DE69115438T2

DE69115438T2 - Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Info

Publication number: DE69115438T2
Application number: DE69115438T
Authority: DE
Inventors: Richard W Armentrout; Kaname Inoue; Motohide Yamazaki
Original assignee: Shin Etsu Bio Inc
Current assignee: Shin Etsu Bio Inc
Priority date: 1990-10-23
Filing date: 1991-10-23
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2011-10-24
Also published as: EP0482909A3; CA2053736C; US5156961A; JP2628119B2; EP0482909B1; CA2053736A1; EP0482909A2; DE69115438D1; JPH07135989A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika durch Züchten von Mikroorganismen in einer Kulturbrühe. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung bzw. Darstellung des gebildeten Antibiotikums aus der Gärbrühe.

II. Beschreibung des Standes der Technik

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika aus Mikroorganismen, bei welchen ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium bzw. einer Kulturbrühe wachsengelassen und das durch den Mikroorganismus produzierte Antibiotikum aus der Brühe extrahiert wird, sind bekannt. In typischer Weise wird das Antibiotikum aus der Gärbrühe mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, wie Ethylacetat, Chloroform, Methylenchlorid und dgl., extrahiert. Diese organischen Lösungsmittel extrahieren jedoch auch andere in der Brühe enthaltene und in dem Lösungsmittel lösliche Materialien und Komponenten, so daß in das extrahierte Antibiotikum Verunreinigungen eingeschleppt werden. Es ist somit erforderlich, diese Verunreinigungen vor der endgültigen Gewinnung und/oder Reinigung des Antibiotikums zu entfernen. Die bislang durchgeführten Reinigungsmaßnahmen sind kompliziert und kostspielig und führen zu einer Kostensteigerung bei dem Produktionsverfahren zur Herstellung des Antibiotikums.
Ein typisches Reinigungsverfahren ist aus der US-PS 3 116 202 bekannt. Im Rahmen dieses Verfahrens erfolgt die Reinigung des Antibiotikums Streptovaricin durch wiederholtes Umkristallisieren.
Ein Verfahren zur Steigerung des Produktionsgrades von Streptovaricin C ist aus den japanischen Patentanmeldungen 14 285/1990 und 14 286/1990 bekannt. Hierbei wird zur Verbesserung der Produktivität von Streptovaricin C ein polymeres Adsorptionsmittel in Perlenform zugesetzt (vgl. auch H. Wang, "Annals New York Academy of Sciences", 431, 1983, 5. 313-321). Bei diesen Verfahren bleibt das aus dem Schimmel gebildete Antibiotikum im wesentlichen sofort an den polymeren Perlen haften. Zu diesem Zweck steht der Schimmel mit den in der Brühe befindlichen Perlen in enger (engem) physikalischen Beziehung und Kontakt. Die Polymerperlen werden im allgemeinen von der Gärbrühe physikalisch abgetrennt. An den Perlen haftendes Antibiotikum muß aus diesen rückgewonnen werden. Mit den während des Trennverfahrens wiedergewonnen Perlen werden jedoch in der Brühe enthaltene Komponenten einschließlich des Schimmels aus der Brühe mitgeschleppt, so daß das erhaltene Gemisch verunreinigt ist. Dies führt darüber hinaus zu einem Verlust an Schimmel und zu Schwierigkeiten bei der Wiederaufbereitung der Perlen zur Wiederverwendung.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben nun ein Verfahren zur erleichterten Gewinnung von Antibiotika aus Fermentations- bzw. Gärbrühen unter Vermeidung der bislang erforderlichen kostspieligen Rückgewinnungsmaßnahmen aufgefunden. Insbesondere haben wir ein Verfahren zur Abtrennung und Rückgewinnung von Polymerperlen aus einer Antibiotikum-Gär- bzw. -Fermentationsbrühe aufgefunden, bei dem das Haftenbleiben von Schimmel und Verunreinigungen an den Perlen während des Trennverfahrens vermindert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird derart durchgeführt, daß ein Gemisch der Perlen und von irgendwelchem (irgendwelchen) daran haftenden Schimmel und Verunreinigungen in einer wäßrigen Lösung eines spezifischen Gewichts, das die Perlen an oder auf der Oberfläche der Lösung getrennt und fern vom Schimmel eine diskrete Schicht bilden läßt, suspendiert wird. Üblicherweise erfolgt diese Maßnahme jedoch nach beendeter Fermentation. Dies läßt sich durch Einstellen des spezifischen Gewichts der Gärbrühe selbst auf den wirksamen Bereich des spezifischen Gewichts oder durch (zunächst) Abtrennen des Perlengemischs aus der Brühe und (anschließende) Zugabe einer wäßrigen Lösung eines spezifischen Gewichts innerhalb des wirksamen Bereichs zu dem abgetrennten Gemisch bewerkstelligen.
