DE69109868T2

DE69109868T2 - Verfahren zur bestimmung von dns-sequenzen.

Info

Publication number: DE69109868T2
Application number: DE69109868T
Authority: DE
Inventors: Alan Hochberg
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Dade Chemistry Systems Inc
Priority date: 1990-08-07
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1995-12-21
Anticipated expiration: 2011-08-02
Also published as: EP0542883A1; CA2088260A1; JPH05509000A; US5667971A; DE69109868D1; WO1992002635A1; EP0542883B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer genaueren DNA-Sequenz-Information.

Hintergrund der Erfindung

Die DNA-Sequenzierung ist einer der Eckpfeiler der analytischen Techniken der modernen Molekularbiologie. Die Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Sequenzierung hat zu großen Vorteilen im Verständnis der Organisation der genetischen Information geführt und die Manipulation von genetischem Material (d.h. die Gentechnik) ermöglicht.
Gegenwärtig gibt es zwei allgemeine Methoden für die DNA- Sequenzierung, die Maxam-Gilbert-Methode des chemischen Abbaus {A.M. Maxam et al., Meth. in Enzym., Band 65, 499-559 (198Q)}, und die Sanger'sche Methode des Didesoxy-Kettenabbruchs {F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Band 74, 5463-5467 (1977)}. Ein gemeinsames Merkmal dieser beiden Techniken ist die Erzeugung eines Satzes von DNA-Fragmenten, die mittels Elektrophorese analysiert werden. Die Techniken unterscheiden sich in den zur Herstellung dieser Fragmente eingesetzten Arbeitsweisen.
Bei der Maxam-Gilbert-Technik werden DNA-Fragmente durch basenspezifische chemische Spaltung des zu sequenzierenden Stücks der DNA hergestellt. Das zu sequenzierende Stück der DNA wird zuerst am 5'-Ende mit ³²P markiert und dann in vier Anteile unterteilt. Jeder Anteil wird einem unterschiedlichen Satz chemischer Behandlungen unterworfen, die so konzipiert sind, daß sie DNA an Positionen spalten, die einer gegebenen Base (oder gegebenen Basen) benachbart sind. Das Ergebnis ist, daß sämtliche markierten Fragmente den gleichen 5'-Terminus wie das ursprüngliche Stück der DNA haben und 3'-Termini haben, die durch die Positionen der Spaltung bestimmt sind. Diese Behandlung wird unter Bedingungen vorgenommen, die DNA- Fragmente erzeugen, die eine zweckmäßige Länge für eine Trennung mittels Gelelektrophorese haben.
Bei der Sanger'schen Technik werden DNA-Fragmente durch partielles enzymatisches Kopieren (d.h. eine Synthese) des zu sequenzierenden DNA-Stücks erzeugt. In der meistgebräuchlichen Version wird das zu sequenzierende Stück der DNA unter Anwendung von Standard-Techniken in einen "Sequenzierungs-Vektor", ein großes kreisförmiges einsträngiges DNA-Stück, wie den Bakteriophagen M13, eingefügt. Dieser wird die Matrize für den Kopiervorgang. Ein kurzes DNA-Stück, dessen Sequenz zu einem Bereich gerade stromaufwärts von der Insertion komplementär ist, wird mit der Matrize reassoziieren gelassen, um als Primer für die Synthese zu dienen. In Anwesenheit der vier natürlichen Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP' s) verlängert eine DNA- Polymerase den Primer von dem 3'-Ende her unter Erzeugung einer komplementären Kopie der Matrize im Bereich des Inserts. Zur Erzeugung eines vollständigen Satzes von Sequenzierungs-Fragmenten werden vier Reaktionen parallel ablaufen gelassen, die jeweils die vier dNTP's zusammen mit einem einzelnen Didesoxyribonucleosidtriphosphat (dDNTP)-Terminator, einen für jede Base, enthalten. (³²P-markiertes oder Fluorophor-markiertes dNTP wird zugesetzt, um markierte Fragmente herzustellen). Wenn ein dNTP durch die Polymerase eingebaut worden ist, kann die Kettenverlängerung fortschreiten. Wenn das entsprechende ddNTP gewählt worden ist, wird die Kette terminiert. Das Verhältnis ddNTP zu den dNTP's wird so eingestellt, daß DNA-Fragmente geeigneter Länge erzeugt werden. Jede der vier Reaktionsmischungen enthält somit eine Verteilung von Fragmenten mit dem gleichen Didesoxyribonucleosid-Rest an dem 3'-Terminus und einem Primer-definierten 5'-Terminus.
