DE69133067T2

DE69133067T2 - Menschliche cyclin-a-zusammensetzungen, verfahren zu ihrer herstellung, nukleotidsequenz, verfahren und wirkstoffe zur bestimmung oder diagnose von zellvermehrung, verfahren und wirkstoffe zur hemmung der zellvermehrung

Info

Publication number: DE69133067T2
Application number: DE69133067T
Authority: DE
Inventors: Christian Brechot; Xavier Chenivesse; Berthold Henglein; Jian Wang; Frederique Zindy
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1990-02-12
Filing date: 1991-02-06
Publication date: 2003-05-08
Anticipated expiration: 2011-02-07
Also published as: DE69133067D1; FR2658204B1; US6103887A; ES2181667T3; EP0471804B1; WO1991012324A1; ATE220717T1; EP0471804A1; US5849508A; FR2658204A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Zusammensetzungen, die ein Human-Cyclin A mit einer erhöhten Konzentration und/oder einem erhöhten Reinheitsgrad enthalten, wobei die Zusammensetzungen insbesondere zur Herstellung von Mitteln zur Feststellung von Cyclin verwendet werden können, wie insbesondere Antiseren oder Antikörper, die monoklonal sind oder nicht.
Die Erfindung betrifft auch eine Antisense-cDNA, die komplementär zur Nukleotidsequenz ist, die für das Human-Cyclin A kodiert, sowie Expressionsvektoren, die diese cDNA enthalten.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren sowie Mittel zur Feststellung oder Diagnose der Zellproliferation.
Schließlich betrifft die Verbindung ein Verfahren und Mittel zur Inhibierung der Zellproliferation.
Es ist bekannt, dass die chronische Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) ein Risikofaktor für die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms (22-24) ist und es wurde festgestellt, dass die provirale DNA des HBV-Virus sich häufig in das Genom von tumoralen Humanzellen des primären Leberkrebses integriert (1-4). Jedoch ist die Rolle, die diese Integration bei der Karzinogenese der Leber spielt, noch nicht geklärt und die Beweise für eine direkte Rolle des Virus bei der Zelltransformation sind gering.
Insbesondere sind die Wirkungen der Integration der viralen DNA in das Zellgenom widersprüchlich. Beim amerikanischen Murmeltier hat sich das Hepatitis Virus des Murmeltiers (WHV) häufig als desregulierend für das MYC nach der viralen Insertion gezeigt (25). Beim Menschen induziert die Integration des HBV häufig in anscheinend nicht-spezifischer Weise Deletionen und Translokationen (3, 26-28). Es wurde jedoch angenommen, dass die Integration in das Chromosom 11 (3) sowie die Umlagerung auf einen Ort des Chromosoms 4q (29, 30) in nicht zufälliger Form erfolgen. Die Integration des HBV in der Nachbarschaft eines Zellgens wurde einzig bei einem Tumor aufgezeigt, bei dem die virale DNA das für den β-Rezeptor der Retinolsäure kodierende Gebiet unterbrochen hat (31, 32).
J. Wang et al., Nature 343: 555-557, 8. Februar 1990, haben die Existenz einer individuellen Integrationsstelle der DNA des HBV-Virus im Humangenom (Chromosom 4q27) beschrieben und insbesondere in einem Gen, das für ein Human-Cyclin A kodiert, dessen Existenz bei der gleichen Gelegenheit entdeckt wurde; diese Integration tritt in Leberzellen zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentwicklung ohne bemerkenswerte Chromosomenumlagerung auf und zeigt keine histologischen Charakteristika für die chronische Hepatitis oder Zirrhose in einer klonalen Proliferation einer Zelle, die eine einzige HBV Integration enthält, die in dem benachbarten Lebergewebe nicht vorhanden ist, so dass es mehr als wahrscheinlich ist, dass durch Desregulierung der Funktion des Cyclin-A, die daraus resultiert, diese Insertion direkt in die Leberkarzinogenese einbezogen wird. Dieses Dokument veröffentlicht die für dieses Cyclin A kodierende Nukleotidsequenz und erinnert daran, dass die Cycline während der Phase G2//M des Zellzyklus intervenieren.
Im Rahmen der Erfindung wurde gefunden, dass die Expression des Cyclin A (mRNA und Protein) im Moment der Phase S und der Phase G2/M des Zellzyklus auftritt und daher mit der Zellteilung assoziiert ist. So wurde auch in der Rattenleber bei der Regeneration nach partieller Hepatectomie, die zu einer Synthese der Zell-DNA in einem großen Anteil von Hepatocyten führte, eine maximale Expression von Cyclin A (mRNA und Protein) zum Zeitpunkt der Phase der Synthese S der Zell-DNA, gefunden.
