-
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von bestimmten Konjugaten,
welche darauf abzielen, Zellproliferation zu inhibieren und genauer die
Verwendung eines Fibroblast-Wachstumsfaktors konjugiert an ein
cytotoxisches Mittel zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels
zur Tumorbehandlung in einem Säugetier mit FGF-vermittelten Tumoren, die
FGF-Rezeptoren exprimieren.
-
Die Gefäßbildung spielt eine wichtige Rolle in der embryonalen Entwicklung
und in einigen physiologischen und pathologischen Zuständen,
-
einschließlich Wundheilung, Ovulation, diabetischer Netzhauterkrankung
und Malignität. Insbesondere wären feste Tumore ohne die über diese
Gefäßneubildung gelieferten Nährstoffe und Sauerstoff nicht in der Lage,
über etwa 2 mm im Durchmesser zu wachsen.
-
Neues Kapillarwachstum findet durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden
Schritten statt, beginnend mit der Auflösung der Kapillargrundmembran.
Mikrovaskulare Endothelzellen, stimuliert durch angiogene Substanzen, wie
etwa einen basischen Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF), sekregieren in
vitro Collagenase, Plasminogenaktivator und Stromelysin, welche die
Grundmembran abbauen und es ermöglichen, daß Endothelzellen zum
angiogenen Stimulus wandern. Nach dem Wandern proliferieren die
endothelialen Zellen, entwickeln Sprößlinge, bilden kapillarartige hohle
Röhren und verbinden schließlich die Röhren zu Kapillarschleifen.
-
Basisches FGF ist ein Protein&sub1; das ein Molekulargewicht von etwa 16 kD
aufweist, säure- und temperaturempfindlich ist und einen hohen
isoelektrischen Punkt aufweist. Ein strukturell verwandtes Protein, saures
FGF (aFGF) hat einen sauren isoelektrischen Punkt. FGFs zeigen eine
mitogene Wirkung auf eine große Vielzahl von mesenchymalen, endokrinen
und neuralen Zellen. Von besonderem Interesse ist ihre stimulierende
Wirkung auf kollaterale Vaskularisation und Angiogenese. Solche mitogenen
Wirkungen haben beträchtliches Interesse an FGFs als mögliche
therapeutische Mittel für z.B. Wundheilung, Nervenregeneration und
Knorpelreparatur hervorgerufen.
-
Es wurde gezeigt, daß viele Zellen, die auf FGF ansprechen, spezifische
Rezeptoren auf den Zelloberflächenmembranen besitzen. Die
Rezeptorproteine scheinen Einzelketten-Polypeptide mit Molekulargewichten
im Bereich von 110 bis 165 kD, abhängig vom Zelltyp, zu sein. Die Proteine
binden basisches FGF mit hoher Affinität (Kd = 10-80 pM), wobei die
Rezeptorzahlen im Bereich von 2000 bis 80000 pro Zelle liegen. Solche
Rezeptoren wurden aus Rattenhirn unter Verwendung einer Kombination
von Lectin und Ligandenaffinitäts-Chromatographie gereinigt und sind mit
Tyrosinkinaseaktivität verknüpft, siehe Imamura et al., B.B.R.C. 155, 583-
590 (1989); Huang und Huang, J. Biol. Chem., 261, 9568-9571 (1986).
-
Auf Babyhamster-Nierenzellen (BHK) wurden zwei basische FGF-Rezeptoren
mit geschätzten Molekulargewichten von 110 und 130 kD von Neufeld et
al., J. Biol. Chem., 260, 13860-13868 (1985) und Neufeld et al., J. Biol.
Chemi., 261, 5631-5637 (1986) berichtet. Beide Rezeptorproteine binden
basisches FGF und saures FGF, auch wenn es scheint, daß das größere
Rezeptorprotein bFGF bevorzugt bindet und es wird manchmals als "hoch
affiner" bFGF-Rezeptor bezeichnet; der kleine Rezeptor hat eine etwas
größere Affinität für saures FGF. Andere Untersuchungen haben weitere
übliche FGF-Rezeptoren in kultivierten Zellinien und embryonalem Gewebe
aufgedeckt, die sowohl bFGF als auch aFGF binden, siehe Olwin et al., J. of
Cel. Biochem., 39, 443-454 (1989).
-
Die Durchführbarkeit der Verwendung von Rezeptor-spezifischen Liganden,
um Toxine in Zellen zu transportieren, wurde kürzlich gezeigt. Die Strategie,
ursprünglich in der lmmuntherapie durch Konjugieren von Toxinen an
monoklonale Antikörper angewendet (siehe Blakey et al., Cancer Research,
48, 7072-7078 (1988)), wurde kürzlich durch Koppeln von Toxinen mit
klassischen endokrinen Hormonen, wie etwa CRF und TRF, mit Cytokinen,
wie etwa EGF und TGFα, und mit Lymphokinen, wie etwa Interleukin-2,
verfolgt. U.S.-Patent Nr.4,468,382 an Bacha et al. zeigt cyctoxische
Konjugate, die eine Disulfidbindung mit einem Histidinrest aufweisen, um
ein toxisches Hybridprotein herzustellen, von dem behauptet wird, daß es
bei der Behandlung von bestimmten Tumoren verwendbar sei.
-
Der Fibroblast-Wachtstumsfaktor (FGF) wurde mit Cytotoxinen gekoppelt,
um FGF-Konjugate herzustellen, die mitotoxisch sind. Wie in Lappi et al.,
B.B.R.C. 160, 917-923 (1989) detalliert ausgeführt, wurde basisches FGF
an Saporin-6 (SAP), ein Ribosomen-inaktivierendes Protein (RIP), isoliert aus
den Samen der Pflanze Sanonaria officinalis gekoppelt, um FGF-SAP
herzustellen, von dem gezeigt ist, daß es ein wirksames Mitotoxin ist.
-
Humanes Melanom ist ein Beispiel eines Krebses, dessen Vorkommen stetig
angestiegen ist und der sehr widerstandsfähig gegenüber herkömmlichen
Therapiearten ist. Von Halaban et al., Oncogene Reserach, 3, 177-186
(1988) wurde berichtet, daß Melanomzellen bFGF-Transkripte exprimieren
und es wurde vorgeschlagen, daß das bFGF deshalb als autokriner
Wachstumsfaktor wirken kann.
-
Es besteht ein gegenwärtiges Bedürfnis für die Entwicklung von
verbesserten Verfahren zur Behandlung von Melanomen und anderen
krebsartigen Tumoren, die gegenwärtig eine geringe Heilungsrate
aufweisen.
-
Es bestehen Hinweise, daß verschiedene Krebsgeschwüre außer
Melanomen, einschließlich Eierstock-, Bauchspeicheldrüsen- und einigen
Dickdarmkarzinomen Rezeptoren für bFGF aufweisen. Untersuchungen mit
radioaktiven Bindeassays an einer Anzahl von humanen karzinogenen
Zellinien, isoliert aus humanen Krebsgeschwüren, zeigte, daß viele, aber
nicht alle dieser Zellinien ¹²&sup5;I-FGF binden. Es wurde gefunden, daß
cytotoxische Konjugate, insbesondere FGF konjugiert mit dem
Saporinmolekül (FGF-SAP) wirksame Inhibitoren von Zellwachstum in vitro
für jede Zellinie sind, die FGF-Rezeptoren exprimiert. Wenn diese Zellinien
subkutan als Festtumor-Xenografte in nackten Mäusen gezüchtet wurden,
zeigten FGF-SAP-Konjugate eine schnelle Verringerung des Tumorvolumens
in solchen Zellinien, welche auf eine in vitro Behandlung des Konjugats
ansprachen, oftmals innerhalb 48 Stunden nach Verabreichung. Es stellte
sich heraus, daß Dosiseinheiten, die zur Tumorverkleinerung wirksam
waren, für die Testtiere nicht toxisch waren. Eine Behandlung von
menschlichen Patienten würde auf ähnliche Weise durch Verabreichung
einer therapeutisch wirksamen Menge des FGF-Konjugats in einem
physiologisch annehmbaren Träger bewirkt werden. Spezifisch werden die
Konjugate in der Behandlung verwendet, um cyctotoxische Mittel in
humane Melanome, Eierstockkarzinome, Teratokarzinome und
Neuroblastomzellen zu leiten, um die Proliferation solcher Zellen zu
inhibieren. Die Konjugate werden auch verwendet, um auf FGF-Rezeptor
exprimierende Zellen in ähnlichen tumorigenen pathophysiologischen
Zuständen zu zielen.
