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Die vorliegende Erfindung betrifft bioelektrochemische Reaktionen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Überwachung eines Analyten unter
Verwendung einer elektrochemischen Zelle, um die Reaktion eines gasförmigen
oder dampfförmigen Substrats zu bestimmen. Die Erfindung betrifft auch neue
Medien zur Durchführung bioelektrochemischer Reaktionen und deren Verwendung
in Enzym-Elektroden.
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Die Verwendung einer Enzym-Elektrode zur Durchführung und Überwachung
bioelektrochemischer Reaktionen ist wohlbekannt. Im allgemeinen werden solche
Reaktionen in wäßriger Lösung durchgeführt. Es ist auch bekannt, Enzym-
Elektroden in organischen oder mikro-wäßrigen Lösungsmitteln einzusetzen, wie in
WO 89/04364 zum Nachweis von Reaktionen von Substraten in der flüssigen Phase
beschrieben.
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Es sind Verfahren zur Überwachung von Reaktionen in der Gasphase
bekannt. Die Eignung von Gassensoren zur Überwachung von gasförmigen Analyten
wird klar, wenn man nicht nur die Anzahl der toxischen oder gefährlichen Gase, die
aus natürlichen oder anthropogenen Quellen stammen, sondern auch
Anwendungen bei der Prozeßsteuerung in Betracht zieht. Herkömmliche
Gassensor-Vorrichtungen sind nicht-biologisch und verwenden im allgemeinen optische
oder elektrochemische Metalloxid-Halbleiterbauelemente. Diese Gerätetypen können
jedoch in einigen Fällen unempfindlich sein und können eine relativ schlechte
Selektivität für einen Analyten, der in komplexen Mischungen, wie z. B. organischen
Dämpfen, nachgewiesen werden soll, aufweisen. Obwohl ein höheres Maß
elektronischer Verfeinerung eine gewisse Kompensation für diese Nachteile bieten
könnte, kann dies zu erhöhten Produktionskosten führen.
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Amperometrische elektrochemische Gassensoren sind ebenfalls bekannt. Sie
werden gewöhnlich mit niedrigerer elektrischer Leistung als Halbleiter-Gassensoren
betrieben und arbeiten bei Raumtemperatur. Wiederum kann diesen Sensoren die
Selektivität für einen bestimmten Analyten fehlen.
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Ein Beispiel eines solchen nicht-biologischen Gassensors wird in DE-A-
40 32 599 beschrieben. In dieser Referenz ist eine dreidimensionale Polyurethan-
Matrix, die einen Elektrolyten und einen Katalysator enthält, an einer Testelektrode
positioniert. Der zwischen der Testelektrode und einer zweiten Elektrode,
Gegenelektrode, erzeugte Strom hängt von dem Partialdruck der Testkomponenten
ab.
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Diese Referenz betrifft jedoch keine bioelektrochemischen Reaktionen und
deshalb werden die speziellen Anforderungen zur Erhaltung von Biorezeptoren oder
Biomimetika in der festen oder halbfesten Phase, welche immer noch den Kontakt
mit dem gasförmigen Substrat ermöglichen werden, nicht angesprochen.
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In einem Versuch zur Erhöhung der Selektivität können nicht-biologische
Sensoren einen sorgfältig ausgewählten flüssigen Elektrolyten verwenden, welcher
eine gewisse Form der Selektion für einen Ziel-Analyten bietet. Beispielsweise
können Parameter wie Löslichkeit von Gasen, pH-Wert des Elektrolyten, chemische
Reaktionen oder Komplexbildung zwischen gelösten Stoffen und Analyt eingesetzt
werden, um die Lösung einer Form einer Analyt-Spezies zu favorisieren.
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Ein alternatives Verfahren zur Erhöhung der Selektivität bei Sensoren ist
jedoch die Inkorporation eines biologischen Katalysators in den Sensor. Solche
Sensoren sind bekannt, es ist jedoch gewöhnlich erforderlich, daß sich der
gasförmige Analyt vor dem Nachweis in einer voluminösen mobilen flüssigen Phase
löst. Hinsichtlich Beispiele siehe I. Karube et al., Analytica Chemica Acta, 135
(1982), 61-67; M. Hikuma et al., Anal: Chem. (1980) 52, 1020-1024; und L. H.
Goodson und W. B. Jacobs in Enzyme Engineering, Bd. 2, Plenum Press, New York,
1974, S. 393, herausgegeben von E. K. Pye und L. B. Wingard Jr. Der flüssige
Elektrolyt, der in diesem Gerätetyp eingesetzt wird, wird gewöhnlich durch die
physiologischen Anforderungen des Biokatalysators definiert und Faktoren wie pH-
Wert der Lösung, Ionenstärke etc. müssen in Betracht gezogen werden, wenn die
Bedingungen für die Biokatalyse geeignet bleiben sollen.
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Untersuchungen in der Elektrochemie wurden durchgeführt In J. Chem. Soc.
1988, 110, S. 2321-2322 berichten B. N. Oliver et al. über Untersuchungen bezüglich
der Festphasen-Voltammetrie eines Proteins und eines Polymer-Lösungsmittels. Das
Redoxprotein, Cytochrom C, wurde in einem halb-starren Polymer-Film gelöst. Bei
Anfeuchtung oder Zugabe von flüssigen Mikrotröpfchen zu dünnen, ionisch leitenden
Filmen wurde über Elektronentransfer und Diffusionseigenschaften von Cytochrom C
in dem halb-starren Polymerfilm berichtet. Die Autoren regten an, daß diese
Untersuchung verwendet werden könnte, um Festphasen-Biosensoren zu
entwickeln, oder bei der Enzym-Katalyse in fester Phase, es wurde jedoch über
keine weiteren Entwicklungen berichtet.
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Es sind einige Gassensoren bekannt, welche biologische Reaktionen
verwenden. Beispielsweise beschreibt WO 88/01299 ein Verfahren und eine
Apparatur zum Nachweis chemischer Verbindungen in der Gasphase. Ein Enzym in
Verbindung mit einem Farbindikator, welcher auf pH-Wert, Oxidation oder einen
anderen chemischen Stimulus der in der Gasphase nachzuweisenden Verbindung
reagieren kann, wird auf einem organischen oder anorganischen festen Träger
immobilisiert und unter kontrollierten Bedingungen entwässert. Wenn das Enzym
einem Gas ausgesetzt wird, welches die Substanz von Interesse enthält, tritt die
Farbänderung ein. Der als Beispiel angegebene feste Träger für das Enzym ist
mikrokristalline Cellulose. Diese Referenz bezieht sich jedoch nicht auf die
Verwendung einer elektrochemischen Zelle zur Überwachung der Reaktion und
deshalb wird dem Problem, einen geeigneten Elektrolyten für eine solche
Überwachung bereitzustellen, nicht begegnet.
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In US-4525704 wird ein enzymatischer Gassensor für ein toxisches Gas
beschrieben. Er umfaßt ein Pufferreservoir, enthaltend eine Pufferlösung, welche
dazu dient, das Enzym in seinem aktiven Zustand zu halten, wobei die Enzyme
durch kovalente Bindung an Glasperlen immobilisiert sind. In dieser Vorrichtung wird
das Substrat für die Reaktion mit dem Enzym in der Apparatur als ein mit dem
Substrat getränktes Filterpapier bereitgestellt. In Anwesenheit eines Analyten,
welcher ein toxisches Gas ist, wird die elektrochemische Reaktion des
Flüssigphasen-Substrats mit dem Enzym inhibiert.
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In "Microbial Gas Metabolism", herausgegeben von R. K. Poole und C. S. Daw,
veröffentlicht von Academic Press 1985, Seiten 161 bis 170, beschreiben A. P. F.
Turner et al. einen Kohlenmonoxid-Sensor, der auf Kohlenmonoxid sowohl in
Lösung als auch als Gas reagiert. Der Sensor wird detaillierter in Analytica Chimica
Acta, 163 (1984) 161-174 beschrieben. Bei diesen Studien findet die Umsetzung von
Enzym und Substrat in flüssiger Phase statt.
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Wie beschrieben, gibt es ferner Probleme hinsichtlich der Stabilität der
Apparatur und es sind stabilere Verfahren erforderlich, um kommerziell geeignete
Vorrichtungen herzustellen.
