DE69117566T2

DE69117566T2 - Verwendung von Isomonoolen zur Behandlung und Prophylaxe von Krebserkrankungen

Info

Publication number: DE69117566T2
Application number: DE69117566T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Miwa; Shingo Nakamura; Yoshichika Nishimura
Original assignee: Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd
Current assignee: DKS Co Ltd
Priority date: 1990-04-19
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2011-04-19
Also published as: US5162304A; DE69117566D1; EP0452941B1; EP0452941A2; EP0452941A3

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von 14-Methyl-1-pentadecanol, 14-Methyl-1-hexadecanol, 16-Methyl-1-heptadecanol, 16- Methyl-1-octadecanol oder 18-Methyl-l-nonadecanol zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Verstärkung der karzinostatischen Aktivität eines bekannten karzinostatischen Mittels
Es sind bereits mehrere Arten karzinostatischer Mittel bekannt. Dazu gehören alkylierende Mittel, die karzinostatische Aktivität durch Alkylierung von Biopolymeren aufweisen, die eine unverzichtbare Rolle spielen, wie z. B. Nudeinsäuren und Enzyme, metabolische Antagonisten, die den Metabolismus der Nucleinsäuren inhibieren, mitotische Gifte, welche die Biosynthese der Nudeinsäuren in den Zellen beeinträchtigen, karzinostatische Antibiotika, welche cytozidale Aktivität gegenüber Zellen bei rascher Proliferation aufweisen, karzinostatische Verbindungen pflanzlichen Ursprungs und Hormone.
Außerdem hat man Amphotericin B und dergleichen als Karzinostase-verstärkende Mittel untersucht, welche eine verbesserte Absorption von Wirkstoffen mit schlechter Absorbierbarkeit durch Krebszellen bewirken und somit die karzinostatischen Effekte karzinostatischer Mittel, wie Bleomycin und Adriamycin, verstärken können. Mit keinem dieser Mittel wurde jedoch ein bemerkenswerter Effekt erzielt.
Die dem Fachmann bekannten karzinostatischen Mittel können das Auftreten von Nebenwirkungen nicht verhindern und wenige von ihnen besitzen einen zufriedenstellenden Effekt. Daher besteht Bedarf an karzinostatischen Mitteln mit verbesserten Eigenschaften. Ebenso besteht Bedarf an hervorragenden Karzinostaseverstärkenden Mitteln, damit sich die Effekte der karzinostatischen Mittel voll entfalten können.
Die JP-A-62-132823 offenbart karzinostatische Mittel, die als aktive Komponente Wollfettsäuren und/oder Wollalkohole enthalten. Die Wollalkohole entsprechen verzweigten, einwertigen C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub7;-Iso- und -Antiisoalkoholen.
Es wurde nun gefunden, daß bestimmte, natürlicherweise im Sebum vorkommende Isomonoole, Karzinostase-verstärkende Effekte besitzen. Darüber hinaus sind sie brauchbar zur Prävention der Karzinogenese, zur Prävention eines erneuten Auftretens nach abgeschlossener Krebstherapie, zur Prävention von berufsbedingtem Krebs und zur Prävention bei denienigen&sub1; die eine hereditäre Veranlagung für bestimmte Krebsarten aufweisen. Da die Isomonoole chemisch stabil sind und auch nach dem Kochen unverändert bleiben, können sie als Lebensmittelzusitze und für funktionelle Lebensmittel oder gesundheitsfödernde Lebensmittel verwendet werden.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von 14-Methyl-1- pentadecanol, 14-Methyl-1-hexadecanol, 16-Methyl-1-heptadecanol, 16-Methyl-1-octadecanol oder 18-Methyl-1-nonadecanol zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Verstärkung der karzinostatischen Aktivität eines bekannten karzinostatischen Mittels.
Als karzinostatisches Mittel verwendet man vorzugsweise Bleomycin.
14-Methyl-1-pentadecanol der Formel (II):
und 14-Methyl-1-hexadecanol der Formel (III):
besitzen besonders hohe Aktivität und sind daher besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Isomonoole sind erhältlich durch Zersetzung natürlich vorkommender Verbindungen, wie Wachse. Beispiele für solche natürlich vorkommenden Verbindungen sind Wollwachs, Walrat, Bienenwachs, weißes Wachs und Carnauba- Wachs.
Die erfindungsgemäß verwendeten Tsomonoole können z. B. wie folgt erhalten werden (Fig. 1, a, Fließdiagramm des Herstellungsverfahrens).

