRNA usw.) im Wesentlichen inaktiviert.
  • Werden Photoaktivierungs-Verbindungen zur Modifikation von Nukleinsäure verwendet, verhindert die Wechselwirkung zwischen Pathogen-Nukleinsäure (wie u.a. DNA, mRNA, usw.) und der Photoaktivierungs-Verbindung, vorzugsweise die Replikation des Pathogens, so dass keine Infektion erfolgt, wenn ein Mensch dem behandelten Pathogen ausgesetzt wird.
  • "Synthetisches Medium", wie es hier verwendet wird, ist definiert als wässriges synthetisches Blut- oder Blutproduktspeichermedium. Bei einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Inaktivierung von Blutprodukten in synthetischen Medien, die eine gepufferte Salzlösung umfassen. Dieses Verfahren reduziert die Schädigung von Blutprodukten und ermöglicht die Verwendung viel niedrigerer Konzentrationen von Photoaktivierungs-Verbindungen.
  • Das Psoralen-Photoinaktivierungsverfahren inaktiviert die Pathogene auf Nukleinsäure-Basis, die in Blut zugegen sind, über ein einziges Verfahren. Somit hat es das Potential, Bakterien, Protozoen, und ebenfalls Viren zu eliminieren. Wäre ein effizientes Dekontaminierungsverfahren vor dem Aufkommen der AIDS-Pandämie verfügbar gewesen, hätte keine transfusionsbedingte HIV- Übertragung stattgefunden. Eine Dekontamination auf Psoralenbasis hat das Potential zur Eliminierung sämtlicher Erreger aus der Blutzufuhr, ungeachtet des beteiligten Pathogens. Zusätzlich hat eine Dekontamination auf Psoralenbasis die Fähigkeit zur Sterilisation von Blutprodukten nach dem Sammeln und Verarbeiten, was bei Plättchenkonzentraten das Problem der schwachen Bakterienkontamination lösen könnte, und zu einer verlängerten Aufbewahrungsdauer führen könnte. Morrow, J.F. et al., JAMA 266; 555–558 (1991); Bertolini F. et al., Transfusion 32: 152–156 (1992).
  • TABELLE 3 Viren, welche photochemisch durch Psoralene inaktiviert werden.
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Eine Liste von Viren, die durch ein oder mehrere Psoralen-Derivate photochemisch inaktiviert wurden, erscheint in Tabelle 3. (Aus Tabelle 1 von Hanson, C.V. Blood Cells 18: 7 (1992)). In dem Artikel wurde hervorgehoben, dass Picorna-Viren nur photoinaktiviert wurden, wenn Psoralen während des Viruswachstums zugegen war. Diese Liste ist nicht erschöpfend, und sie veranschaulicht bloß die große Vielzahl von Pathogenen, die durch Psoralene inaktiviert werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft die Inaktivierung dieser und anderer Viren durch die hier beschriebenen Verbindungen. Die Verbindungen sind besonders gut zur Inaktivierung von Viren mit Hülle, wie HIV-Virus, geeignet.
  • C. Auswahl von Photoinaktivierungs-Verbindungen zur Inaktivierung von Pathogenen
  • Zur Bewertung einer Verbindung zur Entscheidung, ob sie bei den erfindungsgemäßen photochemischen Dekontaminations-(PCD)-Verfahren geeignet ist, sollten zwei wichtige Eigenschaften in Betracht gezogen werden: 1) Die Fähigkeit der Verbindung zur Inaktivierung der Pathogene und 2) ihre Mutagenität. Die Fähigkeit einer Verbindung zur Inaktivierung von Pathogenen kann durch mehrere Verfahren bestimmt werden. Eine Technik ist die Durchführung eines Bakteriophagen-Screens: ein Test, der die Nukleinsäure-Bindung von Test-Verbindungen bestimmt. Ein derartiger Screen, ein r-17-Screen, ist eingehend im nachstehenden Beispiel 12 beschrieben. Wenn der r-17-Screen die Inaktivierungsaktivität zeigt, eignet sie sich zum direkten Testen der Fähigkeit der Verbindung zur Inaktivierung eines Virus. Ein Verfahren zur Durchführung eines direkten Virusinaktivierungs-Screens ist eingehend in Beispiel 13 für zellfreies HIV beschrieben.
  • Der R17-Bakteriophagen-Screen sagt wahrscheinlich die HIV-Inaktivierungseffizienz voraus, sowie die Effizienz von Verbindungen gegen viele andere Viren. R17 wurden gewählt, weil es erwartet wurde, dass es ein sehr schwierig zu inaktivierendes Pathogen ist. Es ist ein kleiner einzelsträngiger RNA-Phage. Man möchte keinesfalls die Arbeitsweise der vorliegenden Erfindung einschränken, jedoch wird erwartet, dass sich kürzere Nukleinsäurefragmente schlechter inaktivieren lassen, weil sie eine höhere Frequenz der Bildung von Psoralen-Addukten als längere Nukleinsäurefragmente erfordern. Zudem sind einzelsträngige RNA-Pathogene schwieriger zu inaktivieren, weil Psoralene weder zwischen Basenpaare interkalieren können, wie bei doppelsträngigen Nukleinsäuren, noch Addukte bilden können, die als Zwischenstrang-Verbindungen arbeiten. Somit wird erwartet, dass bei Erzielung der Inaktivierung von R17 diese gleichen Bedingungen die Inaktivierung vieler Viren und Bakterien verursachen können.
  • Der zellfreie HIV-Screen komplementiert den r-17-Screen, indem bestätigt wird, dass eine bestimmte Verbindung, die im r-17 positiv getestet wurde, tatsächlich die Viren effizient inaktiviert. Zeigt somit eine Verbindung eine Aktivität im r-17-Screen, wird sie als nächstes im Virus-Inaktivierungs-Screen untersucht.
  • Die zweite Eigenschaft, die bei der Untersuchung einer Verbindung zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren wichtig ist, ist die Mutagenität. Der am weitesten verbreitete Mutagen/Karzinogen-Screening-Test ist der Ames-Test. Dieser Test wird durch D.M. Maron und B.N. Ames in Mutation Research 113: 173 (1983) beschrieben und ein bestimmter Screen ist eingehend in dem nachstehenden Beispiel 17 beschrieben. Der Ames-Test nutzt mehrere einzigartige Stämme von Salmonella typhimurium, die zum Wachstum histidinabhängig sind und denen die üblichen DNA-Reparatur-Enzyme fehlen. Die Frequenz von normalen Mutationen, die die Bakterien histidin-unabhängig machen (d.h. die Frequenz der spontanen Revertanten) ist gering. Der Test ermöglicht die Bewertung des Einflusses einer Verbindung auf diese Revertanten-Frequenz.
  • Da einige Substanzen selbst nicht mutagen sind, sondern durch Stoffwechselwirkung in ein Mutagen umgewandelt werden, wird die zu untersuchende Verbindung mit den Bakterien auf Agarplatten zusammen mit dem Leberextrakt untersucht. Der Leberextrakt dient dazu, die Stoffwechselwirkung in einem Tier nachzuahmen. Kontrollplatten enthalten nur die Bakterien und den Extrakt.
  • Die Gemische werden inkubiert. Das Wachstum der Bakterien (sofern vorhanden) wird durch Zählen von Kolonien überprüft. Bei einem positiven Ames-Test ist die Anzahl der Kolonien auf den Platten mit Gemischen, die die Verbindung enthalten, signifikant höher als die Anzahl der entsprechenden Kontrollplatten.
  • Werden bekannte Karzinogene auf diese Weise mit dem Ames-Test untersucht, sind etwa 90% positiv. Werden ähnlich bekannte Nicht-Karzinogene untersucht, sind etwa 90% negativ.
  • Eine neue Verbindung (X) kann als potentielle Blut-Photodekontaminations-Verbindung bewertet werden, wie in der nachstehenden Tabelle 4 gezeigt. x wird zu Beginn in Schritt I bewertet. X wird in dem r-17-Test bei mehreren verschiedenen Konzentrationen zwischen 4 und 320 μM gescreent, wie in Beispiel 12 erläutert. Zeigt die Verbindung eine größere Inaktivierungsaktivität als 1 log Inaktivierung von r-17 (log Abtötung) im r-17-Screen bei einer beliebigen Konzentration, wird die Verbindung dann im zellfreien HIV-Test untersucht, wie in Beispiel 13 erläutert. Zeigt die Verbindung eine größere Inaktivierungsaktivität als 1 log Inaktivierung von HIV (log Abtötung) im zellfreien HIV-Test, werden die Verbindung und AMT dann im Ames-Test untersucht. Zeigt schließlich die Verbindung eine geringere Mutagenität im Ames-Test als AMT, wird die neue Verbindung als geeignetes Mittel für die Inaktivierung von Pathogenen identifiziert.
  • TABELLE 4
    Figure 00480001
  • Durch Befolgen dieser Anweisungen kann eine Person rasch bestimmen, welche Verbindungen für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet wäre.
  • D. Zufuhr der Verbindungen zur Photoinaktivierung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere verschiedene Formulierungen und Wege, durch die die hier beschriebenen Verbindungen in einem Inaktivierungsverfahren zugeführt werden können. Dieser Abschnitt ist lediglich veranschaulichend und soll die Erfindung keinesfalls auf eine Form oder ein Verfahren zur Einbringung der Verbindung einschränken.
  • Die Verbindungen können in verschiedenen Formen in ein Inaktivierungsverfahren eingebracht werden. Die Verbindungen können als wässrige Lösung in Wasser, Salzlösung, ein synthetisches Medium, wie "SteryliteTM 3.0" (Inhalt zu Beginn des nachstehenden Experimentalabschnitts beschrieben) oder eine Reihe anderer Medien eingebracht werden. Die Verbindungen können weiter als trockene Formulierungen mit oder ohne Hilfsstoffe bereitgestellt werden.
  • Die neuen Verbindungen können auch über viele verschiedene Wege bereitgestellt werden. Die Verbindung kann beispielsweise während der Herstellung in das Reaktionsgefäß, wie einen Blutbeutel, eingebracht werden. Alternativ kann die Verbindung in das zu sterilisierende Material nach dem Einbringen des Materials in das Reaktionsgefäß zugefügt werden. Weiterhin können die Verbindungen allein oder in einem "Cocktail" oder als Gemisch mehrer verschiedener Verbindungen eingebracht werden.
  • V. BEWAHRUNG DER BIOCHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN DES BEHANDELTEN MATERIALS
  • Bei der Behandlung von Blutprodukten, die in vivo verwendet werden sollen, sind zwei Faktoren bei der Entwicklung von Verfahren und Verbindungen, die verwendet werden sollen, von vorrangiger Bedeutung. Zuerst muss man sich fragen, ob das verwendete Verfahren oder die verwendeten Verbindungen die In-vivo-Aktivität des behandelten Materials verändern. Beispielsweise ist die Plättchentransfusion eine gut etablierte wirksame Behandlung für Patienten mit thrombozytopenischer Blutung. Wenn jedoch die eingesetzte Dekontaminationsbehandlung die Plättchenverklumpungsaktivität stark reduziert, hat die Behandlung keinen praktischen Wert. Psoralene eignen sich für Inaktivierungsverfahren, weil die Reaktion bei Temperaturen durchgeführt werden kann, die mit den verbleibenden biochemischen Eigenschaften des Blutes und der Blutprodukte kompatibel sind. Hanson, C. V. Blood Cells 18: 7 (1992). Aber nicht alle Psoralene oder Verfahren dekontaminieren ohne signifikante Senkung der biologischen Aktivität des dekontaminierten Materials. Vorhergehende Verbindungen und Protokolle haben die Entfernung von molekularem Sauerstoff aus der Reaktion vor und während dem Aussetzen gegenüber Licht notwendig gemacht, so dass eine Schädigung der Blutprodukte durch Sauerstoffradikale, die bei der Strahlung entstehen, verhindert wird. Siehe L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989); US-Patent 4,727,027 von Wiesehahn. Die vorliegende Erfindung kann zur Dekontamination von Blutprodukten in Anwesenheit von Sauerstoff verwendet werden, ohne dass die Aktivität zerstört wird, für die die Produkte hergestellt werden. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren gibt es weiterhin keinen Bedarf zur Reduktion der Konzentration an molekularem Sauerstoff. Die vorliegende Erfindung schlägt vor, dass die In-vivo-Aktivität eines Blutproduktes nicht zerstört wird oder signifikant gesenkt wird, wenn eine Probe eines Blutproduktes, das durch die erfindungsgemäßen Verfahren dekontaminiert wird, sich so verhält als wäre es in bekannten Tests für die Blutproduktfunktion eine normal funktionierende Probe eines Blutpro duktes. Sind beispielsweise Blutplättchen betroffen, wird die In-vivo-Aktivität nicht zerstört oder signifikant gesenkt, wenn der pH-Wert der Blutplättchen im Wesentlichen genauso ist, wie bei Blutplättchen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden und 5 Tage aufbewahrt wurden, wie es bei unbehandelten Proben der Fall ist, die 5 Tage aufbewahrt wurden. "Im Wesentlichen gleicher" pH-Wert bedeutet, dass die Werte innerhalb des Fehlerbereichs liegen, der diesen bestimmten Datenpunkt umgibt.
  • Der zweite Faktor ist, ob die verwendeten Verbindungen für den behandelten Patient toxisch oder mutagen sind. Eine "Verbindung, die geringe Mutagenität aufweist" ist definiert als Verbindung, die weniger mutagen ist als AMT, wenn sie bei Konzentrationen unter 250 μM im Ames-Test getestet wurde, wie im nachstehenden Experimental-Abschnitt beschrieben. Die erfindungsgemäßen Inaktivierungsverfahren sind besonders geeignet, weil sie die Abkopplung der Pathogeninaktivierungseffizienz von der Mutagenität aufweisen. Die Verbindungen weisen eine starke Pathogeninaktivierung ohne einen gleichzeitigen Anstieg der Mutagenität auf. Die allgemein bekannten Verbindungen, die in Photoinaktivierungsprotokollen untersucht wurden, wie AMT, scheinen eine Bindung zwischen der Pathogeninaktivierungseffizienz und der Mutagenwirkung aufzuweisen, die bisher unteilbar zu sein schien.
  • Man möchte zwar nicht, dass die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Theorie eingeschränkt wird, durch die die Pathogeninaktivierungseffizienz von der Mutagenität entkoppelt wird, jedoch wird postuliert, dass die Entkopplung als Folge der Länge der Gruppen erfolgt, die am Psoralen substituiert sind, und der Stelle der Ladung an den Verbindungen. Es wird postuliert, dass positive Ladungen an einem oder beiden En den der mutagenen Verbindungen nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Phosphatgerüst der DNA haben. Diese Wechselwirkungen erfolgen wahrscheinlich unabhängig von der Anwesenheit von Licht (was als "Dunkelbindung" bezeichnet wird). In der Theorie blockiert das Psoralen dadurch sterisch die Polymerase vor der Öffnung der DNA, was Mutagenität verursacht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen tragen dagegen eine positive oder neutrale Ladung an einer langen Substituentengruppe. Diese substituierten Gruppen bilden eine sterische Grenze während der Dunkelbindung, die viel leichter von der DNA zu befreien ist, so dass die Polymerase passieren kann. Somit kommt es nicht zu Mutagenität.
  • EXPERIMENTE
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, und sie sollen ihren Schutzbereich nicht einschränken.
  • Bei der nachfolgenden Offenbarung gelten die folgenden Abkürzungen: Äq. (Äquivalente); M (molar); μM (mikromolar); N (normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); (Mikrogramm); kg (Kilogramm) 1 (Liter); ml μg(Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); J (Joule, ebenfalls Wattsekunde, man beachte, dass in den 11, 13–22 Joule oder J für Joule/cm2 steht); °C (Grad Celsius); DC; Dünnschichtchromatographie); EAA (Ethylacetoacetat); EtOH (Ethanol); HOAc (Essigsäure); W (Watt); mW (Milliwatt); NMR (Kernmagnetresonanz; Spektren, erhalten bei Raumtemperatur auf einem Varian Gemini 200 MHz Fourier Transformations-Spektrometer); Schmp. (Schmelzpunkt); UV (Ultraviolettlicht); THF (Tetrahydrofuran); DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium); FBS (fötales Rinderserum); LB (Luria-Brühe); EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); Phorbolmyristatacetat (PMA); phosphatgepufferte Salzlösung (PBS); BSA (Rinderserumalbumin); PCR (Polymerasekettenreaktion). Bei den Beispielen, die die Synthese von Verbindungen beschreiben, gelten die angegebenen Ausbeuten weiterhin nur für den vorhergehenden Schritt und nicht für die gesamte Synthese.
  • Für einen leichteren Bezug haben einige Verbindungen eine Nummer von 1 bis 18 erhalten. Die Bezugszahlen sind in der Tabelle 2 angegeben. Ihre Strukturen erscheinen in den 10A–10F. Die Bezugszahlen werden über den gesamten Experimentalabschnitt verwendet.
  • Bei der Isolation von Verbindungen in Form eines Säureadditionssalzes wird die Säure vorzugsweise so ausgewählt, dass sie ein Anion enthält, das nicht toxisch ist und pharmazeutisch verträglich ist, zumindest in den üblichen therapeutischen Dosen. Repräsentative Salze, die in dieser bevorzugten Gruppe enthalten sind, sind die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Acetate, Phosphate, Nitrate, Methansulfonate, Ethansulfonate, Lactate, Citrate, Tartrate, oder Bitartrate, und Maleate. Andere Säuren sind entsprechend geeignet und können bei Bedarf eingesetzt werden. Es können beispielsweise auch Fumar-, Benzoe-, Ascorbin-, Bernstein-, Salicyl-, Bismethylensalicyl-, Propion-, Glucon-, Äpfel-, Malon-, Mandel-, Zimt-, Citracon-, Stearin-, Palmitin-, Itakon-Glykol-, Benzolsulfon- und Sulfaminsäuren ebenfalls als Säureadditionssalz-bildende Säuren eingesetzt werden.
