DE60222669T2

DE60222669T2 - Asthma-assoziiertes gen

Info

Publication number: DE60222669T2
Application number: DE60222669T
Authority: DE
Inventors: Paul Andrew Novartis Hor Horsham WHITTAKER; Deborah Alexis c/o Wake For Winston Salem MEYERS; Dirkje Sjoukje c/o Univ. of POSTMA; Eugene Roland c/o Wake For Winston Salem BLEECKER
Original assignee: Novartis AG; Rijksuniversiteit Groningen; Wake Forest University Health Sciences
Current assignee: Novartis AG; Rijksuniversiteit Groningen; Wake Forest University Health Sciences
Priority date: 2001-07-16
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2022-07-16
Also published as: EP1409740A2; JP2004536603A; JP4428478B2; US20030096270A1; EP1409740B1; WO2003008640A3; US7122311B2; ATE374260T1; WO2003008640A2; PT1409740E; ES2295388T3; AU2002325328A1; DE60222669D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Asthma-assoziierten Gens, das als AAGA bezeichnet wird, das durch AAGA kodierte Proteinmolekül und verwandte Moleküle bei diagnostischen und prognostischen Screenings von Patientenpopulationen, Polymorphismen in AAGA und die Verwendung des durch AAGA kodierten Proteins oder eine Variante hiervon als therapeutisches Ziel.
Asthma ist eine sehr verbreitete Lungenerkrankung mit den folgenden Eigenschaften:
Atemwegsobstruktion – Diese ist gewöhnlich reversibel, aber oft progressiv
Chronisch bronchiale Entzündung – Ein Zustand, der durch Entzündungszellinfiltration und deren Aktivierung, Freisetzung von biochemischen Mediatoren und strukturellen Veränderungen (Atemwegsumbau) gekennzeichnet ist
Bronchiale Hyperreaktivität (BHR) – Eine übertriebene Bronchokonstriktionsreaktion gegenüber einer Vielzahl an immunologischen, biochemischen und physikalischen Stimuli
Asthma ist klinisch durch chronische, intermittierende Atemwegsobstruktion mit Giemen, Husten und Atemnot gekennzeichnet. Obwohl Asthma typischerweise mit einer obstruktiven Störung assoziiert ist, die reversibel ist, ist weder diese Feststellung noch jeder andere einzelne Test oder jede einzelne Maßnahme angemessen, um Asthma zu diagnostizieren [Guidelines for the diagnosis and development of asthma, 1997, NIH Publication Nr. 97-4051]. Viele Erkrankungen sind mit diesem Muster der Abnormalität assoziiert. Das Patientenmuster der Symptome (zusammen mit einer anderen Information aus der medizinischen Historie des Patienten) und der Ausschluss anderer möglicher Diagnosen sind ebenfalls erforderlich, um eine Diagnose von Asthma zu etablieren. Die klinische Beurteilung ist bei der Ausführung der Einteilung für Asthma erforderlich. Patienten mit Asthma sind heterogen und zeigen Anzeichen und Symptome, die breit von Patient zu Patient wie auch innerhalb des Patienten über die Zeit variieren.
Es wurden viele Hypothesen entwickelt, um die Pathologie von Asthma zu erklären, einschließlich Probleme mit der glatten Atemwegsmuskulatur, der Rolle der Entzündung, der Innervierung der Atemwege und Mechanismen, die mit Mediatoren zusammenhängen. Obwohl alle diese Faktoren wichtig sind, ist unklar, welches die primären (das heißt verursachenden) Defekte sind und welches die sekundären Defekte sind. Es findet jedoch allgemeine Zustimmung, dass sowohl die Umgebung als auch die Genetik wichtig sind. Von der multifaktoriellen Art von Asthma ausgehend, ist ein Ansatz die Identifizierung der fundamentalen Mechanismen die Asthmaempfänglichkeitsgene aufzufinden, die Individuen prädisponieren, Asthma zu entwickeln.
Ein Verfahren, das zur Identifizierung von Asthmaempfänglichkeitsgenen verwendet werden kann, ist die Positionsklonierung. Bei diesem Verfahren werden die Empfänglichkeitsgene an einer spezifischen Region eines humanen Chromosoms unter Verwendung von DNA Markern lokalisiert, um die Vererbung der Gene in den Familien zu verfolgen. DNA Marker sind DNA Fragmente mit einer definierten physikalischen Lage auf einem Chromosom, deren Vererbung verfolgt werden kann. Je näher ein DNA Marker an einem Empfänglichkeitsgen liegt, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Marker und das Empfänglichkeitsgen zusammen vom Elternteil zum Kind übergehen. Dieses Phänomen wird genetische Kupplung genannt. Wenn einmal eine Kupplung an eine spezifische chromosomale Region erhalten wurde, wird die Region unter Verwendung einer Kombination aus physikalischer und genetischer Kartierung eingeengt, bis die Region klein genug ist, um sequenziert zu werden und das Empfänglichkeitsgen kann identifiziert werden. Nach der Identifizierung des Empfänglichkeitsgens kann jeder Polymorphismus in diesem Gen bestimmt werden und es kann eine Analyse ausgeführt werden, um zu se hen, ob diese Mutationen mit einer größeren Prävalenz bei Asthmatikern im Vergleich zu Nicht-Asthamtikern auftreten. Die Hauptvorteile der Positionsklonierung sind, dass es möglich ist, neue Gene zu identifizieren, obwohl die zugrundeliegenden Faktoren, die die Erkrankung verursachen, unbekannt sind, und die identifizierten Gene haben eine direkte pathologische Relevanz (das heißt primäre verursachende Defekte), da sie Träger direkt für die Entwicklung der Erkrankung empfänglich machen.
In den letzten Jahren haben mehrere akademische Forschungsgruppen eine Evidenz für das Vorkommen der Gene bereitgestellt, die bei der Regulation von asthmatischen und allergischen Reaktionen auf dem humanen Chromosom 5 wichtig sind. Insbesondere wurde eine Evidenz für das Vorkommen von Empfänglichkeitsgenen für BHR und erhöhtes Serum IgE auf dem Chromosom 5 in der Subregion 5q31–5q33 [Meyers et al., Genomics 23: 464–470, Postma et al., N. Eng. J. Med. 333: 894–900 und Bleecker et al., Clin. Exp. Allergy 25: 84–88] aus einer genetischen Kupplungsanalyse von 92 niederländischen Asthmafamilien erhalten. Es wird eine starke Evidenz für eine genetische Kupplung zwischen dem Marker D5S436, dem IgE Gesamtserumspiegel [Meyers et al., Genomics 23: 464–470, Postma et al., N. Eng. J. Med. 333: 894–900 und Bleecker et al., Clin. Exp. Allergy 25: 84–88] und BHR [Postma et al., N. Eng. J. Med. 333: 894–900 und Bleecker et al., Clin. Exp. Allergy 25: 84–88] in den niederländischen Familien gefunden.
Es wurde bisher kein Asthmaempfänglichkeitsgen identifiziert, so dass in der Technik zur Identifizierung solcher Gene ein Bedarf besteht. Die Identifizierung von Asthmaempfindlichkeitsgenen würde ein grundlegendes Verständnis des Erkrankungsprozesses bereitstellen, aus dem mehrere klinisch wichtige Anwendungen entstehen würden. Identifizierte Empfänglichkeitsgene können zur Entwicklung von Therapeutika (niedermolekularen Arzneimitteln, Antisensemolekülen, Antikörpermolekülen) führen, die direkt auf das Gen oder das Proteinprodukt des Gens abzielen oder den biochemischen Weg angehen können, von dem das Proteinprodukt ein Teil an einer stromaufwärts- oder stromabwärts liegenden Stelle ist, falls die Entwicklung solcher Arzneimittel leichter ist, als das Gen oder dessen Proteinprodukt direkt anzugehen.
Polynukleotidsequenzen, die das Gen umfasst, Sequenzvarianten hiervon und Proteinprodukte hiervon können zur Entwicklung eines klinischen diagnostischen Tests auf Asthma und zur Identifizierung von Individuen verwendet werden, die einem hohen Risiko zur Entwicklung von Asthma ausgesetzt sind. Die Ergebnisse solcher Tests können auch einen prognostischen Wert haben und können verwendet werden, um Patienten vorherzusagen, wer auf die Arzneimitteltherapie anspricht und wer nicht. Schließlich erleichtert die Information über die DNA Sequenzen der Asthmaempfänglichkeitsgene und der durch diese Gene kodierten Aminosäuresequenzen eine Produktion von Proteinen im großen Maßstab durch rekombinante Techniken und die Identifizierung der Gewebe/Zellen, die natürticherweise diese Proteine bilden. Eine solche Sequenzinfomation erlaubt auch die Herstellung von Antikörpersubstanzen oder anderen neuen Bindemolekülen, die spezifisch mit den durch die Empfänglichkeitsgene kodierten Proteinen reagieren, welche bei der Modulierung der Ligand/Antiligand Bindereaktionen verwendet werden können, worin die Proteine beteiligt sein können, und für diagnostische Zwecke.
