-
Die
vorliegende Erfindung betrifft In-vivo-Verfahren zum Messen des
Bindens von chemischen Aktivstoffen, insbesondere Tensiden, an Haut
und vor allem Proteinen in der Haut.
-
In-vivo-
und Ex-vivo-Verfahren zum Messen des Bindens von Chemikalien, hauptsächlich Tensiden, an
der Haut sind bekannt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise
das Anwenden einer stark absorbierenden oder lumineszierenden Sonde/eines
stark absorbierenden oder lumineszierenden Markers entweder vor oder
nach einer Behandlung mit einer Lösung der chemischen Verbindung
oder Gemisch von Verbindungen, die in Frage kommen, und anschließend Messen
der Intensität
der Absorption oder Lumineszenz auf der Haut.
-
In „Cumulative
Effect of Surfactants an cutaneous horny layers: Absorption onto
human keratin layers in vivo",
G. Imokawa und Y. Mishima, Contact Dermatitis 5 (6), Seiten 357–366 (1979),
wird vorgeschlagen, dass das Absorptionsvermögen von der Sonde/dem Marker,
die nach Behandlung aufgetragen werden, ein Maß für den Grad der Bindung durch
Tenside ist. Es wird argumentiert, dass wenn Tenside während der
Behandlung an die Haut binden, sie potenzielle Bindungsstellen für die Sonde/den
Marker blockieren. Folglich binden weniger Sonden-/Markermoleküle an die
Haut, was zu einer weniger intensiven Farbe führt, als beobachtet wird, wenn
die Sonde/der Marker ohne Behandlung aufgetragen wird. Jedoch können die
Autoren keine näheren
Angaben darüber
machen, was die speziellen Bindungsstellen sind, d. h., welche Bestandteile
der Haut die Sonde/den Marker binden.
-
In „Interactions
of cleansing bars with stratum corneum Proteins: An in vitro fluorescence
spectroscopic study",
S. Mukherjee et al., J. Soc. Cosmet. Chem. 46 (1995), Seiten 301–320, wird
eine proteinbindende fluoreszierende Sonde/ein proteinbindender
fluoreszierender Marker auf menschliche und Schweinehaut ex vivo
vor der Behandlung mit verschiedenen Tensidlösungen aufgetragen. Anschließend wird
das Fluoreszenzspektrum der Sonde/des Markers aufgenommen und die
partielle Verdrängung
der Sonde/des Markers durch Tenside wird durch das Verhältnisnehmen
von der Fluoreszenzintensität
von der Sonde/dem Marker zu jenem der Tryptophanrückstände der
Hautproteine berechnet.
-
Jedoch
werden keine Veränderungen
in der Spektralform des Fluoreszenzspektrums der Sonde/des Markers
selbst beobachtet. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht offenbart.
-
In „Pyranine,
a fluorescent dye, detects subclinical injury to sodium lauryl sulphate", A. Pagnoni et al., J.
Cosmet. Sci. 49 (1998), Seiten 33 bis 38, wird eine Fluoreszenzsonde/-marker,
8-Hydroxyl-1,3,6-pyrintrisulfonsäure
(Pyranin), in vivo nach Behandlung aufgetragen. Es wird beobachtet,
dass wenn Haut Natriumlaurylsulfat (SLS), ein anionisches Tensid,
für 24
Stunden ausgesetzt wird, eine viel stärkere Fluoreszenz zu beobachten
ist, als wenn die Sonde ohne jegliche Vorbehandlung aufgetragen
wird.
-
Gemäß der Argumentation,
die in der vorangehend erwähnten
Arbeit verwendet wird, sollte das Binden von SLS an die Haut zu
einer Senkung in der Fluoreszenz führen. Die Tatsache, dass die
Fluoreszenz sinkt anstatt sich zu erhöhen, lässt vermuten, dass die 24-Stunden-Behandlung
die Sperrfunktion der Haut vermindert unter somit Aussetzen von
weiteren Bindungsstellen der Fluoreszenzsonde/dem -marker. Dies
wird durch transepidermale Wasserverlustmessungen gestützt.
