DE69317931T2

DE69317931T2 - Sensibilisierte Erythrozyten, ein Verfahren zu deren Herstellung, und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69317931T2
Application number: DE69317931T
Authority: DE
Inventors: Nee Wartell Mannessier
Original assignee: AETSRN
Current assignee: Etablissement Francais du Sang
Priority date: 1992-02-24
Filing date: 1993-02-01
Publication date: 1998-10-22
Anticipated expiration: 2013-02-02
Also published as: FR2687788B1; EP0558361A1; FR2687788A1; DK0558361T3; EP0558361B1; ES2117108T3; DE69317931D1; ATE165167T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunhämatologie und insbesondere den Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplexen mit Hilfe von Antikörpern oder Phänotypierten, auf einem festen Träger immobilisierten Zellen und von Indikator-Erythrozyten.
Die Erfindung betrifft spezifisch die genannten Indikator-Erythrozyten, auf denen polyvalente Antiglobuline fixiert sind, insbesondere Anti-IgG und Anti-C3d, und eine Methode, um die genannten Indikator-Erythrozyten zu gewinnen.
Die Erfindung ist insbesondere für das Gebiet der Immunhämatologie und der Transfusionssicherheit (Blutgruppenbestimmung AB0-D, Kompatibilitätstest, Bestimmung des Erythrozyten-Phänotyps, Untersuchung der irregulären Antikörper, ...) bestimmt, doch kann sie ebenso angewandt werden auf die indirekte Bestimmung anderer Antikörper oder Antigene, die mit verschiedenen Krankheiten im Zusammenhang stehen.
Die verschiedenen Tests der Blutgruppenbestimmung und der Transfusionsverträglichkeit wurden in flüssiger Phase ausgearbeitet. Obwohl allgemein in den immunhämatologischen Laboratorien verwendet, haben diese Reaktionen der Agglutination in flüssiger Phase doch eine bestimmte Zahl von Nachteilen. Sie sind sehr subjektiv, wenig quantitativ und wenig empfindlich. Der andere größere Nachteil ist die Unmöglichkeit der Auswertung am objektiven Endpunkt der Reaktion.
Aus diesem Grund versuchten mehrere Laboratorien, einfachere und zuverlässigere Tests auszuarbeiten. Die bedeutendsten Fortschritte wurden von den als Tests "in fester Phase" bezeichneten Tests gebracht, d.h. mit einer der Komponenten (Antikörper oder phänotypierte Zellen) in stabiler Weise auf einem Träger aus Plastikmaterial, im allgemeinen auf einer Mikroplatte (mit 96 Vertiefungen) des für die Zellkulturen bestimmten Typs fixiert und mit indirektem Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion durch Immunadhärenz der Erythrozyten. Die zur automatischen Füllung und Manipulation dieser Mikroplatten geeigneten Vorrichtungen sind ohne weiteres verfügbar.
Die neuerdings beschriebenen Tests der Immunadhärenz beruhen auf Verfahren, die erstmals in den fünfziger Jahren beschrieben wurden. Die ersten Ansätze leiten sich ab von Arbeiten von Coombs (R.R.A. Coombs und D. Bedford, Vox Sang. 1955; 5, 11), der Reaktionen der gemischten Agglutination verwendet, um Blutgruppenantigene auf den Platten nachzuweisen (D.E. Ashurst, D. Bedford und R.R.A. Coombs, Vox Sang. 1956; 1, 235).
Obwohl die Entwicklung dieser Technik der gemischten Agglutination anfänglich in flüssiger Phase ausgeführt wurde, wurde sie später in der Rechtsmedizin als eine Festphasenmethode benutzt (R.R.A. Coombs und B.E. Dodd, Med. Sci. Law. 1961; 1, 359).
Die Entdeckung der Hämadsorption durch gewisse Viren auf den infizierten Zellen bildete einen weiteren Schritt (C. Hogman, Vox Sang. 1959; 4, 12), welcher der Durchführung der ersten Reaktion in fester Phase durch Hogman, der die gemischte Agglutination und die Hämadsorption kombinierte (C. Hogman, Vox Sang. 1959; 4, 319), voranging. Zellkulturen werden durch Anti-A oder durch Anti-B sensibilisiert, und die Haftung der roten Indikator-Blutkörperchen zeigt die Anwesenheit des Antigens auf den kultivierten Zellen. In diesem Modell müssen die untersuchte Zelle und die Indikatorzelle das gleiche Antigen haben.