-
Es wird gezeigt, daß diese Konjugate gegenüber den oben offenbarten
Tumoren wirksam sind sowie gegen andere tumorigene pathophysiologische
Zustände, bewirkt durch eine Proliferation von Zellen, die gegenüber FGF-
mitogener Stimulation empfindlich sind.
-
Entsprechend stellt die Erfindung die Verwendung eines FGF-Konjugats zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Tumorbehandlung in einem Säugetier mit
FGF-vermittelten Tumoren, die FGF-Rezeptoren exprimieren, bereit, wobei
das FGF-Konjugat ein Cytotoxin umfaßt, das an ein mit einem FGF-Rezeptor
reaktives FGF-Polypeptid gekoppelt ist und wobei der Tumor ein Melanom,
ein Ovarialkarzinom, ein Teratokarzinom oder ein Neuroblastom ist.
-
Die Figuren 1 bis 5 stellen die Ergebnisse der Behandlung von nackten
Mäusen mit einem bFGF-SAP-Konjugat dar, wobei die Mäuse mit Mel Tang
Human-Melanomzellen injiziert worden sind.
-
Wie oben festgestellt, stellt die Erfindung eine Behandlung unter
Verwendung von Konjugaten eines cytotoxischen Mittels und eines mit
einem FGF-Rezeptor reaktiven FGF-Polypeptids dar, um Wachstum und
Proliferation von FGF-empfindlichen Zellen in vitro und in vivo zu inhibieren.
Es wird gezeigt, daß FGF-Konjugate wirksam gegen tumorigene
pathophysiologische Zustände sind, die durch eine Proliferation von Zellen
bewirkt werden, die gegenüber FGF mitogener Stimulation empfindlich sind.
Tumore, von denen gezeigt wird, daß FGF-Konjugate gegen sie wirksam
sind, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, humane Melanome, humane
Eierstockkarzinome, humane Teratokarzinome und Neuroblastome.
-
Die verwendeten Konjugate umfassen entweder basisches FGF oder ein
anderes mit einem FGF-Rezeptor reaktives FGF-Polypeptid und ein
cytotoxisches Mittel, insbesondere ein Ribosomen inaktivierendes Protein
(RIP), wie etwa Saporin, auch wenn andere cytotoxische Mittel ebenfalls
vorteilhaft verwendet werden können. Basisches FGF wird aufgrund seiner
kommerziellen Verfügbarkeit bevorzugt verwendet. Das cyctotoxische Mittel
kann mit dem FGF durch eine chemische Bindung verknüpft sein oder die
Zusammensetzung kann als chimäre unter Verwendung von rekombinanten
DNA-Techniken hergestellt werden. In jedem Fall wird das Konjugatmolekül
so entworfen und hergestellt, daß das Rezeptor bindende Epitop der FGF-
Einheit des Komplexes zur Erkennung durch den FGF-Rezeptor zur
Verfügung steht.
-
Cytotoxische Konjugate, wie etwa das hierin beschriebene FGF-Konjugat,
bieten Vorteile gegenüber Immunotoxinen. Cytotoxische Konjugate können
lokal direkt an eine Tumorstelle verabreicht werden. Cytotoxische Konjugate
können chemisch definiert, synthetisiert und charakterisiert und in großen
Mengen unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt
werden. Cyctotoxische Konjugate erfordern im allgemeinen eine geringere
Dosis, um als Immunotoxine wirksam zu sein.
-
Zusätzlich zu basischem FGF (bFGF) und saurem FGF (aFGF) sind eine
Reihe anderer Proteinen bekannt, die FGF-mitogene Wirksamkeit vermittelt
durch Bindung an einen FGF-Rezeptor zeigen. Basisches FGF aus
Säugetieren ist ein Peptid mit 146 Resten mit einem Molekulargewicht von
etwa 16 kD und einem pl von etwa 9,6, das eine aminoterminale Extension
haben kann. Andere FGF-Proteine, zusätzlich aFGF umfassen HST, INT/2,
FGF-5, FGF-6 und KGF(FGF-7), siehe Baird et al., Brit. Med. Bull., 45, 438-
453 (1989). Alle induzieren mitogene Aktivität in einer großen Vielzahl von
normalen diploiden Mesoderm-abgeleiteten und neuralen Crista-abgeleiteten
Zellen. Ein Test solcher "FGF mitogener Aktivität" ist die Fähigkeit, die
Proliferation von kultivierten Rinderaorta-Endothelzellen zu stimulieren, wie
von Gospodarowicz et al., J. Biol. Chem., 257 12266-12278 (1982) und
Gospodarowicz et al., P.N.A.S., 73, 4120-4124 (1976) beschrieben. Der
Ausdruck "FGF" wird im allgemeinen verwendet, um sowohl Proteine zu
bezeichnen, die in einem Säugetier gefundene Aminosäuresequenzen
aufweisen, als auch modifizierte Sequenzen mit Aminosäuresubstitutionen,
-Deletionen, -Insertionen oder -Additionen, die noch mitogene Aktivität
exprimieren, vermittelt durch Bindung an einen FGF-Rezeptor. Es wird
häufig beobachtet, daß gereinigte Präparationen von bFGF und aFGF
verschiedene molekulare Formen der Mitogene umfassen. Man weiß, daß
Unterschiede in Aminosäuresequenzen in FGF von verschiedenen Spezien
sowie zwischen FGFs von einzelnen Organismen von Spezien auftreten
können. Der Ausdruck soll auch sowohl aus natürlichen Quellen isolierte
Proteine als auch solche, die synthetisch hergestellt werden, wie etwa
durch rekombinante Mittel oder möglicherweise durch chemische Synthese,
umfassen.
-
Die Aminosäuresequenz eines beispielhaften Säuger-bFGF, erhalten aus
pituitärem Rindergewebe wird von Esch et al., P.N.A.S., 82, 6507-6511
(1985) berichtet; sie ist auch im U.S.-Patent Nr. 4,956,455, erteilt am 11.
September 1990 dargestellt, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme
aufgenommen ist. Der Ausdruck "bFGF" sollte im allgemeinen so
verstanden werden, daß er Proteine oder Polypeptide bezeichnet, die im
wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und mitogene Aktivität wie
die von Rinder-bFGF oder humanem bFGF aufweisen. cDNAs, die humanes
aFGF, siehe Jaye et al., Science, 233, 541-545 (1986), Rinder-bFGF, siehe
Abraham et al., Science, 233, 545-548 (1 986), humanes bFGF, siehe
Abraham et al., EMBO J., 5, 2523-2528 (1986) und Abraham et al., Quant.
Biol., 51, 657-668 (1986) und Ratten-bFGF, siehe Shimasaki et al.,
B.B.R.C. (1988) und Kurokawa et al., Nucleic Acids Res. 16., 5201 (1988)
codieren, wurden cloniert und sequenziert; sie sagen die Existenz von
Proteinen voraus, die identisch zu durch Proteinsequenzierung gefundenem
Rinder-bFGF und -aFGF sind.
-
Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck "FGF-Rezeptor" verwendet, um
Rezeptoren zu bezeichnen, die in der Lage sind, basisches FGF oder sowohl
basisches als auch saures FGF oder andere Proteine mit FGF-Aktivität zu
binden und sie in die Zelle zu transportieren. Unter anderem sind die
Rezeptoren in T. Imamura, B.B.R.C., 155, 583-590 (1988) und in
Moscatelli, J. Cell. Physiol. 131, 123-130 (1987) beschrieben. Wie hierin
verwendet, bezeichnet der Ausdruck "mit dem FGF-Rezeptor reaktives
Polypeptid" jedes Polypeptid, das in der Lage ist, an einen FGF-Rezeptor zu
binden und dadurch in die Zelle transportiert zu werden.
-
Basisches FGF ist kommerziell erhältlich, z.B. von Amgen (Thousand Oaks,
CA) und von Amersham International, und kann von einer Vielzahl von
Gewebetypen von Säugetieren erhalten werden. Beispiele von Verfahren zur
Reinigung von basischem FGF sind Umkehrphasen-
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) und Heparin-
Sepharoseaffinitätschromatographie.