-
Del
Pozo et al. in Ciencia Y Technologia Pharmaceutica (11(3) 2001,
Seiten 140 bis 144) offenbaren ein In-vivo-Verfahren zum Messen der Mildheit/Schärfe von
einem Tensid durch zuerst Auftragen des infrage kommenden Tensids
auf die Haut, gefolgt von Behandlung mit Pyranin durch die Visuali sierung
und Messung der Fluoreszenz durch Bestrahlung bei 365 nm.
-
Sauermann
et al. offenbart in dem Journal Soc. Cosmet. Chem (37(5) (1986),
Seiten 309 bis 327) ein In-vivo-Verfahren
zum Bewerten des Reizvermögens
von Seifen durch Messen der Absorption von einem kationischen Farbstoff
nach Auftragung von Tensiden oder Seifenriegeln.
-
Pagoni
et al. offenbart in dem Journal of Investigative Dermatology (108(4)
1997, Seite 674) die Verwendung von Pyranin als Fluoreszenzfarbstoff
in vivo zum Bewerten von Hautschädigung
mit Waschmitteln. Die Hautschädigung
wird durch Fluoreszenzfotografieren an einer bestimmten Stelle visualisiert.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein In-vivo-Verfahren zum Messen
des Bindens von chemischen Verbindungen, insbesondere Tensiden und
vor allem Tensiden aus Reinigungsmitteln, an Haut und insbesondere an
Proteinen in der Haut.
-
Die
vorliegende Erfindung offenbart eine spezielle Ausführungsform
für eine
In-vivo-Messung.
-
In
der Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird der Grad des Bindens eines Tensids
an der Haut nach Auftragung von einem Reinigungsprodukt durch Auswählen eines
gewünschten
Flecks auf dem Körper
einer Person; Waschen der Haut mit dem infrage kommenden Produkt;
Auftragen einer gewünschten Menge
einer fluoreszierenden Sonde/eines fluoreszierenden Markers (zum
Beispiel Pyranin) und Gewinnen eines Fluoreszenzspektrums des Bereichs
der fluoreszierenden oder absorbierenden Sonde, die auf die Haut aufgetragen
wurde, zum Beispiel durch Anwenden einer faseroptischen Sonde/eines
faseroptischen Markers, und Berechnen des Verhältnisses der Fluoreszenzintensität oder des
Absorptionsvermögens
der Sonde/des Markers auf Haut bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen.
-
Insbesondere
umfasst die Erfindung ein In-vivo-Verfahren zum Messen der Bindungsaffinität von Chemikalien,
insbesondere Tensiden, die entweder reine Tenside oder Tenside aus
Reinigungsmittelformulierungen sein können, auf die Haut und vor
allem auf Proteine in der Haut. Das Verfahren umfasst:
- 1. Auswählen
einer gewünschten
Stelle, typischerweise 5,08 cm × 10,16
cm (2'' × 4''),
jedoch kann die Stelle auf dem Körper
einer Person entweder kleiner oder größer sein;
- 2. Aussetzen der Körperstelle
der Chemikalie oder Formulierung von Interesse. Das Aussetzen der
Chemikalie kann auf jede gewünschte
Art ausgeführt
werden. Im Fall von Tensiden oder Reinigungsformulierungen beinhaltet
das Aussetzen typischerweise Waschen der Haut mit dem Tensid oder
der Reinigungsmittelformulierung;
- 3. Auftragen der Sonde/des Markers auf eine Fläche innerhalb
der Stelle, die der chemischen Formulierung ausgesetzt wurde, typischerweise
einer kreisförmigen
Fläche
von 1,27 cm (0,5'' Durchmesser), jedoch
kann die Fläche
jede Form oder Größe aufweisen,
vorausgesetzt, sie überlappt
vollständig
mit der Stelle, die in Schritt 2 behandelt wurde;
- 4. Untersuchen eines Lumineszenz- oder Absorptionsspektrums
der Fläche
der Haut, auf die die Sonde/der Marker aufgetragen wurde;
- 5. Bestimmen der Bindungsaffinität der chemischen Verbindung
auf einen speziellen Bestandteil der Haut, zum Beispiel Hautprotein,
zum Beispiel durch Berechnen des Verhältnisses der Fluoreszenzintensität oder des
Absorptionsvermögens
bei verschiedenen Wellenlängen
oder durch Messen einer beliebigen Änderung in dem Spektrum von
der Sonde/dem Marker außer
seiner Amplitude.
