DE69423665T2 - Biologische Prüfungen zur Feststellung von Herbiziden - Google Patents

Biologische Prüfungen zur Feststellung von Herbiziden

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Das Journal of Antibiotics (1990) 43(10): 1207-1222 offenbart das Herausfinden bzw. Screening von Inhibitoren für Glutamin-Synthetase unter Einsatz intakter Mikroorganismen mit speziellen Funktionen.
  • Die WO-A-87/05627 offenbart die Expression von Glutamin-Synthase wild gedeihender Arten und Mutanten in fremden Wirten.
  • Mol. Gen. Genet. (1991) 228: 287-293 offenbart in einem komplementierten E. coli-Auxotrophen exprimierte Aktivität von Dihydrodipicolinat-Synthase von Mais.
  • In den vergangenen Jahren wurden zum Auffinden von Herbiziden die Wege des Stoffwechsels für ernährungsmäßig wesentliche Aminosäuren ein primärer Brennpunkt des Interesses. Dieses Interesse ist dem Auffinden verschiedener Klassen von Herbiziden zuzuschreiben, die sehr aktiv sind, eine geringe Tiertoxizität zeigen und Enzyme in diesen Wegen hemmen. Diese Herbizide hemmen Enzyme in den Wegen für verzweigtkettige Aminosäuren (gehemmt durch Imidazolinone, Sulfonylharnstoffe und Thiazolpyrimidine), aromatische Aminosäuren (gehemmt durch Glyphosat), Glutaminin (gehemmt durch Bialaphos und Phosphinotricin) oder Histidin (gehemmt durch Amitrol).
  • Bei der traditionellen Art des Findens von Herbiziden wurde eine chemische Probe auf eine ganze Pflanze gesprüht und die Wirkung der Chemikalie nach einer festgesetzten Zeitdauer, typischerweise zwei bis drei Wochen nach der Anwendung, bewertet. Bei dieser Art des Herangehens identifizierte Verbindungen müssen dann hinsichtlich des Spektrums der befallenen Pflanzen, der Toxizität und der Wirkungsstelle weiter charakterisiert werden. Dieses Verfahren erfordert große Mengen der Testverbindung, ist zeitaufwendig, teuer und ineffizient. Es wäre daher ein schnelles Verfahren zum Herausfinden potentieller Herbizide bei der Herbizid-Entwicklung in kleinem Maßstab vorteilhaft.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft neue Protokolle zum Herausfinden und schnellen Identifizieren von Verbindungen, die spezifisch ein vorbestimmtes Enzym oder eine metabolische Zielstelle hemmen, die in den meisten Fällen spezifisch für Pflanzen ist. Die Erfindung betrifft weiter Mikrobenstämme, die für die hier beschriebenen Screenin-Verfahren brauchbar sind. Enzyme, die spezifisch oder indirekt durch die neuen Prüfungen bzw. Screens beeinflusst werden, schließen Glutamin-Synthetase (GS), 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase (DAHP), Dihydropicolinat- Synthase (DHPS), Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) und Phosphoribosylanthranilat-Transferase (PAT) ein. Idealerweise sind die enzymatischen Wege, auf die die neuen Screening-Protokolle zielen, einzigartig für Pflanzen, Bakterien und Pilze, und sie sind in geringen Niveaus vorhanden.
  • Die hier beschriebenen Screens können auch auf Enzyme zielen, die in Tieren vorhanden sind, z. B. Glutamin-Synthatase. Wegen der merklichen Unterschiede zwischen Pflanzen und Tieren in den Formen dieser Enzyme oder im Verbindungs-Transport, der Aufnahme oder dem Abbau, müssen Inhibitoren von Pflanzen-Enzymen nicht notwendig aktiv gegen die Tierform des Enzyms sein. Das Hemmen dieser Enzyme sollte wenig oder keine Toxizität für Menschen oder Tiere darstellen. Die Screens schaffen ein wirksames und schnelles Verfahren zum Feststellen des herbiziden Potentials von Testverbindungen. Durch die neuen Screening-Protokolle identifizierte Leitverbindungen können als Herbizide zum Hemmen des Pflanzenwachstums benutzt werden.
  • Die hier beschriebenen Verfahren benutzen einen Mikrobenstamm, der idealerweise ein Bakterien-Homologes eines wesentlichen Pflanzengen-Produktes exprimiert. Der Mikrobenstamm weist eine Mutation in dem Gen auf, das für das Bakterien-Homologe codiert, was zu seiner Unfähigkeit führt, entweder ohne das Exprimieren des Pflanzengen-Produktes oder die Zugabe eines Nahrungs-Zusatzes zu wachsen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikrobenstamm unter zwei Sätzen von Bedingungen gehalten: unter Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der das Pflanzengen-Produkt exprimiert, günstig sind, aber ungeeignet für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des Pflanzengen-Produktes und unter Umkehr-Bedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des wesentlichen Pflanzengen-Produktes geeignet sind. Die Mikroben-Kulturen, die unter diesen beiden Bedingungen gezüchtet werden, werden dann mit einer auf die Hemmeigenschaften des Pflanzenwachstumms zu testenden Verbindung in Berührung gebracht. Eine Verbindung, die das wesentliche Pflanzengen-Produkt spezifisch hemmt, wird als eine Verbindung identifiziert, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, unter Umkehr-Bedingungen das Wachstum aber nicht hemmt.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordern nicht, dass alle Enzyme des gesamten wesentlichen Pflanzen-Stoffwechselweges innerhalb des Mikrobenstammes exprimiert werden. Die Verfahren erfordern die Expression nur eines Enzyms des ins Auge gefassten Pflanzen-Weges, der zum Ergänzen der Nahrungs-Bedürfnisse des Mikrobenstammes genügt.
  • Weiter erfordern die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht, dass das gesamte wesentliche Pflanzengen-Produkt innerhalb des Mikrobenstammes exprimiert wird. Die Verfahren erfordern die Expression nur eines Teiles des Pflanzengen-Produktes, das zum Ergänzen der Nahrungs- Bedürfnisse des Mikrobenstammes genügt. Der Teil des Pflanzengen-Produktes, der zum Ergänzen der Nahrungs-Erfordernisse des Mikrobenstammes genügt, kann, z. B., ein Fragment des Pflanzengen-Produktes oder eine Untereinheit eines Holoenzyms sein.
  • Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Phosphoribosylanthranilat-Transferase das wesentlichen Pflanzengen-Produkt, das bei dem Screen auf hemmende Verbindungen ins Auge gefasst wird. Der bei diesem Screen eingesetzte Mikrobenstamm ist einer, der entweder ohne Tryptophan oder das Pflanzengen-Produkt Phosphoribosylanthranilat-Tranferase nicht zum Wachsen in der Lage ist. Gemäß dieser Ausführungsform sind Testbedingungen Bedingungen, bei denen Tryptophan und irgendeine andere Verbindung fehlt, die das Wachstum eines Mikrobenstammes gestattet, dem die Aktivität von Phosphoribosylanthranilat-Transferase fehlt. Umkehr-Bedingungen sind Bedingungen, die Typtophan oder irgendeine andere Verbindung einschließen, die das Wachstum des Mikrobenstammes gestatten, dem es an Aktivität der Phosphoribosylanthranilat-Transferase mangelt.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Acetohydroxysäure- Synthase das ins Auge gefasste, wesentliche Pflanzengen-Produkt, und der eingesetzte Mikrobenstamm ist einer, der entweder ohne Acetohydroxysäure-Synthase oder verzweigtkettige Aminosäuren, die der Mikrobenstamm bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase nicht herstellen kann, unfähig ist zu wachsen. Testbedingungen enthalten nicht die verzweigtkettigen Aminosäuren, die für das Wachstum bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase erforderlich sind, während Umkehr-Bedingungen die benötigten verzweigtkettigen Aminosäuren enthalten.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase das wesentlichen Pflanzengen-Produkt, das bei dem Screen auf hemmende Verbindungen ins Auge gefasst ist. Der bei diesem Screen eingesetzte Mikrobenstamm ist entweder ohne 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase oder die Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin nicht zum Wachstum in der Lage. Testbedingungen enthalten kein Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin, während Umkehr-Bedingungen diese Aminosäuren enthalten.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Glutamin-Synthetase das ins Auge gefasste, wesentliche Pflanzengen-Produkt. Gemäß dieser Ausführungsform ist der für den Screen eingesetzte Mikrobenstamm einer, der entweder ohne die Expression von Glutamin-Synthetase oder die Zugabe von Glutamin zum Wachstum nicht in der Lage ist. Bei Testbedingungen fehlt Glutamin, während bei den Umkehr-Bedingungen Glutamin vorhanden ist.
  • Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das wesentliche Pflanzengen-Produkt, das bei einem Screen auf pflanzen-spezifische Hemmer des Pflanzenwachstums ins Auge gefasst ist, Dihydrodipicolinat-Synthase. Gemäß dieser Ausführungsform ist der zum Screenen von Inhibitoren eingesetzte Mikrobenstamm entweder ohne die Expression von Dihydrodipicolinat-Synthase oder die Zugabe von Diaminopimelinsäure nicht zum Wachstum in der Lage. Dementsprechend enthalten Testbedingungen keine Diaminopimelinsäure, während Umkehr-Bedingungen Diaminopimelinsäure enthalten.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren eines wesentlichen Pflanzengen-Produktes eines Mutanten, der resistent ist gegen eine Verbindung, die das Gegenstück der wild gedeihenden Art des Mutanten-Genproduktes hemmen würde. Die Fähigkeit, ein solches Mutanten-Genprodukt oder den Mikrobenstamm zu identifizieren, der das Mutanten-Genprodukt exprimiert, ist brauchbar für die Produktion transformierter Pflanzen, die das Mutanten-Gen exprimieren, das für das wesentliche Genprodukt des Mutanten codiert. Solche Pflanzen sind resistent gegen eine Verbindung, die das Wachstum einer ähnlichen Pflanze hemmen würden, die das Mutanten-Gen nicht exprimiert (d. h., die wild gedeihende Pflanze). Gemäß dieser Ausführungsform wird ein Mikrobenstamm, der ein Mutanten-Gen exprimiert, das für ein wesentliches Pflanzengen-Produkt codiert, ohne einen Nahrungs-Zusatz gezüchtet, der für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des wesentlichen Pflan zengen-Produktes des wild gedeihenden Typs erforderlich ist. Unter diesen Bedingungen wächst der Mikrobenstamm, wenn das wesentliche Pflanzengen-Produkt des Mutanten, das durch den Mikrobenstamm exprimiert wird, in der Lage ist, die Bedürfnisse des Stammes an eine Nahrungs- Ergänzung zu erfüllen. Ein unter diesen Bedingungen gezüchteter Mikrobenstamm wird dann mit einr genügenden Menge eines bekannten Inhibitors des wesentlichen Pflanzengen-Produktes des wild gedeihenden Typs in Berührung gebracht, um die Hemmung des Wachstums des Mikrobenstammes, der das Genprodukt des wild wachsenden Typs exprimiert, zu verursachen. Die Mikrobenzellen, die in der Lage sind, in Gegenwart des bekannten Inhibitors unter diesen Umständen zu wachsen, sind Zellen, die ein wesentliches Pflanzengen-Produkt des Mutanten exprimieren, das resistent gegen eine Verbindung ist, die das wesentliche Pflanzengen-Produkt des wild gedeihenden Typs hemmen würde.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Pflanzengen-Produkten von Mutanten, um neue Inhibitoren des Pflanzenwachstums zu identifizieren. Mutanten-Pflanzengene, die für modifizierte Formen eines wesentlichen Pflanzen-Enzyms codieren, das gegen bekannte Inhibitoren resistent ist, sind wahrscheinlich resistent gegen weitere Mitglieder der weiteren chemischen Klasse (bestimmt durch die hier beschriebenen Screening-Verfahren). Solche Mutanten würden jedoch nicht notwendigerweise resistent gegen neue Inhibitoren sein, die sich chemisch von vorher gefundenen Inhibitoren unterscheiden. Die hier beschriebenen Screens können daher dazu benutzt werden, neue Inhibitoren von herbizid-resistenten wesentlichen Pflanzengen-Produkten von Mutanten zu identifizieren.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Das hier beschriebene Verfahren gestattet die schnelle Identifikation von Verbindungen, die spezifisch ein vorbestimmtes Enzym oder eine metabolische Zielstelle hemmen, das bzw. die spezifisch ist für Pflanzen, Bakterien und Pilze. Die gleichen biologischen Reagenzien, die beim chemischen Auffinden benutzt werden, können eingesetzt werden, um Mutanten für die Zielstelle auszuwählen, die eine differenzielle Frucht-Selektivität auf der Grundlage der genetischen Modifikation der interessierenden Fruchtpflanze gestatten würden, statt einer Selektivität auf der Grundlage des zufälligen Metabolismus einer Verbindung gegenüber einem inaktiven Metaboliten oder dem Ausschluss einer Verbindung durch eine spezielle Fruchtart.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die genetische Komplementation eines Mikroben-Defektes mit einem Gen pflanzlichen Ursprungs. Gemäß den hier beschriebenen Verfahren wird ein Mikrobenstamm ausgewählt oder konstruiert, so dass er einen genetischen Defekt in einem interessierenden Enzym aufweist, was zu einem Mikroorganismus führt, der entweder ohne Nahrungs-Ergänzung oder genetische Modifikation (z. B. Komplementation) zum Wachstum nicht in der Lage ist. Der genetische Defekt würde aus solchen ausgewählt werden, die Auxotrophie bei Abwesenheit eines von außen hinzugegebenen wesentlichen Pflanzen-Produktes verursachen. Um bei dem Mikroorganismus Prototrophie wieder herzustellen, wird ein Pflanzengen, das das defekte Mikrobengen komplementieren kann, in den Mikroben exprimiert, wodurch dem durch den genetischen Defekt verursachten Mangel abgeholfen wird. Die resultierende Mikrobe hängt von entweder dem Pflanzengen oder dem Pflanzenprodukt des Enzyms ab, das durch das Gen codiert wird, um in Minimalmedien zu wachsen. Die Mikrobe kann zum Herausfinden von Verbindungen benutzt werden, die das ausgewählte Pflanzenenzym hemmen. Dies kann, z. B., durch Bewerten des differenzialen Wachstums auf Minimal-Nähragarplatten erfolgen, die entweder das Produkt des interessierenden Enzyms enthalten oder dieses Produkt nicht aufweisen. Verbindungen, die das Mikrobenwachstum bei Abwesenheit des Produktes des Enzyms oder Weges hemmen, die aber das Mikrobenwachstum bei Anwesenheit des Produktes nicht hemmen, können auf diesen Platten spezifisch identifiziert werden. Der Screen kann derart modifiziert werden, dass ein Endprodukt eines Weges zum Testen der Umkehr der Wachstums-Hemmung benutzt wird. Das Verfahren dieser Erfindung kann somit dazu benutzt werden, Verbindungen zu identifizieren, die einen spezifischen Pfad hemmen, der ein oder mehr als ein Pflanzenenzym anstelle eines Mikroben-Enzyms enthält.
  • Nach dem Identifizieren einer herbiziden Verbindung, die das richtige Funktionieren des wild gedeihenden Enzyms hemmt oder beeinträchtigt, wodurch das Wachstum des das Enzym enthaltenden Organismus verhindert wird, können resistente Mutanten isoliert werden. So kann, z. B., eine Population in Gegenwart einer Konzentration eines Inhibitors mutagenisiert werden, der genügt, um das Wachstum eines wild vorkommenden Organismus zu hemmen, und dann können Einzelne aus der Population ausgewählt werden, die zum Wachstum oder schnelleren Wachstum als die wild gedeihenden Organismen in der Lage sind.
  • Die hier beschriebenen Screens können dazu benutzt werden, neue Inhibitoren spezifischer metabolischer Prozesse von Pflanzen zu identifizieren, Analoge spezifischer Pflanzenprodukte auf der Grundlage der vorhandenen Chemie zu charakterisieren und natürlich vorkommende Inhibitoren pflanzen-spezifischer Enzyme nachzuweisen. Quellen für potentielle Inhibitoren können Gährungsbrühen, teilweise gereinigte Gährungsbrühen und natürliche und synthetisch produzierte Verbindungen einschließen.
  • Potentielle Inhibitoren, die als positiv im primären Screen identifiziert worden sind; z. B. organische Moleküle oder Gährungsbrühen, können in einem sekundären Screen durch Testen der Verbindung gegen den Mikrobenstamm mit Pflanzengen-Mangel, der nicht mit dem Pflanzengen transformiert wurde (d. h., es nicht exprimiert), weiter bewertet werden. Bei diesem Test werden spezifische Inhibitoren von Pflanzenprodukten keine Wachstumshemmung verursachen. Inhibitoren von Mikroben-Homologen der Pflanzen-Enzyme können jedoch noch immer als Herbizide brauchbar sein.
  • Im primären Screen und in sekundären Bewertungen als positiv festgestellte Leitinhibitoren können weiter auf Pflanzen getestet werden.
  • In den folgenden Beispielen wurden fünf verschiedene wesentlichen Pflanzengen-Produkte zum Entwickeln biologischer Screens auf spezifische Inhibitoren von ins Auge gefassten Pflanzen- Enzymen benutzt. Jedes Zielenzym repräsentiert eine wesentliche Stufe im normalen Pflanzen-Metabolismus, ohne die eine Pflanze nicht wachsen kann. In jedem Falle benutzt der Screen einen Mikrobenstamm, der ohne das Pflanzengen-Produkt oder Nahrungs-Ergänzung nicht wachsen kann. Die in diesen Assays benutzten Mikrobenstämme können unter Benutzung bekannter Techniken und ohne unangemessenes Experimentieren leicht konstruiert werden. Beispiele einige bevorzugter Mikrobenstämme schließen Bakterienstämme (z. B. E. coli, Salmonella und Cyanobacteria) sowie Hefe ein.
  • Es ist auch ein Beispiel eines auf einem Mechanismus beruhenden biologischen Screens auf Inhibitoren von herbizid-resistenten Pflanzengen-Produkten von Mutanten beschrieben. Gemäß dieser Ausführungsform repräsentiert ein Zielenzym eine wesentliche Stufe im normalen Pflanzen- Metabolismus, doch ist das Enzym ein Mutanten-Enzym, das gegen einen Inhibitor des wild gedeihenden Homologen des Mutanten-Enzyms resistent ist. Screens gemäß diesem Verfahren benutzen Mikrobenstämme, die ohne entweder das Pflanzengen-Produkt oder Nährstoff-Ergänzung nicht wachsen können. Diese Mikrobenstämme können in den meisten Fällen die gleichen oder ähnlich den Stämmen sein, die zum Identifizieren von Inhibitoren wesentlicher Pflanzengen-Produkte des Wildtyps benutzt wurden, und sie können gemäß bekannten Techniken und ohne unangemessenes Experimentieren leicht konstruiert werden.
  • Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) ist das erste Enzym, das für den biosynthetischen Weg zur Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren spezifisch ist. Acetohydroxysäure-Synthase katalysiert die Kondensation von zwei Molekülen Pyruvat unter Bildung von Acetolactat oder eines Moleküls Pyruvat und eines Moleküls α-Ketobutyrat zur Bildung von Acetohydroxybutyrat. Zusätzlich zu diesen Substraten benötigt AHAS Thiaminpyrophosphat und Flavinadeninnucleotid zur Enzym- Aktivität und -Stabilität. AHAS aus Pflanzen wird durch Isoleucin, Leucin und Valin hinsichtlich der Rückkopplung gehemmt. Die Bakterienenzym-Homologen (AHAS I und III) werden durch Valin hinsichtlich der Rückkopplung gehemmt, während dies bei dem Pflanzen-Homologen (AHAS II) nicht der Fall ist.
