DE69113520T2

DE69113520T2 - Monoklonale Antikörper gegen HIV GP120.

Info

Publication number: DE69113520T2
Application number: DE69113520T
Authority: DE
Inventors: Jade Chin; Mary S Gibadlo; W Gerard Robey
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: ES2080193T3; CA2044741A1; AU7847591A; GR3018082T3; EP0462551B1; ATE128733T1; AU651113B2; JPH04299993A; DK0462551T3; DE69113520D1; EP0462551A1; KR920000333A

Description

Gebiet der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, die Aktivität von humanen Immunschwäche- Viren wesentlich zu neutralisieren, und sie betrifft Hybridome, die solche Antikörper produzieren.

Zugrundeliegende Technik.

Der humane Immunschwäche-Virus (HIV) ist der Erreger des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) und verwandter Erkrankungen wie dem AIDS-verwandten Komplex (ARC, AIDS related complex). HIV erkennt einen Rezeptor, CD4, der für die Helfer/Inducer-Untergruppe der T-Lymphozyten spezifisch ist (Dalgleish et al., Nature (1984) 312:763-67). Diese Untergruppe der Lymphozyten ist bei AIDS-Erkrankten vermindert. Die HIV- induzierte Immunsuppression schädigt die Fähigkeit des AIDS- Erkrankten, opportunistische Infektionen wie eine Lungenentzündung mit Pneumocystic carinii und ungewöhnliche Neoplasmen wie das Karposi-Sarkom zu bekämpfen.
Die Bindung des HIV an dessen zellulären Rezeptor, CD4, wird durch Proteine vermittelt, die durch das virale Hüll(env)- Gen codiert sind. Das virale HiV-Hüllprotein wird als Vorstufenprotein gp160 exprimiert, das proteolytisch unter Bildung eines externen Hüllglycoproteins, gp120, und eines transmembranen Hüllglycoproteins, gp41, gespalten wird. gp120 ist stark glycosyliert. Ratner et al. (Nature (1985) 313:277-84) identifizierten mehr als 20 Asparaginreste, die als potentielle N-Glycosylierungsstellen dienen können. Oligomannosidische und fucosylierte, teilweise sialylierte bi- und tri-antennäre komplexe Kohlenhydrate bilden etwa die Hälfte der Masse von gp120 (Geyer et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:11760-67). Gegenwärtig weil man nur wenig über die genaue Funktion der Kohlenhydrate von gp120 bei der Bindung des gp120-Moleküls an den CD4-Rezeptor. Es ist jedoch bewiesen, daß die CD4-Bindung Glycosylierung erfordert, wie dies in Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:5424-28 beschrieben ist.
Eine andere Funktion des gp120-Moleküls bezieht sich auf dessen Fähigkeit zur Induzierung neutralisierender Antikörper. Zum Beispiel berichteten Robey et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:7023-27), daß gereinigtes gp120 bei Versuchstieren polyklonale neutralisierende Antikörper induzierte. Desweiteren wurden von Mäusen abgeleitete monoklonale neutralisierende Antikörper gegen das gp120-Protein mit Erfolg hergestellt (Skinner et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1988) 4:187-97; Matsushita et al., J. Virol. (1988) 62:2107-14). Für diese Antikörper konnte gezeigt werden daß sie die Infektiösität von T-Zellen in vitro blockieren. Bei der Untersuchung, ob sich diese monoklonalen Antikörper an nichtglycosylierte rekombinante Proteine und synthetische Peptide von gp120 anlagerten, wurde ein primäres Epitop, das mit diesen neutralisierenden Antikörpern assoziiert ist, in der Aminosäuresequenz 301-341 des gp120-Proteins lokalisiert. Eine durch die Cysteinreste 303 und 338 von gp120 ausgebildete Disulfidschleife scheint für die Aufrechterhaltung der konformationellen Integrität dieses Epitops (Javaherian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6768-72) wesentlich zu sein. Bekannte gp120-neutralisierende monoklonale Antikörper binden an nichtglycosylierte rekombinante gp120-Proteine. Deshalb scheinen solche monoklonalen Antikörper die Polypeptidkette des HIV-gp120-Proteins zu erkennen.
Hansen et al., Journal of Virology, (Juni 1990) 64, Nr. 6, S, 2833-2840, offenbaren die Inhibition der in vitro HIV- Infektiösität durch monoklonale anti-Kohlenhydrat-Antikörper. Die beteiligten Virusstämme waren HTLV-IIIB und das Isolat eines Erkrankten. Die verwendeten monoklonalen Antikörper (monoclonal antibodies, "MAbs") waren bekannte Antikörper mit gut definierter Anti-Kohlenhydrat-Spezifität für Kohlenhydratstrukturen, die sich in der Umgebung sowohl N- gebundener als auch )-gebundener, oder nur O-gebundener Ketten aus Glycoproteinen und auch Glycosphingolipiden befinden. Die verwendeten Mabs waren nicht von HIV-1 abgeleitet. Ähnlich offenbart WO-A-9111528, die nach Artikel 54(3) und (4) EPÜ Stand der Technik ist, die Inhibition der in vitro HIV-Infektiösität (Virusstämme HTLV-IIIB und Isolat eines Erkrankten) durch monoklonale anti-Kohlenhydrat-Antikörper, die Kohlenhydratstrukturen definieren, die in der Umgebung von O- gebundenen Glycoproteinketten gefunden wurden. Wiederum waren die verwendeten MAbs nicht von HIV-1 abgeleitet. Von den mit dem HIV-Hüllprotein gp120 assoziierten Kohlenhydratepitopen, die identifiziert wurden, hieß es, daß sie normalerweise nicht im menschlichen Organismus exprimiert werden.
Skinner et al., Journal of Virology, (Nov. 1988) 62, Nr. 11, s. 4195-4200 offenbaren monoklonale Antikörper, die eine neutralisierende Aktivität gegenüber HTLV-IIIB aufweisen, die jedoch nicht die Bindung von gp120 an Zellen verhindern, die das CD4-Oberflächenantigen exprimieren. Das Zielepitop ist die Polypeptidkette zwischen den gp120-Resten 307 und 330.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung liefert monoklonale Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie für ein Epitop auf einem HIV-Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 120000 Daiton (gp120) spezifisch sind. Diese Antikörper erkennen einen Kohlenhydratabschnitt von gp120, der etwa im Bereich zwischen Aminosäure 301 und Aminosäure 358 angesiedelt ist. Die Erfindung liefert desweiteren Hybridome, die diese monoklonalen Antikörper produzieren.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung liefert monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, den HIV-Virus im wesentlichen zu neutralisieren, und Hybridome, die solche monoklonalen Antikörper produzieren. Die monoklonalen Antikörper neutralisieren diverse Stämme sowohl von Labor- als auch klinischen HIV-Stämmen. Der Ausdruck "neutralisieren", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die inhibition der HIV- Infektiösität in H9-Zellen in vitro.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, sich sowohl an das externe Hüllglycoprotein gp120 als auch an sein Vorstufenprotein gp160 spezifisch anzulagern. Die monoklonalen Antikörper sind durch ihre Fähigkeit, ein Epitop im Neutralisierungsbereich des gp120-Proteins zu erkennen, gekennzeichnet. Die monoklonalen Antikörper sind desweiteren durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, den Kohlenhydratabschnitt des größeren gp120- Neutralisierungsbereiches zu erkennen, der etwa im Bereich zwischen Aminosäure 301 und Aminosäure 358 angesiedelt ist.
Zwei besonders bevorzugte monoklonale Antikörper der Erfindung sind die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52- 684-238. Die Hybridome, die die monoklonalen Antikörper 52-581- 290 und 52-684-238 produzieren, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 29. März 1990 unter den Hinterlegungsnummern HB10399 bzw. H810400 hinterlegt worden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können bei der Diagnose, der Vorbeugung und der Behandlung von AIDS eingesetzt werden. Die Antikörper können für eine bessere Charakterisierung des gp120-Antigens eingesetzt werden, für das gezeigt wurde, daß es den CD4-Rezeptor anfälliger T4-Zellen als Initialereignis im Infektionsprozeß bindet. Es ist weiterhin möglich, die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung für die Inhibition des Wachstums des Virus in humanen Wirten oder für die Inhibition einer weiteren Infektion durch Verhinderung der Infektion nichtbefallener T4-Zellen zu verwenden, infolge ihrer Fähigkeit, die HIV-Infektiösität in vltro zu inhibieren.
Die folgenden Verfahren und Beispiele beschreiben die Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung genauer.

