DE68905190T2

DE68905190T2 - Verfahren zur automatisierung der korrelation der im mikroskop beobachteten seriellen schichten.

Info

Publication number: DE68905190T2
Application number: DE89909202T
Authority: DE
Inventors: Christophe Bron; Didier Launay
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-07-27
Filing date: 1989-07-21
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2009-07-22
Also published as: EP0427776A1; US5241607A; DE68905190D1; WO1990001197A1; EP0427776B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Automatisierung der Berechnung von Verformungsfunktionen, die die Korrelation von seriellen Mikroskopie-Schnitten bei der Transmission-Elektronenmikroskopie und optischen Mikroskopie ermöglicht.
Die Biilderserien können auf fakultative und von dieser Erfindung unabhängige Weise entweder serienweise oder die einen bezüglich der anderen innerhalb einer selben Serie, unter Anwendung des in der Erfindung gemäß GB-A-2 046 940 beschriebenen Verfahrens bestimmt werden.
Die Korrelation der seriellen Schnitte wird herkömmlich durch Verschiebung der Bilder und Beurteilung des Bedieners durchgeführt. Diese Vorgehensweise ermöglicht es nicht, die Verformungen, die die mechanische Einwirkung der Schneidewerkzeuge auf die dünnen Schnitte ausübt, zu korrigieren.
Daher sind mehrere Verformungen mit den zur Sichtbarmachung der seriellen Schnitte in der Mikroskopie verwendeten Verfahren verbunden.
- eine Translation und eine Drehung, die durch das nicht genau reproduzierbare Ablegen der Schnitte nacheinander innerhalb der Träger-Gitter oder -Platten bedingt sind.
- Verformungen, die mit der mechanischen Einwirkung des Mikrotoms oder des Ultramikrotoms verbunden sind.
- eine systematische Drehung, die mit den verschiedenen Vergrößerungsstärken verbunden ist (im Falle eines Transmission- Elektronenmikroskops).
Der Stand der Technik, beschrieben in:
4.Kongreß "Reconnaissance des formes et intelligence artificiellelle", Paris (FR), 25.-27.Januar 1984, Band 1, AFCET; M.FORTIN: "Recalage d'images multisources", Seite 481-491, teilt die Verformungen zwischen zwei Bildern in zwei Kategorien ein: die Verformungen, bei denen ein polynomisches Gesamt-Modell an die Gesamtheit des Bildes angewandt werden kann, und die Verformungen, bei denen nur ein lokales Modell nach und nach angewandt werden kann.
Die vorliegende Erfindung behandelt die Verformung von Bildern der ersten Klasse, bei der ein polynomisches Modell des affinen Typs der ersten Ordnung mit 6 Parametern auf die Gesamtheit des Bildes angewandt werden kann.
Durch die Berechnung einer Rücktransformationsfunktion und die Erstellung einer festen Bezugsmarkierung, die von den vorher mechanisch oder durch Impulslaser-Beschuß erhaltenen Markierungen abgeleitet wird, ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren, zwischen zwei Bildern alle mit den Mikrosksopieverfahren verbundenen Verformungen zu korrigieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt nach dem Schritt der histologischen Präparierung, vor der Betrachtung im optischen Mikroskop oder im Transmission-Elektronenmikroskop.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt mehrere Stufen: (Siehe Fig.1)
1. "Markierung":
Das erfindungsgemäße Verfahren weist einen Schritt der Probenpräparation vor dem seriellen Ausschneiden auf (siehe Fig.2).
Man bohrt durch das mikroskopische Präparat (1) nahe der zu untersuchenden Bereiche 3 Löcher (2), die nicht geradlinig angeordnet sind und entweder mechanisch oder mittels eines Impulsionslasers gebohrt werden.
Die Zentren dieser Löcher (2) dienen als Bezugspunkte für die Erstellung einer festen Markierung und die spätere Berechnung der Rücktransformationsfunktionen der Schnitte bezüglich eines als nicht verformt betrachteten Bezugsschnittes (beispielsweise eines dicken Schnittes).
2: "Serieller Schnitt"
Das erfindungsgemäße Verfahren nimmt den herkömmlichen Schritt der seriellen Schnitte (4) auf, nämlich der Präparierung mittels eines Mikrotomes zur Sichtbarmachung der Schnitte im optischen Mikroskop und mittels eines Ultramikrotomes zur Sichtbarmachung der Schnitte mittels eines Elektronenmikroskops (siehe Fig. 3).
3: "Erfassung und Digitalisierung":