  • AHAS ist die Zielstelle verschiedener bekannter und nicht damit in Beziehung stehender Klassen von Herbiziden, einschließlich Imidazolinonen, Sulfonylharnstoffen und Triazolpyrimidinen. Die Imidazolinone und Sulfonylharnstoffe dienen als positive Vergleichsmaterialien für Screens dieser Erfindung, die dieses Enzym nutzen. Weil Tiere nicht die Enzyme zur Synthese verzweigtkettiger Aminosäuren aufweisen und Pflanzen diesen Weg zum Wachstum erfordern, haben diese Herbizide eine geringe Tier-Toxizität. Zusätzlich wurde auch berichtet, dass die Wirkungen einer Anzahl natürlich vorkommender Antimetaboliten (Toxine) durch ein oder mehrere der verzweigtkettigen Aminosäuren umgekehrt werden, wie in Tabelle I, J. P. Scannel und Davis L. Preuss (1974) in Chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Boris Weinstein, herausgeber, Band 3, Seiten 189-224 gezeigt.
    • TABELLE I NATÜRLICHE TOXINE, VON DENEN BERICHTET WIRD, DASS SIE DURCH VERZWEIGTKETTIGE AMINOSÄUREN UMGEKEHRT WERDEN
  • Toxische Verbindung Umkehrmittel
  • L-2-Amino-4,4-dichlorbuttersäure Leu
  • L-4-Azaleucin Leu
  • L-2-Amino-4-methyl-4-capronsäure Leu, Phe
  • L-2-Amino-4-methyl-5-capronsäure Leu > Val, Ile
  • Propargylglycin Met, Leu, Val
  • L-(threo)-3-Hydroxyleucin Leu, Ile, Val und andere
  • Furanomycin, Tbreomycin Ile, Val
  • 1-Amino-2-nitrocyclopentancarbonsäure Leu
  • 2-(1-Cyclohexen-3(R)-yl)-S-glycin Val, Leu, Ile, Thr und andere
  • 1-Cyclohexen-3(R)-yl-glyoxylsäure wie oben, beide TD-Inhibitoren.
  • L-2-(2-Methylen-1-cyclopropyl)glycin Leu
  • Das Auftreten imidazolinonresistenter Unkräuter ist eine Sorge bei dem Einsatz der Imidazolinon-Herbizide und anderer Herbizide, die AHAS hemmen. Durch Identifizieren neuer Verbindungen, die spezifisch die resistente Form von AHAS hemmen, ist es möglich, eine Verbindung zu identifizieren, die brauchbar ist für das spezifische Ausrotten von, z. B., imidazolinon-resistenten Unkräutern. Die auf dem Mechanismus für die Identifikation von AHAS-Inhibitoren beruhende Prüfung ist identisch der für die Identifikation von Inhibitoren des Wildtyp-AHAS beschriebenen Prüfung mit der Ausnahme, dass der genetische Defekt des Testorganismus durch die resistente Form von AHAS anstelle der wild gedeihenden Form komplementiert wird. Diese Prüfung kann daher zum Identifizieren neuer AHAS-Inhibitoren, zum Charakterisieren von Analogen auf der Grundlage der existierenden Chemie und zum Nachweisen von Inhibitoren aus Naturprodukten benutzt werden.
  • 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase ist das erste Enzym im biosynthetischen Weg für die Biosynthese aromatischer Aminosäure. Die auf dem Mechanismus unter Benutzung dieses Enzyms beruhende Prüfung kann Inhibitoren der DAHP-Synthase aus einer Testprobe identifizieren, die daher herbizid sein kann.
  • Die durch DAHP-Synthase katalysierte Reaktion ist die Kondensation von Phosphorenolpyrovat und Erythrose-4-phosphat unter Bildung von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat. Die Endprodukte dieses Weges sind die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. In Pflanzen führt dieser Weg jedoch zu einer anderen Reihe sekundärer Metaboliten, die Lignin, Anthocyan-Pigmente, Auxin und antimicrobielle Phytoalexine einschließen (U. Weiss und J. M. Edwards (1980) The Biosynthesis of Aromatic Compounds (Wiley, New York); K. Hahlbrock und D. Scheel (1989) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol 4: 347-369). Die Pflanzen-Isozyme der DAHP-Synthase werden durch aromatische Aminosäuren nicht gehemmt.
  • Das derzeit einzige identifizierte Naturprodukt, das DAHP-Synthase hemmt, ist das phenylalanin-analoge 2,5-Dihydrophenylalanin (J. P. Scannel und David L. Preuss (1974) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Boris Weinstein, Herausgeber, Band 3, Seiten 189-224). Weil diese Verbindung durch Rückkopplungs-Hemmung bakterieller Enzyme wirken könnte und nicht gegen das Pflanzen-Enzym wirksam zu sein braucht, kann bei dieser Prüfung ein anderer Vergleich erforderlich sein. Andere Verbindungen wurden identifiziert, die eine Umkehr der Wachstums-Hemmung durch aromatische Aminosäuren zeigen, doch ist die Wirkungsstelle nicht DAHP-Synthase.
  • Glutamin-Synthetase (GS) ist das Schlüsselenzym, das bei der Assimilation und Reassimilation von Ammoniak in Bakterien-, Pilz-, und Pflanzenzellen wirkt. Dieses Enzym katalysiert die Bildung von Glutamin aus Glutamat, Ammoniak und ATP, und es wurde festgestellt, dass sie die Zielstelle der herbiziden Verbindungen Phosphinothrizin und Bialaphos (einem Gärungsprodukt) ist. GS ist die Zielstelle von zwei kommerziellen Herbiziden INCITEä (Phosphinothrizin) und BASTAå (Bialaphos). Bialaphos wurde aus einer natürlichen Gärungsbrühe gewonnen, wie verschiedene andere Antimetaboliten (herbizide Verbindungen), wie detailliert in Scannel and Preuss (J. P. Scannel und David L. Preuss (1974) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Boris Weinstein, Herausgeber, Band 3, Seiten 189-244) ausgeführt (siehe Tabelle II). Phosphinothrizin und Bialaphos können als positive Vergleichsproben für den Antagonismus des Pflanzengen-Produkts dienen.
    • TABELLE II -- BEKANNTE GS-INHIBITOREN
  • Anticapsin
  • Azaserin
  • 6-Diazo-5-oxo-norleucin (DON)
  • Tabtoxin
  • Duazomycin B
  • Bialaphos
  • Methioninsulfoximin
  • Phosalacin
  • Oxetin
  • Dihydrodipicolinat-Synthase (DHPS) katalysiert die Kondensation von β-Aspartatsemialdehyd und Pyruvat unter Bildung von 2,3-Dihydrodipicolinat. Bei dieser Reaktion verbindet sich Pyrovat zuerst mit dem Enzym unter Bildung einer Schiff'schen Base mit einem Lysinrest (J. G. - Shedlarski und C. Gilvarg (1970) J. Biol Chem. 24: 1362-1373). Das Enzym aus Tabak, Weizen und Mais wird hinsichtlich der Rückkopplung durch Lysin und zu einem geringeren Grade durch Lysin- Analoge gehemmt (M. Ghislain, V. Frankard und M. Jacobs (1990) Planta 180: 480-486; R. Kumpaisal, T. Haschimoto und Y. Yamada (1987), Plant Physiol. 85: 145-151; D. A. Frisch, A. M. Tommey, B. G. Gegenbach und D. A. Somers (1991), Mol. Gen. Genet. 228: 287-293). Die Enzym-Aktivität wird durch 100 mM Lysin zu 90% gehemmt. Das Lysin-Analoge S-(2-Aminoethyl)-L-cystein war der stärkste Inhibitor des Tabak-Enzyms und zeigt 50% Hemmung bei 0,1 mM und 90% Hemmung bei 0,5 mM (M. Ghislain, V. Frankard und M. Jacobs (1990) Planta 180: 480-486).
  • In Pilz-, Bakterien- und Pflanzen-Zellen wirkt das Enzym Dihydrodipicolinat-Synthase (DHPS) bei der Synthese nahrungsmäßig essentieller Aminosäure, Lysin. Keines der derzeit erhältlichen kommerziellen Herbizide hemmt DHPS. Weil das Enzym in Tieren nicht vorhanden ist und der Pilz-Weg zur Lysin-Biosynthese sich vom Pflanzen-Weg unterscheidet, wird davon ausgegangen, dass Inhibitoren von DHPS für Tiere nicht toxisch und spezifisch für Pflanzen sein werden. Das E. coli-Enzym ist nur zu 22% homolog zum Pflanzen-Enzym auf dem Aminosäure-Niveau. Die meisten der von Scannel und Preuss genannten Verbindungen (J. P. Seannel und David. L. Preuss (1974), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Boris Weinstein, Herausgeber, Band 3, Seiten 189-244), die durch Diaminopimelinsäure oder Lysin umgekehrt werden, haben andere Wirkungsmechanismen oder sind Rückkopplungs-Ihhibitoren mikrobieller Enzyme. Siehe die folgende Tabelle III.