Sowohl bei der Sanger-Methoder als auch bei der Maxam-Gilbert- Methode wird Basen-Sequenz-Information, die im allgemeinen nicht direkt mittels physikalischer Methoden bestimmt werden kann, in Information über die Kettenlänge umgewandelt, die bestimmt werden kann. Diese Bestimmung kann mit Hilfe einer elektrophoretischen Trennung bewerkstelligt werden. Unter denaturierenden Bedingungen (hohe Temperatur, Anwesenheit von Harnstoff etc.) wandern kurze DNA-Fragmente, als seien sie steife Stäbe. Wenn eine Gel-Matrix für die Elektrophorese eingesetzt wird, werden die DNA-Fragmente der Größe nach sortiert. Die für die Sequenzierung erforderliche Einzelbasen-Auflösung kann gewöhnlich für DNA-Fragmente erhalten werden, die bis zu mehrere hundert Basen enthalten.
Zur Bestimmung einer vollständigen Sequenz werden die vier Sätze von Fragmenten, die entweder nach der Maxam-Gilbert- Methode oder nach der Sanger-Methode erzeugt wurden, der Elektrophorese unterworfen. Dies ergibt, daß die Fragmente räumlich über die Strecke des Gels aufgelöst sind. Eine Methode der Unterscheidung der Farbstoffe (die die ³²P-Markierung ersetzen) und der Verwendung dieser Information zur Bestimmung von DNA- Sequenzen ist in der Anwendung von Prober et al. beschrieben. Dieses System ist verfügbar in einem kommerziellen Instrument, das als Genesis 2000 bekannt und von E.I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware, erhältlich ist. Das Genesis -System zur DNA-Sequenzierung umfaßt ein Mittel zum Nachweis von Strahlungsenergie aus eng verwandten, jedoch trotzdem unterscheidbaren "Reportern" oder Markierungen, die kovalent an Verbindungen gebunden sind, die als kettenterminierende Nucleotide bei einer modifizierten Sanger-DNA-Kettenverlängerungs- Methode wirken. Unterscheidbare fluoreszierende Reporter sind an jede der vier Didesoxynucleotid-Basen gebunden, die bei Sanger-DNA-Sequenzierungs-Reaktionen repräsentiert werden, d.h. Didesoxynucleotide von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Diese Reporter-markierten, kettenterminierenden Reagentien ersetzen die unmarkierten Kettenterminatoren bei der traditionellen Sanger-Methode und werden in Reaktion mit den entsprechenden Desoxynucleotiden, einem passenden Primer, Matrize und Polymerase kombiniert. Das resultierende Gemisch enthält DNA- Fragmente variierender Länge, die sich voneinander durch eine Base unterscheiden, die an dem 3'-Ende mit individuell markierten Ketten-Terminatoren enden, die einer der vier DNA-Basen entsprechen. Diese neue Markierungsmethode ermöglicht die Eliminierung der üblichen radioaktiven Markierung, die in einem der Desoxynucleotide der traditionellen Sanger-Methode enthalten ist.
Der Nachweis dieser Reporter-Markierungen kann mit zwei stationären Photovervielfacher-Röhren (PMT's) bewerkstelligt werden, die Banden unterschiedlicher Wellenlängen von Fluoreszenz- Emissionen von Laser-stimulierten Reportern, die an Ketten- Terminatoren auf DNA-Fragmenten gebunden sind, empfangen. Diese Fragmente können in Raum und/oder Zeit elektrophoretisch getrennt werden, so daß sie sich entlang einer senkrecht zu der Nachweisfläche der PMT's verlaufenden Achse bewegen. Die Fluoreszenz-Emissionen passieren zuerst ein dichroitisches oder ein anderes wellenlängenselektives Filter oder mehrere solcher Filter, die so angebracht sind, daß sie eine charakteristische Wellenlänge auf eine PMT und die andere charakteristische Wellenlänge auf die andere PMT richten. Auf diese Weise werden unterschiedliche digitale Signale in jeder PMT geschaffen, deren Verhältnis zueinander bestimmt werden kann, wodurch ein drittes Signal entsteht, das für einen gegebenen fluoreszierenden Reporter selbst dann eindeutig ist, wenn eine Serie fluoreszierender Reporter dicht beeinander liegende Emissions- Wellenlängen hat. Dieses System ist fähig, Reporter nachzuweisen, die sämtlich in wirksamer Weise durch eine einzelne Laser-Linie, wie etwa 488 nm, angeregt werden und die dicht beeinander liegende Emissionen haben, deren Maxima sich gewöhnlich nur um 5 bis 7 nm unterscheiden. Auf diese Weise können die Zuordnungen der sequentiellen Basen in einem interessierenden DNA-Strang auf der Basis des individuellen Verhältnisses vorgenommen werden, das für jeden der vier Reporter- markierten Ketten-Terminatoren abgeleitet wurde, die jeder der vier Basen in DNA entsprechen.
Wiewohl die Basen-Information in den Fluoreszenz-Markierungen in der Genesis 2000-Einheit enthalten ist, ist anzumerken, daß die Information auch in einer kolorimetrischen {S. Beck, Anal. Biochem. 164 (2) 514-520 (1987)} Markierung, einem chemilumineszierenden {S. Beck, Nucleic Acids Res. 17, 5115-5123 (1989)} oder einem anderen Signal enthalten sein könnte.
