DE69228704T2

DE69228704T2 - Stabilisierte pharmazeutische formulierung, die wachstumshormon und asparagin enthält

Info

Publication number: DE69228704T2
Application number: DE69228704T
Authority: DE
Inventors: Hans Sorensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1991-12-20
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: US5851992A; RU2098130C1; JP3662580B2; NO942299L; RU94045921A; HUT69682A; DE69228704D1; CA2125856A1; KR940703689A; KR100270726B1; EP0618806A1; BG98804A; AU664416B2; DK204791D0; WO1993012811A1; ATE177645T1; NZ246555A; US5977069A; FI942905A0; SK73794A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte pharmazeutische, Wachstumshormone enthaltende Formulierung, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Formulierung und die Verwendung von Asparagin zu Stabilisierung einer Formulierung von Wachstumshormon.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Wachstumshormone des Menschen und der gewöhnlichen Haustiere sind Proteine mit etwa 191 Aminosäuren, die vom Vorderlappen der Hirnanhangsdrüse synthetisiert und ausgeschieden werden. Das Wachstumshormon des Menschen besteht aus 191 Aminosäuren.
Das Wachstumshormon ist ein Schlüsselhormon, das nicht nur an der Steuerung des Körperwachstums, sondern auch an der Steuerung des Stoffwechsels von Proteinen, Kohlenhydraten und Fetten beteiligt ist. Die Hauptwirkung des Wachstumshormons ist die Förderung des Wachstums.
Die vom Wachstumshormon betroffenen Organsysteme schließen das Skelett, Bindegewebe, Muskeln und Eingeweide, wie Leber, Darm und Nieren, ein.
Bis zur Entwicklung der Rekombinationstechnologie und dem Klonieren des Gens des Wachstumshormons, die jetzt die Produktion von z. B. Wachstumshormon des Menschen (hGH) und Met-hGH im Industriemaßstab erlauben, konnte das Wachstumshormon des Menschen lediglich durch Extraktion aus Hirnanhangsdrüsen von Leichen gewonnen werden. Die sehr begrenzte Verfügbarkeit mit Wachstumshormon hat dessen Anwendung auf die Förderung des Längenwachstums in der Kindheit und Pubertät zur Behandlung des Zwergwuchses beschränkt, obwohl seine Anwendung auch vorgeschlagen wurde, u. a. für die Behandlung von Zwergwuchs (hervorgerufen durch Mangel an Wachstumshormon, normalem Kleinwuchs und Turner-Syndrom), Mangel an Wachstumshormon bei Erwachsenen, Unfruchtbarkeit, Behandlung von Verbrennungen, Wundheilung, Ernährungsstörung, Knochenreparatur (bone knitting), Osteoporose, diffuse Magenblutung und Pseudoarthrose.
Weiterhin wurde vorgeschlagen, Wachstumshormon zur Steigerung der Wachstumsgeschwindigkeit von Haustieren einzusetzen oder um den Anteil von Fett in Tieren zu reduzieren, die zum menschlichen Verbrauch geschlachtet werden sollen.
Pharmazeutische Zubereitungen von Wachstumshormon neigen zu Instabilität. Abbauprodukte, wie desamidierte oder sulfoxidierte Produkte, und dimere oder polymere Formen bilden sich besonders in Lösungen von Wachstumshormon.
Die Hauptabbaureaktionen von hGH sind
1) Desamidierung durch direkte Hydrolyse oder über ein cyclisches Succinimid-Zwischenprodukt mit der Bildung unterschiedlicher Mengen L-asp-hGH, L-iso-asp-hGH, D-asp-hGH und D-iso-asp-hGH (Ref. 1-3),
2) Oxidation der Methioninreste in Pos. 14 und 125 (ReL 4-9) und
3) Spaltung von Peptidbindungen.
Desamidierung findet insbesondere am Asn in Pos. 149 statt.
hGH wird ziemlich leicht in Pos. 14 und 125 oxydiert, besonders in Lösung (4-8). Die Oxidation von hGH in Lösung unter Bildung von Sulfoxiden rührt normalerweise vom. Sauerstoff her, der in der Zubereitung gelöst ist. Die Löslichkeit von Sauerstoff in destilliertem Wasser beträgt etwa 200 uM (9). Da die Konzentration von hGH in einer Zubereitung, die 4 IE/ml enthält, 1,3 mg/ml beträgt, entsprechend 60 nM hGH, wird Sauerstoff, bei normalen Lagerbedingungen, in etwa 3.000-fachem Überschuß der stöchiometrischen Menge für die Oxidation von hGH vorhanden sein. Es ist nicht durchführbar, das Problem dadurch zu lösen, die Puffer vor dem Abfüllen und Verpacken der Zubereitungen zu entgasen.