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Elektrochemische Gassensoren auf Basis eines flüssigen Elektrolyten teilen
jedoch die inhärenten Nachteile von flüssigen Systemen: begrenzte
Gebrauchsfähigkeitsdauer aufgrund von Lösungsmittelverdampfung, Elektrodenkorrosion und
Verlust von Sensorkomponenten. Elektrodenkorrosionsreaktionen können Gase
erzeugen, welche Dichtungen beschädigen und schließlich einen Elektrolytaustritt
verursachen können.
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Obwohl Enzym-Elektroden wohlbekannt sind, ist derzeit kein brauchbares
Verfahren beschrieben worden, welches die Überwachung eines Analyten unter
Verwendung einer elektrochemischen Zelle ermöglichen wird, wenn der Analyt kein
Inhibitor für die Enzymaktivität ist und wenn das Enzym nicht in der flüssigen Phase
gehalten wird.
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Die Erfinder fanden alternative Medien zur Überwachung eines gasförmigen
oder dampfförmigen Analyten unter Verwendung einer Meßelektrode einer
elektrochemischen Zelle. Diese neue Medien können eingesetzt werden, um Sensoren zur
Verfügung zu stellen, welche die Probleme des Standes der Technik zu überwinden
und eine verbesserte Stabilität und Langlebigkeit der Vorrichtung ermöglichen.
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Die Erfinder haben festgestellt, daß es möglich ist, auf das
Kontaktlösungsmittelmedium zu verzichten, welches zur Bildung der
Elektrolyt/Enzym/Elektrode-Grenzfläche in gegenwärtigen Vorrichtungen eingesetzt wird. Die Erfinder
fanden neue Verfahren, um den Elektrolyt und den biologischen Katalysator an den
Elektroden zu halten und die Funktionsfähigkeit aufrechtzuerhalten.
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Nachweis eines Analyten in der Gas- oder Dampfphase bereitgestellt, umfassend
das Kontaktieren eines gasförmigen oder dampfförmigen Analyten mit einer
Meßelektrode einer elektrochemischen Zelle, wobei ein biologisches Molekül, ausgewählt
aus der Gruppe, die Synzyme, Antikörper, bindende Proteine und Enzyme umfaßt,
auf einem Träger an der Meßelektrode gehalten wird und der Träger ein
Elektrolytsalz umfaßt, so daß ein Substrat das biologische Molekül kontaktiert und unter
Hervorrufung eines elektrischen Antwort reagiert; und das Messen dieser
elektrischen Antwort der Zelle, wobei die Antwort zur Konzentration des Analyten in
Beziehung gebracht werden kann und wobei das biologische Molekül in der festen
oder halbfesten Phase vorliegt.
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Somit wird ein Verfahren zur Überwachung bioelektrochemischer Reaktionen
in der Gasphase bereitgestellt, welches sich zum Nachweis von Inhibitoren für das
biologische Molekül eignet, sich jedoch insbesondere auch zur Überwachung von
Reaktionen eignet, bei denen der Analyt kein Toxin für den Biorezeptor oder das
Biomimetikum ist, und die nachgewiesene elektrische Antwort auf das Stattfinden
einer Reaktion, nicht auf Inhibierung zurückzuführen ist. Dies erweitert das
Anwendungsgebiet für Gassensoren beträchtlich, welche zum Nachweis
verschiedener Gase mittels elektrochemischer Überwachung eingesetzt werden
können. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nimmt daher die
elektrische Antwort der Zelle mit der Exposition gegenüber einer zunehmenden
Analyt-Konzentration zu.
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Bei biokatalytischer Elektrochemie in flüssiger Lösung können Lösungsionen,
Reaktionssubstrat und Produkt in eine Substanz-Matrix ein- und austreten, sei es,
daß das System eine poröse Elektrodenstruktur verwendet oder daß die Substanz-
Matrix einen Elektrodenkörper umfaßt. In einem Lösungsmedium steht der
Biokatalysator in Kontakt mit frei beweglichen Flüssigkeiten. Diese Erfindung ermöglicht es,
daß kein Kontakt einer voluminösen Lösung mit dem biologischen Molekül auf dem
Träger stattfindet.
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Es wurde festgestellt, daß das Lösungsmittelmedium deshalb vollständig
weggelassen werden kann, was eine ionisch leitende Matrix mit aktiver biologischer
Komponente in direktem Kontakt mit der Gas- oder Dampfphase beläßt. Es wurde
festgestellt, daß elektrochemische Reaktionen durch gasförmige Spezies bewirkt
werden konnten, welche zur Elektrode diffundierten und dort eine Reaktion erfuhren,
und daß ein inniger Kontakt biologischer Komponenten, wie z. B. Enzyme, mit der
ionischen Matrix erzielt werden konnte, so daß die elektrochemische Reaktion an
biochemische Reaktionen gasförmiger Reaktanten gekoppelt werden konnte.
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Das biologische Molekül kann jedes biologische Molekül sein, welches an
einen Reaktanten binden und eine nachweisbare elektrochemische Reaktion
ergeben wird. Es kann ein synthetisch hergestelltes chemisches Analogon eines
biologischen Rezeptors sein, z. B. Synzyme. Andere Beispiele des biologischen Moleküls
sind Antikörper, bindende Proteine und biologische Katalysatoren, wie z. B. Enzyme.
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Das biologische Molekül wird im allgemeinen ein biologischer Katalysator, wie
z. B. ein Enzym, sein. Wenn das biologische Molekül ein Enzym ist oder ein
synthetisches Äquivalent davon, kann das Substrat ein Enzym-Substrat oder ein
Enzym-Cofaktor sein. Das biologische Molekül befindet sich im festen oder
halbfesten Zustand. Dieser Ausdruck soll bedeuten, daß es nicht in der flüssigen
Phase, insbesondere nicht in wäßriger Lösung, vorliegt. Das biologische Molekül
wird im allgemeinen in einem im wesentlichen entwässerten Zustand vorliegen. Es
wurde festgestellt, daß zur Aufrechterhaltung der Aktivität des biologischen Moleküls
eine Hydrathülle um das biologische Molekül erforderlich ist. Diese ist notwendig, um
die dreidimensionale Struktur des biologischen Moleküls zu erhalten, welche zur
Aufrechterhaltung seiner Aktivität essentiell ist. Somit wird das biologische Molekül,
obwohl es im wesentlichen entwässert sein kann, ausreichend hydratisiert sein, um
den erforderlichen Hydratationsgrad zur Aufrechterhaltung der Aktivität zu erhalten,
und wird nicht wasserfrei sein.
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Die Erfindung eignet sich besonders zur Überwachung einer Reaktion, in der
das Substrat für die Reaktion mit dem biologischen Molekül von dem Analyten
stammt. Eine Möglichkeit besteht darin, daß der Analyt das Substrat für das
biologische Molekül ist. Weitere Möglichkeiten bestehen darin, daß das biologische
Molekül die Überführung eines Analyten in ein Produkt katalysiert, welches direkt an
der Elektrode eine elektrochemische Reaktion erfährt; oder daß das biologische
Molekül eines ist, welches die Oxidation oder Reduktion des Substrats bewirken
kann, gegebenenfalls unter Beteiligung eines Vermittlers, und somit am Transfer von
Elektronen zwischen dem Substrat und der Elektrode beteiligt ist; oder daß der
Analyt auf dem Träger an der Elektrode mit beispielsweise einem Enzym reagiert,
um ein Substrat für die Bindung mit dem biologischen Molekül zu erzeugen.
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Alternativ kann der Analyt ein Inhibitor oder Vorläufer eines Inhibitors für das
biologische Molekül sein.
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Es sind verschiedene feste oder halbfeste Alternativen zur Verwendung von
voluminösen flüssigen Lösungsmitteln als elektrochemische Medien bekannt, die
eingesetzt werden können. Anorganische Materialien, welche untersucht wurden,
sind β-Aluminiumoxid und Silbersalze. Von den organischen festen Alternativen oder
Gel-Alternativen sind geeignete Medien Hydrogele, Ionomere und Polyelektrolyten
oder solvatisierende Polymere.