  • Eines der nachstehenden Beispiele betrifft HEPES-Puffer. Dieser Puffer enthält 8,0 g 137 mM NaCl, 0,2 g 2,7 mM KCl, 0,203 g 1 mM MgCl2 (6 H2O), 1,0 g 5,6 mM Glucose, 1,0 g 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) (er hältlich von Sigma, St. Louis, MO) und 4,8 g 20 mM HEPES (erhältlich von Sigma, St. Louis, MO).
  • Bei einem der nachstehenden Beispiele wird das phosphatgepufferte synthetische Medium für die Plättchenbehandlung formuliert. Dies kann in einem Schritt formuliert werden, so dass eine Lösung mit ausgeglichenem pH-Wert erhalten wird (beispielsweise pH-Wert 7,2), indem die folgenden Reagentien in 2 l destilliertem Wasser vereinigt werden.
  • Figure 00540001
  • Die Lösung wird dann gemischt, steril filtriert (0,2 Mikron Filter) und gekühlt.
  • Ein weiteres synthetisches Medium, das sich in der vorliegenden Erfindung eignet, enthält die folgenden Reagentien:
    Figure 00540002
    Figure 00550001
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird bei einem der Beispiele verwendet, um zu messen, ob die virale Inaktivierung durch einige Verbindungen vollständig war. Die PCR ist ein Verfahren zur Steigerung der Konzentration eines Segmentes einer Zielsequenz in einem Gemisch aus genomischer DNA ohne Klonierung oder Reinigung. Siehe K.B. Mullis et al., US-Patent 4,683,195 und 4,683,202. Dieses Verfahren zur Amplifizierung der Zielsequenz besteht aus der Einbringung eines großen Überschusses von zwei Oligonukleotid-Primern zum DNA-Gemisch, das die gewünschte Zielsequenz enthält, gefolgt von einer genauen Abfolge der Wärmezylklen in der Anwesenheit einer DNA-Polymerase. Die beiden Primer sind komplementär zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz. Zur Durchführung der Amplifikation wird das Gemisch denaturiert, und die Primer werden dann an ihre komplementären Sequenzen in dem Zielmolekül hybridisiert. Nach dem Hybridisieren werden die Primer mit einer Polymerase verlängert, so dass ein neues Paar komplementärer Stränge erhalten wird. Die Schritte Denaturieren, Primer-Hybridisierung und Polymerase-Verlängerung können oft wiederholt werden (d.h. Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung machen einen "Zyklus" aus, d.h. es können zahlreiche „Zyklen" vorhanden sein), so dass eine hohe Konzentration eines amplifizierten Segmentes der gewünschten Zielsequenz erhalten wird. Die Länge des amplifizierten Segmentes der gewünschten Zielsequenz wird bestimmt durch die relativen Positionen der Primer in Bezug zueinander, und daher ist diese Länge ein steuerbarer Parameter. Mit Hilfe des Wiederholungsaspektes des Verfahrens wird das Verfahren von den Erfindern als "Polymerasekettenreaktion" bezeichnet. Weil die gewünschten amplifizierten Segmente der Zielsequenz zu den vorherrschenden Sequenzen (in Bezug auf die Konzentration) in dem Gemisch werden, werden sie als „PCR-amplifiziert" bezeichnet.
  • Mit der PCR kann man eine einzelne Kopie einer spezifischen Zielsequenz in genomischer DNA auf einen Wert amplifizieren, der sich über mehrere verschiedene Verfahren nachweisen lässt (beispielsweise Hybridisierung mit einer markierten Sonde; Einbau biotinylierter Primer, gefolgt von Avidin-Enzym-Konjugat-Nachweis, Einbau von 32P-markierten Desoxynukleotidtriphosphaten, beispielsweise dCTP oder dATP, in das amplifizierte Segment). Neben der genomischen DNA kann eine beliebige Oligonukleotid-Sequenz mit dem geeigneten Satz von Primer-Molekülen amplifiziert werden.
  • Das PCR-Amplifikationsverfahren erreicht bekanntlich eine Plateau-Konzentration spezifischer Zielsequenzen von etwa 10–8 M. Ein übliches Reaktionsvolumen ist 100 μl, was einer Ausbeute von 6 × 1011 doppelsträngigen Produktmolekülen entspricht.
  • Die PCR ist ein Polynukleotid-Amplifikationsprotokoll. Der beobachtete Amplifikationsfaktor wird auf die Anzahl (n) der erfolgten PCR-Zyklen und die Effizienz der Replikation in jedem Zyklus (E) bezogen, was wiederum eine Funktion der Priming- und Verlängerungs-Effizienzen in jedem Zyklus ist. Die Amplifikation folgt Beobachtungen zufolge der Form En, bis hohe Konzentrationen an PCR-Produkt ent standen sind. Bei diesen hohen Konzentrationen (etwa 10–8 M/l) fällt die Replikationseffizienz drastisch. Dies beruht wahrscheinlich auf der Verdrängung der kurzen Oligonukleotid-Primer durch die längeren komplementären Stränge des PCR-Produktes. Bei Konzentrationen über 10–8 M wird die Rate der beiden komplementären PCR-amplifizierten Produktstränge, die einander während der Priming-Reaktionen finden, hinreichend schnell, dass dies vor oder zeitgleich mit dem Verlängerungsschritt der PCR-Prozedur erfolgt. Dies führt schließlich zu einer reduzierten Primimg-Effizienz, und daher einer reduzierten Zykluseffizienz. Fortgesetzte PCR-Zyklen führen zu sinkenden Zunahmen der PCR-Produktmoleküle. Das PCR-Produkt erreicht schließlich eine Plateau-Konzentration.
  • Die Sequenzen der in diesem Experimentalabschnitt verwendeten Polynukleotidprimer sind wie folgt:
    DCD03: 5' ACT AGA AAA CCT CGT GGA CT 3'
    DCD05: 5' GGG AGA GGG GAG CCC GCA CG 3'
    DCD06: 5' CAA TTT CGG GAA GGG CAC TC 3'
    DCD07: 5' GCT AGT ATT CCC CCG AAG GT 3'
  • Mit DCD03 als einem allgemeinen Vorwärtsprimer erzeugen die Paare Amplikons der Länge 127, 327 und 1072 Bp. Diese Oligos wurden aus Bereichen ausgewählt, die zwischen 5 verschiedenen dHBV-Isolaten (DHBV1, DHBV3, DHBV16, DHBV22 und DHBV26) sowie Heron-HBV (HHBV4) absolut konserviert sind.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, und sollen ihren Schutzbereich nicht einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Photoaktivierung photoreaktiver Nukleinsäure-bindender Verbindungen. In diesem Beispiel ist eine Photoaktivierungsvorrichtung zur Dekontamination von Blutprodukten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. Diese Vorrichtung umfasst: a) Mittel zur Bereitstellung von elektromagnetischer Strahlung mit geeigneten Wellenlängen, so dass man die Photoaktivierung mindestens einer photoreaktiven Verbindung bewirkt; b) Mittel zum Halten einer Mehrzahl von Blutprodukten in einer festen Beziehung zu dem Strahlung bereitstellen den Mittel bei der Photoaktivierung; und c) Mittel zum Halten der Temperatur der Blutprodukte in einem gewünschten Temperaturenbereich während der Photoaktivierung.
  • 6 ist eine Perspektivansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung, die die vorstehend genannten Eigenschaften integriert. Die Figur zeigt ein opakes Gehäuse (100), bei dem ein Teil davon entfernt ist, mit einer Anordnung von Glühbirnen (101) oberhalb und unterhalb einer Mehrzahl repräsentativer Blutprodukt enthaltenden Mittel (102), die sich zwischen Plattenbauteilen (103, 104) befinden, die bestimmte Lichtwellenlängen filtern. Die Plattenbauteile (103, 104) werden eingehender nachfolgend beschrieben.
  • Die Glühbirnen (101), die sich an eine Stromquelle (nicht gezeigt) anschließen lassen, dienen als Quelle für elektromagnetische Strahlung. Man ist nicht auf einen bestimmten Glühbirnentyp eingeschränkt, die Ausführungsform ist jedoch so ausgelegt, dass eine Industriestandard-Dual-Bipin-Lampe verwendet werden kann.
  • Das Gehäuse (100) kann über einen Riegel (105) geöffnet werden, so dass das Blutprodukt geeignet untergebracht werden kann. 6 zufolge umgrenzt das Gehäuse (100) im geschlossenen Zustand vollständig die Strahlung von den Glühbirnen (101). Während der Bestrahlung kann der Benutzer bestätigen, dass die Vorrichtung läuft, indem er durch ein Sicherheitssichtfenter (106) schaut, das kein Ultraviolettlicht zum Benutzer durchlässt.
  • Das Gehäuse (100) dient auch als Befestigung für mehrere elektronische Komponenten auf einer Steuerkonsole (107), die beispielsweise einen Hauptstromschalter, einen Countdown-Zähler und einen Betriebsstundenzähler aufweist. Der Stromschalter kann geeigneterweise an den Countdown-Zähler angeschlossen sein, der wiederum parallel an einem Betriebsstundenzähler und an die Quelle der elektromagnetischen Strahlung angeschlossen ist. Der Countdown-Zähler ermöglicht einem Benutzer die Strahlungsdauer auf eine gewünschte Einwirkdauer einzustellen. Der Betriebsstundenzähler hält eine Aufzeichnung der Gesamtzahl der Bestrahlungsstunden, die von der Quelle der elektromagnetischen Strahlung bereitgestellt wird. Diese Eigenschaft ermöglicht, dass die Glühbirnen (101) überwacht und ausgewechselt werden können, bevor ihr Ausgang unter einen bestimmten Mindestwert fällt, der für eine rasche Photoinaktivierung notwendig ist.
  • 7 ist eine Querschnittsansicht der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linie 2-2. 7 zeigt die Anordnung der Glühbirnen (101) mit geöffnetem Gehäuse (100). Ein Reflektor (108A, 108B) umgibt vollständig jede Anordnung von Glühbirnen (101). Blutprodukt enthaltende Mittel (102) werden zwischen den oberen (103) und unteren (104) Plattenbauteilen (beispielsweise BK-7-Glas, Shott-Glass-Technologies Inc. Duryea, PA) untergebracht. Jedes Plattenbauteil umfasst eine obere (103A, 104A) und untere (103B, 104B) Platten. Die Plattenbauteile (103, 104) sind über ein Gelenk (109) verbunden, das so ausgelegt ist, dass es den Raum ausfüllt, der von den Blutprodukt enthaltenen Mitteln (102) erzeugt wird. Das obere Plattenbauteil (103) wird direkt über das obere der Blutprodukt enthaltenden Mittel (102) gebracht, das von der unteren Platte (104B) des unteren Plattenbauteils (104) gehalten wird.
  • Detektoren (110A, 110B, 110C, 110D) können geeignet zwischen die Platten (103A, 103B, 104A, 104B) der Plattenbauteile (103, 104) untergebracht werden. Sie können an eine Platine (111) angeschlossen werden, die wiederum an die Steuerkonsole (107) angeschlossen ist.
  • 8 ist eine Querschnittsansicht der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linien von 3-3. Sechs Blutprodukt enthaltende Mittel (102) (beispielsweise TeflonTM-Blutplättcheneinheitsbeutel) werden in einer festen Beziehung über einer Anordnung von Glühbirnen (101) angeordnet. Die Temperatur des Blutproduktes kann über ein Gebläse (112) allein gesteuert werden, oder stärker bevorzugt durch Einsatz eines Wärmetauschers (113) mit Kühleinlass- (114) und -auslass (115)-Öffnungen, die an eine Kühlquelle (nicht gezeigt) angeschlossen sind.
  • 9 ist eine Querschnittsansicht der in 6 gezeigten Vorrichtung entlang der Linien von 4-4. 9 zeigt klarer den Temperatursteueransatz einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung. Die oberen Plattenbauteilplatten (103A, 103B) bzw. die unteren Plattenbauteilplatten (104A, 104B) erzeugen jeweils eine Temperatursteuerkammer (103C, 104C). Das Gebläse (112) kann Luft in und zwischen den Kammern 103C, 104C) wälzen. Wenn der Wärmetauscher (113) eingesetzt wird, wird die zirkulierende Luft gekühlt und zwischen die Platten (103A, 103B, 104A, 104B) geleitet.
  • BEISPIEL 2
  • Synthese von 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen
  • In diesem Beispiel wird die Dreischritt-Synthese von 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen beschrieben. Diese Synthese wird ohne Brommethylierungsschritt durchgeführt, was sie sicherer als bekannte Syntheseverfahren macht.
  • Schritt 1: 3-Chlor-2-butanon (29,2 ml, 0,289 mol) wurde in eine mechanisch gerührte Suspension von 7-Hydroxy-4,8-dimethylcumarin (50,00 g, 0,263 mol) und pulverförmigem K2CO3 (54 g, 0,391 mol) in Aceton (500 ml) gegeben. Der Schlamm wurde 15 Std. unter Rückfluss erhitzt, wonach das Lösungsmittel abgestrippt wurde. Zur Entfernung des Salzes wurde der Feststoff in 1,2 l Wasser gerührt, filtriert und mit Wasser gespült, bis der pH-Wert der Mutterlauge neutral war (pH-Wert 5–7). Das braune Filtrat wurde in kochendem Methanol (150 ml) gelöst, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, so dass eine dicke Paste erhalten wurde, und mit eiskaltem Methanol gespült, so dass das meiste der braunen Verunreinigung entfernt wurde, so dass 4,8-Dimethyl-7-(1-methyl-2-oxo)propyloxycumarin (67,7 g, 99,0 Ausbeute) als schmutzig-weißer Feststoff erhalten wurde, Schmelzpunkt 95–96°C. NMR: d 1,57 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,39 (s, 6H), 4,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H), 6,63 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,9 Hz, 1H).
  • Schritt 2: Eine Suspension von 4,8-Dimethyl-7-(1-methyl-2-oxo)propyloxy-cumarin (67,5 g, 0,260 mol), 10% wässrigem NaOH (114 mml, 0,286 mol) und Wasser (900 ml) wurde für 2 bis 4 Std. bei 70–85°C erhitzt. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der Feststoff wurde filtriert, und dann mit gekühltem Wasser (1,5 l) gespült, bis die Mutterlauge farblos wurde, und der pH-Wert neutral (pH-Wert 5–7) wurde. Das Produkt wurde luft- und vakuumgetrocknet, so dass 4,4',5,8-Tetramethylpsoralen (56,3 g, 89,5%) als weißer Feststoff erhalten wurde, Schmp. 197–199°C. NMR: d 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 6,23 (s, 1H), 7,40 (s, 1H).
  • Schritt 3: Trockenes 4,4',5',8-Tetramethylpsoralen (10,00 g, 41,3 mmol) wurde in Methylenchlorid (180 ml) bei Raumtemperatur gelöst. N-Bromsuccinimid (8,09 g, 45,3 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 4,5 Std. gerührt. Das Lösungsmittel wurde volllständig entfernt, und der resultierende Feststoff wurde mit Wasser (200 ml) für 0,5–1 Std. gerührt, filtriert und kalt mit zusätzlichem Wasser (etwa 500 ml) verrieben, so dass das Succinimid-Nebenprodukt entfernt wurde. Das Rohprodukt (d.h. 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen) wurde in einem Vakuum-Exsikkator mit P2O5 getrocknet, dann in einer minimalen Menge an kochendem Toluol (200 bis 300 ml) umkristallisiert, so dass 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (10,2 g), ein blassgelber Feststoff, erhalten wurde. Die Mutterlauge wurde abgestrippt, und wieder mit Toluol (60 ml) umkristallisiert, so dass eine zweite Produkternte erhalten wurde (1,08 g, vereinigte Ausbeute = 85,1 > 99% Reinheit nach NMR), Schmp. 206–207°C. NMR: d 2,50 (s, 3H), 2,54 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,28 (apparentes q, J = 1,3 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H).
  • BEISPIEL 3
  • Synthese von 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Hydrochlorid (Verbindung 2) und verwandten Verbindungen (Verbindung 4)
  • In diesem Beispiel werden zwei Verfahren zur Synthese von Verbindung 2 beschrieben. Das erste Verfahren wurde folgendermaßen durchgeführt:
  • Schritt 1: 4'-Brommethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (3,09 g, 9,61 mmol) (Synthese, beschrieben in Beispiel 2), und N-(2-hydroxyethyl)phthalimid (4,05 g, 21,2 mmol) wurden in trockenem Dimethylformamid (65 ml) gerührt. Trockenes N2-Gas wurde vorsichtig in das Reaktionsgemisch eingeperlt. Das Reaktionsgemisch wurde für 4,5 Std. auf 100°C erwärmt, und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und für mehrere Std. in den Gefrierschrank überführt. Das kristalline Produkt wurde filtriert und mit MeOH, gefolgt von H2O, gewaschen. Der Feststoff wurde weiter mit MeOH (100 ml) verrieben, um die Verunreinigungen zu entfernen. Das Rohprodukt wurde an der Luft getrocknet und in CHCl3 (150 ml) gelöst. Aktivkohle und Silicagel wurden zum Entfärben dazugegeben, und das CHCl3 wurde vollständig entfernt. Das resultierende weiße Produkt, 4'[4-(N-Phthalimido)-2-oxa]butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (1,56 g, Ausbeute 37,5) war ≥99% rein, sowohl gemäß NMR als auch HPLC; Schmp. 224–225°C. NMR (CDCl3) δ 2,37 (s, 3H); 2,47 (s, 3H); 2,48 (s, 3H); 3,78 (s, 4H), 4,59 (s, 2H); 6,22 (s, 1H); 7,42 (s, 1H); 7,50 (m, 4H).