Verfahren.

Reinigung von nativem gp120.

Das HIV-gp120-Antigen wurde entsprechend dem Verfahren von Robey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:7023-27 gereinigt. Kurz gesagt wurden H9-Zellen, die mit HTLV-IIIB infiziert waren (HTLV-III-Prototypenstamm bezogen von R. Gallo, National Institutes of Health), in phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, "PBS") mit 0,5 % Triton X-100 und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert. Die Zellen wurden in einem Verhältnis von etwa 6 ml bis etwa 10 ml Puffer auf 1 g Zellhaufen resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden bei 500 x g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde über Nacht bei -20ºC gefroren, aufgetaut und wieder gefroren. Der zweimal aufgetaute Überstand wurde bei 9000 U/min (JA10 Rotor) 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem Hochgeschwindigkeitsrotor mit kontinuierlichem Fluß (CF32) bei 30000 U/min und einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 2 l/Stunde bis etwa 3 l/Stunde zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde auf 1,0 M KCl und 0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 8,5, eingestellt. Der Überstand wurde mit einem monklonalen gp41-Antikörperharz gemischt, und der durch die Säule geströmte Teil (d.h der Teil, der sich nicht am gp41-Antikörper anlagerte) wurde einem polyklonalen AIDS-Antikörperharz zugesetzt, das derart ausgewählt war, daß es in erster Linie Antikörper gegen env- Genprodukte enthielt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, während es auf einer Walzenmühle umgewälzt wurde. Das Gemisch wurde danach auf eine Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 4 M MgCl&sub2; eluiert. Das eluierte gp120 wurde gegen Wasser dialysiert, wobei es bei etwa 4ºC aufbewahrt wurde und das Wasser 2 mal täglich gewechselt wurde, bis sich ein Niederschlag bildete (nach etwa 2 Tagen). Das dialysierte gp120 wurde durch Zentrifugieren 30 Minuten lang bei 12000 U/min geklärt. Der Überstand wurde mit flüssigem Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Diese Schritte wurden wiederholt, sofern beim Wiederauflösen des gefriergetrockneten gp120 in Wasser Irgendwelche Trübstoffe verblieben. Das gefriergetrocknete gp120 wurde in Wasser wieder aufgelöst und das Gemisch wurde geklärt, sofern es trüb war.