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Wie von M. Madou und T. Otagawa in "Solid state ionics" (1988), Bd. 28-30,
S. 1653-1659, erläutert, können Hydrogele als wäßrige Elektrolytlösungen, die in
einer polymeren Matrix eingefangen sind, betrachtet werden. Der Widerstand, den
solche Medien aufweisen, ist typischerweise ähnlich dem der eingefangenen
wäßrigen Elektrolytlösungen. Die Verdampfung des Lösungsmittels wird durch die
Polymer-Matrix verlangsamt und kann weiter durch die Inkorporation von
hygroskopischen Materialien, welche die Ionenbewegung innerhalb des Materials
erleichtern, verlangsamt werden. Ein Beispiel wird in DE-A-40 32 599 (oben erörtert)
beschrieben, worin eine dreidimensionale polymere Matrix von Polyurethan gebildet
wird, welche ein organisches Leitersalz enthält. Ein fester Elektrolyt oder Gel-
Elektrolyt kann auch aus Ionomeren und Polyelektrolyten gebildet werden, welche
anionische (z. B. -CF&sub2;SO&sub3;) oder kationische (z. B. -R&sub3;N&spplus;) Gruppen an die
Polymerkette gebunden enthalten, welche als Gegenionen für kleine ungebundene und
potentiell bewegliche Ionen wirken. Ein geeignetes Beispiel ist Nafion, welches ein
Copolymer von Teflon oder Polytetrafluorethylen (PTFE) und
Polysulfenylfluoridvinylether, enthaltend chemisch an ein Fluorkohlenstoffgerüst gebundene
Sulfonsäuregruppen, darstellt.
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Es können auch solvatisierende Polymere eingesetzt werden. Hier besitzt das
trockene Polymer selbst das Vermögen zur Lösung bestimmter Salze und zur
Förderung der Ionenbeweglichkeit. Das Solvatisierungsvermögen ist eine
wesentliche Vorbedingung für eine schnelle Ionenleitung in einem trockenen Polymer.
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Beispiele für diesen Materialtyp umfassen Poly(propylenoxid) (PPO) mit gelösten
Lithiumsalzen (siehe P. J. Smith, Electrochemical Science and Technology of
Polymers (1987), S. 293, herausgegeben von R. G. Linford, Elsevier London).
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Beim Einsatz sollten die Bedingungen an dem Trägermedium geeignet sein,
um die Aktivität des Biorezeptors oder Biomimetikums aufrechtzuerhalten.
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Obwohl feste oder Gel-Elektrolyt-Trägermedien, wie z. B. Enzym-redox-
vermitteltes Gel, Hydroxyethylcellulose und Festpolymer-Elektrolyt-Enzym-Gel, in der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können sie unter Problemen
bezüglich abnehmender Ionenleitfähigkeit oder geringer Bioverträglichkeit im Verlauf
relativ kurzer Zeiträume leiden. In der vorliegenden Erfindung werden
Reaktionsmedien für bioelektrochemische Reaktionen eingesetzt, welche verbesserte Medien
für bioelektrochemische Reaktionen ergeben und insbesondere verbesserte Medien
für die Verwendung bei einer Enzym-Elektrode zur Verwendung in einem Sensor
ergeben.
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Das Trägermedium für die bioelektrochemische Reaktion umfaßt eine feste
Matrix oder Gel-Matrix eines Elektrolytsalzes, wobei ein biologisches Molekül für die
Reaktion auf dem Trägermedium gehalten wird und das Substrat für die Reaktion in
Kontakt mit dem Träger gebracht werden kann, um die Reaktion hervorzurufen.
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Die festen Medien oder Gel-Medien basieren nicht auf einer polymeren
Matrixstruktur und sind im wesentlichen frei von organischem polymerem Material.
Es handelt sich um Strukturen, die von dem Elektrolytsalz selbst gebildet werden. Es
wird angenommen, daß die Medien in Form einer halbfesten, halbkristallinen Matrix
vorliegen, die eine im wesentlichen stabile Struktur aufweist. Sie sind herstellbar
durch Herstellung einer Lösung des Elektrolyten und Trocknen. Somit besteht die
Trägerstruktur im wesentlichen nur aus dem Elektrolyten.
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Die Medien bieten signifikante Vorteile, da die ionisch leitenden Materialien
nicht in Lösung vorliegen. Die verringerte Wasser-Umgebung erhöht deutlich die
Thermostabilität des Biokatalysators bei erhöhten Temperaturen. Ferner eignen sich
die Medien zur Verwendung mit Reaktanten in der Gas- oder Dampfphase und die
Diffusionskoeffizienten in der Gasphase sind um Größenordnungen höher als in
Lösung und deshalb kann bei Verwendung solcher Medien eine empfindlichere und
schnellere Überwachung erreicht werden. Die erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht die
Herstellung einer quantitativen Apparatur, wobei die Antwort zur molaren Menge des
Analyten in dem Testgas oder -dampf in Beziehung steht.
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Diese Medien können deshalb vorteilhafterweise in Sensoren, insbesondere
Gassensoren, eingesetzt werden. Viele gasförmige Analyten zeigen schlechte
Löslichkeit in Lösung, was zu verminderter Empfindlichkeit führen kann, wohingegen
die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Medien dieses Problem verringern.
Ferner kann die Elektrolyt-Matrix hinsichtlich eines speziellen Analyten von Interesse
ausgewählt werden und deshalb bei Verwendung in einem Sensor die
Empfindlichkeit der Vorrichtung erhöhen.
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Ferner könnten solche Gassensoren, welche auf dem Einsatz von
nichtflüssigen Elektrolyten beruhen, nicht unter einem Austritt von Sensorkomponenten
leiden, wie er bei üblichen Flüssigphase-Sensoren angetroffen wird, da die ionisch
leitende Matrix nur mit einer Gasphase in Kontakt gebracht wird, welche den
Analyten zu dem Meßelement bringt.
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Die in der Erfindung eingesetzten Trägermedien sind imstande, die Aktivität
des biologischen Moleküls aufrechtzuerhalten, ergeben elektrische Leitfähigkeit und
sind ausreichend durchlässig, um dem Reaktanten für die Reaktion mit dem
biologischen Molekül das Erreichen des biologischen Moleküls und die Reaktion zu
ermöglichen.
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Es wurde festgestellt, daß bei Bildung einer Matrix eines Elektrolyten die
Struktur der Matrix, die ein halbkristalliner Feststoff ist, dazu tendiert, die
erforderlichen Wassermoleküle zur Aufrechterhaltung der Hydrathülle um das
biologische Molekül einzuschließen. Somit sind die neuen Trägermedien der
vorliegenden Erfindung im wesentlichen frei von Wasser, werden jedoch eine
geringe Konzentration an Wasser enthalten, welche mindestens ausreicht, um die
erforderliche Hydrathülle um das biologische Molekül aufrechtzuerhalten. Somit wird
die Matrix nicht wasserfrei sein.
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Bezüglich der elektrischen Leitfähigkeit dieser Trägermedien wird postuliert,
daß diese auf die Mobilität von Wasserstoff und Hydroxylionen und/oder Pufferionen
innerhalb der Matrix zurückzuführen ist.
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Die Matrix ist auch ausreichend durchlässig, um dem Substrat den Kontakt mit
dem biologischen Molekül und die Reaktion zu erlauben. Somit ermöglichen es die
Massentransfer-Eigenschaften in der ganzen Matrix dem Gas, hindurchzutreten und
das biologische Molekül zu kontaktieren.
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Vorzugsweise bleibt die Durchlässigkeit für den Reaktanten konstant oder im
wesentlichen konstant.
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Die feste Matrix oder Gel-Matrix kann hergestellt werden, indem zunächst eine
Lösung des Elektrolytsalzes in einem Lösungsmittel gebildet wird. Die Lösung des
Salzes zur Herstellung der Matrix kann in einem organischen oder wäßrigen
Lösungsmittel erfolgen, welches das biologische Molekül nicht deaktiviert. Beim
Trocknen bildet sich die Elektrolyt-Matrix. Vorzugsweise wird das Trocknen bei
Raumtemperatur durchgeführt.
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Im allgemeinen wird die Lösung eine konzentrierte Lösung sein, da dies die
erforderliche Trocknungszeit reduziert, obwohl die Trägermedien unter Verwendung
einer beliebigen Lösungskonzentration hergestellt werden können. Das
Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel sein, welches verdampft werden kann, um das
Trocknen unter Bildung der festen Elektrolyt-Matrix oder Gel-Elektrolyt-Matrix zu
ermöglichen.
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Vorzugsweise wird das Trocknen bei Raumtemperatur durchgeführt.
Vorzugsweise ist auch ein Puffer in der Lösung des Elektrolytsalzes eingeschlossen,
um geeignete Bedingungen für die Aktivität des biologischen Moleküls
bereitzustellen. Jedes andere Additiv, welches zur Aufrechterhaltung der Aktivität des
biologischen Moleküls erforderlich ist, kann in diesem Stadium inkorporiert werden.