In gleicher Weise haben die Erfinder festgestellt, dass die Expression von Cyclin A bei akuten myeloblastischen hyperleucocytären Leukämien zum Zeitpunkt der raschen Verdoppelung maximal war und sehr schwach war beim einfachen Leberkrebs, bei dem die Verdoppelungszeit des Tumors langsam ist.
Die Erfinder haben auch gefunden, dass es möglich ist, die Synthese von Cyclin A in Hepatocyten mittels einer DNA von "Antisense" Human-Cyclin A zu blockieren.
Erfindungsgemäß wurde die entsprechende DNA an der Insertionsstelle geklont und es wurden Expressionsvektoren konstruiert, die die Erzeugung einer großen Menge von kodiertem Cyclin A ermöglichten. Die Erfindung ermöglichte die Herstellung von Human-Cyclin A durch genetische Expression, sowie die Herstellung von konzentrierten Zusammensetzungen an Human-Cyclin A mit einem erhöhten Reinheitsgrad.
Die isolierte Nukleotidsequenz, die für das Human-Cyclin A kodiert, markiert als Nummer: 1 in der beigefügten Sequenzliste, zeigt einen Fehler für einige Nukleotide in der N- terminalen Partie, bezogen auf die von J. Wang et al. (siehe oben) veröffentlichte Sequenz. Vektoren, die die für das Cyclin A kodierende Sequenz enthalten und/oder exprimieren, können hergestellt werden.
Diese Sequenz kann an andere übliche Einheiten, wie Promotoren, Initiations- oder Haltesignale oder Introne oder andere Sequenzen, die an der Extremität 3' und/oder 5' nicht kodieren, assoziiert sein. Sie umfasst auch die Varianten, die insbesondere durch Substitution von Kodonen oder Nukleotiden erhalten werden, die die Signifikation des Codes beibehalten oder durch Substitutionen, Insertionen oder Deletionen und für ein äquivalentes Polypeptid kodieren und insbesondere die antigene Wirkung des Polypeptids beibehalten. Sie umfasst auch jegliches Fragment, das die Expression eines Polypeptids ermöglicht, das diese antigene Wirkung beibehält. Schließlich erstreckt sich die Sequenz auch auf ein Gen des Human-Cyclin A, welches bestimmte oder sämtliche Elemente eines Operons umfasst oder nicht umfasst und frei von natürlichen flanktierenden Sequenzen ist sowie jegliches Fragment, das die Expression eines Polypeptids ermöglicht, das eine antigene Wirkung von Cyclin A beibehält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Diagnose der Zellproliferation, bei dem man ausgehend von einer Probe von Zellen oder Geweben den Gehalt an Human- Cyclin A bestimmt, insbesondere mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern, beispielsweise Tierantiseren, die durch Immunisation mit Human-Cyclin A induziert wurden oder polyklonale Antikörper, die durch Expression des Human-Cyclin A Proteins in Bakteriensystemen erhalten wurden oder monoklonale Antikörper des Human-Anticyclin A.
Die Erfindung betrifft daher auch derartige Antikörper.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung der Zellproliferation, bei dem man diese Proliferation mit Hilfe cDNA von "Antisense" Human-Cyclin A inhibiert. Diese Definition der cDNA umfasst auch pertinente Fragmente der cDNA Sequenz.
Um ihre Einführung in die zu behandelnde Zelle sicherzustellen kann diese cDNA entweder in einen Retroviralvektor eingeschlossen werden (beispielsweise nach den Techniken, beschrieben von J. A Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3344, 1987 oder von D. G. Miller et al., Mol, Cell. Biol. 10: 4239, 1990) oder durch ein desialiniertes Protein getragen werden, das sich an einen an der Zielzelle vorhandenen Rezeptor für den Eintritt der cDNA fixieren kann, wobei die cDNA und das Protein insbesondere an ein Polylysin gebunden sind (beispielsweise nach den Techniken, beschrieben von G. Y. Wu & G. H. Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621, 1988 und von G. H. Wu et al., J. Biol. Chem. 264 16985, 1989), oder eingeschlossen sein in ein Liposom.
Die Erfindung betrifft daher auch die cDNA von Antisense Cyclin A, geeignet zur Inhibierung der Zellproliferation, die Plasmide, die diese cDNA einschließen, und die retroviralen Vektoren, die sie umfassen.
Die Erfindung betrifft auch die Zusammensetzung, gebildet aus Antisense cDNA und desialiniertem Protein, sowie die Liposome, die die Antisense cDNA einschließen.
Andere Vorteile und Charakteristika der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, ohne eine Einschränkung darzustellen.