Die Perlen mit dem daran haftenden Antibiotikum bilden an der Oberfläche der Flüssigkeit fern vom Schimmel und sonstigen Verunreinigungen eine Schicht. Danach lassen sich die Perlen ohne Schwierigkeit von der Flüssigkeit nach physikalischen Methoden, beispielsweise durch Filtrieren, Abschöpfen, Waschen und dgl. unter Zurücklassung des Schimmels abtrennen. Die Perlen können dann zur Gewinnung des Antibiotikums oftmals bei nur minimaler Anzahl von Umkristallisierungsstufen mit geeigneten Lösungsmitteln gewaschen werden.
Bei Durchführung dieses Verfahrens lassen sich nicht nur das perlenförmige polymere Adsorptionsmittel wieder verwenden, sondern auch die im extrahierten Antibiotikum enthaltenen Verunreinigungen, die aus dem Schimmel während des Lösungsmittelextraktionsverfahrens eingeschleppt worden sein können, in erheblichem Maße vermindern.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Um die erfindungsgemäßen vorteilhaften Ergebnisse gewährleisten zu können, ist es von wesentlicher Bedeutung, daß das spezifische Gewicht innerhalb eines Bereichs liegt, der eine wirksame Trennung der Perlen ermöglicht. Ist das spezifische Gewicht zu niedrig, trennen sich die Perlen weder an der Oberfläche der Lösung noch vom Schimmel. Ist das spezifische Gewicht zu hoch, bilden die Perlen keine Schicht getrennt vom Schimmel oder an der Oberfläche der Flüssigkeit. Darüber hinaus kommt es in dem Maße, wie das Gemisch aus Perlen und Schimmel in derselben Schicht flotiert, nicht zu einer Trennung der Schicht an der Oberfläche der Flüssigkeit, wobei das perlenförmige Polymer nicht wiedergewonnen werden kann.
Der Bereich für das spezifische Gewicht, der sich zur Herbeiführung des gewünschten Ergebnisses eignet, variiert entsprechend der speziellen Art der Brühe, des Schimmels und der Perlen. Im allgemeinen haben wir gefunden, daß ein Bereich für das spezifische Gewicht von etwa 1,05 bis etwa 1,20 zu bevorzugen ist.
Das spezifische Gewicht der Brühe läßt sich durch Zusatz eines geeigneten wasserlöslichen Materials, z.B. eines anorganischen Salzes oder einer organischen Verbindung, die das spezifische Gewicht der Lösung zu ändern vermag, auf den gewünschten Wert einstellen. Typische derartige Salze und Verbindungen sind NaCl, KCl, Na&sub2;SO&sub4;, MgSO&sub4;, Glycerin, Glucose, Saccharose und Kombinationen derselben. NaCl ist das am meisten bevorzugte Material, da es am wirtschaftlichsten ist.
Die Perlen des absorbierenden Polymers (Harzes) mit dem daran adsorbierten Antibiotikum lassen sich durch physikalische Abtrennung der oberen Schicht, beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren und dgl., gewinnen. Die abgetrennten Perlen können dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und anschließend zur Extraktion des Antibiotikums einer Extraktionsstufe zugeführt werden. Selbstverständlich erfolgt jegliche Trocknung bei einer Temperatur, bei der weder die Perlen noch das Antibiotikum beeinträchtigt werden, beispielsweise bei einer Temperatur unterhalb von 40ºC.
Die hierbei erhaltenen Rohantibiotika können dann direkt ohne Umkristallisieren oder erneute Fällung einer üblichen Säulenchromatographiereinigung unterworfen werden.
Die extrahierten Polymerperlen können durch Entfernen des organischen Lösungsmittels, beispielsweise durch Verdampfen und anschließendes Auskochen mit Wasser wiederverwendet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