Der Genesis -Sequenzierer ist so konzipiert, daß er sich die Chemie der Didesoxy-Ketten-Terminierung zunutze macht. Um diese Chemie anzuwenden, war es notwendig, vier chemisch ähnliche Farbstoffe zur Unterscheidung der vier Basen A, C, G und T zu verwenden. Sofern die Farbstoffe nicht sorgfältig ausgewählt und erschöpfend untersucht werden, kann ihre elektrophoretische Beweglichkeit in manchen DNA-Sequenzen unterschiedlich sein, was zu einer Verwirrung der Sequenz-Information führt. Die aufgrund ihrer ähnlichen elektrophoretischen Mobilität ausgewählten vier Farbstoffe hatten überlappende Emissions- und Anregungs-Spektren. Das Bedürfnis zur Unterscheidung dieser Farbstoffe ohne den übermäßigen Licht-Verlust durch extreme Schmalband-Filter führte zu einem Zweikanal-Nachweis-Schema, in dem das Verhältnis der zwei Signale verwendet wird, um zu bestimmen, welche Base den Detektor durchlaufen hat. Wenn die Peaks gut aufgelöst und frei von Rauschen sind, lassen sich die ratiometrischen Signale leicht interpretieren (Fig. 1). Zur Maximierung des Betrags der Sequenz-Information, der aus jedem Durchlauf erhalten werden kann, ist es notwendig, das Zwei- Kanal-Signal unter Bedingungen einer schlechten Peak-Auflösung und eines signifikanten Rauschens genau zu interpretieren.
Die Methoden zur Analyse von Zwei-Kanal-Daten unter diesen Bedingungen unterscheiden sich von denjenigen, die zur Verarbeitung konventioneller Elektrophoretogramme und Chromatogramme eingesetzt werden. Die Ausgabe der hier beschriebenen Analyse ist eine Sequenz von Basen-Kennzeichnungen A, C, G oder T, während bei der Chromatographie die gewünschte Ausgabe typischerweise eine Liste von Peak-Positionen und -Flächen ist. Chromatographische Verfahren bedienen sich im allgemeinen nicht zweier Detektor-Signale, die mit einem von vier Verhältnissen gekoppelt sind. Diese Beziehung zwischen den zwei Signalen ist eine spezielle Eigenschaft des in der Patentanmeldung von Prober et al. beschriebenen Sequenzierers. Die Datenverarbeitungsleistung ist für das Sequenzieren eine wichtigere Überlegung als für die Chromatographie. Bei der Chromatographie können brauchbare Ergebnisse dadurch erhalten werden, daß ausgedehnte Berechnungen an zwei oder drei Peaks durchgeführt werden; beim Sequenzieren kann es nötig sein, 300 bis 600 Peaks zu analysieren.
Das ratiometrische Schema von Prober et al. präsentiert auch ein Problem der Signal-Interpretation, das sich von dem anderer DNA-Sequenzierer unterscheidet. Sequenzierer, die die Primer- Chemie einsetzen, sind bei L.M. Smith et al., Nucleic Acids Res. 13, 2399-2412 (1985), und bei W. Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 13, 315-323 (1986), beschrieben. Diese Sequenzierer verwenden vier Signal-Kanäle, einen für jede Base. Andere Sequenzierer, etwa derjenige, der von Kambara et al. [H. Kambara et al., Biotechnology 6, 816-821 (1988)] und von Ansorge et al. [W. Ansorge et al., Nucleic Acids Res. 15, 4593-4602 (1987)] beschrieben ist, verwenden ein Signal in jeder der vier Elektrophorese-Spuren. Diese Systeme setzen noch eine andere Klasse von Methoden der Daten-Analyse ein, da die Ergebnisse aus vier getrennten Spuren in einer richtigen Zeitfolge zur Deckung gebracht oder ausgerichtet werden müssen.
In diesen automatisierten Versionen der DNA-Sequenzierung muß der Reporter fluorimetrisch, wie in der Anmeldung von Prober et al. beschrieben ist, kolorimetrisch {S. Beck, Anal. Biochem. 164 (2) 514-520 (1987)}, chemilumineszierend {S. Beck, Nucleic Acids Res. 17, 5115-5123 (1989)} oder einer eines anderen Typs sein.