I Nachweis der Insertion

J. Wang et al. (siehe oben) haben ein frühes primäres hepatocelluläres Karzinom (HCC) analylsiert, das gut differenziert und in der Form eines isolierten kleinen Knötchens ohne einhergehende Zirrhose bei einer Frau entwickelt war, die Antikörper gegen das Oberflächenantigen der Hepatitis B hatte. Nach klassischer Technik haben sie zelluläre DNA aus einem Teil des Tumorgewebes und einem anderen Teil des benachbarten nicht-tumoralen Gewebes extrahiert. Die Southern Blots dieser DNA wurden mit DNA von HBV sondiert. Die DNA des HBV war in dem nicht-tumoralen Gewebe nur in der Form von freien Molekülen vorhanden, wohingegen die tumorale DNA eine einzige Bande bildete, die der Integration einer einzigen Kopie des HBV Genoms pro Zelle entsprach.
Wang et al. haben eine Phagen-Bibliothek der tumoralen DNA konstruiert, die die Isolation mehrerer übereinander liegender Klone ermöglichte, die durch eine spezifische HBV-Sonde identifiziert wurden. Die Bibliothek wurde durch partielle Digestion der tumoralen DNA mit Hind III und Ligation in den Zweigen Hind III des Phagus L 47 konstruiert. Eine Population von Klonen von übereinander liegenden Phagen wurde isoliert unter Verwendung von kloniertem HBV als Sonde. Die Unter-Klonierung wurde mit Bluescript(Stratagene)-Vektoren durchgeführt. Die natürliche Allele wurde ausgehend von einer EMBL 3 Bibliothek kloniert, die aus Plazenta-DNA, partiell digeriert mit Sau 3A I. gebildet war. Die Sequenzierung wurde nach dem in der Referenz (39) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die cDNA wurde ausgehend von einer Bibliothek isoliert, die gebildet war ausgehend von mRNA der Leber eines erwachsenen Menschen, angeregt durch Oligo (dT) (32).
J. Wang et al. geben die daraus resultierende Restriktionskarte des Provirus HBV und der flankierenden Zeltsequenzen in dem Tumor an und zeigen die von repetitiven Sequenzen befreiten Subklone A, X, Y, B an, die von Phagusklonen stammen. Die Sequenzierung der Fragmente X und Y der Verbindung Provirus-Wirt, haben zusammen mit der detaillierten Restriktionsanalyse der proviralen Insertion die Erzielung eines viralen Genoms ohne bedeutende Umlagerungen bestätigt. Beide Verbindungen der Viruszellen liegen in äußeren Bereichen des HBV (Nukleotide 1840 und 1617 in dem viralen Kern bzw. den offenen Leserahmen X (1). Die Hybridisierung der Southern Blots gebildet ausgehend von tumoraler DNA mit den Sonden A und B hat die Genomkonfiguration bestätigt. Mit der Sonde B, d. h. einem Fragment EcoR I/Bgl II von 1,1 kb haben die Autoren die Phagusbibliothek des normalen Human-Genoms ausgelöscht und mehrere übereinander liegende Klone isoliert.
Die virale Integration in den Tumor hat zu keinen wesentlichen Umlagerungen in seiner Nachbarschaft geführt.
Die Hybridisierung des Klons B mit Northern Blots von polyadenylierter und nichtpolyadenylierter RNA aus der Leber eines normalen Neugeborenen ermöglichte die Identifikation von zwei polyadenylierten RNA Molekülen, transkribiert von 1,8 kb und 2,7 kb. Das aufeinanderfolgende Sichten einer Phagenbibliothek von cDNA einer normalen menschlichen Leber ermöglichte die Isolierung von 5 cDNA Klonen, die nach ihren Restriktionskarten das gleiche RNA Molekül repräsentieren. Die Autoren geben die Sequenz der cDNA der klonierten Insertion größer an.
Eine von den Autoren am Computer durchgeführte vergleichende Recherche hat gezeigt, dass das von dieser Insertion hergeleitete Protein ein Gebiet von 150 Aminosäuren als Cyclinkern enthält (9), welches das Hauptgebiet für die Konservierung sämtlicher bekannter Cycline bildet (4, 5, 7, 9, 12). Das Protein zeigt eine große Ähnlichkeit mit den Cyclinen A von S. solidissima (4) und D. melanogaster (5). Da es nur 54 Aminosäurestellen über die 150 üblichen im Falle der Cycline, der Cycline B von S. solidissima (1) und des Menschen (12) aufweist, ist das abgeleitete Protein ein Human- Cyclin A. Das N-terminale Ende des Proteins zeigt keine für andere bekannte Proteine, einschließlich anderer Cycline wahrnehmbare Homologie, was eine allen bekannten Cyclinen gemeinsame Charakteristik darstellt.
Es hat sich erwiesen, dass das Fragment A durch Hybridisierung mit der cDNA reagiert. Die Autoren haben daher die Fragmente A und B partiell sequenziert und Sequenzen ausgehend von den Enden 5' bzw. 3' der cDNA gefunden. Die Orientierung, die sich daraus für das Gen des Cyclin A ableitet, ist von links nach rechts. Die Untersuchung der Sequenz zeigt, dass das Cyclin A mehrere Exone aufweist und aus der Tatsache, dass die Zellfrequenzen der Fragmente der Verbindung Virus-Wirt X, Y, in der cDNA nicht wiedergefunden werden, resultiert, dass sich die Integration der DNA des HBV Virus in ein Intron des Gens vollzieht.
Die virale Insertion in den so festgestellten Ort desreguliert die Funktion des Gens des Cyclin A, was entscheidende Folgen für die Regulierung des Zellwachstums zu haben scheint. Genauere Details für die Cycline A und B sowie ihre Bedeutung bei der Mitose ergeben sich aus 5-21, 33-38.