  • Schritt 2: 4'-[4-(N-Phthalimido)-2-oxa]butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (1,56 g, 3,61 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (75 ml) bei Raumtemperatur suspendiert. Methylamin (50% wässrige Lösung, 25 ml, 290 mmol) wurde zu der Suspension gegeben und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel und Methylamin wurden vollständig entfernt. Der resultierende Feststoff wurde in 0,3 N wässriger HCl-Lösung aufgenommen (25 ml). Die saure Suspension wurde dreimal mit 40 ml CHCl3 gespült, dann mit 20% wässrigem NaOH auf pH-Wert 11 eingestellt. CHCl3 (3 × 60 ml) wurde zum Extrahieren des Produktes (d.h. 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen) von der basisch gemachten Schicht verwendet. Die vereinigten CHCl3-Schichten wurden mit H2O (100 ml), gefolgt von Salzlösung (100 ml) gewaschen, dann über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und eingeengt, so dass 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wurde, Schmp. 139–141°C. Die Reinheit war größer als 99% nach NMR. NMR (CDCl3) δ 2,50 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 2,90 (t, J = 5,27 Hz, 2H), 3,53 (t, J = 5,17 Hz, 2H), 4,66 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H). Das 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen wurde in absolutem Ethanol (150 ml) gelöst, eine 1,0 M Lösung von HCl in Ether (10 ml) wurde zugegeben, und die Suspension wurde im Gefrierschrank über Nacht gekühlt. Nach Filtration und Waschen mit Ether wurde der Feststoff vakuumgetrocknet, so dass blassgelbe Kristalle erhalten wurden (0,76 g, Ausbeute 62%), Schmp. 235–236°C.
  • Alternativ kann Schritt 2 durchgeführt werden, indem entweder Hydrazin oder Butylamin anstatt Methylamin verwendet wird. Das Verfahren, das Butylamin verwendet, ist für eine Synthese im größeren Maßstab bevorzugt, wohingegen ein Überschuss an Methylamin aufgrund von Verflüchtigung benötigt wird, jedoch gilt dies nicht für Butylamin. Das Verfahren, das Butylamin verwendet, wurde folgendermaßen ausgeführt: Die Schutzgruppen von 28,3 g Phthalimid wurden mit n-Butylamin in Propanol entfernt. Die rohe Reaktionslösung wird dann mit HCl behandelt, so dass das Produkt ausgefällt wird. Somit wurde das Reaktionsgemisch in 285 ml 1-Propanol mit HCl-Gas auf pH-Wert 2 behandelt. Das Gemisch wurde für 0,5 Std. bei 5°C gerührt, dann filtriert und mit kaltem Lösungsmittel (3 × 15 ml) gewaschen, so dass 20,5 g rohes 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (92% Ausbeute) erhalten wurden.
  • Das Verfahren mittels Hydrazin erfolgte wie folgt: Die Schutzgruppen der Phthalimid-Vorstufe (6 mol) wurden mit Hydrazin entfernt, und nach der Einengung und den Säure-Base-Extraktionen wurde das rohe Amin in 30 l Ethylendichlorid erhalten. Dazu wurde HCl-Gas (0,14 kg) über Dispersionsrohr über 40 min zugegeben, wobei die Temperatur bei 15–25°C gehalten wurde. Der erhaltene Schlamm wurde eine weitere Std. gerührt. Die Feststoffe wurden auf einem Büchner-Trichter aufgefangen. Beim Trocknen in einem Lufttrockner bei 80°C für 2 Std. wurden 0,945 kg rohes 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten. 0,94 kg Produkt in einem Gemisch von 7,5 kg Isopropanol und 1,88 kg Wasser wurden für 30 min unter Rückfluss erhitzt und dann heiß filtriert. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur über 1 Std. gekühlt, dann für 0,5 Std. auf 15 bis 20°C gekühlt. Die Feststoffe wurden auf einem Büchner-Trichter aufgefangen, dann mit kaltem Isopropanol (0,3 l) gewaschen. Die feuchten Feststoffe wurden in Glasbehälter überführt und unter Vakuum (>28 min) bei etwa 75°C für 11,5 Std. getrocknet. Der Feuchtigkeitsgehalt betrug 0,5%. Die Ausbeute betrug 0,758 kg (81% Ausbeute). Das 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen war analytisch rein. Restliches Isopropanol betrug gemäß NMR etwa 1700 ppm.
  • Das erste Verfahren ist wegen seiner hohen Ausbeute und Reinheit eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Das zweite Verfahren beginnt mit der Herstellung von 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen aus kommerziell erhältlichem 4,5',8-Trimethylpsoralen, wie oben beschrieben. Die Synthese von 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralenhydrochlorid wird in vier (4) Schritten erzielt.
  • Schritt 1: 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (550 mg, 1,99 mmol) und Ethylenglykol (6,8 ml, 121,9 mol) wurden in Aceton (6 ml) für 3,5 Std. auf 50–60°C erhitzt. Nach 2 Std. Erhitzen wurde die weiße Suspension zu einer klaren hellgelben Lösung. Das Aceton und Ethylenglykol wurden auf dem Rotationsverdampfer entfernt, und Wasser (50 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben. Die resultierende Suspension wurde filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen, dann im Vakuumofen getrocknet, so dass 574 mg (96%) 4'-(4-Hydroxy-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wurden; NMR (CDCl3) δ 2,51 (s, 6H); 2,58 (s, 3H); 3,62 (t, J = 4,5 Hz, 2H); 3,78 (t, J = 4,9 Hz, 2H); 4,70 (s, 2H); 6,26 (d, J = 1,1 Hz, 1H); 7,61 (s, 1H).
  • Schritt 2: 4'-(4-Hydroxy-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (574 mg, 1,9 mmol) wurde in CH2Cl2 (6 ml) unter N2 bei ≤10°C gelöst. Triethylamin (359 mg, 3,55 mmol) wurde zugegeben. Methansulfonylchlorid (305 mg, 266 mmol) wurde langsam eingetropft, wobei die Temperatur unter 10°C gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch für weitere 15 min gerührt, und dann wurde es für 10 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Zu der umgesetzten Suspension wurde CH2Cl2 (45 ml) gegeben, und das Gemisch wurde mit Wasser (3 × 20 ml) gewaschen, dann über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Die Einengung bei ≤30°C, gefolgt von Vakuumtrocknen ergab 4'-[(4-Methansulfonyloxy-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen als gelben Feststoff (706 mg, 98%), Schmp. 138–140°C. NMR δ 2,51 (s, 3H); 2,52 (d, 3H); 2,58 (s, 3H); 2,99 (s, 3H); 3,77 (m, 2H); 4,39 (m, 2H); 4,71 (s, 2H); 6,26 (s, 1H); 7,62 (s, 1H).
  • Schritt 3: 4'-[(4-Methansulfonyloxy-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (706 mg, 1,86 mmol) und Natriumazid (241 mg, 3,71 mmol) wurden in 95% Ethylalkohol (5 ml) für 8 Std. unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionslösung wurde gekühlt, und kaltes Wasser (55 ml) wurde zugegeben. Der schmutzig-weiße Feststoff wurde filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen. Beim Vakuumtrocknen wurde das Azid (d.h. 4'-(4-Azido-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen) als hell gelblicher Feststoff erhalten (575 mg, 95 %, Schmp. 105–106°C. NMR δ 2,51 (s, 6H); 2,58 (s, 3H); 3,41 (t, J = 4,9 Hz, 2H); 3,67 (apparentes t, J = 4,9 Hz, 2H); 4,70 (s, 2H); 6,26 (s, 1H); 7,66 (s, 1H).
  • Schritt 4: Das 4'-(4-Azido-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen (1,65 g, 5,03 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst. Triphenylphosphin (1,59 g, 6,08 mmol) und sechs Tropfen Wasser wurden zu der vorhergehenden Lösung zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die hellgelbe Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in CHCl3 (90 ml) gelöst und mit 0,3 N wässrigem HCl (30 ml, dann 2 × 5 ml) extrahiert. Die vereinigten HCl-Schichten wurden vorsichtig bis zur Sättigung mit K2CO3 behandelt. Die Basislösung wurde mit CHCl3 (3 × 60 ml) extrahiert. Die vereinigten CHCl3-Schichten wurden mit 60 ml Wasser, 60 ml Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Beim Einengen und Vakuumtrocknen wurde das Amin als gelber Feststoff erhalten (1,25 g, 82%), Schmp. 139–141°C; NMR δ 2,48 (s, 6H); 2,55 (s, 3H); 2,89 (t, J = 6 Hz, 2H); 3,52 (t, J = 6 Hz, 2H); 4,64 (s, 2H); 6,22 (s, 1H); 7,59 (s, 1H).
  • Das Amin wurde in absolutem Ethanol (40 ml) gelöst, und 20 ml 1 N HCl in Ethylether wurden zugegeben. Nach Absetzenlassen bei 5°C über Nacht wurde der Niederschlag filtriert, und mit Ether gespült, so dass 1,25 g Verbindung 2 erhalten wurden, Schmp. 236°C (Zers.) 13C-NMR: 8,54, 12,39, 19,18, 38,75, 62,26, 65,80, 108,01, 112,04, 112,42, 112,97, 116,12, 125,01, 148,76, 153,97, 154,37, 155,76, 160,34.
    Anal berechn. für C10H20ClNO4: C, 60,45: H, 5,97; N, 4,15. Gefunden: C, 60,27; H, 5,88; N, 4,10.
  • Ähnlich durch Umsetzen von 4'-CMT mit 1,3-Propandiol, vergleichbar zu Schritt 1 und analog weiter bis zu Schritt 4, wurde 4'-(5-Amino-2-oxa)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen, (Verbindung 4), hergestellt, Schmp. 212–214°C (zersetzt). NMR der freien Base: δ 1,73 (pent, J = 6,4 Hz, 2H), 2,45 (s, 6H), 2,51 (s, 3H), 2,78 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,54 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,59 (s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,54 (s, 1H).
    oranger Feststoff, sublimiert ≥ 250°C, zers. >300°C, 1H NMR (CDCl3): 2,54 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,68 (s, 3H), 6,32 (apparentes d, J = 1 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 10,07 (s, 1H).
  • 4,4',8-Trimethyl-5-psoralencarboxaldehyd (7,50 g, 29,3 mmol) wurde in 200 proof EtOH (250 ml) gerührt. Natriumborhydrid wurde zugegen, und der Schlamm wurde über Nacht gerührt. Eiswasser (150 ml) und 10% wässr. NaCO3 (50 ml) wurden zugegeben, um die Reaktion zu quenchen. Nach dem Rühren für 45 min wurde der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gespült, bis das Filtrat neutral war (pH-Wert 5–7). Das Produkt wurde in einem Vakuum-Exsikkator mit P2O5 getrocknet, so dass 5'-Hydroxymethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (7,46 g, 98,5) als blassgelber Feststoff erhalten wurde, Schmp. 244–245°C. 1H NMR (CDCl3): 1,97 (t, J = 6 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,79 (d, J = 6 Hz, 2H), 6,25 (apparentes d, J = 11 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H).
  • Zu einem gerührten, mit Eis/Wasser gekühlten Schlamm von 5'-Hydroxymethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (15,42 g, 59,7 mmol) in Dichlorethan (500 ml) wurde Phosphortribromid (6,17 ml, 85,7 mmol) tropfenweise gegeben. Die Reaktion wurde vor Feuchtigkeit geschützt und konnte über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Das Gemisch wurde dann mit 300 ml Eis/Wasser für 1 Std. gerührt. Der Feststoff wurde abfiltriert, getrocknet, in heißem Toluol gelöst, durch geriffeltes Filterpapier filtriert und abgestrippt, so dass 5'-Brommethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (3,43 g) erhalten wurde. Die Reaktions-Lösungsmittel (Dichlorethan und Wasser) wur den getrennt, und die wässrige Schicht wurde dreimal mit Dichlorethan extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung gespült, und dann getrocknet (wasserfr. Na2SO4) und unter Vakuum gestrippt, so dass ein Großteil des Produktes, 5'-Brommethyl-4,4',8-trimethylpsoralen, erhalten wurde (13,13 g, kombinierte Ausbeute 86,4%) als blassgelber Feststoff, Schmp. 201–202°C. 1H NMR (CDCl3): 2,29 (s, 3H), 2,52 (d, J = 1 Hz, 3H), 260 (s, 2H), 4,64 (s, 2H), 6,27 (apparentes d, J = 1 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H).
  • N-Hydroxyethylphthalimid (3,00 g, 15,5 mmol) wurde in DMF (5 ml) bei 60–64°C gelöst, während N2 in die Lösung geperlt wurde. Natriumiodid (0,01 g, 0,067 mmol) und 5'-Brommethyl-4,4',8-trimethylpsoralen (1,00 g, 3,11 mmol) wurden dazu gegeben, und der Schlamm wurde unter diesen Bedingungen über Nacht gerührt. Das dicke gelbe Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, in einem Eis/Wasser-Bad gekühlt, filtriert und mit eiskaltem MeOH gespült, so dass das Rohprodukt (1 g) erhalten wurde. Der Feststoff wurde in Dichlorethan (100 ml) umkristallisiert, so dass 4,4',8-Trimethyl-5'-[2-(N-phthalimido)-2-oxa]butylpsoralen (0,68 g, 50,8% als schmutzig-weißer Feststoff erhalten wurde, Schmp. 225–228°C. 1H NMR (CDCl3): 2,26 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 3,87 (m, 4H), 4,64 (s, 2H), 6,26 (apparentes d, J = 1 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,64 (Multiplett, 4H), 4,4',8-Trimethyl-5'-[4'-(N-phthalimido)-2-oxa]butylpsoralen (1,61 g, 3,73).
  • BEISPIEL 4
  • Synthese von 4'-(7-Amino-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Hydrochlorid (Verbindung 7)
  • In diesem Beispiel wird die Synthese von Verbindung 7 beschrieben. Die Synthese von 4'-(7-Amino-2,5- oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Hydrochlorid verläuft in vier (4) Schritten:
  • Schritt 1: 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (589 mg, 2,13 mmol), Diethylenglykol (15,48, 145 mmol) und Aceton (13 ml) wurden für 11,5 Std. unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionslösung wurde eingeengt, so dass Aceton und ein Teil des Diethylenglykols entfernt wurde. Zu der erhaltenen hellbraunen Lösung wurde CHCl3 (40 ml) zugegeben, dann mehrmals mit Wasser gewaschen. Die CHCl3-Schicht wurde über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und eingeengt, so dass 781 mg Produkt erhalten wurde. 4'-(7-Hydroxy-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (100%). NMR δ 2,46 (d, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 3,58–3,67 (m, 8H), 4,67 (s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,57 (s, 1H).
  • Schritt 2: 4'-(7-Hydroxy-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (781 mg, 2,25 mmol) wurde in CH2Cl2 (2,5 ml) unter einem N2-Strom bei <10°C gelöst. Triethylamin (363 mg, 3,59 mmol) wurde zugegeben. Methansulfonylchlorid (362 mg, 3,16 mmol) wurde langsam eingetropft, so dass die Temperatur unter 10°C gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch für weitere 15 min unter 10°C gehalten. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, dann wurde CH2Cl2 (50 ml) zugegeben. Die Lösung wurde mit Wasser (3 × 60 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, und bei 530°C eingeengt. Beim Vakuumtrocknen wurde ein hellbrauner Sirup erhalten [4'-(7-Methansulfonyloxy-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen]; 437 mg (76%) NMR δ 2,50 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 3,01 (s, 3H), 3,66 (m, 4H), 3,77 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 4,37 (t, J, t = 6 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).
  • Schritt 3: 4'-(7-Methansulfonyloxy-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (288 mg, 0,678 mmol) und Natriumazid (88,2 mg, 1,36 mmol) wurden in 3 ml 95% Ethylalkohol für 8 Std. unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionslösung wurde abkühlen gelassen, und es wurde kaltes Wasser (50 ml) hinzugegeben. Die Wasserschicht wurde weggegossen. Das rohe Material wurde durch Chromatographie auf (Silicagel mit Chloroform-Elutionsmittel) einem Chromatotron (Harrison Research, Inc., Palo Alto, CA) gereinigt und vakuumgetrocknet, so dass ein hellgelber Sirup erhalten wurde. 4'-(7-Azido-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (123 mg, 49%). NMR δ 2,50 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 3,39 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,68 (m, 6H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,62 (s, 1H).
  • Schritt 4: 4'-(7-Azido-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (122 mg, 0,33 mmol), Triphenylphosphin (129 mg, 0,49 mmol) und mehrere Tropfen Wasser wurden in Tetrahydrofuran (2 ml) gelöst. Die hellgelbe klare Lösung wurde bei Raumtemperatur über ein Wochenende gerührt. Es wurde kein Ausgangsmaterial durch DC nachgewiesen. Die Reaktionslösung wurde eingeengt, und der Rückstand wurde in CHCl3 (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 0,15 N wässriger HCl-Lösung (10 ml, dann 2 × 5 ml) extrahiert, und die HCl-Schichten wurden durch Zugabe von 20% wässriger NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 13 eingestellt. Die basische Lösung wurde mit CHCl3 (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten CHCl3-Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, eingeengt und im Vakuum getrocknet, so dass 63,9 mg Produkt, 4'-(7-Amino-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen erhalten wurden (56%). Die DC zeigte nur einen Fleck. NMR δ 2,50 (s, 3H); 2,50 (s, 3H); 2,57 (s, 3H); 2,86 (t, J = 5,3 Hz, 2H); 3,50 (t, J = 5,3 Hz, 2H); 3,63 (s, 4H); 4,70 (s, 2H); 6,24 (s, 1H); 7,62 (s, 1H). Schmp. 170–173 °C.
  • Der Feststoff wurde in absolutem Ethanol gelöst, dann wurde 1 M HCl in Ethylether dazu gegeben, die Suspension wurde filtriert, und das Produkt wurde mit Ether gespült und getrocknet.