-
Die
Erfindung wird nun nur mithilfe von Beispielen mit Bezug auf die
beigefügten
Zeichnungen beschrieben, worin:
-
1 ein
Fluoreszenzspektrum von Pyranin in 50 mm Hepes-Puffer, enthaltend
2,5 mg/ml BSA (gestrichelte Linie) auf menschlicher Haut, wenn örtlich aufgetragen
(gepunktete Linie), enthält;
-
2 gibt
das Fluoreszenzspektrum von Pyranin in 50 mm Hepes-Puffer (durchgezogene
Linie), in 50 mm Hepes- Puffer,
enthaltend 2,5 mg/ml BSA (gestrichelte Linie), und in 50 mm Hepes-Puffer,
enthaltend 2,5 mg/ml BSA und 4 × 10–5 Gewichtsfraktion
STS (gepunktete Linie), an;
-
3 gibt
das Fluoreszenzspektrum von Pyranin an, wenn örtlich auf die Haut ohne jegliche
Vorbehandlung (durchgezogene Linie) aufgetragen und wenn nach einem
zweiminütigen
Waschen mit einem scharfen Seifenriegel aufgetragen (gestrichelte
Linie);
-
4 gibt
die Fluoreszenzspektren von Pyranin an, wenn örtlich auf die Haut nach Waschen
mit einem milden Syndetriegel (durchgezogene Linie) aufgetragen
und nach Waschen mit einem scharfen Seifenriegel (gestrichelte Linie),
und
-
5 gibt
das Ergebnis einer klinischen Pilotstudie an. Gezeigt wird der Unterschied
zwischen dem Grundlinienfluoreszenzspektrum (keine Behandlung) und
dem Spektrum nach einer Seifenwäsche,
wie durch den Unterschied in dem Verhältnis der maximalen Fluoreszenzintensität und der
Intensität
bei 460 nm quantifiziert. Jeder Riegel gibt die Anzahl an Personen
wieder.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein In-vivo-Verfahren zum Messen
der Fähigkeit
von Chemikalien, insbesondere von Tensiden und vor allem von Tensiden,
die aus Reinigungsmittelformulierungen aufgetragen wurden, um spezielle
Bestandteile der Haut, zum Beispiel Proteine oder Lipide, zu binden.
Das Verfahren ist auch ex vivo anwendbar. Das Verfahren kann als
ein schnelles und leichtes Assay zum Bestimmen der Mildheit von
Reinigungsmittelformulierungen verwendet werden.
-
Insbesondere
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Messen der Fähigkeit
von Chemikalien, um an Proteine in der Haut in vivo zu binden, bereit,
umfassend:
- 1. Auswählen einer gewünschten
Stelle, typischerweise 2'' × 2'',
auf dem Körper
einer Person;
- 2. Aussetzen der Stelle der chemischen Verbindung, die in Frage
kommt, in dem Fall von Tensiden oder Reinigungs formulierungen typischerweise
durch Waschen der Stelle für
einen ausgewählten
Zeitraum/Menge;
- 3. Auftragen der lumineszierenden oder absorbierenden Sonde/des
lumineszierenden oder absorbierenden Markers, zum Beispiel Pyranin,
oder einer beliebigen anderen Sonde/eines beliebigen anderen Markers,
die/der ein anderes Lumineszenz- oder Absorptionsspektrum in Abhängigkeit
von ihrer/seiner Mikroumgebung innerhalb der Haut zeigt, typischerweise
in Ethanol oder Wasser gelöst,
auf typischerweise kreisförmiger
Fläche,
ungefähr
1,26 cm (0,5'') im Durchmesser;
- 4. Untersuchen eines Lumineszenz- oder Absorptionsspektrums
des Bereichs der Haut, auf den die Sonde/der Marker aufgetragen
wurde, zum Beispiel durch Anwenden einer faseroptischen Sonde/eines
faseroptischen Markers;
- 5. Bestimmen der Bindungsaffinität von der chemischen Verbindung
an einem bestimmten Bestandteil der Haut, zum Beispiel Hautprotein,
durch Berechnen des Verhältnisses
der Fluoreszenzintensität
oder des Absorptionsvermögens
bei zwei verschiedenen Wellenlängen
oder durch Messen von jeglicher Veränderung in dem Spektrum von
der Sonde/dem Marker, außer
seiner Amplitude.