Die hierin verwendeten Ausdrücke haben die folgenden Bedeutungen:
"Isoliert" bezieht sich auf Material, das aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde.
"Hybridisierung" oder "hybridisiert" bezieht sich auf jedes Verfahren, durch das ein Strang eines Polynukleotids mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung bindet.
"Stringente Bedingungen" beziehen sich auf experimentelle Bedingungen, die bis zu 20% Basenfehlpaarungen erlauben, typischerweise zwei 15 Minuten dauernde Waschschritte in 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat, pH 7,0) bei 65°C.
"Homologie" oder "homolog" bezieht sich auf ein Maß an Ähnlichkeit zwischen den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, die partiell sein können oder wenn die Sequenzen identisch sind, vollständig.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein lineares oder zirkuläres DNA Molekül, das ein Segment umfasst, welches ein Polypeptid von Interesse funktionsfähig an zusätzliche Segmente gebunden aufweist, die für dessen Transkription sorgen.
"Antisense" bezieht sich auf die selektive Hemmung der Proteinsynthese über Hybridisierung eines Oligo- oder Polynukleotids an dessen komplementäre Sequenz in der Boten RNA (mRNA) des Zielproteins. Das Antisensekonzept wurde als erstes von Zamecnik und Stephenson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 280–284, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 285–288) vorgeschlagen und hat anschließend eine breite Anwendung sowohl als experimentelles Werkzeug und als Mittel zur Erzeugung von putativen therapeutischen Molekülen gefunden (A. Alama, Pharmacol. Res. 36: 171–178, N. M. Dean, Biochem. Soc. Trans. 24: 623–629, C. F. Bennet, J. Pharmacol. Exp. Ther. 280: 988–1000, S. T. Crooke, Antisense Research and Application, Springer).
Es wurde nun durch genetische Kupplungsanalyse und Bioinformatikanalyse festgestellt, dass AAGA, ein Gen auf Chromosom 5, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 aufweist, wobei die Nukleotidsequenz 100% Homologie mit mRNA Sequenzen und ESTs aufweist, die dem Protocadherin 42 Gen entsprechen, mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist. Protocadherin 42 ist ein Vertreter der Cadherinsuperfamilie. Die Proteine dieser Superfamilie sind bei der Zell-Zell-Adhäsion (interzellulär) beteiligt, die eine wichtige Rolle bei einer großen Vielzahl an Ereignissen in vivo spielt und für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität essentiell ist – M. Takeichi, Annu. Rev. Biochem. (1990), 58, 237–252. Von AAGA wurde festgestellt, dass es mit einem hohen Maß in humanen bronchialen Epithelzellen exprimiert wird. Es wurde auch festgestellt, dass Polymorphismen in AAGA häufiger in asthmatischen Patienten auftreten, als dies in Nicht-Asthmatikern der Fall ist.
Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum eine Erkrankung aufweist oder ein Risiko aufweist, diese zu entwickeln, die gekennzeichnet ist durch bronchiale Hyperreaktivität, das umfasst die Bestimmung in einer Probe an Zellen aus dem Individuum (i) die Expressionsmenge eines Polynukleotids (A), das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 oder eine Sequenz umfasst, die hiermit unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder die Expressionsmenge eines Polypeptids (B), das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 oder eine Variante hiervon mit Zell-Zell-Adhäsionsfunktionsäquivalenz umfasst oder die Menge an Bioaktivität dieses Polypeptids (B) durch Messen der Calcium-abhängigen Zell-Zell-Adhäsion und den Vergleich der Expressionsmenge von (A) oder (B) oder des Bioaktivitätsniveaus von (B) mit der entsprechenden Expressionsmenge von (A) oder (B) oder der Bioaktivität in einem gesunden Individuum oder (ii) das Vorkommen einer Variante dieses Polynukleotids (A), die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist, wobei die Variante von Polynukleotid (A) ein T an der Position aufweist, die der Position 6377 in SEQ ID Nr. 1 entspricht und/oder ein C an der Position aufweist, die der Position 7390 in der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Der Ausdruck "Variante" meint, wie er hierin verwendet wird, in Bezug auf Aminosäuresequenzen eine Aminosäuresequenz, die durch eine oder mehrere Aminosäuren verändert ist. Die Veränderungen können Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion umfassen. In Bezug auf Nukleotidsequenzen meint der Ausdruck "Variante, wie er hierin verwendet wird, eine Nukleotidsequenz, die durch eine oder mehrere Nukleotide verändert ist, wobei die Veränderungen die Nukleotidsubstitution, -deletion oder -insertion umfassen. Eine bevorzugte funktionelle äquivalente Variante hiervon der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 ist eine mit mindestens 80% oder vorzugsweise mindestens 90% und speziell mehr als 95% Aminosäuresequenzidentität zur SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8. Bei solchen bevorzugten funktionell äquivalenten Varianten werden die Regionen der SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8, die der extrazellulären Domäne entsprechen, gewöhnlich substanziell konserviert.
Durch eine Aminosäuresequenz mit X% Identität zu einer Referenzsequenz, wie SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 ist eine Sequenz gemeint, die zur Referenzsequenz identisch ist, außer dass sie bis zu 100–X Aminosäureveränderungen pro 100 Aminosäuren der Referenzsequenz umfassen kann. Beispielsweise können in einer in Frage kommende Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Identität zu einer Referenzsequenz bis zu 20% Aminosäurereste in der Referenzsequenz durch einen anderen Aminosäurerest substituiert, deletiert oder inseriert sein. Die prozentuale Identität zwischen den Aminosäuresequenzen kann herkömmlich mittels bekannter Computerprogramme bestimmt werden, beispielsweise dem FASTDB Programm, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. beruht (Corp. App. Biosci. (1990) 6: 237–245).
Die Expressionsmenge eines Polynukleotids (A), wie dies hierin vorher definiert ist, oder eines Polypeptids (B), wie dies hierin vorher definiert ist, kann beispielsweise durch Northern Blot Analyse, reverser Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), in situ Hybridisierung, Immunfällung, Western Blot Hybridisierung oder Immunhistochemie bestimmt werden. Die Menge an (A), beispielsweise als mRNA oder an Polypeptid (B), die durch eine der obigen Techniken gemessen wird, in Zellen aus dem Individuum, kann mit der Menge jeweils an (A) oder (B) in einem gesunden Individuum verglichen werden. Eine abnormale Menge des Polynukleotids (A) oder Polypeptids (B) dürfte eine unkontrollierte Menge an AAGA Aktivität anzeigen, die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist.
Das Niveau an Bioaktivität des Polypeptids (B) kann beispielsweise durch Messen der Calcium-abhängigen Zell-Zell Adhäsion gemessen werden, beispielsweise durch Förderung der homotypischen Ca²⁺ abhängigen Aggregation und Adhäsion in L-Zellen, wie dies von Sano et al., EMBO J. 12: 2249–2256 beschrieben ist. Ein Vergleich der gemessenen Aktivität in Zellen aus dem Individuum mit der Aktivität, die in Zellen aus einem gesunden Patienten gemessen wird, zeigt an, ob ein Individuum eine abnormale AAGA Aktivität aufweist, die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist.
