DE69125262T2

DE69125262T2 - Synergische Mischung zur Behandlung von Herpes

Info

Publication number: DE69125262T2
Application number: DE69125262T
Authority: DE
Inventors: Robert Deziel; Yvan Guindon
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1991-12-21
Publication date: 1997-10-09
Anticipated expiration: 2011-12-22
Also published as: ATE150317T1; CA2033447C; AU648854B2; EP0493767A3; US5380727A; AU9009191A; NZ241120A; JPH04275230A; IL100550A0; EP0493767B1; JP3209553B2; IL100550A; EP0493767A2; DE69125262D1; CA2033447A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine antivirale Arzneimittelzusammensetzung, die eine Kombination eines Nucleosid-Analogons und eines Peptid-Derivats umfasst und zur Behandlung von Herpes-Infekten in einem Säuger verwendbar ist, indem die Kombination dem Säuger verabreicht wird.

Hintergrund der Erfindung

Herpes-Viren verursachen bei Menschen und Tieren ein breites Spektrum von Krankheiten. Beispielsweise sind Herpes- simplex-Viren Typus 1 oder Typus 2 (HSV-1 und HSV-2) verantwortlich für jeweilige Erkältungen und genitale Läsionen; das Varizella-Zoster-Virus (VZV) verursacht Windpocken und Gürteirose; und das Epstein-Barr-Virus (EBV) verursacht Pfeiffer-Drüsenfieber.
Während des letzten Jahrzehnts war eine Klasse von als Purin- und Pyrimidin-Nucleosid-Analoga bekannten Verbindungen Gegenstand grosser Aufmerksamkeit bei Forschern auf der Suche nach neuen therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Herpes- Viren-Infekten. Als Ergebnis davon wurden mehrere Nucleosid- Analoga als antivirale Mittel entwickelt. Das zur Zeit erfolgreichste ist Aciclovir, welches zur Behandlung von genitalen Herpes-simplex-Infekten das Mittel der Wahl ist. Andere zur Behandlung von Herpes-Infekten therapeutisch verwendete Nucleosid-Analoga umfassen Vidarabin, Idoxuridin, Trifluridin und Ganciclovir.
Es wird angenommen, dass der Wirkungsmechanismus, durch den die Nucleosid-Analoga ihre antivirale Wirkungen ausüben, die Hemmung der Replikation der viralen Nucleinsäure mit einbezieht. Im Falle der Herpes-Viren ist die Erzeugung neuer viraler Desoxyribonudeinsäure (DNA) - ein wesentliches Stadium der viralen Replikation - abhängig von der Wechselwirkung des vom Virus codierten Enzyms, DNA-Polymerase, mit Desoxynudeotiden der Zelle. Wenn das Nucleosid-Analogon in vivo enzymatisch zu seinem Triphosphat-Derivat konvertiert wird, wirkt es als zweitmögliches Substrat (d.h. als "Täuschungssubstrat") für die virale DNA-Polymerase, und es wird in die wachsende virale DNA-Kette einverleibt. Entweder weil dem Nucleosid-Analogon eine wesentliche Gruppe, beispielsweise das 3'-Hydroxyl, fehlt oder es die falsche Stereochemie aufweist, wirkt es auch als Ketten-Terminator für die wachsende virale DNA-Kette. Im Endeffekt wirkt das Nucleosid-Analogon in vivo als Hemmstoff für die virale DNA-Polymerase.
Obschon sich die therapeutisch wirksamen Nucleosid-Analoga als wertvolle Mittel zur Bekämpfung oder Eindämmung von Herpes-Infekten erwiesen haben, sind diese Mittel nicht ohne Nebeneffekte. Beispielsweise wurde über Hautausschläge und Nierenfunktionsstörung als Nebeneffekte bei Aciclovir berichtet (vgl. "Physician's Desk Reference", 44. Auflage, Medical Economics Inc., Oradell, N.J., USA, 1990, Seiten 819-821). Fur eine neuere Übersicht der zur Verfügung stehenden antiviralen Arzneimittel und ihrer Nebeneffekte vgl. M.C. Nahata, "Antiviral Drugs": Pharmacokinetics, Adverse Effects, and Therapeutic Use", J. Pharm. Technol., 3, 100 (1987). Deshalb würden sowohl Unbedenklichkeit wie auch Kostenvorteile erreicht werden, wenn diese Mittel in einer Weise, die ihre therapeutische Wirkung erhöht, formuliert würden.
Wir haben nun gefunden, dass die antivirale Wirkung der Nucleosid-Analoga durch deren Kombination mit gewissen Peptid-Derivaten, welche selektiv die Ribonucleotid-Reduktase inhibierende Eigenschaften aufweisen, ohne gleichzeitige Erhöhung von toxischen Wirkungen synergistisch erhöht werden kann.
Ribonucleotid-Reduktase (RR) ist das Enzym, welches für die Konversion von Ribonucleotiden zu Desoxyribonudeotiden verantwortlich ist. Die Rolle der RR in der DNA-Biosynthese wurde vor kurzem von J. Stubbe, J. Biol. Chem. 265, 5329 (1990) in einem Übersichtsartikel diskutiert.
Im Jahre 1985 berichteten T. Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4254 (1985), dass eine Kombination von Aciclovir mit einem Semicarbazon-RR-Hemmer, 2-Acetylpyridinthiosemicarbazon, eine synergistische Anti-Herpes-Wirkung zeitigt. Die Kombination von Aciclovir mit dem RR-Hemmer Hydroxyharnstoff war jedoch für die Wirtszelle toxisch, und das mit einigen verwandten Semicarbazon-Derivaten kombinierte Aciclovir potenzierte nicht immer die Anti-Herpes-Wirkung von Aciclovir.
Über eine dreifältige Kombination von Aciclovir, Bacitracin und einem RR-hemmenden Nonapeptid wurde von E.A. Cohen et al. im Patent US-4795740 vom 3. Januar 1989 berichtet. Merkwürdigerweise wurde die Anti-Herpes-Wirkung dieser letztgenannten Kombination als gleich oder geringer als diejenige von Aciclovir angegeben.
Es wurde noch über andere synergistische Kombinationen berichtet, die ein Nucleosid-Analogon als Komponente enthalten, beispielsweise :
- T.P. Zimmerman und G. Wolberg, Patentanmeldung EP- 235931, veröffentlicht am 9. September 1987 (Nucleosid-Analoga plus Nucleosid-Transport-Hemmer);
- K.O. Smith, Patent CA-1239093, erteilt am 12. Juli 1988 (Nucleosid-Analoga plus ein Interferon);
- T. Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1051 (1989), (Nucleosid-Analogon plus RR-Hemmer);
- T. Spector et al., Patent US-4758572, erteilt am 19. Juli 1988 (Nucleosid-Analogon plus RR-Hemmer); und
- T.A. Blumenkopf et al., Patentanmeldung EP-349243, veröffentlicht am 3. Januar 1990 (Nucleosid-Analogon plus RR- Hemmer).
Die erfindungsgemässe Kombination ist von den vorangegangenen Kombinationen durch ihre andere Zusammensetzung und/oder ihr relatives Fehlen von Toxizität unterscheidbar.