-
Jeder
der Verfahrensschritte wird nachstehend genauer und in den Beispielen
erörtert.
-
Wie
ausgewiesen, ist es der erste Schritt in dem In-vivo-Verfahren zum Bestimmen der Bindungsaffinität von chemischen
Verbindungen an bestimmte Bestandteile der Haut gemäß der vorliegenden
Erfindung, einen gewünschten
Fleck, der für
Messungen geeignet ist, auf der Person auszuwählen.
-
Das
Verfahren ist auf jede Körperstelle
anwendbar, die mit der chemischen Verbindung, deren Binden zu messen
ist, behandelt werden kann. Beschränkungen in der Größe der ausgewählten Stelle
werden nur durch das Verfahren des Aussetzens der chemischen Verbindung
bestimmt. Wenn zum Beispiel die infrage kommende Verbindung ein
Tensid ist und es durch Waschen der Körperstelle mit dem Tensid aufgetragen
wird, würde
es nicht praktisch sein, eine Fläche
kleiner als etwa 1,26 cm × 1,26
cm (0,5'' × 0,5'')
in der Größe auszuwählen. Wenn
das Verfahren des Aussetzens es jedoch erlaubt, kann eine Körperstelle
mit viel kleineren Abmessungen ausgewählt werden.
-
Es
gibt keine obere Grenze für
die Größe der auszuwählenden
Körperstelle.
Wenn man zum Beispiel wünscht,
das Binden einer Reinigungsformulierung auf der Haut zu messen,
kann der ganze Körper
der Person gewaschen werden und anschließend kann das Binden bei verschiedenen
Stellen an dem Körper
gemessen werden (siehe den zweiten Schritt).
-
In
dem zweiten Schritt der Erfindung wird die Körperstelle, die in dem ersten
Schritt ausgewählt
wurde, der chemischen Verbindung oder Gemisch von Verbindungen ausgesetzt,
von der/dem das Binden gemessen werden soll.
-
Es
gibt keine Beschränkungen
hinsichtlich des Verfahrens, durch das die chemische Verbindung
der Haut ausgesetzt werden soll, oder der Dauer der Aussetzung,
außer,
dass sie vernünftigerweise
in vivo aufgetragen werden kann. Wenn das Verfahren ex vivo aufgetragen
wird, gibt es keine Begrenzungen hinsichtlich des Verfahrens oder
der Dauer der Aussetzung. Typische Verfahren zur Aussetzung können durch
Einweichen der Haut mit der Verbindung oder Gemisch von Verbindungen
von Interesse sein, Reiben der Haut mit der Verbindung und insbesondere
im Fall von Tensiden oder Reinigungsmittelformulierungen Waschen
der Haut.
-
In
dem dritten Schritt der Erfindung wird die lumineszierende oder
optisch absorbierende Sonde/der lumineszierende oder optisch absorbierende
Marker auf die Fläche
aufgetragen, die der chemischen Verbindung(en) in dem zweiten Schritt
ausgesetzt wurde.
-
Die
Sonde/der Marker, die/der aufgetragen wird, kann jede Sonde/jeder
Marker sein, die/der Unterschiede in ihrem Lumineszenz- oder Absorptionsspektrum
zeigt, außer
der Amplitude, in Abhängigkeit
von ihrer Mikroumgebung innerhalb der Haut. Pyranin ist eine fluoreszierende
Sonde/ein fluoreszierender Marker, das sowohl in einem protonierten
als auch deprotonierten Zustand fluoreszieren kann. Jeder Zustand
fluoresziert bei anderen Wellenlängen.
Die Fluoreszenz von dem protovierten Zustand hat Peaks zwischen
430 nm und 460 nm, während
die Fluoreszenz von dem deprotonierten Zustand bei 510 nm Peaks
hat. Das Verhältnis der
Fluoreszenzintensitäten
von den zwei verschiedenen Zuständen
ist stark von der Mikroumgebung des Moleküls abhängig.
-
Zum
Beispiel ändert
sich das Fluoreszenzspektrum von Pyranin stark, wenn es an Proteine
gebunden ist, wie in Beispiel 1 erläutert wird. Dies macht Pyranin
zu einer bevorzugten Sonde/einem bevorzugten Marker zum Messen des
Bindens von chemischen Verbindungen an Hautproteine, wie in Beispiel
3 erläutert.