Sequenzierer, die die Primer-Chemie einsetzen, (wie der von Hunkapiller et al., US-Patent 4 811 218) sind hinsichtlich der Auswahl der Farbstoffe, die zur Markierung der DNA-Fragmente verwendet werden können, nicht so eingeschränkt. Diese Sequenzierer können vier Signal-Kanäle, einen für jede Base, verwenden und erfordern demzufolge nicht den komplexen Algorithmus, der zum Interpretieren ratiometrischer Signale benötigt wird. Andererseits können diese Sequenzierer sich nicht der Vorteile der Terminator-Chemie erfreuen. Insbesondere erfordert die Primer-Chemie vier getrennte Reaktions-Rohre für jede zu sequenzierende Probe, während die Terminator-Chemie nur eines benötigt. Außerdem ist die Primer-Chemie anfällig gegenüber Fehlern durch "falsche Stops", fehlerhafte Signale, die erzeugt werden, sobald eine Polymerase unfähig ist, über einen bestimmten Punkt auf dem DNA-Strang hinweg fortzuschreiten.
Andere Sequenzierer, wie derjenige, der von Kambara et al. [H. Kambara et al., Biotechnology 6, 816-821 (1988)] beschrieben ist, benutzen ein Signal in jeder der vier Elektrophorese- Spuren. Dies überwindet viele der Schwierigkeiten, die bei dem Auflösungs-Problem der automatisierten DNA-Sequenzierer des Standes der Technik auftreten. Diese Systeme setzen noch eine andere Klasse von Methoden der Daten-Analyse ein, da die Ergebnisse aus vier getrennten Spuren in einer richtigen Zeitfolge registriert oder ausgerichtet werden müssen. Sobald die Spuren zur Deckung gebracht sind, können die Methoden der Daten-Analyse mit denjenigen von Hunkapiller et al. identisch sein. Eine korrekte Ausrichtung für die Spuren ist offenkundig entscheidend für die korrekte Sequenz-Bestimmung. Wenn die Spuren nicht passend ausgerichtet sind, werden die entsprechenden Basen nicht in der richtigen Reihenfolge interpretiert. Das Problem der Ausrichtung von vier Spuren ist komplex, da es seiner Natur nach kombinatorisch ist. Für ein gegebenes Paar dicht benachbarter Banden in allen vier Spuren gibt es 41 = 2 × 3 × 4 = 24 mögliche Anordnungen der Banden. Nur eine entspricht der korrekten Sequenz. Das Verfahren der Ausrichtung kann Fehler bei der Sequenz-Interpretation einführen, und aus diesem Grunde können bei der Vorgabe einer gleichen Auflösung und eines gleichen Signal-Rausch-Verhältnisses Sequenzierer des von Kambara beschriebenen Typs einen geringeren Betrag der genauen Sequenz-Information erzeugen als diejenigen von Hunkapiller. Man beachte jedoch auch, daß diese Sequenzen nicht nur vier Reaktions-Rohre sondern auch vier Elektrophorese-Spuren für jede zu analysierende DNA-Probe erfordern. Weiterhin offenbaren W. Ansorge et al., J. of Biochem. and Biophys. Methods 20, 47- 52 (1989) , und DE-A-38 41 565, ein Ein-Farbstoff-Zwei-Spuren- System, und DE-A-38 39 397 betrifft eine Sequenzierung unter Beteiligung einer oder mehrerer Fluoreszenz-Färbungen und Modifizierungs-Reaktionen.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Zwillings-Probleme der Genauigkeit oder Auflösung und der Ausrichtung werden durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung weitgehend gelöst. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Sequenz der Basen durch die Verwendung zweier Elektrophorese-Spuren für jede Probe, deren DNA sequenziert werden soll, bestimmt, d.h. abgerufen werden. Jede Spur enthält eingearbeitet zwei Terminator-Farbstoffe. Gemäß der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur DNA-Sequenzierung zur Sicherstellung der Sequenz der vier Basen G, C, A und T die Schritte
des Herstellens eines ersten Satzes von DNA-Fragmenten mit Reporter-markierten Terminatoren für zwei der vier Basen, wobei jede Base einen anderen Reporter besitzt,
des Herstellens eines zweiten Satzes von DNA-Fragmenten mit Reporter-markierten Terminatoren für die übrigen zwei der vier Basen, wobei jede Base einen anderen Reporter besitzt,
des Trennens des betreffenden ersten Satzes und des betreffenden zweiten Satzes durch Gel-Elektrophorese,
des Erzeugens eines ersten Signals, dessen Amplitude variiert, für jeden der betreffenden Sätze zur Bildung von Peaks gemäß einer charakteristischen Eigenschaft des Reporters und der Geschwindigkeit, mit der eine Base sich durch das Gel bewegt,
des Erzeugens eines zweiten Signals, dessen Amplitude variiert, für jeden der betreffenden Sätze zur Bildung von Peaks gemäß einer charakteristischen Eigenschaft des Reporters und der Geschwindigkeit, mit der jeder sich durch das Gel bewegt hat, und
des Umwandelns des ersten Signals und des zweiten Signals in Signale, die den vier Basen in der Reihenfolge dieser Bewegung durch das Gel entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der erste Satz der DNA-Fragmente G und C. Diese tendiert dahin, das wohlbekannte Phänomen der G-C-Kompression zu überwinden, bei dem der Abstand zwischen den Peaks des G-Signals und den Peaks der unmittelbar nachfolgenden Signale in hohem Maße veränderlich ist. Weiterhin werden gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der erste Satz und der zweite Satz in benachbarten Spuren auf dem Gel getrennt. Dies ist vorteilhaft, da die zu trennenden DNA-Fragmente im wesentlichen der Einwirkung derselben Gel-Zusammensetzung, derselben thermischen Umgebung und des gleichen elektrischen Feldes ausgesetzt werden. Während der Sequenzen werden die vier Basen-Signale gemäß ihrer Durchgangs-Geschwindigkeit durch das Gel geordnet. Ebenfalls können die für den ersten Satz verwendeten Reporter die gleichen wie die für den zweiten Satz verwendeten Reporter sein.