Enzymimmunoassav (EIA)

Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul je Vertiefung einer gp 120-Antigenlösung von 1 ug/ml in PBS, pH 7,4, beschichtet. Alle verbleibenden Bindungsstellen in den Polystyrolvertiefungen wurden mit 3 % Rinderserumalbimun (BSA; Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL) in PBS etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden dreimal mit Wasser gewaschen. Verdünnungen von Mäuseseren, hergestellt in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM; Gibco, Grand Island, NY) mit 10 % Fetalrinderserum (FBS; Hyclone, Logan, UT) oder Überstände von Gewebekulturen monoklonaler Antikörper wurden etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur in den Vertiefungen inkubiert, und die Vertiefungen wurden dreimal mit Wasser gewaschen. Die Bindung der monoklonalen Antikörper wurde mit Ziegen-Anti-Mäuse- IgG+M-Meerretich-Peroxidase (horseradish peroxidase, "HRPO") (Kirkegaard-Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD), verdünnt auf eine Konzentration von 1:1000 in PBS, nachgewiesen. O-Phenylendiaminsubstrat (OPD; Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) wurde als Chromogen verwendet, und die Platten wurden bei 490 Nanometer (nm) abgelesen.

Western-Blot.

HIV-1-Proteine wurden einer Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid (SDS-PAGE) unterworfen und anschließend auf Nitrocellulose überführt, entsprechend den Vorschriften des Herstellers (Schleicher & Schuell, Keene, NH; Hoefer Scientific Instruments Co., San Fransisco, CA; Bio-Rad, Richmond, CA) . Die Nitrocellulosestreifen wurden mit 1 % Rinderhämoglobin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 0,05 % Tween 20 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in PBS 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Streifen mit Gewebekulturüberstand oder Verdünnungen der gereinigten Antikörper in der Blockierlösung inkubiert. Die Streifen wurden nach der Inkubation mit PBS gewaschen. Die Sichtbarmachung des Antigen: erfolgte mit Ziegen-Anti-Mäuse-IgG+M-HRP0 und 4-Chlor- 1-naphthol als chromogenem Substrat.

Radioimmunfällung.

Die Radioimmunopräzipitations (RIPA)-Methode wurde nach einer bewährten Vorschrift durchgeführt (Sun et al., J. Virol. (1989) 63:3579-85). Kurz gesagt, es wurden H9-Zellen (infiziert mit den HIV-Isolaten IIIB, RF, MN, AL, Z34, Z84 und AC) über Stoffwechselvorgänge 4 Stunden lang mit [³&sup5;S]Cystein und [³&sup5;S]Methionin (100 uCi/ml; ICN Pharmaceuticals Inc., Irvine, CA) markiert und in einem RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 mM PMSF) suspendiert. Die Lysate wurden 3 Stunden bei Raumtemperatur vorgeklärt mit Protein-A-Sepharose (Sigma), gebunden an Kaninchen-Antiserum gegen Mäuse-Kappa-Leichtkette (Cappel Laboratories, West Chester, PA) (k-PAS). Das RIPA wurde durch Zugabe von 3 ug gereinigtem monoklonalem Mäuse-Antikörper und 0,2 ml einer 10 %- Suspension von k-PAS zu 200 ul markiertem und geklärtem Lysat durchgeführt. Die Proben wurden bei 4ºC 18 Stunden inkubiert und die Kügelchen wurden mit dem RIPA-Lysepuffer gewaschen Die Pellets wurden in Elektrophoreseprobenpuffer suspendiert und drei Minuten gekocht. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von der Autoradiografie analysiert.

Peptidsynthese.