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Eine Enzym-Vermittler-Verbindung und gegebenenfalls auch das biologische
Molekül selbst kann vor dem Trocknen in die Lösung inkorporiert werden. Wenn das
biologische Molekül eingeschlossen wird, darf die Trocknungstemperatur nicht so
hoch sein, daß die Aktivität des biologischen Moleküls verlorengeht und das
Lösungsmittel muß dementsprechend ausgewählt werden. Vorzugsweise sollte die
Trocknungstemperatur unterhalb von 37ºC, besonders bevorzugt unterhalb von
30ºC, liegen.
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Das Elektrolytsalz kann auch als Puffersalz oder Elektronenvermittler dienen.
In solchen Fällen kann das Elektrolytsalz die doppelten Funktionen der Bildung der
Elektrolyt-Matrix und der Bereitstellung von Puffer bzw. Vermittler erfüllen.
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Alternativ kann das biologische Molekül auf dem Träger in einer Außenschicht
angeordnet werden, beispielsweise durch Herstellen einer separaten Lösung des
biologischen Moleküls, welche dann auf die vorgebildete feste Matrix oder Gel-Matrix
gegossen und getrocknet werden kann.
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Mit dem biologischen Molekül kann sogar eine Unterschicht gebildet werden,
in Kontakt mit dem Trägermaterial, welches über dem biologischen Molekül gebildet
werden kann.
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Das biologische Molekül ist wie oben beschrieben.
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Geeignete organische Salze zur Bildung der festen Matrix oder Gel-Matrix
umfassen jedes anorganische Salz, welches Stabilität und ausreichend Feuchtigkeit
behalten wird, um die erforderliche Hydrathülle für das biologische Molekül
bereitzustellen. Bevorzugte Komponenten umfassen Puffersalze wie
Natriumphosphat und Salze, welche auch als Elektronenvermittler dienen können, wie z. B.
Kaliumhexacyanoferrat (II).
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Bevorzugter wird die Matrix jedoch aus einem organischen Salzelektrolyten
gebildet werden. Besonders bevorzugt sind quaternäre Ammoniumsalze wie
Tetraalkylammoniumsalze, insbesondere Tetrabutylammoniumperchlorat,
Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat, Tetrabutylammoniummethansulfonat,
Tetrabutylammoniumphenolborat, Tetraethylammoniumtetrafluorborat, Tetrabutylammoniumchlorid
und Tetrabutylammoniumiodid. Diese Salze sind besonders bevorzugt, da
festgestellt wurde, daß sie relativ stabile Matrices ergeben, welche einen relativ
konstanten inneren Wassergehalt aufrechterhalten. Ein besonders bevorzugtes Salz
ist Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat.
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Falls festgestellt wird, daß die Matrix dazu neigt, bis zu einem Grad
entwässert zu werden, bei dem die Hydrathülle des biologischen Moleküls
verlorengehen könnte, kann es vorteilhaft sein, ein hygroskopisches Salz einzusetzen.
Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat ist ein Beispiel eines solchen Salzes. Alternativ
kann auch ein hygroskopisches Material in die Medien eingeschlossen werden.
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Beispiele geeigneter hygroskopischer Salze sind Lithiumsalze, wie z. B.
Lithiumchlorid. Diese Additive können in die Matrix inkorporiert werden, indem sie zu der
Lösung zugegeben werden, die zur Bildung der Trägermedien eingesetzt wird.
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Die Medien können zur Bestimmung eines Analyten durch einen Sensor,
insbesondere in der Gas- oder Dampfphase, eingesetzt werden.
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Der Analyt kann das Substrat sein. Alternativ kann das biologische Molekül
die Überführung des Analyten in ein Produkt katalysieren, welches dann eine
elektrochemische Reaktion direkt an der Elektrode erfährt. Eine weitere Alternative
besteht darin, daß das biologische Molekül eines ist, welches die Oxidation oder
Reduktion des Substrats bewirken kann, gegebenenfalls unter Beteiligung eines
Vermittlers, und somit an dem Transfer von Elektronen zwischen dem Substrat und
der Elektrode beteiligt ist; oder daß der Analyt auf dem Träger mit beispielsweise
einem Enzym reagiert, um ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, welches an den
Biorezeptor oder das Biomimetikum bindet.
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Alternativ kann der Analyt ein Inhibitor für das biologische Molekül sein oder
kann einen Inhibitor für das biologische Molekül bilden. Die Medien können auch für
Reaktionen eingesetzt werden, in denen ein Strom zugeführt wird, um eine Reaktion
innerhalb der Medien hervorzurufen.
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Geeignete biologische Moleküle zur Verwendung in dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung sind wie oben beschrieben. Jedoch können biologische
Moleküle, die von einem Analyten oder einem Reaktionsprodukt eines Analyten
inhibiert werden, ebenfalls eingesetzt werden, insbesondere, wenn der Träger eine
feste Matrix oder Gel-Matrix eines Elektrolyten umfaßt. Beispiele umfassen:
Sulfitoxidase zum Nachweis von Schwefeldioxid; Polyphenoloxidase zum Nachweis von
phenolischen Dämpfen, ein Oxigenase-Enzym zum Nachweis von Methan;
Cytochrom P450 oder vorzugsweise synthetische Analoga zum Nachweis von
Kohlenwasserstoffen wie Campher; Nitratreduktase zum Nachweis von NOx-Gasen;
Kohlenmonoxidoxidoreduktase zum Nachweis von Kohlenmonoxid;
Cytochromoxidase zum Nachweis von Cyanid; TNT-Oxidoreduktase zum Nachweis von TNT;
und Enzyme, welche den Analyten metabolisieren können, oder Antikörper, z. B. für
Pestizide, können eingesetzt werden.
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Es wurde festgestellt, daß, wenn das biologische Molekül vor dem Trocknen
zur Bildung des Trägers mit darauf gehaltenem biologischen Molekül in die
Trägermedien-bildende Elektrolytlösung inkorporiert wird, eine Verzögerungsphase, d. h.
Zeitverzögerung, zwischen der Exposition der Trägermedien gegenüber dem
gasförmigen oder dampfförmigen Elektrolyten und der elektrochemischen Antwort
auftreten kann. Die Erfinder haben postuliert, daß die Struktur der Trägermedien
durch den Analyten selbst beeinflußt werden könnte.
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Es wurde festgestellt, daß dieses Problem verringert und im wesentlichen
bewältigt werden kann durch Verringerung der Dicke der Elektrolytschicht der Gel-
Trägermedien oder durch Gießen der Schicht des biologischen Moleküls in einem
zweiten Schritt als Außenschicht auf die vorbereitete Matrix.
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Es wird angenommen, daß, wenn der Träger durch Inkorporation des
biologischen Moleküls in die Lösung zur Bildung der Matrix gebildet wird, der
geschwindigkeitsbegrenzende Schritt in der Reaktion des biologischen Moleküls und
des Substrats die Diffusion des Analyten durch die Matrix ist, welche den Kontakt
des Substrats mit dem biologischen Molekül ermöglicht. Das bedeutet, im
allgemeinen sollte der Sensor bei einer Spannung betrieben werden, welche
negativer ist als die Spannung des beobachteten Reaktionspeaks. Im Gegensatz
dazu ist, wenn das biologische Molekül in einem zweiten Schritt als Außenschicht
gegossen wird, die Diffusionsbarriere verringert. Jedoch kann das in einer
Außenschicht auf die vorbereitete Matrix gegossene biologische Molekül aufgrund seiner
relativ stärker exponierten Position eine verringerte Stabilität aufweisen. Deshalb
wird das biologische Molekül vorzugsweise innerhalb der Matrix gebildet durch
Inkorporation in die Lösung zur Bildung der Matrix und der Träger auf der
Meßelektrode, welcher die Matrix umfaßt, wird vorzugsweise als Dünnschicht
ausgebildet.
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Das biologische Molekül kann in einem ersten Schritt auf oder in der
Elektrodenstruktur ausgebildet werden und mit einer Schicht Matrix bedeckt werden.
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Die Matrixschicht ist im allgemeinen weniger als 1 mm dick. Vorzugsweise
sollte die Matrixschicht eine Dicke von nicht mehr als 100 um, am meisten bevorzugt
nicht mehr als 50 um, aufweisen.
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Jede elektrochemische Zelle eignet sich zur Verwendung in den Sensoren der
vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise werden die Elektroden durch eine
mikrovoltammetrlsche Elektrode bereitgestellt. Eine solche Elektrode ist vorteilhaft,
da sie den Zellwiderstand auf analytisch brauchbare Niveaus verringern kann.