Kurzfassung der Erfindung

Hiermit wird eine Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung von Herpes-Infekten in einem Säuger zur Verfügung gestellt, umfassend einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge der Kombination eines antiviralen Nucleosid-Analogons, das unter Aciclovir, Vidarabin, Idoxuridin, Trifluridin, Ganciclovir, Edoxudin, Brovavir, Fiacitabin, Penciclovir, Famciclovir und Rociclovir ausgewählt ist, oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon, und eines Ribonucleotid-Reduktase inhibierenden Peptid-Derivats, das unter
Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;)CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- γMeLeu-OH
Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]C0-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- {(S)-NHCH[CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;]CH&sub2;OH}
und
Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH&sub3;[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;)CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- NHCH&sub2;CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;
oder ein therapeutisch annehmbares Salz eines beliebigen davon ausgewählt ist.
Das in der Kombination verwendete antivirale Nucleosid- Analogon ist ein solches, das (in vivo) enzymatisch zu einem Hemmstoff für virale DNA-Polymerase und/oder zu einem zweitmöglichen Substrat für die virale DNA-Polymerase des Herpes- Virus konvertierbar ist.
Gemäss einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, die in einer zur gleichzeitigen oder sequenziellen Verabreichung zur Behandlung von Herpes-Infekten in einem Säuger geeigneten Form ein Nucleosid-Analogon oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon sowie ein wie im vorstehenden definiertes Ribonucleotid-Reduktase inhibierendes Peptid-Derivat oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon umfasst.
Im Rahmen der Erfindung enthalten ist eine kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine gegen Herpes-Virus prophylaktische Menge der Kombination eines wie im vorstehenden definierten antiviralen Nucleosid-Analogons oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon; eines wie im vorstehenden definierten Ribonucleotid-Reduktase inhibierenden Peptid-Derivats oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon; sowie einen physiologisch annehmbaren Träger.

Kurzbeschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein Isobologramm, das die synergistische Hemmung der Replikation von HSV-2 durch das Peptid der Formel 1, Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cypn)- γMeLeu-OH, und Aciclovir zeigt (vgl. Beispiel 6). Die Konzentration des Peptids wurde variiert und die Hemmung der Replikation des Virus ausgewertet. Die Grösse FIC60(Aciclovir) ist das Verhältnis der zur Hemmung der Replikation des Virus um 60% benötigten Konzentration von Aciclovir in Gegenwart einer gegebenen Konzentration des Peptids. Auf der Abszissenachse dargestellt ist das Verhältnis einer gegebenen Konzentration des Peptids zur Konzentration des Peptids, die bei Abwesenheit von Aciclovir eine 60%ige Hemmung der Replikation des Virus zeitigt.