Peptidsequenzen des HIV-1-gp120-Hüll-Proteins wurden entsprechend der allgemeinen Vorgehensweise synthetisiert, die von Barany und Merrifield beschrieben wurde (Gross & Meinehofer, eds., The Peptides, vol. 2 [Academic Press, New York, 1980]). Die synthetisierten Sequenzen waren die Aminosäuren 37-59, 68- 85, 272-323, 329-384, 462-518 sowie 491-518, numeriert nach Ratner et al. (Nature (1985) 313:277-84).
Das der Sequenz 272-323 des HIV-1-gp120-proteins entsprechende Peptid wurde auf einem Harzträger durch schrittweise Festphasensynthese aufgebaut, beginnend mit dem Carboxy-terminalen Rest. Ein BOC-L-Ala-OCH&sub2;-Pam-Harz wurde in den Reaktionsbehälter eines Synthesizers von Applied Biosystems, Modell 430A, eingebracht. Geschützte Aminosäuren wurden schrittweise zweiseitig an den Harzträger mittels der Chemie vorgebiideter symmetrischer Anhydride gekuppelt, außer bei der Addition von Arginin, Asparagin und Glutamin, für die die DCC/HOBT-Vorschrift angewendet wurde, die von Konig und Geiger (Chem. Ber. (1970) 103:788-798) beschrieben ist. Alle α-Amino- terminalen Reste wurden durch t-Butyloxycarbonyl(t-BOC)- Bindungen geschützt und die Seitenketten verschiedener Aminosäurereste wurden durch die folgenden Gruppen geschützt: Glu, OBzl; Arg, Tos; Ser, Bzl; Thr, Bzl; Asp, OBzl; Lys, 2-Cl-Z und Cys, 4MeBzl.
Dreihundert Milligramm (300 mg) des geschützten Peptid- Harzes wurden in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) 5 Minuten quellen gelassen. Die Nα-BOC-Schutzgruppen wurden mit Hilfe von 60 % Trifluoressigsäure (TFA/CH&sub2;Cl&sub2;), sowie CH&sub2;Cl&sub2;-Spülungen, 10 % N,N- Diisopropylethylamin (DIEA/CH&sub2;Cl&sub2;)-Neutralisation und zuletzt CH&sub2;Cl&sub2;-Spülungen entfernt. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das so gewonnene Peptid-Harz wurde 60 Minuten bei 0ºC mit 9 ml wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF) behandelt, der 0,5 ml p-Kresol und 0,5 g p-Thiokresol zugesetzt waren (HF- "Cocktail") . Die HF wurde unter Vakuum bei 0ºC abdestilliert. Das abgespaltene, freie Peptid und das Harz wurden dreimal mit aliquoten Anteilen von 15 ml Diethylether gewaschen. Das Peptid wurde anschließend dreimal mit aliquoten Anteilen zu 10 ml von wäßriger 40% Essigsäure extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden gefriergetrocknet und lieferten das Rohpeptid für die Reinigung.
Das Rohpeptid wurde durch Reversed-Phase-Hochleistungs- Flüssigchromatografie (HPLC) an C&sub4;-Säulen gereinigt, unter Verwendung von Gradienten aus 0,1 % TFA/Wasser (A) und 100 % Acetonitril (B) als den Lösungsmittelsystemen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min für die analytische Säule (Vydac-214-TP54, Vydac Separation Group, Hesperia, Californien) und 12 ml/min für die halbpräparative Säule (Vydac-214-TP1022). Der Gradient setzte mit 17 % B ein. Nach drei Minuten wurde der Gradient linear über einen Zeitraum von 20 Minuten auf 60 % B angehoben, anschließend in 2 Minuten zurück auf 17 % B gebracht.
Die Anwesenheit des Peptids wurde bei 225 nm und 280 nm überwacht. Die Zusammensetzung des Peptids wurde durch Hydrolyse in 6 N Salzsäure/0,3 % Phenol bei 150ºC 2 Stunden lang unter Vakuum bestätigt und anschließend auf einem Beckmann 6300 Aminosäureanalysator analysiert.
Ähnlich wurden die anderen gp120-Peptide wie oben beschrieben aufgebaut. Weitere Aminosäureseitenketten wurden mit den Gruppen Tyr, 2-Br-Z; und His, Tos geschützt. Die Aminosäuren Tryptophan und Methionin wurden ohne irgendwelche Seitenketten- Schutzgruppen verwendet. Nach dem Einbau von Tryptophan wurde Indol in einer Konzentration von 1 % (Gewicht/Volumen) zu Trifluoressigsäure für die Entfernung aller Nα-Schutzgruppen (BOC) zugesetzt. Nach dem Einbau von Methionin wurde Ethandithiol ebenfalls zu Trifluoressigsäure in einer Konzentration von 0,25 % (V/V) zugesetzt. Das HF-Cocktail für die Peptide 37-59 und 491-518 bestand aus 9 ml HF und 1 ml p- Kresol Das HF-Cocktail für die Peptide 61-78 bestand aus 9 ml HF, 0,5 ml p-Kresol und 0,5 g p-Thiokresol. Das HF-Cocktail für die Peptide 322-377 und 462-518 bestand aus 10 ml HF, 1 ml p- Kresol und 1 ml Dimethylsulfid. Das HF-Cocktail für die Peptide 322-377 enthielt desweiteren 0,2 g p-Thiokresol.

Beispiel 1

Immunisierung von Tieren und Fusion.