Diese Methode hat viele Vorteile. Die Terminator-Chemie kann ohne die Komplexität der Verarbeitung radiometrischer Signale, wie sie von Prober et al. beschrieben ist, durchgeführt werden. Die Methode erfordert die Verwendung von lediglich zwei Reportern mit ähnlicher elektrophoretischer Beweglichkeit und unterschiedlichen spektralen Charakteristiken an Stelle der vier Reporter, die von einem einspurigen System benötigt werden. Die Ausrichtung der Spuren spielt eine Rolle, ist ihrer Natur nach jedoch nicht kombinatorisch, da es nur zwei mögliche Anordnungen von zwei Objekten gibt. Die beiden Signale können in bezug auf einander einfach "verschoben" werden, bis die passenden Ausrichtungen, wie sie unten beschrieben werden, bestimmt sind. Da weder Verhältnisse noch komplexe Ausrichtungs- Algorithmen eingesetzt werden, vermag dieses Verfahren eine größere Menge an genauer Sequenz-Information aus einer gegebenen Probe zu erzeugen als die Verfahren des Standes der Technik. Der Einsatz von zwei Spuren an Stelle von vier ist ökonomischer als alternative Vier-Spuren-Verfahren zur Gewinnung vier getrennter Signale.
Bei noch einem anderen alternativen Verfahren kann die Erfindung mit einer Primer-Markierung eingesetzt werden. Entweder die Sanger- oder die Maxam-Gilbert-Chemie kann zur Anwendung kommen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung ist einfacher zu verstehen bei einer Betrachtung der folgenden Zeichnungen in Verbindung mit der Beschreibung.
Fig. 1 zeigt ein Ablaufschema, das die Schritte gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Sequenzierung von DNA- Fragmenten veranschaulicht.
Fig. 2 zeigt ein Ablaufschema, das die in dem Verfahren zur Ausrichtung der Spuren, wie es in Fig 1 dargestellt ist, angewandten Schritte veranschaulicht.
Fig. 3 zeigt Diagramme der nachgewiesenen Peaks, die über der Zeit aufgetragen sind, welche die Art und Weise veranschaulichen, in der die Abstände der Peaks eingestellt werden, um mehrere Peaks mit angemessenen Peak-Abständen anzuordnen.
Fig. 4 zeigt ein Ablaufschema, das die Einzelheiten des Schrittes des Abrufens der Basen-in dem Ablaufschema der Fig. 1 veranschaulicht.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in Verbindung mit dem Genesis 2000-Sequenzierer beschrieben, der zwei Detektoren hat, die Ausgangs-Signale R und T liefern, wie oben beschrieben ist. Diese Ausgangs-Signale variieren in ihrer Amplitude unter Bildung von Peaks entsprechend der Charakteristik des bei den DNA-Fragmenten verwendeten Reporters und der Zeit, mit der sich die Base durch das Gel bewegt. Unter Verwendung der Reagens- Kits, die für eine Verwendung mit dem Genesis 2000-Sequenzierer zur Verfügung stehen, werden beispielsweise DNA-Proben hergestellt, und zwei Terminator-Reaktionen werden mit fluoreszierenden Didesoxy-Terminatoren durchgeführt. In einer Reaktion sind nur zwei Terminatoren, G und C, enthalten. In der anderen Reaktion sind nur die Terminatoren A und T enthalten. Diese paarweise Anordnung wird wegen des Phänomens der G-C-Kompression bevorzugt; der Abstand zwischen den Peaks des G-Signals und den unmittelbar nachfolgenden Peaks des C-Signals ist in hohem Maße variabel. Wenn G- und C-Terminatoren in einer einzelnen Reaktion enthalten sind, ist es später nicht notwendig für den Algorithmus, der die beiden Spuren ausrichtet, der Variabilität des G-C-Abstands Rechnung zu tragen. Die beiden Reaktionsmischungen werden auf einem sequenzierenden Gel getrennt. Es ist zu bevorzugen, daß die Mischungen in zwei benachbarte Spuren auf dem Gel gebracht werden, um die Fehlausrichtung zwischen den beiden Spuren zu minimieren. Von jeder Spur werden mit Hilfe der Genesis-Apparatur zwei Photovervielfacher-Signale abgeleitet.