    • TABELLE III ANTIMETABOLITEN, FÜR DIE DIAMINOPIMELINSÄURE ODER LYSIN ANTAGONISTEN SIND
  • L-Selenomethionin
  • L-4-Oxalysin
  • L-2-Amino-4-(2-aminoethoxy)-trans-3-buttersäure
  • Homoarginin
  • Ganavanin
  • Azaserin
  • 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin
  • Das Enzym Phosphoribosylanthranilat-Transferase (PAT) katalysiert die Reaktion nach der Anthranilat-Synthase im biosynthetischen Weg zu Tryptophan. Weil dieses Enzym für den Pflanzen- und Mikroben-Metabolismus einzigartig ist, wird davon ausgegangen, dass ein Inhibitor von PAT ein potentielles Herbizid mit minimaler Säugetier-Toxizität sein wird. Arabidopsis-Mutanten, denen dieses Enzym fehlt, sind nicht zum Wachstum in der Lage, was zeigt, dass dieses Enzym wahrscheinlich eine gute Zielstelle für ein Herbizid ist.
  • PAT katalysiert die Bildung von N-5'-Phosphoribosylanthranilat aus Phosphoribisylpyrophosphat und Anthranilat. Pflanzen und Mikroben, denen dieses Enzym fehlt, weisen aufgrund der Ansammlung von Anthranilat (o-Aminobenzoesäure) eine blaue Fluoreszenz auf. Während der frühen Wachstumsstufen dieser Mutanten auf Nähragar, der mit Tryptophan ergänzt wurde, wachsen die Pflanzen mit einer normalen Rate und sehen dem wild gedeihenden Typ ähnlich. Drei oder vier Monate nach dem Keimen ist der PAT-Mutant jedoch dramatisch kleiner als der wild gedeihende Typ und beginnt morphologische Abnormalitäten zu zeigen, die gekräuselte Blätter, keinen Blattstiel, verstärkte Schädigung und schließlich stark verminderte Fruchtbarkeit einschließen (R. L. Last und G. R. Fink (1988) Science 240: 305-310). In Planta ist sehr wenig Information über die Regelung dieses Enzyms enthalten.
  • Die Erfindung wird nun weiter durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht:
    • BEISPIELE Beispiel 1 - Prüfung auf Mechanismus-Grundlage auf Inhibitoren von Glutamin- Synthetase (GS) Materialien und Verfahren
  • Der E. coli-Stamm TH16 (L. J. Reitzer und B. Magasanik (1986) Cell, 45: 785-792) hat aufgrund der Einführung eines Tn10Kan-Transposons in das glnA-Gen einen Mangel an GS-Aktivität. Diese Einführungs-Mutation führt zu einem Bedarf an Glutamin zum Wachstum und führt auch zu einer Resistenz gegen Kanamycin (verliehen durch das Tn10Kan-Transposon).
  • Um den Ausschluss von Verbindungen durch die Bakterien-Membran zu verringern, d. h., um die Membran-Permeabilität zu erhöhen (B. A. Sampson, R. Misra und S. A. Benson, (1989), Genetics 122: 491-501) wurde der GS-Defekt von TH16 in den imp E. coli-Stamm (BAS849) durch P1 vir vermittelte Transduktion bewegt (J. H. Miller, (1972), Experiments in Molecular Genetics, CHS Laboratory, Cold Spring Habor, NY). Die imp-Mutation verleiht eine vergrößerte Membran-Permeabilität. Der resultierende Stamm, SC3 bezeichnet, zeigt Glutamin-Auxotrophie und Resistenz gegen Tetracyclin (verliehen durch das Tn10-Transposon).
  • Der GS-Mangel von SC3 wurde durch Transformieren von SC3 mit dem Plasmid pGS12 komplementiert. Dieses Plasmid beruht auf dem Vektor pKK233-2 (Pharmacia), der ein Plasmid geringer Kopienzahl ist, das den chimärenhaften Bakterien-Promoter trc für eine Expression von Genen, die stromabwärts des Promoters geklont sind, auf hohem Niveau aufweist. Dieses Plasmid hat auch das bla-Gen für Resistenz gegen Ampicillin. Die chloroplastische Form des Pisum sativum GS- Gens (S. V. Tingey, F.-Y. Tsai, J. W. Edwards, E. L. Walker und G. M. Coruzzi (1988), J., Biol. Chem. 2: 9651-9657) wurde hinter dem trc-Promoter geklont, mit dem Ergebnis, dass das Pflanzen-GS- Protein in E. coli, das dieses Plasmid aufwies, erzeugt wurde. Der E. coli-Stamm mit GS-Mangel, komplementiert mit dem pea GS-Gen, wurde SC3(GS12) bezeichnet.
  • Eine Kultur des E. coli-Stammes SC3(GS12) wurde aus einem Glycerinvorrat (gelagert bei -80ºC) oder aus einer einzelnen Kolonie von einer Platte begonnen und über Nacht bei 30ºC in 50 m l flüssigem M9ATK-Medium gezüchtet.
  • Die Testplatten waren aus M9ATK-Agar und die Umkehrplatten aus M9ATKG-Agar folgendermaßen zusammengesetzt:
    • Medien:
  • Vollständiges flüssiges M9ATK:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 970 ml destilliertes Wasser
  • Im Autoklaven bei 20# 30 Minuten behandelt.
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml 1 M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml 5 mg/ml Tetracyclin
  • 1,0 ml 10 mg/ml Kanamycin
  • Vollständiger M9ATK-Agar:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 470 ml destilliertes Wasser
  • Im Autoklaven in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten behandelt
  • Flasche 2:
  • 15 g DIFCO-Agar
  • 500 ml destilliertes Wasser
  • Im Autoklaven in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten behandelt
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml 1 M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml 5 mg/ml Tetracyclin
  • 1,0 ml 10 mg/ml Kanamycin
  • M9ATKG:
  • Herstellen von M9ATK-Medium, wie oben beschrieben.
  • Hinzugeben von 25 ml von 20 g/ml Glutamin zusammen mit anderen Zugaben zu Flasche 1.
  • Testplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATK-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1l geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml einer Übernachtkultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 4) von SC3(GS12).
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll (Cat. Nr. MS12450).
  • Umkehrplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATKG-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 11 geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml einer Übernachkultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 4) von SC3(GS12).
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll (Cat. Nr. MS12450).
  • Man ließ das Medium in den Platten 30 Minuten fest werden und trocknen. Es wurden Testproben (25 ul) sowohl auf die Testplatte als auch die Umkehrplatte in Probenbohrungen (144, 5 mm Durchmesser in 12 · 12-Reihen) hinzugegeben. Das Vergleichs-Herbizid, Bialaphos, wurde unter Verwendung von 5 ul des Vorrates auf jede Platte aufgebracht. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert und dann untersucht, um Zonen der Hemmung auf den angepassten Platten zu vergleichen. Aktive Verbindungen zeigen größere Hemmzonen auf der Testplatte als auf der Umkehrplatte.
    • Prüfungsergebnisse
  • Die Extinktion (OD&sub6;&sub0;&sub0;) der Übernachtkultur von SC3(GS12) nach einer 100-fachen Verdünnung beträgt etwa 1,0 ± 0,1. Nach einem Wachstum über Nacht bei 30ºC zeigt eine wie oben beschriebene Platte vollständiges, zusammenlaufendes Wachstum von SC3(GS12). Bialaphos, der positive Herbizid-Vergleich, zeigt eine Hemmzone von 8-12 mm.
  • Es wurden dreiundzwanzig antimikrobielle Verbindungen, erhalten von BBL auf 1/4"-Papierscheiben zum Testen von SC3(GS12) benutzt. Siehe Tabelle IV. Keine dieser Verbindungen hatte Glutamiin als Antagonisten.
  • Zusätzlich wurde eine Liste von Verbindungen, die verschiedene Naturprodukt-Antibiotika repräsentieren, gegen SC3(GS12) getestet. Keine dieser Verbindungen hatte Glutamin als Antagonisten.
  • Es wurde auch eine Reihe verschiedener Gärungs-Medien oder -Brühen getestet, die repräsentativ sind für die Medien, die zum Züchten verschiedener Organismen benutzt wurden. Diese Medien wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das Wachstum von nicht komplementiertem SC3 in Minimalmedien zu unterstützen. Diese Medien wurden in Mikrotiter-Platten getestet.
    • Beispiel 2 - Prüfung auf Mechanismus-Grundlage auf Inhibitoren von Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Materialien und Verfahren
  • Es wurde ein E. coli-Stamm konstruiert, der Deletionen für leuB (Isopropylmalat-Dehydrogenase), ilvIH (große und kleine Untereinheiten von AHAS III), ilvB (große Untereinheit von AHAS I) enthielt und auch die imp (erhöhte Membran-Permeabilität)-Mutation aufwies. Die Konstruktion von Bakterien-Stämmen, die die imp-Mutation aufweisen, ist detaillierter in Beispiel 1 beschrieben. Die ilv-GM-Stelle (große und kleine Untereinheit von AHAS II) ist in allen E, coli- Stämmen K-12 inaktiv. Diese E.coli-Stamm, mit SC2 bezeichnet, hat daher einen Mangel an AHAS- Aktivität und benötigt die Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin zum Wachstum auf Minimalmedium. Diese Bakterienzellen sind auch resistent gegen Tetracyclin und Kanamycin aufgrund der Anwesenheit von Tn10- und Tn10Kan-Transposonen, die zum Konstruieren der SC2-Stämme benutzt wurden.
  • Das Arabidopsis-AHAS-Gen (dessen Isolation und Charakterisierung in Plant Physiol. 85: 1110-1117 (1987) beschrieben ist) wurde in das bakterielle Expressions-Plasmid pKK233-2 (Pharmacia) geklont. Dieses Plasmid ist ein Plasmid geringer Kopienzahl, enthaltend das AHAS- Gen, geklont hinter dem chimärenhaften bakteriellen trc-Promoter. Das Plasmid hat auch das bla- Gen für Resistenz gegen Ampicillin. SC&sub2;-Zellen wurden mit dem AHAS-Expressionsvektor zur Produktion des Stammes SC2/AC201 transformiert, was zu einer Komplementation der SC&sub2;-AHAS- Mutationen durch das Arabidopsis-AHAS-Gen führte. Die Komplementation gestattet das Wachstum der Zellen auf Minimal-Medien, die nur mit Leucin ergänzt sind, das wegen der leuB-Mutation erforderlich ist.