Schon 1961 kombinieren Fagraeus und Espmarck die gemischte Agglutination und die Hämadsorptionsreaktion (Nature 1961; 190, 370; A. Fagraeus, J.A. Espmarck und J. Johnson, Immunobgy 1965; 9, 161). Der neue Gesichtspunkt dieser Technik ist die Verwendung von roten Indikator-Blutkörperchen, auf denen man Antiglobulin fixiert hat. Eine technische Variante der "Markierung" mit Antiglobulin wurde von Coombs entwickelt, der Chromchlorid verwendete, um das Antiglobulin oder andere Proteine direkt auf den roten Blutkörperchen zu fixieren (R.R.A. Coombs, Assays utilizing red cells as markers, in: "Immunology for the 80's", Hrsg. A. Voller, MTP Press, Lancester, 1981). Im Jahre 1967 machen Catt und Tregear (Science 1967; 158, 1570) die wichtige Beobachtung, daß die Antikörpermoleküle an Polystyrol oder Polypropylen adsorbiert werden können, ohne ihre immunologische Aktivität zu verlieren. Diese Entdeckung erlaubte die Erweiterung der Tests in fester Phase.
Schließlich wurde von Rosenfield im Jahre 1978 die Möglichkeit dokumentiert, Monoschichten von roten Blutkörperchen in der Serologie zu verwenden. Wenn die Erythrozyten mit Hilfe von Fibrinogen und Poly-L-lysin auf Plastikmaterial fixiert wurden (R.E. Rosenfield, New technical approaches to red cell serology, XV Congr. Int. Soc. Blood Transfusion, Paris, 1978), konnte die Monoschicht von Test-Erythrozyten anschließend den spezifischen, in Lösung (Serum) befindlichen Antikörper adsorbieren. Dann wurde der fixierte Antikörper detektiert, und zwar indirekt durch eine Immunhämolyse (nach Zugabe von AB- Serum, Komplementquelle). Nach Inkubation und Waschung wurden die verbliebenen intakten Erythrozyten lysiert und der Hämoglobingehalt gemessen.
Eine andere Methode bestand darin, Antiglobulin zuzusetzen, nachdem man die sensibilisierten Erythrozyten lysiert hatte. Die quantitative Bestimmung wurde nach Lyse der fixierten Indikator-Erythrozyten durch Messung der Absorption des freigesetzten Hämoglobins ausgeführt.
Im Jahr 1982 beschreibt Moore einen anderen Test mit Antiglobulin in fester Phase (H.H. Mooore und J.D. Conradie, Transfusion 1982; 22, 540). Nach Sensibilisierung der Test- Erythrozyten in flüssiger Phase durch die Seren werden die Erythrozyten gewaschen, dann in eine Mikroplatte überführt, wo menschliches Antiglobulin fixiert wurde. Nach Zentrifugation werden Peroxydase-Reagenzien zugesetzt, um die sensibilisierten Erythrozyten zu detektieren.
Die Mehrzahl der Tests in fester Phase leiten sich von den oben beschriebenen originalen Methoden ab. Ausgehend von den Techniken von Mage (M.G. Mage, L.L. McHugh und T.L. Roth- Stein, J. immunol. Methods, 1977; 15, 47) und von Wysocki (L.J. Wysocki und V.L. Sabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978; 75, 2844) wurde die Anwendung dieser Tests an die Bestimmung der Blutgruppen AB0-D angepaßt.
Die Gegenprobe der Gruppe ABO ist eine Modifikation der Technik der Zellgewebekultur von Hogman (1959, weiter oben zitiert).
Ebenso beruht die Untersuchung der irregulären Antikörper auch auf der gemischten Agglutination von Hogman und auf der gemischten Hämadsorption von Fagraeus (1961, 1965).
Man findet die Beschreibung von Tests für die Blutgruppenbestimmung in der Mikroplatte in der Patentanmeldung EP-A-0 084 102 der Firma Biotest und in dem Patent US-A-4 608 246 der Firma Immucor.
Das Biotest -Material verlangt die Ausführung mehrerer Zentrifugationen in den verschiedenen Schritten des Tests, was gegenüber den traditionellen Tests in Reagensgläsern keine Vereinfachung darstellt. Ferner bildet die Notwendigkeit, die sensibilisierten Erythrozyten von einer ersten Mikroplatte zur Test-Mikroplatte zu überführen, eine mögliche Quelle eines für das Gebiet der Bluttransfusionen zu gefährlichen Handhabungsfehlers.
Das Immucor -Material ist einfacher zu benutzen und zuverlässiger, doch tragen die Indikator-Erythrozyten nur das Antiglobulin Anti-IgG. Dieser Test kann also weder die IgM noch die schwachen IgG detektieren, die das Komplement fixieren.