  • BEISPIEL 5
  • Synthese von 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid (Verbindung 8)
  • Die Synthese von 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid verläuft in einem (1) Schritt von dem Produkt aus Beispiel 5, Verfahren 2, Schritt 2: Eine Lösung von 4'-(7-Methansulfonyloxy-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen (108 mg, 0,253 mmol) in 8 ml Acetonitril wurde langsam zu einer Lösung von 1,4-Diaminobutan (132 mg, 1,49 mmol) in 2,8 ml Actonitril gegeben. Nach Erhitzen unter Rückfluss für 8 Std. verblieb kein Ausgangsmaterial gemäß DC. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und CHCl3 (25 ml) und 1 N wässrige NaOH (25 ml)-Lösung wurden zugegeben. Die Schichten wurden getrennt, und CHCl3 (2 × 10 ml) wurde zum Waschen der wässrigen Schicht verwendet. Wässriges HCl (0,3 N, 3 × 10 ml) wurde zum Extrahieren des Produktes aus den vereinigten organischen Schichten verwendet. Die HCl-Schichten wurden mit 20% wässriger NaOH-Lösung behandelt, bis der pH-Wert 13 betrug. Die vereinigten basischen Schichten wurden dann mit CHCl3 (3 × 20 ml) extrahiert. Die CHCl3-Schicht wurde mit wässriger gesättigter NaCl-Lösung (10 ml) gewaschen, dann über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Nach dem Einengen und Vakuumtrocknen wurden 63 mg Produkt, 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid erhalten (60%). NMR δ 1,45 (m, 2H), 2,49 (s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,58 (t, 2H), 2,66 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,76 (m, 4H), 3,55–3,61 (m, 6H), 4,68 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).
  • BEISPIEL 6
  • Synthese von 4'(2-Aminoethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen-Hydrochlorid (Verbindung 3)
  • Die Synthese von 4'-(2-Aminoethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen verläuft in einem (1) Schritt: Natriumtrifluoracetoxyborhydrid wurde hergestellt durch Zugabe von Trifluoressigsäure (296 mg, 2,60 mmol) in 2 ml THF zu einer gerührten Suspension von Natriumborhydrid (175 mg, 4,63 mmol) in 2 ml THF über einen Zeitraum von 10 min bei Raumtemperatur. Die resultierende Suspension wurde zu einer Suspension von 4'-Cyanomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (Kaufman et al., J. Heterocyclic Chem. 19: 1051 (1982)) (188 mg, 0,703 mmol) in 2 ml THF gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Mehrere Tropfen Wasser wurden zu der umgesetzten hellgelben klaren Lösung gegeben, so dass das überschüssige Reagens unter 10°C zersetzt wurde. Das resultierende Gemisch wurde eingeengt, und es wurde 1 N wässrige NaOH-Lösung (30 ml) zugegeben. Chloroform (30 ml, dann 10 ml, 5 ml) wurde zum Extrahieren des resultierenden Amins verwendet. Die vereinigten CHCl3-Schichten wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Das Amin wurde dann in wässrige 0,3 N HCl (10,5, 5 ml) extrahiert, und die sauren Schichten wurden mit 20% wässrigem NaOH auf einen pH-Wert von 13 eingestellt. CHCl3 (3 × 10 ml) wurde verwendet, um das Amin aus den vereinigten basischen Schichten zu extrahieren, dann wurde mit Wasser (2 ml) gewaschen und über wasserfreien Na2SO4 getrocknet. Beim Einengen und Vakuumtrocknen wurde das Amin als Feststoff erhalten. >95% rein gemäß NMR. NMR δ 2,45 (s, 3H); 2,47 (s, 3H); 2,53 (s, 3H); 2,78 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 3,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 6, 20 (s, 1H) ; 7, 44 (s, 1H).
  • Der Feststoff wurde in absolutem Ethanol gelöst. Eine Lösung von Chlorwasserstoff in Diethylether (1 N, 1 ml) wurde zugegeben. Die Suspension wurde filtriert, so dass Verbindung 3, ein leicht purpurner Feststoff, erhalten wurde (32,7 mg, Ausbeute 15%), Schmp. > 237°C (zers.).
  • BEISPIEL 7
  • 4'-(6-Amino-2-aza)hexyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid (Verbindung 6)
  • Die Synthese von 4'-(6-Amino-2-aza)hexyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid verläuft in einem (1) Schritt, wie folgt: Eine Lösung von 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (188 mg, 0,68 mmol) in 30 ml Acetonitril wurde zu einer Lösung von 1,4-Diaminobutan (120 mg, 1,4 mmol) in 7 ml Acetonitril gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Chloroform (10 ml) und 1 N NaOH (10 ml) wurden zu dem Rückstand gegeben, und das Gemisch wurde geschüttelt und getrennt. Die wässrige Lösung wurde mit weiteren 2 × 10 ml CHCl3 extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gespült. Das Produkt wurde dann aus der CHCl3-Lösung mit 0,3 N wässriger HCl extrahiert und die saure Schicht wurde dann mit konzentrierter NaOH-Lösung auf pH-Wert 12 eingestellt. Die Basensuspension wurde mit CHCl3 extrahiert, was dann mit Wasser gespült wurde, über Na2SO4 getrocknet wurde und unter reduziertem Druck eingeengt wurde, so dass das Amin als die freie Base erhalten wurde. NMR (CDCl3); δ 1,33 (m, 3H), 1,52 (m, 4H), 2,47 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,68 (q, J = 6,5 Hz, 4H), 3,86 (s, 2H), 6,21 (apparentes d, J = 1,1 Hz, 11H), 7,60 (s, 1H).
  • Die freie Base, gelöst in etwa 6 ml absolutem EtOH, wurde mit einer Lösung von HCl in Ether (1,0 M, 3 ml) behandelt. Das resultierende HCl-Salz wurde filtriert, mit absolutem EtOH gespült und unter Vakuum getrocknet, so dass 150 mg Verbindung 6 (55%) erhalten wurden, Schmp. 290°C (zersetzt). Analyse, berechnet für C19H26C12N2O3·H2O: C, 54,42; H, 6,73; N, 6,68. Gefunden: C, 54,08; H, 6,45; N, 6,65.
  • Die folgenden Verbindungen wurden auf ähnliche Weise hergestellt, hergestellt, wobei die Unterschiede in der Synthese vermerkt sind:
    • a) 4'-(4-Amino-2-aza)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid (Verbindung 1), Schmp. 320–322°C (zers.). Bei dieser Synthese wurde Ethylendiamin als Diamin verwendet.
    • b) 4'-(5-Amino-2-aza)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid (Verbindung 5), Schmp. 288°C (zers.). NMR der freien Base: d 1,33 (brs, 3H), 1,66 (pent, J = 6,8 Hz, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,50 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,6–2,85 (m, 4H), 3,89 (s, 2H), 6,22 (apparentes d, J = 1 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H). Für diese Synthese wurde 1,3-Diaminopropan als Diamin verwendet.
    • c) 4'-(7-Amino-2-aza)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Dihydrochlorid (Verbindung 10), Schmp. 300°C (zers.). NMR der freien Base: d 1,22 (brs,), 1,3–1,6 (m) total 9H, 2,44 (s), 2,50 (s), total 9H, 2,63 (m, 4H), 6,17 (s, 1H), 7,56 (s, 1H).
  • Hier wurde 1,5-Diaminopentan als Diamin verwendet.
  • BEISPIEL 8
  • 4'-(14-Amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Tetrahydrochlorid (Verbindung 15)
  • Die Synthese von 4'-(14-Amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Tetrahydrochlorid verläuft in einem (1) Schritt, wie folgt: Zu einer Lösung von 0,5 g (2,5 mmol) Spermin (Aldrich, Milwaukee, WI) in 10 ml Methanol wurde eine 5 N Methanol-Lösung von HCl (konzentrierte HCl, verdünnt mit MeOH auf 5 N) gegeben, so dass der pH-Wert auf 5–6 eingestellt wurde, gefolgt von 0,128 g (0,5 mmol) 4,5',8-Trimethylpsoralen-4'-carboxaldehyd, 20 mg (0,3 mmol) NaBH3CN und 3 ml MeOH. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 5 N methanolischer HCl wurde zugefügt, bis der pH-Wert <2 war, und das Methanol wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in etwa 100 ml Wasser aufgenommen, und mit drei 25 ml Portionen CHCl3 gespült. Die wässrige Lösung wurde mit konzentrierter NaOH auf pH-Wert >10 gebracht und mit drei 25 ml-Portionen CHCl3 extrahiert. Diese endgültigen Extrakte wurden vereinigt und mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und verdampft, so dass die freie Aminbase erhalten wurde, ≥95% rein gemäß NMR. NMR (CDCl3): d 1,31 (m, 5H), 1,45 (pent, J = 3,41 Hz, 4H), 1,65 (m, 4H), 2,46 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,14 Hz, 3H), 2,66 (m, 15H), 3,85 (s, 2H), 6,21 (s, 1H), 7,60 (s, 1H).
  • Das freie Amin wurde in absolutem Ethanol gelöst und HCl (wasserfrei, 1N in Ethylether) wurde dazugegeben. Das Hydrochlorid-Salz wurde filtriert und mit absolutem Ethanol gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, so dass 80,2 mg Produkt, 4'-(14-Amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Tetrahydrochlorid als hellgelber Feststoff erhalten wurde.
  • BEISPIEL 9
  • Ein r-17-Bakteriophagentest wurde in diesem Beispiel verwendet, um die Pathogeninaktivierungseffizienz vorherzusagen, und um die Nukleinsäure-Bindung der photoreaktiven bindenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Bei dem r-17-Assay wurde der Bakteriophage in einer Lösung mit jeder untersuchten Verbindung vorgelegt und dann bestrahlt. Die Fähigkeit des Phagen zur anschließenden Infektion von Bakterien und Hemmung ihres Wachstums wurde gemessen. Der Bakteriophage wurde auf seine relativ zugängliche Nukleinsäure hin ausgewählt, so dass die Kulturwachstumshemmung genau den Nukleinsäure-Schaden durch die Testverbindungen widerspiegeln würde. Der Bakteriophagentest für die Nukleinsäure-Bindung an Testverbindungen bietet ein sicheres und billiges Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die wahrscheinlich eine effiziente Pathogen-Inaktivierung aufzeigen. Vorherige Experimente legen nahe, dass der r-17-Test genau die HIV-1-Empfindlichkeit gegenüber ähnlichen Verbindungen misst.
  • Der r-17 wurde in HFr-3000-Bakterien, ungefährer Titer 5 × 1011 gezüchtet (R17 und Hfr 3000 wurden von American Tissue Culture Collection (ATCC), Washington D.C.) erhalten. Das R17-Phagen-Ausgangsmaterial wurde zu einer Lösung von 15% fötalem Rinderserumalbumin in Dulbecco's modifiziertem Eagles Medium (DMEM) zu einer Phagen-Endkonzentration von 109/ml gegeben. Ein Aliquot (0,5 ml) wurde in ein 1,5 ml Polyethylen-Röhrchen mit Schnappverschluss überführt. Ein Aliquot (0,004–0,040 ml) der Ausgangslösung der Testverbindung, hergestellt in Wasser, Ethanol oder Dimethylsulfoxid bei 0,80–8,0 mM wurde in das Röhrchen gegeben. Die Verbindungen wurden bei Konzentrationen zwischen 4 μM und 320 μM getestet. (AMT ist kommerziell erhältlich von HRI, Inc. Concord, CA; 8-MOP ist kommerziell erhältlich von Sigma, St. Louis, MO). Die Röhrchen wurden in einer Lichtvorrichtung untergebracht, wie in Beispiel 1 beschrieben, und 1 bis 10 min bestrahlt. Sterile 13 ml Verdünnungsröhrchen wurden hergestellt; jede Testverbindung benötigte ein Röhrchen mit 0,4 ml Luria-Brühe (LB) und fünf Röhrchen mit 0,5 ml LB-Brühe. Zur Erstellung der Verdünnungen wurde ein 0,100 ml-Aliquot der bestrahlten Lösung von Phage und Testverbindung zum ersten Verdünnungsröhrchen von 0,4 ml Medium gegeben, dann wurden 0,020 ml dieser Lösung zum zweiten Röhrchen mit 0,5 ml Medium (1:25) gegeben. Die zweite Lösung wurde dann seriell verdünnt (1:25) in die verbleibenden Röhrchen. Zu jeder verdünnten Probe wurden 0,050 ml Hfr 3000-Bakterien gegeben, die über Nacht gezüchtet wurden, und 3 ml geschmolzener LB-Top-Agar und die gemischten Materialien wurden auf Platten mit LB-Brühe gegossen. Nach dem Härten des Top-Agars wurden die Platten bei 37°C über Nacht inkubiert. Die plaquebildenden Einheiten wurden am nächsten Morgen gezählt, und der Phagentiter der nach der Photobehandlung verblieb, wurde auf der Basis der Verdünnungsfaktoren berechnet.
  • Es wurden folgende Kontrollen durchgeführt; "Nur Phage", wobei der Phage nicht mit der Testverbindung behandelt wurde und auch nicht bestrahlt wurde (aufgeführt als "Anfangstiter" in den nachstehenden Tabellen); "Nur UV", wobei der Phage in der Abwesenheit von Testverbindung bestrahlt wurde; und "Dunkel"-Kontrolle, wobei die Lösung aus Phage/Test-Verbindung nicht bestrahlt wurde, bevor sie verdünnt und plattiert wurde.
  • Tabelle 5 unten zeigt drei verschiedene Experimente, die die Verbindung 1 gemäß dem soeben beschriebenen R17-Protokoll untersuchten. Ein Vergleich der Werte der Kontrollproben in den Durchgängen 1 bis 3 (Werte fett gedruckt) zeigt, dass weder die "Nur W"- noch die "Dunkel"-Kontrollen zu einer signifikanten bakteriellen Abtötung (höchstens 0,3 log in der "Nur W"- abgetötet und 0,1 log in der "Dunkel"-Kontrolle abgetötet) führen.
  • Die "Nur W"-Kontrolle wurde in vielen ähnlichen Experimenten mit anderen erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführt, und diese zeigten durchweg keine signifikante Abtötung (Daten nicht gezeigt). Somit ist die "Nur W"-Kontrolle nicht in den folgenden Tabellen und Figuren gezeigt, obgleich dies in jedem Experiment in diesem Beispiel durchgeführt wurde. Wie bei der "Dunkel"-Kontrolle wurde nach vielen Versuchen mit verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen offensichtlich, dass unabhängig von dem Typ der Substitution an der 4'-Position des Psoralens keine experimentell signifikante bakterielle Inaktivierung im Dunkeln beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). In Tabelle 5 zeigt beispielsweise Versuch 1 0,1 log Abtötung mit der Verbindung 1 im Dunkeln. Wird die Verbindung 1 dagegen für nur 1 min bestrahlt, beträgt der Abfall des Titers >6,7 log. Daher wurden die "Dunkel"-Kontrollen für die später getesteten Verbindungen nicht durchgeführt, und wenn sie durchgeführt wurden, sind sie nicht in den nachstehenden Tabellen und Figuren aufgeführt.
  • TABELLE 5
    Figure 00800001
  • Die nachstehenden Tabellen 6–9 und die 11–13 zeigen die Ergebnisse des R17-Tests für mehrere der 4'-primär-aminosubstituierten Psoralen-Verbindungen. Die Daten in den Tabellen 7 und 8 erscheinen in den 11 bzw. 12. 5'-primär-aminosubstituierte Psoralen-Verbindungen (Vergleichsbeispiele), die Substitutionen an der 5'-Position ähnlich wie die 4'-primär-amino-substituierten Psoralen-Verbindungen aufweisen, wurden ebenfalls bei verschiedenen Konzentrationen untersucht, wie oben in diesem Beispiel beschrieben, und sie weisen Befunden zufolge eine vergleichbare Inaktivierungseffizienz auf. Die Ergebnisse für diese Verbindungen sind in den 14 und 15 unten beschrieben.
  • Die Verbindungen mit Substitutionen an der 4'-Position des Psoralen-Rings töteten Befunden zufolge R17 wie gezeigt in: TABELLE 6
    Figure 00810001
    TABELLE 7
    Figure 00810002
    TABELLE 8
    Figure 00820001
    TABELLE 9
    Figure 00820002
    den vorstehenden Tabellen. Es ist offensichtlich in Tabelle 7, dass Verbindung 1 eine viel höhere R17-Inaktivierungseffizienz aufweist, als 8-MOP. Wie in Tabelle 7 und 11 gezeigt, ist Verbindung 1 eine der weniger aktiven Verbindungen. Beide Verbindungen 2 und 3 zeigen eine höhere log-Inaktivierung als Verbindung 1 an jedem Konzentrationspunkt. Diese Ergebnisse unterstützen, dass die Verbindungen gewöhnlich viel aktiver sind als 8-MOP.
  • Die Verbindungen haben auch eine ähnliche oder bessere R17-Inaktivierungseffizienz als AMT. In den Tabellen 7 und 8 und in den 11 bis 15 erzielen sämtliche erfindungsgemäßen Verbindungen eine R17-log-Inaktivierung in Mengen, vergleichbar mit AMT. Die Verbindungen 2 und 3 (Tabelle 6, 11), die Verbindungen 5 und 6 (Tabelle 8, 12) und Verbindung 16 (15) weisen eine erheblich höhere Inaktivierungseffizienz als AMT auf.
  • Die Verbindungen wurden ebenfalls bei einer konstanten Konzentration für verschiedene Dosen von W-Licht untersucht. Drei Sätze mit 1,5 ml-Röhrchen wurden hergestellt, die 0,6 ml Aliquots von R17 in DMEM enthielten (hergestellt wie oben beschrieben). Die untersuchte Verbindung wurde in der gewünschten Konzentration zugegeben, und die Proben wurden im Vortex-Gerät aufgewirbelt. Die Proben wurden dann in Intervallen von 1,0 J/cm2 bis zum Erreichen von 3,0 J/cm2 bestrahlt. Zwischen jedem 1,0 J/cm2-Intervall wurden 100 μl aus jeder Probe entnommen und in dem ersten entsprechenden Verdünnungsrohr untergebracht, dann wurden 5 aufeinander folgende Verdünnungen für jede untersuchte Verbindung bei sämtlichen 3 Bestrahlungsdosen, wie oben in diesem Beispiel beschrieben, durchgeführt.
  • Dann wurden 50 μl Hfr 3000-Bakterien in jedes Röhrchen gegeben, 3 ml Top-Agar wurden zugegeben und der Inhalt der Röhrchen wurde im Vortexgerät aufgewirbelt. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde in seine eigene LB-Platte gegossen, und die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plaques wurden durch optische Untersuchung am nächsten Morgen gezählt.