Es wird gegenwärtig nicht angenommen, daß diese Abbauprodukte toxische oder veränderte biologische Aktivität oder Rezeptor-bindungseigenschaften hätten, aber es gibt Hinweise dahingehend, daß die Konformationsstabilität der Sulfoxide in Vergleich zu nativem hGH herabgesetzt ist.
Für die Entwickelung einer stabilen, gelösten Zubereitung mit hGH ist es wichtig, die Bildungsgeschwindigkeit der Sulfoxide und die Möglichkeiten der Kontrolle der Oxidation zu kennen.
Die Kinetik des Abbaus hängt von der Temperatur, dem pH-Wert und den verschiedenen Zusätzen und Hilfsstoffen in der hGH-Formulierung ab.
Wegen der Instabilität wird Wachstumshormon gegenwärtig gefriergetrocknet und in gefriergetrockneter Form bei 4ºC gelagert, bis es zur Verwendung zur ursprünglichen Konzentration rekonstituiert wird, um den Abbau zu minimieren.
Die gefriergetrockneten pharmazeutischen Zubereitungen von hGH werden gegenwärtig durch den Patienten rekonstituiert und dann als Lösung während des Gebrauchs über eine Zeitspanne von bis zu 14 Tagen bei 4ºC gelagert, während dessen ein gewisser Abbau stattfindet.
Weiterhin bereitet der Vorgang der Rekonstitution des gefriergetrockneten Wachstumshormons dem Patienten leicht Schwierigkeiten.
Es wird deshalb gegenwärtig bevorzugt, das Wachstumshormon so spät wie möglich vor Gebrauch zu rekonstituieren und die Zubereitung in gefriergetrocknetem Zustand zu lagern und zu versenden. Die Kette vom Hersteller bis zur Apotheke ist darauf ausgerichtet, die Zubereitungen bei einer kontrollierten tiefen Temperatur, z. B. 4ºC, zu handhaben, was eine lange Lagerzeit von bis zu zwei Jahren erlaubt.
Der ausgedehnte Gebrauch von Dosierstift-Systemen zur Selbstmedikation und das ausgedehnte Feld der Anwendung verlangen jedoch nach einer Zubereitung, die für eine hinreichend lange Zeit beim Endverbraucher stabil ist, unter Bedingungen, bei denen eine 'ausreichende' Kühlung nicht immer verfügbar ist.
Vorzugsweise sollte eine Zubereitung beim Endverbraucher in gefriergetrocknetem Zustand etwa einen Monat und zusätzlich einen Monat in rekonstituiertem Zustand in einem Dosierstift für die beabsichtigte Zeit der Verwendung einer Kartusche stabil sein.
Es gibt folglich ein Bedürfnis für stabilere Zubereitungen von Wachstumshormonen, die in gefriergetrocknetem Zustand bei einer vergleichsweise hohen Temperatur für eine gewisse Zeit, und zusätzlich für eine Zeitspanne des Verbrauchs bei vergleichsweise hoher Temperatur in Lösung stabil sind. Solch eine Stabilisierung ist von sehr großer Bedeutung, wenn das Verabreichen des Wachstumshormons von den Kliniken nach Hause verlagert wird, wo eine optimale Lagerung, wie vorstehend dargelegt, nicht möglich ist.
Weiterhin verlangt der Wechsel in der Form der Verabreichung von Wachstumshormon hin zur Verwendung von Dosierstiften nach einer stabilen, gelösten Wachstumshormon-Zubereitung, um die Handhabung durch den Patienten zu erleichtern. Eine stabile, gelöste Wachstumshormon enthaltende Zubereitung kann gebrauchsfertig in Form von Kartuschen hergestellt werden, die in Dosierstifte passen, die vom Patienten benutzt werden, der dann die Rekonstitution der Zubereitung vermeiden kann, und der deshalb nicht im Besitz einer gefriergetrockneten Zubereitung, eines geeigneten Lösungsmittels zur Rekonstitution sowie der notwendigen Fertigkeit und sterilen Ausrüstung für das sterile Verdünnen der Zubereitung auf die ursprüngliche Konzentration sein muß.