BALB/c-Mäuse wurden subkutan und intraperitoneal mit 50 ug des zuvor beschriebenen viralen gp120 in RIBI's Adjuvans (RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT) während der Wochen 1, 4, 5 und 7 immunisiert. Ansprechende Tiere, beurteilt durch das oben beschriebene Enzym-Immunoassay(EIA)-Verfahren, erhielten eine intravenöse Stoßinjektion mit 10 ug des gp120-Antigens in PBS drei Tage vor der Fusion. Die Mäuse wurden getötet und die Milzzellen wurden isoliert.
Die Fusion wurde entsprechend bekannten herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von SP2/O-Zellen als Myelompartner durchgeführt (G. Kohler und C. Milstein, Nature (1975) 256:495- 497; J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice [New York: Academic Press, 1983]). Die Hybride wurden durch Ergänzung des Nährmediums mit Hypozanthin, Aminopterin und Thymidin selektiert. Die Hybride wurden sieben bis zehn Tage nach der Fusion durch EIA gegen das immunisierende Antigen gescreent und durch Western-Blot bestätigt, wie weiter unten beschrieben. Die Hybride wurden durch einschränkende Verdünnung geklont und es wurde von den interessierenden Klonen Ascitesflüssigkeit in BALB/c-Mäusen nach Standardverfahren erzeugt. (Siehe allgemein (Goding, weiter oben). Die Antikörper wurden aus der Ascites-Flüssigkeit durch Protein-A-Sepharose- Säulenchromatografie gereinigt erhalten, wie dies in Ey et al., Immunochem (1978) 15:429-36 beschrieben ist.
Die geklonten Hybride aus den Fusionsexperimenten wurden auf ihre Reaktivität gegenüber gp120 durch das zuvor beschriebene EIA-Verfahren gescreent, und solche Hybride, die positiv reagierten, wurden vermehrt. Zwei monoklonale Antikörper aus der gleichen Fusion, die mit 52-581-290 und 52-684-238 bezeichnet wurden, lieferten stark positive Reaktionen.

Beispiel 2

Epitop-Identifizierung.

Bei weiterer Untersuchung reagierten die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 spezifisch mit gp120 des immunisierenden Stamms (HTLV-IIIB) nach dem Western-Blot- Verfahren, wie oben beschrieben. Die Antikörper wurden außerdem durch RIPA untersucht, unter Verwendung metabolitisch markierter, mit den HIV-1-Stämmen IIIB-, RF-, MN-, AL-, Z34-, Z84 und AC infizierter H9-Zellen. Jeder monoklonale Antikörper fällte sowohl gp120 als auch gp160 des immunisierenden Stamms IIIB spezifisch aus. Die beiden Antikörper unterschieden sich jedoch bezüglich ihrer Reaktivität mit anderen HIV-1-Stämmen. Tabelle 1 Mab "+" bedeutet Reaktivität mit gp120 und gp160
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist der Antikörper 52-581-290 kreuzreaktiv gegenüber den HIV-Stämmen RF, MM und AL, der Antikörper 52-684-238 reagierte jedoch nur mit dem immunisierenden Stamm.
Desweiteren reagierten weder der monoklonale Antikörper 52- 581-290 noch der monoklonale Antikörper 52-684-238 mit den rekombinanten Proteinen pE3, pB1 oder penv 9 (erhalten von J. Ghrayeb, Centocor; S. Putney, Repligen bzw. S. Petteway, Dupont). Die rekombinanten Proteine pE3, pB1 und penv 9 wurden in Bakterien exprimiert und wurden daher als nichtglycosylierte Proteine exprimiert. Die Proteine erstrecken sich über 84% der Hülle. PB1 ist ein Fragment der Carboxy-terminalen Hälfte von gp120, die das neutralisierende Epitop enthält. Diese Nichtreaktivität läßt darauf schließen, daß die Epitope, die von dem monoklonalen Antikörper 52-581-290 und dem monoklonalen Antikörper 52-684-238 erkannt werden, entweder konformationsabhängig sind, oder im wesentlichen einen Kohlenhydratrest des gp120-Proteins enthalten.

IgG-Isotypisierung.

Der Isotyp der monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52- 684-238 wurde zu IgG2a bzw. IgG1 bestimmt. Kurz gesagt, es wurden Mikrotiter-Platten mit Ziegen-Anti-Mäuse-IgG+M- Immunoglobulin (KPL) beschichtet und mit 3% BSA Rinderserumalbumin] blockiert. Die Proben der Kulturflüssigkeit wurden in die Vertiefungen eingebracht, und die Platten wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, markierte Ziegen-Anti-Mäuse-Isotyp-Konjugate (Southern Biotech, Birmingham, AL) wurden zugesetzt, und die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Das überschüssige Konjugat wurde durch Waschen entfernt, dann wurde OPD zugesetzt. Die an Mäuseimmunoglobulin gebundene Menge an Ziegen-Anti-Mäuse-Isotyp war zu der bei 490 nm gemessenen Extinktion proportional

Peptidinhibitionstest.

Synthetische Peptide wurden wie zuvor beschrieben für die HIV-1 Aminosäuresequenzen 37-59, 68-85, 272-323, 329-384, 462- 518 und 491-518 synthetisiert (numeriert nach Ratner et al., Nature (1985) 313:277-84). Diese Peptide wurden in Konkurrenzassays gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren eingesetzt unter Substitution des unmarkierten Antikörpers durch die Reihenverdünnungen der Peptide. Fünfzig Mikroliter von entweder monoklonalem Antikörper 52-581-290 oder 52-684-238 oder des Kontrollantikörpers 52-445-22 kommerziell erhältlich von den Abbott Laboratories, Abbott Park, IL unter der Katalog-Nr. 3A18-59) oder von 44-322-51 wurden in einer Verdünnung zugesetzt, die der Verdünnung entsprach, die einen Wert von 50 % des maximalen Extinktionswerts in einem direkten EIA ergibt. Die Peptide und monoklonalen Antikörper wurden den Vertiefungen gleichzeitig zugesetzt. HRPO-markiertes Ziegen-Anti-Mäuse- Konjugat (KPL) wurde zum Nachweis der so gebildeten Immunkomplexe verwendet. Tabelle 2 Aminosäuresequenz Antikörper
Wie in Tabelle 2 gezeigt, erkannten die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 die Peptide 272-323 und 329-384 nicht, welche den neutralisierenden Bereich abdecken, während die beiden monoklonalen Antikörper 52-445-22 und 44-322- 151 das Peptid 272-323 erkannten. Diese Daten lassen darauf schließen, daß wenn die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 neutralisierende Antikörper sind, diese das Peptidgerüst des neutralisierenden Bereichs nicht erkennen.