  • Der E. coli-Stamm SC2/AC201 wurde aus einem Glycerin-Vorrat (bei -80ºC gelagert) oder einer einzelnen Kolonie von einer M9ATKL-Platte (weniger als zwei Wochen alt) genommen und über Nacht bei 37ºC in 50 ml flüssigem M9ATKL-Medium gezüchtet. Die Testplatten, die aus M9ATKL-Agar und die Umkehrplatten, die aus M9ATKILV-Agar zusammengesetzt waren, wurden folgendermaßen hergestellt:
    • Medien:
  • Vollständiges flüssiges M9ATKL:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 970 ml destilliertes Wasser
  • Autoklav bei 20# 30 Minuten
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml mg/ml Tetracyclin
  • 1,0 ml 10 mg/ml Kanamycin
  • 2,0 ml 25 mg/ml L-Leucin
  • Vollständiger M9ATKL-Agar:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 470 ml destilliertes Wasser
  • Im Autoklaven in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten behandelt.
  • Flasche 2:
  • 15 g DIFCO-Agar
  • 500 ml destilliertes Wasser
  • Im Autoklaven in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl&sub2;
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml 5 mg/ml Tetracyclin
  • 1,0 ml 10 mg/ml Kanamycin
  • 2 ml 25 mg/ml L-Leucin
  • Vollständiger M9ATKILV-Agar:
  • Herstellen von M9ATKL-Medium, wie oben beschrieben.
  • Hinzugeben von 2 ml von 25 mg/ml L-Isoleucin und L-Valin zusammen mit anderen Zugaben zu Flasche 1.
  • Testplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATKL-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 t geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml einer Übernachkultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1) von SC2/AC201.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll (Cat. Nr. MS12450).
  • Umkehrplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATKILV-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 l geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml einer Übernachkultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1) von SC2/AC201.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 23 cm · 23 cm (9 · 9 Zoll) (Cat. Nr. MS12450).
  • Man ließ das Medium in den Platten 30 Minuten fest werden und trocknen. Es wurden Testproben (25 ul) sowohl auf die Testplatte als auch die Umkehrplatte in Probenbohrungen (144, 5 mm Durchmesser in 12 · 12-Reihen) hinzugegeben. Das Vergleichs-Herbizid, Imazethapyr, wurde unter Verwendung von 5 ul des Vorrates (10 uM Imazethapyr in 50% DMSO/Wasser bei 4ºC) auf jede Platte aufgebracht. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und dann untersucht, um Zonen der Hemmung auf den angepassten Platten zu vergleichen. Aktive Verbindungen (d. h., Verbindungen, die die Aktivität von AHAS hemmen) zeigen größere Hemmzonen auf der Testplatte als auf der Umkehrplatte.
    • Prüfungsergebnisse
  • Die Extinktion (OD&sub6;&sub0;&sub0;) der Übernachtkultur von SC2/AC201 nach einer 100-fachen Verdünnung beträgt etwa 1,0 ± 0,1. Nach einem Wachstum über Nacht bei 37ºC zeigt eine wie oben zubereitete Platte ein vollständiges, zusammenlaufendes Wachstum von SC2/AC021. Imazethapyr, der positive Vergleich, zeigt eine Zone der Wachstumshemmung von etwa 10 mm.
  • Als ein Vergleich wurden dreiundzwanzig antimikrobielle Verbindungen, die in Tabelle IV, Beispiel 1, aufgeführt sind, von denen keine durch Hemmen der AHAS-Aktivität wirkt, erhalten von BBL auf 1/4"-Papierscheiben zum Testen der Wachstumshemmung von SC2/AC201 benutzt. Keine dieser getesteten Verbindungen hatte Isoleucin und Valin als Antagonisten. In anderen Worten, keine dieser Verbindungen zeigt eine differenzielle Wirkung auf das Wachstum in der Testplatte, verglichen mit der Umkehrplatte.
  • Zusätzlich zu den oben aufgeführten antimikrobiellen Verbindungen wurde eine Liste von Verbindungen, die verschiedene Naturprodukt-Antibiotika repräsentieren, gegen SC2/AC201 getestet. Siehe Tabelle V, Beispiel 1. Keine dieser aufgeführten Verbindungen hat Isoleucin und Valin als Antagonisten. TABELLE IV - GETESTETE ANTIMIKROBIELLE VERBINDUNGEN
    • TABELLE V - ANTIBIOTISCHE NATURPRODUKT-VERBINDUNGEN
  • Phenazin Alpha-COOH Antibiotikum E19085 Alpha
  • Terreinsäure D42067 Alpha
  • Curvularin Antibiotikum F28249 Alpha
  • Mitomycin A Antibiotikum E19020 Alpha
  • Caldariomycin Antibiotikum F42248 Alpha
  • 4-Dedimethylamino-4-methylamino-anhydrotetracyclin
  • Valinomycin/Miticid Cycloserin
  • Blasticidin "S" Isochinocyclin·HCt (AA575 Gamma)
  • Actithiazinsäure/Mycobacidin Moxidectin
  • Frenolicin (AC860 alpha) Lincomycin·HCt
  • Griseofulvin, -5-OH Antibiotikum A0341 Beta, Hydrochlorid
  • Palitantin
  • Aspartocin, Na-Salz Streptogramin/vertimycin
  • Antibiotikum Z-1220A 3 Monazomycin
  • Crassin-Acetat Antibiotikum AC541 Sulfat
  • Antibiotikum BL580 Alpha Antibiotikum A1531
  • Antibiotikum BM782 Alpha-1 Angustmycin
  • Antibiotikum C23024 Alpha Etamycin, Na-Salz
  • Antibioticum C08078 Alpha Antibioticum B02964 Komplex
  • Avilamycin Mocimycin
  • Antibiotikum D49194 Alpha Antibioticum A7363
  • Antibiotikum D49194 Beta-1 Antibioticum A9537
  • Antibiotikum F28249 Omega Actinomycin roh
  • Aureothin Levomycin
  • Paromomycin, Sulfat Antibiotikum AM374 22
  • Clavacin/Patulin Antiprotozoin/Antiprotozoin
  • Copragen/Fusarminsäure
  • Kasugamycin Antibiotikum A4825
  • Chloramphenicol Antibioticum V241W
  • Bacitracin Antibioticum V214X
  • Polymyxin-B-SO&sub4; Relomycin, LL-AM684 beta
  • Viomycin, Sulfat Amphomysin, Ca
  • Novobiocin Mycorhodin
  • Hygromycin A Antibiotikum C19004 Alpha
  • Puromycin Aminonucleosid Bottromycin
  • Pyromycin·HCl Antibiotikum AF283 Alpha
  • Nucleocidin Antibiotikum AF283 Beta
  • Antibiotikum BP12 Alpha Lemonomycin
    • TABELLE V (FORTSETZUNG)
  • Leucanicidin Antibiotikum B04068
  • Antibiotikum BM123 Alpha, SO4 Senfolomycin (RA6950 Beta-A)
  • Declomycin·HCl Antibiotikum RA6950 Beta-B
  • Gibberellinsäure Antibiotikum 15E038 Alpha
  • Alazopeptin Nonactin (AE409 Gamma)
  • Nystatin Antibioticum AM31 Beta & Gamma
  • Carbomycin Leucomycin
  • Nosiheptid Usninsäure
  • Netropsin, HCl Neutramcin
  • Avoparcinsulfat Citrinin
  • Geldamycin
  • Antibiotikum BM123 Gamma, HCl
    • Beispiel 3 -Prüfung auf Mechanismus-Grundlage auf Inhibitoren imidazolinonresistenter Formen von Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) Materialien und Verfahren
  • Der in Beispiel 2 beschriebene E. coli-Stamm SC2 ist ein geeigneter Stamm zum Einsatz in einer Prüfung auf Inhibitoren von imidazolinon-resistenten Formen von Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase. Dieser Stamm enthält Deletionen für leuB, ilvIH und ilvB und eine inaktive ilvGM-Stelle. Zusätzlich hat der Stamm eine Mutation für verstärkte Permeabilität, imp. Siehe Beispiel 2 für eine detailliertere Beschreibung dieses Stammes.
  • Die Komplementation des AHAS-Mangels von SC2 durch ein imidazolinon-resistentes AHAS-Gen gestattet das Wachstum des Stammes auf Minimalmedien, die nur mit Leucin ergänzt sind (wird wegen der leuB-Mutation benötigt). Das mutante AHAS-Gen, das zum Komplementieren des AHAS-Mangels in SC2 benutzt wird, wird, z. B., in einem leicht erhältlichen bakteriellen Expressions-Plasmid geklont oder untergeklont.
  • Die für Test- und Umkehr-Platten in dieser Prüfung benutzten Medien sind die gleichen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben sind, das die Prüfung auf Inhibitoren von Pflanzen-AHAS beschreibt. Die Verfahren sind auch die gleichen; wie die in Beispiel 2 beschriebenen mit der Ausnahme, dass die Test- und Umkehr-Platten mit einer Übernacht-Kultur eines mutanten Bakterienstammes inokuliert werden, der einen Mangel an AHAS-Aktivität aufweist, dessen Mutation jedoch durch ein imidazolinon-resistentes Pflanzen-AHAS-Gen (z. B. Stamm SC2/AC152) komplementiert ist.