Einzelheiten der Erfindung

Zur Vereinfachung werden die erfindungsgemässen RR-hemmenden Peptid-Derivate im nachstehenden manchmal als "die Peptide" bezeichnet.
Bezüglich der Peptide basieren die im vorliegenden verwendeten Kürzel zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf den Empfehlungen der IUPAC-IUB Kommission für Biochemische Nomenklatur, vgl. European Journal of Biochemistry, 138, 9 (1984). Beispielsweise werden von Val, Ala, Ile, Asp und Leu die jeweiligen Reste von L-Valin, L-Alanin, L-Isoleucin, L-Asparaginsäure und L-Leucin dargestellt.
Die asymmetrischen Kohlenstoffatome, die sich auf der linearen Hauptachse (d.h. in der Hauptkette) der Peptide der Formel 1 befinden, weisen, unter Ausschluss des 1,4-Dioxobutyl-Molekülteils und der endständigen Gruppen, eine S-Konfiguration auf. Asymmetrische Kohlenstoffatome, die sich auf der Seitenkette einer Aminosäure oder eines Aminosäurerest- Derivats, im 1,4-Dioxobutyl-Molekülteil oder in einer endständigen Gruppe befinden, können die S- oder die R-Konfiguration aufweisen.
Der auf eine Aminosäure oder ein Aminosäure-Derivat bezogene Terminus "Rest" bedeutet ein Radikal, das von der entsprechenden α-Aminosäure durch Entfernen des Hydroxyls der Carboxy-Gruppe und eines Wasserstoffatoms der α-Amino-Gruppe abgeleitet ist.
Das Symbol "Tbg" stellt den Aminosäurerest der 2(S)- Amino-3,3-dimethylbuttersäure dar. Das Symbol "Cpg" stellt den Aminosäurerest der (S)-α-Aminocyclopentanessigsäure dar. Das Symbol "Cha" stellt den Aminosäurerest der (S)-α-Aminocyclohexanpropionsäure dar. Der Terminus "γMe-Leu" stellt den Aminosäurerest der 2(S)-Amino-4,4-dimethylvaleriansäure dar.
Andere im vorliegenden verwendete Symbole sind: (N-Me)- Asp für den Rest der (S)-2-(Methylamino)bernsteinsäure; Asp(cyBu) für den Rest der (S)-α-Amino-1-carboxycyclobutanessigsäure; Asp(cyPn) für den Rest der (S)-α-Amino-1-carboxycyclopentanessigsäure; Asp(pyrrolidino) für den Rest des Amids 2(S)-Amino-4-oxo-4-pyrrolidinobuttersäure; und gleichwohl stehen Asp(morpholino) und Asp(NET&sub2;) für die Reste der entsprechenden Amide, bei denen Pyrrolidino durch Morpholino bzw. Diethylamino ersetzt wurde. Das Symbol Asp(diMe) steht für den Rest der 2(S)-Amino-3,3-dimethylbuttersäure d.h. der 3,3-Dimethyl-L-asparaginsäure.
Die Ribonucleotid-Reduktase (RR) inhibierenden Peptide und deren therapeutisch annehmbare Salze werden nach Verfahren hergestellt, die von P.L. Beaulieu, R. Déziel und N. Moss in der am 12. Juni 1990 eingereichten Patentanmeldung CA- 2018801 beschrieben wurden. Insbesondere können die Peptide der Formel 1 nach Verfahren hergestellt werden, die Methoden umfassen, welche bei der Synthese von Peptiden herkömmlich verwendet werden, wie beispielsweise klassiche Kupplung von Aminosäureresten und/oder Peptid-Fragmenten in Lösung, und falls erwünscht, Festphasen-Techniken. Beschrieben sind solche Methoden beispielsweise von E. Schröder und K. Lübke in "The Peptides", Band 1, Academic Press, New York, N.Y., 1965, Seiten 2-128; in der Lehrbücher-Reihe "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", herausgegeben von E. Gross et al., Academic Press, New York, N.Y., 1979-1987, Bande 1 bis 8; sowie von J.M. Stewart und J.D. Young in "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, USA, 1984.
Ein gemeinsames Merkmal der im vorstehenden erwähnten Verfahren für Peptide ist der Schutz der reaktionsfähigen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurereste oder Aminosäurerest-Derivate mittels geeigneter Schutzgruppen, welche verhindern, dass an der jeweiligen Stelle eine chemische Reaktion stattfindet, bis die Schutzgruppe schliesslich entfernt wird. Üblicherweise ist ein gemeinsames Merkmal auch der Schutz einer α-Aminogruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment, während dieses Gebilde bei der Carboxygruppe reagiert, und die nachfolgende selektive Entfernung der α- Aminoschutzgruppe, um einer nachfolgenden Reaktion zu ermöglichen, an dieser Stelle stattzufinden. Üblicherweise ist ein anderes gemeinsames Merkmal der anfängliche Schutz des C-endständigen Carboxyls des Aminosäurerests oder Peptidfragments, welches, falls vorhanden, dazu bestimmt ist, die C-endständige Funktion des Peptids zu werden, mit einer geeigneten Schutzgruppe, um zu vermeiden, dass an der jeweiligen Stelle eine chemische Reaktion stattfindet, bis die Schutzgruppe entfernt wird, nachdem die gewünschte Sequenz des Peptids zusammengebaut wurde.
Somit kann im allgemeinen ein Peptid der Formel 1 hergestellt werden durch schrittweise Kupplung, in der Reihenfolge der Sequenz des Peptids, der Aminosäure oder der Aminosäurenrest-Derivate, oder von Fragmenten des Peptids, die falls erforderlich auf geeignete Weise geschützt werden, und Beseitigung aller Schutzgruppen, falls vorhanden, nach Vollziehung der schrittweisen Kupplung, um das Peptid der Formel 1 zu erhalten.
Der Terminus "pharmazeutisch annehmbarer Träger", wie im vorliegenden verwendet, bedeutet ein nicht toxisches, im allgemeinen inertes Vehikel für die wirksamen Ingredienzien, welches die wirksamen Ingredienzien nicht beeinträchtigt.
Der Terminus "physiologisch annehmbarer Träger", wie im vorliegenden verwendet, bedeutet ein annehmbares kosmetisches Vehikel mit einem oder mehreren nicht toxischen Arzneimittelträgern, welche mit den darin enthaltenen wirksamen Ingredienzien nicht reagieren und deren Wirksamkeit nicht beeinträchtigen.
Der Terminus "veterinärmedizinisch annehmbarer Träger", wie im vorliegenden verwendet, bedeutet ein physiologisch annehmbares Vehikel zur Verabreichung von Arzneistoffen an Haustiere mit einem oder mehreren nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträgern, welche mit dem Arzneistoff nicht reagieren und dessen Wirksamkeit nicht beeinträchtigen.
Der Terminus "wirksame Menge" bedeutet eine vorbestimmte antivirale Menge des antiviralen Wirkstoffes, d.h. eine Menge des Wirkstoffes, welche genügt, um gegen die viralen Organismen in vivo wirksam zu sein.