II Herstellung von Human-Cyclin A durch genetische Expression.

Das klonierte cDNA Molekül, das in der Liste angegeben wird, wird in einen bakteriellen oder vorzugsweise Eucaryoten-Expressionsvektor insertiert, beispielsweise durch Klonieren der cDNA in den Bluescript-Klonierungs-Vektor, Insertion in den Plasmidexpressionsvektor pET-3b, Transfektion eines Wirts, beispielsweise bakteriell, wobei die Enden der Sequenz durch die Restriktionsenzyme Eco RI und Sma I bestimmt werden. Eine detaillierte Beschreibung dieser Technik findet sich in Gene - 1987, 56: 125-135.
Ein Präparat von Cyclin A kann ausgehend von der Bakterienkultur durch Reinigung an Gel erhalten werden.

III Untersuchung der Expression des Cyclin A Gens in Hepatozyten und in der in Regeneration befindlichen Leber

Die cDNA wird als Sonde zur Untersuchung der Expression des Cyclin A am Modell von Hepatozyten in Kultur und an der in Regeneration befindlichen Leber der Ratte verwendet.
Normale Hepatozyten der Ratte können in Primärkulturen während eines Zeitraums von etwa 10 Tagen gehalten werden, wobei sie einen Teil der differenzierten Hepatozytenfunktionen beibehalten. Es gibt jedoch keine Zellproliferation. Es ist möglich, die DNA Synthese durch Zufügen eines Epidermis-Wachstumsfaktors zum Milieu (Epidermiswachstumsfaktor EGF), von Pyruvat und Insulin zu stimulieren. Man erhält eine zelluläre DNA Synthese (gemessen durch Einfügung von tritiiertem Thymidin), die am dritten Kulturtag maximal ist. Im Northern Blot und im Western Blot hat es sich gezeigt, dass der Akkumulutions-Peak der RNA des Cyclin A Proteins sich bei der Synthesephase von DNA befindet (am dritten Tag der Kultur nach der Stimulation), im Gegensatz zum Cyclin B1, das am ersten Tag der Kultivierung der Hepatozyten bis zum fünften Tag festgestellt wird. Darüber hinaus wird das Cyclin A in Hepatozyten, in denen die DNA Synthese nicht stimuliert wurde, nicht festgestellt (im Gegensatz zum Cyclin D1).
Um diese Feststellungen in vitro, die die tatsächliche Situation in vivo reflektieren, bewahrheiten zu können, wurde ein Lebermodell der Ratte in Regeneration verwendet. Nach einer Hepatectomie von zwei Drittei, führt man eine erste synchrone Mitöse herbei, an der etwa 40% der Hepatocyten beteiligt sind. Auf eine zelluläre DNA Synthese zwischen der 20. und 24. Stunde folgt etwa sechs Stunden später eine erste Mitose. Der wichtige Punkt ist das zögernde Auslösen der Proliferation von nichthepatozytären Zellen der Leber, die etwa 24 Stunden nach der der Hepatozyten eintritt.
Es zeigte sich, dass:
- Das Cyclin A in einer normalen Leber nicht festgestellt wird.
- Das Cyclin A festgestellt wird (RNA und Protein) zum Zeitpunkt der Synthesephase der zellulären DNA.
Auf die Akkumulation des Cyclin A folgt ein leichter Abfall des Gehalts an Cyclin A und anschließend eine erneute Steigerung zum Zeitpunkt des Mitose,
- Darüber hinaus weist dort das Cyclin B1 ein völlig unterschiedliches Profil auf, als wenn es in einer normalen Leber festgestellt wird und sein Gehalt wird zum Zeitpunkt der Phase S nicht vergrößert.