    • Prüfungs-Ergebnisse
  • Die Extinktion (OD&sub6;&sub0;&sub0;) der Übernachtkultur von SC2/AC152 nach einer 100-fachen Verdünnung beträgt etwa 0,95 ± 0,07. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37ºC zeigt eine wie in Beispiel 2 und oben beschrieben hergestellte Platte ein vollständiges, zusammenlaufendes Wachstum von SC21AC152.
  • Dreiundzwanzig antimikrobielle Verbindungen, erhalten von BBL (aufgeführt in Tabelle IV, Beispiel 1), von denen keine die AHAS-Aktivität wild gedeihender Pflanzen hemmt, wurden zum Testen von SC2/AC152 benutzt. Keine dieser Verbindungen wirkt Isoleucin und Valin entgegen. Zusätzlich zu den in Tabelle IV aufgeführten antimikrobiellen Verbindungen wurde eine Liste von Verbindungen, die verschiedene Naturprodukt-Antibiotika repräsentierten, gegen SC2/AC152 getestet. Siehe Tabelle V, Beispiel 1. Keine der aufgeführten Verbindungen wirken Isoleucin und Valin entgegen.
    • Beispiel 4 - Prüfung auf Mechanismus-Grundlaffe auf Inhibitoren von 3-Desoxy-D- araino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase Materialien und Methoden
  • Der E. coli-Stamm HE628 enthält Deletionen für aroF (tyrosin-repressierbare DAHP-Synthase), aroG (phenylalanin-repressierbare DAHP-Synthase) und tyrA (Chorismat-Mutase/Prephenat-Dehydrogenase) (C. C. Garner und K. M. Herrmann (1985) J. Biol. Chem. 260: 3820-3825). Diese Zellen erfordern Tyrosin zum Wachstum, doch können sie aufgrund der Rückkopplungs-Hemmung von aroH (tryptophan-repressierbare DAHP-Synthase) durch Tryptophan nicht auf Minimalmedium wachsen, das mit 40 ug/ml Tyrosin und Tryptophan ergänzt ist. Diese Zellen weisen den imp- Phenotyp auf, wie er in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Komplementation von HE628 durch Pflanzen-DAHP-Synthase, um den Stamm HE828/pLW3-210 zu produzieren, gestattet das Wachstum der Zellen auf Tryptophan und Tyrosin. Der E. coli-Stamm und Kartoffel-DAHP-Synthase, geklont in das bakterielle Expressions-Plasmid pKK233-2, wurden von Dr. Klaus Herrmann von der Universität Purdue geliefert. Das Expressions-Plasmid ist ein Plasmid geringer Kopienzahl, enthaltend die Kartoffel-DAHP-Synthase unter der Kontrolle des chimären bakteriellen trc-Promoters. Das Plasmid hat auch das bla-Gen zur Resistenz gegen Ampicillin.
  • Ein Übernachtkultur von E. coli-Zellen (HE628/pLW3-210) wurde bei 37ºC unter Schütteln in 50 ml flüssigem M9ATT-Medium, ausgehend von einem Glycerin-Vorrat (bei -80ºC) oder einer einzelnen Kolonie von einer M9ATT-Platte gezüchtet. Testplatten, zusammengesetzt aus M9ATT- Agar und Umkehrplatten, zusammengesetzt aus M9ATTF-Agar, wurden folgendermaßen zubereitet:
    • Medien:
  • Vollständiges flüssiges M9ATT:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 970 ml destilliertes Wasser
  • Autoklaven-Behandlung bei 20# 30 Minuten
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml 1 M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 1,6 ml 25 mg/ml L-Tryptophan und
  • L-Tyrosin
  • Vollständiger M9ATT-Agar:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 470 ml destilliertes Wasser
  • Autoklavenbehandlung in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten.
  • Flasche 2:
  • 15 g DIFCO-Agar
  • 500 ml destilliertes Wasser
  • Autoklavenbehandlung in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten.
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 1,6 ml 25 mg/ml L-Tryptophan und L-Tyrosin
  • Vollständiger M9ATTF-Agar:
  • Herstellen von M9ATT-Medium, wie oben beschrieben.
  • Hinzugeben von 1,6 ml von 25 mg/ml L-Phenylalanin zusammen mit anderen Zusätzen zu Flasche 1.
  • Testplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATT-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 l geschmolzenen. Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml der Übernachtkultur von HE628/pLW3-210 (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1).
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll (Cat. Nr. MS12450).
  • Umkehrplatten:
  • 1. Kombinieren der M9ATTF-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 l geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 nie einer Übernachkultur von HE628/pLW3-210 (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1).
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden 9 · 9 Zoll sterilen Sumilon-Biotrog (Cat. Nr. MS12450).
  • Man ließ das Medium in den Platten 30 Minuten fest werden und trocknen. Testproben (25 ul) wurden sowohl auf die Testplatte als auch die Umkehrplatte in Probenbohrungen (144, 5 mm Durchmesser in 12 · 12-Reihen) hinzugegeben. Die Platten wurden aber Nacht bei 37ºC inkubiert und dann untersucht, um die Zonen der Hemmung der angepassten Test- und Umkehr-Platten zu vergleichen. Aktive Verbindungen zeigen größere Hemmzonen auf der Testplatte als auf der Umkehrplatte.
    • Prüfungsergebnisse
  • Die Extinktion (OD&sub6;&sub0;&sub0;) der Übernachtkultur von HE628/pLW3-210 nach einer 100-fachen Verdünnung betrug etwa 1,21±0,04. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37ºC zeigte eine wie oben zubereitete Platte ein vollständiges, zusammenlaufendes Wachstum von HE628/pLW3-210.
  • Als ein Vergleich wurden dreiundzwanzig antimikrobielle Verbindungen mit bekannten Wirkungsarten, die nicht die Hemmung von DAHP-Synthase einschließen, erhalten von BBL auf 0,64 cm (1/4")-Papierscheiben, zum Testen von HE628/pLW3-210 eingesetzt. Phenylalanin wirkte keiner dieser getesteten Verbindungen entgegen.
  • Zusätzlich wurde eine Liste von Verbindungen, die verschiedene Naturprodukt-Antibiotika und eine Vielfalt chemischer Strukturen repräsentieren, gegen HE628/pLW3-210 getestet. Siehe Tabelle V, Beispiel 1. Phenylalanin wirkte keiner dieser Verbindungen entgegen.
    • Beispiel 5 - Prüfung auf Mechanismus-Grundlage auf Inhibitoren von Dihydrodipicolinat-Synthase (DHPS) Materialien und Methoden
  • Der E. coli-Stamm AT997 (P. Yeh, A. M. Sicard und A. J. Sinskey (1988), Mol Gen. Genet. 212: 105-111) hat aufgrund einer Mutation im dapA-Gen einen Mangel an DHPS-Aktivität. Als ein Ergebnis benötigt dieser Stamm Diaminopimelinsäure zum Wachstum. Der Defekt wird nicht durch Lysin komplementiert, weil Diaminopimelat auch für die Zellwand-Biosynthese benötigt wird. Diese Prüfung kann daher auf reicher Brühe statt auf Minimalmedien ausgeführt werden. Dieser Stamm hat auch die imp-Mutation, die eine erhöhte Membran-Permeabilität verursacht. Die Konstruktion eines imp-Stammes ist in Beispiel 1 beschrieben. Der genetische Defekt im dapA-Gen in diesem Stamm wurde durch Transformieren des Stammes mit dem Plasmid pZMDHPS5 (D. A. Frisch, A. M. Tommey, B. G. Gegenbach und D. A. Somers (1991), Mol Gen. Genet. 22: 287-293), einem pUC19-Vektor, enthaltend die Mais-cDNA für DHPS unter der Kontrolle des lac-Promoters komplementiert. pZMDHPS5 wies auch das bla-Gen für Resistenz gegen Ampicillin auf. Der mutante E. coli-Stamm, der das pZMDHPS5-Plasmid enthielt, wurde als DHPS/AT997 bezeichnet.
  • Ein Übernachtkultur von DHPS/AT997 E. coli-Zellen wurde bei begonnen aus einer einzelnen Kolonie oder aus Glycerin-Vorrat (gelagert bei -80ºC) und gezüchtet in 50 ml LBA (Luriabrühen-Grundlage) unter Schütteln bei 37ºC.
  • Testplatten von LBA-Agar und Umkehrplatten von LBADap-Agar wurden folgendermaßen zubereitet:
    • Medien
  • LBA:
  • 25 g GIBCO/BRL Luriabrühen-Grundpulver
  • 1 l destilliertes Wasser
  • Autoklaven-Behandlung von 500 ml in 1 l-Flaschen bei 20# 30 Minuten
  • Nach dem Abkühlen wurden 0,5 ml 100 mg/ml Ampicillin-Vorrat zu jeder Flasche hinzugegeben.
  • LBA-Agar:
  • 25 g GIBCO/BRL Luriabrühen-Grundpulver
  • 15 g Bacto-Agar
  • 1 l destilliertes Wasser
  • Autoklaven-Behandlung von 500 ml in 1 l-Flaschen bei 20# 30 Minuten
  • Vor dem Gießen der Platten wurden 0,5 ml 100 mg/ml Ampicillin-Vorrat zu jeder Flasche hinzugegeben.
  • LBADap-Agar:
  • 25 g GIBCO/BRL Luriabrühen-Grundpulver
  • 15 g Bacto-Agar
  • 1 l destilliertes Wasser
  • Autoklaven-Behandlung von 500 ml in 1 l-Flaschen bei 20# 30 Minuten
  • Vor dem Gießen der Platten wurden 0,5 ml 100 mg/ml Ampicillin-Vorrat zu jeder Flasche hinzugegeben und 25 mg D,L-α,ε-Diaminopimelinsäure (Sigma).
  • Testplatten:
  • 1. 5U0 ml LBA-Agar, geschmolzen
  • 2. Abkühlen auf 45ºC.