Eine Variante des Polynukleotids (A), die mit der bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist, kann eine Variante mit einer Veränderung sein, die die Aminosäuresequenz im kodierten Polypeptid verändert oder die die Expressionsmenge des kodierten Polypetids, die Stabilität eines Transkripts oder die Art verändert, auf die ein Transkript prozessiert wird. Solche Veränderungen können zumindest eines der folgenden umfassen: (i) Eine Deletion eines oder mehrerer Nukleotide aus einem Polynukleotid (A), (ii) eine Anfügung eines oder mehrerer Nukleotide an das Polynukleotid (A), (iii) eine Substitution eines oder mehrerer Nukleotide eines Polynukleotids (A), (iv) eine größere chromosomale Umlagerung eines Polynukleotids (A), (v) eine starke Veränderung der Menge eines Boten RNA Transkripts von Polynukleotid (A), (vi) eine unkontrollierte Modifikation eines Polynukleotids (A), wie des Methylierungsmusters der genomischen DNA, (vii) die Anwesenheit eines Nicht-Wildytp Spleißmusters eines Boten RNA Transkripts des Polynukleotids (A), (viii) eine Nicht-Wildtypmenge des Polypeptids (B), (ix) ein allelischer Verlust des Polynukleotids (A) und/oder (x) unpassende posttranslationale Modifikation des Polypeptids (B). Es können verschiedene Testtechniken verwendet werden, um Veränderungen im AAGA Gen (Polynukleotid (A)) zu detektieren. Diese Verfahren umfassen unter anderem Verfahren, wie Sequenzanalyse, Southern Blot Hybridisierung, Konformations-empfindliche Gelelektrophorese (CSGE), Restriktionsenzymstellenkartierung und Verfahren, die eine Detektion der Abwesenheit der Nukleotidpaarung zwischen der zu analysierenden Nukleinsäure und einer Sonde umfassen.
Demnach wird in einer Ausführungsform die Variante eines Polynukleotids (A), das heißt eine genetische Abnormalität, die mit einer bronchialen Hyperreaktivität bei einem Individuum assoziiert ist, durch die Inkubation einer DNA Probe aus dem Individuum mit einer Polynukleotidsonde detektiert, die zumindest 5, beispielsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide des vorher definierten Polynukleotids (A) umfasst, unter Bedingungen, worin die Sonde an die komplementäre Polynukleotidsequenz hybridisiert, unter Bildung eines ersten Reaktionsprodukts und Vergleich des ersten Reaktionsprodukts mit einem Kontrollreaktionsprodukt, das aus der Sonde und der DNA von einem gesunden Individuum erhalten wurde. Falls es einen Unterschied zwischen dem ersten Reaktionsprodukt und dem Kontrollreaktionsprodukt gibt, der mit bronchialer Hyperreaktivität korreliert ist, beispielsweise bei Asthmatikern, zeigt der Unterschied eine Prädisposition für die Entwicklung einer Krankheit an, die durch bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet ist. Die Sonde ist im allgemeinen ein synthetisches Oligonukleotid mit 15 bis 50 Nukleotiden und kann beispielsweise mit einem Fluorophor oder einem radioaktiven Nukleotid unter Bildung eines detektierbaren Signals markiert werden.
AAGA Mutationen, die besonders wahrscheinlich die Entwicklung von Asthma oder anderen entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankungen, die durch BHR charakterisiert sind, verursachen oder dazu beitragen, sind die Mutationen, die die normale (Wildtyp) Funktion von AAGA negativ beeinflussen, insbesondere die extrazelluläre Domäne, die bei der homotypischen Assoziation und daher der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt ist und der intrazellulären Domäne, die mit Strukturproteinen oder Signalmolekülen wechselwirkt. Beispiele dieser Mutationen umfassen: i) Mutationen, die den Spiegel der gebildeten Transkripte beeinflussen, ii) Fehlermutationen, die innerhalb der intrazellulären, transmembranen oder extrazellulären Domäne auftreten und Mutationen, die die Art beeinflussen, auf die das Transkript prozessiert wird.
Spezifische Erkrankungen oder Störungen, beispielsweise genetische Erkrankungen oder Störungen, sind mit spezifischen allelischen Varianten polymorpher Regionen bestimmter Gene assoziiert, die nicht notwendigerweise für ein mutiertes Protein kodieren. Daher kann das Vorkommen einer spezifischen allelischen Variante einer polymorphen Region eines Gens, wie ein Einzelnukleotidpolymorphismus ("SNP") in einem Patienten das Individuum für die Entwicklung einer spezifischen Erkrankung oder Störung empfänglich machen. Polymorphe Regionen in Genen, beispielsweise AAGA Genen, können durch die Bestimmung der Nukleotidsequenz der Gene in Populationen der Individuen identifiziert werden. Falls eine polymorphe Region, beispielsweise SNP oder ein Haplotyp, das heißt eine Kombination von SNPs, identifiziert wird, dann kann die Verbindung zu einer spezifischen Krankheit durch die Untersuchung der spezifischen Populationen an Individuen bestimmt werden, beispielsweise Individuen, die eine spezifische Erkrankung entwickelt haben, wie Asthma. Eine polymorphe Region kann in jeder Region eines Gens, beispielsweise Exons, in kodierenden oder nicht-kodierenden Regionen von Exons, Introns und Promotorregionen lokalisiert sein.
Es wurde festgestellt, dass die AAGA Gene polymorphe Regionen umfassen, von denen spezifische Alle mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert sind, insbesondere bei Asthmapatienten. Daher kann die Bestimmung des Vorkommens einer Variante eines Polynukleotids (A), wie dies vorher definiert wurde, die Bestimmung der Identität eines Allels oder einer allelischen Variante eines Polymorphismus eines Polynukleotids (A) bei einem Individuum umfassen, wobei bestimmt wird, ob das Individuum eine spezifische allelische Variante eines Polymorphismus aufweist, die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist.
Es sind mehrere SNPs in SEQ ID Nr. 1, die in DNA Proben von asthmatischen Patienten identifiziert wurden, in Beispiel 3 gezeigt. Aus diesen wurde für die Polymorphismen an den Positionen 6377 (eine Veränderung von C nach T) und 7390 (eine Veränderung von G nach C) der SEQ ID Nr. 1 gezeigt, dass sie mit der bronchialen Hyperreaktivität assoziiert sind. Demnach umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Bestimmung des Vorkommens einer Variante von Polynukleotid (A), wie dies vorher beschrieben wurde, die Bestimmung der Identität der Base an einer oder beiden Positionen, die den Positionen 6377 und 7390 in SEQ ID Nr. 1 entsprechen, in einer Zellprobe aus dem Individuum. Das Vorkommen von T an der der Position 6377 entsprechenden Position und/oder C an der der Position 7390 entsprechenden Position, zeigt eine Variante des Polynukleotids (A) an, die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist. Wenn es erwünscht ist, das Vorkommen eines Haplotyps zu bestimmen, das heißt eine Kombination an SNPs, kann die Identität der Base an einer oder beiden Positionen 6377 und 7390 bestimmt werden oder die Identität der Base an einer oder mehrerer der den Positionen 589, 1001, 1060, 2033, 2193, 2561, 5667, 5804 und 7531 in SEQ ID Nr. 1 entsprechenden Positionen und 1212, 1216, 1964 und 2330 in SEQ ID Nr. 2 entsprechenden Positionen bestimmt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die SEQ ID Nr. 1 umfasst oder einen Teil hiervon, der das Nukleotid 6377 und/oder das Nukleotid 7390 umfasst, aus der Zellprobe isoliert und sequenziert.
In einer beispielhaften Ausführungsform wird die DNA aus einer Zellprobe eines Individuums für eine Hybridisierung zugänglich gemacht und mit einer Nukleinsäuresonde zusammengebracht, die eine Region der Nukleotidsequenz umfasst, die zur Hybridisierung mit einer Sense- oder Antisenseregion eines AAGA Gens (Polynukleotid (A)) oder natürlich vorkommenden Mutanten hiervon fähig ist, beispielsweise eine polymorphe Region des Gens, wie eine Region, die die Position 6377 und/oder die Position 7390 der SEQ ID Nr. 1 umfasst, oder 5' oder 3' flankierende Sequenzen, die natürlicherweise mit den AAGA Genen oder natürlich vorkommenden Mutanten hiervon assoziiert sind und die Hybridisierung der Sonde mit der DNA Probe wird detektiert. Solche Techniken können zur Detektion von Veränderungen oder allelischen Varianten entweder auf genomischem oder mRNA Niveau einschließlich Deletionen, Substitutionen, etc. wie auch zur Bestimmung der mRNA Transkriptmengen verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung eines Allels oder einer allelischen Variante einer polymorphen Region ist eine allelspezifische Hybridisierung mittels Sonden, die die Mutation oder polymorphe Stelle überlappen und etwa 5 bis 30, beispielsweise 5, 10, 20, 25 oder 30 Nukleotide umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Sonden, die zur spezifischen Hybridisierung an allelische Varianten fähig sind, wie Einzelnukleotidpolymorphismen, an einen festen Träger angebracht, beispielsweise einen "Chip". Die Oligonukleotide können an einen festen Träger durch eine Vielzahl an Prozessen gebunden werden, einschließlich Lithographie. Beispielsweise kann ein Chip bis zu 250 000 Oligonukleotide tragen. Die Mutationsdetektionsanalyse mittels dieser Chips, die die Oligonukleotide enthalten, die auch "DNA Sondentests" genannt werden, ist beispielsweise in Cronin et al (1996) Human Mutation 7: 244 beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst ein Chip alle allelischen Varianten von zumindest einer polymorphen Region eines Gens. Der feste Träger wird dann mit einer Testnukleinsäure in Verbindung gebracht und die Hybridisierung an die spezifischen Sonden wird detektiert. So kann die Identität von mehreren allelischen Varianten einer oder mehrerer Gene in einer DNA Probe aus einem Patienten in einem einfachen Hybridisierungsexperiment identifiziert werden.
So liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine allelspezifische Oligonukleotidsonde, die zur Detektion eines Polymorphismus in Polynukleotid (A) fähig ist, wie dies vorher an einer oder mehrerer der Positionen 6377 und 7390 der SEQ ID Nr. 1 beschrieben ist. Die Allel-spezifische Sonde hat im allgemeinen etwa 15 bis 50 Nukleotide, gewöhnlicher etwa 15 bis 30 Nukleotide und überlappt die Position 6377 oder 7390. Bequemerweise aligniert eine zentrale Position der Sonde mit der Position 6377 oder 7390. Die Nukleotidsequenz einer solchen Sonde ist im allgemeinen zu 100% komplementär zur entsprechenden Sequenz in der polymeren Region des Polynukleotids (A). Die Sonde kann markiert sein, beispielsweise herkömmlich, wie mit einem Fluorophor oder einer radioaktiven Markierung, um ein detektierbares Signal bereitzustellen.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Detektion der Veränderung die Verwendung der Sonde/des Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe beispielsweise US 4 683 195 A und US 4 683 202 A ), wie Anker PCR oder RACE PCR oder alternativ dazu in einer Ligasekettenreaktion (LCR) (siehe beispielsweise Landegran et al., (1988) Science 241: 1077–1080 und Nakazawa et al. (1994) PNAS 91: 360–364) wobei letztere besonders zur Detektion von Punktmutationen im AAGA Gen brauchbar sein kann (siehe Abravaya et al., (1995) Nuc. Acid Res. 23: 675–682). In einer ausschließlich erläuternden Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte aus (i) Gewinnen einer Zellprobe von einem Patienten, (ii) Isolierung der Nukleinsäure (beispielsweise genomisch, mRNA oder beide) aus den Zellen der Probe, (iii) Zusammenbringen der Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, die spezifisch an ein AAGA Gen unter den Bedingungen spezifisch hybridisiert, so dass eine Hybridisierung und Amplifizierung des AAGA Gens (falls es vorkommt) auftritt und (iv) Detektion des Vorkommens oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder Detektion der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleich der Länge mit einer Kontrollprobe. Es wird antizipiert, dass PCR, LCR oder jedes andere Amplifizierungsverfahren (beispielsweise selbstgetriebene Sequenzreplikation (J. C. Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), Transkriptionsamplifikationssystem (D. Y. Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177) oder Q-Beta Replicase (P. M. Lizardi et al., 1988, Bio/technology 6: 1197)) als erster Schritt zur Erhöhung der Menge einer Probe verwendet werden können, mit der eine der hierin zur Detektion der Mutation beschriebenen Techniken ausgeführt werden kann.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Variante eines Polynukleotids (A), wie dies hierin definiert ist, wobei die Variante einen Einzelnukleotidpolymorphismus aufweist, umfasst die Bestimmung der allelischen Variante durch Sequenzierung einer DNA Probe aus dem Individuum. In einem weiteren Verfahren zur Identifizierung einer allelischen Variante eines Polymorphismus werden DNA Fragmente aus einer Zellprobe durch PCR in Anwesenheit eines allelspezifischen Primers amplifiziert, der zur Detektion eines Polymorphismus im Polynukleotid (A) fähig ist, insbesondere an einer oder mehrerer Positionen 6377 und 7390 der SEQ ID Nr. 1. Mehrere SNPs, die in DNA Proben aus Asthmapatienten identifiziert werden, sind in Beispiel 2 gezeigt. Von diesen wurde von den Polymorphismen an den Position 6377 und 7390 in SEQ ID Nr. 1 in bestimmten Populationen gezeigt, dass sie mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert sind.
Die Erfindung liefert auch einen allelspezifischen Primer, beispielsweise zur Verwendung in Polymorphismus-detektierenden Verfahren, einschließlich eines Amplifikationsschritts, der zur Detektion eines Polymorphismus in Polynukleotid (A) fähig ist, wie dies vorher an einer oder mehreren der Positionen 6377 und 7390 in SEQ ID Nr. 1 definiert wurde. Der Primer weist im allgemeinen 15 bis 50 Nukleotide, gewöhnlicher etwa 15 bis 30 Nukleotide auf. Die Nukleotidsequenz des Primers entspricht der des zu detektierenden Allels, obwohl eine partiell korrespondierende Sequenz mit etwa 5 bis 10 Nukleotiden am 3' Ende des Primers, die denen des zu detektierenden Allels entspricht, verwendet werden kann.
Der Primer kann markiert werden, beispielsweise mit einem Fluorophor oder einer radioaktiven Markierung, um die Detektion hiervon zu unterstützen.
Die Erfindung liefert ferner einen diagnostischen oder prognostischen Kit, der eine allelspezifische Oligonukleotidsonde, wie sie hierin vorher beschrieben ist, oder einen allelspezifischen Primer, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, optional zusammen mit anderen Reagenzien umfasst, wie Markierungsreagenzien (um eine detektierbare Markierung in ein hybridisiertes Produkt einzubauen), Puffer und DNA Polymerasen, wie Taq Polymerase.
Demnach liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein isoliertes Polynukleotid, das eine Variante von Polynukleotid (A) ist, wie dies hierin vorher definiert wurde, die mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, insbesondere eine Variante von Polynukleotid (A) mit einer spezifischen allelischen Variante eines Einzelnukleotidpolymorphismus, der mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, wie ein Einzelnukleotidpolymorphismus an der Position 6377 und/oder Position 7390 der SEQ ID Nr. 1, speziell T an der Position 6377 und/oder C an der Position 7390. Dementsprechend liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein isoliertes, mutiertes Polypeptid, das mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, das durch die Polynukleotidvariante von Polynukleotid (A) kodiert wird, die mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, wie dies vorher beschrieben ist, oder ein isoliertes Polypeptid, das eine Variante von Polypeptid (B) ist, wie dies hierin vorher definiert ist, welche mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist.
Information, die mittels der diagnostischen Tests erhalten wird, welche hierin beschrieben sind (alleine oder zusammen mit Information über einen weiteren genetischen Defekt, der zur selben Krankheit beiträgt) ist zur Prognose, Diagnose oder Bestätigung brauchbar, dass ein symptomatisches Individuum einen genetischen Defekt aufweist (beispielsweise in einen AAGA Gen oder ein Gen, das die Expression eines AAGA Gens reguliert), der die bestimmte Erkrankung oder Störung verursacht oder hierzu beiträgt. Alternativ dazu kann die Information (alleine oder zusammen mit Information über einen weiteren genetischen Defekt, der zur selben Krankheit beiträgt) prognostisch zur Vorhersage verwendet werden, ob ein nicht symptomatisches Individuum wahrscheinlich eine Krankheit oder einen Zustand entwickelt, die durch eine abnormale AAGA Aktivität oder Proteinmenge bei einem Individuum verursacht wird oder hierzu einen Beitrag leistet. Insbesondere erlauben es die Tests einem, die Neigung eines Individuums festzustellen, eine bronchiale Hyperreaktivität zu entwickeln, die mit einer Mutation in oder assoziiert mit AAGA assoziiert ist, wobei die Mutation ein Polymorphismus ist, wie ein Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP). Basierend auf der prognostischen Information kann der Doktor einen Plan empfehlen, beispielsweise ein therapeutisches Protokoll, das zur Prävention oder Verzögerung des Einsetzens von Asthma im Individuum brauchbar ist.