-
Kationenaustausch-HPLC und RP-HPLC sind bei Bohlen et al., P.N.A.S., 81,
5364-5368 (1984) beschrieben. Reinigung durch Heparin-
Sepharoseaffinitätschromatographie ist im US-Patent Nr. 4,785,079
beschrieben, sowie bei Gospodarowicz et al., P.N.A.S., 81, 6963-6967
(1984) und Gospodarowicz, Meth. Enzym., 147, 106-119 (1987).
Zusätzlich kann bFGF synthetisiert werden, etwa durch rekombinante
Verfahren. Expression eines rekombinanten Proteins in Hefe und E.coli wird
bei Barr et al., J. Biol. Chem., 263, 16471-16478 (1988) und im US-Patent
Nr. 4,956,455 beschrieben.
-
Das FGF-cytotoxisches Mittel-Konjugat kann auf einer immobilisiertes
Heparin enthaltenden Säule gereinigt werden. Geeignete Säulen umfassen
Heparin-Sepharose und Heparin-Agarose. Das gebundene Konjugat kann mit
einem Salzgradienten, wie etwa NaCl, eluiert werden; es eluiert zwischen 1
und 3 M NaCl.
-
FGF, konjugiert an ein cytotoxisches Mittel, wird verwendet, um das
cytotoxische Mittel zielgerichtet zu spezifischen Zellen von Interesse zu
leiten. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck cyctotoxisches Mittel
ein Molekül, das in der Lage ist, eine Zellfunktion zu inhibieren. Der
Ausdruck umfaßt Mittel, die nur toxisch sind, wenn sie in die Zelle
transportiert werden und auch solche, deren toxische Wirkung durch die
Zelloberfläche vermittelt wird. Es kann eine Vielzahl von cytotoxischen
Mitteln verwendet werden, insbesondere solche, die die Proteinsynthese
hemmen. Als ein Beispiel wird bFGF mit einem Ribosomen-inaktivierenden
Protein (RIP), wie etwa, z.B. Saporin-6 (SAP) oder anderen SAP-Derivaten
kombiniert. SAP ist ein starkes RIP, welches aus den Samen der Pflanze
Sanonaria officinalis isoliert wird, siehe Stirpe et al., Biochem J. 216,
617-625 (1983). Die Konjugation von FGF mit SAP hat den Vorteil, daß SAP
nicht modifiziert werden muß, um es für die Konjugation vorzubereiten. Dies
steht im Gegensatz zu anderen cyctotoxischen Mitteln, die umfangreich
modifiziert werden müssen, um in eine geeignete Form für cyctotoxisches
Zielen gebracht zu werden. Andere geeignete cytotoxische Mittel umfassen,
sind aber nicht beschränkt auf Ricin, Ricin-A-Kette, Gelonin, Diphtherie-
Toxin, Diphtherie-Toxin-A-Kette, antivirales Protein der Kermesbeere (PAP)
und Pseudomonas Exotoxin. Alternativ kann es möglich sein, ein
Arzneimittel als cytotoxisches Mittel zu verwenden; Beispiele solcher
Arzneimittel umfassen Anthracycline, wie etwa die Daunomycine
(einschließlich Daunorubicin und Doxorubicin) und Methotrexat und seine
Analoga.
-
FGF wird geeigneterweise an ein proteinartiges cytotoxisches Mittel durch
bekannte chemische Reaktionen konjugiert, wie etwa durch Derivatisierung
mit einer reaktiven Sulfhydryl-enthaltenden Einheit, wie etwa SPDP, oder
über ein Quervernetzungsmittel, wie etwa Glutaraldehyd oder Carbodimid.
Zum Beispiel kann das cytotoxische Mittel mit einem reaktiven
Sulfhydrylenthaltenden Mittel, wie etwa N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat,
derivatisiert werden, bevor FGF zugegeben und damit vermischt wird. Das
FGF-Konjugat kann von den nicht umgesetzten Produkten auf einer
geeigneten Säule getrennt werden. Alternativ kann bFGF mit einem
Arzneimittel konjugiert werden, wie etwa 14-Brom-doxorubicin, über die
Zuckereinheit, wie durch das Cis-Aconitase-Verfahren, siehe Shen und
Riser, B.B.R.C. 102, 1048 (1981).
-
Alternativ können chimäre FGF-Konjugate durch rekombinate Verfahren
hergestellt werden. Solche Verfahren, angewendet auf Konjugate von IL-2
oder TGFα werden von Chaudhary et al., P.N.A.S., 84, 4538-4542 (1987)
und von Lorberman-Galski et al., P.N.A.S., 85, 1922-1926 (1988)
beschrieben. Siehe auch Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
-
Ein FGF und ein cytotoxisches Mittel enthaltendes Konjugat kann bei der
Behandlung einer Vielzahl von FGF-vermittelten pathophysiologischen
Zuständen verwendet werden. Wie hierin verwendet bezeichnet der
Ausdruck "FGF-vermittelter pathophysiologischer Zustand" einen
nachteiligen Zustand, der gekennzeichnet ist durch oder bewirkt wird durch
eine Proliferation von Zellen, die gegenüber einer bFGF mitogenen
Stimulation empfindlich sind; von besonderem Interesse sind solche
tumorigene Zustände.
-
Die folgenden Beispiele sollen die Herstellung und Verwendung von FGF-
Konjugaten veranschaulichen, sollten aber nicht als die Erfindung
begrenzend verstanden werden.
BEISPIEL 1
KONJUGATION VON bFGF MIT SAPORIN
-
Rekombinates bFGF, entsprechend der von Abraham et al., Quant. Biol.,
51, 657-668 (1986) offenbarten Sequenz von 154 Aminosäuren wurde von
Farmitalia Carlo Erba erhalten. Saporin-6 wurde gemäß dem Verfahren
Stirpe et al., supra, wie durch Lappi et al., B.B.R.C., 129, 934-942 (1985)
modifiziert, gereinigt. Kurz, Samen von Sadonaria officinalis wurden durch
Mahlen in 0,14 M NaCl in 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2 (8 miig)
extrahiert. Nach Rühren über Nacht bei 4 ºC wurden Extrakte durch Mull
futriert und bei 28000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde
vom Sediment und von schwimmendem Fett abgetrennt; er wird als
"Rohextrakt" bezeichnet.
-
Rohextrakte wurden gegen 5 mM Natrimphosphatpuffer, pH 6,5 dialysiert,
bei 28000 g für 30 Minuten zentrifugiert und auf eine CM-Cellulosesäule
(CM 52; Whatman, Maidstone, Kent, U.K.) aufgebracht, die, nach
Waschen, mit einem 0 bis 0,3 M NaCl-Gradienten in dem gleichen Puffer
eluiert wurde. Dieses Material wurde dann gegen Wasser dialysiert und auf
einer FPLC Mono S-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), äquilibriert mit
50 mM Sodiumborat, pH 9,5, 0,156 M Natriumchlorid, chromatographiert.
Das Protein wurde mit einem 20 minütigen Gradienten von 0,156 M bis
0,186 M Natriumchlorid eluiert. Das resultierende Peakmaterial wurde dann
extensiv gegen Milli-Q-Wasser (Millipore, Bedford, MA) dialysiert. Ein Teil
des getrockneten Materials wurde gewogen und in Wasser bei einer
Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Ein Ultraviolett-Spektrum wurde
aufgezeichnet, das einen 1 % Extinktionskoeffizienten von 6,4 bei 277 nm,
dem Extinktionsmaximum, ergab. Bei 280 nm betrug der E&sub2;&sub8;&sub0; 6,0. Ein
Proteinassay unter Verwendung des Lowry-Verfahrens, Lowry et al., J. Biol.
Chem., 193 265-275 (1951), unter Verwendung von BSA als Standard
ergab ein Ergebnis von 1,07 mg/ml.