  • 3. Hinzugeben von 5 ml der Übernachtkultur von DHPS/AT997 (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1) zu jeder Flasche.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll.
  • Umkehrplatten:
  • 1. 500 ml LBADap-Agar, geschmolzen.
  • 2. Abkühlen auf 45ºC.
  • 3. Hinzugeben von 5 ml einer Übernachkultur von DHPS/AT997 (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1) zu jeder Flasche.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden 9 · 9 Zoll sterilen Sumilon-Biotrog.
  • Man ließ das Medium in den Platten 30 Minuten fest werden und trocknen. Testproben (25 14) wurden sowohl auf die Testplatte als auch die Umkehrplatte in Probenbohrungen (144, 5 cm Durchmesser in 12 · 12-Reihen) hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und dann untersucht, um die Zonen der Hemmung der angepassten Test- und Umkehr-Platten zu vergleichen. Aktive Verbindungen zeigen größere Hemmzonen auf der Testplatte als auf der Umkehrplatte.
    • Prüfungsergebnisse
  • Die Extinktion bei 600 nm einer Übernachtkultur von DHPS/AT997 in LBA, gezüchtet wie beschrieben, betrug etwa 1,0 ± 0,11. Wie oben beschrieben zubereitete Platten zeigen ein zusammenfließendes Wachstum von DHPS/AT997 nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht.
  • Eine Reihe standardgemäßer antimikrobieller Verbindungen, erhalten von BBL auf 0,64 cm (1/4")-Papierscheiben, wurden gegen DHPS/AT997 getestet. Siehe Tabelle IV, Beispiel 1. Keine dieser Verbindungen wirkte Diaminopimelinsäure entgegen. Zusätzlich wurde eine Liste von Naturprodukt-Verbindungen, die verschiedene Antibiotika und Chemie repräsentiert, gegen DHPS/AT997 getestet. Siehe Tabelle V, Beispiel 1. Keine dieser Verbindungen wirkte Diaminopimelinsäure entgegen.
    • Beispiel 6- Prüfung auf Mechanismus-Grundlage für Inhibitoren von Phosphoribosyl- Anthranilat-Transferase (PAT)- Materialien und Verfahren
  • Der E. coli-Stamm trpD9923, erhalten vom E. coli Genetics Stock Center, Yale Universität, hat aufgrund einer Mutation im trpD-Gen einen Mangel an PAT-Aktivität. Dieser Stamm benötigt zum Wachstum Tryprophan. Dieser genetische Defekt wurde durch Transformieren des trpD-E. coli-Stammes mit dem Plasmid pATC13, erhalten von Dr. Rob Last (Boyce Tompson Institute), komplementiert. pACCT13 ist ein λYES-Vektor, enthaltend die Arabidopsis-cDNA für PAT unter der Kontrolle des lac-Promoters (A. D. Rose et al., Plant Physiol., 1: 582-592 (1992)). Der mutante E. coli-Stamm, der das PRT-Gen aufwies, wurde auch dahingehend modifiziert, dass er die imp-Mutation für erhöhte Membran-Permeabilität (detaillierter in Beispiel 1 beschrieben) aufwies. pACT13 enthielt auch das bla-Gen für Resistenz gegen Ampicillin. Der mutante E. coli-Stamm mit dem pACT13-Plasmid wurde als PAT/trpD bezeichnet.
  • Eine Übernachtkultur von PAT/trpD-E. coli-Zellen wurde von einer einzelnen Kolonie oder aus Glycerin-Vorrat (gelagert bei -80ºC) begonnen und in 50 ml M9A unter Schütteln bei 37ºC gezüchtet. Testplatten von M9A-Agar und Umkehrplatten, von M9AW-Agar, wurden folgendermaßen zubereitet:
    • Medien
  • Vollständiges flüssiges M9A:
  • Flasche 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 970 ml destilliertes Wasser
  • Autoklaven-Behandlung bei 20# 30 Minuten
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml 1 M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml 5 mg/ml Tetracyclin
  • Vollständiger M9A-Agar:
  • Flaische 1:
  • 10 g M9-Grundpulver (GIBCO)
  • 470 ml destilliertes Wasser
  • Autoklavenbehandlung in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten.
  • Flasche 2:
  • 15 g DIFCO-Agar
  • 500 ml destilliertes Wasser
  • Autoklavenbehandlung in der 1 l-Flasche bei 20# 30 Minuten.
  • Hinzugeben zu Flasche 1 vor der Verwendung:
  • 10 ml 20% Glucose
  • 10 ml 5% NaCl
  • 10 ml 0,01 M CaCl&sub2;
  • 1 ml 1 M MgSO&sub4;
  • 2,25 ml 50 mg/ml Thiamin
  • 0,75 ml 100 mg/ml Ampicillin
  • 2,0 ml 5 mg/ml Tetracyclin
  • Vollständiger M9AW-Agar:
  • Herstellen von M9A-Medium, wie oben beschrieben.
  • Hinzugehen von 1,6 ml von 25 mg/ml Tryptophan zusammen mit anderen Zusätzen zu Flasche 1.
  • Testplatten:
  • 1. Kombinieren der M9A-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 l geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml der Übernachtkultur von PAT/trpD (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1) zu jeder Flasche.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden sterilen Sumilon-Biotrog von 9 · 9 Zoll.
  • Umkehrplatten:
  • 1. Kombinieren der M9AW-Flaschen 1 und 2 (geschmolzen), um 1 t geschmolzenen Agarmediums herzustellen.
  • 2. Abkühlen auf 50ºC.
  • 3. Hinzugeben von 10 ml einer Übernachkultur von PAT/trpD (OD&sub6;&sub0;&sub0; ~ 1) zu jeder Flasche.
  • 4. Gießen von 150 ml in jeden 9 · 9 Zoll sterilen Sumilon-Biotrog.
  • Man ließ das Medium in den Platten 30 Minuten fest werden und trocknen. Testproben (25 ul) wurden sowohl auf die Testplatte als auch die Umkehrplatte in Probenbohrungen (144,5 cm Durchmesser in 12 · 12-Reihen) hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und dann untersucht, um die Zonen der Hemmung der angepassten Test- und Umkehr-Platten zu vergleichen. Aktive Verbindungen zeigen größere Hemmzonen auf der Testplatte als auf der Umkehrplatte.
    • Prüfungsergebnisse
  • Die Extinktion bei 600 nm einer Übernachtkultur von PAT/trpD in M9A, wie beschrieben gezüchtet, betrug etwa 1,0 ± 0,14. Wie oben beschrieben zubereitete Platten zeigten zusammenfließenden Wachstum von PAT/trpD nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC.
  • Eine Reihe standardgemäßer antimikrobieller Verbindungen, erhalten von BBL auf 0,64 cm (1/4")-Papierscheiben (siehe Tabelle IV, Beispiel 1), wurde gegen PAT/trpD getestet. Tryptophan wirkte keiner dieser Verbindungen entgegen. Zusätzlich wurde eine Liste natürlich vorkommender Verbindungen, die verschiedene Antibiotika und Chemie repräsentieren, gegen PAT/trpD (siehe Tabelle V, Beispiel 1) getestet. Tryptophan wirkte keiner dieser Verbindungen entgegen.
  • Weiter wurde ein Sammlung verschiedener Gärungs-Medien getestet. Keines dieser Medien unterstützte das Wachstum des nicht-transformierten trpD-E.coli-Stammes, noch hemmten sie das Wachstum von trpD- oder PAT/trpD-Stämmen.
  • Schließlich wurde eine Vielfalt von Verbindungen, die eine Liste standardgemäßer Herbizide repräsentieren, überprüft (sie die folgende Tabelle VI). Keine der aufgeführten Verbindungen war bei dieser Prüfung ein aktiver Inhibitor.
    • TABELLE VI - HERBIZIDE Verbindung Verbindung
  • F3814-525-Perfluidon Benefin
  • 2-014-1 Oxadiazon 2,3,5-Trichlorbenzoesäure
  • Simazin (CL15395) DACTHAL
  • Norea (CL2608) Desmedipham
  • Monuron Trifluralin
  • Fenuron DDT (CL2013)
  • Planavin Atraton
  • Mefluidid Concep II
  • CMU (CL14255) Propazin
    • TABELLE VI (FORTSETZUNG)
  • Paraquat Triallat
  • Neburon Phenmedipham
  • Maleinsäure-Hydrazid (CL6374) Bifenox
  • Sivexsäure (CL35861) PPG844
  • Diphenamid (CL87417) CDEC (Vegedex)
  • Tebuthuiron Bialaphos
  • Norflurazon Thiobencarb (Bolero tech)
  • Cypromid Isopropalin
  • CIPC Prefar
  • Siduron Diallate (Avadex tech)
  • Norflurazon Tillam
  • IPC CDEA (CL25224)
  • Mefluidid (CL117204), EMBARK

Claims (13)

1. Verfahren zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die ein für das Pflanzenwachstum erforderliches, wesentliches Pflanzengen-Produkt hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Exprimieren eines Pflanzengens in einem Mikrobenstamm, das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codiert, das das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit eines Nahrungszusatzes gestattet, der ansonsten für das Wachstum des Mikrobenstammes erforderlich ist;
b) Erhalten des in a) beschriebenen Stammes unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der das wesentliche Pflanzengen-Produkt exprimiert, geeignet, aber ungeeignet sind für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des wesentlichen Pflanzengen-Produktes und (2) Umkehrbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des wesentlichen Pflanzengen-Produktes geeignet sind, wodurch wachsende Test- und Umkehrkulturen des in a) beschriebenen Mikrobenstammes produziert werden;
c) Inberührungbringen der in b) produzierten wachsenden Test- und Umkehrkulturen mit einer auf das Pflanzenwachstum hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung und
d) Identifizieren eine Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, das Wachstum des Mikrobenstammes unter Umkehrbedingungen aber nicht hemmt, wobei diese Verbindung eine ist, die das für das Pflanzenwachstum erforderliche wesentliche Pflanzengen-Produkt hemmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codierende Gen für die gesamte oder einen Teil von Pflanzen-Phosphoribosylanthranilat-Transferase codiert oder worin das Gen, das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codiert, für die gesamte oder einen Teil von Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase codiert, oder worin das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codierende Gen für die gesamte oder einen Teil von Pflanzen-Glutamin-Synthase codiert, oder worin das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codierende Gen für die gesamte oder einen Teil von Pflanzen-3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase codiert, oder worin das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codierende Gen für die gesamte oder einen Teil von Pflanzen-Dihydrodipicolinat-Synthase codiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die Pflanzen-Phosphoribosylanthranilat-Transferase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Pflanzengen exprimiert, das für Phosphoribosylanthranilat-Transferase codiert, unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes geeignet sind, der Phosphoribosylanthranilat-Tranferase exprimiert, bei denen aber Tryptophan und andere Verbindungen fehlen, die bei dem biosynthetischen Weg zu Tryptophan nach der durch Anthranilat-Synthase katalysierten Reaktion erzeugt werden, wobei der Mikrobenstamm bei Abwesenheit von entweder Phosphoribosylanthranilat- Transferase oder von Verbindungen, die im biosynthetischen Weg zu Tryptophan nach der durch Anthranilat-Synthase katalysierten Reaktion erzeugt werden, nicht zum Wachsen in der Lage ist und (2) Umkehrbedingungen, die Tryptophan oder andere Verbindungen umfassen, die im biosynthetischen Weg zu Tryptophan nach der durch Anthranilat-Synthase katalysierten Reaktion produziert werden, wodurch Test- und Umkehrkulturen erzeugt werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf Phosphoribosylanthranilat-Transferase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei diese Verbindung eine ist, die Phosphoribosylanthranilat-Transferase hemmt.