  • Die Ergebnisse des Tests für mehrere 4'- und 5'-primär-amino substituierte Psoralen-Verbindungen sind in den 16-22 gezeigt. Diese Daten unterstützen weiterhin, dass die Verbindungen hinsichtlich ihrer Fä higkeit zur Inaktivierung von R17 mit AMT vergleichbar sind. Zudem inaktivierten die Verbindungen 6 (16), 10 (17), 12 (18), 15 (19 und 22), und Verbindung 17 (20) R17 jeweils effizienter als AMT.
  • BEISPIEL 10
  • Die Pathogeninaktivierungseffizienz verschiedener Verbindungen wurde durch Untersuchen der Fähigkeit der Verbindungen zur Inaktivierung von zellfreiem Virus (HIV) bewertet. Die Inaktivierung von zellfreiem HIV wurde folgendermaßen durchgeführt.
  • Wie in dem R17-Test wurden kleine Aliquots der Verbindungen, die in den Tabellen 10 und 11 unten aufgeführt sind, bei den in der Tabelle aufgeführten Konzentrationen zu einem Ausgangs-HIV-1 auf insgesamt 0,5 ml zugegeben. Der Ausgangs-HIV (105–107 plaquebildende Einheiten/ml) war in DMEM/15% FBS. Die 0,5 ml Testaliquots wurden in 24 Polystyrol-Gewebekulturplatten untergebracht und mit 320 bis 400 nm (20 mW/cm2) für 1 min auf einer Vorrichtung ähnlich wie in Beispiel 1 bestrahlt. Die hier verwendete Photoaktivierungsvorrichtung wurde zuvor untersucht und führte zu einer vergleichbaren Lichtexposition wie bei der Vorrichtung von Beispiel 1 (Daten nicht gezeigt). Die Kontrollen umfassten Nur-HIV-Ausgangsmaterial, Nur HIV-1 plus UVA und HIV-1 plus höchste Konzentration jedes untersuchten Psoralens ohne UVA. Nach der Bestrahlung wurden sämtliche Proben bis zum Test auf Infektiosität durch einen Mikrotiter-Plaque-Test bei –70°C eingefroren aufbewahrt. Die Aliquots zur Messung der restlichen HIV-Infektiosität in den mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelten Proben wurden entnommen und gezüchtet.
  • Die restliche HIV-Infektiosität wurde mit einem MT-2-Infektiositätstest untersucht (zuvor beschrieben in Hanson, C.V. Crowford-Miksza, L. und Sheppard, H.W., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990)). Das Assay-Medium war 85% DMEM (mit einer hohen Glucose-Konzentration) mit 100 μg Streptomycin, 100 U Penicillin, 50 μg Gentamicin, und 1 μg Amphotericin B pro ml, 15% FBS und 2 μg Polybrene (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) pro ml. Test- und Kontrollproben aus dem Inaktivierungsverfahren wurden in 50% Assaymedium und 50% normalem menschlichem gepooltem Plasma verdünnt. Die Proben wurden direkt in Platten mit 96 Vertiefungen (Corning Glass Works, Corning N.Y.) seriell verdünnt. Die Platten wurden in einem Schwingschüttler für 30 sek gemischt und bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre für 1 bis 18 Std. inkubiert. MT-2-Zellen (0,025 ml) [Klon alpha-4, erhältlich (Katalog-Nummer 237) von den National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] wurden in jede Vertiefung gegeben, so dass eine Konzentration von 80000 Zellen pro Vertiefung erhalten wurde. Nach einer zusätzlichen Stunde Inkubation bei 37°C in 5% CO2 wurden 0,075 ml auf 38,5°C vorgewärmtes Assaymedium mit 1,6 % SeaPlaque-Agarose (FMC Bioproducts; Rockland, Maine) in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden für einige Minuten bei 37°C gehalten, bis sich mehrere Platten angesammelt hatten, und dann in Plattenträgern bei 600 × g für 20 min in einer auf 10°C vorgekühlten Zentrifuge zentrifugiert. In der Zentrifuge bildeten sich Zellmonoschichten vor der Gelbildung der Agaroseschicht. Die Platten wurden für 5 Tage bei 37°C in 5% CO2 inkubiert, und durch die Zugabe von 0,05 ml 50 μg/ml Propidiumiodid (Sigma Chemical Co.) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) in jede Vertiefung gefärbt. Nach 24 bis 48 Std. wurden die rot fluoreszenz-gefärbten Mikropla ques durch Unterbringen der Platten auf einem 8000 μW/cm2 304 nm UV-Lichtkasten (Fotodyne, Inc. New Berlin Wis.) sichtbar gemacht. Die Plaques wurden bei einer 20- bis 25-fachen Vergrößerung über ein Stereomikroskop gezählt. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 10 und 11 gezeigt. "n" veranschaulicht die Anzahl der Durchgänge, für die der Datenpunkt ein Durchschnitt ist.
  • Die Ergebnisse unterstützen, dass die Verbindungen HIV effizient inaktivieren. Tatsächlich legen die Daten für die Konzentrationen von 64 μM Verbindung oder höher nahe, dass die Verbindungen 2 und 3 signifikant aktiver als AMT sind, was zuvor für das wirksamste antivirale Psoralen gehalten wurde. Bei niedrigeren Konzentrationen kann Verbindung 6 einen höheren log HIV (3,1 log bei 32 μM) als AMT (2,5 log bei 32 μM) abtöten. Die anderen in Tabelle 9 aufgeführten Verbindungen zeigen eine Inaktivierungseffizienz im gleichen Bereich wie AMT.
  • TABELLE 10
    Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • TABELLE 11
    Figure 00870002
  • Beispiel 11
  • Dieses Beispiel beschreibt das Protokoll zur Inaktivierung von Enten-Hepatitis-B-Virus (DHBV), ein Modell für Hepatitis B-Virus, unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen.
  • DHBV in Enten-Eidotter wurde zu einem Blutplättchenkonzentrat (PC) in einer Endkonzentration von 2 × 107 Teilchen pro ml gegeben und durch sanftes Schütteln für ≥15 min gemischt. Die Psoralene S-70, S-59 und AMT wurden zu 3 ml-Aliquots von PC in einem TeflonTM-Minibeutel in Konzentrationen von 35, 70 und 100 mM gegeben. Proben, einschließlich Kontrollen ohne zugefüg tes Psoralen, wurden unter Mischen mit 5 J/cm2 UVA bei Zunahmen von 1 J/cm2 bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden Leukocyten und Blutplättchen durch Zentrifugation von Virus getrennt. Der Überstand mit DHBV wurde über Nacht mit 50 μg/ml Proteinase K in einem Puffer mit 0,5% Natriumdodecylsulfat, 20 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, und 5 mM EDTA bei 55°C gespalten. Die Proben wurden mit Phenol-Chloroform und Chloroform extrahiert, gefolgt von Ethanolfällung. Gereinigte DNA wurde dann in PCR-Amplifikationsreaktionen verwendet, mit einer Anfangseingabe von 106 DHBV-Genomen aus jeder Probe. Die PCR-Amplikons wurden mit den Primerpaaren DCD03/DCD05 (127 Bp), DCD03/DCD06 (327 Bp) und DCD03/DCD07 (1072 Bp) erzeugt. Die PCR wurde in einem Standard-PCR-Puffer mit jeweils 0,2 mM der Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, und dTTP), jeweils 0,5 mM der Primer und 0,5 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 ml-Reaktion durchgeführt. Es wurden 30 Amplifikationszyklen mit dem folgenden Wärmeprofil durchgeführt: 95°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 1 min. Der Amplifikation folgte eine 7 min Inkubation bei 72°C, so dass Volllängenprodukte erhalten wurden. [Lambda-32P]-dCTP wurde in einer Menge von 10 mCi pro 100 ml zugefügt, so dass die resultierenden Produkte nachgewiesen und quantifiziert wurden. Die Produkte wurden durch Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidplattengelen getrennt und gezählt. Die Abwesenheit von Signal in einer bestimmten Reaktion diente der Anzeige der effizienten Inaktivierung von DHBV.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die kleineren Amplikons eine steigende Inaktivierung als Funktion der Psoralenkonzentration für alle untersuchten Psoralene aufwiesen. Bei den gleichen Konzentrationen hemmten S-59 und S-70 die PCR der kleineren Amplikons besser als AMT. Für das 1072 Bp-Amplikon wurde eine vollständige Hemmung der PCR bei allen Konzentrationen von S-59 und S-70 beobachtet, wohingegen die Probe ohne Psoralen ein starkes Signal ergab. AMT hemmte die PCR-Amplifikation des 1072 Bp-Amplikons bei Mengen von 70 und 100 mM, aber ein Signal konnte erfasst werden, wenn AMT in einer Endkonzentration von 35 mM verwendet wurde.
  • BEISPIEL 12
  • In Beispiel 10 wurden die Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Inaktivierung von Virus in DMEM/15% FBS getestet. In diesem Beispiel werden die Verbindungen in 100% Plasma und vorwiegend Synthesemedium getestet, so dass gezeigt wird, dass die erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf einen bestimmten Mediumtyp eingeschränkt sind.
  • Für die Proben in Synthesemedium wurden die Standard-Plättchenkonzentrate aus Mensch zentrifugiert, um Plasma zu trennen. 85% des Plasmas wurde dann ausgedrückt und durch ein synthetisches Medium (bezeichnet als "SterilyteTM 3.0") ersetzt, das 20 mM Na-Acetat, 2 mM Glucose, 4 mM KCl, 100 mM NaCl, 10 mM Na3-Citrat, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4 und 2 mM MgCl2 enthielt. H9-Zellen, die mit HIV infiziert waren, wurden entweder zu den 85% SterilyteTM 3.0 Plättchenkonzentraten oder Standardplättchenkonzentraten aus Mensch (2,5 × 107 Zellen je Konzentrat) gegeben, Endkonzentration 5 × 105 Zellen/ml. Die Plättchenkonzentrate wurden in Teflon modifizierten FL20- oder TeflonTM-Minibeuteln (American Fluoroseal Co., Silver Springs, MD) untergebracht, mit einer der in 24 gezeigten Verbindungen bei den gezeigten Konzentrationen behandelt, und dann mit 320–400 nm (20 mW/cm2) für 5 J/cm2 (für Plasmaproben) oder 2 J/cm2 (für 85% SterilyteTM 3.0-Proben) auf einer Vorrichtung ähnlich der Vorrichtung von Beispiel 1 bestrahlt. Die hier verwendete Photoaktivierungsvorrichtung wurde zuvor getestet, und es zeigte sich, dass sie eine vergleichbare Lichtexposition ergab, wie die Vorrichtung von Beispiel 1 (Daten nicht gezeigt). Aliquots für die Messung der restlichen HIV-Infektiosität in den mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelten Proben wurden entnommen und gezüchtet.
  • Für Proben, die in Plasma liefen: H9-Zellen, infiziert mit HIV, wurden zu Standardplättchenkonzentraten aus Mensch (2,5 × 107 Zellen pro Konzentrat) gegeben, Endkonzentration 5 × 105 Zellen/ml. Aliquots von HIV-komtaminiertem Plättchenkonzentrat (5 ml) wurden in Pyrexkammern mit Wassermantel untergebracht. Die Kammern wurden vorher auf der Innenseite mit Silicium beschichtet. Die Plättchenkonzentrate wurden mit einer der Verbindungen behandelt, die in den nachstehenden Tabellen 10 und 11 aufgeführt sind, und zwar in den in der Tabelle aufgeführten Konzentrationen, und dann mit 320 bis 400 nm (20 mW/cm2) für 1 Min auf einer ähnlichen Vorrichtung wie der von Beispiel 1 bestrahlt (Daten nicht gezeigt). Aliquots für die Messung der Rest-HIV-Infektiosität in den mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelten Proben wurden entnommen und gezüchtet. Die Rest-HIV-Infektiosität wurde für die Plasma- und die 85% SterilyteTM-Proben mit einem MT-2-Infektiositäts-Test untersucht (eingehend beschrieben in Beispiel 13 oben und zuvor beschrieben in Hanson, C.V. et al., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990)). Die Ergebnisse sind in 24 gezeigt.
  • Die Ergebnisse unterstützen, dass die Verbindungen effizient HIV in Plasma- und synthetischem Medium inaktivieren. Ein Vergleich der 18 und 19 ergibt, dass die Inaktivierungskurven gleich zu sein scheinen, wobei beide 5 log Inaktivierung bei Konzentrationen von 64 μM Verbindung erzielen. Die Inaktivierung in synthetischem Medium wurde jedoch mit nur 2 J/cm2 Bestrahlung durchgeführt, 3 J/cm2 weniger als zur Erzielung der gleichen Inaktivierung in Plasma notwendig ist. Somit erscheint es aus den Daten, dass synthetisches Medium die erfindungsgemäßen Inaktivierungsverfahren erleichtert.
  • BEISPIEL 13
  • In diesem Beispiel wurde die bakterielle Inaktivierung durch die photoreaktiven nukleinsäurebindenden Verbindungen als Funktion der Fähigkeit der Bakterien zur nachfolgenden Replikation gemessen. Ein gramnegatives Bakterium wurde als Beispiel für die schwieriger zu inaktivierenden Bakterienstämme gewählt.
  • Die Bakterien, ein Pseudomonus-Stamm, wurden mit einer sterilen Impföse in LB überimpft, und über Nacht in einem Schüttler bei 37°C gezüchtet. Auf der Basis der Annäherung, dass eine OD bei 610 nm 5 × 108 koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml entspricht, wurde eine 1:10-Verdünnung der Kultur in einem Spektralphotometer (hergestellt von Shimatsu) gemessen. Die Bakterienkultur wurde in eine Lösung von 15% fötalem Rinderserum in DMEM auf eine endgültige Bakterienkonzentration von etwa 106/ml gegeben. Ein Aliquot (0,8 ml) wurde in ein 1,5 ml Polyethylen-Röhrchen mit Schnappverschluss überführt. Ein Aliquot (0,004–0,040 ml) der in Wasser, Ethanol oder Dimethylsulfoxid hergestellten Ausgangslösung der Testverbindung wurde in das Röhrchen bei 0,80–8, 0 mM überführt. Die Verbindungen wurden bei einer Konzentration von 16 μM untersucht. Die Röhrchen wurden in einer Lichtvorrichtung wie in Beispiel 1 beschrieben untergebracht und mit 1,3 J/cm2, 1,2 J/cm2 und schließlich 2,5 J/cm2 für insgesamt 5 J/cm2 bestrahlt. 150 μl wurden zur Untersuchung nach jeder Pulsperiode entnommen. Es wurden sterile 13 ml-Verdünnungs-Röhrchen vorbereitet; jede Testverbindung benötigte ein Röhrchen mit 0,4 ml LB-Brühe und vier Röhrchen mit 0,5 ml LB-Brühe. Zur Herstellung der Verdünnungen wurde ein 0,050 ml-Aliquot der bestrahlten Lösung von Phage und Testverbindung zum ersten Verdünnungsröhrchen mit 0,5 ml Medium gegeben, dann wurden 0,050 ml dieser Lösung in das zweite Röhrchen mit 0,5 ml Medium gegeben (1:10). Die zweite Lösung wurde dann seriell (1:10) in die restlichen Röhrchen verdünnt. 100 μl der Ausgangsprobe und jede Verdünnung werden gesondert auf LB-Agarplatten ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die koloniebildenden Einheiten wurden dann am darauf folgenden Morgen gezählt, und der Titer des nach der Photobehandlung verbleibenden Phagen wurde auf der Basis der Verdünnungsfaktoren berechnet.
  • Es wurden folgende Kontrollen mitgeführt: "Nur Bakterien", in denen die Bakterien nicht mit der Testverbindung behandelt wurden und nicht bestrahlt wurden (aufgeführt als "Ausgangstiter" in den nachstehenden Tabellen); "Nur UV", wobei die Bakterien in der Abwesenheit von Testverbindung bestrahlt wurden. Dunkelkontrollen wurden hier aus den für Beispiel 12 oben offenbarten Gründen nicht durchgeführt.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt. Der Ausgangstiter der Bakterien betrug 6,5 log. Nach 5 J/cm2 Bestrahlung wurde die log Abtötung für verschiedene Verbindungen folgendermaßen untersucht: 8-MOP – 1,9 log, AMT – 5,2 log, Verbindung 2 – >5,5, Verbindung 6 – >5,5. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Verbindungen effizienter als AMT und 8-MOP bei der Inaktivierung eines gramnegativen Bakteriums sind.
  • BEISPIEL 14
  • Bei den vorstehenden Beispielen erwiesen sich die Psoralene als effizient für die Inaktivierung von Pathogenen wie Bakterien (Pseudomonus), Bakteriophage (R17) und Viren (HIV und DHBV). Man möchte nicht auf ein bestimmtes Verfahren eingeschränkt sein, durch das die Verbindungen Pathogene inaktivieren, jedoch nimmt man an, dass die Inaktivierung auf der lichtinduzierten Bindung der Psoralene an die Nukleinsäure der Pathogene beruht. Wie oben erörtert, ist AMT bekannt für seine Pathogen-Inaktivierungseffizienz und seine begleitenden Mutagenwirkung im Dunkeln bei niedrigen Konzentrationen. Die weniger aktiven Psoralene, wie 8-MOP, die vorher untersucht wurden, zeigen erheblich weniger Mutagenität. Dieses Beispiel etabliert, dass die Photobindung und die Mutagenität kein verknüpftes Phänomen in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind. Die erfindungsgemäßen Psoralene haben eine außergewöhnliche Pathogen-Inaktivierungseffizienz, während sie nur minimale Mutagenität zeigen.
  • In diesem Beispiel werden die Verbindungen auf ihre Dunkel-Mutagenität mit einem Ames-Test untersucht. Die für die Salmonella-Mutagenität verwendeten Verfahren wie eingehend von Maron und Ames beschrieben wurden genau befolgt. Maron, D.M. und B.N. Ames, Mutation Research 113: 173 (1983). Eine kurze Beschreibung für jedes Verfahren ist hier angegeben. Die Testerstämme TA97a, TA98, TA100, TA102, TA1537 und TA1538 wurden von Dr. Ames erhalten. TA97a, TA98, TA1537 und TA1538 sind Rasterverschiebungs-Testerstämme. TA100 und TA102 sind Basensubstitutions-Testerstämme. Bei Erhalt wurde jeder Stamm unter einer Reihe von Bedingungen gezüchtet, so dass die für diese Stämme spezifischen Genotypen bestätigt wurden.