In einem 500 ml fassenden Kolben wurde ein steriles Me dium (Saatmedium) der folgenden Zusammensetzung:
Saatmedium:
hydrolisiertes Casein (N-Z-Amin-A) 1,25 g
Glucose 0,63
enzymzersetzter Sojabohnenextrakt (Soytone) 0,63
K&sub2;HPO&sub4; 0,16
KH&sub2;PO&sub4; 0,16
destilliertes Wasser 100,00
zubereitet, mit Streptomyces spectabilis ATCC27465 beimpft und zur Herstellung einer Saatkultur 72 h lang bei 27ºC auf einem mit 200/min rotierenden Rüttler inkubiert.
In einem 500 ml fassenden Kolben wurde durch Beimpfen eines sterilen Mediums (Vorproduktionsmedium) der folgenden Zusammensetzung:
Vorproduktionsmedium:
Maisdextrin 2,0 g
entfettetes Sojabohnenmehl (Kaysoja) 1,0
Maiseinweichflüssigkeit 1,0
Bierhefe 0,25
KCl 0,3
CaCO&sub3; 0,4
destilliertes Wasser 100,00
mit 2 ml der zuvor hergestellten Saatkultur und 48-stündiges Inkubieren bei 27ºC auf einem mit 200/min rotierenden Rüttler eine Vorproduktionskultur hergestellt.
In einem 500 ml fassenden Kolben wurde ein Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung:
Produktionsmedium:
Glucose 4,0 g
Sojabohnenmehl 4,0
Bierhefe 0,25
NaCl 0,3
CaCO&sub3; 0,05
MgSO&sub4; 0,25
K&sub2;HPO&sub4; 0,25
DIAION HP-20 (Polystyrolperlen, 50%-iger Feststoffgehalt) 3,0
destilliertes Wasser 100,0
mit 5 ml der zuvor hergestellten Vorproduktionskultur beimpft und 6 Tage lang bei 28ºC auf einem mit 200/min rotierenden Rüttler inkubiert.
Nach 6 Tagen wurde das Gemisch aus HP-20 (Harz) und Schimmel aus der Brühe abfiltriert. Das Gemisch (Feuchtgewicht: 10 g) wurde dann in einer 20%igen NaCl-Lösung (spezifisches Gewicht bei 20ºC: 1,14) dispergiert und stehengelassen.
Das Harz trennte sich vom Schimmel auf der Oberfläche der NaCl-Lösung und wurde unter Zurücklassung des Schimmels am Boden der Lösung gewonnen. Nach dem Waschen des Harzes mit frischem Wasser und Trocknen desselben unter Vakuum bei 35ºC wurde es mit 20 ml Ethylacetat extrahiert.
Hierbei wurden 5 mg rohes Streptovaricin mit 0,4 mg Streptovaricin C erhalten. Das extrahierte Harz konnte nach Entfernen des Ethylacetats unter Vakuum und anschließendem Auskochen (des Harzes) in Wasser als polymeres Adsorptionsmittel wiederverwendet werden.

Beispiel 2

Es wurden 5 NaCl-Lösungen mit spezifischen Gewichten von 1,04, 1,07, 1,15, 1,20 bzw. 1,22 zubereitet. Proben des Gemischs aus Harz und Schimmel aus Beispiel 1 wurden in jeder der Lösungen dispergiert. Klare Trennungen waren bei spezifischen Gewichten von 1,07, 1,15 bzw. 1,20, jedoch nicht bei 1,04 bzw. 1,22 feststellbar.