Verseifung:

Man suspendiert eine natürlich vorkommende Verbindung, wie Wollfett, in Gegenwart der 1,18-fachen molaren Alkalimenge (NaOH) in Wasser und führt unter Rühren bei 135 ± 5ºC und unter Druck eine 3-stündige Verseifungsreaktion in einem Autoklaven durch.

Abtrennung der Alkohole aus den Fettsäuren:

Zu dem resultierenden Verseifungsprodukt (Gemisch aus Natriumsalzen höherer Fettsäuren und höherer Alkohole) gibt man Wasser und Methylethylketon (im folgenden als MEK bezeichnet). Das Gemisch gibt man in einen Scheidetrichter und erwärmt auf 70 bis 75ºC, um die Alkohole in das MEK zu extrahieren. Die resultierende Lösung von Wollalkoholen in MEK wird im Vakuum abge dampft, wodurch man Wollalkohole in fester Form erhält.

Molekulardestillation der Wollalkohole:

Die so erhaltenen Wollalkohole in fester Form werden einer Molekulardestillation unterzogen, um eine Fraktion mit einem niedrigeren Siedepunkt zu erhalten (Temperatur: < 80º C, Druck: 1 x 10&supmin;² Torr). Diese Fraktion wird im folgenden als MDL-Alc bezeichnet.
Fraktionierung von MD1-Alc durch Reverse Phase-Säulenchromatographie:
MD1-Alc wird durch Reverse Phase-Säulenchromatographie (offene Säule) in 6 Fraktionen getrennt:

Fraktionierungsbedingungen:

Feste Phase: ODS, zerstoßen, Porengröße 60 Å, Teilchengröße 60/200 Mesh (Handelsbezeichnung:
YMC GEL, YAMAMURA KAGAKU KENKYUSHO K.K.)
Eluens: CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O = 5/15/1 (volumenbezogen)
Die dritte Fraktion, welche die dritthöchste Polarität besitzt, wird im folgenden als ODS#3 bezeichnet.
Fraktionierung von ODS#3 durch Normalphasen-säulenchromatographie:
ODS#3 wird durch Normalphasensäulenchromatographie (offene Säule) fraktioniert.

Fraktionierungsbedingungen:

Feste Phase: Silicagel, Porengröße 60 Å, TYPE 60 Å SPECIAL, Teilchengröße 100/200 Mesh (Handelsbezeichnung: SILICAR (Warenzeichen); Hersteller: Mallinckrodt, Vertrieb durch:
DAIICHI KAGAKU YAKUHIN K.K.)
Eluenzien: Eluens 1, CHCl&sub3;/CH&sub3;COCH&sub3; = 96/4 (volumenbezogen)
Eluens II, CH&sub3;OH
Die erste und die zweite Fraktion werden mit Eluens 1 und die dritte mit Eluens II eluiert. Die zweite eluierte Fraktion wird im folgenden als ODS#3-2 bezeichnet.
Fraktionierung von ODS#3-2 durch HPLC: Abtrennung und Isolierung von Isomonoolen:
ODS#3-2 wird durch HPLC fraktioniert, um die gewünschten Verbindungen zu isolieren.