Die antivirale Aktivität der erfindungsgemässen Kombination kann durch biochemische, mikrobiologische und biologische Prozeduren demonstriert werden, welche die inhibierende Wirkung der Kombination auf die Replikation von HSV-1 und HSV-2 sowie von anderen Herpes-Viren wie beispielsweise Varizella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Pferde- Herpes-Virus (EHV) und Pseudowut-Virus (PRV) zeigen.
Ein Verfahren zur Demonstration der inhibierenden Wirkung der Kombination auf die virale Replikation ist beispielsweise die Zellenkulturtechnik; vgl. beispielsweise T. Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4254 (1985).
Ein Beispiel dieses Verfahren wird im nachstehenden in einer modifizierten Form gegeben.
Ein Verfahren zur Demonstration der therapeutischen Wirkung der Kombination ist bei Herpes-simplex-viralen Hautinfekten das Meerschweinchen-Modell; vgl. beispielsweise S. Alenius und B. Oberg, Archives of Virology, 58, 277 (1978).
Bei der Verwendung der erfindungsgemässen Kombination zur Behandlung von viralen Infekten wird die Kombination warmblütigen Tieren, z.B. Menschen, Schweinen oder Pferden in einem Vehikel verabreicht, das ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger umfasst, deren Proportion von der Löslichkeit und chemischen Beschaffenheit des Nucleosid-Analogons und des Peptids, vom gewählten Verabreichungsweg, von der biologischen Standardpraxis und von der relativen Menge der beiden wirksamen Ingredienzien zur Erzeugung einer synergistischen antiviralen Wirkung bestimmt wird. Vorzugsweise wird die Kombination topisch verabreicht. Beispielsweise können die beiden Wirkstoffe (d.h. das antivirale Nucleosid- Analogon und das Peptid oder deren therapeutisch annehmbare Salze) in Form von Lösungen, Emulsionen, Cremen oder Lotionen in pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln formuliert werden. Eine solche Formulierung kann 0,01 bis 1.0 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 Gew.-%, des Nucleosid-Analogons oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon und etwa 0,5-20 Gew.- %, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, des Peptids oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon enthalten.
Jedenfalls sind die beiden Wirkstoffe in der Arzneimittelzusammensetzung in Mengen vorhanden, die eine synergistische Anti-Herpes-Wirkung ergeben.
Eine bevorzugte erfindungsgemässe Ausbildung bezieht sich auf eine antivirale Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung von Herpes-Virus-Infekten der Haut oder Teile der oralen oder genitalen Höhle. Diese Zusammensetzung umfasst eine Kombination von 0,05 bis 1,0 Gew.-% des im vorliegenden definierten Nucleosid-Analogons und 1 bis 10 Gew.-% des Peptids zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Bevorzugte Trager sind in diesem Fall wasserlösliche Salbenbasen oder Emulsionen des Typus Wasser-in-Öl.
Beispiele von geeigneten Vehikeln oder Trägern für die vorangehend erwähnten Formulierungen sind in gängigen pharmazeutischen Texten, beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1980, beschrieben.
Die Dosierung der erfindungsgemässen Kombination variiert mit der Form der Verabreichung und den jeweils gewählten Wirkstoffen. Ausserdem variiert sie mit dem jeweils behandelten Wirt. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Mengen begonnen, die wesentlich geringer sind als die optimale Dosis der Kombination. Danach wird die Dosierung in kleinen Mengenerhöhungen erhöht, bis die den Umständen entsprechende optimale Wirkung erreicht wird. Im allgemeinen ist es am meisten bevorzugt, die Kombination bei einem Konzentrationsgrad zu verabreichen, der im allgemeinen antiviral wirksame Resultate gegen Herpes-Virus bringt, ohne schädigende oder beeinträchtigende Nebenwirkungen zu zeitigen.
Die Kombination wird der infizierten Fläche des Körpers, z.B. der Haut oder einem Teil der oralen oder genitalen Höhle, topisch in einer Menge verabreicht, die genügt, um die infizierte Fläche zu bedecken. Die Behandlung sollte wiederholt werden, beispielsweise alle vier bis sechs Stunden, bis die Läsionen heilen.
Obschon das Verfahren zur Behandlung von Herpes-Virus- Infekten vorzugsweise durchführbar ist, indem die Kombination des Nucleosid-Analogons und des Peptids in einer einzigen Formulierung gleichzeitig verabreicht wird, fällt die tägliche Verabreichung der beiden Wirstoffe getrennt oder nacheinander ebenfalls in den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Eine andere Ausbildung der vorliegenden Erfindung umfasst eine kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine gegen Herpes-Virus prophylaktische Menge der erfindungsgemässen Kombination zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Träger. Den Formulierungen können zusätzliche Komponenten, beispielsweise Hautweichmacher, beigegeben werden. Die erfindungsgemässen kosmetischen Formulierungen werden prophylaktisch verwendet, um den Ausbruch von Herpes-Läsionen zu vermeiden. Sie können bei Nacht aufgetragen werden und enthalten im allgemeinen geringere Mengen der beiden Wirkstoffe der Kombination als die Arzneimittelzusammensetzungen. Ein bevorzugter Mengenbereich für jeden der Wirkstoffe in der kosmetischen Zusammensetzung liegt bei 0,01 bis 0,1 Gew.-% des Nucleosid-Analogons und 0,1 bis 1 Gew.-% des Peptids.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Lösungsmittel-Prozente oder -Verhältnisse drücken Volumen-zu-Volumen-Verhältnisse aus, sofern nichts anderes angegeben wird. In den Beispielen verwendete Kürzel umfassen: Boc = t-Butyloxycarbonyl; BOP = (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat; Bzl = Benzyl; CH&sub2;Cl&sub2; = Methylendichlorid; DIPEA = Diisopropylethylamin; DCC = N,N-Dicyclohexylcarbodiimid; DMF = Dimethylformamid; Et&sub2;O = Diethylether; EtOAc = Ethylacetat; EtOH = Ethanol; HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol; HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; MeOH = Methanol; NMM = Methylmorpholin; TFA = Trifluoressigsäure; THF = Tetrahydrofuran; TLC = Dünnschichtchromatographie. Temperature werden in ºC gegeben.