Die Kenntnis der bestimmten Veränderung oder Veränderungen, die zu defekten oder defizienten AAGA Genen oder Proteinen bei einem Individuum führen (dem genetischen AAGA Profil) erlaubt alleine oder zusammen mit der Information über andere Gendefekte, die zur selben Krankheit beitragen (dem genetischen Profil der einzelnen Krankheit) eine Anpassung der Therapie für eine bestimmte Erkrankung auf das genetische Profil des Individuums, das Ziel der "Pharmacogenomics". Beispielsweise können Individuen mit einem spezifischen Allel eines AAGA Gens Symptome einer bestimmten Krankheit zeigen oder auch nicht oder zur Entwicklung von Symptomen einer bestimmten Krankheit prädisponiert sein. Ferner können diese Individuen, falls sie symptomatisch sind, auf ein bestimmtes Arzneimittel ansprechen oder auch nicht, beispielsweise ein spezifisches AAGA Therapeutikum, aber sie können auf ein anderes ansprechen. Daher erlaubt die Erzeugung eines genetischen AAGA Profils (beispielsweise Kategorisierung von Veränderungen in den AAGA Genen, die mit der Entwicklung von Asthma assoziiert sind) aus einer Population an Individuen, die für eine Erkrankung oder einen Zustand symptomatisch sind, der durch ein defektes und/oder defizientes AAGA Gen und/oder Protein verursacht wird (ein genetisches AAGA Populationsprofil) und ein Vergleich des AAGA Profils eines Individuums mit dem Populationsprofil die Selektion oder das Design von Arzneimitteln die sicher und wirksam für einen bestimmten Patienten oder Patientenpopulation sind (das heißt eine Gruppe an Patienten mit derselben genetischen Veränderung).
Demnach liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur pharmakogenomischen Selektion einer Therapie zur Verabreichung an ein Individuum mit Asthma, das die Bestimmung eines genetischen AAGA Profils eines Individuums und den Vergleich des genetischen AAGA Profils des Individuums mit einem genetischen AAGA Populationsprofil umfasst, wobei die an das Individuum zu verabreichende Therapie ausgewählt wird.
Beispielsweise kann ein AAGA Populationsprofil durch die Bestimmung des AAGA Profils ausgeführt werden, beispielsweise der Identität von AAGA Genen, in einer Patientenpopulation mit einer Erkrankung, die durch ein defektes oder defizientes AAGA Gen verursacht wird. Optional kann das AAGA Populationsprofil weiter Infomation, die sich auf das Ansprechen der Population auf ein AAGA Therapeutikum bezieht, unter Verwendung einer Vielzahl an Verfahren umfassen, einschließlich Verfolgen: 1) Der Schwere der mit der AAGA in Bezug stehenden Krankheit, 2) der AAGA Genexpressionsmenge, 3) dem AAGA mRNA Spiegel und/oder 4) der AAGA Proteinmenge und (iii) Einteilung oder Kategorisierung der Population basierend auf der einzelnen genetischen Veränderung oder den Veränderungen, die im AAGA Gen oder einem Gen des AAGA Wegs vorkommen. Das genetische AAGA Populationsprofil kann optional auch die bestimmten Veränderungen anzeigen, bei denen der Patient entweder auf ein bestimmtes Therapeutikum anspricht oder nicht anspricht. Diese Information oder das Populationsprofil ist dann zur Vorhersage brauchbar, welche Individuen auf bestimmte Arzneimittel aufgrund ihres individuellen AAGA Profils ansprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das AAGA Profil ein Transkriptions- oder Expressionsmengenprofil und Schritt (i) umfasst die Bestimmung der Expressionsmenge von AAGA Proteinen alleine oder zusammen mit der Expressionsmenge von anderen Genen, die bekanntermaßen zur selben Erkrankung beitragen. Das AAGA Profil kann bei vielen Patienten bei verschiedenen Stadien der Erkrankung gemessen werden.
Es können auch pharmakogenomische Studien mittels transgener Tiere ausgeführt werden. Beispielsweise können transgene Mäuse, die eine bestimmte allelische Variante eines AAGA Gens enthalten, beispielsweise durch Austauschen ihres Wildtyp AAGA Gens durch ein Allel des humanen AAGA Gens erzeugt werden. Die Reaktion dieser Mäuse auf spezifische AAGA Therapeutika kann dann bestimmt werden.
Die Behandlung eines Individuums mit einem AAGA Therapeutikum kann durch den Vergleich der AAGA Charakteristiken verfolgt werden, wie AAGA Proteinmenge oder Aktivität, AAGA mRNA Menge und/oder AAGA Transkriptionsmenge. Diese Messungen zeigen an, ob die Behandlung effektiv ist oder ob sie angepasst oder optimiert werden sollte. Daher kann AAGA als Marker für die Wirksamkeit eines Arzneimittels während klinischer Versuche verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfolgung der Wirksamkeit einer Behandlung eines Patienten mit einem Pharmazeutikum (beispielsweise Agonisten, Antagonisten, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, Nukleinsäure, niedermolekulares Molekül oder andere Arzneimittelkandidaten, die durch die hierin beschriebenen Screeningtests identifiziert werden), das die Bestimmung der Expressionsmenge eines Polynukleotids (A), beispielsweise als mRNA oder genomische DNA oder eines Polypeptids (B) oder das Aktivitätsniveau dieses Polynukleotids (A) oder Polypeptids (B) in einer DNA Probe vor der Verabreichung aus dem Individuum und in einer DNA Probe nach der Verabreichung aus dem Individuum, Vergleich des entsprechenden Niveaus der Expression oder Aktivität in der Probe vor der Verabreichung und der Probe nach der Verabreichung und erforderlichenfalls entsprechende Veränderung des Pharmazeutikums an das Individuum. Beispielsweise kann eine erhöhte Verabreichung des Mittels erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von AAGA auf größere Mengen als detektiert zu erhöhen, das heißt um die Wirksamkeit des Mittels zu erhöhen. Alternativ dazu kann eine verringerte Verabreichung des Mittels erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von AAGA auf geringere Mengen als den detektierten abzusenken, das heißt um die Wirksamkeit des Mittels zu verringern.
Die Zellen eines Patienten können auch vor oder nach der Verabreichung eines AAGA Therapeutikums erhalten werden, um die Expressionsmenge von anderen Genen als AAGA zu detektieren und zu bestätigen, dass das AAGA Therapeutikum keine schädliche Erhöhung oder Verringerung in der Expression solcher Gene verursacht. Dies kann beispielsweise unter Verwendung des Verfahrens der Transkriptionsprofilerstellung ausgeführt werden. Daher kann mRNA aus Zellen, die in vitro einem AAGA Therapeutikum gegenüber exponiert wurden, und mRNA aus demselben Typ an Zellen, die nicht gegenüber dem AAGA Therapeutikum exponiert wurden, revers transkribiert und auf einem Chip hybridisiert werden, der DNA aus verschiedenen Genen enthält, um hierbei die Expression von Genen in Zellen zu vergleichen, die mit einem AAGA Therapeutikum behandelt und nicht behandelt wurden. Falls beispielsweise ein AAGA Therapeutikum die Expression eines Protoonkogens in einem Individuum anschaltet, kann die Verwendung dieses bestimmten AAGA Therapeutikums unerwünscht sein.
Ein genetisches AAGA Profil oder das genetische Profil von Asthma kann ermöglichen: 1) Effektivere Verschreibung eines Arzneimittels, das die molekulare Basis von Asthma adressiert und 2) bessere Bestimmung der geeigneten Dosierung eines bestimmten Arzneimittels. Die Fähigkeit Populationen anzugehen, die den stärksten klinischen Nutzen aufgrund von AAGA oder des genetischen Asthmaprofils zeigen könnten, kann ermöglichen: 1) Die Repositionierung von vermarkteten Arzneimitteln mit enttäuschenden Marktergebnissen, 2) die Wiederaufnahme von Arzneimittelkandidaten, deren klinische Entwicklung als Ergebnis von Sicherheits- oder Wirksamkeitslimitierungen gestoppt wurden, die spezifisch für Patientensubgruppen sind, und 3) eine beschleunigte und günstigere Entwicklung von Arzneimittelkandidaten und optimalere Arzneimittelbeschriftung (beispielsweise da die Verwendung von AAGA als Marker für die Optimierung der effektiven Dosis brauchbar ist).