HPLC-Bedingungen:

Säule: TSK-Gel ODS-120T (Handelsbezeichnung; TOSO K.K.), 21,5 mm I.D. x 300 mm
Mobile Phase: CH&sub3;OH/H&sub2;O = 95/5 (volumenbezogen)
Fließgeschwindigkeit: 5,0 ml/Min.
Säulentemperatur: Raumtemperatur
Die Isomonoole können auch durch andere Methoden abgetrennt und isoliert werden. Zu Beispielen für diese anderen Methoden gehören die von SATOSHI TAKANO, MAKOTO YAMANAKA, KIKUHIKO OKAMOTO und FUMIO SAITO beschriebenen Methoden (Allergens of lanolin: parts I and II, Part I: ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE ALLERGENS OF HYDROGENATED LANOLIN, JOURNAL OF THE SOCIETY OF COSMETIC CHEMISTS, 34, S. 99-116 (1983)).
Die Isomonoole können alleine oder im Gemisch mit einem oder mehreren weiteren Isomonoolen verwendet werden.
Die Isomonoole können in Form eines injizierbaren oder instillierbaren Mittels zur Anwendung kommen. Die Isomonoole können mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie Pluronic F-68 (Handelsbezeichnung eines Poloxamers, ASAHI DENKA K.K.), HCO-60 (Handelsbezeichnung, NIKKO CHEMICALS K.K.) und dergleichen, vermischt und mit Hilfe von Ultraschallwellen dispergiert werden. Die Isomonoole können auch zu einer bestimmten Art von Zusammensetzung, wie z. B. einer Liposomensuspension oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion, verarbeitet werden.
Derartige zusammensetzungen können Konservierungsmittel, wie Methyl-p-hydroxybenzoat, Stabilisatoren, wie Lecithin oder Linolsäure, nicht-wäßrige Träger, wie Kokosnußöl, und Suspendierhilfsmittel, wie Glucose, enthalten.
Zur Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung kann man die Isomonoole zu intestinal resorbierbaren Kapseln formulieren, indem man beispielsweise Bindemittel, wie Gelatine, Stabilisatoren, wie Magnesiumstearat, verdünnende Grundstoffe, wie Lactose, und Disintegriermittel, wie Kartoffelstärke, inkorporiert und indem man die Kapseln mit Acetylphthalylcellulose oder einem Methylacrylat-/Methacrylat-Copolymer zur Bildung einer enterischen Überzugsschicht beschichtet.
Die Isomonoole können auch zu Granulaten, Kapseln mit verzögerter Freisetzung zur Implantation, Suppositorien, zerstäubbaren oder bukkal verabreichbaren Präparaten formuliert werden.
Bei der Verwendung als Karzinostase-verstärkendes Mittel beträgt die Dosis vorzugsweise 0,45 bis 102 mg, insbesondere 1 bis 28 mg, bei einem Präparat zur parenteralen Verabreichung und vorzugsweise 0,005 bis 5,2 g, insbesondere 0,07 bis 1,2 g, bei einem Präparat zur oralen Verabreichung.
Die erfindungsgemäßen Mittel sind nicht nur zur Behandlung von Aszites-Tumoren und Leukämie, sondern auch zur Behandlung von festen Tumoren, wie Adenokarzinomen, Plattenepithelzellen-Karzinomen, undifferenzierten Karzinomen und Sarkomen in verschiedenen Gewebetypen, wirksam. Diese Mittel sind nicht nur bei Tieren, denen Tumore implantiert wurden, sondern auch bei kultivierten malignen Zellen von Mensch, Maus, Ratte, Hamster, etc., wirksam. Somit ist ersichtlich, daß diese Mittel einen direkten, letalen Effekt auf die Tumorzellen, und zwar ohne Spezifizität gegenüber einer bestimmten Tierspezies, besitzen und daher als chemotherapeutische Mittel gegen Krebs beim Menschen, beim Haustier oder bei anderen Tieren verwendet werden können.
Darüber hinaus sind sie nicht nur bei direkter Applikation an der Stelle des implantierten Tumors, sondern auch bei Applikation an einer davon entfernten Stelle, wirksam. Was die Toxizität angeht, so liegt die LD&sub5;&sub0; bei 5,1 bis 17 g/kg bei subkutaner Injektion in Ratten, und es wurden keine Nebenwirkungen bei wiederholter Verabreichung einer Dosis von 1 bis 2 g/kg über einen Zeitraum von 10 Tagen beobachtet.
Das folgende Beispiele zeigt die Verfahren zur Herstellung der Isoomonoole und der aktiven Bestandteile der Karzinostase-verstärkenden Mittel.