Beispiel 1

(a) Herstellung des Zwischenstoffes Boc-Asp(pyrrolidino)-OH

Einer gerührten Lösung von Boc-Asp-OBzl (47,60 g; 0,147 mol) in Acetonitril (500 ml) wurde in kleinen Portionen N,N'- Carbonyldiimidazol (24,32 g; 0,15 mol) beigegeben. Nach 45 min wurde das Reaktionsgemisch auf 0º gekühlt und Pyrrolidin (13,4 ml, 0,16 mol) tropfenweise beigegeben. Dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur gerührt, um die Umsetzung zur Vollständigkeit zu führen (etwa 3 Stunden, aufgrund der TLC geschätzt). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand in EtOAc (500 ml) gelöst. Die organische Phase wurde mit 10%igem wässrigem HCl (3 x 100 ml) und 1N wässrigem NaOH (2 x 100 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Verdampfen der organischen Phase unter reduziertem Druck ergab ein farbloses Öl, das sich beim Stehenlassen verfestigte. Letztgenanntes Produkt wurde, in einer EtOH-Lösung (200 ml), während 20 Stunden unter atmosphärischem Druck der Hydrogenolyse unterzogen, wobei als Katalysator 200 mg von 20 Gew.-%igem Pd(OH)&sub2; auf Kohlenstoff verwendet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über Kieselgur filtriert. Verdampfen des Filtrats ergab einen Rückstand, der durch Umkristallisieren aus Hexan/Et&sub2;O gereinigt wurde, was das gewünschte Produkt (37,10 g; 80%) ergab. Schmp. 114º-116º. Die Struktur des Produkts wurde mit NMR bestätigt.
Entsprechende N-substituierte Asparagin-Analoga wurden erhalten, indem bei dem Vorgehen nach dem vorliegenden Beispiel Pyrrolidin durch das geeignete Amin (beispielsweise Diethylamin oder Piperidin) ersetzt wurde.

