DE69216086T2

DE69216086T2 - Verfahren zur gewinnung von zellen, die informationen tragen

Info

Publication number: DE69216086T2
Application number: DE69216086T
Authority: DE
Inventors: William Dackowski; Timothy Houseal; Katherine Klinger; Karen Pavelka
Original assignee: IG LAB Inc
Current assignee: IG LAB Inc
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2012-05-02
Also published as: ES2097329T3; GR3022129T3; EP0583354A1; CA2102428A1; EP0583354B1; WO1992019967A1; DK0583354T3; ATE146594T1; DE69216086D1

Description

Die in situ-Hybridisierung ist zu einem Hauptforschungswerkzeug für Molekulargenetiker geworden, um in Zellen vorhandene spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen sichtbar zu machen. Ursprünglich in einem isotopen Format durchgeführt, werden nichtisotope Techniken, wie die Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung (FISH), schnell zum Verfahren der Wahl, weil sie schneller durchgeführt werden können, weil gleichzeitig mehrere Signale nachgewiesen werden können und weil die Hybridisierungssignale präziser lokalisiert werden können.
Im allgemeinen jedoch haben nichtisotope Verfahren unter fehlender Sensitivität gelitten, besonders, wenn die zu analysierenden Proben tote und/oder degradierende Zellen enthielten. Tote oder degradierende Zellen scheinen gegen eine in situ-Hybridisierung resistent zu sein, währscheinlich, weil die Kern-DNA selbst zu degradieren begann und/oder weil die Zellen nicht auf die während des Verfahrens angewendeten chemischen Reagentien antworteten. Die Gegenwart einer Probe von Zellen, die gegen in situ-Hybridisierung resistent sind, macht die Analyse informationstragender Zellen, die ebenso vorhanden sein können, schwierig.
US-A-4 888 278 offenbart ein Verfahren zur in situ-Hybridisierung einer Sonde an fixierten Zellen. Die Zellen werden auf einem festen Substrat ausplattiert und auf dem Substrat während 3 Tagen gezüchtet. WO89/05357 offenbart ein Verfahren zur in situ-Hybridisierung, worin CaSki-Zellen auf Glasobjektträger getüpfelt und fur 12 h bei 37ºC gezüchtet werden. Developmental Biology 61, 5. 114-117 (1977) offenbart eine modifizierte Glasperlensäule zur Trennung lebender von toten Mäusespermatozoen.
Ein Verfahren zur bevorzugten Isolierung informationstragender Zellen, die in einem in situ-Hybridisierungsassay klare Hybridisierungssignale liefern, wäre nützlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Zellen, die in in situ-Hybridisierungsassays Informationen tragen von nichtinformationstragenden Zellen in einer biologischen Probe durch: a) Erhalten zellulären Materials aus einer biologischen Probe; b) Übertragen des Materials auf ein Substrat; und c) Inkubieren des zellulären Materials auf dem Substrat für eine Zeitspanne im Bereich von 1 bis 60 min, damit sich informationstragende Zellen auf der Oberfläche des Substrats ansiedeln und die nichtinformationstragenden Zellen nicht.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung zellulären Materials für die in situ-Hybridisierung, wobei das oben beschriebene Verfahren zur Trennung informationstragender Zellen von nichtinformationstragenden Zellen verwendet wird. Haben sich die informationstragenden Zellen einmal abgesetzt, werden sie mit einem Fixiermittel in Kontakt gebracht, das Nucleinsäuren innerhalb des zellulären Materials bewahrt und zurückhält. Fixiertes zelluläres Material kann dann durch in situ-Hybridisierungstechniken analysiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das zelluläre Material mit einem Proteaseinhibitor (z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid oder Benzamidinnydrochlorid) und/oder einem Salz einer kurzkettigen Fettsäure (z.B. Natriumbutyrat, Natriumpropionat oder Natriumvalerat) vor der Fixierung in Kontakt gebracht.