IV Feststellung von Cyclin A an Gewebeschnitten, die durch Biopsie erhalten werden.

Ausgehend von eingefrorenen Schnitten bewirkt man eine Fixierung mit PFA (Paraformaldehyd)-PBS 4% während 20 Minuten bei 4ºC oder mit Methanol während 10 Minuten bei -20ºC, man wäscht mit PBS und anschließend zweimal mit Tris-HCl (pH 7,6).
Ausgehend von Paraffin-Schnitten, entfernt man das Paraffin mit Xylol, hydratisiert die Schnitte (ausgehend von 100% Alkohol bis zu destilliertem Wasser) und wäscht anschließend zweimal mit Tris-HCl (pH 7,6).
Es ergibt sich folgendes Protokoll:
- rascher Durchlauf an BSA (Rinderserum Albumin) 1% oder Tris-HCl;
- Inkubieren mit Avidin, 15 Minuten;
- Wäsche mit Tris-HCl + Passage in BSA;
- Inkubieren mit Biotin, 15 Minuten;
- 2 Wäschen mit Tris-HCl + Passage in BSA;
- Inkubation mit normalem Serum, 20 Minuten;
- Entfernen von überschüssigem Serum;
- Inkubation mit Human-Anti-Cyclin A-Antikörpern eine Nacht bei 4ºC;
- 2 Wäschen mit Tris-HCl + Passage in BSA;
- Inkubation mit einem biotinierten Entwicklungsantikörper, während 30 Minuten;
- 2 Wäschen mit Tris-HCl + Passage in BSA;
- Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Komplex, 30 Minuten;
- 2 Wäschen mit Tris-HCl;
- Entwicklung mit Diamino-Benzidin (DAB), 5 Minuten im Dunkeln;
- Wäsche mit Wasser;
- Färben mit Hematoxilin;
- Entwässern in Alkoholen (bis zu 100%);
- Durchlauf durch Xylol;
- Ablesen.
Die Ablesung ermöglicht eine bestimmte Quantifizierung des Gehalts an vorhandenem Cyclin A in dem Gewebe durch Zählendes Prozentsatzes der Zellkerne, die markiert wurden. In der normalen Leber liegt der Prozentsatz unter 1%. Man stellt einen Gehalt bis zu 80% in dem Gewebe in Proliferation fest.

V Verfahren zur Feststellung oder Diagnose der Zellproliferation.

Angewendet auf zirkulierende Zellen kann man auf jegliche bekannte Methoden zur Feststellung von Antikörpern zurückgreifen, insbesondere ELISA und insbesondere Sandwich-ELISA, die auf Proben angewendet wurden.
Angewendet auf Gewebe stellt man das Cyclin A direkt in den Geweben fest, wie dies auf übliche Weise mit bekannten diagnostischen Mitteln für die Proliferation erfolgt.
Die Herstellung von Anti-Cyclin A-Antikörpern kann beim Kaninchen durch Injektion des durch Reinigung an Gel erhaltenen Cyclin A erfolgen, um ein Kaninchen-Antiserum zu erhalten.
Die Feststellung mit Quantifizierung von Human-Cyclin A in den Geweben kann anschließend durch Western Blot oder Immunhistochemie erfolgen.
Zur Feststellung kann man die Zählung von markierten Zellkernen und den Vergleich des gezählten Gehalts mit dem Gehalt des gleichen normalen Gewebes anwenden.