Die bevorzugte Kombinationen aus Farbstoffen und Terminatoren ist G-Farbstoff 1, A-Farbstoff 1, C-Farbstoff 2 und T-Farbstoff 2. Viele potentielle Auswahlmöglichkeiten für Farbstoff 1 und Farbstoff 2 können zur Verfügung stehen. Farbstoff 1 und Farbstoff 2 sollten so ausgewählt werden, daß eine angemessene spektrale Trennung zu ihrer Unterscheidung gegeben ist und daß die stärksten und am gleichmäßigsten verteilten Signale für alle vier Basen erhalten werden. Dieser letztere Parameter muß experimentell bestimmt werden, da er in komplizierter Weise von dem Enzym und den Reaktionsbedingungen abhängt, die für das Sequenzieren zur Anwendung kommen.
Die vier Signale (zwei Photovervielfacher-Signale von jeder der beiden Spuren) müssen in Signale umgewandelt werden, die den vier Basen in der korrekten Reihenfolge entsprechen. Zuerst muß jedes Paar der Photovervielfacher-Signale auf orthogonaler Basis umgewandelt werden, so daß ein Signal der einen Base entspricht und das andere Signal der anderen Base entspricht. Dies kann auf der Grundlage der Tatsache erfolgen, daß die beiden Photovervielfacher auf die beiden Signale unterschiedlich antworten. Nimmt man die G-C-Spur als Beispiel, so gilt:
P&sub1; = βG1 G + βC1 C ,
P&sub2; = βG2 G + βC2 C , worin P&sub1; und P&sub2; die PMT-Signale sind, G und C die tatsächlichen Konzentrationen des Farbstoffs sind, die beim Erhalten der Signale nachgewiesen werden, und die β-Werte die Antwortreaktion der beiden PMT's auf die beiden Farbstoffe beschreiben. Dann ist es möglich, Signale abzuleiten, die die Konzentrationen der nachgewiesenen Farbstoffe repräsentieren:
G = (βC2 P&sub1; - βC1 P&sub2;) / (βC2βG1 - βC1βG2) [1]
C = (βG2 P&sub1; - βG1 P&sub2;) / (βG2βC1 - βG1βC2) [2].
Von der anderen Spur können die A- und T-Signale in identischer Weise abgeleitet werden.
Als nächstes ist es notwendig, die G-C- und A-T-Signale richtig anzuordnen oder auszurichten. Viele Algorithmen für das Ausrichten von Signalen sind bekannt, d.h. bei A. Rosenfeld et al., Digital Picture Processing, Academic Press, 297-302 (1976). Ein spezielles Verfahren ist in dem nachstehenden Beispiel beschrieben. Sobald die Signale geordnet sind, sind die Daten im Aussehen mit denjenigen identisch, die von dem an Hunkapiller et al. ausgegebenen US-Patent 4 811 218 erzeugt wurden, in dem jedes Signal einer Base entspricht. Jedes Mittel der Sequenz-Interpretation, das auf diese Daten anwendbar ist, kann verwendet werden.
Wie in dem Ablaufschema der Fig. 1 beschrieben ist, wird die Ausrichtung der Spuren durch die Arbeitsweise bewerkstelligt, die ausführlicher in dem Ablaufschema der Fig. 2 dargestellt ist. Die als Eingabe in das Zwei-Spuren-Datenanalyse-Verfahren verwendeten Signale entsprechen den Photovervielfacher-Signalen in den G-C- und A-T-Spuren. Diese vier Photovervielfacher-Signale werden unter Verwendung der obigen Gleichungen 1 und 2 in vier Basen-Signale A, G, C und T umgewandelt. Als nächstes werden die Peaks in der G-C-Spur lokalisiert. Zuerst werden die G- und C-Signale summiert. Das resultierende Daten-Muster wird vom Anfang bis zum Ende abgetastet, und jeder Punkt, an dem die erste Ableitung der Daten den Wert Null mit einem einen bestimmten Schwellenwert (0,00015 V/Datenpunkt) überschreitenden Anstieg kreuzt, wird als Ort eines Peaks genommen. Auf diese Weise wird eine Liste von Peaks in dem G-C-Kanal erhalten. Eine Liste von Peaks in dem A-T-Kanal wird aus den Daten der anderen Spur mittels eines identischen Verfahrens erhalten.