In einem bevorzugten Verfahren, das insbesondere zur Gewinnung zellulären Materials, das aus einer Probe mit wenigen informationstragenden Zellen erhalten worden ist, nützlich ist, wird das zelluläre Material aus der Probe erhalten und auf ein Substrat, das einen Proteaseinhibibor (z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid oder Benzamidinhydrochlorid) und/oder ein Salz einer kurzkettigen Fettsäure (z.B. Natriumbutyrat, Natriumpropionat oder Natriumvalerat) enthält, übertragen. Die abgesetzten Zellen können dann während der Vorbereitung für die in situ-Analyse fixiert werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren liefern saubere Präparierungen informationstragender Zellen mit großen und flachen Kernen. Die in situ- Analyse solcher Präparierungen ist einfacher durchzuführen, und die Ergebnisse sind besser interpretierbar. Deshalb können diagnostische Berechnungen, die auf der in situ-Analyse basieren, unter Verwendung der offenbarten Verfahren mit größerer Zuverlässigkeit durchgeführt werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, daß informationstragende Zellen von nichtinformationstragenden Zellen durch ein Absetzungsverfahren getrennt werden können. Informationstragende Zellen sind Zellen, die in einem in situ-Hybridisierungsassay ein interpretierbares Hybridisierungssignal liefern. Im Gegensatz dazu liefern nichtinformationstragende Zellen, wie tote oder degradierende Zellen, kein interpretierbares Hybridisierungssignal. Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform basiert auf der Feststellung, daß gewisse Mittel während des Absitzens der Zellen zugegeben werden können, um saubere Präparierungen informationstragender Zellen mit großen und flachen Kernen zu liefern, die in der in situ-Hybridisierungsanalyse schneller analysiert werden können.
Zelluläres Material, wie fetale Zellen (z.B. erhalten aus ämniotischer Flüssigkeit, maternem Blut, Nabelschnurblut, Chorionzottengewebe oder zervikalen Sekreten), Lymphocyten (z.B. erhalten aus Blut), embryonischen Zellen (z.B. erhalten aus biopsierten Embryonen) und Krebszellen (z.B. erhalten aus einem Tumor) kann aus einer biologischen Probe erhalten werden nach Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Zelluläres Material kann dann auf einem Substrat, wie Glas, Kunststoff oder Nitrocellulose, abgelegt werden. Ein Glasobjektträger wird bevorzugt, weil er leichter manipuliert und unter einem Mikroskop angesehen werden kann. Das Substrat kann mit einem "Zellhaftmittel" vorbehandelt werden, was die Wahrscheinlichkeit, daß eine Zelle, die sich auf der Oberfläche absetzt, während der nachfolgenden Manipulationen haften bleibt, erhöht. Ein bevorzugtes Zellhaftmittel ist 3-Aminopropyltriethoxysilan. Behandlung mit diesem Haftmittel resultiert in "silanisierten" Substraten Weitere erfindungsgemäß nützliche Haftmittel schließen ein: Poly-L-Lysin und Musselhaftmittel (mussel adhesin). Die Vorbehandlung der festen Substrate kann durch Anwendung irgendeines Verfahrens durchgeführt werden, das sicherstellt, daß sich das Zellhaftmittel absetzt (z.B. Eintauchen, Ubertragen mit einem Tropfenzähler etc.). Vorbehandelte feste Substrate können in einer staubfreien Umgebung bei Raumtemperatur gelagert werden.