Aus Gründen der Sicherheit ist es auch wünschenswert, die Rekonstitution einer gefriergetrockneten Zubereitung unmittelbar vor dem Gebrauch der Zubereitung zu vermeiden.
Es wäre weiterhin auch ein Vorteil, den Gefriertrocknungsschritt bei der Produktion von Wachstumshormon-Zubereitungen zu vermeiden.
Gefriertrocknung ist ein zeitraubender und teurer Prozeß und stellt auch oft einen Engpaß in der Produktion dar, aufgrund der begrenzten Kapazität des Gefriertrockners.
Es besteht folglich eine Notwendigkeit, die Geschwindigkeit der Abbauprozesse herabzusetzen, die es gelösten hGH-Zubereitungen erlaubt, während der Lagerzeit und während der Zeitspanne des Gebrauchs bis zu einem Monat stabil zu sein.
Frühere Versuche, hGH zu stabilisieren, waren nicht völlig erfolgreich, die Bildung von Dimeren zu verhindern. Die Probleme, die mit der Dimerbildung verbunden sind, sind z. B. besonders erwähnt in Becker, G. W. Biotechnology and Applied Biochemistry 9 : 478 (1987).
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 89/09614 und die australische Patentanmeldung Nr. 30771/89 beschreiben eine stabile pharmazeutische Formulierung, die Wachstumshormon des Menschen, Glycin und Mannit enthält. Solch eine Zubereitung zeigt eine verbesserte Stabilität während der normalen Verarbeitung und Lagerung in gefriergetrocknetem Zustand wie auch in der Zeitspanne des Gebrauchs nach der Rekonstitution.
Die EP-A-303746 beschreibt, daß ein Tier-Wachstumshormon mit verschiedenen Stabilisatoren stabilisiert werden kann, was zu einer verminderten Bildung von unlöslichen Stoffen und einer Beibehaltung der Aktivität in Lösung in wäßrigen Medien führt, wobei solche Stabilisatoren bestimmte Polyole, Aminosäuren, Polymere von Aminosäuren, die eine geladene Seitengruppe bei physiologischem pH-Wert besitzen, und Cholinsalze einschließen. Polyole werden aus der Gruppe, bestehend aus nichtreduzierenden Zuckern, Zuckeralkoholen, Zuckersäuren, Pentaerythrit, Lactose, wasserlöslichen Dextranen und Ficoll, ausgewählt; Aminosäuren werden aus der Gruppe, bestehend aus Glycin, Sarcosin, Lysin oder deren Salzen, Serin, Arginin oder deren Salzen, Betain, N,N-Dimethylglycin, Asparaginsäure oder deren Salzen, Glutaminsäure oder deren Salzen, ausgewählt; ein Polymer einer Aminosäure, die eine geladene Seitengruppe bei physiologischem pH-Wert besitzt, kann unter Polylysin, Polyasparaginsäure, Polyglutaminsäure, Polyarginin, Polyhistidin, Polyornithin, und deren Salzen ausgewählt werden; und Cholinderivate werden aus der Gruppe ausgewählt, die Cholinchlorid, Cholindihydrogencitrat, Cholinbitartrat, Cholinbicarbonat, Tricholincitrat, Cholinascorbat, Cholinborat, Cholingluconat, Cholinphosphat, Di(cholin)sulfat und Dicholinmucat enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Zubereitung von Wachstumshormon des Menschen, die Asparagin als Zusatz oder Puffersubstanz enthält, eine sehr hohe Stabilität gegen Desamidierung, Oxidation und Spaltung von Peptidbindungen zeigt. Die Stabilität des Produktes ermöglicht es, dieses in gefriergetrocknetem Zustand oder in Form einer gelösten oder wiederaufgelösten Zubereitung zu lagern und zu versenden.
Die Zubereitung der Erfindung kann folglich vorliegen in Form eines gefriergetrockneten Pulvers, das später mit konventionellen Lösungsmitteln, wie destilliertem Wasser oder Wasser zur Injektion, rekonstituiert wird, oder in Form einer Lösung, die Wachstumshormon enthält. Solche Lösungsmittel können konventionelle Konservierungsmittel, wie m-Kresol und Benzylalkohol enthalten.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zubereitung von Wachstumshormon des Menschen, die Asparagin in der Form einer gepufferten, wäßrigen Lösung von Wachstumshormon, gepuffert mit Asparaginpuffer, enthält. Solch eine Zubereitung ist gebrauchsfertig und kann als wäßrige Lösung ohne erheblichen Abbau gelagert und versandt werden.