Die Anmelderin hat nun entdeckt, daß es möglich ist, ein neues Modell zu realisieren, das ebenfalls die IgM und das Komplement zu detektieren erlaubt und dabei auf denselben theoretischen Prinzipien der Immunreaktion in fester Phase und des Nachweises von Antigen-Antikörper-Komplexen durch Immunadhärenz von Indikator-Erythrozyten beruht, indem man Indikator-Erythrozyten herstellt, die zugleich Antiglobulin Anti-IgG und Anti-Komplement, insbesondere monoklonales Anti-C3d, tragen. Überraschenderweise sind diese Indikator-Erythrozyten genügend stabil, um im Laboratorium im großen Maßstab konditioniert, transportiert und verwendet zu werden. So ist es möglich, die Gesamtheit der Blutkompatibilitättests mit Hilfe eines einzigen Reagens (den Indikator-Erythrozyten) und mit einer einzigen Mikroplatte auszuführen, die zuvor mit der Serie von Antikörpern und/oder Test-Erythrozyten oder ihren Membranen bedeckt wurde.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Methode zur Herstellung von Indikator-Erythrozyten, die Anti-IgG und Anti-C3d tragen. Diese umfaßt drei Schritte: die beiden ersten dienen dazu, die zwei Marker auf den Erythrozyten zu fixieren, um sogenannte "sensibilisierte" Erythrozyten zu liefern, der letzte dient zur Fixierung der Antiglobuline auf diesen Markern.
Die Indikator-Erythrozyten stammen aus einem Pool von Erythrozyten 0 Rh positiv DCcEE.
Der erste Schritt besteht darin, das Komplement (man benutzt einen Pool von frischem AB-Serum als Komplementquelle) auf den Erythrozyten zu fixieren, eine Reaktion, die durch die Zugabe von Saccharose zu der Pufferlösung niedriger Ionenstärke bewirkt wird.
Das derart adsorbierte Komplement ist im Stadium C3bi. Man kann seine Aktivierung zum Stadium C3d durch eine Behandlung mit Trypsin bewirken. (Dieser Schritt ist nicht unbedingt nötig, denn das Antiglobulin Anti-C3d erkennt auch das Fragment C3bi.)
Die so erhaltenen, für C3d sensibilisierten Erythrozyten werden anschließend in die Gegenwart von Immunglobulinen der Klasse IgG, die gegen einen Antigenmarker der Erythrozyten gerichtet sind, gebracht. Man benutzt vorzugsweise ein monoklonales Immunglobulin, um eine bessere Reproduzierbarkeit zu erhalten, und verwendet beispielsweise IgG Anti-D.
Die Indikator-Erythrozyten sind also für C3d und für IgG sensibilisiert. Der dritte Schritt besteht darin, die entsprechenden Antiglobuline durch Immunadhärenz auf diesen beiden Markern zu fixieren. Die Konzentrationen von Antiglobulin Anti-IgG und Anti-C3d müssen richtig eingestellt werden, um die Fixierung der Indikator-Erythrozyten auf den Antigen-Antikörper-Komplexen in der Test-Mikroplatte zu erlauben, ohne eine Agglutination der Indikator-Erythrozyten untereinander zu ermöglichen.
Die Verwendung monoklonaler Antikörper erlaubt eine gute Standardisierung der Präparationsverfahren und garantiert ihre Reproduzierbarkeit, während mit den Antikörpern menschlichen Ursprungs die Affinitätskonstante von einem Spender zum anderen zwischen 1 und 10³ variieren kann.
Die durch diese Methode hergestellte Lösung von Indikator-Erythrozyten gemäß der Erfindung ist gebrauchsfertig für die immunhämatologischen Tests in fester Phase, und sie könnte auch in flüssiger Phase Anwendung finden. Diese Lösung von Indikator-Erythrozyten ist für mindestens vier Wochen stabil, d.h. man beobachtet keine Desorption der Antiglobuline.
Diese Lösung von Erythrozyten ist das erste ausgearbeitete polyvalente Reagens. Ihre Verwendung erlaubt somit, den Coombs-Test in fester Phase auf einer einzigen Mikroplatte auszuführen, wobei Erythrozyten und Mikroplatte zusammen einen gebrauchsfertigen Kit bilden können.
Ihre Verwendung erlaubt, zugleich die das Komplement fixierenden oder es nicht fixierenden IgG und die das Komplement fixierenden IgM zu detektieren und deshalb alle Klassen irregulärer Antikörper zu detektieren. Die Verwendung dieses Reagens ist also besonders für die Blutkompatibilitätstests vor den Transfusionen sowie für die Diagnostik von hämolytischen Krankheiten und Transfusionszwischenfällen geeignet. Diese Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Das folgende Beispiel schildert die Erfindung, ohne ihre Reichweite zu begrenzen.