  • Die in dieser Untersuchung verwendeten Standard-Salmonella-Testerstämme benötigen Histidin für das Wachstum, da jeder Testerstamm einen anderen Mutationstyp im Histidin-Operon benötigt. Neben der Histidin-Mutation enthalten diese Testerstämme andere nachstehend beschriebene Mutationen, die ihre Fähigkeit zur Erfassung von Mutagen stark steigern.
  • Histidin-Abhängigkeit: Der Histidin-Bedarf wurde durch Ausstreichen jedes Stammes zuerst auf einer Minimal-Glucoseplatte, die nur mit Biotin angereichert war, und dann auf einer Minimal-Glucose-Platte, die mit Biotin und Histidin angereichert war, untersucht. Alle Stämme entwickelten das Fehlen des Wachstums der Stämme bei Abwesenheit von Histidin.
  • rfa-Mutation: Eine Mutation, die einen partiellen Verlust der Lipopolysaccharid-Schranke verursacht, die die Oberfläche der Bakterien überzieht, wodurch die Permeabilität für große Moleküle gesteigert wird, wurde bestätigt, indem eine ausgestrichene Nähragarplatte, die mit dem Testerstamm bestrichen war, Kristallviolett ausgesetzt wurde. Zuerst wurden 100 μl jeder Kultur zu 2 ml geschmolzenem Minimal-Topagar gegeben und auf eine Nähragarplatte gegossen. Dann wurde eine sterile, mit Kristallviolett gesättigte Filterpapierscheibe in der Mitte jeder Platte untergebracht. Nach 16 Std. Inkubation bei 37°C wurden die Platten bewertet und eine klare Zone ohne Bakterienwachstum wurde um die Scheibe gefunden, welche die rfa-Mutation anzeigte.
  • uvrB-Mutation: Drei Stämme, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, enthalten ein defektes UV-Reparatursystem (TA97a, TA98, TA100, TA1537 und TA1538). Auf dieses Merkmal wurde untersucht, indem die Stämme auf einer Nähragarplatte ausgestrichen wurden, die Hälfte der Platte bedeckt wurde, und die exponierten Seiten der Platte mit keimtötenden Lampen bestrahlt wurden. Nach der Inkubation wurde Wachstum nur auf der Seite der Platte beobachtet, die vor UV-Bestrahlung geschützt war.
  • R-Faktor: Die Testerstämme (TA97a, TA98, TA100 und TA102) enthalten das pKM101-Plasmid, das ihre Empfindlichkeit gegenüber Mutagenen erhöht. Das Plasmid verleiht den Bakterien auch eine Ampicillin-Resistenz. Dies wurde durch Anzucht der Stämme in Anwesenheit von Ampicillin bestätigt.
  • pAQ1: Der Stamm TA102 enthält auch das pAQ1-Plasmid, das seine Empfindlichkeit gegenüber Mutagenen weiter steigert. Dieses Plasmid codiert auch eine Tetracyclin-Resistenz. Zur Untersuchung auf die Anwesenheit dieses Plasmids wurde TA102 auf einer Minimal-Glucoseplatte ausgestrichen, die Histidin, Biotin und Tetracyclin enthielt. Die Platte wurde 16 Std. bei 37°C inkubiert. Der Stamm zeigte normales Wachstum, was die Anwesenheit des pAQ1-Plasmids anzeigte.
  • Die gleichen Kulturen, die für die Genotyp-Untersuchung verwendet wurden, wurden wiederum gezüchtet, und Aliquots wurden unter kontrollierten Bedingungen eingefroren. Die Kulturen wurden wieder auf den Genotyp untersucht, so dass die Genauigkeit des Genotyps bei der Handhabung der Herstellung der eingefrorenen Dauerproben bestätigt wurde.
  • Die ersten mit den Stämmen erfolgten Tests bestimmten den Bereich der spontanen Reversion für jeden der Stämme. Bei jedem Mutagenitäts-Experiment wurde die spontane Reversion der Testerstämme zur Histidin-Unabhängigkeit gemessen und ausgedrückt als die Anzahl der spontanen Revertanten pro Platte. Dies diente als Hintergrundkontrolle. Eine positive Mutagenesekontrolle wurde für jeden Testerstamm aufgenommen, indem ein diagnostisches Mutagen verwendet wurde, das sich für diesen Stamm eignete (2-Aminofluoren bei 5 mg/Platte für TA98 und Natriumazid bei 1,5 mg/Platte für TA100).
  • Für sämtliche Experimente wurde das Vorinkubationsverfahren verwendet. In diesem Verfahren wurde ein Gefäß jedes Testerstamms aufgetaut und 20 μl dieser Kultur wurden zu 6 ml Oxoid-Nährbrühe Nr.2 gegeben. Diese Lösung wurde 10 Std. bei 37°C geschüttelt. Bei dem Vorinkubationsverfahren wurden 0,1 ml dieser Übernachtkultur zu jeder der erforderlichen Anzahl von sterilen Teströhrchen gegeben. Zur Hälfte der Röhrchen wurden 0,5 ml einer 10% S-9- Lösung mit Aroclor 1254 induziertem Rattenleberextrakt (Molecular Toxicology Inc. Annapolis, MD) und MgCl2, KCl, Glucose-6-Phosphat, NADP und Natriumphosphatpuffer (Sigma, St. Louis, Missouri) gegeben. Bei der anderen Hälfte der Röhrchen wurden 0,5 ml 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4 anstelle des S-9-Gemischs verwendet (die -S9-Proben). Schließlich wurden 0,1 ml Testlösung mit 0, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100, 250 oder 500 μg Testverbindung hinzugefügt. Das 0,7 ml-Gemisch wurde im Vortexer aufgewirbelt und dann unter Schütteln für 20 min bei 37°C vorinkubiert. Nach dem Schütteln wurden 2 ml geschmolzener Topagar, angereichert mit Histidin und Biotin, zu dem 0,7 ml-Gemisch gegeben und sofort auf eine Minimal-Glucose-Agarplatte gegossen (Volumen des Basisagars war 20 ml). Der Topagar konnte 30 min fest werden, und dann wurden die Platten umgedreht und für 44 Std. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Anzahl der revertierten Kolonien auf jeder Platte gezählt. Die Ergebnisse erscheinen in den Tabellen 12(A)–18(B) unten. ("n" steht für die Anzahl der Replikate, die für jeden Datenpunkt durchgeführt wurden.)
  • TABELLE 12(A)
    Figure 00970001
  • (Fortsetzung)
    Figure 00980001
  • TABELLE 12(B)
    Figure 00980002
  • (Fortsetzung)
    Figure 00990001
  • TABELLE 13(A)
    Figure 01000001
  • TABELLE 13(B)
    Figure 01000002
  • (Fortsetzung)
    Figure 01010001
  • TABELLE 14
    Figure 01010002
  • TABELLE 15(A)
    Figure 01020001
  • TABELLE 15(B)
    Figure 01020002
  • (Fortsetzung)
    Figure 01030001
  • TABELLE 16
    Figure 01030002
  • TABELLE 17
    Figure 01030003
  • (Fortsetzung)
    Figure 01040001
  • TABELLE 18(A)
    Figure 01040002
  • TABELLE 18(B)
    Figure 01050001
  • TABELLE 19(A)
    Figure 01050002
  • (Fortsetzung)
    Figure 01060001
  • TABELLE 19(B)
    Figure 01060002
  • Maron und Ames (1983) beschreiben die widersprüchlichen Ansichten in Bezug auf die statistische Behand lung von Daten, die aus dem Test hergeleitet wurden. Daher nimmt dieses Beispiel das einfache Modell der Mutagenität an, das durch eine zweifache oder größere Zunahme der Anzahl der Revertanten über dem Hintergrund gekennzeichnet ist (fett gedruckt in den Tabellen), sowie die dosisabhängige Mutagenreaktion auf Medikament.
  • In Bezug auf 8-MOP war die einzige erfasste Mutagenreaktion ein schwaches Basensubstitutions-Mutagen in TA102 bei 500 μg/Platte (Tabelle 13(B)).
  • Im scharfen Gegensatz dazu zeigte AMT (Tabelle 12(A) und 12(B)) eine Rasterverschiebungs-Mutagenität zwischen 5 und 10 μg/Platte in TA97a und TA98 bei 5 μg/Platte in TA1537 und bei 1 μg/Platte in TA1538. AMT zeigte keine signifikanten Basensubstitutionsmutationen.
  • Bei Verbindung 1 war die einzige Mutagenreaktion ein schwaches Rasterverschiebungsmutagen in TA1538 bei 5 μg/Platte in der Anwesenheit von S9. Die Verbindung 1 zeigte auch eine Mutation im TA100-Stamm, aber nur in der Abwesenheit von S9. Verbindung 2 zeigte auch eine schwache Rasterverschiebungsmutagenität in der Anwesenheit von S9 in TA98 und TA1537. Die Verbindungen 3 und 4 zeigten keine Mutagenität. Verbindung 6 hatte keine Basensubstitutionsmutagenität, zeigte aber eine Rasterverschiebungsreaktion in TA98 in der Anwesenheit von S9 bei Konzentrationen von 250 μg/Platte und darüber. Sie zeigte auch eine Reaktion bei 50 μg/Platte in TA1537 in der Anwesenheit von S9. Verbindung 18 zeigte nur eine schwache Reaktion bei hohen Konzentrationen in der Anwesenheit von S9 in den Stämmen TA90 und TA1537. Die Reaktion war höher bei der Abwesenheit von S9, aber immer noch signifikant unter derjenigen von AMT, das Mutagenität bei viel niedrigeren Konzentrationen zeigte (5 μg/Platte).
  • Aus diesen Daten geht hervor, dass die Verbindungen weniger mutagen sind als AMT, wie es durch den Ames-Test bestimmt wurde. Gleichzeitig zeigen diese Verbindungen eine viel höhere Inaktivierungseffizienz als 8-MOP, wie es in den Beispielen 12 und 16 gezeigt wurde. Diese beiden Faktoren unterstützen, dass die Verbindungen die besten Merkmale von AMT und 8-MOP vereinen, nämlich hohe Inaktivierungseffizienz und niedrige Mutagenität.
  • BEISPIEL 15
  • In Beispiel 12 zeigten die Verbindungen die Fähigkeit zur Inaktivierung von Pathogenen in synthetischem Medium. Dieses Beispiel beschreibt die Verfahren, durch die synthetische Medien und Verbindungen eingebracht werden können und zur Inaktivierung von Pathogenen in Blut verwendet werden können. 25A zeigt schematisch den Standard-Blutprodukttrennungsansatz, der derzeit in Blutbanken verwendet wird. Drei Beutel sind durch flexible Röhren integriert, so dass ein Blutübertragungs-Set (200) erzeugt wird (beispielsweise kommerziell erhältlich von Baxter, Deerfield, Ill.). Nach der Entnahme von Blut in den ersten Beutel (201), wird das gesamte Set durch Zentrifugation verarbeitet (beispielsweise mit einer SorvallTM Schwingbecher-Zentrifuge, Dupont), was zu verpackten roten Blutkörperchen und plättchenreichem Plasma in dem ersten Beutel (201) führt. Das Plasma wird aus dem ersten Beutel (201) (beispielsweise mit einer FenwallTM-Vorrichtung zum Ausdrücken von Plasma) durch die Rohrleitung und in den zweiten Beutel (202) ausgedrückt. Der erste Beutel (201) wird dann abgenommen und das Zweibeutel-Set wird zentrifugiert, so dass das Plättchenkonzentrat und plättchenarmes Plasma erhalten wird; Letzteres wird aus dem zweiten Beutel (202) in den dritten Beutel (203) ausgedrückt.
  • 25B zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Ausführungsform, durch die synthetisches Medium und Photoaktivierungsverbindung in das Plättchenkonzentrat wie in 25A eingebracht werden. Ein Zweibeutel-Set (300) ist steril an den Plättchenkonzentratbeutel (202) (angezeigt als "P.C.") angedockt. Das sterile Andocken ist im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise das US-Patent 4,412,835 von D.W.C. Spencer. Siehe ebenfalls die US-Patente 4,157,723 und 4,265,280. Sterile Andock-Vorrichtungen sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Terumo, Japan).
  • Einer der Beutel (301) des Zweibeutel-Sets (300) enthält eine synthetische Medienformulierung (angezeigt als "STERILYTE"). Im zweiten Schritt, der in 25B gezeigt ist, wird das Plättchenkonzentrat mit dem synthetischen Medium gemischt durch Übertragen des Plättchenkonzentrates in den Beutel mit dem synthetischen Medium (301), indem das Plättchenkonzentrat aus dem ersten Blutbeutel über ein steriles Verbindungsmittel in den zweiten Blutbeutel ausgedrückt wird. Die Photoaktivierungsverbindung kann in dem Beutel vorliegen, der das synthetische Medium (301) enthält, das zum Zeitpunkt der Herstellung dazugegeben wird. Alternativ kann die Verbindung mit dem Blut zum Zeitpunkt des Auffangens gemischt werden, wenn die Verbindung zum Herstellungs-Zeitpunkt in den Blutsammelbeutel gegeben wird (25A, 201). Die Verbindung kann entweder in trockener Form oder in einer Lösung vorliegen, die mit der Bluterhaltung kompatibel ist.
  • 25C zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Dekontaminationsansatzes, der speziell bei einem Plättchenkonzentrat angewendet wird, das mit dem synthetischen Medium verdünnt wird, wie in 25B. Bei dieser Ausführungsform wurden die Plättchen in einen Beutel (301) für synthetisches Medium überführt. Die Photoaktivierungsverbindung wurde entweder bereits in den Blutsammelbeutel (201) eingeführt oder ist in dem Beutel (301) für synthetisches Medium zugegen. Entweder werden die Plättchen dann in den Beutel mit dem synthetischen Medium über ein steriles Verbindungsmittel (wie gezeigt) ausgedrückt, oder das synthetische Medium wird in den Plättchenbeutel ausgedrückt. Der Beutel, der das Gemisch aus Plättchenkonzentrat und synthetischem Medium (301) enthält, das UV-Licht-Transmissionseigenschaften und andere Eigenschaften aufweist, die sich erfindungsgemäß eignen, wird dann in einer Vorrichtung (wie in Beispiel 1 oben beschrieben) untergebracht und bestrahlt.
  • Nach der Photobehandlung werden die dekontaminierten Plättchen aus dem Beutel mit synthetischem Medium (301) in den Aufbewahrungsbeutel (302) des Zweibeutel-Sets (300) überführt. Der Aufbewahrungsbeutel kann ein kommerziell erhältlicher Aufbewahrungsbeutel (beispielsweise der CLX-Beutel von Cutter) sein.
  • 25D zeigt schematisch eine Ausführungsform des Dekontaminationsansatzes der vorliegenden Erfindung, welche eine Fangvorrichtung aufweist, mit der die Photoinaktivierungs-Verbindung von dem behandelten Material nach der Photobehandlung entfernt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere adsorbierende Materialien, die in einer Fangvorrichtung zum Entfernen der Photoinaktivierungs-Verbindungen verwendet werden können, von denen Folgendes eine nichtausschließliche Liste ist: Amberlite XAD-4 (erhältlich von Rohm und Haas Ltd., Croydon, Surrey, UK) ("Resin hemoperfusion for Acute Drug Intoxication", Arch Intern Med 136: 263 (1976)); Amberlite XAD-7 ("Albumin-Coated Amberlite XAD-7 Resin for Hemoperfusion in Acute Liver Failure, "Artificial Organs, 3: 20 (1979); Amberlite 200, Amberlite DP-1 Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-16; Aktivkohlen, ("Charcoal haemoperfusion in Drug Intoxication," British J. Hospital Med. 49:493 (1993); Silica ("In vitro Studies of the Efficacy of Reversed Phase Silica Gel as a Sorbent for Hemo- and Plasmaperfusion," Clinical Toxicology 30:69 (1992)). Bei einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein absorbierendes Material, das zur Entfernung von Verbindungen zusammen mit einer Filtervorrichtung arbeitet.
  • BEISPIEL 16
  • Dieses Beispiel beinhaltet eine Bestimmung des Einflusses der erfindungsgemäßen Verfahren auf die Plättchenfunktion. Vier Indikatoren der Plättchenlebensfähigkeit und -funktion wurden eingesetzt: 1) GMP-140-Expression; 2) Erhaltung des pH-Wertes; 3) Plättchenaggregation, und 4) Plättchenzahl.