Beispiel 3

3 l eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
Steriles Medium:
Glucose 40,0 g/l
Sojabohnenmehl 40,0
Bierhefe 2,5
NaCl 3,0
CaCO&sub3; 0,5
MgSO&sub4; 2,5
KH&sub2;PO&sub4; 2,5
Mononatriumfumarat 20,0
Entschäumer (KM 75) 2,0
DIAION HP-20 (50%iger Feststoffgehalt) 100,0
das in einem 5 l fassenden Weithalsgärbottich zubereitet worden war, wurden mit 160 ml der in Beispiel 1 hergestellten Vorproduktionskultur beimpft. Das Medium wurde dann 9 Tage lang bei 27ºC, 300/min und einer Belüftung von 1 v/v/m fermentiert.
Nach beendeter Fermentation wurden etwa 200 g eines Feuchtgemischs aus Harz und Schimmel abfiltriert. Das Gemisch wurde in einer 15%igen KCl-Lösung eines spezifischen Gewichts bei 20ºC von 1,10 dispergiert und 3 h lang stehengelassen. Danach konnte das Harz von der Oberfläche der Lösung gewonnen werden.
Durch Extraktion wurde 0,5 g rohes Streptovaricin mit 150 mg Streptovaricin C erhalten. Das Harz ließ sich nach dem Verdampfen des Lösungsmittels und Auskochen mit Wasser wiederverwenden.

Beispiel 4

Die Fermentation erfolgte entsprechend Beispiel 3. Danach wurde der Inhalt des Weithalsgärbottichs in einen größeren Behälter gegossen und auf 10 l verdünnt. In den Behälter wurde soviel NaCl eingetragen, daß das spezifische Gewicht der verdünnten Brühe 1,14 betrug. Nach 3-stündigem Stehenlassen der Lösung konnte das Harz von der Lösungsoberfläche gewonnen werden.
ATCC27465 wurde bei der American Type Culture Collection zum Zwecke dieser Anmeldung hinterlegt (Artikel 83, Rule 28).

Claims

1. Verfahren zur Rückgewinnung eines adsorbierenden Polymers in Perlenform mit einem daran haftenden Antibiotikum aus einem Gemisch von Perlen und einem Gärschimmel, dadurch gekennzeichnet, daß die Perlen in einer wäßrigen Lösung eines (solchen) spezifischen Gewichts, das eine schichtartige Trennung der Perlen entfernt vom Schimmel an der Oberfläche der Lösung ermöglicht, behandelt und die Perlen aus der Lösung entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Einstellung des spezifischen Gewichts auf einen wirksamen Wert eine das spezifische Gewicht einstellende, wasserlösliche Verbindung zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die wasserlösliche Verbindung aus NaCl, KCl, Na&sub2;SO&sub4;, MgSO&sub4;, Glycerin, Glucose oder Saccharose oder einer Kombination derselben besteht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Antibiotikum Streptovaricin und der Schimmel Streptomyces spectabilis sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das spezifische Gewicht im Bereich von etwa 1,05 bis 1,20 liegt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die entfernten Polymerperlen zur Extraktion des Antibiotikums von bzw. aus diesen mit einem organischen Lösungsmittel behandelt werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Perlen in einer Gärbrühe vorliegen und zunächst aus der Brühe abgetrennt werden und wobei die abgetrennten Perlen zu der Behandlungslösung zugesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das spezifische Gewicht der Brühe als solches eingestellt wird und die Perlen aus der derart behandelten Brühe entfernt werden.

9. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums durch (i) Züchten eines Mikroorganismus in einer Brühe zur Produktion eines Schimmels und zur Erzeugung eines Antibiotikums in Gegenwart von absorbierenden Polymerperlen und (ii) Rückgewinnen der Perlen mit dem daran haftenden Antibiotikum aus der Brühe, dadurch gekennzeichnet, daß die Perlen unter Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche rückgewonnen werden.