VI Inhibierung der Zellproliferation.

In vitro blockiert die Mikroinjektion in Hepatozyten in einer mit Insulin, Pyruvat und EGF stimulierten Primärkultur von Plasmiden, die die zum Cyclin A in Antisens-Situation unter Kontrolle von regulierenden Elementen des Virus SV40 komplementäre DNA enthalten, die zelluläre DNA Synthese.
Um die Inhibierung der Zellproliferation in vivo, insbesondere tumoralen Ursprungs, sicherzustellen, bedient man sich Konstruktionen, um das Antisense DNA in das Innere der zu behandelnden Zelle zu führen.
Man kann zunächst auf einen retroviralen Vektor zurückgreifen (J. A. Wolff et al. und D. G. Miller et al. wie bereits genannt), der Antisense cDNA einschließt und geeignet ist, die Zielzelle zu infizieren und daher die Antisense cDNA in deren Genom einzuführen. Um dies zu erzielen, wird die cDNA von Human-Cyclin A in Antisense Stellung in ein Plasmid eingeführt, insbesondere das handelsübliche Plasmid PKC4, mit einem geeigneten Promotor, beispielsweise dem Promotor des Virus SV40. Man selektioniert die Plasmide, die in Stellung der Antisense DNA gut integrieren mittels einer Restriktionskarte vor dem Einführen von cDNA und ihrem Promotor in das Retrovirus.
Man kann auch ein Protein verwenden, das geeignet ist, an einen Rezeptor der Zielzelle fixiert zu werden. Man fixiert die Antisense cDNA auf ein desialiniertes Protein (G. Y. Wu & C. H. Wu et al. wie bereits genannt) mittels eines Polylysins. Nach der Fixierung an der Zielzelle wird die cDNA in das Cytoplasma der Zelle eingeführt, in der es im Antisense RNA transkribiert wird, welche die Synthese von Cyclin A durch Hybridisierung an der Zell- RNA blockiert.
Man kann sich auch Liposomen bedienen, die die Antisense cDNA enthalten.

Referenzen

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Sequenzliste

SEQ ID No.: 1

Sequenztyp: Nukleotid und sein entsprechendes Protein
Länge der Sequenz: 1647 pb
Anzahl der Stränge: einfach
Konfiguration: linear
Molekültyp: cDNA
Ursprungsorganismus: human
Charakteristika: 1293 Peptidbasen-Paare
Eigenschaften: Kodierend für Human-Cyclin A

Claims

1. In-vitro-Verfahren zur Diagnostik der Zellproliferation, dadurch charakterisiert, dass man ausgehend von einer Probe von humanen Zellen oder Geweben die Menge an Human-Cyclin A bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass man Cyclin A mit Hilfe von Anti-Cyclin A-Antikörpern oder -Antiserum bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass man das Cyclin A mit Hilfe von polyklonalen oder monoklonalen humanen Anti-Cyclin A-Antikörpern bestimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch charakterisiert, dass es darüber hinaus eine Mengenbestimmung des in der untersuchten Probe vorhandenen Cyclin A umfasst,

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch charakterisiert, dass die Mengenbestimmung von Cyclin A durch Western Blot, Immunohistochemie oder Zählen von Zellkernen durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das zum Nachweis oder zur Diagnostik der Zellproliferation angewendet wird.

7. Präparat von Human-Anti-Cyclin A-Antikörpern, die zum Nachweis von Human- Cyclin A fähig sind, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch charakterisiert, dass die Antikörper polyklonale Antikörper sind.

9. Präparat nach Anspruch 7, dadurch charakterisiert, dass die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

10. Human-Anti-Cyclin A-Antiserum, das zum Nachweis von Human-Cyclin A fähig ist, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

11. Zur Sequenz von Human-Cyclin A komplementäre Antisense-cDNA, die zur Inhibierung der Zellproliferation fähig ist.

12. Plasmid, das die Antisense cDNA nach Anspruch 11 enthält.

13. Retroviraler Vektor, der die Antisense cDNA nach Anspruch 11 enthält.

14. Liposom, das die Antisense cDNA nach Anspruch 11 umfaßt.