  • Zur Messung der Auswirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren der Dekontamination auf die Plättchenfunktion mit diesen vier Indikatoren wurden vier Proben für jede untersuchte Verbindung hergestellt, zwei Kontrollproben und zwei mit der Verbindung. Drei Einheiten von Human-Plättchen wurden aus dem Sacramento Blood Center, Sacramento, CA erhalten. Diese wurden jeweils unter sterilen Bedingungen in 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, dann wurden Aliquots jeder Einheit in einen zweiten Satz von sterilen 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Zu jedem Zentrifugenröhrchen, das Plättchenkonzentrat (PC) enthielt, wurde ein Aliquot des Verbindungs-Ausgangsmaterials zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 100 μM Verbindung erhalten wurde. Die Verbindungen, die in diesem Experiment untersucht wurden, waren Verbindung 2 (36 μl 10 mM Ausgangsmaterial, zugefügt zu 4 ml PC), Verbin dung 6 (173,5 μl 9,8 mM Ausgangsmaterial, zugefügt zu 16,8 ml PC), Verbindung 17 (2,0 ml 1 mM Ausgangsmaterial, zugefügt zu 18 ml PC) und Verbindung 18 (0,842 ml 2,0 mM Ausgangsmaterial zu 16 ml PC). Diese Proben wurden vorsichtig zum Mischen auf- und abpipettiert. Dann wurden Aliquots (entweder 3 ml oder 8 ml) jeder Probe in zwei sterile TeflonTM Medi-BagsTM (American Fluoroseal Co., Silver Springs, MD) (derzeit Eigentum von The West Company, Lionville, PA) überführt. Die Proben wurden in einem von zwei verschieden großen Beuteln behandelt, die entweder 3 ml oder 8 ml Fassungsvermögen aufwiesen. Die Beutel haben beide etwa die gleichen Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen, und vorherige Experimente haben gezeigt, dass die beiden Beutel etwa äquivalente Eigenschaften während der Bestrahlung der Proben aufweisen (Daten nicht gezeigt). Für jede untersuchte Verbindung wurden zwei Kontrollproben ohne Verbindung hergestellt, indem Aliquots des Plättchenkonzentrats wieder (17 ml bei der Verwendung eines 8 ml-Beutels, 4 ml bei der Verwendung eines 3 ml-Beutels) aus dem gleichen des ersten Sets der 50 ml-Zentrifugenröhrchen entnommen wurden, aus dem die Verbindungs-Probe entnommen wurde, und in Medibags wie zuvor aufgeteilt wurden. Ein Beutel jedes Paars Medibags mit einer Verbindung und ein Beutel jedes Paars Kontroll-Medibags wurde für 5 Joule/cm2 in der in Beispiel 1 oben beschriebenen Vorrichtung bestrahlt. Dann wurden sämtliche Experiment- und Kontroll-Medibags in einem Plättchen-Schüttler zur Aufbewahrung für 5 Tage untergebracht. Die gleichen Experimente wurden mehrmals wiederholt, so dass statistisch relevantere Daten erhalten wurden, wie dargestellt durch "n", der Anzahl der aufgeführten Datenpunkte, in den nachstehend erörterten Schaubildern der 26–29. In den 26–29 veranschaulicht auch "C1" eine unbehandelte Kontrolle an Tag 1, "D5" veranschaulicht eine unbehandelte Kontrolle nach 5 Tagen Aufbewahrung, "uv" veranschaulicht eine Probe, die nur mit UV-Licht behandelt wurde, und "PCD" veranschaulicht die Testprobe, die mit Ultraviolettlicht und einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelt wurde.
  • Zur Gewinnung der Daten für die Kontrollproben an Tag 1 wurden etwa 3 ml aus dem verbleibenden Volumen von jeder der 3 Einheiten entnommen und in zwei 1,5 ml-Röhrchen aufgeteilt. Diese Proben wurden wie nachstehend beschrieben auf den pH-Wert untersucht. Die Plättchenzahl wurde ebenfalls bestimmt, wie nachstehend beschrieben, und zwar in einer 1:3-Verdünnung. Das Rest-Plättchenkonzentrat aus jeder Einheit wurde für 10 min bei 3800 U/min (3000 g) in einer Sorval RC3B (DuPont Company, Wilmington, Delaware) zentrifugiert, so dass die Blutplättchen pelletiert wurden. Das Plasma wurde dann in 2 sterile 50 ml-Röhrchen dekantiert (eines für Tag 1, und das andere wurde bei 4°C für Tag 5 aufbewahrt) zur Verwendung im Aggregationstest.
  • 1) GMP-140-Expression
  • Wenn Plättchen aktiviert werden, wird ein alpha-Granula-Membranglycoprotein, das als p-Selectin (GMP140) bezeichnet wird, auf der Plättchenoberfläche exponiert. Weniger als (5%) der frischen normalen unstimulierten Plättchen exprimieren nachweisbare GMP140-Spiegel gemäß Durchflusscytometrie. Siehe im Allgemeinen M.J. Metzelaar, Studies on the Expression of Activation-Markers on Human Platelets (Doktorarbeit 1991).
  • Zur Messung von GMP140 wird ein kleines Aliquot von plättchenreichem Plasma in HEPES-Puffer untergebracht, der einen GMP140-bindenden Antikörper oder Isotyp-Kontroll-Maus-IgG enthält. CD62 ist ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper, der an GMP140 (erhältlich von Sanbio, Uden, Niederlande, Caltag Labs, So. San Francisco, CA, und Becton Dickinson, Mountain View, CA) bindet. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde Ziege-F(ab')2-Anti-Maus-IgG, konjugiert an FITC (Caltag Laboratories, So. San Francisco, CA) in das Röhrchen in Sättigungsmengen zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Schließlich wurden die Zellen in 1% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt und auf einem FACSCANTM (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. Die positive Kontrolle erfolgt durch Zugabe von Phorbolmyristatacetat (PMA) zu dem Testsytem in einer Endkonzentration von 2 × 10–7 M.
  • In diesem Beispiel wurde CD62 zur Messung der Auswirkung, sofern vorhanden, der Bestrahlung in der Anwesenheit von mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Plättchenaktivierung verwendet. Der Antikörper wurde mit HEPES-Puffer (10 μl Antikörper [0,1 mg/ml]; 2,49 ml Puffer) gemischt und in 50 μl-Aliquots bei –40°C vor dem Gebrauch aufbewahrt. Eine positive Kontrolle bestand aus: 10 μl CD62, 8 μl PMA und 2,482 ml Hepes-Puffer. Eine 5-fach konzentrierte Maus-IgG1-Kontrolle (0,05 mg/ml) (Becton Dickinson, Mountain View, CA Nr.9040) wurde ebenfalls eingesetzt. Der Antikörper wurde im HEPES-Puffer (20 μl Antikörper: 2,48 ml Puffer) verdünnt und bei –40°C aufbewahrt. Phorbolmyristatacetat (PMA) (Sigma, St. Louis, MO) wurde bei –40°C aufbewahrt. Am Gebrauchszeitpunkt wurde dies in DMSO gelöst (die Arbeitskonzentration betrug 10 μg/ml).
  • 1% Paraformaldehyd (PFA) (Sigma, St. Louis, MO) wurde hergestellt durch Zugabe von 10 g Paraformaldehyd zu 1 l PBS. Dies wurde auf 70°C erhitzt, woraufhin 3 M NaOH tropfenweise zugegeben wurde, bis die Lösung klar wurde. Die Lösung wurde gekühlt, und der pH-Wert wurde mit 1 N HCl auf 7,4 eingestellt. Dies wurde filtriert und aufbewahrt.
  • Die Verarbeitung jeder Probe Plättchenkonzentrat beinhaltete die Zugabe von 5 μl Plättchenkonzentrat, 1:3, in Hepes-Puffer verdünnt, in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, das den Antikörper CD62 und geeignete Reagentien enthielt, und das sehr vorsichtige Aufwirbeln mit dem Vortex-Gerät. Die Proben wurden dann für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Das Ziege-Anti-Maus-IgG-FITC (1:10 in HEPES-Puffer verdünnt) wurde in jedes Röhrchen zugegeben (5 μl), und die Lösung wurde mit dem Vortex-Gerät vorsichtig aufgewirbelt. Die Proben wurden für weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 ml 1% PFA in PBS in jedes Röhrchen gegeben und vorsichtig gemischt. Die Plättchen wurden im FACSCANTM analysiert. Die Ergebnisse sind in den 26C, 27C, 28C und 29C gezeigt. (26 entspricht Verbindung 2, 27 entspricht Verbindung 6, 28 entspricht Verbindung 17 und 29 entspricht Verbindung 18). Drei der vier untersuchten Verbindungen, d.h. 2, 6 und 17 zeigten eindeutig wenig oder keinen Unterschied zwischen der unbehandelten Kontrolle an Tag 5 (D5) und der Probe, die mit Licht und der Psoralen-Verbindung behandelt wurde (PCD). Nur Verbindung 18 zeigte einen bemerkenswerten Anstieg über die Kontrolle. Aber der Wert lag noch gut unter dem positiven Kontrollwert.
  • 2) Erhaltung des pH-Wertes
  • Änderungen des pH-Wertes der Plättchen im Konzentrat können ihre morphologischen Eigenschaften und ihr Überleben nach der Transfusion verändern. Moroff, G. et al., "Factors Influencing Changes in pH during Storage of Platelet Concentrates at 20–24°C" Vox Sang 42:33 (1982). Der pH-Wert-Bereich, bei dem die Plättchen normal funktionieren, reicht von etwa 6,0–6,5 zu 7,6. Stack, G. und E.L. Snyder, "Storage of Platelet Concen trate", Blood Separation and Platelet Fractionation 99, S. 107 (1991). Zur Messung des pH-Wertes der Proben wurde ein CIBA-CORNING 238 pH-Wert/Blutgas-Analysator verwendet (CIBA-Corning, Norwood, MA). Eine kleine Menge Plättchenkonzentrat aus jeder Probe wurde in den pH-Wert/Blutgasanalysator eingebracht.
  • Die Messungen des pH-Wertes wurden am Zeitpunkt Null und nach 5 Tagen Aufbewahrung für alle Proben bestimmt. Die 26D, 27D, 28D und 29D sind Säulendiagramme, die die pH-Wert-Ergebnisse für eine Dunkelkontrolle, eine Lichtkontrolle und ein Experimentallicht plus Verbindung zeigen. Diese Diagramme zeigen, dass der pH-Wert der Plättchenkonzentratproben nach der Bestrahlung in der Anwesenheit von einer der Verbindungen über einem pH-Wert von 6,5 bleibt. Somit verbleiben die Plättchen bei einem pH-Wert, der für die aufbewahrten Plättchen nach der Photoinaktivierungsbehandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen annehmbar ist.
  • 3) Aggregation
  • Die Plättchenaggregation wird gemessen durch die Änderung der optischen Transmission, die eine Plättchenprobe beim Stimulieren der Aggregation aufweist. Die Plättchenaggregation wurde gemessen mit einem vollblut-Aggregometer (Chrono-Log Corp., Havertown, PA, Modell 560VS). Die Anzahl der Plättchen in jeder Probe wurde so gesteuert, dass sie für jede Messung konstant war. Ein Modell F800 Sysmex-Zellzähler (Top Medical Electronics, Kobe, Japan) wurde zum Messen der Plättchenzahl in den Plättchenproben verwendet, und autologes Plasma wurde zum Einstellen der Plättchenzahlen auf 300000/ml Plättchenkonzentrat verwendet.
  • Für das Verfahren wurden sämtliche Proben in einem verschlossenen Plastikröhrchen für 30 min bei 37°C zur Aktivierung inkubiert. Das Aggregometer wurde auf 37°C erwärmt. Der optische Kanal wurde zur Plättchenaggregationsmessung verwendet. Die Magnetgeschwindigkeit des Aggregometers wurde auf 600/min eingestellt. Das verbleibende Plättchenkonzentrat aus den erhaltenen Einheiten, das nicht als Probe zur Behandlung entnommen wurde, wurde bei hoher Geschwindigkeit (14000 g) mit einer Mikrozentrifuge für 5 min zentrifugiert, so dass Behälter mit plättchenarmem Plasma erhalten wurden, das für die experimentellen Proben autolog war.
  • Zu Beginn wurden 0,45 ml autologes plättchenarmes Plasma zusammen mit 0,5 ml Salzlösung in eine Glasküvette gegeben und in dem PPP-Kanal untergebracht. Dann wurden 0,45 ml des Proben-Plättchenkonzentrates und 0,50 ml Salzlösung zu einer Glasküvette (die einen kleinen Magneten enthielt) in den Probenkanal gegeben. Nach einer Minute wurden ADP und Kollagen-Reagentien (10 μl) jeweils in die Probenküvette gegeben. Die ADP-Endkonzentration war 10 μM und die Kollagenendkonzentration war 5 μg/ml. Die Plättchenaggregation wurde für etwa 8 bis 10 min aufgezeichnet oder bis die höchste Ablesung erreicht wurde.
  • Die Ergebnisse erscheinen in den 26B, 27B, 28B und 29B. Die 100% Aggregations-Gerade ist dasjenige Niveau, bei dem das Aufzeichnungsgerät auf null eingestellt wurde. Die 0% Aggregations-Gerade befindet sich dort, wo die Plättchen übertragen wurden, bevor ADP und Kollagen zugegeben wurden. Der Aggregationswert für die Probe wird bestimmt durch Verwendung des Höchst-Aggregationswertes als Prozentsatz des Gesamtbereichs. Drei der vier untersuchten Verbindungen zeigten sehr wenig oder keinen Unterschied der Aggregationsmengen zwischen den Proben, die mit der Verbindung behandelt wurden, und den unbehandelten Proben, die 5 Tage aufbewahrt wurden. Verbindung 2 zeigte eine geringe Reduktion der Aggregation von etwa 8% von der Kontrolle an Tag 1. Die Aggregation für die Probe, die mit Verbindung und UV behandelt wurde, war genauso wie bei der Nur-UV-Probe. Dies ist ein zwingender Beweis, dass die untersuchten Dekontaminations-Verbindungen keine signifikante Auswirkung auf die Plättchenaggregation haben, wenn sie in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden.
  • 4) Zählung
  • Zum Messen der Plättchenzahl in den Plättchenproben wurde ein Sysmex-Zellzähler verwendet. Die Proben wurden 1:3 in Blutbank-Salzlösung verdünnt.
  • Die Ergebnisse der Plättchenzahlmessungen erscheinen in den 26A, 27A, 28A und 29A. Für jede der Verbindungen zeigen die Proben wenig oder keinen Abfall der Plättchenzahl zwischen der Kontrolle an Tag 5 und der behandelten Probe an Tag 5. Interessanterweise weisen die Proben, die mit den Verbindungen 6, 17 und 18 behandelt wurden alle eine höhere Plättchenzahl auf als Proben, die mit Licht allein behandelt wurden. Proben, die mit Verbindung 6 behandelt wurden, hatten beispielsweise Zählungen, die der Kontrolle an Tag 5 entsprechen, aber Proben, die nur mit Ultraviolettlicht behandelt wurden, zeigten eine etwa 33%ige Reduktion der Plättchenzahl. Somit ist nicht nur die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kompatibel mit der Erhaltung der Plättchenzahl, sondern scheint tatsächlich den Abfall der Zählung zu verhindern, der durch Einwirkung von Ultraviolettlicht verursacht wird.
  • BEISPIEL 17
  • Eine bevorzugte Verbindung zur Dekontamination von Blut, das anschließend in vivo verwendet wird, sollte für den Empfänger der Bluts nicht mutagen sein. Im ersten Teil dieses Experimentes wurden einige Verbindungen untersucht, um ihr Genotoxizitätsausmaß im Vergleich mit Aminomethyltrimethylpsoralen zu bestimmen. Im zweiten Teil wurde die In-vivo-Clastogenität einiger erfindungsgemäßer Verbindungen gemessen, indem Maus-Retikulozyten auf Mikronukleus-Bildung untersucht wurden.
  • 1) Genotoxizität
  • Säugetier-Zellkulturen sind wertvolle Werkzeuge zur Bestimmung des clastogenen Potenzials von Chemikalien. In derartigen Untersuchungen werden die Zellen Chemikalien mit und/oder ohne Ratten-S9-Stoffwechselaktivierungssystem (S-9) ausgesetzt, und später auf Zellüberleben (für einen Genotoxizitäts-Sceen) oder auf Änderungen der Chromosomen-Struktur (für einen Chromosomenaberrations-Assay) untersucht.
  • Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO; ATCC CCL 61 CHO-K1, die Prolin benötigen) wurden für die In-vitro-Genotoxizitäts- und Chromosomenaberrationstests verwendet. CHO-Zellen werden ausgiebig für Cytogenie-Untersuchung verwendet, weil sie eine relativ niedrige Chromosomenzahl (2n = 20) und eine rasche Vermehrungsrate (–12 bis 14 Std., je nach den Kulturbedingungen) aufweisen. Die Zellen wurden in einer Atmosphäre von 5% CO2 bei etwa 37°C in McCoys 5a-Medium mit 15% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung gezüchtet, so dass ein exponentielles Wachstum aufrechterhalten wurde. Dieses Medium wurde auch bei der Einwirkung der Testverbindung auf die Zellen verwendet, wenn kein S-9 verwendet wurde. Die Zellkulturen wurden erhalten und die Zelleinwirkungen erfolgten in T-75- oder T-25-Kolben.
  • Die Probenverbindungen wurden jeweils in 7 Verdünnungen untersucht. 1, 3, 10, 33, 100, 333 und 1000 μg/ml. Die Verbindung wurde in komplettes McCoys 5a- Medium gegeben. Nach Zugeben der Verbindung wurden die Zellen im Dunkeln bei etwa 37°C für etwa 3 Std. gezüchtet. Das Medium, das die Testverbindung enthielt, wurde dann abgesaugt, die Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei etwa 37°C gewaschen und frisches komplettes McCoys 5a-Medium wurde zugefügt. Die positive Kontrolle war Methylmethansulfonat. Die Lösungsmittel-Kontrolle war Dimethylsulfoxid (DMSO), verdünnt in Kuturmedium. Für Assays, die eine Stoffwechselaktivierung (siehe unten) verwenden, wurde das Aktivierungsgemisch ebenfalls in die Lösungsmittel-Kontrolle gegeben. Die Kulturen wurden dann für eine weitere Zeit von etwa 12 Std. vor der Ernte inkubiert. Colchicin (Endkonzentration, 0,4 μg/ml) wurde etwa 2,5 Std. vor der Ernte zugegeben.
  • Nach etwa 2,5 Std. mit Colchicin wurden die Zellen geerntet. Die Zellen wurden von der Oberfläche der Kolben mit einem Zellschaber entfernt. Die resultierende Zellsuspension wurde zentrifugiert, der Überstand abgesaugt, und 4 ml einer hypotonischen Lösung von 0,075 M KCl zu den Zellen für 15 min bei etwa 37°C gegeben. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, der Überstand abgesaugt, und die Zellen in einem Fixierer aus Methanol:Essigsäure (3:1) suspendiert. Nach dreimaligem Wechsel des Fixierers wurden luftgetrocktete Objektträger mit Zellen aus allen Kolben hergestellt. Die Zelldichte und die Metaphasenqualität des Anfangs-Objektträgers aus jedem Kolben wurde mit einem Phasenkontrast-Mikroskop überwacht; mindestens zwei Objektträger geeigneter Zelldichte wurden aus jedem Kolben hergestellt. Die Objektträger wurden in 3% Giemsa für 20 min gefärbt, in entionisiertem Wasser gespült und durch Xylol geleitet. Die Deckgläschen wurden mit Permount befestigt. Die Objektträger wurden dann unter sucht, um zu bestimmen, welche Konzentration jeder Testverbindung eine toxische Dosis darstellte.