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet ist, die die Verabreichung an einen behandlungsbedürftigen Patienten einer wirksamen Menge eines wie hierin vorher beschriebenen Polynukleotids (A) oder eines wie hierin vorher beschriebenen Polypeptids (B) oder eines Antikörpers (C), der mit diesem Polypeptid (B) oder einer mit der Krankheit assoziierten Variante hiervon immunreaktiv ist oder ein Anisenseoligonukleotid (D), das eine Nukleotidsequenz umfasst, die komplementär zu der des Polynukleotids (A) oder einer mit der Krankheit assoziierten Variante hiervon ist.
Das Polynukleotid (A) kann cDNA sein, die umfasst die Nukeotidsequenz der SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID 6, eine genomische DNA, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 umfasst oder eine DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst das Polynukleotid (A) einen Teil, der zumindest 20, beispielsweise mindestens 50, beispielsweise mindestens 100, beispielsweise mindestens 200 aufeinanderfolgende Basen von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 aufweist. In einem weiteren Aspekt umfasst das Polynukleotid (A) eine Nukleotidsequenz, die mindestens 10, beispielsweise mindestens 50, beispielsweise mindestens 100, beispielsweise mindestens 200 aufeinanderfolgende Aminosäuren von SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 umfasst.
Das Polynukleotid (A) kann isoliert werden durch Bioinformatikanalyse der DNA Sequenzen aus der Subregion 5q31–5q33 auf Chromosom 5, die durch Sequenzierung von künstlichen Hefechromosomen (YACs), künstlichen Bakterienchromosomen (BACs) und/oder künstlichen P1 Chromosomen (PACs) zur Identifizierung von Genen innerhalb der Subregion bestimmt wurden, Suche nach einer Sequenz mit mehr als 95% Identität zu dem vorhergesagten Exon für ein ausgewähltes Gen und Isolierung der cDNA aus einer humanen cDNA Lungenbank durch PCR mittels Primer, die unter Verwendung dieser Sequenz entworfen wurden.
Das Polynukleotid (A) mit beispielsweise der Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 kann aus den Nukleotiden, aus denen es sich zusammensetzt, durch chemische Synthese, beispielsweise automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von bekannten Verfahren und Geräten hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst das Polypeptid (B) einen Teil mit mindestens 10, beispielsweise mindestens 50, beispielsweise mindestens 100, beispielsweise mindestens 200 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8.
Das Polypeptid (B) oder das mutierte Polypeptid, wie sie hierin vorher beschrieben wurden, können durch Klonierung einer Polynukleotidsequenz oder Variante hiervon, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, in einen Expressionsvektor, der einen Promotor und andere geeignete Regulationselemente zur Transkription, Überführung in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, wie Bakterien-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Tier- oder Menschenzellen und Kultivierung der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden, die den rekombinanten Expressionsvektor enthalten. Techniken für eine solche rekombinante Expression von Polypeptiden sind gut bekannt und beispielsweise beschrieben in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, 1990.
Das Polypeptid (B) oder mutierte Polypeptid, wie dies hierin vorher beschrieben ist, kann als rekombinantes Fusionsprotein mit einem oder mehreren heterologen Polypeptiden exprimiert werden, um beispielsweise die Reinigung zu erleichtern. Beispielsweise kann es als rekombinantes Fusionsprotein mit einem heterologen Polypeptid exprimiert werden, wie einem Polyhistidin, das eine Spaltstelle enthält, die zwischen der Polynukleotidsequenz der Erfindung und der heterologen Polypeptidsequenz liegt, so dass das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 oder eine Variante hiervon umfasst, die mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, abgespalten und vom heterologen Rest mittels gut bekannter Techniken weggereinigt werden kann.
Das Polypeptid (B) oder das mutierte Polypeptid, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, kann auch als ganzes oder teilweise unter Verwendung gut bekannter chemischer Verfahren, beispielsweise automatisierter Festphasentechniken, aus den Aminosäuren synthetisiert werden, aus denen es besteht.
Das Polypeptid (B) oder das mutierte Polypeptid, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, kann durch gut bekannte Standardverfahren gereinigt werden.
Der Antikörper (C) kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Solche Antikörper können mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen gereinigtes Antigen sind gut etabliert (siehe Cooper und Paterson in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausgeber John Wiley and Sons Inc., Kapitel 11). Typischerweise wird ein Wirtstier, wie ein Kaninchen oder eine Maus mit einem gereinigten Polypeptid der Erfindung oder einem immunogenen Teil hiervon als Antigen immunisiert und nach einem geeigneten Zeitintervall wird das Wirtsserum gewonnen und auf Antikörper getestet, die gegen das Polypeptid spezifisch sind. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen gereinigtes Antigen sind gut etabliert (siehe Kapitel 11, Current Protocols in Molocular Biology, Ausubel et al., Herausgeber John Wiley and Sons Inc.). Zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers kann das Serum mit gesättigtem Ammoniumsulfat oder DEAE Sephadex behandelt werden. Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers werden die Milz oder die Lymphozyten des immunisierten Tieres entfernt und immortalisiert oder zur Herstellung von Hybridomen durch bekannte Verfahren verwendet. Antikörper, die durch die immortalisierten Zellen sek retiert werden, werden gescreent, um die Klone zu bestimmen, die die Antikörper der gewünschten Spezifität sekretieren, beispielsweise mittels Western Blot Analyse. Humanisierte Antikörper können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
Das Antisenseoligonukleotid (D) umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu der mRNA von AAGA ist, insbesondere eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 ist oder komplementär zu der eines Polynukleotids, das für eine Variante eines Polypeptids (B) mit einem Polymorphismus kodiert, der mit der Krankheit korreliert, beispielsweise Asthma, insbesondere eine Nukleotidsequenz, die zu einer solchen polymorphen Variante der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 komplementär ist. Das Antisenseoligonukleotid kann DNA oder ein DNA Analogon, wie ein Phosphorthioat oder Methylphosphonatanalogon der DNA, RNA ein Analogon von RNA, oder eine Peptidnukleinsäure (PNA) sein. Die Antisenseoligonukleotide können durch herkömmliche Verfahren synthetisiert werden, beispielsweise mittels automatisierter Festphasentechniken.
Die Rolle des Polypeptids (B) bei Asthma und anderen obstruktiven oder entzündlichen Atemwegserkrankungen, die durch eine bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet sind, können mittels herkömmlicher Allergen-getriebener Tiermodelle für eine bronchiale Hyperreaktivität bestimmt werden, beispielsweise durch das Ovalbumin induzierte BHR Mausmodell (Tsuyuki et al., J. Clin. Invest. 96: 2924–2931) oder das hierin später beschriebene Meerschweinchenmodell.
Polynukleotide, Polypeptide, Antikörper oder Antisenseoligonukleotide, wie sie hierin vorher beschrieben sind, die hierin später alternativ zusammen als erfindungsgemäße Mittel bezeichnet werden, können zur Behandlung (prophylaktisch oder symtomatisch) von entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankungen verwendet werden. Beispielsweise kann ein Polypeptid (B) verwendet werden, um einen Säuger, insbesondere einen Menschen zu behandeln, der für das Polypeptid defizient ist oder einen sonstigen Bedarf hat, ein Polynukleotid (A) kann bei der Gentherapie verwendet werden, wo es gewünscht ist, die AAGA Aktivität zu erhöhen, beispielsweise wenn ein Individuum ein mutiertes oder fehlendes AAGA Gen aufweist, ein Antisenseoligonukleotid (D) kann zur Hemmung der AAGA Aktivität oder Aktivität von Varianten des AAGA Gens, wo dies gewünscht wird, verwendet werden, die einen Polymorphismus aufweisen, der mit einer Erkrankung korreliert, beispielsweise Asthma, und ein Antikörper (C) kann zur Hemmung von Liganden/Antiligandenbindungsaktivitäten der AAGA Polypeptide verwendet werden.
"Gentherapie" bezieht sich auf einen Ansatz zur Behandlung einer Erkrankung beim Menschen, der auf dem Transfer von genetischem Material in somatische Zellen eines Individuums basiert. Der Gentransfer kann direkt in vivo durch die Verabreichung von Gen-tragenden viralen oder nicht-viralen Vektoren in Blut oder Gewebe oder indirekt ex vivo über die Einführung von genetischem Material in Zellen erreicht werden, die im Labor manipuliert wurden, wonach die Abgabe der Gen-enthaltenden Zellen zurück in das Individuum erfolgt. Durch die Veränderung des genetischen Materials innerhalb einer Zelle kann die Gentherapie die zugrundeliegende Erkrankungspathophysiologie korrigieren. Geeignete Vektoren und Verfahren zur Genabgabe an spezifische Gewebe und Organsysteme bei Tieren sind in N. C. Dracopoli et al., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley and Sons Inc., jeweils Kapitel 12 und 13 beschrieben. In Bezug auf ein Polynukleotid (A), wie dies hierin beschrieben ist, kann die Gentherapie die Abgabe eines viralen oder nicht-viralen Gentherapievektors umfassen, der eine Expressionskassette des AAGA Gens unter geeigneten Kontrollelementen für die Lungen der erkrankten Individuen (beispielsweise Asthmatiker) enthält, so dass die der Krankheit zugrundeliegende Pathophysiologie korrigiert oder gelindert wird.