Beispiel 1:

Man unterwarf 200 g Wollalkohol, den man durch Verseifung von Wolifett erhalten hatte, einer Molekulardestillation, wodurch man 15,2 g MD1-Alc als Fraktion mit niedrigerem Siedepunkt erhielt (Temperatur: < 80ºC, Druck: 1 x 10&supmin;² Torr).
Die Fraktion MD1-Alc wurde durch Reverse Phase-Säulenchromatographie (offene Säule) in 6 Fraktionen getrennt, wobei man als Eluens das Gemisch CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O 5/15/1 (volumenbezogen) verwendete. Die dritte eluierte Fraktion (ODS#3) erhielt man in einer Menge von 1,68 g.
Die Fraktion ODS#3 unterwarf man einer Normalphasensäulenchromatographie (offene Säule) und trennte diese unter Verwendung der entsprechenden Eluenzien (Eluens 1: CHCl&sub3;/CH&sub3;COCH&sub3; = 96/4 (volumenbezogen), Eluens II: CH&sub3;OH) in 3 Fraktionen.
Die zweite der drei eluierten Fraktionen (ODS#3-2) erhielt man in einer Menge von 0,96 g.
ODS#3-2 wurde zur Isolierung der gewünschten Verbindungen mittels HPLC fraktioniert.
So erhielt man 14-Methyl-1-pentadecanol, 14-Methyl-1-hexadecanol, 16-Methyl-1-heptadecanol, 16-Methyl-1-octadecanol und 18- Methyl-1-nonadecanol.
Eine Kapillar-Gaschromatographie zeigte, daß jedes dieser Isomonoole isoliert worden war.
Zur Bestimmung der chemischen Strukturen kamen ¹³C-NMR und GC-MS zur Anwendungn und man identifizierte die isolierten Verbindungen als die erfindungsgemäßen Isomonoole der allgemeinen Formel (I).
Fig. 2 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum (100,40 MHz, CDCl&sub3;, δ ppm) von 14-Methyl-1-pentadecanol, und Fig. 3 und Fig. 4 zeigen dessen GC-MS-Daten. Fig. 5 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum (100,40 MHz, CDCL&sub3;, δ ppm) von 14-Methyl-1-hexadecanol, und Fig. 6 und Fig. 7 zeigen dessen GC-MS-Daten. Die in Fig. 3 und Fig. 6 dargestellten Daten wurden im EI-Mode mit einer Ionisationsspannung von 70 eV erhalten, wobei die Temperatur der lonenguelle 250ºC betrug. Die in Fig. 4 und Fig. 7 dargestellten Daten wurden im CI-Mode unter Verwendung von Isobutan als reaktives Gas und mit einer Ionisationsspannung von 200 eV erhalten, wobei die Temperatur der Ionenquelle 250ºC betrug.
Die so erhaltenen Isomonoole wurden auf ihre Karzinostase-verstärkende Aktivität untersucht.

Versuche 1 und 2 und Vergleichsversuch 1:

Man bewertete die cytozidale Aktivität (IC&sub9;&sub0;) von Bleomycin alleine und in Kombination mit 14-Methyl-1-pentadecanol oder 14- Methyl-1-hexadecanol unter Verwendung von Ehrlich's Maus-Asziteskarzinomzellen und menschlichen A549- Lungentumorzellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wie die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, bewirkt die gemeinsame Verwendung der erfindungsgemäßen Isomonoole mit einem karzinostatischen Mittel im Vergleich zur alleinigen Verwendung des karzinostatischen Mittels eine deutliche verstärkung des cytozidalen Effektes.