-
SAP wurde mit N-Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionat (SPDP; Pharmacia
Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers
derivatisiert. Kurz, SAP wurde in (2,7 mg/ml) in Natriumphosphatpuffer
(0,1M, pH 7,5) enthaltend NaCl (0,1 M) gelöst. Ein 1,25 facher molarer
Überschuß von SPDP, gelöst in Ethanol, wurde tropfenweise unter Rühren
zugegeben und für 30 Minuten bei 23 ºC mit gelegentlichem Rühren
reagieren gelassen. Überschüssiges Reagenz und niedermolekulare
Reaktionsprodukte wurden durch Gelfutration entfernt. bFGF (2 mg/ml)
wurde zugegeben und mit dem derivatisierten Saporin (6 mg/ml in 0,1 M
Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid, pH 7,5) für zwei Stunden bei
Raumtemperatur vermischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 35 ul
0,1 M Jodacetamid beendet. Nach weiteren 30 Minuten wurde das
Reaktionsgemisch auf 30 ml verdünnt und auf eine Heparin-Sepharose
(Pharmacia) Säule (0,5 x 5,5 cm) aufgebracht. Die gebundenen Proteine
wurden mit einem schrittweise Gradienten von 0,6 M, 1 M und 2 M NaCl in
10 mM TRIS, pH 7,4 eluiert. Das zwischen 1 M und 2 M eluierende
-
Material wurde gesammelt. Eine letztuche Reinigung des Konjugats wurde
erzielt, nachdem der Pool gegen Wasser dialysiert und auf einer Mono-5/5-
NaCl-Kationenaustauschsäule (Pharmacia) (Puffer A: 50 mM Natrimborat,
pH 8,0, Puffer B: 0,5 M NaCl in Puffer A) chromatographiert wurde. Das
Konjugat enthaltende Fraktionen wurden durch Silberfärben nach PhastGel
(Pharmacia) Elektrophorese detektiert und geeignete Fraktionen wurden zur
Analyse gesammelt.
-
Die Synthese des Konjugats wurde durch Gelelektrophorese beurteilt und
Ablaufengelassen bis kein nachweisbares bFGF in dem Reaktionsgemisch
verblieb. Chromatographische Trennung auf Heparin-Sepharose und
anschließende elektrophoretische Analyse jeder der Peakfraktionen zeigte,
daß während SAP nicht an Heparin-Sepharose bindet, das Konjugat daran
bindet. Nur kleine Mengen des Konjugats wurden während der 1,0 M NaCl-
Waschung freigesetzt; das Hauptprodukt eluierte mit der 2 M Waschung
und enthielt äquimolare Mengen SAP und basisches FGF (Mr-40.000). Es
gab jedoch auch einen Teil des Konjugats, das ein geschätztes Mr> 68.000
aufwies, vermutlich als Ergebnis der Konjugation von zwei Molekülen bFGF
pro Molekül Saporin.
-
Eine zweifelsfreie Identifikation des SAP-FGF-Konjugats wurde unter
Verwendung von sequenzespezifischen Antisera, erzeugt in Kaninchen,
bewerktstelligt. Das verwendete Immunogen war ein Fragment von bFGF,
umfassend die Aminosäuren 1 bis 24, chemisch synthetisiert unter
Verwendung eines Beckman 990 Peptid Synthesizers. Westembiot-Analyse
zeigte, daß alle Molekulargewichtsformen des Konjugats sowohl bFGF als
auch SAP enthielten. Das Antiserum erkennt den Mittelabschnitt des
Peptids und kreuzreagiert auf äquimolarer Basis mit gereinigtem Rinder- und
rekombinantem humanem basischem FGF.
-
Proben in einem Natriumdodecylsulfat-enthaltenden Polyacrylamidgel
wurden nach Elektrophorese auf Nitrocellulosemembranen
elektroaufgebracht
(electro-blotted) und Luft trocknen gelassen. Die Membran
wurde mit TRIS-gepufferter Salzlösung (TBS) bedeckt und für 10 Minuten
bewegt. Die Lösung wurde abgesaugt und verworfen. Die Membran wurde
mit 5 % fettfreier Milch (NFM) in TBS bedeckt und für 10 Minuten bewegt.
Die Lösung wurde abgesaugt und verworfen. Primärantikörper, entweder
Anti-SAP oder Anti-bFGF-Antiserum wurde bei einer Konzentration von
1/1000 in NFM/TBS zugegeben und über Nacht bewegt. Die Lösung wurde
abgesaugt und verworfen. Die Membran wurde mit TBS bedeckt, für 10
Minuten bewegt und die Lösung abgesaugt und verworfen. Die Membran
wurde mit 0,05 % NP40/TBS bedeckt und 1 Minute geschüttelt; die Lösung
wurde abgesaugt und verworfen. Die abschließenden TBS und NP40/TBS-
Waschungen wurden zweimal wiederholt. Meerrettichperoxidase-markiertes
Anti-IGG wurde bei einer Verdünnung von 1/2000 in NFM/TBS zugegeben
und die Membran wurde für 2 Stunden bewegt. Die TBS und NP40/TBS-
Waschschritte wurden wiederholt. Die Membran wurde in eine frisch
gemischte Lösung aus 60 mg 4-Chlor-1-naphtol in 20 ml Methanol, 100 ml
doppelt destilliertem Wasser und 60 pl 30 % H&sub2;O&sub2; gegeben und die Lösung
wurde der Membran zugegeben und entwickeln gelassen. Die Lösung wurde
abgesaugt und verworfen und die Reaktion durch Spülen mit Wasser
gestoppt. Die Membran wurde trocknengelassen.
BEISPIEL II
AKTIVITÄT DES FGF/SAP-KONJUGATS
-
Die Kapazität des Konjugats den basischen FGF-Rezeptor zu erkennen
wurde in BHK-Zellen unter Verwendung der von Moscatelli, D., J. Cell
Physiol., 131, 123-130 (1987) beschriebenen Vorgehensweise untersucht.
Kurz, Zeilen wurden bis auf Subkonfluenz gezüchtet und in 300 ul Puffer,
enthaltend F-12 14 mM NaHCO&sub3;&sub1; 25 mM HEPES und 0,2 % Gelatine, bei 4
ºC für zwei Stunden mit 10 ul radiojodiertem bFGF in Gegenwart von
verschiedenen Konzentrationen von bFGF oder dem Konjugat inkubiert. Die
Zellen wurden dann dreimal mit 0,5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS) und zweimal mit 2M NaCl in PBS gewaschen. Bindung an den
hochaffinen Rezeptor wurde durch Zählen der Membranfraktion bestimmt,
die in 0,5 % Triton X-100 in PBS (pH 8,1) solubilisiert wurde.
-
Die Proteinsynthese-Hemmaktivität des SAP-Proteins wurde mit der
Proteinsynthese-Hemmaktivität des bFGF-SAP-Konjugats in in vitro Assays
von Proteinsynthese, wie von Siena et al., Blood,72, 756-765 (1988)
beschrieben, verglichen. Die cyctotoxische Aktivität des Konjugats wurde
an Babyhamster-Nierenfibroblasten untersucht (ATCC Zugangsnummer CRL
6281). BHK-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen bei einer
Konzentration von 5000 Zellen/ml aufgebracht und über Nacht bei 37 ºC,
5 % CO&sub2; inkubiert. Am folgenden Morgen wurde HEPES-gepuffertes DMEM
und F-12 Medium (1:1) plus 5 % FCS von den Vertiefungen abgesaugt und
mit Medium allein oder mit einem Medium enthaltend das Konjugat,
basisches FGF oder Saporin ersetzt. Zwei Tage später wurden die Zeilen
zweimal gewaschen und trypsiniert, und Zellzahlen wurden mit einem
Coulter Partide Counter (Coulter Electronics, Hialeah, FL) bestimmt.
-
Es wurde gezeigt, daß das Konjugat Saporinaktivität behält, wenn es in
einem in vitro Proteinsynthese-Hemmassay untersucht wird. Das Konjugat
ist, wie erwartert, leicht weniger aktiv (etwa zweifach) als freies SAP. Dies
stimmt mit dem geringen Ausmaß von Derivatisierung von SAP vor der
Konjugation (0,8 Mol SPDP/Mol) und mit einer möglichen sterischen
Hinderung aufgrund der Anwesenheit von gebundenem bFGF überein. Im
Gegensatz dazu zeigen die in den Radiorezeptorassays für bFGF erhaltenen
Ergebnisse, daß das bFGF-SAP gleichpotent wie, wenn nicht leicht aktiver
als bFGF in dem Bindeassay ist. Folglich scheint es, daß die Bindung von
freien Sulfhydryl-Gruppen in bFGF zur Verbrückung mit SAP seine Fähigkeit
seinen Rezeptor zu erkennen und daran zu binden nicht stört; falls
überhaupt, kann diese Reaktion bFGF stabilisieren.