Untersuchungen zur konkurrierenden Antikörper-Bindung.

Monoklonale Anti-gp120-Antikörper, von Abbott und kommerziell erhältliche (Dupont, Wilmington, DE), wurden in einem Konkurrenzbindungs-Assay mit markierten monoklonalen Antikörpern der Erfindung eingesetzt, um deren Reaktivität zu bestimmen. Die Fähigkeit des unmarkierten Antikörpers, mit dem markierten Antikörper um die Bindung zu konkurrieren, wurde als Beweis für ihre Fähigkeit erachtet, identische oder benachbarte Epitope zu erkennen. Der monoklonale Antikörper 52-445-22 ist bekannt dafür, daß er mit dem synthetischen Peptid 272-323 reagiert (siehe oben), und daß er den Kohlenhydratabschnitt nicht erkennt. Von dem monoklonalen Antikörper 44-322-151 ist ebenfalls bekannt, daß er mit dem synthetischen Peptid 272-323 reagiert, aber es wurde herausgefunden, daß er ein anderes Epitop als der 52-445-22 erkennt, weil die beiden monoklonalen Antikörper nicht miteinander konkurrieren. Der Antikörper 9284 von Dupont ist dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop im Bereich der Aminosäurereste 307-319 erkennt. Es wurde nachgewiesen, daß dieser Antikörper das Polypeptidgerüst von gp120 erkennt (Skinner et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1988) 4:187-97)
Kurz gesagt, es wurden die monoklonalen Antikörper 52-5 81- und 52-684-238 mit NHS-Biotin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) entsprechend der Vorschriften des Herstellers markiert. Die Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit gp120-Antigen wie zuvor beschrieben beschichtet. Zuerst wurden Reihenverdünnungen des nicht markierten Antikörpers in den Vertiefungen 15 Minuten vor-inkubiert, anschließend wurde eine bestimmte Menge an biotinyliertem Antikörper zugesetzt (in der Verdünnung, die in einem direkten EIA-Assay des biotinylierten Antikörpers allein einen Wert von 50% des maximalen Extinktionswertes ergab). Die Platten wurden dreimal mit Wasser gewaschen. Verdünntes Streptavidin-HRPO (Zymed, South San Fransisco, CA) wurde den Vertiefungen zugesetzt, und die Vertiefungen wurden 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden erneut gewaschen, und OPD wurde zugesetzt. Nach der Farbbildung wurde die Reaktion mit 1 N Schwefelsäure gelöscht und die Extinktion wurde bei 490 nm abgelesen. Tabelle 3 Nicht markierter Antikörper (Dupont) *biotinylierter Antikörper
Wie in Tabelle 3 gezeigt, konkurrieren die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 nur untereinander. Keiner der beiden Antikörper konkurriert mit irgendeinem der anderen Antikörper, einschließlich solchen Antikörpern, die mit dem Peptidgerüst des neutralisierenden Bereichs zusammen passen (52- 445-22, 44-322-151 und 9284). Diese Ergebnisse zeigen an, daß die beiden monoklonalen Antikörper ein Epitop im gleichen Bereich des gp120-Antigens erkennen.

V8-Proteolvse von gp120.

Das zuvor beschriebene gereinigte gp120 wurde mit einer glutamatspezifischen Protease von Staphylococcus aureus V8 entsprechend dem veröffentlichten Verfahren nach Nygren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:6543-46 aufgeschlossen. Nach Reduktion der Disulfidbindungen hatten sich Fragmente mit Molekularmassen von etwa 95, 60, 50 und 25 Kilodalton (kDa) gebildet. Untersuchungen hinsichtlich der Bindung an CD4- positive Zellen zeigten, daß nur zwei Fragmente, die 95- und 25- kDa-Peptide, in den Spaltprodukten beobachtet wurden, bei denen die selektive Bindungseigenschaft von gp120 erhalten war. Die unten genannten Positionen kennzeichnen die Aminosäurereste in gp120, einschließlich dem Signalpeptid. (Ratner et al., Nature (1985) 313:277-84). Basierend auf Nygren's vorläufiger Kartierung der 95-, 50- und 25-kDa-Fragmente innerhalb von gp120 ist es möglich, das 60-kDa-Fragment als größeres Fragment des 50-kDa-Proteins einzuordnen, abgespalten an den Aminosäureresten 179 und 358.
Nachdem das gp120 mit der glutamatspezifischen V8-Protease aufgeschlossen worden war, reagierten die beiden monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 mit dem 95-kDa- und dem 60- kDa-Fragment des gespaltenen gp120, jedoch nicht mit dem 50-kDa- Fragment. Diese Daten zeigen, daß beide monoklonalen Antikörper sich an das gp120-Protein im Bereich der Aminosäurereste 301-358 anlagern.