4. . Verfahren nach Anpruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Gen exprimiert, das für Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase codiert, unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase exprimiert, geeignet sind, wobei es unter den Testbedingungen an einer Aminosäure mit verzweigter Kette fehlt, die für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase erforderlich ist und (2) Umkehrbedingungen, die die Aminosäure mit verzweigter Kette umfassen, die für das Wachstum des Bakterienstammes bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase erforderlich ist; wodurch Test- und Umkehrkulturen erzeugt werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf Pflanzen- Acetohydroxysäure-Synthase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei diese Verbindung eine ist, die Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase hemmt.
5. Verfahren nach Anpruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Gen exprimiert, das für Pflanzen-3-Desoxy-d-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase codiert, unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat- Synthase exprimiert, geeignet sind, aber ungeeignet sind für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase, wobei der Mikrobenstamm bei Abwesenheit von 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin zum Wachstum nicht in der Lage ist und (2) Umkehrbedingungen, umfassend Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin, wodurch Test- und Umkehrkulturen erzeugt werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf Pflanzen- 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei diese Verbindung eine ist, die 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonat-7-phosphat- Synthase hemmt.
6. Verfahren nach Anpruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die Pflanzen-Glutamin-Synthetase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Gen exprimiert, das für Pflanzen-Glutamin-Synthetase codiert, unter: (1) Testbedingungen, bei denen Glutamin fehlt, die geeignet sind zum Wachstum des Mikrobenstammes, der Glutamin-Synthetase exprimiert, wobei der Mikrobenstamm bei Abwesenheit von sowohl Glutamin-Synthetase als auch Glutamin zum Wachstum nicht in der Lage ist, und (2) Umkehrbedingungen, umfassend Glutamin, wobei Test- und Umkehrkulturen produziert werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf Glutamin-Synthetase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung, und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, die aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei die Verbindung eine ist, die Pflanzen-Glutamin-Synthetase hemmt.
7. Verfahren nach Anpruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die Pflanzen-Dihydrodipicolinat-Synthase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Gen exprimiert, das für Pflanzen-Dihydrodipicolinat-Synthase codiert, unter: (1) Testbedingungen, bei denen Diaminopimelinsäure fehlt, die geeignet sind zum Wachstum des Mikrobenstammes, der Dihydrodipicolinat-Synthase exprimiert, wobei der Mikrobenstamm bei Abwesenheit von sowohl Dihydrodipicolinat- Synthase als auch Diaminopimelinsäure zum Wachstum nicht in der Lage ist, und (2) Umkehrbedingungen, umfassend Diaminopimelinsäure, wodurch Test- und Umkehrkulturen produziert werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf Dihydrodipicolinat-Synthase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung, und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei die Verbindung eine ist, die Pflanzen-Dihydrodipicolinat-Synthase hemmt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die ein für das Pflanzenwachstum wesentliches Pflanzengen-Produkt eines herbizid-resistenten Mutanten hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Exprimieren eines Mutanten-Pflanzengens in einem Mikrobenstamm, das für ein herbizidresistentes, wesentliches Pflanzenprodukt codiert, das das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit eines Nahrungszusatzes gestattet, der ansonsten für das Wachstum des Mikrobenstammes erforderlich ist;
b) Erhalten des in a) beschriebenen Mikrobenstammes unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der das herbizid-resistente, wesentliche Pflanzengen-Produkt exprimiert, geeignet sind, die aber nicht geeignet sind für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des herbizid-resistenten, wesentlichen Pflanzengen-Produktes und (2) Umkehrbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des herbizid-resistenten, wesentlichen Pflanzengen-Produktes geeignet sind, wodurch wachsende Test- und Umkehrkulturen des in a) beschriebenen Mikrobenstammes produziert werden;
c) Inberührungbringen der in b) produzierten wachsenden Test- und Umkehrkulturen mit einer auf das Pflanzenwachstum hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung und
d) Identifizieren eine Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, das Wachstum des Mikrobenstammes unter Umkehrbedingungen aber nicht hemmt, wobei diese Verbindung eine ist, die das für das Pflanzenwachstum erforderliche herbizid-resistente, wesentliche Pflanzengen-Produkt hemmt.
9. Verfahren nach Anspruch 8 zum Herausfinden und Identifizieren einer Verbindung, die imidazolidon-resistente Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Erhalten eines Mikrobenstammes, der ein Pflanzengen exprimiert, das für imidazolidonresistente Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase codiert, unter: (1) Testbedingungen, die für das Wachstum des Mikrobenstammes, der imidazolidon-resistente Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase exprimiert, geeignet sind, wobei bei den Testbedingungen eine verzweigtkettige Aminosäure fehlt, die für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase erforderlich ist, und (2) Umkehrbedingungen, umfassend die verzweigtkettige Aminosäure, die für das Wachstum des Bakterienstammes bei Abwesenheit von Acetohydroxysäure-Synthase erforderlich ist, wodurch Test- und Umkehrkulturen produziert werden;
b) Inberührungbringen der in a) erzeugten Test- und Umkehrkulturen mit einer auf imidazolidon-resistente Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase hemmende Eigenschaften zu testenden Verbindung, und
c) Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum des Mikrobenstammes unter Testbedingungen hemmt, aber das Wachstum des Mirobenstammes unter Umkehrbedingungen nicht hemmt, wobei die Verbindung eine ist, die imidazolidon-resistente Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase hemmt.
10. Mikrobenstamm, der das gesamte oder einen Teil eines Pflanzengens exprimiert, das für eine von Pflanzen-Phosphoribosylanthranilat-Transferase, Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase, Pflanzen-Glutamin-Synthase, Pflanzen-3-Desoxy-d-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase oder Pflanzen-Dihydrodipicolinat-Synthase codiert.
11. Mikrobenstamm nach Anspruch 10, worin das Pflanzengen für das gesamte oder einen Teil eines herbizid-resistenten, wesentlichen Pflanzenproduktes codiert.
12. Mikrobenstamm nach Anspruch 11, worin das Gen für die gesamte oder einen Teil von imidazolidon-resistenter Pflanzen-Acetohydroxysäure-Synthase codiert.
13. Verfahren zum Identifizieren von Mikrobenzellen, die ein wesentliches Pflanzengen-Produkt eines Mutanten exprimieren, das für eine Verbindung resistent ist, die das Pflanzengen-Produkt des Wildtyps hemmt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Exprimieren eines Mutanten-Pflanzengens in einem Mikrobenstamm, das für ein wesentliches Pflanzenprodukt codiert, das das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit eines Nahrungszusatzes gestattet, der ansonsten für das Wachstum des Mikrobenstammes erforderlich ist;
b) Erhalten des in a) beschriebenen Mikrobenstammes unter für das Wachstum des Mikrobenstammes, der das wesentliche Pflanzengen-Produkt exprimiert, geeignet sind, die aber ungeeignet sind für das Wachstum des Mikrobenstammes bei Abwesenheit des wesentlichen Pflanzengen-Produktes, wodurch eine wachsende Kultur des Mikrobenstammes produziert wird;
c) Inberührungbringen der in b) produzierten wachsenden Kultur mit einer genügenden Menge eines Inhibitors des wesentlichen Pflanzengen-Produktes des Wildtyps, um die Hemmung des Wachstums des Mikrobenstammes zu verursachen, der das wesentliche Pflanzengen-Produkt des Wildtyps exprimiert, und
d) Identifizieren von Mikrobenzellen, die in Gegenwart des Inhibitors des wesentlichen Pflanzengen-Produktes des Wildtyps unter in b) beschriebenen Bedingungen wachsen, wobei die identifizierten Zellen solche sind, die ein wesentliches Mutanten-Pflanzengen-Produkt exprimieren, das resistent ist gegenüber einer Verbindung, die das wesentliche Pflanzengen- Produkt des Wildtyps hemmt.
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