Beispiel

Die Ausführung der Erfindung umfaßt mehrere Phasen:
- die Herstellung des Trägers (Mikroplatte),
- die Herstellung der Indikator-Erythrozyten,
- die Verwendung und Auswertung des Tests.
Das folgende Beispiel findet insbesondere auf die Untersuchung irregulärer Antikörper für Blutkompatibilitätstests Anwendung.

A. Herstellung des Trägers

Man verwendet als Träger Mikroplatten mit 96 vertiefungen des für Zellkulturen laufend verwendeten Typs.
Die phänotypierten Test-Erythrozyten stammen von regelmäßigen und unbezahlten Spendern, die mindestens zweimal in den meisten Blutgruppensystemen pHänotypiert wurden. Diese Erythrozyten sind in einer Aufbewahrungslösung (vom Alsever- Typ) suspendiert, die eine Stabilität von 28 Tagen sicherstellt.
Die Test-Erythrozyten werden am Boden der Vertiefungen der Mikroplatten fixiert,
- entweder durch eine kovalente Bindung, indem man am Boden der Vertiefungen Poly-L-lysin vom Molekulargewicht größer als 300000 oder Glutaraldehyd aufbringt,
- oder durch eine immunologische Bindung über den Umweg eines spezifischen Antikörpers (Anti-I, Anti-K, Anti- Glycophorin A, .66) eines auf den Test-Erythrozyten anwesenden Antigens.
Die so behandelten Mikroplatten sind mindestens zwei Monate stabil.
In gleicher Weise kann man Antikörper am Boden der Vertiefungen fixieren.

A.1. Beispiel der Behandlunq mit Poly-L-lysin

Der Träger (die Mikroplatte) wird für eine Stunde im Wärmeschrank bei 37ºC mit einer 0,2%igen Lösung von Poly-L-lysin vom Molekulargewicht größer als 300000 d in destilliertem Wasser behandelt (nach K. Carroll, B. Lannon und R. O'Kennedy, J. of Imm. Methods 1990; 129, 71).
Der Träger wird dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, bevor er vor Licht und Feuchtigkeit geschützt aufbewahrt wird. Dieser so behandelte Träger ist bei Umgebungstemperatur mindestens drei Monate stabil. Es genügt dann, 100 Mikroliter von nativen oder durch die proteolytischen Enzyme behandelten Test-Erythrozyten in 0,5%iger Suspension hinzuzufügen. Der Träger wird zwei Minuten bei 120 g zentrifugiert und dreimal in 0,15m Salzlösung gewaschen.

A.2. Herstellung von Membranen von Test-Erythrozyten

Man kann die Erythrozyten durch ihre Membranen ersetzen, die nach einer von Steck (Meth. of enzym. 1974, 31; 172-180) beschriebenen Technik hergestellt werden.
Man verwendet als Puffer für die Hämolyse einen hypotonischen Natriumphosphatpuffer, versetzt mit Magnesiumsulfat, und man läßt die Erythrozyten für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubieren.
Die mit den 0,5%igen Suspensionen von Erythrozyten 2 Minuten lang bei 120 g zentrifugierten Mikroplatten werden durch Umdrehen entleert, geschüttelt, um die "Klumpen" von überschüssigen Erythrozyten am Boden der Vertiefungen abzulösen. Sie werden dann mit Hilfe einer Vielkanal-Pipette mit dem Puffer dreimal mild und bis zum vollständigen Verschwinden der roten Färbung gewaschen (200 ul pro Vertiefung bei jeder Waschung).
Die in den Vertiefungen fixierten und in situ lysierten Membranen werden anschließend in einer 40%igen Lösung von Glycerin, versetzt mit 40 g/l Saccharose, 1 mmol/l MgSO&sub4; und einem Antibiotikum, stabilisiert. Die Mikroplatten werden zwei Stunden bei +4ºC mit dieser Lösung inkubiert, dann entleert, getrocknet, in Beutel mit einem Trocknungsmittel gebracht und bei +4ºC aufbewahrt.
Unter diesen Bedingungen sind die Membranen ungefähr 7 Wochen stabil.