Einmal auf einem Substrat abgelegt, kann zelluläres Material so inkubiert werden, daß sich vorzugsweise informationstragende Zellen ansiedeln. Die Inkubationsdauer muß lange genug sein, damit sich eine ausreichende Zahl an Zellen mit intakten Zellmembranen ansiedeln, aber nicht so lange, daß Zellmenbranen beschädigt werden, und sich Zell- und andere Trümmer ansiedeln. Die angemessene Inkubationsdauer liegt im Bereich von 1 bis 60 min, wobei etwa 15 bis etwa 30 min optimal sind. Für das Anwachsen bevorzugter Zellen scheint es keine starke Temperaturabhängigkeit zu geben. Z.B. wurden Experimente bei Raumtemperatur und bei 37ºC durchgeführt ohne klaren Unterschied in der Qualität der Präparation.
Gewisse Mittel können der gepufferten lösung während des Ansiedelns zugegeben werden, um das bevorzugte Absetzen informationstragender Zellen weiterzuverstärken. So wurde z.B. gefunden, daß Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) die Ansiedlungseffizienz weiter verbessert. Es scheint vernünftig anzunehmen, daß andere Proteaseinhibitoren wie z.B. Benzamidinhydrochlorid (BZA) sich im bevorzugten Ansiedeln informationstragender Zellen vor nichtinformationstragenden Zellen als nützlich erweisen.
Das oben beschriebene Ansiedlungsverfahren ergibt die Trennung informationstragender Zellen von nichtinformationstragenden Zellen. Werden die informationstragenden Zellen dann analysiert, z.B. in einem Hybridisierungsassay, können sie weiter behandelt werden, wobei saubere Präparationen mit großen und flachen Kernen hergestellt werden. Z.B. scheint ein Salz einer kurzkettigen Fettsäure (wie Natriumbutyrat, Natriumpropionat und Natriumvalerat), wenn es der Präparation zugegeben wird, Kerne aus den Zellen freizusetzen, wodurch die Kerne einer in situ-Hybridisierung besser zugänglich gemacht werden. Es wurde ebenso gefunden, daß die Inkubation informationstragender Zellen in einer hypotonischen lösung das Anschwellen der Zellen induziert, wodurch die Zellbestandteile auseinandergespreizt werden und sich die Wahrscheinlichkeit, daß der Kern der Endpräparation gut ausgesetzt ist, erhöht.
Informationstragende Zellen können dann nach einem Fixierungsprotokoll bearbeitet werden, um den Kern oder das Chromosom in einem morphologisch stabilen Zustand zu konservieren, so daß die Nucleinsäuren durch die harten Bedingungen, die während der in situ-Hybridisierung vorhanden sind, zurückbehalten werden. Geeignete Fixiermittel sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und schließen z.B. 4 % Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter lösung (PBS), die 5 mM MgCl&sub2; enthält, ein Fixiermittel, das 3 Teile Ethänol und 1 Teil Essigsäure enthält, Carnoy-Fixiermittel, 1 % Osmiumtetraoxid, Bouin-Fixiermittel, und Zenker-Fixiermittel ein. Um den Verlust zellulären Materials von einem Träger zu vermeiden, kann das Fixiermittel entweder in einer kleinen Menge direkt auf das abgelegte (angesiedelte) Material angewendet werden oder ein größeres Volumen einer verdünnten lösung kann angewendet werden. Die Träger können dann zur Vorbereitung für die in situ-Analyse getrocknet werden.
Ein Kit, umfassend die erfindungsgemaßen lösungen, der zur Gewinnung zellulären Materials verwendet werden kann, kann hergestellt werden. Er kann z.B. einen Behälter zum Halten der benötigten Bestandteile, Träger, auf denen zelluläres Material abgelegt werden kann, lösungen zur Fixierung informationstragender Zellen, einen Proteaseinhibitor (z.B. PMSF oder BZA) und eine kurzkettige Fettsäure (z.B. Natriulributyrat, Natriumpropionat oder Natriumvalerat) einschließen. Ggf. kann ein Kit auch Sonden und lösungen zum Farben der Sonden enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgend angeführten Beispiele näher erläutert, die die Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.