Als nächstes wird die Ausrichtung der beiden Muster bestimmt. Die Ausrichtung wird an Gruppen von 40 Peaks durchgeführt. Wenn, wie in den Fig. 2 und 3 dargestellt ist, die beiden Listen der Peak-Positionen mit einer ungeeigneten Ausrichtung kombiniert werden, gibt es eine breite Varianz in den Abständen zwischen den Peaks in der kombinierten Liste. Wenn die A-T- Peaks um einen Versetzungswert verschoben werden, der sie an ihren geeigneten Positionen plaziert, wird die Varianz der Abstände vermindert. Die Positionen der A-T-Peaks werden in Bezug auf die Positionen der G-C-Peaks verschoben, bis ein Grad der Versetzung gefunden ist, der ein Minimum der Varianz der Peak- zu-Peak-Abstände ergibt, wenn die Listen der G-C- und A-T-Peaks kombiniert werden. Unter Verwendung der so bestimmten Versetzungen wird ein neues Muster der A-T-Daten geschaffen und mit dem Muster der G-C-Daten ausgerichtet. Da die Versetzung von einem Block von 40 Peaks zum nächsten variierte, wird an jedem Datenpunkt ein linear interpolierter Versetzungs-Wert verwendet.
Um das Abrufen der Peaks zu erleichtern, werden die Daten normalisiert, d.h. die Daten werden skaliert, so daß identische mittlere Signal-Amplituden in allen vier Kanälen erhalten werden.
Das Abrufen der Basen beginnt mit dem ersten Peak in jedem der vier Muster und schreitet die Muster hinunter fort, jeweils einen Peak nach dem anderen. Sobald eine erwartete Position eines Peaks bestimmt wird, wie in dem Ablaufschema der Figur 4 gezeigt ist, wird um diese Position herum eine oszillierende Suche durchgeführt, bis ein Peak gefunden wird. Ein Peak wird durch das Kriterium des Kreuzens des Null-Wertes definiert, wie oben beschrieben ist. Wenn nur einer der vier Kanäle, A, C, G oder T einen Peak an dieser Position hat, wird die entsprechende Base abgerufen. Wenn zwei Kanäle einen Peak an derselben Stelle haben (was gewöhnlich auf ein Rauschen in einem der Kanäle zurückzuführen ist), wird die dem größten Peak entsprechende Base abgerufen.
Alternativ kann die zwei Spuren und zwei Farbstoffe einsetzende vorliegende Erfindung mit einer Primer-Markierung angewandt werden. In diesem Fall kann entweder die Sanger- oder die Maxam-Gilbert-Chemie zur Anwendung kommen. Wenn die Erfindung auf diese Weise eingesetzt wird, müssen vier Reaktionen, wie dies für Primer-Markierungen der Fall ist, statt deren zwei durchgeführt werden. Diese vier Reaktionen können jedoch so kombiniert werden, daß sie nur zwei Spuren auf dem Gel benötigen; z.B. können die G- und C-Töpfe und die A- und T-Töpfe kombiniert werden. Auf diese Weise kann der effiziente Einsatz von Gel-Raum und die Vereinfachung der Ausrichtung der Spuren noch immer genutzt werden, obwohl die Primer-Chemie angewandt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt eine genauere und größere Anzahl abgerufener Basen, als zuvor möglich gewesen ist.

BEISPIEL

Das folgende Beispiel erläutert das Prinzip der Zwei-Spuren- Zwei-Farbstoffe-Sequenzierung. In Wirklichkeit wurden vier Farbstoff-Terminatoren verwendet: ddg-SF505, dda-SF512, ddc-SF519 und ddt-SF526. Dies erlaubte die Verwendung von im Handel erhältlichen Terminator-Reagentien aus dem Genesis- System. Ein echtes Zwei-Farbstoffe-System könnte Farbstoff- Terminator-Kombinationen benutzen, deren Synthese in der Anmeldung von Prober et al. beschrieben ist, beispielsweise ddg-SF505, dda-SF505, ddc-SF519 und ddt-SF519, die diejenigen sind, die in den Genesis 1000-Kits kommerziell verfügbar sind. Die Proben in diesem Beispiel wurden in Paaren in einer Weise laufen gelassen und analysiert, die keine Unterscheidung des G-Farbstoffs von dem A-Farbstoff oder des C-Farbstoffs von dem T-Farbstoff beinhaltete. Aus diesem Grunde sollte deutlich sein, daß der Ersatz von SF512 durch SF505 und von SF526 durch SF519 die Ergebnisse nicht materiell beeinflußt.