-
Basisches FGF-SAP ist ein starker cyctotoxischer Faktor für BHK-Zellen;
SAP allein hat jedoch keine toxische Wirkung auf diese Zellen selbst bei der
höchsten untersuchten Dosis (10&supmin;&sup8; M) und bFGF allein hat eine leichte
Hemmwirkung auf die Proliferation. Ein Gemisch von bFGF und SAP hat
eine leichte Toxizität, aber nur bei der höchsten untersuchten
Konzentration. Der IC&sub5;&sub0; (25 pM) für das cytotoxische Mittel ist gut mit der
Potenz von bFGF (15 pM) in Proliferationsassays vergleichbar. Die Spezifität
des cyctotoxischen Mittels wurde in Kompetitionsexperimenten untersucht,
um nachzuweisen, daß die mitotoxische Aktivität des Konjugats
rezeptorspezifisch ist. BHK-Zeiien wurden für eine Stunde mit
verschiedenen Mengen bFGF oder Nervenwachstumsfaktor (NGF), der FGF-
Rezeptoren nicht bindet, vorinkubiert, vor der Behandlung der Zellen mit
dem cyctotoxischen Mittel. Es wurde auch gezeigt, daß es eine Dosis
abhängige Inhibition der cytotoxischen Aktivität in Gegenwart von
steigenden Mengen an basischem FGF gibt. Im Gegensatz dazu hat ein
1000-facher Überschuß an NGF keine Wirkung.
-
FGF-Konjugate weisen eine starke Wirkung auf bestimmte tumorigene
FGFvermittelte pathophysiologische Zustände auf. In einigen Fällen wird in
Betracht gezogen, daß dies eine Folge der Rolle von FGF bei der
Gefäßbildung ist und der Gegenwart von FGF-Rezeptoren in relevanten
Geweben. Die Wirksamkeit von FGF-Konjugaten wird in den Beispielen III
und IV veranschaulicht.
BEISPIEL III
WIRKUNG VON FGF-SAP AUF DUPUYTREN'S ZELLEN
-
Zellen, erhalten durch chirurgisches Entfernen von Gewebe von der Hand
von erwachsenen Patienten, bei den das Dupuytren'-Syndrom diagnostiziert
wurde, eine Erkrankung, die die Bewegung der Hand beeinflußt, wurden in
Primärkultur gegeben. Diese Zellen hatten zwischen 10.000 und 15.000
basische FGF-Rezeptoren pro Zelle.
-
Die Zellen wurden über Nacht in einer Gewebskulturschale mit 24
Vertiefungen bei einer Konzentration von 10.000 Zellen pro Vertiefung in
HEPES-gepuffertem Dulbecco's Minimal Eagles Medium (DMEM) mit 10 %
fötalem Kälberserum (FCS) gezogen. Am nächsten Morgen wurde das
Medium entfernt und mit einem Medium ersetzt, das Konzentrationen von
bFGF-SAP-Konjugat im Bereich von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;¹² Molar enthielt. Kontrollen
umfaßten Vertiefungen, die nur mit Medium behandelt wurden,
Vertiefungen, die mit ähnlichen Konzentrationen von basischem FGF allein,
Saporin allein und basischem FGF und Saporin zusammen, aber nicht
konjugiert, behandelt wurden. Die Zellen wurden in den Inkubator für 72
Stunden zurückgegeben. Am Ende dieser Inkubation wurden die Zellen
gewaschen, mit Trypsin entfernt und auf einem Coulter Zellzähler gezählt.
Die Zahl der Zeilen in den Mediumkontrollen wurde mit der Zahl der Zellen
in den behandelten Vertiefungen verglichen. Der IC&sub5;&sub0;, die Konzentration, bei
der 50 % der Zellen abgetötet worden sind, wird für FGF-SAP berechnet.
Die Ergebnisse dieser Zellabtötungsassays zeigen, daß Dupuytren's Zeilen
empfindlich gegenüber basischem FGF-SAP sind, wobei die Anzahl an
getöteten Zellen proportional zur Dosis von FGF-SAP ist. Beträchtlich
höhere Konzentrationen von entweder SAP oder FGF+SAP wurden
benötigt, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen und die Zahl von
abgetöteten Zellen, insbesondere für SAP allein, war nicht so klar
dosisabhängig. Ähnliche Ergebnisse wurden mit drei anderen Zellproben
erhalten.
-
Es wurde gefunden, daß FGF-cytotoxisches Mittel-Konjugate verwendet
werden können, um das cytotoxische Mittel zielgerichtet zu Zeilen zu
befördern, die FGF-Rezeptoren exprimieren, mit dem Ziel den Zelltod zu
bewirken. Untersuchungen haben nun gezeigt, daß es eine direkte
Beziehung zwischen der Zahl von FGF-Rezeptoren pro Zeilen und der Dosis,
bei denen 50 % solcher Zellen getötet werden (der IC&sub5;&sub0;) gibt. Die Toxizität
von bFGF-SAP wurde für jede Zellinie nach 48 oder 72 Stunden Behandeln
mit bFGF-SAP bestimmt. Zellzahlen wurden bestimmt und die
Konzentration, die die Zahl an Zeilen um 50 % verringerte, wurde gegen die
Rezeptorzahl für diese Zellinie aufgetragen. Die Rezeptoranzahl wurde durch
das Verfahren von Moscatelli, D., J. Cell. Physiology, 131, 123-130 (1987)
bestimmt. Für Zellen, von denen bekannt ist, daß sie äußerst hohe
Rezeptorzahlen aufweisen, z.B. BHK-Zellen, ist der IC&sub5;&sub0; identisch mit der
Affinitätskonstante von basischem FGF für seinen Rezeptor (beide betragen
etwa 25 pM für BHK-Zellen). Dieses unerwartete Ergebnis zeigt an, daß die
Gegenwart des cytotoxischen Mittels, selbst eines solch großen Moleküls
wie SAP, die FGF-Aktivität des Konjugats nicht verringert. Diese
Testergebnisse scheinen anzuzeigen, daß diese Zellinien, welche eine große
Zahl von FGF-Rezeptoren exprimieren, empfindlicher gegenüber dem
Konjugat sind als solche, die eine viel kleinere Zahl exprimieren.
-
Zellinien können auf die Gegenwart von FGF-Rezeptoren z.B. durch ¹²&sup5;I-FGF-
Bindeassays untersucht werden. Dieser Assay ist in Beispiel IV dargestellt.
Man kann nicht a priori wissen, welche Zellinien FGF-Rezeptoren tragen.
-
Eine Anzahl von Zellinien, die von humanen Krebsgeschwüren stammten,
wurden nun auf die Gegenwart von FGF-Rezeptoren untersucht. Die
untersuchten Zellinien umfassen SK-Mel-1, ein humanes Melanom, SK-N-
MC, ein humanes Neuroblastom und PA-1, eine humane Eierstock-
Teratokarzinomzellinie und A431, ein humanes Epidermoidkarzinom. Diese
Linien wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD
erhalten. FSallC, ein Maus-Fibrosarcom, erhalten von Dr. Beverly Teicher
vom Dana Farbaer Cancer Institute, Boston, wurde ebenfalls untersucht.
Andere Zellinien können auf ähnliche Weise getestet werden.
BEISPIEL IV
¹²&sup5;I-FGF-REZEPTORBINDEASSAY
-
Zellen wurden in Gewebskulturplatten mit 12 Vertiefungen (Costar) bei 10&sup5;-
Zellen/Vertiefung eingesetzt und gezogen, bis sie in ihrem jeweiligen
Medium zusammenflossen. SK-Mel-1, SK-N-MC und PA-1 werden in
modifiziertem Eagle's Medium (MEM), ergänzt mit 10 % fötalem
Kälberserum (FCS) gezogen. FSallC wurde in α-MEM mit 5 % FCS gezogen.