Beispiel 1: Verfahren zur Präparierung einer Zellprobe zur in situ- Analyse

Lösungen

PBS:
32 g NaCl, 0,8 g KCl und 8,68 g NaH&sub2;PO&sub4;.7H&sub2;O. Mit destilliertem H&sub2;O auf 4 l auffüllen, pH auf 7,5 einstellen.
Carnoy-Fixiermittel:
75 ml Methanol
25 ml Eisessig
0,075 M KCl:
5,59 g KCl in 1 l destilliertem H&sub2;O auflösen. Mit einem 0,2 um Filterkolben steril filtrieren.
30 % Fix in 0,075 M KCl:
3 ml Carnoy-Fixiermittel
7 ml KCl

Herstellung von Aminoalkylsilan-beschichteten Objektträgern

Eine 2%ige lösung 3-Aminopropyltriethoxysilan wurde durch Mischen von 5 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan mit 250 ml Aceton hergestellt. Saubere Glasobjektträger wurden in einen Objektträgerständer gestellt und für 2 min in der oben beschriebenen 2%igen lösung eingetaucht. Nach dem Eintauchen wurden die Objektträger aus der lösung entfernt und mit destilliertem Wasser gespült, wobei das Wasser zweimal gewechselt wurde. Die Objektträger ließ man dann ablaufen und an der Luft trocknen. So hergestellte Objektträger wurden in staubfreien Behältern bei Raumtemperatur gelagert.

Probenvorbereitung zum Absiedeln auf Objektträgern

Eine Probe amniotischer Flüssigkeit wurde in einer Zentrifugenröhre bei 2100 UpM (1029 G) während 7 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde dann durch Absaugen entfernt. Der verbleibende Niederschlag wurde in 50 µl PBS pro 1 ml Absgangsflüssigkeitsvolumen resuspendiert. 25 µl des in PBS resuspendierten Niederschlags wurden dann auf einen silianisierten Glasobjektträger (wie oben hergestellt) gegeben. War eine wesentliche Menge Blut in der amniotischen Flüssigkeit vorhanden, so wurde ein Tropfen aus 30 % 3:1 Methänol:Eisessig-Fixiermittel (Carnoy-Fixiermittel) in 70 % 0,075 M KCl zugegeben.
In einer feuchten Kammer wurden bei einer Temperatur von 37 ºC die Objektträger für 15 min horizontal gelegt. Diese Inkubationszeit erlaubt es den informationstragenden Zellen, sich ungestört auf der Oberfläche der silanisierten Objektträger anzusiedeln, während tote Zellen und andere Zellen mit beschädigten Membranen im Puffer schweben bleiben.

Herstellung von auf Objektträgern angesiedelten Zellen zur in situ- Analyse

Nach 15 min wurden 50 µl 0,075 M KCl hypotonische lösung (auf 37ºC vorgewärmt) schonend der gepufferten lösung, die das resuspendierte Zellpellet enthält, zugegeben, gefolgt von einer zusätzlichen 15minütigen Inkübation in der beheizten feuchten Kammer. Die hypotonische Lösung ruft bei lebensfähigen Zellen ein Anschwellen hervor, was ein Entfernen des Cytoplasmas und der Zellmembran in den nachfolgenden Stufen erleichtert.
Nach 15minütiger Inkübation in KCl bei 37ºC wurde die Flüssigkeit sanft von jedem Objektträger gekippt (zur Seite, nicht der Länge nach). Die Objektträger ließ man bei dieser Stufe nicht austrocknen. Nachdem jeder Objektträger abgekippt wurde, wurde er flach auf ein Papiertuch gelegt und 100 µl 30 % Carnoy-Fixiermittel in 70 % 0,075 M KCl wurden vorsichtig zugegeben. Während einer Dauer von 5 min ließ man die Objektträger bei dieser Bedingung ungestört. Die 30 % Fix/KCl-lösung reißt angeschwollene Zellmembranen auf und konditioniert die Zellen an den Fix.
Nach einer 5minütigen Inkubationsdauer wurde die Flüssigkeit sanft von jedem Objektträger gekippt. Die Objektträger ließ man nicht austrocknen. 5 bis 6 Tropfen frisches unverdünntes Carnoy-Fixiermittel ließ man sofort auf den Bereich des Objektträgers tropfen, der die fetalen Zellen enthielt. Die Objektträger wurden für ungefähr 5 min inkubiert, dann in einen 60ºC-Objektträgerwärmer gegeben und trocknen gelassen. Diese fixierende Behandlung zerreißt alle verbleibenden Membranen und spült anhaftende Rückstände weg, während die Kerne auf dem Objektträger fixiert werden.
Einmal getrocknet, wurden Objektträger, die fixierte Zellen enthielten, vor der Hybridi sierung mehrfach mit Ethanol behandelt. In Coplingefäßen wurden die Objektträger nacheinander mit 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethänol in jeder Verdünnung für 1 min in Kontakt gebracht. Die Objektträger ließ man dann bei Raumtemperatur trocknen.