Verschiedene Sonden/Marker können
zum Messen des Bindens von Chemikalien an Bestandteile der Haut,
die von Protein verschieden sind, verwendet werden. Zum Beispiel
würde eine
Sonde/ein Marker, die/der in ihrem/seinem Lumineszenz- oder Absorptionsspektrum
eine Veränderung
zeigt, wenn es in einer flüssigen
Umgebung vorliegt, ein Kandidat sein, um das Binden von Chemikalien
an Hautlipide zu messen. In-vitro-Lumineszenz- oder -Absorptionsspektren
können
genommen werden, um die bevorzugte Mikroumgebung von einer Sonde/einem
Marker zu bestimmen (siehe Beispiel 2).
-
Es
gibt keine Beschränkungen
hinsichtlich des Verfahrens, durch das die Sonde/der Marker auf
die Haut aufgetragen wird, oder hinsichtlich der Dauer der Auftragung,
außer,
dass sie/er vernünftigerweise
in vivo aufgetragen wird. Wenn das Verfahren ex vivo aufgetragen
wird, gibt es keine Beschränkungen
in dem Verfahren oder der Dauer der Aussetzung. Typischerweise würde sie örtlich auf
die Sonde aus der Lösung,
zum Beispiel gelöst
in Alkohol oder Wasser, auf eine kreisförmige Fläche von ungefähr 1,26
cm (0,5'') im Durchmesser
aufgetragen werden. Es gibt keine Beschränkungen hinsichtlich der Größe der Fläche, auf
die die Sonde/der Marker zu dem anderen aufgetragen wird, außer, dass
sie in den Bereich fallen sollte, der den chemischen Verbindungen
im zweiten Schritt ausgesetzt wurde. In einigen Fällen kann
es erwünscht
sein, einen relativ großen
Bereich in dem zweiten Schritt zu exponieren, zum Beispiel durch
Waschen des gesamten Vorderarms und dann anschließend Auftragen
der Sonde/des Markers auf verschiedene kleinere Flächen innerhalb
der größeren Fläche, die
der chemischen Verbindung ausgesetzt wurde.
-
In
dem vierten Schritt der Erfindung wird ein Lumineszenz- oder Absorptionsspektrum
von der Sonde/dem Marker auf der Haut erhalten. Typischerweise werden
diese Spektren mit einem Fluorometer (Fluoreszenzsonde/-marker)
oder einem Spektrophotometer (für
absorbierende Sonde/absorbierenden Marker) aufgenommen. Es ist wichtig,
dass die Fläche
der Haut, die durch die Messung abgedeckt wird, gleich oder kleiner als
die Fläche
ist, auf die die Sonde/der Marker in dem dritten Schritt aufgetragen
wurde. Dies kann typischerweise durch Anwenden einer faseroptischen
Sonde/eines faseroptischen Markers erreicht werden, um die Haut
mit dem angeregten Licht zu beleuchten und das erhaltene Fluoreszenzlicht
zu sammeln (für
Fluoreszenzsonde/-marker) oder durch Anwenden des einfallenden Lichts
und Sammeln des reflektierten Lichts (für absorbierende Sonde/absorbierenden
Marker).
-
In
dem fünften
Schritt der Erfindung wird das Spektrum, das in dem vierten Schritt
gemessen wird, analysiert, um das Binden der chemischen Verbindung
oder des Gemisches von Verbindungen, die in dem zweiten Schritt
aufgetragen wurde, zu bestimmen. Zum Beispiel kann dies durch Nehmen
des Verhältnisses der
Fluoreszenzintensität
oder Absorption bei verschiedenen Wellenlängen in dem Spektrum erfolgen
oder durch Bestimmen der Wellenlänge
der maximalen Fluoreszenzintensität oder des Absorptionsvermögens bzw. der
Extinktion.
-
Ausgenommen
in den Arbeits- und Vergleichsbeispielen oder wo anders explizit
ausgewiesen, sind alle Zahlen in dieser Beschreibung, die Mengen
oder Verhältnisse
von Materialien oder Zuständen
oder Reaktion, physikalische Eigenschaften von Materialien und/oder
Anwendung anzeigen, als durch das Wort „etwa" modifiziert zu verstehen.