B. Herstellung der Indikator-Erythrozyten

B.1. Fixierung des Komplements

Ein Pool von drei Typen von Erythrozyten 0 Rh positiv DCcEe wird sechsmal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, dann werden in einem Reagensglas 500 ul gewaschener globulärer Bodensatz mit 500 ul physiologischer Kochsalzlösung, darauf mit 8,5 ml Phosphatpuffer-Saccharose und mit 300 ul eines Pools von frischem AB-Serum (als Komplementquelle) versetzt.
Herstellung der Phosphatpuffer-Saccharose
1º 1,0m K&sub2;HPO&sub4;-Lösung
17,4 g auf 100 ml destilliertes Wasser 1,0m KH&sub2;PO&sub4; -Lösung
13,6 g auf 100 ml destilliertes Wasser
2º - Lösung A
0,5 ml 1m K&sub2;HPO&sub4; auf 100 ml destilliertes Wasser
- Lösung B
0,5 ml 1m KH&sub2;PO&sub4; auf 100 ml destilliertes Wasser
3º Phosphatpuffer-Saccharose
A zu B hinzufügen, bis pH 6,1 erreicht ist (Phosphatpuffer)
9,24 g Saccharose auf 100 ml Phosphatpuffer hinzufügen In gleiche Portionen von 5 ml aufteilen und bei -20ºC einfrieren.
Diese Saccharoselösung hat den Effekt, die Fixierung und die direkte Aktivierung des Komplements auf den Erythrozyten über den alternativen Pfad zu bewirken.
Nach Inkubation des Reagensglases für 30 Minuten im Wasserbad bei 37ºC ist die Aktivierung des Komplements im Stadium C3bi. Die Suspension der durch das Komplement sensibilisierten Erythrozyten wird zentrifugiert, dann wird der globuläre Bodensatz erneut viermal bis zum Verschwinden der Hämolyse gewaschen. Danach wird 1 ml 0,1%iges Trypsin hinzugefügt, und das Reagensglas wird erneut für 30 Minuten im Wasserbad bei 37ºC inkubiert. Das Trypsin führt zur Aktivierung und Spaltung von C3bi in C3d.
Die Erythrozyten 0 Rh positiv, endlich mit C3d bedeckt, werden erneut viermal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (bis zum Verschwinden der Hämolyse).

B.2. Fixierung von monoklonalem Immunglobulin IgG

In einem Reagensglas werden zu 150 ul Bodensatz von mit C3d bedeckten Erythrozyten 200 ul monoklonales Immunglobulin IgG Anti-D und 1 ml physiologische Kochsalzlösung hinzugefügt.
Das Reagensglas wird für 30 Minuten im Wasserbad bei 37ºC inkubiert, um die Fixierung des IgG Anti-D zu ermöglichen. Dann werden die sensibilisierten Erythrozyten erneut viermal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

B.3. Fixierung der Antiglobuline Anti-IgG und Anti-C3d

Zu dem Bodensatz von mit C3d und Anti-D bedeckten Erythrozyten 0 Rh positiv werden 300 ul Antiglobulin Anti-IgG und 1 ml Antiglobulin Anti-C3d hinzugefügt. Eine letzte Inkubation wird bei Umgebungstemperatur und, um die Agglutination der Erythrozyten zu verhindern, unter mäßigem, aber beständigem Rühren ausgeführt. Nach vier weiteren Waschungen in physiologischer Kochsalzlösung wird der Bodensatz von mit den zwei Antiglobulinen bedeckten Erythrozyten in einer Aufbewahrungslösung in Röhrchen aus sterilem Glas suspendiert. Stabilitätsversuche wurden ausgeführt: diese roten Blutkörperchen, die das Anti-IgG und das Anti-C3d fixiert haben, sind während vier Wochen verwendbar, ohne daß eine starke Desorption der Antiglobuline beobachtet wird.
Die Schwierigkeit dieser Präparation liegt in der Austarierung der Konzentrationen von Erythrozyten, Antikörpern, Komplement und Antiglobulin, damit eine Sensibilisierung der Erythrozyten erfolgt, ohne daß es zur Agglutination kommt.
Man verwendet ungefähr 100 ug/ml monoklonales IgG Anti-D (Stamm HM-16), 2,6 mg/ml Antiglobulin Anti-IgG und 2,7 mg/ml Gesamtproteine von Antiglobulin Anti-C3d (von ungefähr 30%iger spezifischer Aktivität). Der verwendete Antikörper IgG Anti-D ist ein monoklonaler Antikörper, dessen Produktionslinie von der Anmelderin entwickelt wurde, aber andere, vorzugsweise monoklonale Antikörper wird man ebenso verwenden können.