Beispiel 2: Verfahren zur Herstellung einer Zellprobe zur in situ- Analyse, das die Zugabe von Natriumbutyrat und PMSF enthält

Proben amniotischer Flussigkeit wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, aber mit den folgenden Modifikationen:
1. Natriumbutyrat wurde bis zu einer Konzentration von 10 mM zugegeben, und die Proben wurden bei Raumtemperatur für bis zu 2 h inkubiert. Nachfolgende Experimente haben gezeigt, daß die Inkubation nur 5 min zu dauern braucht oder daß die Inkubation sogar ganz weggelassen werden kann.
2. 20 mM Natriumbutyrat und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid wurden dem Puffer, der zum Resuspendieren des durch Zentrifugation erhaltenen Niederschlags verwendet wurde, zugegeben.

In situ-Hybridisierungsanalyse

Fixierte Objektträger wurden für 1 bis 2 h vor der Hybridisierung in einen 60ºC-Objektträgerwärmer gegeben. Eine Nucleinsäuresonde einer endogenen Maussequenz mit einer Länge von etwa 35 kb wurde mit Biotin durch Nick-Translation markiert. Jede Hybridisierungsreaktion enthielt 5 bis 10 ng/µl der Biotin-markierten Sonde, 100 ng/µl Maus-Cot-1 DNA 900 ng/µl Lachs-DNA in einem Cocktail aus 50 % deionisiertem Formamid, 6XSSC und 10 % Dextransulfat. Ein 5 bis 10 µl Alignot des Hybridisierungscocktails wurde auf jede Stelle gegeben, mit einem Deckgläschen überdeckt und mit Kautschuklösung versiegelt. Sonde und Matrix wurden gleichzeitig für 7 bis 10 min bei 80ºC denaturiert. Nach Übernacht-Hybridisierung bei 37ºC wurden die Objektträger auf die folgende Weise behandelt: Objektträger wurden für 3 bis 5 min in 50 % Formamid/2XSSC bei 42ºC, 1 bis 5 min in 2XSSC bei Raumtemperatur und 3 bis 5 min in 0,1XSSC bei 60ºC gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation bei 37ºC in 3 % BSA/4XSSC für 5 min blockiert. Die hybridisierte Sonde wurde nachgewiesen mit einer lösung, die 2,0 ng/µl Cy3, konjugiert an Streptavidin in 1 % BSK, 0,1 % Tween 20 und 4X SSC enthielt; die Präparate wurden in dieser Lösung während 20 min bei 37ºC inkubiert. Abschließend an den Nachweis wurden die Objektträger für 3 bis 5 min in 4x Ssc mit 0,1 % Tween 20 bei 42ºC gewaschen, dann wurden sie in 2X SSC während mindestens 5 min bei Raumtemperatur gewaschen. Präparate wurden mit 4'6-Diamidino-2- Phenylindol (DAPI) gegengefärbt und in 2,33 % DABCO (Sigma, #D2522) in 100 mM Tris (8,0) und 90 % (Vol.:Vol.) Glycerin montiert. Posthybridisierungs-Waschen und -nachweis wurden im wesentlichen, wie in Klinger et al., AM. J. Hum. Genet. 51(1): inpress (1982) beschrieben, ausgeführt.