Versuch Nr. 3 und Vergleichsversuch Nr. 2:

Wurde Bleomycin (60 µg/ml) in Kombination mit 14-Methyl-1-pentadecanol (0,05 µM) verwendet, so bestimmte man die Menge des
von Ehrlich's Asziteszellen aufgenommenen Bleomycins als Funktion der Zeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Wie die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, bewirkt die gemeinsame Verwendung der erfindungsgemäßen Isomonoole mit einem karzinostatischen Mittel im Vergleich zur alleinigen Verwendung des karzinostatischen Mittels einen raschen Anstieg der Aufnahme des karzinostatischen Mittels in Ehrlich's Asziteszellen.

Versuch Nr. 4 und Vergleichsversuche Nr. 3 und 4:

5 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen inokulierte man 106 Ehrlich's Maus-Asziteskarzinomzellen. Nach 24 Stunden und dann über einen Zeitraum von 5 Tagen injizierte man je 8 Tieren/Gruppe intraperitoneal jeweils 50 µg/ml einer Lösung von Bleomycin in 0,25 % HCO-60-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung (Dosis: 10 mg/kg/Tag) bzw. eine Suspension, die 50 µg/ml Belomycin und 5 µg/ml 14-Methyl-l-pentadecanol enthielt (Dosis: 11 mg/kg/Tag). Dann verfolgte man die Überlebensdauer der injizierten Mäuse. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 zeigt, daß die durchschnittliche Überlebensdauer nach Inokulation bei der Gruppe, der man die Bleomycinlösung ohne die Karzinostase-verstärkenden Mittel verabreicht hatte (Vergleichsversuch 3) 33,3 Tage betrug. Die durchschnittliche Überlebensdauer nach Inokulation betrug bei der Gruppe, der man die Bleomycinlösung verabreicht hatte, welche eines der erfindungsgemäßen Isomonoole als Karzinostase-verstärkendes Mittel enthielt, 54,3 Tage (Versuch 4).
Somit wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Isomonoole als Karzinostase-verstärkende Agenzien brauchbar sind.
Die Karzinostase-verstärkenden Mittel besitzen hervorragende Effekte und verursachen keine schweren Nebenwirkungen auf den Organismus, da ihre aktiven Isomonoole von Organismen (höherer Lebewesen) stammen. Tabelle 1 Cytozidale Aktivität (IC&sub9;&sub0; (µg/ml) Versuch Karzinostatisches Mittel Karzinostaseverstärkendes Mittel (0,05 µM) Ehrlich's Maus-Aszites-karzinomzellen menschliche A549-Lungen-karzinomzellen Bleomycin *1: 14-Methyl-1-pentadecanol *2: 14-Methyl-1-hexadecanol Tabelle 2 Bleomycin-Aufnahme im Lauf der Zeit (µg/mg Ehrlich's Zellen0 Versuch karzinostatisches Mittel Karzinostaseverstärkendes Mittel zu Beginn Bleomycin *1: 14-Methyl-1-pentadecanol Tabelle 3 Anzahl überlebender Mäuse im Zeitverlauf (Tag) Versuch Karzinostatisches Mittel Karzinostaseverstärkendes Mittel Bleomycin *1: 14-Methyl-1-pentadecanol

Claims

1. Verwendung von 14-Methyl-1-pentadecanol, 14-Methyl-1- hexadecanol, 16-Methyl-1-heptadecanol, 16-Methyl-1- octadecanol oder 18-Methyl-1-nonadecanol zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Verstärkung der karzinostatischen Aktivität eines bekannten karzinostatischen Mittels.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das karzinostatische Mittel Bleomycin ist.