C. Verwendung und Auswertung des Tests

Die zu testenden Seren werden in die Mikroplatten verteilt, welche die pHänotypierten Zellen (oder ihre Membranen) oder gewählte Antikörper tragen.
Man verwendet im allgemeinen 50 Mikroliter Serum pro Vertiefung, gegebenenfalls versetzt mit 10 Mikrolitern "Puffer niedriger Ionenstärke" (BFI, wie in den klassischen Tests im Reagensglas).
Die Mikroplatten werden 35 min lang bei 37ºC (oder 15 min lang in Gegenwart von BFI) inkubiert, dann werden sie dreimal in 0,15m Salzlösung gewaschen.
Im Fall der Blutgruppenbestimmung AB0-D oder der Phänotypbestimmung Rh-K werden die zu testenden Erythrozyten einem am Boden der Vertiefungen fixierten spezifischen Antigen-Antikörper-Komplex hinzugefügt (z.B. Test-Erythrozyten D positiv, schwach durch ein Anti-D sensibilisiert: wenn der zu testende Erythrozyt D positiv ist, wird er mit dem am Boden der Vertiefung fixierten Komplex reagieren).
Während der Inkubation fixieren sich die vorhandenen Antikörper auf den entsprechenden Antigenen und führen gegebenenfalls zur Aktivierung des Komplements.
Diese Antigen-Antikörper-Reaktion wird indirekt durch den Zusatz der weiter oben beschriebenen Indikator-Erythrozyten sichtbar gemacht.
Dieser Test erlaubt, die Gesamtheit der irregulären Antikörper zu detektieren:
- IgG, die das Komplement nicht fixieren,
- IgG, die das Komplement fixieren (wenn sie in sehr kleiner Menge vorliegen, werden sie manchmal lediglich durch die Aktivierung des Komplements und die Fixierung des Anti- Komplements, Anti-C3d, detektiert),
- IgM, die das Komplement fixieren.
Es wurden bisher 11205 Seren von Patienten, 417 Antikörper und 24 Spezifititen untersucht.
Die folgende Tabelle zeigt die größere Empfindlichkeit des in fester Phase ausgeführten Tests, verglichen mit dem klassischen Test im Reagensglas in Gegenwart ebenfalls von Anti-C3d und von Anti-Ig4G.

Claims

1. Anzeigende Erythrozyten, die für eine Verwendung in der Immuno-Hämatologie zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplexen in fester Phase fertig sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie gleichzeitig das Antiglobulin anti-lgg und das Antiglobulin anti-C&sub3;d tragen.

2. Verfahren zur Herstellung von anzeigenden Erythrozyten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden drei Schritte umfaßt:

- einen ersten Schritt der Fixierung von Komplement und der Aktivierung des Fragments C&sub3;d, um C&sub3;d-sensibilisien:e Erythrozyten zu ergeben,

- einen zweiten Schritt einer Fixierung von Immunglobulin IgG, gerichtet gegen einen Antigen-Marker anzeigender Erythrozyten, um IgG-sensibilisierte Erythrozyten zu ergeben,

- einen dritten Schritt der Fixierung durch Immuno-Adhärenz von Antiglobulin anti- C&sub3;d und Antiglobulin anti-IgG an die sensibilisierten Erythrozyten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung des Komplements in Gegenwart von Saccharose bewirkt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung des Fragments C&sub3;d durch eine Behandlung mit Trypsin bewirkt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunglobulin ein monoklonales anti-D IgG ist.

6. Verwendung der Erythrozyten nach Anspruch 1 für den Nachweis von IgG, das Komplement bindet oder nicht und von IgM, das Komplement bindet.

7. Verwendung nach Anspruch 6 für Tests auf die Blutverträglichkeit vor Transfusionen oder zu einem diagnostischen Zweck.

8. Immuno-hämatologisches Kit für eine Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die Erythrozyten nach Anspruch 1 umfaßt, die durch das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 hergestellt werden können.