Ergebnisse:

In einem Seite-an-Seite-Vergleich mit der gleichen amniotischen Flüssigkeitsprobe wurden sehr viel mehr informationstragende Kerne wiedergewonnen, wenn man das in Beispiel 1 beschriebene Protokoll verwendet. Zwischen 3- bis 2smal mehr Kerne wurden wiedergewonnen, und von diesen waren 88 % (im Durchschnitt) in der Lage, zu hybridisieren. Die Absolutzahl an Kernen war größer, und ein größerer Teil dieser Zellen trug Informationen. Deshalb braucht man weniger Probe, um eine Analyse durchzuführen. Die meisten Hybridisierungssignale waren in der gleichen fokalen Ebene oder konnten von einer fokalen Ebene aus gesehen werden, was darauf hindeutet, daß diese Kerne auch flacher waren als diejenigen, die unter Verwendung des Protokolls in Beispiel 1 wiedergewonnen wurden.

Beispiel 3: In situ-Analyse der Zellen von Embryonen

Embryorückgewinnung und Zellgewinnung zur FISH

Embryonen im 8- bis 16-Zellstadium wurden aus dem Uterus/den Eileitern von schwangeren Frauen mit Hanks-gepufferter Salzlösung (HBSS) und BSA ausgespült. Die Zona-pellucida wurde aus der Morula entfernt, indem sie kurz einer vorgewärmten sauren Tyrodeslösung (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Hrg. Hogan Constantini und Lacy (Cold Spring Harbor Laboratory), 1986 ausgesetzt wurde. Die Embryonen im Morulastadium wurden dann in Calcium-freiem CZB-Medium mit 5 mg/ml BSA während 20 min bei 37ºC in Luft mit 5 % CO&sub2; inkubiert, um die Erribryonen auseinanderzudrängen. Die Embryonen wurden dann mit einer polierten Mikropipette zu Einzelzellen disaggregiert. Sodann wurden die dissoziierten Morulazellen für die FISH behandelt.
Die Zellen wurden in 10 µl TB-Puffer (T-Puffer: 1 mM Tris; 25 mM KCl; 0,9 mM CaCl&sub2;; und 0,9 mM MgCl&sub2; bei pH 7,6; TB-Puffer: T-Puffer plus 20 mM Natriumbutyrat oder TB/PMSF-Puffer: TB-Puffer, der eine 1/100-Verdünnung von 50 nM EMSF in Isopropanol enthält) auf einen siliconisierten Teflon -maskierten Glasobjektträger (Cel-line Assoc, Newfield, N.J.) für 15 min überführt. Sodann wurden 20 µl 0,3 % hypotonisches Natriumchlorid dem Tropfen für 15 min zugegeben. Eine Fixierung wurde durch Zugabe von 5 µl Carnoys (3:1 Methanol:Eisessiglösung) für 10 min erreicht, gefolgt von der Zugabe von 40 bis 60 µl Carnoys. Die Proben ließ man an Luft trocknen, oder uberschüssiges Fixiermittel wurde in einigen Wällen dadurch entfernt, daß man den Objektträger leicht zur Seite kippte und dann in einer feuchten Kaamer langsam trocknen ließ.