Alle Reagentien waren kommerzielle Produkte der Biotechnology Systems Division, E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, außer in den bezeichneten Fällen. 3 ug M13mp18- Matrizen-DNA wurden für jede der drei Reaktionen, eine G-C-Reaktion, eine A-T-Reaktion und eine Kontrolle, verwendet. Jede Reaktionsmischung wurde mit 15 ng 17-mer-Universal-M13-Primer- Oligonucleotid (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') in Sequenase -Puffer (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH), einem Volumen von 21 ul, 2 min bei 95 ºC, um die Matrize zu denaturieren, und 10 min bei 37 ºC, um den Primer zu tempern, inkubiert. Dem G-C- Reaktionsrohr wurden dann 2,5 ul Dithiothreit, 3,0 ul von jeweils 75 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 0,5 ul eines Gemischs aus 1,12 uM ddGTP-F-fluoreszenz-markiertem G-Terminator und 8,96 uM ddCTP-F-fluoreszenz-markiertem C-Terminator zugesetzt. Dem A-T-Reaktionsrohr wurden dann 2,5 ul Dithiothreit, 3,0 ul von jeweils 75 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 0,5 ul eines Gemischs aus 3,36 uM ddATP-F-fluoreszenz-markiertem A-Terminator und 112 uM ddTTP-F-fluoreszenz-markiertem T-Terminator zugesetzt. Der Kontroll-Reaktion wurden alle vier Terminatoren zugesetzt. Jede Reaktion erhielt 0,5 ul Sequenase -T7-Polymerase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) und wurde 2 min bei 42 ºC inkubiert. Weitere 1,0 ul Sequenase wurden jeweils zugesetzt und weitere 5 min bei 42 ºC inkubiert. Nicht-eingebautes ddNTP-F wurde aus jeder Reaktion mit einer Sephadex G-50 Spin-Säule entfernt.
Die G-C-, A-T- und Kontroll-Reaktionsmischungen wurden dann in benachbarten Spuren aufgetragen und auf einem Genesis 2000- DNA-Analysensystem (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE) bei 18 W unter Verwendung eines 6-proz. Polyamid- Gels (Vernetzung 19 : 1) der Elektrophorese unterzogen. Daten wurden 10 h gesammelt und auf einem Macintosh II-Rechner (Apple Corp., Cupertino, CA) unter Benutzung des in Fig. 1 gezeigten Programms und des in Fig. 2 dargestellten Ablaufschemas analysiert.
Die mittels dieser Methode analysierten Daten ergaben 501 Basen der Sequenz-Information bei 97-proz. Genauigkeit und 3 nicht- eindeutigen Abrufen (kein Peak innerhalb des erwarteten Peak- Intervalls vorhanden). Die Kontroll-Reaktion wurde unter Verwendung von Software analysiert, die zusammen mit dem Genesis- 2000-DNA-Analysensystem (Version 3.0.2) geliefert wurde, und erzeugte 379 Basen bei 97-proz. Genauigkeit und 23 nicht-eindeutigen Abrufen. Somit wurde eine größere Menge an Information aus der Matrize durch Ausnutzung der Zwei-Spuren- Zwei-Farbstoffe-Methode erhalten.

Claims

1. Verfahren zur DNA-Sequenzierung zur Sicherung der Sequenz der vier Basen G, C, A und T, umfassend die Schritte des Herstellens eines ersten Satzes von DNA-Fragmenten mit Reporter-markierten Terminatoren für zwei der vier Basen, wobei jede Base einen anderen Reporter besitzt,

des Herstellens eines zweiten Satzes von DNA-Fragmenten mit Reporter-markierten Terminatoren für die übrigen zwei der vier Basen, wobei jede Base einen anderen Reporter besitzt,

des Trennens des betreffenden ersten Satzes und des betreffenden zweiten Satzes durch Gel-Elektrophorese,

des Erzeugens eines ersten Signals, dessen Amplitude variiert, für jeden der betreffenden Sätze zur Bildung von Peaks gemäß einer charakteristischen Eigenschaft des Reporters und der Geschwindigkeit, mit der eine Base sich durch das Gel bewegt,

des Erzeugens eines zweiten Signals, dessen Amplitude variiert, für jeden der betreffenden Sätze zur Bildung von Peaks gemäß einer charakteristischen Eigenschaft des Reporters und der Geschwindigkeit, mit der jeder sich durch das Gel bewegt hat, und

des Umwandelns des ersten Signals und des zweiten Signals in Signale, die den vier Basen in der Reihenfolge dieser Bewegung durch das Gel entsprechen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Satz der DNA- Fragmente G und C ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Satz und der zweite Satz in benachbarten Spuren auf dem Gel getrennt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das den Schritt des Ordnens der vier Basen-Signale gemäß ihrer Durchgangs-Geschwindigkeit durch das Gel umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, das den Schritt des Ordnens der vier Basen-Signale gemäß ihrer Durchgangs-Geschwindigkeit durch das Gel umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, worin der erste Satz und der zweite Satz in benachbarten Spuren auf dem Gel getrennt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, das den Schritt des Ordnens der vier Basen-Signale gemäß ihrer Durchgangs-Geschwindigkeit durch das Gel umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die für den ersten Satz verwendeten Reporter die gleichen sind wie die für den zweiten Satz verwendeten Reporter.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der erste Satz der DNA- Fragmente G und C ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Fragmente Terminatoren haben, die markiert sind.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Fragmente Primer haben, die markiert sind.