(b) Herstellung des Zwischenstoffes Boc-2(S)-amino-4-oxo-undecansäure

Boc-Asp-OBzl (500 mg; 1155 mmol) wurde in Acetonitril (10 ml) gelöst, und der Lösung wurde N,N'-Carbonyldiimidazol (277 mg; 1,71 mmol) beigegeben. Nach 30 min wurde p-Nitrobenzyl-magnesiummalonat (860 mg; 1,71 mmol) beigegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur (20-22ºC) während 1,5 Stunden gerührt. Das Acetonitril wurde verdampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst, mit 1N wässrigem HCl, Wasser und dann Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde durch Chromatographie (SiO&sub2;, Elutionsmittel: Hexan-EtOAc) gereinigt, was Boc-2 (S)-amino-4-oxo- 1,6-adipinsäure-1-benzylester-6-(4-nitrophenyl)-methylester (600 mg; 80%) ergab. Die letztgenannte Verbindung (3,25 g; 6,5 mmol) wurde in DMF (40 ml) gelöst. Der Lösung wurden Cs&sub2;CO&sub3; (2,33 g; 7,14 mmol) und Hexyliodid (1,51 g; 7,14 mmol) beigegeben. Die Mischung wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit 1N wässrigem HCl und H&sub2;O gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und verdampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie (SiO&sub2;, Elutionsmittel: Hexan-EtOAc) gereinigt, was Boc-2 (S)-amino-4- oxo-5-[(4-nitrophenyl)methoxycarbonyl]-undecansäure-benzylester (630 mg) ergab. Eine Lösung der letztgenannten Verbindung (630 mg) in MeOH (25 ml) wurde in einer Parr-Vorrichtung unter H&sub2;-Atmosphäre in Gegenwart von 20%igem Pd(OH)&sub2;/C (70 mg) während 18 Stunden geschüttelt. Nach einer Filtration und Konzentration des Reaktionsgemisches wurde der resultierende Rückstand in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde während 10 min mit 1N wassrigem HCl gerührt. Die organische Phase wurde getrennt, mit H&sub2;O gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und verdampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie (SiO&sub2;, Elutionsmittel: Hexan-EtOAc) gereinigt, was die Titelverbindung (160 mg) ergab. NMR und MS des Produktes stimmten mit der erwarteten Struktur überein.
Die Kupplung der Titelverbindung mit geeigneten Einheiten zur Herstellung von Peptiden der Formel 1 mit Y in der Bedeutung Heptyl wurde mit DCC/HOBt als Kupplungagens erreicht.

(c) Herstellung des Zwischenstoffes Boc-2(S)-amino-5-cyclodentyl-4-oxocyclopentancarbonsäure

Boc-2(S)-amino-4-oxo-1,6-adipinsäure-1-benzylester-6-(4- nitrophenyl)methylester (4,8 g; 9,6 mmol) wurde in DMF (100 ml) gelöst. Der Lösung wurden Na&sub2;CO&sub3; (4,07 g; 38,4 mmol) und 1,4-Diiodobutan (3,59 g; 11,6 mmol) beigegeben. Das Gemisch wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann während 3 Stunden auf 50ºC erhitzt. Durch Verdampfen des Reaktionsgemisches, Extraktion des resultierenden Rückstands mit EtOAc, Waschen des Extrakts mit 1N wässrigem HCl und Wasser, Trocknen (MgSO&sub4;) und Verdampfen des Extrakts ergab sich ein Rohprodukt. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie (SiO&sub2;, Elutionsmittel: Hexan-EtOAc) gereinigt, was den entsprechenden Benzylester der Titelverbindung (4,3 g) ergab. Der Benzylester der letztgenannten Verbindung wurde der Hydrogenolyse [5% Pd(OH)&sub2;/C in MeOH; 18 Stunden) unterzogen und verarbeitet (vgl. im Abschnitt (a) des vorliegenden Beispiels, was die Titelverbindung (140 mg) ergab. NMR und MS des Produkt stimmten mit der erwarteten Struktur überein.
Die Kupplung der letztgenannten Zwischenverbindung mit anderen geeigneten Einheiten zur Herstellung von Peptiden der Formel 1 mit Y in der Bedeutung Cyclopentyl wurde mit BOP erreicht.

Beispiel 2

Herstellung von (S)-α-Azido-1-[(phenylmethoxy)carbonyl)cyclopentanessigsäure

Die Titelverbindung wurde hergestellt aus dem von M.N. Aboul-Enein et al., Pharm. Acta Helv., 55, 50 (1980), beschriebenen 2-Oxaspiro[4.4]nonan-1,3-dion nach dem Verfahren der asymmetrischen Azidierung unter Verwendung des Evans- Hilfsstoffes, vgl. D.A. Evans et al., J. Amer. Chem. Soc., 112, 4011 (1990). Das NMR (200 MHz, CDCl&sub3;) der Verbindung ergab: δ 4,55 (s,1H), 5,12 (s,2H) und 7,4 (m, 5H).