A431 wird in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 % FCS gezogen. ¹²&sup5;I-
FGF-Bindung wurde unter Verwendung eines Radiorezeptorassays wie von
Neufeld, G. et al., Identification of the fibroblast growth factor receptor in
human vascular endothelial cells. J. Cell Physiol., 136: 537-542, 1991
beschrieben, durchgeführt. Kurz, Zellmonoschichten wurden mit frischem,
nicht ergänztem Medium enthaltend 0,2 % Gelatine und 3 ug/ml Heparin
(Sigma) für 1 Stunde bei 37 ºC/5 % CO&sub2; inkubiert und dann mit eiskaltem
Medium gewaschen und für 1 Minute kühlengelassen. Zellen wurden mit
verschiedenen Konzentrationen von ¹²&sup5;I-FGF in 250 ul des gleichen
Mediums für 2 Stunden auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann vorsichtig
zweimal mit eiskalter 0,9 % Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
gewaschen, um nicht gebundenes ¹²&sup5;I-FGF zu entfernen und verbleibende
Zell-assozuerte Radioaktivität wurde mit 1 % Triton X-100 extrahiert und
unter Verwendung eines Beckman Gamma Counters quantifiziert. Nicht
spezifische Bindung wurde durch Hemmen der spezifischen Bindung unter
Verwendung eines 200-fachen Überschusses von nicht radiomarkiertem
FGF bestimmt.
-
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind, daß SK-Mel-1, PA-1, SK-N-MC,
und FSallC-Zeilen hochaffine FGF-Rezeptoren exprimierten, d.h. Rezeptoren
die sowohl basisches als auch saures FGF binden, aber bervorzugt
basisches FGF binden. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß A431-
Zellen frei von FGF-Rezeptoren waren.
-
Die SK-Mel-1, PA-1, SK-N-MC, FSallC und A431-Zellinien wurden in vitro
untersucht, um das Zellüberleben bei Behandlung mit sowohl FGF-SAP als
auch SAP allein zu bestimmen. Korrelationen zwischen Zellüberleben und
dem Vorliegen von FGF-Rezeptoren, wie in Beispiel IV bestimmt, können
dann bestimmt werden. Die experimentelle Vorgehensweise und die
Ergebnisse für in vitro Zelluntersuchungen sind in Beispiel V ausgeführt.
BEISPIEL V
IN VITRO UNTERSUCHUNGEN ZUM ZELLÜBERLEBEN
-
Zellen wurden auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) bei
10³ Zellen/Vertiefung in ihrem jeweiligen Medium aufgebracht. Einen Tag
später wurde das Medium entfernt und ein Medium enthaltend 1 pM bis 1
pM des Konjugats FGF-SAP oder freies SAP. Zellen wurden dreifach
behandelt und bei 37 ºC/5 % CO&sub2; gehalten. 72 Stunden nachdem die
Behandlung begonnen wurde, wurde das Medium entfernt und die Zellen
wurden trypsiniert und unter Verwendung eines Coulter-Zählers (Coulter
Electronics, Inc., Hialeah, FL) gezählt. Die Ergebnisse wurden als die
mittlere Zellzahl von behandelten Vertiefungen ausgedrückt, normalisiert auf
Mediumkontrollen, als Funktion der FGF-SAP- oder SAP-Konzentration. IC&sub5;&sub0;-
Werte wurden aus Dosis-Ansprechkurven berechnet und stellen die
Konzentration von FGF-SAP oder SAP dar, die in einer 50 %-Verringerung
der Zellzahl resultierte.
-
Es wurde festgestellt, daß FGF-SAP ein wirkungsvoller Inhibitor von
Zeliwachstum für jede der Zellinien ist, die einen FGF-Rezeptor exprimiert,
wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Im Gegensatz dazu kann man aus Tabelle 1
sehen, daß FGF-SAP minimale cytotoxische Wirkungen in A431-Zellen
zeigte. SAP-assoziierte Wachstumsinhibition wurde für PA-1 und SK-N-MC-
Zellen beobachtet, aber nur nach Behandlung mit SAP-Konzentrationen, die
2-6 Größenordnungen größer waren als das Konjugat. Die Zugabe von FGF
und SAP in einem nicht kovalenten Gemisch hatte keine cytotoxische
Wirkungen.
-
Weitere Zellinien zeigten ebenfalls Inhibition von in vitro Wachstum nach
Behandlung mit einem bFGF-SAP-Konjugat für 72 Stunden. Diese umfassen
die humanen Melanomzellinien SK-MEL 24 und SK-MEL 5 (beide hinterlegt
und erhältlich von der American Type Culture Collection, ATCC) und die
humane Eierstockkarzinomzellinie SKOV-3, ebenfalls erhältlich von ATCC.
In vitro und in vivo Untersuchungen wurden durchgeführt unter
Verwendung von Mel Tang Zellen des Parentaltyps, erhältlich vom Roger
Williams Cancer Center an der Brown University, Providence, Rhode Island
und sie werden in den Beispielen VII und VIII unten diskutiert.
Tabelle 1 Anzahl an hoch affinen FGF-Rezeptoren, FGF-
Dissoziationskonstante und Wachstumsinhibition von Tumorzellinien in
Gegenwart von FGF-SAP oder SAP
-
aKd, in pM
-
b IC50, in nM, stellt die Konzentration berechnet aus Dosis-Ansprechkurven
dar, die in einer 50 %-igen Verringerung der Zelizahi resultierte. Jeder Wert
ist das Mittel von mindestens drei Bestimmungen.
-
cNA = nicht anwendbar
-
Es ist möglich, in vivo die Krebszellinien, die in vitro mit Verfahren
untersucht wurden, die in der Technik bekannt sind, zu untersuchen. Dies
wird durch subkutanes Einpflanzen der gewünschten Tumorzellen in
immundefiziente nackte Mäuse bewerkstelligt, um ein Xenograft in dem
Testtier zu erzeugen. Die Tiere mit den Tumoren werden dann gemäß den
verschiedenen Verfahren mit einem Bereich von Dosiseinheiten eines FGF-
cytotoxisches Mittel-Konjugats, äquivalenten Dosiseinheiten an Cytotoxin
und verschiedenen anderen Kontrollen behandelt. Geeignete Dosisbereiche
eines FGF-Konjugats können anfänglich durch Bestimmungen der lethalen
Dosis (LD&sub5;&sub0;) des Konjugats in BALB/c-Mäusen bestimmt werden. In vivo
Untersuchungen unter Verwendung von FGF-SAP sind z.B. in Beispiel VI
unten beschrieben.
BEISPIEL VI
IN VIVO ANTITUMOR-UNTERSUCHUNGEN UNTER VERWENDUNG
NACKTER MÄUSE
-
Experimente mit SK-Mel-1, SK-N-MC und A431-Zellinien wurden in 8 bis 10
Wochen alten männlichen nulnu-Mäusen durchgeführt, während solche mit
PA-1-Zellen 8 bis 10 Wochen alte weibliche nulnu-Mäuse verwendeten.
Nackte Mäuse wurden gezüchtet und in der Roger Williams Hospital Animal
Care Facility gehalten. FSallC-Zellen wurden in 8 bis 10 Wochen alte
männliche C3H/HeN-Mäuse (Taconic Laboratories, Germantown, NY)
eingebracht. Es wurde gefunden, daß die LD&sub5;&sub0; von FGF-SAP in BALB/c-
Mäusen 500 ug/kg beträgt, wobei die Toxizität sich als extensive Blutung,
oftmals im Intestinaltrakt manifestierte. Lappi, D.A. et al., Basic fibroblast
growth factor-saporin mitotoxin: An endothelial cell growth inhibitor. J.
Cell. Biochem., Suppl., 14E: 222, 1990. Für in vivo Untersuchungen
wurden Gruppen von 5 Mäusen mit 2x10&sup6; Tumorzellen subkutan in die
rechte Rückenflanke geimpft. In den anfänglichen Untersuchungen wurden
125 ug/kg FGF-SAP oder 85 ug/kg SAP (d.h. äquivalente molekulare
Konzentrationen von Saporin in jeder Behandlungsgruppe) in sterilem PBS
gelöst und als einzelne intravenöse Injektion über die Schwanzvene 0, 1, 5,
10 oder 15 Tage nach der Tumorimplantation verabreicht. In nachfolgenden
Untersuchungen empfingen die Mäuse eine Reihe von intravenösen
Injektionen von 0,5 ug/kg FGF-SAP, verabreicht in wöchentlichen
Intervallen, insgesamt 4 Dosiseinheiten. Der Fortschritt jedes Tumors wurde
mindestens zweimal wöchentlich gemessen, beginnend 5 Tage nach der
Tumorimplantation und die Tumorvolumen wurden unter Verwendung der
Formel: Volumen = [(minimale Messung)² (maximale Messung)] : 2
berechnet. Die Ergebnisse werden als mittlere Tumorvolumen der
behandelten Gruppen ausgedrückt, normalisiert auf nicht behandelte
Kontrollen, als Funktion der Zeit. Fehler sind Standardfehler der Mittelwerte.