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Wird der Gassensor zum Nachweis eines Inhibitors für das biologische
Molekül eingesetzt, könnte entschieden werden, daß der Biosensor nicht in dem
begrenzenden Strombereich betrieben werden sollte, und stattdessen könnte der
geschwindigkeitsbegrenzende Schritt die Katalysegeschwindigkeit sein. In diesem
Fall wird für einen Inhibitor-Analyten die Inhibierungsgeschwindigkeit den
geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt ergeben und nicht die Geschwindigkeit des
Massentransfers.
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Einige Beispiele von Elektroden und der Überwachung von
bioelektrochemischen Reaktionen werden nun unter Bezug auf die Begleitzeichnungen beschrieben.
BEISPIELE
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Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (18ºC) unter Verwendung einer
Gold-Mikroband-Elektrode mit 50 Paaren ineinandergreifender Elektroden mit einer
Stiftbreite von 15 um und einem Stiftabstand von 15 um durchgeführt. Die akustische
Öffnung der Elektrode betrug 4800 um und die Elektrodendicke 1000 Å ± 500 Å bei
einem ausreichenden Kathodenpotential. Fig. 1 illustriert die verwendete Elektrode
mit ineinandergreifenden Mikrobändern (bezogen von Mikrosensor Systems,
Kentucky, USA), worin 1 und 2 die Meßelektrode bzw. die kombinierte Gegen- und
Quasi-Referenz-Elektrode (CC + QRE) darstellen. Die ineinandergreifenden
Bereiche der Elektroden sind klar bei 3 sichtbar. Die Elektrode wird von dem Quarz 4
getragen.
BEISPIEL 1. Reaktion von gasförmigem H&sub2;O&sub2; mit
Meerrettichperoxidase-Elektronenvermittler-Gelen, welche auf eine Anordung
von Elektroden mit ineinandergreifender Mikroband-Anordnung
gegossen wurden
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In diesem Beispiel demonstrieren wir die Reaktion von anorganischem H&sub2;O&sub2;-Gas mit
dem Enzym Meerrettichperoxidase [E.C.1.11.1.7] und einem Elektronenvermittler.
Das Enzym wird durch Wasserstoffperoxid oxidiert und verwendet den Ein-
Elektronen-Donor Kaliumhexacyanoferrat (II). Die resultierende oxidierte Form des
Vermittlers wird dann an einer Gold-Mikroband-Elektrode wie oben beschrieben
reduziert.
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In diesem Beispiel wurde das Gel, welches sich aus einer Lösung von Enzym,
Elektronenvermittler und Citronensäurepuffer bildete, als ionisch leitende Matrix mit
inkorporiertem Biokatalysator eingesetzt. Der reduzierte ohmsche Spannungsabfall
an den Mikroelektroden erleichterte die Überwachung der biokatalytischen
elektrochemischen Reaktion innerhalb der Gel-Matrix.
Methodik
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Die Enzym-Vermittler-Gele wurden wie folgt hergestellt.
Meerrettichperoxidase (2 mg) wurde zu einer 100-ul-Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (II)
(0,05 M) in Citronensäurepuffer (0,1 M, pH 6,5) zugegeben. Die Mischung wurde 1
Minute lang heftig auf einer Rotationsvorrichtung gerührt. Ein Volumen von 5 ul der
resultierenden Lösung wurde dann auf den Abschnitt der Mikroelektrodenanordnung
der Goldelektroden aufgetragen und in Luft bei Raumtemperatur 10 Minuten lang
trocknengelassen. Nach dieser Zeitspanne hatte die Enzym-Vermittler-Lösung ein
Gel gebildet, welches bei Elektroden-Inversion unbeweglich war. Ein zyklisches
Voltammogramm mit 0,2 V/s, bei dem das Potential zyklisch von +1 V bis -1 V
gegenüber den kombinierten Gegen- und Quasi-Referenz-Elektroden geführt wurde,
offenbarte zwei Peaks, welche der Einelektronen-Oxidation und -Reduktion des
Elektronenvermittlers entsprachen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 illustriert. Von
Interesse war der Reduktionspeak bei etwa -0,5 V gegenüber der kombinierten
Gegen- und Quasi-Referenz-Elektrode.
-
Zur Untersuchung der Aktivität der biokatalytischen elektrochemischen
Medien wurden amperometrische Experimente in Gegenwart von gasförmigem H&sub2;O&sub2;-
Substrat durchgeführt. Das Potential der Indikator-Elektroden wurde für die
Reduktion der oxidierten Form des Vermittlers nach der Enzymreaktion mit H&sub2;O&sub2; auf
-0,6 V gegenüber den CC + QRE eingestellt. Nachdem ein anfänglicher
Gleichgewichtsstrom erhalten worden war, wurde ein 20-ml-Becherglas, enthaltend 10 ml 0,8
M H&sub2;O&sub2; in Wasser, periodisch der Elektrode in einer Entfernung von 5 mm von der
Flüssigkeitsoberfläche präsentiert.
-
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 illustriert. Die durchgezogenen Pfeile zeigen
die Exposition gegenüber gasförmigem H&sub2;O&sub2; an. Die unterbrochenen Pfeile zeigen
nichtvorhandene Exposition gegenüber gasförmigem H&sub2;O&sub2; an. Die Erhöhung des
Kathodenstroms repräsentierte die biokatalytische elektrochemische Reaktion des
Enzyms und Vermittlers und des gasförmigen H&sub2;O&sub2;. Kontrollelektroden ohne Enzym
und/oder Vermittler ergaben wesentlich kleinere Stromerhöhungen und es wurde
gefolgert, daß es sich bei diesen um ein Ergebnis von Leitfähigkeitsänderungen
innerhalb der Gel-Matrix, induziert von dem Substrat, handelte.
-
Die Enzym-Vermittler-Gele waren für etwa 45 Minuten bei Raumtemperatur
aktiv, nach welcher Zeit vernachlässigbare Stromerhöhungen aufgezeichnet wurden;
dieser Stromverlust resultierte wahrscheinlich aus der verringerten ionischen
Leitfähigkeit in der Gel-Matrix als Ergebnis von Lösungsverlust an die Atmosphäre.
BEISPIEL 2. Reaktion von phenolischen Dämpfen mit
Polyphenoloxidase auf einem Festpolymer-Elektrolyten, der auf eine
Anordnung von ineinandergreifenden Mikroband-Elektroden gegossen
worden war
-
In diesem Beispiel wurde ein Festpolymer-Elektrolyt, Nafion, als ionisch leitende
Matrix in der Gasphase eingesetzt, auf die das Enzym Polyphenoloxidase
[E.C.1.14.18.1] gefällt wurde. Nafion ist ein Copolymer von Teflon oder
Tetrafluorethylen (PTFE) und Polysulfonylfluoridvinylether mit Sulfonsäuregruppen. Die
Sulfonsäuregruppen sind chemisch an ein Fluorkohlenstoffgerüst gebunden. Die
Indikatorreaktion war die Reaktion von p-Cresol-Dämpfen mit Polyphenoloxidase
und die anschließende Reduktion eines Chinon-Produkts an den Gold-Mikroband-
Arbeitselektroden bei einem Kathodenpotential.
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Dieses Experiment und alle Beispiele unter Verwendung von p-Cresol, die im
folgenden ausgeführt sind, wurden auch unter Ersatz von p-Cresol durch Phenol
durchgeführt. In jedem Fall waren die erhaltenen Ergebnisse qualitativ die gleichen,
es wurden jedoch größere Stromgrößenordnungen erhalten.
Methodik
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Eine 0,83 gew.%ige Lösung von Nafion in Isopropanol wurden 5 Minuten
lang beschallt. Eine saubere Mikroband-Elektrode wurde dann vertikal in dieser
Lösung für einen Zeitraum von 15 Minuten tauchbeschichtet. Die Elektrode wurde
soweit eingetaucht, daß alle Mikrobänder vollständig von Nafion-Lösung bedeckt
waren. Nach einer weiteren Zeitspanne von 5 Minuten Lufttrocknung bei
Raumtemperatur wurde die Nafion-beschichtete Elektrode in eine Trockenkammer bei
72ºC für 30 Minuten untergebracht. Nach einer Abkühlperiode von 5 Minuten auf
dem Labortisch war die modifizierte Elektrode einsatzbereit. Die Überprüfung der
Elektrodenoberfläche offenbarte sichtbare Interferenzmuster, welche eine unebene
Oberflächenbedeckung des Polymer-Elektrolyten anzeigten.