Die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Mittels bei der Hemmung oder der Umkehr von Atemwegshyperreaktivität kann in einem Meerschweinchentestmodell gezeigt werden. Die akute Injektion eines vorgeformten Immunkomplexes macht Meerschweinchen gegenüber Histamin hyperreaktiv. Dosen an Histamin, die nur ein geringes Maß an Bronchokonstriktion vor der Verabreichung des Immunkomplexes verursachen danach einen sehr viel stärkeren Effekt. Meerschweinchen (Dunkin-Hartley, männlich, 400–600 g) werden mit Phenobarbital (100 mg/kg i. p.) und Pentobarbital (30 mg/kg i. p.) betäubt und mit Gallamin (10 mg/kg i. m.) paralysiert und mit einem Gemisch aus Luft und Sauerstoff (45:55 V/V) beatmet. Die Tiere werden über eine Tracheenkanüle beatmet (8 ml/kg, 1 Hz). Die Atmung wird durch einen Flussumwandler aufgezeichnet. Wenn Messungen des Flusses durchgeführt werden, werden gleichzeitig Druckveränderungen im Thorax direkt durch einen intrathorakalen Trochar aufgezeichnet, was die Anzeige von einem unterschiedlichen Druck relativ zur Trachea erlaubt. Aus dieser Information wird der Widerstand und die Compliance bei jedem Einatmen berechnet. Es wird eine allergische Reaktion durch die intravenöse Injektion von vorgeformten Immunkomplexen (hergestellt durch die Zugabe von 30 μg Rindergammaglobulin in 0,05 ml Kochsalzlösung zu 0,05 ml Meerschweinchen-Antirindergammaglobulin-Antiserum) dreimal in Intervallen von 10 Minuten initiiert. Es werden intravenöse Injektionen von Histamin (1,0–3,2 μg/kg in Intervallen von 10 Minuten) verwendet, um die Empfindlichkeit der Atemwege vor und nach der letzten Exposition gegenüber dem Immunkomplex zu definieren. Die Atemwegshyperreaktivität wird als gepaarte Differenz für den maximalen Wert des Lungenwiderstands auf die Reaktion gegenüber Histamin vor und nach der wiederholten Injektion des Immunkomplexes ausgedrückt. Die erfindungsgemäßen Mittel werden intratracheal entweder als Lösungen oder Suspensionen in Tragacanth verabreicht. Die ED₅₀ Werte für die Umkehr der Atemwegshyperreaktivität werden jeweils graphisch aus den Dosis-Wirkungskurven bestimmt und repräsentieren die Dosen, die eine 50% Reduktion der Atemwegshyperraktivität verursachen.
Erkrankungen, die durch bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet sind, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, umfassen entzündliche oder obstruktive Atemwegserkrankungen, insbesondere Asthma jedes Typs oder jeder Genese, einschließlich sowohl intrinsisches (nicht allergisches) als auch extrinsisches (allergisches) Asthma, mildes Asthma, moderates Asthma, schweres Asthma, Bronchitisasthma, Anstrengungs-bedingtes Asthma, berufsbedingtes Asthma und Asthma, das nach einer bakteriellen Infektion induziert wird. Die Behandlung des Asthmas kann als umfassende Behandlung von Patienten verstanden werden, die beispielsweise weniger als 4 oder 5 Jahre alt sind, giemende Symptome aufweisen und als "giemende Kinder" diagnostiziert wurden oder diagnostiziert werden können, eine bekannte Patientenkategorie von großem medizinischem Interesse, die jetzt oft als beginnende oder Frühphasenasthmatiker identifiziert wird. (Der Einfachheit halber wird dieser asthmatische Zustand als "Giemendes Kindersyndrom" beschrieben).
Die prophylaktische Wirksamkeit bei der Behandlung von Asthma wird durch die verringerte Frequenz oder Schwere der symptomatischen Attacke, beispielsweise der akuten asthmatischen oder bronchokonstriktiven Attacke, der Verbesserung der Lungenfunktion oder der Verbesserung in der Atem wegshyperreaktivität deutlich. Sie wird ferner durch den verringerten Bedarf für eine weitere symptomatische Therapie deutlich, das heißt eine Therapie, die zur Begrenzung oder zum Abbruch der symptomatischen Attacke gedacht ist, wenn diese auftritt, beispielsweise eine anti-entzündliche (beispielsweise Corticosteroid) oder bronchodilatatorische Therapie. Der prophylaktische Nutzen bei Asthma wird insbesondere bei Patienten deutlich, die an einem "Morgentief" leiden. Das "Morgentief" ist ein anerkanntes asthmatisches Syndrom, das für einen substantiellen Prozentsatz von Asthmatikern zutrifft und durch eine Asthmaattacke beispielsweise zwischen 4 bis 6 Uhr morgens gekennzeichnet ist, das heißt zu einer Zeit, die normalerweise wesentlich von jeder vorher verabreichten symptomatischen Asthmatherapie entfernt ist.
Weitere entzündliche oder obstruktive Atemwegserkrankungen und Zustände, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, sind unter anderem Atemstresssyndrom beim Erwachsenen (ARDS), chronisch obstruktive Lungen- oder Atemwegserkrankung (COPD, COAD, oder COLD), einschließlich chronischer Bronchitis oder der hiermit assoziierten Dyspnoe, Emphysem, wie auch Exacerbation der Atemwegshyperreaktivität nach einer anderen Arzneimitteltherapie, insbesondere einer anderen inhalativen Arzneimitteltherapie. Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls anwendbar auf die Behandlung der Bronchitis jeden Typs oder jeder Genese, einschließlich beispielsweise der akuten Bronchitis, Erdnußbronchitis, katarrhalischer Bronchitis, kruppartiger Bronchitis, chronischer Bronchitis oder phthinoider Bronchitis. Weitere entzündliche oder obstruktive Atemwegserkrankungen, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, umfassen Pneumokoniose (eine entzündliche, gewöhnlich besitzergreifende Erkrankung der Lungen, die häufig von einer Atemwegsobstruktion begleitet wird, ob chronisch oder akut, und durch die wiederholte Einatmung von Stäuben verursacht wird) jedes Typs oder jeder Genese, einschließlich beispielsweise Aluminose, Anthracose, Asbestose, Chalicose, Ptilose, Siderose, Silicose, Tabacose und Byssinose.
In Anbetracht ihrer antiinflammatorischen Aktivität, insbesondere in Bezug auf die Hemmung der Aktivierung der Eosinophilen, sind die erfindungsgemäßen Mittel auch zur Behandlung von Störungen, die mit Eosinophilen zusammenhängen, indiziert, beispielsweise Eosinophilie, insbesondere mit Eosinophilen zusammenhängende Störungen der Atemwege (beispielsweise krankhafter Eosinophileninfiltration der Lungengewebe) einschließlich Hypereosinophilie, soweit sie die Atemwege und/oder Lungen betrifft, wie auch beispielsweise mit Eosinophilen zusammenhängende Störungen der Atemwege aufgrund oder zusammenhängend mit dem Löffler Syndrom, Eosinophilenpneumonie, parasitischer (insbesondere metazoischer) Befall (einschließlich tropischer Eosinophilie), bronchopulmonale Aspergillose, Polyarteritis nodosa (einschließlich des Churg-Strauss Syndroms), eosinophile Granulome und mit Eosinophilen zusammenhängende Störungen, die die Atemwege betreffen und durch eine Arzneimittelreaktion verursacht werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel können auf jeden geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise oral, wie in Form einer Tablette oder Kapsel, parenteral, beispielsweise intravenös, topisch, beispielsweise in einer Salbe oder Creme, transdermal, beispielsweise in einem Pflaster, durch Inhalation oder intranasal.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Mittel enthalten, können mittels herkömmlicher Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und Techniken hergestellt werden, die in der galenischen Technik bekannt sind. Daher können die oralen Dosierungsformen Tabletten und Kapseln umfassen und Zusammensetzungen zur Inhalation können ein Aerosol oder andere atomisierbare Formulierungen oder Trockenpulverformulierungen enthalten.