Aus Gründen der Stabilität wird der pH-Wert einer Lösung vorzugsweise auf einen Wert von 2-8 eingestellt. Zubereitungen mit einem pH-Wert von 5-8 werden stärker bevorzugt und am meisten bevorzugt werden Zubereitungen mit einem pH-Wert von 6-7,5.
Um den Stabilisierungseffekt zu erreichen, wird Asparagin vorzugsweise in einer Menge von bis zu 100 mM zugegeben. Die Konzentration des Asparagins liegt vorzugsweise in dem Intervall von 2-20 mM, insbesondere 2-10 mM.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann auch in Form einer gefriergetrockneten Zubereitung vorliegen.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann weiterhin Salze und Saccharide enthalten, um deren Verarbeitung, z. B. das Gefriertrocknen, zu erleichtern. Üblicherweise wird Mannit als Füllmittel zum Gefriertrocknen verwendet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Asparagin zur Herstellung einer stabilisierten Zubereitung von Wachstumshormon.
Im vorliegenden Zusammenhang kann 'Wachstumshormon' ein Wachstumshormon beliebigen Ursprungs, wie Vogel-, Rinder-, Pferde-, Menschen-, Schaf Schweine-, Lachs-, Forellen- oder Thunfisch- Wachstumshormon sein, vorzugsweise Rinder-, Menschen- oder Schweine- Wachstumshormon, wobei das Menschen-Wachstumshormon am meisten bevorzugt ist. Das erfindungsgemäß verwendete Wachstumshormon kann ein natives Wachstumshormon sein, das aus einer natürlichen Quelle, z. B. durch Extraktion von Hirnanhangsdrüsen in herkömmlicher Weise, isoliert werden kann, oder ein Wachstumshormon, das durch rekombinante Techniken, wie z. B. in E. B. Jensen und S. Carlsen, Biotech. and Bioeng. 36 : 1-11 (1990), beschrieben, hergestellt wird. Das 'Wachstumshormon' kann auch eine verkürzte Form von Wachstumshormon sein, aus dem ein(e) oder mehrere Aminosäurerest(e) entfernt worden ist (sind); ein Analogon davon, in dem ein oder mehrer Aminosäurerest(e) in dem nativen Molekül durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt worden ist (sind), vorzugsweise einen natürlichen Aminosäurerest, sofern die Substitution keine nachteilige Wirkung aufweist, Antigenizität oder reduzierte Wirkung; oder ein Derivat davon, z. B. mit einer N- oder C-terminalen Verlängerung, wie Met hGH, Met-Glu-Ala-Glu-hGh oder Ala-Glu-hGH. Das bevorzugte Wachstumshormon ist hGH.
In der vorliegenden Erfindung wird 'hohe Stabilität' erhalten, wenn die Zubereitung stabiler als die herkömmliche Formulierung ist, die einen Phosphatpuffer enthält.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff 'Salze' zur Bezeichnung zusätzlicher Bestandteile einer pharmazeutischen Zubereitung umfaßt solche herkömmlichen Salze, wie Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, oder Ammoniumsalze von organischen Säuren, wie Zitronensäure, Weinsäure oder Essigsäure, z. B. Natriumcitrat, Natriumtartrat, oder Natriumacetat, oder von Mineralsäuren, wie Salzsäure, z. B. Natriumchlorid.
'Saccharide' können Monosaccharide, Disaccharide oder Zuckeralkohole, wie Lactose oder Mannit, sein, die herkömmlicherweise für pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden.
Bei dem in den erfindungsgemäßen Zubereitungen verwendeten Lösungsmitteln kann es sich um Wasser, Alkohole, wie Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl- oder Butylalkohol, oder Gemische davon handeln. Das Lösungsmittel kann ein Konservierungsmittel, wie m-Kresol oder Benzylalkohol, enthalten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung wird ausführlicher in den nachstehenden Beispielen, die die Erfindung erläutern, erklärt.