Das erfindungsgemäße Verfahren weist die Schritte der Betrachtung im optischen Mikroskop oder im Transmission- Elektronenmikroskop auf, sowie die der Erfassung, Digitalisierung, Speicherung und Verarbeitung der Bilder durch ein Informatik-System. Für ein zu untersuchendes Bild werden 3 Bilder erfaßt: (siehe Fig.4)
Bild A: das zu untersuchende Bild.
Bild B: ein bei einer schwächeren Vergrößerung ohne Bewegung des Objektträgers (3) erhaltenes Bild, das zumindest eines der Markierungslöcher (2) sichtbar macht.
Bild C: Ein Bild in der selben Vergrößerung wie Bild B, das alle Markierungslöcher (2) sichtbar macht.
4. "Normierung":
Ein Normierungsschritt durch numerische Verarbeitung aller Bilder A der zu untersuchenden Schnitte ermöglicht es, eine gleichmäßige Information bezügl. des Kontrastes und der Verteilung der Graustufen der Bilder zu erhalten. Die Histogramme der Graustufen der Bilder werden hinsichtlich ihres Mittelwertes und ihrer Varianz normiert.
Die Verstärkung erfolgt durch Staffelung des Histogrammes. Spezifische mathematische Funktionen werden für die Arbeiten auf den Histogrammen verwendet (Verbesserung und Stabilisierung).
5. "Berechnung der Rücktransformation":
Das erfindungsgemäße Verfahren weist einen Schritt der Berechnung der Rücktransformationsfunktionen auf, der es nach und nach von einem ersten als Bezug betrachteten Schnitt ausgehend ermöglicht, einen für alle Schnitte festen Bezug zu erstellen. Man verfährt wie folgt:
5.1. Die automatische Berechnung der Translation zwischen den Bildern B und C, die aufweist:
5.1.1. Die automatische Erfassung der Löcher (2) durch Bild- Analyse-Verfahren (Schwellenverfahren) auf den Bildern B und C.
5.1.2. Berechnung der Zentren der Löcher (2) des Bildes C.
5.1.3. Berechnung der Zentren des Loches/der Löcher des Bildes B.
5.1.4. Übereinanderlagerung der entsprechenden Zentren.
5.1.5. Berechnung der erforderlichen Translation zwischen den 2 Bildern durch Berechnung des Abstandes der 2 Zentren auf den jeweiligen Bildern.
5.2.Berechnung der Drehung und der Verformung (siehe Fig.5)
Diese beiden Funktionen sind auf das laufende Bild A bezüglich des Bezugsbildes A anzuwenden. Sie ermöglichen die automatische virtuelle Registrierung der Serie der Bilder A.
5.2.1. Berechnung der Drehung.
Die Berechnung der Drehung wird durch die Winkelsumme der mit dem Funktionieren des Gerätes verbundenen, für jede Vergrößerung spezifischen Drehung und der mit der zufälligen Ausrichtung des Schnittes im Objektträger (3) des Mikroskopes verbundenen Drehung erhalten. Die mit dem Gerät verbundene Funktion ist im voraus gegeben, die der Position des Schnittes wird abhängig von der Ausrichtung der Löcher (2) im Bild C berechnet.
5.2.2.Berechnung der Verformung:
In Kenntnis der Position der Löcher (2) vor dem Ausschneiden und ihrer jeweiligen Abstände, verwendet die Berechnung der auf die nacheinanderfolgenden Bilder anzuwendenden Rückverformungen zur Registrierung der Löcher (2) und folglich der ihnen zugeordneten Bilder ein an die Gesamtheit des Bildes angewandtes Matrizenmodell, das bereits bei den vorherigen Stufen erprobt wurde und das bis hierhin ausreichend bleibt, namlich:
eine affine Transformation erster Ordnung mit 6 Parametern.
6. "Registrierung":
Ein Registrierungsschritt der Bilder wird erhalten durch numerische Verarbeitung unter Anwendung auf die Bilder A der Folge von Transformationsfunktionen sowie der bei dem vorhergehenden Schritt 5 beschriebenen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren berechneten Drehungen und Translationen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet für die Rekonstruktion von dreidimensionaler Information, ausgehend von im Transmission-Elektronenmikroskop oder optischen Mikroskop beobachteten seriellen Schnitten (4).
Die Information kann anschließend unter Verwendung aller Verfahren zur numerischen Verarbeitung der Bilder verwertet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, die Ermittlung von Bereichen von einem Schnitt auf den anderen innerhalb von mittels Transmission-Elektronenmikroskopen betrachteten serieIlen Schnitten zu automatisieren, deren Verschiebungen der Objektträgerplatte und Steuerparameter computergesteuert sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, die Ermittlung von Bereichen von einem Schnitt auf den anderen innerhalb von mittels optischen Mikroskopen betrachteten seriellen Schnitten zu automatisieren, deren Verschiebungen der Objektträgerplatte und Steuerparameter computergesteuert sind.