Statistische Vergleiche der mittleren Tumorvolumen für die verschiedenen
Behandlungsgruppen wurden unter Verwendung des t-Tests nach Student
(Statview SE, Brainpower, Calabasas, CA) durchgeführt.
-
Eine vorläufige toxikologische Beurteilung von FGF-SAP zeigte, daß eine
Dosis von 500 ug/kg in BALB/c-Mäuse lethal ist (Lappi et al., J. Cell.
Biochem., Suppl., 14E: 222 (1990)) und daß 250 ug/kg nicht lethal sind.
Entsprechend wurden 125 ug/kg als anfängliche Dosis von FGF-SAP
gewählt. Pilotuntersuchungen wurden in nackten Mäusen durchgeführt, die
humane Tumor-Xenografte trugen, bei denen eine einzige intravenöse Dosis
von FGF-SAP 1, 5, 10 oder 15 Tage nach der Tumorimplantation
verabreicht wurde. FGF-SAP bewirkte eine schnelle Verringerung des
Tumorvolumens, oftmals innerhalb von 48 Stunden nach der Verabreichung
und in einigen Tieren wurde ein vollständiger Tumorrückgang beobachtet.
Vorübergehende Verringerungen in der Tumorgröße wurden beobachtet,
selbst wenn die Behandlung bis zum Tag 15 verzögert wurde, als die
Tumorvolumen etwa 50 bis 100 mm³ betrugen. Am Tag 30 maßen die
mittleren Volumen von Tumoren in behandelten Mäusen jedoch nur 5 bis 33
% der Kontrolltumore. Da FGF-SAP bei diesem Dosisgehalt gleich wirksam
erschien, wenn es am Tag 1, 5 oder 10 verabreicht wurde, wurde der Tag
5 als Behandlungstag für weitere Untersuchungen gewählt. Zu dieser Zeit
hatten die Tumore ein Volumen von etwa 40 bis 50 mm³.
-
Die nächste Reihe von Untersuchungen verglich den breiten Bereich von
FGF-SAP-Dosiseinheiten mit äquivalenten Dosiseinheiten von SAP, um in
vivo Dosisantworten zu bestimmen. Mittlere Tumorvolumen am Tag 30 für
FGF-SAP- oder SAP-behandelte Xenografte verglichen mit unbehandelten
Kontrollen sind in Tabelle 2 dargestellt. In nackten Mäusen, die PA-1, SK-N-
MC oder SK-Mel-1 Xenografte trugen, durchgeführte Untersuchungen
zeigten eine Wachstumsinhibition mit FGF-SAP und ein Fehlen von
Wirksamkeit unter Verwendung von freiem SAP (Tabelle 3).
-
Antitumorantworten auf FGF-SAP wurden auch bei immunkompetenten
Wirtsmäusen beobachtet, die FSallC-Xenografte trugen, auch wenn FGF-
SAP-Wirkungen charakteristischerweise in diesen Einzeldosissystem von
kurzer Dauer waren. Keine Wachstumsinhibition wurde nach Behandlung
mit FGF-SAP oder SAP in Mäusen beobachtet, die A431-Xenografte trugen.
Tabelle 2: Dosiswirksamkeit von FGF-SAP gegen SAP verabreicht als
einzelne intravenöse Injektion 5 Tage nach der
Tumorimplantation in Mäusena
-
a 2 x 10&sup6; Tumorzellen wurden subkutan in die rechte Rückenflanke der
Wirtsmäuse geimpft.
-
b Mittlere Tumorvolumen für behandelte Xenografte wurden berechnet unter
Verwendung von 2 bis 11 Mäusen pro Behandlungsgruppe. Es waren 2 bis
24 Mäuse in den Kontrollgruppen. Fehler sind Standardfehler der
Mittelwerte.
-
c Signifikante Differenz zwischen Behandlungs- und Kontrolltumorvolumen,
p ≤ 0,01.
-
In Verbindung mit der Beurteilung von geringeren FGF-SAP-Dosiseinheiten
in vivo wurden Untersuchungen durchgeführt, in denen mehrere
Dosiseinheiten von FGF-SAP intravenös verabreicht wurden. Mit FGF-SAP
bei einer einzigen Dosiseinheit von 0,5 ug/kg wurde nur eine
vorübergehende Verringerung im Tumorvolumen und eine anschließende
schnelle Tumorprogression wurde beobachtet, wie in Tabelle 2 zu sehen.
Deshalb wurden Gruppen von Mäusen, die SK-Mel-1, PA-1, SK-N-MC oder
FSallC Xenografte trugen, mit FGF-SAP (0,5 ug/kg) beginnend am Tag 5
und dann einmal die Woche mit ingesamt vier Dosiseinheiten behandelt.
Tabelle 3 vergleicht mittlere Tumorvolumen für das System mit mehreren
geringen Dosen an FGF-SAP mit Volumen für das System mit einer einzigen
hohen Dosis. Signifikante Tumorverringerungen wurden am Tag 35 für
jeden der untersuchten Tumortypen unter Verwendung der Behandlung mit
mehreren geringen Dosen beobachtet. Diese starke Antitumorwirkung
wurde nicht durchweg bei der Behandlung mit einer einzigen hohen Dosis
beobachtet.
Tabelle 3. Vergleich von FGF-SAP-Behandlungssystemen bei
Tumor-tragenden Mäusena
-
a 2 x 10&sup6; Tumorzellen wurden subkutan in die rechte Rückenflanke von
Wirtsmäusen geimpft.
-
b Mittlere Tumorvolumen wurden unter Verwendung von 2 bis 14
Mäusen pro Behandlungsgruppe berechnet. Es waren 2 bis 24 Mäuse
in den Kontrollgruppen. Fehler sind Standardfehler der Mittelwerte.
-
c Eine einzige Dosis von FGF-SAP 125 ug/kg wurde am Tag 5
verabreicht.
-
d Eine Dosis von FGF-SAP, 0,5 ug/kg, wurde am Tag 5 verabreicht,
gefolgt von wöchentlichen Injektionen für insgesamt 4
Dosiseinheiten.
-
e Statistische Differenz zwischen Behandlungs- und
Kontrolltumorvolumen, p ≤ 0,01
-
Man kann folgern, wie in den Beispielen IV bis VI gezeigt, daß Cytotoxine,
insbesondere das Ribosomen-inaktivierende Protein Saporin, kovalent
verknüpft an FGF starke cytotoxische Wirkungen in vitro gegen eine
Vielzahl von Tumorzelltypen ausüben, die Zelloberflächenrezeptoren für FGF
exprimieren. Die in vitro Daten sagen die überlegene Cytotoxizität von FGF-
SAP im Vergleich mit freiem SAP für FGF-Rezeptor-tragende SK-Mel-1, PA-
1 und SK-N-MC Xenografte (Tabelle 1) und die Abwesenheit von
signifikanten Antitumorwirkungen auf A431 Xenografte genau voraus.
-
Die Wirksamkeit von als in mehreren geringen Dosen verabreichtem FGF-
SAP in vivo ist insbesondere beeindruckend. Dieses System bietet den
Vorteil wiederholt, relativ nicht toxische FGF-SAP-Dosiseinheiten an
Tumorzellen zu liefern, die die anfängliche Behandlung überleben. Vom
therapeutischen Standpunkt ist es von großer praktischer Wichtigkeit, daß
mehr als eine Dosis des Konjugats sicher verabreicht werden kann.
-
In vivo Untersuchungen wurden auch unter Verwendung der Mel Tang
Zellinie des Parentaltyps, erhältlich vom Roger Williams Cancer Center an
der Brown University, Providence, Rhode Island, durchgeführt. In vitro
Untersuchungen an dieser Zellinie wurde zuvor gemäß Beispiel V
durchgeführt. In vitro Wachstum dieser Zellinie wurde durch Behandlung
mit FGF-Konjugaten, insbesondere FGF-SAP, dramatisch inhibiert, wenn sie
mit dem Konjugat für 72 Stunden behandelt wurden. Der IC&sub5;&sub0; wurde als
1pM für diese Zellinie berechnet.