Beispiel 3

Herstellung von (R.S)-3-(1,1-Dimethylethyl)-dihydro-2,5-furandion

(a) Ein Gemisch von 2,2-Dimethylpropanal (5,00 g; 58 mmol), Ethylcyanacetat (6,60 g; 58,3 mmol), Essigsäure (3,50 g; 58,3 mmol) und Pyridin (4,60 g; 58,2 mmol) wurde während 1 Stunde im Rückfluss erhitzt. Es wurde eine zweite Portion 2,2-Dimethylpropanal (5,00 g; 58 mmol) beigegeben. Das Erhitzen des Gemisches im Rückfluss wurde während 18 Stunden weitergeführt. Nach der Abkühlung wurde das Gemisch in 1N wässriges HCl (50 ml) geschüttet. Das resultierende Gemisch wurde mit EtOAc (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 1N wässrigem HCl gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert, was ein farbloses Öl ergab. Das Öl wurde dürch Flash-Chromatographie auf 5i0&sub2; unter Verwendung von Hexan-EtOAc (9:1) als Elutionsmittel gereinigt, was 2- Cyan-4, 4-dimethyl-2-pentencarbonsäure-ethylester als farbloses Öl (7,69 g; Ausbeute 73%) ergab.
(b) Die letztgenannte Verbindung (7,69 g; 42,4 mmol) wurde mit Eisessig (2,60 g; 43 mmol) und wasserfreiem Pyridin (3,41 g; 43 mmol) gemischt. Das Gemisch wurde auf 500 erhitzt. Es wurden Kaliumcyanid und danach wasserfreies EtOH (6 ml) beigegeben. Das Gemisch wurde während 45 min auf 50º erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und zwischen 1N wässrigem HCl (25 ml) und Et&sub2;O (100 ml) aufgeteilt. Die Et&sub2;O-Schicht wurde getrennt, mit 1N wässrigem HCl (2 x 20 ml) und Kochsalzlösung (2 x 20 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert, was 2,3-Dicyan-4,4-dimethylvaleriansäure-ethylester als braunes Öl (8,83 g; Rohausbeute 100%) ergab.
(c) Die letztgenannte Verbindung (11 g) wurde in konzentriertes HCl (150 ml) suspendiert. Das Gemisch wurde während 24 Stunden im Rückfluss erhitzt und dann in einem Eisbad gekühlt. Der als weisser Feststoff resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Der Feststoff wurde in EtOAc (300 ml) aufgelöst. Unlösliches Material in der Lösung wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, was ein Öl ergab. Das Öl wurde mit Hexan zerrieben. Der resultierende weisse kristalline Stoff wurde gesammelt, was (R,S)-2-(1,1-Dimethylethyl)-1,4-bernsteinsäure (7,95 g; Ausbeute 95%) ergab.
(d) Die letztgenannte Verbindung (7,95 g; 51 mmol) wurde in Essigsäureanhydrid (11 ml, 117 mmol) suspendiert. Das Gemisch wurde während 2 Stunden auf 110º erhitzt. Eine darauffolgende Destillation des Gemisches unter Vakuum ergab die Titelverbindung des vorliegenden Beispiels als Öl (Sp. 140-145º/12mm, 7,08 g; Ausbeute 88%). Das Öl verfestigte sich beim Abkühlen.

Beispiel 4

Herstellung von (R,S)-2-(1,1-Dimethylethyl)-4-oxo-4- (1-ethylpropylamino)buttersäure
Es wurde (R,S)-3-(1,1-Dimethylethyl)-dihydro-2,5-furandion (5,00 g; 32 mmol, im Beispiel 3 beschrieben) in Acetonitril (50 ml) gelöst. Die Lösung wurd auf 0º gekühlt. Der gerührten Lösung wurde (1-Ethylpropyl)amin (6,13 g; 70,4 mmol) langsam beigegeben. Die Lösung wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zwischen Et&sub2;O und 10%iger wässriger Citronensäure (jeweils 60 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wurde getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Et&sub2;O (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10%iger wässriger Citronensäure (2 x 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Der Rückstand wurde mit Et&sub2;O zerrieben, was die Titelverbindung als weissen Feststoff (4,65 g; Ausbeute 59%) ergab.

Beispiel 5

Herstellung von Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO- Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)-γMeLeu-OH
(a) Eine Lösung von Boc-γMeLeu-OBzl (0,272 g; 0,81 mmol) in 30%igem TFA in CH&sub2;Cl&sub2; wurde während 1 Stunde bei 0º gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. Das resultierende TFA-Salz wurde in Acetonitril (20 ml) aufgelöst. Der Lösung wurde NMM (0,53 ml; 4,86 mmol) beigegeben, dann wurden (S)-α-Azido-1-[(phenylmethoxy)carbonyl]cyclopentanessigsäure < 0,269 g; 0,89 mmol; im Beispiel 2 beschrieben) und BOP (0,464 g; 1,05 mmol) beigegeben. Die Lösung wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde mit 10%igem wässrigem HCl (2 x 25 ml), einer gesättigten wässrigen Na&sub2;CO&sub3;-Lösung (2 x 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen. Verdampfen der organischen Phase unter reduziertem Druck ergab N-{(S)-α-Azido-1-[(phenylmethoxy)carbonyl]cyclopentanacetyl}-2(S)-amino-4,4-valeriansäure-benzylester als gelbes Öl (0,400 g; Ausbeute 96%).
(b) Eine Lösung der letztgenannten Verbindung (0,312 g; 0,6 mmol) in MeOH (20 ml) wurde tropfenweise einer SnCl&sub2;-Lösung (0,207 g; 1,2 mmol) in MeOH (10 ml) bei 0º beigegeben. Das Gemisch wurde während 4 Stunden unter Argon gerührt, während die Umsetzungstemperatur zur Raumtemperatur zurückkehren durfte. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde durch Beigabe von 5%igem wässrigem NaOH basisch gemacht. Die organische Phase wurde getrennt, mit H&sub2;O (20 ml) und Kochsalzlösung (20 ml) gewaschen, auf wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und bis zur Trockenheit konzentriert, was N-{(S)-α-Amino-1-[(phenylmethoxy)carbonyl)- cyclopentanacetyl}-2(S)-amino-4,4-dimethylpentancarbonsäurebenzylester als weissen Feststoff (0,300 g; 0,6 mmol) ergab.
(c) Das letztgenannte Amin wurde in Acetonitril (20 ml) aufgelöst. Der Lösung wurden NMM (0,39 ml; 3,6 mmol), Boc- Asp(pyrrolidino)-OH (0,343 g; 1,2 mmol; im Beispiel 1 beschrieben) und BOP (0,583 g; 1,32 mmol) beigegeben. Die Lösung wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand in EtOAc (50 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde mit 10%igem wassrigem HCl (2 x 20 ml), einer gesattigten wässrigen Na&sub2;CO&sub3;-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde die Lösung getrocknet (MgSO&sub4;) und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie [SiO&sub2;; Elutionsmittel = EtOAc-hexan (1:1)) gereinigt, was N'-[N-(tert-Butyloxycarbonyl)-2(S)-amino-4-oxo-4-pyrrolidinobutanoyl]-N-α-amino-1- [(phenylmethoxy)carbonyl] cyclopentanacetyl}-2(S)-amino-4,4dimethylpentancarbonsäure-benzylester [Boc-Asp (pyrrolidino)- Asp(cyPn)-γMeLeu-OH-dibenzoat) als farblosen Schaum (0,459 g; 100%) ergab.
(d) Eine Lösung der letztgenannten Verbindung (0,385 g; 0,5 mmol) in 30%igem TFA in CH&sub2;Cl&sub2; wurde während 1 Stunde bei 0º gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand unter Vakuum getrocknet. Das resultierende, in Acetonitril (20 ml) aufgelöste TFA-Salz wurde unter Verwendung von BOP (0,309 g; 0,7 mmol) und NMM (0,65 ml; 6 mmol) nach dem im Abschnitt (c) des vorliegenden Beispiels beschriebenen Verfahren mit (R,S)-2-(1,1-Dimethylethyl)-4-oxo-4-(1-ethylpropylamino)buttersäure (0,146 g; 0,6 mmol, im Beispiel 4 beschrieben) gekuppelt. Das resultierende Produkt war ein Gemisch zweier Diastereoisomere. Die Isomere wurden durch Flash-Chromatographie [SiO&sub2;; Elutionsmittel = EtOAc] getrennt, was ein weniger polares Isomer [0,100 g; Rf 0,71 (EtOAc)) und ein mehr polares Isomer [0,120 g; Rf 0,42 (EtO- Ac)] ergab. Das mehr polare Isomer, nämlich das Di(benzyl)ester der Titelverbindung des vorliegenden Beispiels, wurde der Hydrogenolyse (10% Pd/C in ETOH; 1 Atmosphäre H&sub2;; 3 Stunden] unterzogen. Nach vollständig erfolgter Umsetzung wurde der Katalysator durch Filtration durch eine 45µm-Membran aus dem Reaktionsgemisch entfernt und das Filtrat konzentriert. Der Rückstand wurde mit ET&sub2;O zerrieben. Der resultierende weisse Feststoff wurde gesammelt und unter Vakuum getrocknet, was die Peptid-Titelverbindung des vorliegenden Beispiels (51 mg; Ausbeute 53%; Reinheit 92% wie durch HPLC bestimmt) ergab.