EXPERIMENTELLER TEIL

BEISPIEL

Reduktion der Desamidierung

Die Geschwindigkeit der Desamidierung bei 25ºC wurde untersucht bei hGH- Zubereitungen, die 6 IE hGH bei pH-Wert 6,5 enthielten, in Gegenwart von 10 mM Asn im Vergleich zu 8 mM Phosphatpuffer bei gleichem pH-Wert und beim pH-Wert 7,3.
Die hGH-Zubereitungen wurden durch Auflösen von 20 mg hGH in 10 ml einer 10 mM Asparagin-Lösung, hergestellt durch Auflösen von 13,2 mg Asparagin in 10 ml entionisiertem Wasser, das 0,9% (Vol/Vol) Benzylalkohol enthält, und Zugabe von 0,1 N Salzsäure zur Einstellung des angegebenen pH-Wertes hergestellt.
Die hGH-Formulierungen, die in der nachstehenden Tabelle angegeben sind, wurden bei 25ºC gelagert und auf den Desamidierungsgehalt nach 14 und 30 Tagen durch IE-HPLC geprüft. Die Ergebnisse gehen aus der nachstehenden Tabelle hervor. Tabelle Gehalt von Desamido-hGH, bestimmt durch IE-HPLC als Funktion der Formulierung und der Zeit in Lösung bei 25ºC:
*): Enthält 0,9% Benzylalkohol außer Formulierung Nr. 3.
Der Desamido-hGH-Gehalt im Ausgangsmaterial betrug: 2,1%. nd: nicht bestimmt
Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß die Desamidierung von hGH durch Zugabe von Asparagin um etwa 25% vermindert wird im Vergleich zu dem Phosphatpuffer beim pH-Wert 6,5.
Die Zugabe von Asp oder Glu erhöht die Geschwindigkeit der Desamidierung im Vergleich zum Phosphat beim pH-Wert 6,5.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Geschwindigkeit der Desamidierung durch Verringern des pH-Wertes und durch Zugabe von Asparagin in geringer Konzentration von bis zu 100 mM, vorzugsweise etwa S mM, vermindert wird. Die Geschwindigkeit der Desamidierung kann zu über 50% durch Verringern des pH-Wertes und Ersetzen des Phosphatpuffers durch Asparagin erniedrigt werden.
Die Verwendung von m-Kresol oder Benzylalkohol als Konservierungsmittel scheint keinen Einfluß auf die Geschwindigkeit der Desamidierung zu haben.
Bruch-Bildung (Hydrolyse von Peptidbindungen) wird durch Asparagin bei pH- Wert 6,5 im Vergleich zum Phosphat verringert.

REFERENZEN

1) Y.-C. J. Wang und M. A. Hanson. Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers. J. Parenteral Science and Technology 42 (Suppl.) (1988) 53- 525.
2) M. C. Manning, K. Patel, R. T. Borchardt. Stability of Protein Pharmaceuticals Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918.
3) B. A. Johnson, J. M. Shirokawa, W. S. Hancock, M. W. Spellman, L. J. Basa and D. W Asward, J. Biol. Chem. 264, 1462-71 (1989).
4) L. C. Teh et al., J. Biol. Chem., 262, 785-794 (1987).
5) G. W. Becker et al., Biotech. Appl. Biochem., 10, 326-337 (1988).
6) R. A. Houghten et al., Arch. Biochem. Biophys., 178, 350-355 (1977).
7) R. M. Riggin et al., Anal. Biochem., 167, 199-209 (1987).
8) P. Gellerfors et al., Acta Paediatr. Scand (Suppl.), 370, 93-100 (1990).
9) M. J. Kaufman, Pharm. Res., 7 (3) 289-292 (1990).

Claims

1. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend ein Wachstumshormon und Asparagin.

2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1 in der Form einer gepufferten wässrigen Lösung von Wachstumshormon, die Asparagin enthält.

3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der pH auf einen Wert von 2-8 eingestellt ist.

4. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration an Asparagin bis zu 100 mM beträgt.

5. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zusätzlich Salze und Saccharide enthalten sind.

6. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-5. wobei das Wachstumshormon hGH ist.

7. Verwendung von Asparagin zur Herstellung einer stabilisierten Zubereitung von Wachstumshormon.