-
Wenn
in der Beschreibung verwendet, ist der Begriff „umfassend" vorgesehen, das Vorliegen von ausgewiesenen
Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten einzuschließen, jedoch
nicht das Vorliegen oder die Zugabe von einem oder mehreren Merkmalen,
ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten oder Gruppen davon auszuschließen.
-
Die
nachstehenden Beispiele sind zur weiteren Erläuterung der Erfindung vorgesehen
und sind nicht vorgesehen, die Erfindung in irgendeiner Weise zu
begrenzen.
-
Sofern
nicht anders ausgewiesen, sind alle Prozentangaben als Gewichtsprozentsätze vorgesehen.
-
METHODOLOGIE
-
Ausrüstung
-
Fluoreszenzspektren
von Pyranin in Lösungen
und auf Haut wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer-LS50B-Fluorometers
erhalten. Im Fall, dass die Spektren auf der Haut genommen wurden,
wurde die faseroptische Sondenbewertung angewendet.
-
EXPERIMENTELLES VERFAHREN
-
In-vitro-Versuche:
-
Alle
Spektren wurden bei Pyranin-Konzentrationen von 1,0 × 10–8 M
in 50 mM Hepes-Puffer (wässrige Pufferlösung mit
pH 6,7) genommen. Rinderserumalbumin(BSA)-Konzentrationen waren
2,5 mg/ml. Tensid wurde bei Gewichtsfraktionen von 4 × 10–8 zugegeben.
-
In-vivo-Versuche
-
Eine
Fläche
auf dem Handvorderarm, ungefähr
4'' × 2'' in
der Größe, wurde
mit entweder einem Dove®- oder einem Ivory®-Seifenriegel
für 2 Minuten
gewaschen. Die Haut wurde anschließend mit Leitungswasser für 10 Sekunden
gespült
und anschließend
trockengetupft. 100 μl
einer 10000-ppm-Lösung
von Pyranin in Ethanol wurde auf eine kreisförmige Fläche von 1,26 cm (0,5'') Durchmesser in der Mitte der Fläche, die
gewa schen wurde, aufgetragen. Die faseroptische Sonde/der faseroptische
Marker wurde in der Mitte der kreisförmigen Fläche angeordnet und das Lumineszenzspektrum
wurde erhalten.
-
BEISPIEL 1
-
Abhängigkeit
des Pyranin-Fluoreszenzspektrums von der Mikroumgebung
-
1 zeigt
Fluoreszenzspektren von Pyranin in drei verschiedenen Umgebungen,
gelöst
in einem wässrigen
Puffer, gelöst
in dem gleichen Puffer mit zugegebenem Protein (BSA) und auf menschlicher
Haut in vivo.
-
Das
Spektrum in wässrigem
Puffer zeigt eine intensive Bande in der Mitte bei rund 510 nm.
Diese Bande entspricht dem deprotonierten Zustand, wie früher erörtert wurde.
Zusätzlich
kann eine geringere Bande, rund 425 nm, beobachtet werden, die aus
dem protonierten Zustand erwächst.
Wenn BSA zugegeben wird, können
die gleichen Banden in dem Spektrum beobachtet werden, jedoch mit
stark verschiedenen relativen Intensitäten. Die Veränderung
in den relativen Intensitäten
von den zwei Banden ergibt sich aus dem Binden von Pyranin an das
Protein.
-
In
dieser verschiedenen Mikroumgebung ist die Fluoreszenz von der deprotonierten
Form von Pyranin weniger bevorzugt als in freier Lösung. Das
Fluoreszenzspektrum von Pyranin auf der Haut zeigt auch deutlich mehrfache
Banden. Die Fluoreszenz von dem protonierten Zustand ist rot verschoben,
bezogen auf das freie Lösungsspektrum,
und hat deutlich mehr Intensität.
Die Fluoreszenz von dem deprotonierten Zustand scheint nicht signifikant
bezüglich
des freien Lösungsspektrums
verschoben zu sein. Die höhere
relative Intensität
der Fluoreszenz aus dem protonierten Zustand lässt vermuten, dass örtlich aufgetragenes
Pyranin an Hautproteine bindet.