Beispiel 6

Vergleich von Aciclovir, des Peptids der Formel Et&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- γMeLeu-OH und der Kombination der beiden Wirkstoffes bei der Hemmung der Redlikation von HSV-2 in Zellkulturen

BHK-21/C13-Zellen (ATCC CCL 10) werden während zwei Tagen in 150-cm²-T-Kolben mit Alpha-MEM-Medium (Gibco Canada Inc., Burlington Ont, Kanada) inkubiert (1,5 x 106 Zellen/Kolben), das mit 8 Vol.-%igem fetalem Rinderserum (FBS, Gibco Canada Inc.) ergänzt war. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und dann in ein frisches Medium auf einer 24-Mulden-Platte übertragen, was 2,5 x 10&sup5; Zellen in 750 µl Medium pro Mulde ergibt. Die Zellen werden während einer Zeitdauer von 6 Stunden bei 37ºC inkubiert, um sie an die Platte haften zu lassen. Danach werden die Zellen einmal mit 500 µl Alpha-MEM-Medium, das mit 0,5 Vol.-%igem fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt ist, gewaschen und dann mit 750 µl des gleichen Mediums (arm an Serum) während 3 Tagen inkubiert. Nach dieser Zeitdauer des Serum-Aushungerns wird das an Serum arme Medium entfernt, und die Zellen werden während 2 bis 3 Stunden in 500 µl BBMT inkubiert. [Das BBMT-Medium wird von P. Brazeau et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 79, 7909 (1982)) beschrieben]. Danach werden die Zellen in 100 µl BBMT-Medium mit HSV-2 infiziert (Infektions-Mehrzahl = 0,02 PFU/Zelle). (Zu bemerken: Das verwendete HSV-2 war der Stamm HG-52, vgl. Y. Langelier und G. Buttin, J. Gen. Virol., 57, 21 (1981); das Virus wurde bei -80ºC gelagert). Nach 1 Stunde Virus-Adsorption bei 37ºC wird das Medium entfernt, und die Zellen werden mit BBMT (3 x 250 µl) gewaschen. In jeder Mulde werden die Zellen mit oder ohne (Referenz) geeigneten Konzentrationen des in 200 µl BBMT-Medium gelösten Testwirkstoffes inkubiert. Nach 29 Stunden Inkubation bei 37ºC werden die infizierten Zellen geerntet, indem die Platte zunächst auf -80ºC tiefgefroren und dann aufgetaut wird. In jeder Mulde werden die Zellen mit Hilfe der schmelzenden Eisstücke von der Oberfläche der Mulde abgeschabt. Nach dem vollständigem Auftauen werden die Zellsuspensionen gesammelt, und jede Mulde wird mit 150 µl BBMT-Medium gespült. Die Virenprobe (Suspension plus Waschflüssigkeit) wird während 4 Minuten bei 4ºC vorsichtig beschallt. Zellenbruchstücke werden durch Zentrifugation (1000malige Schwerkraft während 10 Minuten bei 4ºC) entfernt. Der Überstand wird gesammelt und bis zur Bestimmung des Virentiters bei -80ºC gelagert.
Die Bestimmung des Virentiters wurde nach einer Modifikation der kolorimetrischen Untersuchungsmethode von M. Langlois et al., Journal of Biological Standardization, 14, 201 (1986) durchgeführt.
Im Einzelnen werden BHK-21/C13-Zellen auf ähnliche Weise, wie es im vorstehenden beschrieben wurde, mit Trypsin behandelt und dann in ein frisches Medium auf einer 96-Mulden- Platte übertragen, was 20'000 Zellen in 100 µl Medium pro Mulde ergibt. Auf der bearbeiteten Platte werden die Zellen während 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Inzwischen wird die Virenprobe aufgetaut und während 15 Sekunden vorsichtig beschallt, und es werden logarithmische Verdünnungen der Probe hergestellt (1/5 Sequenzen: 50 µl Probe plus 200 µl BBMT-Medium, wobei aufeinanderfolgende Verdünnungen mit einer Multikanal-Pipette gemacht werden).
Wenn die im vorstehenden angegebene 2stündige Inkubation der BHK-21/C13-Zellen vollständig erfolgt ist, wird das Medium mit Alpha-MEM-Medium ersetzt, das mit 3 Vol.-e%igem fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt ist. Nun sind die Zellen bereit, mit den verschiedenen Virenproben-Verdünnungen infiziert zu werden. Teilmengen (50 µl) der verschiedenen Verdünnungen werden in die geeigneten Mulden der Platte übertragen. Die resultierenden infizierten Zellen werden während 2 Tagen bei 37ºC inkubiert. Dann werden jeder Mulde 50 µl einer 0,15 Vol.-%igen Lösung von neutralem rotem Farbstoff in Hanks Ausgeglichener Salzlösung (pH-Wert 7,3, Gibco Canada Inc.) beigegeben. Die bearbeitete Platte wird während 45 Minuten bei 37ºC inkubiert. Von jeder Mulde wird dann das Medium aufgesaugt, und die Zellen werden einmal mit 200 µl Hanks Ausgeglichener Salzlösung gewaschen. Nach dem Waschen wird der Farbstoff aus den Zellen durch Beigabe von 100 µl eines Gemisches 1:1 von 0,1M Sorensens Citratpuffer (pH-Wert 4,2) und Ethanol herausgeholt. [Sorensens Citratpuffer wird wie folgt zubereitet: Erstens wird eine 0,lM Dinatriumcitratlösung hergestellt, indem Citronensäure-Monohydrat (21 g) in 1N wassriges NaOH (200 ml) gelöst wird und genug filtriertes H&sub2;O beigegeben wird, um auf 1 Liter zu ergänzen. Zweitens wird die 0,1M Dinatriumcitratlösung (61,2 ml) mit 0,1N wässrigem HCl (38,8 ml) gemischt, und der pH-Wert der resultierenden Lösung wird nötigenfalls auf 4,2 eingestellt.] Das in den Mulden befindliche Gemisch wird einer vorsichtigen Verwirbelung unterzogen, um eine richtige Durchmischung zu erreichen. Die Mulden der Platte werden mit einem Plattenleser- Spektrophotometer bei 540 µm abgetastet, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu schätzen. Auf diese Weise kann die prozentuale Inhibition des Virenwachstums für die verschiedenen Konzentrationen des Testwirkstoffes bestimmt werden, und es kann daraus die Konzentration des Testwirkstoffes, die zu einer 50%igen Inhibition der Virenreplikation führt, d.h. das IC&sub5;&sub0; berechnet werden.
Die nachstehende Tabelle veranschaulicht die Resultate, die erhalten werden, wenn Aciclovir und die Peptid-Titelverbindung nach dem Testverfahren des vorliegenden Beispiels untersucht werden. TABELLE
x Aciclovir wurde von Bourroughs Wellcome Inc., Kirkland Que, Kanada, bezogen.
xx Die Peptid-Titelverbindung des vorliegenden Beispiels.
Die Synergiewirkung der Kombination von Aciclovir und Peptid kann weiter bewiesen werden, indem auf die angegebenen Resultate das Isobolverfahren angewendet wird, vgl. J. Sühnel, Antiviral Research, 13, 23 (1990) und dessen Literaturnachweis. Das mit der Anwendung des vorliegenden Verfahrens erreichte positive Resultat wird in der beigefügten Fig. 1 graphisch dargestellt.
Nach dem Verfahren des vorliegenden Beispiels kann die Synergiewirkung auch für andere Kombinationen der Nucleosid- Analoga und der Peptide bewiesen werden. Beispiele von anderen spezifischen Peptiden zur erfindungsgemässen Verwendung sind:
ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)- Asp(cyPn)-{(S)-NHCH[CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;]CH&sub2;OH}
ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)- Asp(cyPn)-NHCH&sub2;CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;
ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;)CO-Asp(pyrrolidino)- Asp(cyBu)-Leu-OH
ME2CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(NET&sub2;)- Asp(diMe)-γMeLeu-OH
(Cyclohexyl)CH&sub2;NH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO- Asp(morpholino)-Asp(cyPn)-Cpg-OH
ME&sub2;CHCH&sub2;CH&sub2;NH-COCH&sub2;CH[(S)-Et]CO-Asp(piperidino)- Asp(cyBu)-Cha-OH

Claims

1. Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung von Herpes- Infekten in einem Säuger, umfassend einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge der Kombination eines antiviralen Nucleosid-Analogonsl das unter Aciclovir, Vidarabin, Idoxuridin, Trifluridin, Ganciclovir, Edoxudin, Brovavir, Fiacitabin, Penciclovir, Famciclovir un& Rociclovir ausgewählt ist, oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon, und eines Ribonucleotid-Reduktase inhibierenden Peptid-Derivats, das unter

ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- γMeLeu-OH

ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn){(S)-NHCH[CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;)CH&sub2;OH}

und

ET&sub2;CHNH-COCH&sub2;CH[(S)-C(CH&sub3;)&sub3;]CO-Asp(pyrrolidino)-Asp(cyPn)- NHCH&sub2;CH&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;

oder ein therapeutisch annehmbares Salz eines beliebigen davon ausgewählt ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei welcher die Menge des Nucleosid-Analogons oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon 0,01 bis 1,0 Gew.-% der Zusammensetzung beträgt und die Menge des Peptids oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon 0,5 bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung beträgt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend 0,05 bis 1,0 Gew.-% Aciclovir und 1 bis 10 Gew.-% des im Anspruch 1 definierten Peptids beträgt.

4. Kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine gegen Herpes-Virus prophylaktische Menge einer Kombination von Aciclovir oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon und eines wie im Anspruch 1 definierten Ribonucleotid-Reduktase inhibierenden Peptid-Derivats oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon, sowie einen physiologisch annehmbaren Träger.

5. Zusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 in einer zur topischen Applikation geeigneten Form.

6. Zusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 zur Behandlung von durch Herpes simplex Typus 1 oder Typus 2 verursachten Infekten in einem Säuger.