In situ-Hybridisierungsanalyse

Fixierte Objektträger wurden für 1 bis 2 h vor der Hybridisierung in einen 60 ºC-Objektträgerwärmer gegeben. Eine Nucleinsäuresonde einer endogenen Mausseguenz mit einer Länge von etwa 35 kb wurde mit Biotin durch Nick-Translation markiert. Jede Hybridisierungsreaktion enthielt 5 bis 10 ng/µl der Biotin-markierten Sonde, 100 ng/µl Maus-Cot-1 DNA, 900 ng/µl Lachs-DNA in einem Cocktail aus 50 % deionisiertem Formamid, 6XSSC und 10 % Dextransulfat. Ein 5 bis 10 µl Aliquot des Hybridisierungscocktails wurde auf jede Stelle gegeben, mit einem Deckgläschen überdeckt und mit Kautschuklösung versiegelt. Sonde und Matrix wurden gleichzeitig für 7 bis 10 min bei 80ºC denaturiert. Nach Ubernacht-Hybridisierung bei 37ºC wurden die Objektträger auf die folgende Weise behandelt: Objektträger wurden für 3 bis 5 min in 50 % Formamid/2XSSC bei 42ºC, 1 bis 5 min in 2XSSC bei Raumtemperatur und 3 bis 5 min in 0,1XSSC bei 60ºC gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation bei 37ºC in 3 % BSA/4XSSC für 5 min blockiert. Die hybridisierte Sonde wurde nachgewiesen mit einer lösung, die 2,0 ng/µl Cy3, konjugiert an Streptavidin in 1 % BSA, 0,1 % Tween 20 und 4X SSC enthielt; die Präparate wurden in dieser lösung für 20 min bei 37ºC inkubiert. Abschließend an den Nachweis wurden die Objektträger für 3 bis 5 min in 4X SSC mit 0,1 % Tween 20 bei 42ºC gewaschen, dann wurden sie in 2X SSC für mindestens 5 min bei Raumtemperatur gewaschen. Präparate wurden mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) gegengefärbt und in 2,33 % DABCO (Sigma, #D2522) in 100 mm Tris (8,0) und 90 % (Vol.:Vol.) Glycerin montiert. Posthybridisierungs-Waschen und -nachweis wurden im wesentlichen, wie in Klinger et al., Am. J. Hum. Genet. 51(1): inpress (1982) beschrieben, ausgeführt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Insgesamt 209 Morulazellen wurde aus drei unabhängigen Experimenten erhalten; 166 davon (79,5 %) wurden nach dem Behandeln in der beschriebenen Weise wiedergewonnen. Ein Hybridisierungssignal wurde bei allen (100 %) der wiedergewonnenen Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse beweisen eine gute Rückgewinnung embryonischer Zellen (beinahe 80 %) und eine 100%ige Hybridisierungseffizienz. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß diese Verfahren auf die Analyse biopsierter Zellen eines preimplantierten Embryos angewendet werden können. Tabelle 1

Claims

1. Verfahren zur Trennung von Zellen, die in einem in-situ- Hybridisierungsassay Information tragen, von nicht-informationstragenden Zellen, die in einer biologischen Probe vorhanden sind, umfassend die Stufen:

a) Gewinnen eines zellulären Materials aus einer biologischen Probe;

b) Übertragen des in Stufe a) erhaltenen zellulären Materials auf ein Substrat; und

c) Inkubieren des zellulären Materials auf dem Substrat für eine Zeitspanne im Bereich von 1 bis 60 Minuten, wobei sich informationstragende Zellen auf der Oberfläche des Substrats ansiedeln und die nicht-informationstragenden Zellen nicht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mit einem Zellhaftmittel vorbehandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zelluläre Material mit einem Protease-Inhibitor in Kontakt gebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Protease-Inhibitor ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phenylmethylsulfonylfluorid und Benz amidinhydrochlorid.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Protease-Inhibitor Phenylmethylsufonylfluorid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zelluläre Material mit einem Salz einer kurzkettigen Fettsäure in Kontakt gebracht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz der kurzkettigen Fettsäure ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Natriumbutyrat, Natriumpropionat und Natriumvalerat.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz der kurzkettigen Fettsäure Natriumbutyrat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen fetale Zellen sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Amnionflüssigkeit, Chorionzottengewebe, materne cervicale Sekrete, Nabelschnurblut und maternes Blut.

11. Verfahren zur Gewinnung des zellulären Materials für die in-situ-Hybridisierungsanalyse, umfassend die Stufen:

Trennung informationstragender Zellen von nicht-informationstragender Zellen nach einem Verfahren, gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 oder 10;

und Inkontaktbringen des zellulären Materials mit einem Fixiermittel, wodurch ein fixiertes zelluläres Material hergestellt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe ein Embryo ist.