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Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines zyklischen Voltammogramms mit 0,2 V/s
der modifizierten Elektrode in Luft bei 18ºC. Das Potential wurde zyklisch von +1 V
1 bis -1 V gegenüber den CC + QRE geführt.
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Eine Lösung von Polyphenoloxidase (1 mg/100 ul) in Natriumphosphatpuffer
(0,1 M, pH 7) wurde dann hergestellt und auf einer Rotationsvorrichtung 2 Minuten
lang heftig gerührt. Ein 5-ul-Volumen der Enzymlösung wurde dann sorgfältig auf
den Mikroanordnungsabschnitt der modifizierten Elektrode aufgetragen und 15
Minuten lang trocknengelassen. Nach diesem Zeitraum hatte sich ein Gel auf der
Elektrode gebildet, welches bei Elektroden-Inversion unbeweglich war. Eine kleine
Glasflasche (35 mm Durchmesser und 35 mm Länge), enthaltend 500 mg p-Cresol-
Kristalle, wurde dann der Elektrode präsentiert. Die modifizierte Elektrode drang in
den Hals der Glasflasche bis zu einer Tiefe von 5 mm ein. Anschließend wurden
zyklische Voltammogramme mit 0,005 V/s mit oder ohne p-Cresol-Exposition
aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 illustriert. (A) repräsentiert die
Ergebnisse mit der Polyphenoloxidase-Nafion-Elektrode und (B) repräsentiert die
Ergebnisse, welche mit der Elektrode mit nur Nafion in Gegenwart von p-Cresol-
Dämpfen erhalten wurde. Das Potential wurde zyklisch von 0 V bis -1 V gegenüber
den CC + QRE geführt. Der klare Reduktionspeak bei etwa -0,550 V gegenüber den
CC + QRE entsprach der Reduktion des Chinon-Produkts der Enzymreaktion mit p-
Cresol-Dampf.
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Anschließend wurden amperometrische Experimente durchgeführt, welche
Expositionen von 100 Sekunden gegenüber phenolischen Dämpfen mit einem
ähnlichen Zeitraum ohne Exposition beinhalteten. Fig. 6 zeigt die amperometrische
Kurve der Nafion-Polyphenoloxidase-Elektrode mit Expositionen gegenüber p-Cresol
von etwa 100 Sekunden mit ähnlichen Zeitintervallen ohne Exposition. Die vertikalen
Pfeile zeigen den Beginn der periodischen Expositionen an. Die horizontalen Pfeile
zeigen nichtvorhandene Exposition an. Das Potential der Arbeitselektroden betrug
-0,650 V gegenüber den CC + QRE. Kontrollelektroden ohne Enzym ergaben kleine
Stromerhöhungen bei Exposition gegenüber p-Cresol.
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Gleichgewichtsströme wurden gewöhnlich innerhalb von 30-60 Sekunden
erhalten. Eine relativ kleine Stromerhöhung war in Abwesenheit von Enzym zu
sehen, mutmaßlich ein Ergebnis von Leitfähigkeitsänderungen, welche durch den
phenolischen Dampf auf dem Polymerfilm induziert wurden.
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Enzym-Nafion-modifizierte Elektroden waren nur etwa 30 Minuten lang
biokatalytisch aktiv. Das Enzym wurde mutmaßlich durch die sauren Gruppen des
Nafion-Polymers und/oder übermäßige Dehydratation inaktiviert. Jedoch fuhr die
Nafion-beschichtete Elektrode fort, die ionische Leitfähigkeit für mindestens 28
Stunden bei Raumtemperatur nach der ersten Herstellung aufrechtzuerhalten. In
Abwesenheit von Nafion waren Enzym-Gele nach etwa 25 Minuten nicht mehr
ionisch leitfähig.
BEISPIEL 3. Reaktion von phenolischen Dämpfen mit
Polyphenoloxidase, inkorepriert in ein Hydroxyethylcellulose-Gel, das auf eine
Anordnung von ineinandergreifenden Mikroband-Elektroden
gegossen wurde
-
Hydroxyethylcellulose (HEC) ist ein wasserlösliches Material, das auf der Cellulose-
Polymerstruktur basiert. In diesem Beispiel wurde ein aus HEC und Hepes-Puffer
gebildetes Gel als bioverträgliche ionische Matrix eingesetzt. Die Indikatorreaktion
war identisch mit der von Beispiel 2.
Methodik
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Eine 2,5%ige Gew./Vol.-Lösung von HEC in Hepes-Puffer (pH 7, 0,1 M)
wurde hergestellt und 24 Stunden lang vor der Verwendung bei 4ºC gelagert. Eine
Enzym-HEC-Polymer-Lösung (1 mg/100 ul) wurde hergestellt und ein Volumen von
5 ul auf den Abschnitt der Mikrobandanordnung der Elektrode aufgetragen. Nach
einer Trockenperiode von 15 Minuten hatte sich ein Gel gebildet, welches bei
Elektroden-Inversion unbeweglich war. Zyklische Voltammogramme mit 0,005 V/s,
wobei das Potential zyklisch von 0 V bis -1 V gegenüber den kombinierten Gegen-
und Quasi-Referenz-Elektroden in Anwesenheit und Abwesenheit von p-Cresol-
Dämpfen geführt wurde, zeigte einen deutlichen Peak bei etwa -0,6 V gegenüber
den kombinierten Gegen- und Quasi-Referenz-Elektroden, entsprechend der
Reduktion des Chinon-Produkts der Enzymreaktion mit p-Cresol. Fig. 7 zeigt das
zyklische Voltammogramm mit 0,005 V/s von (A) einer Hydroxyethylcellulose-
Polyphenoloxidase-Elektrode und (B) einer Elektrode mit nur Hydroxyethylcellulose
in Gegenwart von p-Cresol-Dämpfen.
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Amperometrische Experimente der HEC-Enzym-Gel-Elektroden beinhalteten,
daß das Potential der Arbeitselektroden bei -0,7 V gegenüber den CC + QRE im
Gleichgewicht gehalten wurde. Nach einer Trocknungsperiode von 15 Minuten
wurde die Gel-Elektrode periodisch p-Cresol-Dämpfen ausgesetzt.
Gleichgewichtsströme wurden normalerweise binnen etwa 100 Sekunden erhalten. Die
Stromantwort auf die Exposition gegenüber p-Cresol lag im Bereich von 30
Sekunden. Antwortströme im Nichtgleichgewichtszustand wurden bei fortgesetzter
periodischer Exposition gegenüber p-Cresol erhalten. Diese Ergebnisse sind in Fig.
8 illustriert, welche die amperometrische Kurve von (A) einer Hydroxyethylcellulose-
Polyphenoloxidase-Gel-Elektrode und (B) einer Elektrode mit nur
Hydroxyethylcellulose zeigt. Die durchgezogenen Pfeile zeigen p-Cresol-Exposition an;
gestrichelte Pfeile zeigen nichtvorhandene Exposition an. Das Potential der
Arbeitselektroden betrug -0,7 V gegenüber den CC + QRE.
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HEC-Enzym-Gele verloren die ionische Leitfähigkeit nach 30 Minuten schnell.
Beim Plazieren der Gel-Elektrode nach 30 Minuten Trocknungszeit in eine gerührte
Lösung von Phosphatpuffer (pH 7, 0,1 M) und Zugabe von gelöstem p-Cresol
wurden erneut amperometrische Stromerhöhungen beobachtet, welche aktives
inkorporiertes Enzym anzeigten.
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Trotz des aktiven Enzyms litt die HEC-Enzym-Elektrodenkonfiguration nach
30 Minuten unter verringerter ionischer Leitfähigkeit, mutmaßlich als Ergebnis von
Lösungsmittelverlust an die Atmosphäre.
Neue Trägermedien, welche biokatalyltische elektrochemische Reaktionen in
der Gasphase unterstützen
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Enzym-Redoxvermittler-Gele, Hydroxyethylcellulose- und Festpolymer-
Elektrolyt-Enzym-Gele demonstrierten klar das Prinzip der Durchführung von
biokatalytischen elektrochemischen Reaktionen in der Gasphase. Die beschriebenen
Verfahren litten jedoch unter den Problemen hinsichtlich entweder niedriger ionischer
Leitfähigkeit oder Bioverträglichkeit im Laufe relativ kurzer Zeiträume. Die neuen
Trägermedien dieser Erfindung, welche eine verlängerte ionische Leitfähigkeit und
Bioverträglichkeit für relativ längere Zeiträume ermöglichen, werden nun
exemplarisch dargestellt. Die Trägermedien der Erfindung erwiesen sich bezüglich
ionischer Leitfähigkeit und biologischer Verträglichkeit als unerwartet günstig. Andere
überraschende Merkmale des Materials werden ebenfalls erörtert werden.