Claims

1. Verfahren zur Korrelation von im Mikroskop (Transmission-Elektronenmikroskop oder optisches Mikroskop) beobachteten seriellen Schnitten (4), gekennzeichnet durch:

a) eine Markierung der Präparate vor dem Zuschneiden, wobei diese Markierung aus einer Anzahl von 3 Löchern (2) besteht, die mechanisch oder durch Impulslaser-Beschuß so nahe wie möglich zu den zu untersuchenden Bereichen hergestellt werden;

b) eine Erfassung, Digitalisierung und Speicherung einer Anzahl von 3 Bildern pro Schnitt, nämlich

- des zu untersuchenden Bildes (Bild A);

- eines Bildes von geringerer Vergrößerung desselben Schnittes in der gleichen Position wie bei Bild A, und das mindestens eines der Löcher (2) der Markierung enthält (Bild B);

- eines Bildes in derselben Vergrößerung wie bei Bild B, in welchem aber alle Löcher (2) der Markierung sichtbar gemacht sind (Bild C);

c) die Positionsbestimmung - durch numerische Analyse der Bilder - der Zentren der Markierungslöcher (2) der Bilder B und C und die Berechnung ihrer relativen Positionen zur Mitte jedes Bildes C;

d) die Berechnung einer Rücktransformationsfunktion der Position der Zentren der Markierungslöcher (2) für jeden Schnitt, welche alle Verformungen und Verschiebungen korrigiert und aus Translationen, Rotationen und einer Transformation, insbesondere einer affinen Transformation erster Ordnung mit 6 Parametern zusammengesetzt ist;

e) eine Normierung der Bilder A im Kontrast und Verteilung der Graustufen durch numerische Verarbeitung der Bilder;

f) eine Registrierung - oder eine Korrelation - der Serie der Bilder A durch numerische Verarbeitung der Bilder, wobei die Rücktransformationsfunktionen, die nach der unter d) beschriebenen Weise bestimmt werden, Anwendung finden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur automatischen Positionierung auf einem vorgegebenen Bereich serieller Schnitte (4) angewandt wird, mit einem Photonenstrahl im Falle eines optischen Mikroskops, und mit einem Elektronenstrahl im Falle eines Transmission-Elektronenmikroskops, bei dem die Bewegungen der Objektträgerplatte und die Steuerparameter computergestützt sind.