Behandlung von gp120 mit Endoglycosidase F und H.

Zum Nachweis, ob die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 den Kohlenhydratabschnitt des gp120-Antigens erkennen, wurden spezifische Endoglycosidasen verwendet, um das gp120-Antigen selektiv seiner Glycane zu berauben. Natives gp120 wurde mit rekombinanter Endoglycosidase H behandelt, die von Strentomyces lividans (Calbiochem, La Jolla, CA) abgeleitet war und die spezifisch N-gebundene Oligosaccharide abspaltete. Sie wurde in einem Verhältnis von 10&supmin;³ Einheiten (U) Enzym je 100 Nanogramm (ng) gp120-Antigen in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,8, bei 37ºC 30 Minuten lang verwendet. Das aufgeschlossene gp120- Antigen wurde einer Elektrophorese unterworfen und auf Nitrozellulose überführt.
In ähnlicher Weise wurde gp120-Antigen mit Endoglycosidase F (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) behandelt, die die komplexen Kohlenhydrate vom gp120-Molekül entfernt. Endoglycosidase F wurde mit einer Konzentration von 0,1 U je 100 ng gp120 in einem 1% SDS-Puffer 24 Stunden lang bei 37 ºC angewendet.
Entsprechend den zuvor offenbarten Verfahren wurde gp120 mit Endoglycosidase H behandelt, die etwa 60 % der Asparagin- gebundenen Kohlenhydrate vom gp120-Molekül entfernte, was zu einem Glycoprotein von etwa 95 kDa führte. Das gp120-Antigen wurde ebenfalls mit Endoglycosidase F behandelt, die im wesentlichen die komplexen Kohlenhydrate entfernte, die mit dem gp120-Molekül assoziiert waren. Dadurch sank das scheinbare Molekulargewicht auf 58-60 kDa.
Der monoklonale Antikörper 52-581-290 reagierte mit dem Endoglycosidase H-behandelten gp120, jedoch nicht mit dem Endoglycosidase F-behandelten gp120. Dies läßt darauf schließen, daß das durch den monoklonalen Antikörper 52-581-290 erkannte Epitop ausschließlich auf den Kohlenhydratanteil des gp120- Antigens gerichtet sein könnte. Andererseits reagierte der monoklonale Antikörper 52-684-238 sowohl mit Endoglycosidase H- behandeltem gp120 als auch mit Endoglycosidase F-behandeltem gp120. Dies läßt darauf schließen, daß das durch den monoklonalen Antikörper 52-684-238 erkannte Epitop auf einen Bereich gerichtet sein könnte, der eine Kombination aus Kohlenhydrat- und Peptidgerüst ist.

Beispiel 3

Konkurrierende Bindungsuntersuchungen mit Lectin.

Die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 wurden gegen die Lectine Triticum vulgaris (Weizenkeim), Tetragonolobus purpureas (Engl. Erbse), Glycine max (Sojabohne) und Canavalia ensiformis (Schwertbohne) Concanavalin A in Konkurrenz gebracht. Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit dem zuvor beschriebenen gp120-Antigen beschichtet, wie dies bei den Verfahren beschrieben ist. Fab-Fragmente der monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 wurden gemäß der Anleitung des Herstellers (Pierce) erzeugt. Die Fab-Fragmente wurden von den abgespaltenen Fc-Fragmenten durch Protein A-Chromatografie abgetrennt. Biotin-markierte Lectine (Sigma) konkurrierten mit den monoklonalen Fab-Antikörpern um die Bindung an das Zielantigen gp120.
Kurz gesagt, es wurden die Fab-Fragmente reihenweise in PBS mit 0,2 % FBS bei einer Konzentration von 100 ug/ml bis etwa 0,4 ug/ml verdünnt, während die Lectinkonzentration konstant gehalten wurde (12,5 ug/ml für T. vulgaris und Con A, 50 ug/ml für T. purpureas und Glycine max). Die Fab-Fragment-Verdünnungen wurden in den Vertiefungen 15 Minuten inkubiert, die markierten Lectine wurden den Vertiefungen zugesetzt und die Vertiefungen wurden weitere 30 Minuten lang inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden dreimal mit Wasser gewaschen. Verdünnte Streptavidin-HRPO wurde den Vertiefungen zugesetzt, und eine Farbbildung vollzog sich, wie zuvor beschrieben. Die Konkurrenz der Fab-Fragmente um die Lectin-Bindungsstellen wurde als mindestens 50 %ige Abnahme der Ektinktion bei 490 Nanometer (nm) im Vergleich mit dem allein umgesetzten markierten Lectin definiert. Tabelle 4 Lectin (Spezifität) Kontrolle T. vulgaris (D-gIcNAc)&sub2; T. purpureas (a-L-fuc) Glycine max (D-gaINAc) Con A (a-D-man) NC = No competition (keine Konkurrenz). Die Konkurrenz ist definiert als die kleinste Konzentration an monoklonalem Antikörper (ug/ml), bei der die Extinktion um 50 % vermindert ist. Kontrollantikörper ist 52-445-22.
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich konkurrieren die beiden monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 mit den Lectinen von T. vulgaris und T. purpureas, während Kontrollantikörper 52-445-22 nicht konkurrierte. Keiner der monoklonalen Antikörper konkurrierte mit den Lectinen von Glycine max und Concanavalin A. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die beiden monoklonalen Antikörper einen Abschnitt der Kohlenhydratseitenkette erkennen, der sich in der Nähe des Peptidgerüsts des gp120-Proteins befindet.
Darüberhinaus hatte die Behandlung von gp120 mit Natriumperiodat (NaIO&sub4;) und Natriumborhydrid (NaBH&sub4;) in zwei Zyklen des Oxidations-/Reduktionsverfahrens, bei dem terminale Sialinsäurezucker zu ihren korrespondierenden Glycolen reduziert wurden, keine Auswirkung auf die Reaktivität weder des monoklonalen Antikörpers 52-581-290 noch des monoklonalen Antikörpers 52-684-238 mit dem reduzierten gp120, wie durch Western-Blot nachgewiesen wurde. Kurz gesagt, es wurden 10 ug gp120 mit 10 ul 0,12 M NaIO&sub4; bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Zwanzig Mikroliter 0,1 % NaBH&sub4; wurden zugesetzt, und das Gemisch eine weitere Stunde inkubiert. Der Zyklus wurde unter Verwendung von 40 ul und 80 ul NaIO&sub4; bzw. NaBH&sub4; wiederholt. Jeder der monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 reagierte spezifisch mit dem reduzierten gp120. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die beiden monoklonalen Antikörper nicht den Sialinsäureabschnizt der Kohlenhydratkomponente von gp 120 benötigen, um das Epitop zu erkennen.