  • Eine Analyse der Ergebnisse zeigte, dass AMT bei 30 μg/ml genotoxisch war. Die Verbindungen 2 und 6 waren dagegen nur bei 100 μg/ml genotoxisch, mehr als das Dreifache der toxischen Dosis von AMT.
  • Eine Psoralen-Verbindung mit einer Struktur, die sich von den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen unterscheidet, d.h. 8-Aminomethyl-4,4',5'-trimethylpsoralen, wurde ebenfalls in diesem Experiment untersucht, und sie erwies sich bei 10 μg/ml als toxisch. Die 8-substituierte Aminomethyl-Verbindung und ähnliche Strukturen sind zwar für die erfindungsgemäßen Verfahren nicht geeignet, jedoch können sie sich für alternative Zwecke eignen. Angesichts der Fähigkeit der Verbindungen zur Verhinderung der Nukleinsäure-Replikation in Kombination mit ihrer extremen Toxizität können die Verbindungen beispielsweise zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch unkotrolliertes Zellwachstum gekennzeichnet sind, wie Krebs.
  • 2) Mikronukleus-Assayprotokoll
  • Salzlösungen wurden hergestellt für die Verbindungen 2, 6, 17 und 18 bei verschiedenen Konzentrationen. Männlichen Balb/c-Mäusen wurden dann 0,1 ml einer Verbindungs-Lösung über die Schwanzvene injiziert. Mindestens 3 Mäuse wurden je Dosismenge beimpft. Nur Salzlösung wurde als negative Kontrolle verwendet. Für eine positive Kontrolle wurde Cyclophosphamid (cycloPP) bei einer Dosis von 30 mg/kg verabreicht. In der Experimentalgruppe wurden die Injektionen einmal täglich für 4 Tage wiederholt. In der positiven Kontrollgruppe wurde die Probe nur einmal an Tag 3 verabreicht. An Tag 5 wurden mehrere μl Blut aus jedem Individuum entnommen und auf einem Glas-Objektträger verteilt. Die Zellen wurden in absolutem Methanol fixiert und in einem Objektträgerständer aufbewahrt.
  • Zur Analyse wurden die Zellen mit Acridin-Orange gefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht, durch Zählen: (i) der Anzahl Retikulozyten pro 5000 Erythrozyten; und (ii) der Anzahl der Retikulozyten mit Mikronukleus pro 1000 Retikulozyten. Die Retikulozyten wurden durch ihre rote Fluoreszenz aufgrund der Anwesenheit von RNA unterschieden. Die Mikronuklei wurden durch ihre grüne Fluoreszenz aufgrund der Anwesenheit von DNA unterschieden. Der Prozentsatz an Retikulozyten (%PCE) wurde dann berechnet. Eine Abnahme der Frequenz der Erythrozyten, dargestellt durch einen Anstieg des Prozentsatzes von Retikulozyten, ist ein Anzeichen für Knochenmarkstoxizität. Der Prozentsatz von Retikulozyten mit Mikronuklei (%PCE mit MN) wurde ebenfalls berechnet. Ein Anstieg der %PCE mit MN ist ein Maß für die Clastogenität.
  • Nach der Bestimmung der Anfangsergebnisse wurde das Experiment mit steigenden Dosismengen wiederholt, bis (i) die Mikronukleus-Bildung sichtbar wurde; oder (ii) die Knochenmarkstoxizität beobachtet wurde, oder (iii) die letale Dosis erreicht wurde oder (iv) eine Dosis von 5 g/kg verabreicht wurde. Für die Tests mit jeder der Verbindungen 2, 6, 17 und 18 wurde jeweils die akut letale Dosis erreicht, bevor sich Anzeichen von Knochenmarkstoxizität oder Mikronukleus-Bildung ergaben. Die Ergebnisse des Experimentes erscheinen in der nachstehenden Tabelle 20. Aus der Tabelle geht hervor, dass für keine der Verbindungen bei den untersuchten Dosen Knochenmarkstoxizität beobachtet wurde. Der prozentuale Retikulozytenwert zur Behandlung mit jeder Verbindung blieb nahe bei dem negativen Kontrollwert. Dies ist im Widerspruch zu einem Abfall von etwa 2–2,5% PCE/RBC, der bei der positiven Kontrolle beobachtet wird, was eine Erythrozytenabreicherung aufgrund von Knochenmarkstoxizität darstellt. Keine der Verbindungen zeigte clastogene Wirkung.
  • TABELLE 20
    Figure 01230001
  • BEISPIEL 18
  • In Beispiel 10 ist die Inaktivierung von zellfreiem HIV-Virus mit den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt. Dieses Beispiel zeigt die Inaktivierung von zellassoziiertem HIV ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen.
  • H9-Zellen, die chronisch mit HIVIIIB infiziert waren, wurden verwendet (H9/HTLV-III-B NIH 1983 Kat.Nr.400). Kulturen dieser Zellen wurden in glucosereichem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, angereichert mit 2 mM L-Glutamin, 200 μ/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 9% fötalem Rinderserum (Intergen Company, Purchase NY) gehalten. Zur Erhaltung wurde die Kultur einmal wöchentlich auf eine Dichte von 3 × 105 bis 4 × 105 Zellen/ml geteilt, und etwa 4 Tage nach dem Teilen wurde bei Bedarf eine 3,3% Natriumbicarbonat-Lösung zugegeben. Für das Inaktivierungsver fahren wurden die Zellen drei Tage nach dem Aufteilen verwendet. Sie wurden aus ihrem Kulturmedium bei 400 g × 10 min pelletiert, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 1 bis 5 Tage altem Humanplättchenkonzentrat (PC) (pH-Wert 7,5–6,5) bis zu einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Aliquots der PC-infizierten Zellsuspension wurden für psoralenfreie Dunkelkontrollen, für psoralenfreie Nur-UVA-Kontrollen, für Psoralen-Dunkelkontrollen und für die Psoralen plus UVA-Experimentalprobe erstellt. Konzentrierte steril filtrierte Stammlösungen jedes Psoralens in Wasser wurden in die geeigneten Aliquots verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 150 μM erhalten wurde (eine 10 mM Stammlösung von Verbindung 18 wurde etwa 67-fach verdünnt und eine 2 mM Stammlösung von Verbindung 2 wurde etwa 13-fach verdünnt). Nach einem Äquilibrierungszeitraum von 30 min bei Raumtemperatur wurden jeweils 0,5 ml jeder Dunkelkontrolle in einem Kryogefäß untergebracht und im Dunkeln bei –80°C aufbewahrt. Für die UVA-Bestrahlung wurden 8 ml des psoralenfreien Aliquots und 8 ml jedes psoralenhaltigen Aliquots in einen modifizierten Fl 20 TeflonTM-Beutel (modifiziert auf 92 cm2 Gesamtoberfläche, The West Co., Phoenixvill, PA) über eine 10 ml Plastik-Einwegspritze eingebracht, die an einer der Polypropylen-Öffnungen am Beutel befestigt war. Dies ergab eine durchschnittliche Weglänge von 0,17 cm. Die Beutel wurden dann für eine Gesamteinwirkung von 3 Joule/cm2 in der in Beispiel 1 oben beschriebenen Vorrichtung bestrahlt, die an einem zirkulierenden Kühlwasserbad befestigt war, das auf 4°C eingestellt war und das die Temperatur in dem Beutel bei etwa 22 bis 25°C hielt. Bei der Einwirkung wurde die Vorrichtung auf einem Plättchenschüttler (Helmer Labs, Noblesville, IN) geschüttelt. Nach der Exposition wurde der Inhalt der Beutel mit einer frischen Spritze durch die verbleibende nicht verwendete Öffnung im Beutel entnommen, und in Kryogefäßen zur Speicherung im Dunkeln bei –80°C bis zur Analyse untergebracht.
  • Die aufbewahrten Proben wurden bei 37°C aufgetaut, dann in einem HIV-Mikroplaquetest, wie in Hanson, C.V. Crawford-Miksza, L. und Sheppard H.W., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990) beschrieben und wie in Beispiel 13 oben beschrieben, mit den folgenden Modifikationen titriert. Die Gerinnungsentfernung aus jeder Probe erfolgte vor dem Plattieren. Da die Plattierung eines Zielvolumens von 4 ml nach der Gerinnungsentfernung gewünscht war, wurde ein Überschuss der Probe (6 ml) in ein Polypropylen-Röhrchen überführt und auf ein Endvolumen von 60 ml verdünnt, wobei die Test- und Kontrollproben aus dem Inaktivierungsverfahren in 50% Assaymedium und 50% normalem gepooltem Plasma aus Mensch verdünnt wurde. Die Proben wurden direkt seriell auf Platten mit 96 Vertiefungen (Corning Glass Works, Corning N.Y) verdünnt. Die Platten wurden in einem Schwingschüttler für 30 sek gemischt und bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre für 1 bis 18 Std. inkubiert. MT-2-Zellen (0,025 ml) [Klon alpha-4, erhältlich (Katalognummer 237) von den National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] wurden in jede Vertiefung gegeben, so dass eine Konzentration von 80000 Zellen pro Vertiefung erhalten wurde. Nach einer weiteren Std. Inkubation bei 37°C in 5% CO2 wurden 0,075 ml Assaymedium mit 1,6% SeaPlaque-Agarose (FMC Bioproducts, Rockland, Maine) und vorgewärmt auf 38,5°C in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden bei 37°C für einige Minuten gehalten, bis sich mehrere Platten angesammelt hatten und dann in Plattenträgern bei 600 × g für 20 min in einer auf 10°C vorge kühlten Zentrifuge zentrifugiert. In der Zentrifuge bildeten sich Zell-Monolayer vor dem Gelieren der Agaroseschicht. Die Platten wurden 5 Tage bei 37°C in 5% CO2 inkubiert und durch Zugabe von 0,05 ml 50 μg/ml Propidiumiodid (Sigma Chemical Co.) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) in jede Vertiefung gefärbt. Nach 24 bis 48 Std. wurden die rot fluoreszierend gefärbten Mikroplaques durch Unterbringen der Platten in einem 8000 μW/cm2 304 nm UV-Lichtkasten (Fotodyne, Inc. New Berlin, Wis.) sichtbar gemacht. Die Plaques wurden bei 20- bis 25-facher Vergrößerung mit einem Stereomikroskop gezählt.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt: Verbindung 2 (150 μM) inaktivierte > 6,7 log HIV nach 3 Joules/cm2 Bestrahlung (verglichen mit Dunkel- und Lichtkontrollen von 0 log Inaktivierung, Ausgangs-log-Titer 6,1 plaquebildende Einheiten/ml). Bei gleicher Konzentration und Bestrahlungszeit inaktivierte Verbindung 18 >7,2 log HIV (verglichen mit einer Dunkelkontrolle von 0 log und einer Lichtkontrolle von 0,1 log, Ausgangstiter 6,6). Dieses Beispiel unterstützt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen zellassoziiertes Virus effizient inaktivieren.
  • BEISPIEL 19
  • Dieses Beispiel beinhaltet eine Bestimmung neuer synthetischer Medienformulierungen, wie gemessen durch die folgenden In-vitro-Plättchenfunktionstests: 1) Erhaltung des pH-Wertes; 2) Plättchenaggregation ("Agg") und 3) GMP140-Expression. Die Assays für jeden dieser Tests wurden oben beschrieben.
  • TABELLE 21*
    Figure 01270001
  • (Fortsetzung)
    Figure 01270002
  • Vier Formulierungen wurden hergestellt, S 2.19, S 2.22, S 3.0 und S 4.0. Die Zusammensetzung dieser synthetischen Medienformulierungen sind in Tabelle 21 gezeigt.
  • Eine Einheit an humanem plättchenreichen Plasma (PRP) wurde von der Sacramento Blutbank erhalten. Die Einheit wurde bei Raumtemperatur 6 min bei 4000 U/min zentrifugiert und dann in eine Einheitspresse überführt. Mit einer befestigten Übertragungsleitung wurde das Plasma aus der Einheit ausgedrückt, so dass etwa 9,4 ml Restplasma übrig blieben.
  • Die Einheit konnte 1 Std. ruhen, wonach sie vorsichtig zum Resuspendieren der Plättchen geknetet wurde. Zu 0,6 ml Suspension wurden 2,4 ml Plasma zurückgegeben, und der gesamte Inhalt wurde in einen TeflonTM Minibeutel überführt. Die wiederhergestellte Einheit wurde auf pH-Wert und andere Tests am folgenden Tag untersucht, mit den folgenden Ergebnissen:
    pH-Wert 7,19
    GMP140 62%
    Agg 58%
  • Die verbleibende Einheit wurde dann zur Bewertung der synthetischen Medien auf die Plättchenaufbewahrung mit und ohne Photodekontamination verwendet. Aliquots (0,8 ml) aus der Einheit wurden zu jeder Formulierung (3,2 ml) in Röhrchen gegeben. 3 ml jedes Gemischs wurden in einen TeflonTM Minibeutel überführt (Plasmaendkonzentration 20%).
  • 5 Tage später wurde die Plättchenfunktion mit der oben beschriebenen Reihe von Tests bestimmt. Die Ergebnisse jeder der synthetischen Medienformulierungen sind in der nachstehenden Tabelle 22 gezeigt.
  • TABELLE 22
    Figure 01280001
  • Es schien, dass die synthetischen Medien mit 2 mM Glucose, d.h. (S 2.22) die Plättchenfunktion erhielten, wie durch GMP140 und Aggregation gemessen, und zwar besser als das synthetische Medium, das keine Glucose enthielt (d.h. S 2.19).
  • Zur Bestätigung der vorstehenden Befunde wurden die Experimente wiederholt ("n" ist die Anzahl der Wiederholungexperimente) mit diesen Formulierungen, und mit zusätzlichen glucosefreien Formulierungen (3.0 und 4.0). Die Plättchenfunktion wurde vor und nach der Aufbewahrung und zusammen mit der Photodekontamination bewertet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in den nachstehenden Tabellen 4, 5 und 6 angegeben.
  • TABELLE 23*
    Figure 01290001
  • (Fortsetzung)
    Figure 01290002
  • TABELLE 24*
    Figure 01290003
  • TABELLE 25*
    Figure 01290004

Claims (23)

  1. Verfahren zum Inaktivieren von Mikroorganismen in Blutpräparaten, umfassend in der folgenden Reihenfolge: a) Bereitstellen in einer beliebigen Reihenfolge: i) von einer oder mehreren photoreaktiven Verbindungen oder Salzen davon der folgenden Formel:
    Figure 01300001
    worin: X1 eine Kohlenwasserstoffkette mit einer Gesamtlänge von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, wobei 0 bis 6 dieser Kohlenstoffatome unabhängig durch NH oder O ersetzt sind, und die Austauschpunkte jeweils durch mindestens zwei Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, und sie von dem Psoralen durch mindestens 1 Kohlenstoffatom getrennt sind, und X2, X3 und X4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H und (CH2)vCH3, wobei v eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist; ii) von Photoaktivierungsvorrichtungen zum Photoaktivieren der Verbindungen oder von deren Salzen; und iii) von einem Blutpräparat, von dem vermutet wird, dass es durch einen Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure kontaminiert ist; b) Zugeben der Verbindungen oder von deren Salzen zu dem Blutpräparat; und c) Photoaktivieren der Verbindungen oder von deren Salzen unter Bedingungen, die zum Inaktivieren des Mikroorganismus hinreichen, ohne dass die Konzentration von molekularem Sauerstoff eingeschränkt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei X1: -(CH2)w-R2-(CH2)z-, -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z- oder -(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4(CH2)z- ist; und R2, R3 und R4 unabhängig O oder NH sind, und w eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, x eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, y eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, und z eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung 4'-(4-Amino-2-aza)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(2-Aminoethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(5-Amino-2-oxa)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(5-Amino-2-aza)pentyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(6-Amino-2-aza)hexyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(7-Amino-2,5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(12-Amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(13-Amino-2-aza-6,11-dioxa)tridecyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(7-Amino-2-aza)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(7-Amino-2-aza-5-oxa)heptyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(9-Amino-2,6-diaza)nonyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(8-Amino-5-aza-2-oxa)octyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-(9-Amino-5-aza-2-oxa)nonyl-4,5',8-trimethylpsoralen, oder 4'-(14-Amino-2,6,11-triaza)tetradecyl-4,5',8-trimethylpsoralen ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mikroorganismen Bakterien umfassen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mikroorganismen gramnegative Bakterien umfassen.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mikroorganismen ein Virus umfassen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Blutpräparat Blutplättchen umfasst.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Blutpräparat Plasma umfasst.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Blutpräparat zudem ein synthetisches Medium umfasst.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Photoaktivierungsvorrichtung ein Photoaktivierungsgerät umfasst, das eine festgelegte Intensität eines Spektrums elektromagnetischer Strahlung aussenden kann, umfassend Wellenlängen zwischen 180 und 400 nm.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung Wellenlängen zwischen 320 und 380 nm umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Intensität zwischen 1 und 30 mW/cm2 liegt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Blutpräparat der Intensität für 1 sec bis 30 min ausgesetzt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung zu dem Blutpräparat in einer Endkonzentration zwischen 0,1 und 250 μM zugegeben wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Verbindung zu dem Blutpräparat in einer Endkonzentration zwischen 10 und 150 μm zugegeben wird.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens zwei der Verbindungen zugegen sind.
  17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Verbindung vor dem Zusammenkommen mit dem Blutprodukt in einer Lösung vorliegt
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Lösung Wasser, Salzlösung oder ein synthetisches Medium umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das synthetische Medium Natriumacetat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Natriumcitrat, Natriumphosphat und Magnesiumchlorid umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das synthetische Medium zudem mindestens einen Bestandteil umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannit und Glucose.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Lösung in einem ersten Blutbeutel enthalten ist und das Blutprodukt in einem zweiten Blutbeutel enthalten ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Zusammenbringen durch Ausdrücken der Lösung aus dem ersten Blutbeutel in den zweiten Blutbeutel über eine sterile Verbindung erfolgt.
  23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Verbindung vor dem Zusammenbringen in einem trockenen Zustand vorliegt.
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