BEISPIEL 4. Ionisch leitende Gele von Tetrabutylammoniumtoluol-
4-sulfonat mit inkorporierter Polyphenoloxidase, gegossen auf eine
Anordnung von ineinandergreifenden Mikroband-Elektroden zur
Reaktion mit phenolischen Dämpfen
-
In diesem Beispiel wird eine ionisch leitende Gel-Matrix, gebildet aus
Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat und Natriumphosphatpuffer unter Inkorporation von
Polyphenoloxidase, beschrieben. In diesem Beispiel erwies sich das Enzym für eine
Anzahl von Stunden als relativ stabil innerhalb der Gel-Matrix. Die Indikatorreaktion
war identisch mit der in Beispiel 2.
Methodik
-
Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat (TBATS),
Toluol-4-sulfonsäuretetrabutylammoniumsalz, (CH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;)&sub4;N(CH&sub3;C&sub6;H&sub4;SO&sub3;), M 413,67, (500 mg) wurde mit
Mörser und Pistill zerstoßen, um ein Pulver zu bilden, und dann in eine Glasflasche
eingebracht, die ein 3-ml-Volumen von Natriumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7) und
Kaliumchlorid (0,05 M) enthielt. Die Mischung wurde sanft erwärmt, bis das TBATS-
Material vollständig gelöst war. Die Mischung wurde dann für einen Zeitraum von 5
Minuten beschallt. Polyphenoloxidase (1 mg) wurde dann zu 100 ul TBATS-Lösung
zugegeben und die resultierende Mischung 2 Minuten lang heftig auf einer
Rotationsvorrichtung gerührt. 5 ul der TBATS-Enzym-Lösungsmischung wurde dann
auf den Mikrobandabschnitt der Elektrode aufgebracht und 30 Minuten lang an Luft
trocknen gelassen. Nach dieser Zeitspanne war das Gel, welches sich gebildet hatte,
bei Elektroden-Inversion unbeweglich. Es wurden dann zyklische Voltammogramme
mit 0,005 V/s in Abwesenheit und Anwesenheit von p-Cresol-Dämpfen
aufgezeichnet. Das Potential wurde zyklisch von 0 V bis -1 V gegenüber den CC + QRE
geführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 illustriert. In Anwesenheit von phenolischen
Dämpfen war ein Reduktionspeak bei etwa -0,5 V gegenüber den CC + QRE zu
sehen, entsprechend der Reduktion des Chinon-Produkts der Enzymreaktion. (A)
repräsentiert das zyklische Voltammogramm der TBATS-Polyphenoloxidase-Gel-
Elektrode und (B) das der Elektrode mit nur TBATS-Gel in Gegenwart von p-Cresol-
Dämpfen. Das Potential wurde zyklisch von 0 V bis - 1 V gegenüber den CC + QRE
geführt.
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Bei amperometrischen Experimenten wurde das Arbeitspotential auf -0,65 V
gegenüber den kombinierten Gegen- und Quasi-Referenz-Elektroden eingestellt.
Nach einer anfänglichen Trockenperiode von 30 Minuten nach dem Gießen des Gels
wurde die modifizierte Elektrode p-Cresol-Dämpfen für Intervalle von 100 Sekunden
mit ähnlichen Zeiträumen ohne Exposition ausgesetzt.
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Diese Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt, welche eine amperometrische
Kurve von (A) der TBATS-Polyphenoloxidase-Gel-Elektrode und (B) der Elektrode
mit nur TBATS-Gel mit Expositionen gegenüber p-Cresol von 100 Sekunden mit
ähnlichen Zeitintervallen ohne Exposition zeigt. Der Pfeil zeigt den Beginn der
Expositionen an. Das Potential der Arbeitselektroden betrug 0,650 V gegenüber den
kombinierten Gegen- und Quasi-Referenz-Elektroden.
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Zur Untersuchung der Stabilität der biokatalytischen elektrochemischen Gel-
Medien wurde eine Elektrode hergestellt und dann 48 Stunden lang auf dem
Labortisch bei Raumtemperatur vor dem amperometrischen Test bei 18ºC gelagert. Nach
dieser Zeitspanne wurde ein amperometrisches Experiment mit kontinuierlicher
Exposition gegenüber phenolischen Dämpfen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 11 dargestellt, welche die amperometrische Kurve (A) einer Elektrode mit nur
TBATS-Gel, (B) einer TBATS-Polyphenoloxidase-Gel-Elektrode und (C) einer
TBATS-Polyphenoloxidase-Gel-Elektrode nach 30 Minuten Trocknen bei
Raumtemperatur nach dem Gelgießen zeigt. Der Pfeil gibt den Beginn der kontinuierlichen
Exposition gegenüber p-Cresol-Dämpfen an. Das Potential der Arbeitselektroden bei
allen Experimenten betrug - 0,650 V gegenüber den kombinierten Gegen- und
Quasi-Referenz-Elektroden.
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In weiteren Tests wurden zwei Mikroanordnungs-Elektroden entweder mit
einem TBATS/Wasser-Gel oder einem TBATS-Isopropanol (IPA)-Gel beschichtet.
Das letztere Gel wurde in einer geheizten Trockenkammer bei 72ºC 30 Minuten lang
getrocknet, was einen Dünnfilm von TBATS auf der Oberfläche der Elektrode ergab.
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Die modifizierten Elektroden wurden in eine transparente Petrischale auf dem
Labortisch bei Raumtemperatur für eine Reihe von Wochen plaziert. Sowohl für die
gegossenen TBATS/Wasser- als auch für die gegossenen TBATS-IPA-Gele war
eine ähnliche Verringerung der Ionenströme nach 60 Tagen Lagerung zu
beobachten. Es wurde kein Versuch gemacht, Temperatur, Licht, Feuchtigkeit etc.
zu kontrollieren. Das Ergebnis wurde unter Berücksichtigung der unkontrollierten
Umweltbedingungen als gut betrachtet. Es wurde angenommen, daß die
hygroskopische Neigung von TBATS zu der elektrochemischen Stabilität beigetragen haben
könnte. Nach dem Lagerungszeitraum hatte das Gel ein relativ starres Material
gebildet, welches schwer von der Elektrodenoberfläche zu entfernen war.
BEISPIEL 5. Reaktion von gasförmigem H&sub2;O&sub2; mit Meerrettich-
peroxidase und Kaliumhexacyanoferrat (II) in
Tetrabutylammoniumtoluol-4-sulfonat-Gelen, die auf eine Anordnung von
ineinandergreifenden Mikroband-Elektroden gegossen worden waren
-
Die Indikatorreaktion ist identisch mit der in Beispiel 1 beschriebenen.
Methodik
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Ein ähnliches Verfahren wie das in dem Beispiel 4 eingesetzte wurde
durchgeführt, jedoch unter Verwendung von 2 mg Meerrettichperoxidase und 500 mg
TBATS/3 ml Citronensäurepuffer (0,1 M, pH 6,5). Ein 5-ul-Volumen der Enzym-
TBATS (2 mg/100 ul)-Lösung wurde auf den Mikroband-Abschnitt der Elektrode
gegossen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an Luft trocknen gelassen.
Nach dieser Trocknungsperiode bildete das Enzym ein Gel, welches bei Elektroden-
Inversion unbeweglich war. Ein zyklisches Voltammogramm mit 0,2 V/s nach der
Trocknungsperiode, bei dem das Potential zyklisch von +1 V bis -1 V gegenüber den
CC + QRE geführt wurde, offenbarte einen Reduktionspeak bei etwa -0,25 V
gegenüber den CC + QRE. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt.
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Anschließend wurden amperometrische Experimente durchgeführt, bei denen
die Gel-Elektrode in einer Entfernung von 5 mm von 10 ml einer Flüssigkeitslösung
von H&sub2;O&sub2; in Wasser (0,8 M) in einem 25-ml-Becherglas plaziert wurde. Das Potential
der Indikator-Elektrode wurde auf -0,350 V gegenüber den CC + QRE eingestellt.
Durchgezogene Pfeile zeigen Exposition gegenüber gasförmigem H&sub2;O&sub2; an.
Unterbrochene Pfeile zeigen nichtvorhandene Exposition an. Die Zunahme des
kathodischen Stroms bei Exposition gegenüber gasförmigem H&sub2;O&sub2; zeigte die
Reduktion der oxidierten Form des Vermittlers nach der Enzymreaktion mit H&sub2;O&sub2; an.