-
BEISPIEL 2
-
Die Wirkung von Tensiden auf das Spektrum
von Pyranin in Proteinlösung
-
Um
die Anwendbarkeit von Pyraninfluoreszenz zum Verfolgen des Bindens
von Tensiden an Proteinen zu testen, untersuchten die Anmelder die
Wirkung von zugesetztem Tensid auf das Fluoreszenzspektrum von wässrigen
Lösungen
von Pyranin und BSA. 2 zeigt, wie die Zugabe von
Natriumdodecylsulfat (SDS) eine signifikante Erhöhung der relativen Intensität der Fluoreszenz
von dem deprotonierten Zustand ergibt. Diese Wirkung kann durch
den Austausch von Pyranin-Molekülen, die
durch SDS-Moleküle
an BSA gebunden sind, was zu einer erhöhten Konzentration an Pyranin
in freier Lösung
und deshalb zu einer relativen Erhöhung der Intensität der Fluoreszenz
von dem deprotonierten Zustand führt,
erklärt
werden. Das Verhältnis
von den Fluoreszenzintensitäten
von dem deprotonierten und protonierten Zustand ist ein Maß der Fähigkeit
von einem Tensid, Pyranin von den BSA-Bindungsstellen zu ersetzen.
Nachstehende Tabelle 1 zeigt dieses Verhältnis für eine Anzahl von Tensiden,
wenn zu einer Pyranin-BSA-Lösung bei
gleichen Gewichtsfraktionen gegeben.
-
Es
wird aus Tabelle 1 deutlich, dass Tenside die dafür gut bekannt
sind, dass sie für
die Haut scharf sind, wie SDS, ein höheres Verhältnis als bekannte mildere
Tenside, wie Alkylpolyglykosid (APG), aufweisen, was vermuten lässt, dass
die Schärfe/Mildheit
von Tensiden zumindest z. T. durch deren Affinität auf Proteinbindungsstellen
bestimmt wird. Tabelle 1
| System | 509
nm | 426
nm |
| Pyranin | 8,03 |
| Pyranin
+ BSA + SDS | 2,23 |
| Pyranin
+ BSA + Natriumlaurat | 2,13 |
| Pyranin
+ BSA + Natriumlaurylethersulfat | 2,12 |
| Pyranin
+ BSA + Cocamidopropylbetain | 1,56 |
| Pyranin
+ BSA + APG | 1,34 |
| Pyranin
+ BSA | 1,17 |
-
BEISPIEL 3
-
Die Wirkung von einer Seifenwäsche auf
das Fluoreszenzspektrum von Pyranin auf der Haut
-
3 zeigt
zwei Fluoreszenzspektren von Pyranin auf Haut, eines, wo Pyranin
ohne irgendeine Vorbehandlung aufgetragen wurde, und eines, wo Pyranin
nach einer zweiminütigen
Armwäsche
mit einem scharfen Seifenriegel aufgetragen wurde. Die Seifenbehandlung
führt zu
einer signifikanten Veränderung
in dem Fluoreszenzspektrum, insbesondere zu einer verminderten Intensität der Bande
um rund 450 nm. Die verminderte Intensität der Fluoreszenz von dem protonierten
Zustand ist am wahrscheinlichsten aufgrund des Bindens von Tensiden
aus dem Seifenriegel an Proteinbindungsstellen auf der Haut.
-
Wenn
Pyranin nach der Seifenwäsche
aufgetragen ist, werden einige potenzielle Bindungsstellen bereits
durch Tensidmoleküle
eingenommen und deshalb wird ein Teil der Sondenmoleküle übermäßig binden, was
zu einer Verminderung der Fluoreszenz von dem protonierten Zustand
führt.
Dieser Effekt ist signifikant vermindert, wenn ein milder Syndetriegel,
wie in 4 gezeigt, angewendet wird, was die Spektren nach
Waschen mit sowohl einem scharfen Seifenriegel als auch einem milden
Syndetriegel zeigt.
-
Der
Effekt einer Seifenwäsche
auf das Fluoreszenzspektrum von Pyranin auf der Haut kann durch Nehmen
des Verhältnisses
der Fluoreszenzintensität
bei einer Peakhöhe
und der Intensität
bei 460 nm quantifiziert werden und anschließend durch Differenznehmen
zwischen diesem Verhältnis
vor und nach dem Waschen mit dem Seifenriegel. 5 zeigt
die Ergebnisse einer klinischen Pilotstudie, die deutlich eine insgesamt stärkere Wirkung
für den
scharfen Seifenriegel zeigt.