BEISPIEL VII
INTRAVENÖSE INJEKTION EINES FGF-SAP-KONJUGATS
-
Das folgende Experiment wurde ausgeführt, um die Wirkung einer FGF-SAP-
Verabreichung auf ein Tumorvolumen an der anfänglichen Stelle der
subkutanen Injektion von Mel Tang Zellen in nackten Mäusen zu bewerten.
Mel Tang Zellen des Parentaltyps sind eine humane Melanomzellinie, die
vom Roger Williams Cancer Center an der Brown University, Providence,
Rhode Island erhalten werden kann. Das folgende Protokoll wurde
ausgeführt, worin eine subkutane Injektion von Mel Tang Zellen entweder
begleitet oder gefolgt wurde von der Injektion des bFGF-SAP-Konjugats.
TABELLE 4
-
*FGF-SAP wird mit einer Zellsuspension gemischt und gleichzeitig injiziert.
-
Das Protokoll wurde anschließend wiederholt, so daß, als Ergebnis der zwei
unabhängigen Untersuchungen,
10 Mäuse hinsichtlich jedes einzelnen
Systems behandelt wurden. Die Ergebnisse des Protokolls sind in den
Figuren 1 bis 5 dargestellt und zeigen, daß bFGF-SAP dramatische
Verringerungen in Tumorvolumen innerhalb von 1 bis 2 Tagen nach der
Verabreichung bewirkte, selbst wenn die IV-Behandlung bis zu 15 Tagen
nach der anfänglichen Tumorimpfung verzögert wurde. Eine weitere
Untersuchung der Mäuse wurde durchgeführt und hinsichtlich des Zustands
jeder Maus am Tag 42 der Untersuchung tabellarisiert. Sie zeigte, daß alle
Mäuse, die das Konjugat gemischt mit dem Tumorimpfstoff am Tag
empfingen, einen vollständigen Rückgang der Tumor zeigten; in einigen der
IV-behandelten Mäuse folgte jedoch auf den vollständigen Rückgang der
Tumore für eine gewisse Zeitdauer ein erneutes Wachstum.
BEISPIEL VIII
SUBKUTANE INJEKTION NACKTER MÄUSE MIT FGF-SAP
-
Das folgende Protokoll wurde ausgeführt, um die Wirkung auf Tumore der
Mel Tang Zellinie als Ergebnis der subkutanen Injektion in die Läsion in
nackten Mäusen zu vergleichen.
TABELLE 5
-
*FGF-SAP Dosis 0,125 mg/kg und SAP-Dosis 0,084 mg/kg, was
äquivalente SAP-Dosen darstellt.
-
Die Ergebnisse von diesem Protokoll zeigen, daß eine Injektion des
Konjugats an die Stelle des Tumors der Injektion einer äquivalenten Dosis
des Cytotoxins Saporin selbst überlegen ist, d.h. die Konjugat-behandelten
Tumoren bleiben klein, wohingegen SAP-behandelte Tumore erneut
wachsen.
-
Für eine Behandlung eines Zustandes von Interesse, wird eine therapeutisch
wirksame tumorizide Menge eines Arzneimittels enthaltend ein FGF-
cytotoxisches Mittel-Konjugat in einem physiologisch annehmbaren
Trägerstoff einem Säugetier verabreicht. Beispiele von physiologisch
annehmbaren Arzneimittelträgern umfassen PBS und Salzlösung. Im
allgemeinen kann das Konjugat intravenös (IV) oder durch subkutane
Injektion (SQ) verabreicht werden. Das Konjugat kann auch intraläsional
verabreicht werden, wobei das Konjugat subkutan in die Tumorstelle selbst
verabreicht wird oder intrakompartmental wobei das Konjugat in die
Bauchhöhle injiziert wird. Die Verabreichung des Konjugats wurde von den
Testtieren unabhängig vom Weg der Verabreichung gut vertragen.
Insgesamt können Arzneimittel enthaltend das Konjugat insbesondere zur
Behandlung von Patienten nützlich sein, die an bestimmten Karzinomen
leiden, wobei die Tumorzellen FGF-Rezeptoren exprimieren. Einige Typen
von Tumorzellen können FGF auch als autokrinen Wachstumsfaktor
benötigen und man vermutet, daß diese besondere Ziele sind, gegen die
diese Konjugate vorteilhaft verwendet werden können.
-
Die Wirksamkeit mit der ein Cytotoxin, wie etwa Saporin oder eine Ricin A-
Kette oder ein ähnliches Protein, Proteinsynthese inhibieren kann und
folglich die DNA-Synthese stören kann, ist ziemlich weit bekannt.
Entsprechend wird die Dosis des Konjugats, das verbreicht wird, zu einem
gewissen Grad von dem speziellen gewählten Cytotoxin abhängen; man
erwartet jedoch, daß Dosen des Konjugats im Bereich von etwa 0,01 mg
bis etwa 100 mg des Konjugats pro Kilogramm Körpergewicht als tägliche
Dosis zur Behandlung solcher tumorigene Beschwerden eingesetzt werden.
-
Man würde erwarten, daß die Toxizität der FGF-Konjugate, wie etwa FGF-
SAP mit dem in dem Konjugat verwendeten Cytotoxin variieren würde.
Geringere Dosiseinheiten von FGF-SAP wurden von den meisten der
Testtiere in den oben beschriebenen Beispielen gut vertragen, was zu dem
Schluß führt, daß wirksame und nicht toxische Dosiseinheiten der
Konjugate für menschliche Patienten sowie für Testtiere aufgestellt werden
können. Deutliche Hinweise existieren, daß FGF-Konjugate, insbesondere
FGF-SAP, eine minimale Toxizität für normales Gewebe aufweist. Lindner et
al., Circ. Res., 68: 106-113 (1991) fanden, daß FGF-SAP für normales
Gewebe eine geringe Cytotoxizität aufweist. Es wird nun vermutet, daß
unter normalen Bedingungen, der basische FGF-Rezeptor nicht in genügend
hohen Mengen exprimiert wird, um die lnternalisierungseffekte des
Konjugats zu vermitteln. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von
Whalen et al., Growth Factors, 1:157-164 (1989), daß die systemische
Verabreichung von basischem FGF eine geringe oder keine toxische
Wirkung aufweist. Entsprechend und überraschend macht die selektive
Expression von FGF-Rezeptoren in Tumoren und anderen
pathophysiologischen Zuständen diese äußerst empfänglich gegenüber einer
FGF-Konjugatwirkung.
BEISPIEL IX
FGF-KONJUGAT-TOXIZITÄT IN NACKTEN MÄUSEN
-
Eine Behandlung mit FGF-SAP oder SAP wurde von der Mehrzahl der Tiere
in diesen Untersuchungen gut vertragen. Subkutane Blutungen und Ödeme,
begleitet von Gewichtsverlust und letztlich Tod traten zwischen 10 und 14
Tagen bei der höchsten Dosis von FGF-SAP (125 ug/kg) bei 10 % der
Mäuse auf, die SK-Mel-1, PA-1, SK-N-MC oder FSallC Xenografte trugen.
Vorzeitiger Tod trat auch bei nahezu 60 % der Mäuse auf, die A431-
Xenografte trugen, die diese höchste FGF-SAP Dosis empfingen, trotz der
Tatsache, daß die Autopsie keine großen Abnormalitäten in lebenswichtigen
Organen zeigte und kein Tier an einer metastatischen Erkrankung starb. Im
Gegensatz dazu wurden geringere Dosen von FGF-SAP (siehe Tabellen 2
und 3) gut vertragen und waren mit keinen Todesfällen verbunden. Darüber
hinaus wurden keine kumulativen Toxizitäten bei Mäusen beobachtet, die
das System mit mehreren geringen Dosen von FGF-SAP empfingen (siehe
Tabelle 3). Folglich schien eine chronische Behandlung von Tumoren in vivo
mit geringen Dosen von FGF-SAP sowohl wirksam als auch nicht toxisch zu
sein. Toxischen Nebenwirkungen oder vorzeitige Todesfälle wurden weder
bei Mäusen beobachtet, die freies SAP in den verwendeten Dosen
empfingen noch bei den nicht behandelten Kontrollmäusen
-
Auch wenn die Erfindung mit Hinweis auf die gegenwärtig bevorzugten
Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte verstanden werden, daß
verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.