BEISPIEL 6. Durch die phenolische Verbindung induzierte
Strukturänderungen in TBATS-Gelen
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Die mit dem in Beispiel 4 beschriebenen TBATS-Enzym-Gel erhaltene
amperometrische Kurve (Fig. 10) zeigte eine Verzögerung der ersten Antwort auf p-Cresol-
Exposition zwischen 200-800 Sekunden. Das Experiment unter Verwendung von
Phenol anstelle von p-Cresol zeigte ebenfalls diese Verzögerung. Die beobachtete
"Verzögerungsphase" wurde für bedeutsam gehalten und war einer weiteren
Untersuchung Wert. Experimente mit einem TBATS-Wasser-Gel, beladen mit dem
Elektronenvermittler Ferrocen (0,0125 M), wurden verwendet, um die bei
amperometrischen Bestimmungen beobachtete Verzögerungsphase zu untersuchen.
Ein Volumen von 1,5 ul der TBATS-Wasser-Ferrocen-Lösung wurde auf den
Mikroanordnungsabschnitt der Elektrode aufgetragen. Es wurde sofort ein zyklisches
Voltammogramm mit 0,2 V/s und bei einem Potential von +1 V bis -1 V
aufgezeichnet, was ein Voltammogramm ohne Peaks ergab, repräsentativ für die rapide
Diffusion der elektroaktiven Sonde Ferrocen zu den Arbeitsmikroelektroden. Siehe
Fig. 14.
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Fig. 15 illustriert die zyklischen Voltammogramme mit 0,2 V/s, welche dann
für ein Potential von +1 V bis -1 V der TBATS-Ferrocen-Gel-Elektrode nach (A) 7
Minuten Trocknen bei Raumtemperatur und (B) 30 Minuten Trocknen bei
Raumtemperatur aufgezeichnet wurden. Zyklische Voltammogramme wurden auch
nach Intervallen von 10, 16 und 24 Minuten aufgezeichnet, die Ergebnisse sind
jedoch nicht dargestellt.
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Die klare Änderung der voltammetrischen Gestalt von Fig. 14 bis Fig. 15
illustriert die verringerte Diffusion der elektroaktiven Sonde, als das Gel vermutlich
Wasser verlor und starrer wurde.
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Die besonders interessante Situation, wenn sich Phenol-Dampf in das Gel
verteilt und eine biokatalytische Umwandlung erfährt, wurde ebenfalls untersucht.
Ein ähnliches Verfahren wie das bei den amperometrischen Experimenten
angewandte Verfahren wurde eingesetzt, jedoch unter Überwachung der Diffusion
des Vermittlers mit Hilfe zyklischer Voltammetrie. Elektroaktive Sonden-Gel-
Elektroden, wie sie in dem vorigen Experiment nach 30 Minuten Trocknen eingesetzt
worden waren, wurden p-Cresol für Intervalle von 100 Sekunden, gefolgt von
weiteren 100 Sekunden ohne Exposition, ausgesetzt. Unmittelbar nach einer
Exposition gegenüber p-Cresol wurde ein zyklisches Voltammogramm mit 0,2 V/s
und einem Potential von +1 V bis -1 V bei Raumtemperatur aufgezeichnet.
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Fig. 16 zeigt eine Folge von zyklischen Voltammogrammen, die etwa alle
200 Sekunden bei 0, 200, 800, 1800 und 2200 Sekunden aufgezeichnet wurden. Die
Buchstaben zeigen die ungefähren Zeitpunkte der aufgezeichneten
Voltammogramme an: (A) anfängliches Voltammogramm nach 30 Minuten Trocknungszeit; (B)
nach 200 Sek.; (C) nach 800 Sek.; (D) nach 1800 Sek.; und (E) nach 2200 Sek.
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Die Peak-Ströme nahmen mit den aufeinanderfolgenden Voltammogrammen
zu und stabilisierten sich nach etwa 2200 Sekunden. Unterscheidbare Peaks
begannen sich nach etwa 800 Sekunden zu bilden, eine Zeit, die etwa dem Ende der
Verzögerungsphase entspricht, die bei den amperometrischen Bestimmungen
beobachtet wurde (Fig. 10). Die Ergebnisse legten nahe, daß das Gelmaterial eine
Strukturänderung erfuhr, welche die erhöhte Mobilität der elektroaktiven Sonde bei
fortgesetzter Exposition gegenüber p-Cresol förderte. Wiederum ergab die
Wiederholung des Experiments unter Ersatz von p-Cresol durch Phenol qualitativ die
gleichen Ergebnisse, es wurden jedoch größere Stromgrößenordnungen beobachtet.
Obwohl Weichmachungseffekte bezüglich Polymere gut dokumentiert sind, war
unklar, wie p-Cresol die Strukturänderung innerhalb des TBATS-Gels induzierte. Die
präzise Struktur des TBATS-Gels war uns unbekannt, wir nehmen jedoch eine
geordnete Matrix, bestehend aus kationischen und anionischen Gruppen von
Tetrabutylammonium- bzw. Toluol-4-sulfonationen mit dazwischen verteilten
Wassermolekülen an.
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Eine weitere Annahme ist, daß p-Cresol die elektrostatischen Kräfte zwischen
den geladenen Gruppen störte, was zu einer Lockerung der Matrixstruktur führte und
so die Mobilität der elektroaktiven Sonde erhöhte. Bezüglich der amperometrischen
Enzym-Elektroden-Kurve, die in Fig. 10 erhalten wurde, postulieren wir, daß der
Diffusionskoeffizient des Produkts der Enzymreaktion bei fortgesetzter periodischer
Exposition gegenüber p-Cresol-Dämpfen als Folge von Erhöhungen der Gelfluidität
zunahm. Zweifellos erhöhte sich die Substrat-Diffusion innerhalb des Gels ebenfalls,
der Effekt würde jedoch zufällig erscheinen, nachdem Kontrollelektroden ohne
Enzym ziemlich konstante Stromerhöhungen als Ergebnis von nicht-spezifischen
Leitfähigkeitsänderungen, die von p-Cresol induziert wurden, ergaben.
Lösungsmittelwirkungen auf die Träger-Matrix
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Weitere Experimente, welche die Auswirkung des Gießlösungsmittels
untersuchten, ergaben unerwartete und interessante Ergebnisse. TBATS-Material wurde
in Isopropanol gelöst und dann auf die Elektrodenoberfläche gegossen und 30
Minuten lang bei 72ºC in einer Trockenkammer untergebracht. Nach weiteren 5
Minuten Trocknungszeit bei Raumtemperatur wurde das TBATS-Gel von einem 5-ul-
Volumen einer Polyphenoloxidase-Natriumphosphatpuffer-Lösung (1 mg/100 ul)
bedeckt und 15 Minuten lang an Luft trocknen gelassen. Als die Elektrode p-Cresol-
Dämpfen ausgesetzt wurde, wurde eine sofortige Stromerhöhung aufgezeichnet.
Dies wird illustriert durch Fig. 17, welche eine amperometrische Kurve einer
lösungsmittelgegossenes-TBATS-Polyphenoloxidase-Elektrode bei -0,65 V zeigt.
Der durchgezogene Pfeil zeigt den Beginn der Exposition gegenüber p-Cresol an.
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Es wurde postuliert, daß das Gießlösungsmittel eine wichtige Rolle bei der
Festlegung der Struktur der TBATS-Gel-Matrix spielte. Es scheint so, daß im
letzteren Fall das Chinon-Produkt imstande war, schnell durch die Gel-Matrix zu
diffundieren und an der Elektrode zu reagieren. Es wird angenommen, daß dies
deshalb der Fall ist, weil die Verwendung des Isopropanol-Lösungsmittels eine
dünnere Schicht des Matrix-Gels ergibt, so daß die Diffusion durch das Gel schneller
ist. In dieser Situation war jedoch wahrscheinlich, daß nach dem Hochtemperatur-
Trocknungsverfahren wenig Lösungsmittel in der Matrix verblieb, was
möglicherweise zu einer hochdichten Gel-Struktur führte. Dieses Beispiel der Manipulation der
Struktur und der Eigenschaften der TBATS-Gele weist darauf hin, wie schnell
antwortende und stabile Matrices zur Inkorporation in analytischen Vorrichtungen für
die qualitative und quantitative Bestimmung von gasförmigen Analyten
geeigneterweise hergestellt werden können.