Beispiel 4

Neutralisationsassays.

Es wurden Neutralisationsassays wurden entsprechend den von Ho et al., Science (1988) 239:1021-23; J.Virol. (1987) 61:2024- 28 offenbarten Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt es wurden 100 ul Virusimpfkultur (50 zu 50 % Gewebekultur infizierende Dosen) mit 100 ul Testantikörper unterschiedlicher Konzentrationen 1 Stunde bei 37 ºC inkubiert. Das Virus- Antikörper-Gemisch wurde anschließend zum Infizieren von 0,75 x 10&sup6; H9-Zellen in 1,5 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 15 % Fetalrinderserum, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure), 250 U Penicillin je ml, 250 ug Streptomycin je ml und 2 mM L-Glutamin verwendet. Nach 7 bis 10 Tagen in Kultur wurden die zellfreien Kulturüberstände für den Nachweis des HIV-p24-Antigens durch EIA (Abbott HTLV-III-Antigen-EIA, Abbott Laboratories) vereinigt.
Ein besonderer HIV-Stamm wurde bei einer Konzentration als durch einen monoklonalen Antikörper neutralisiert bezeichnet, bei der die Expression des HIV-p24-Antigens um 50 % im Vergleich zu infizierten Kontroll-H9-Zellen inhibiert war (ID&sub5;&sub0;) Tabelle 5 Virusisolat Laborstämme Klinische Stämme
Wie in Tabelle 5 gezeigt, neutralisieren die monoklonalen Antikörper 52-581-290 und 52-684-238 eine Vielzahl von HIV- Isolaten, sowohl bei den Labor- als auch den klinischen Stämmen. Stämme, die immer noch eine p24-Expression von mehr als 50 % der Kontroll-H9-Zellen bei 10 ug monoklonalem Antikörper zeigten, wurden als nicht neutralisiert betrachtet.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an ein Epitop auf einem humanen Immunschwäche-Virus(HIV)-Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 120 000 Dalton (gp120) bindet, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen Kohlenhydratanteil von gp120 erkennt, der sich im Bereich von etwa Aminosäure 301 bis etwa Amiriosäure 358 befindet.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der desweiteren die Eigenschaft aufweist, HIV im wesentlichen zu neutralisieren.

3. Monoklonaler Antikörper, der die immunologischen Bindungseigenschaften des monoklonalen Antikörpers aufweist, der von einer Hybridomzellinie gebildet wird, die bei der American Type Culture Collection unter ATCC No. HB10399 hinterlegt ist.

4. Monoklonaler Antikörper, der die immunologischen Bindungseigenschaften des monoklonalen Antikörpers aufweist, der von der Hybridomzellinie gebildet wird, die bei der American Type Culture Collection unter ATCC No. HB10400 hinterlegt ist.

5. Hybridom, das in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper zu bilden, der den Kohlenhydratanteil von HIV-gp120 erkennt, wobei der monoklonale Antikörper an einen Kohlenhydratanteil bindet, der sich im Bereich von etwa Aminosäure 301 bis etwa Aminosäure 358 befindet.

6. Hybridomzellinie ATCC No. HB10399, die Antikörper gegen den Kohlenhydratanteil von HTV-gp120 bildet.

7. Hybridomzellinie ATCC No. HB10400, die Antikörper gegen den Kohlenhydratanteil von HIV-gp120 bildet.

8. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-4 in Immunoassays zum Nachweis dar Anwsenheit von HIV.

9. Verwendung eines Hybridoms nach einem der Ansprüche 5-7 zur Bildung eines monoklonalen Antikörpers.

10. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-4 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorsorge und Behandlung von AIDS.