Die Erfindung umfasst (A) ein erfindungsgemäßes Mittel in inhalierbarer Form, beispielsweise in einem Aerosol oder einer anderen atomisierbaren Zusammensetzung oder in inhalierbarer partikulärer Form, beispielsweise mikronisierter Form, (B) ein inhalierbares Arzneimittel, das ein erfindungsgemäßes Mittel in inhalierbarer Form umfasst, (C) ein pharmazeutisches Produkt, das ein solches erfindungsgemäßes Mittel in inhalierbarer Form zusammen mit einer Inhaliervorrichtung umfasst und (D) eine Inhaliervorrichtung, die ein erfindungsgemäßes Mittel in inhalierbarer Form enthält.
Die Dosierungen der Erfindung, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, hängen natürlich beispielsweise vom zu behandelnden Zustand, dem gewünschten Effekt und dem Verabreichungsweg ab. Im allgemeinen liegen geeignete Tagesdosen zur Verabreichung durch Inhalation in der Größenordnung von 1 μg bis 10 mg/kg, während für eine orale Verabreichung die Tagesdosen in der Größenordnung von 0,1 bis 1000 mg/kg liegen.
Ein wie hierin vorher beschriebenes Polypeptid (B) oder ein wie hierin vorher beschriebenes mutiertes Polypeptid, das mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, beispielsweise ein Polypeptid, das durch eine Variante eines Polynukleotids kodiert wird, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 umfasst, wobei die Variante einen Sequenzpolymorphismus enthält, kann zur Identifizierung von Enhancern (Agonisten) oder Inhibitoren (Antagonisten) der Aktivität verwendet werden, das heißt zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Behandlung von entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankungen brauchbar sind, insbesondere Asthma. Die Enhancer oder Inhibitoren können beispielsweise Peptide, Peptidomimetika, Nukleinsäuren oder niedermolekulare Verbindungen sein. Demnach liefert die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die die Aktivität eines Polypeptids (B) oder einer Variante hiervon moduliert, die mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, insbesondere einer Substanz, die zur Behandlung der entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankungen, wie Asthma, brauchbar ist, das die Kombination einer Kandidatensubstanz mit diesem Polypeptid (B) oder der Variante hiervon und Messung des Effekts auf die Kandidatensubstanz auf diese Aktivität umfasst. Die Aktivität des Polypeptids (B) oder der Variante hiervon kann beispielsweise durch Förderung der homotypischen Ca²⁺ abhängigen Aggregation und Adhäsion in L-Zellen gemessen werden, wie dies beispielsweise von Sano et al., EMBO J. 12: 2249–2256 beschrieben ist. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die an ein Polypeptid (B) oder Variante hiervon bindet, wie dies hierin vorher beschrieben ist, insbesondere einer Substanz, die zur Behandlung von entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankungen brauchbar ist, wie Asthma, das das Mischen einer Kandidatensubstanz mit dem Polypeptid (B) oder der Variante und die Bestimmung umfasst, ob eine Bindung stattgefunden hat.
In einem weiteren Aspekt liefert ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die an ein mutiertes Polypeptid bindet oder dessen Aktivität moduliert, das durch eine Variante des hierin vorher beschriebenen Polynukleotids (A) kodiert wird, insbesondere einer Substanz, die zur Verwendung bei der Behandlung einer entzündlichen oder obstruktiven Atemwegserkrankung geeignet ist, wie Asthma, das das Mischen einer Kandidatensubstanz mit dem mutierten Polypeptid und (i) Bestimmung, ob die Bindung stattgefunden hat und/oder (ii) Messung des Effekts auf die Kandidatensubstanz auf diese Aktivität umfasst.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

AEBSF:: 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid
BAC:: Künstliches Bakterienchromosom
BAP:: 1,4-Bis(acryloyl)piperazin
BHR:: Bronchiale Hyperreaktivität
BLAST:: Grundlegendes Werkzeug für die lokale Übereinstimmungssuche
BSA:: Rinderserumalbumin
CSGE:: Konformations-empfindliche Gelelektrophorese
dNTP:: Desoxynukleotidtriphosphat
DTT:: Dithiothreit
EIA:: Enzymimmuntest
EST:: Exprimierter Sequenzanhang
FAM:: 6-Carboxyfluorescein
FCS:: Fetales Kälberserum
HBEC:: Humane Bronchialepithelzelle
LBNL:: Lawrence Berkley National Laboratory
LCD:: Logarithmus der Chancen
MTN:: Mehrfachgewebenorthernblot
ORF:: Offener Leserahmen
PAC:: künstliches P1 Chromosom
PCR:: Polymerasekettenreaktion
PBS:: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PEG:: Polyethylenglycol
PMSF:: Phenylmethylsulfonylfluorid
SDS-PAGE:: Natriumdodecylsulfatpolycarylamidgelelektrophorese
SNP:: Einzelnukleotidpolymorphismus
STS:: Sequenz-markierte Stelle
TAMRA:: 6-Carboxytetramethylrhodamin
TDT:: Transmissionsdisäquilibriumtest
TET:: Tetrachlor-6-carboxyfluorescein
TTE:: 44 mM Tris, 14,5 mM Taurin, 0,1 mM EDTA, pH 9,0

Beispiel 1
Asthmatische und nicht-asthmatische Individuen werden aus einer Familienstudie über die Genetik von Asthma in den Niederlanden ausgewählt ([Panhuysen et al., Clin. Exp. Allergy 25 (Supplement 2): 35–38], das medizinische Ethikkomitee des Universitätskrankenhauses von Groningen und der Universität von Maryland genehmigen die Studie und es werden von allen Teilnehmern schriftliche Zustimmungen erhalten). Zwischen 1962 und 1975 wurden Patienten mit Asthma bezüglich einer Diagnose von Asthma und der Optimierung ihrer Behandlung in Beatrixoord, Haren, Holland evaluiert. Für die Aufnahme in diese Studie aus dieser ersten Evaluierung müssen die Patienten 3 Kriterien erfüllen: (1) Die Symptome müssen mit Asthma übereinstimmen, (2) das Alter muss ≤ 45 Jahre betragen, (3) es besteht eine bronchiale Hyperreaktivität gegenüber Histamin (PC₂₀ ≤ 32 mg/ml mittels des 30 Sekunden dauernden de Vries Inhalationsmodells [de Vries et al., Int. Arch. Allergy 20: 93–101]). Die klinische Evaluierung umfasst die Performance von intrakutanen Hauttests mit allgemeinen Luftallergenen, Lungenfunktionstests mit einem Wasserspirometer (Lode Spirograph, Groningen, Holland) und den Test auf bronchiale Hyperreaktivität mit Histamin mittels des 30 Sekunden dauernden Inhalationsprotokolls [de Vries et al., Int. Arch. Allergy 20: 93–101]. Blutproben für die DNA Isolation und das Gesamt IgE, spezifische IgE und die Eosinophilenmessungen werden entnommen.
Von 1990 an werden diese Probanden erneut zusammen mit ihren Ehegatten, mindestens 2 Kindern und, falls möglich, Enkeln untersucht. Insgesamt werden 200 Familien mit 2 und 3 Generationen untersucht. Bei der zweiten Evaluierung (1990–1998) werden die bei der ersten Evaluierung (1962–1975) vorgenommenen Messungen bei den Probanden wiederholt und auch bei ihren Verwandten vorgenommen. Die Reversibilität wird durch Wiederholung der Spirometrie 20 Minuten nach der Verabreichung von 800 μg Salbutamol (Albuterol) getestet. Alle Teilnehmer werden gebeten, eine Lungenmedikation vor dem klinischen Test zu stoppen, falls dies möglich ist: Inhalierte Kortikosteroide werden für 14 Tage, inhalierte langwirkende beta-Mimetika und orale Antihistaminika für 48 Stunden und inhalierte kurz wirkende beta-Mimetika und Anticholinergika für 8 Stunden gestoppt. Die Asthmapatienten weisen keine Asthmaexacerbation auf oder erfordern keine Behandlungsrunde an oralem Prednisolon in den 6 Wochen vor der Studie.
Diese Evaluierung umfasst ferner eine modifizierte Version des British Medical Council Fragebogens mit zusätzlichen Fragen über Symptome und Therapie von Asthma und Allergie [Panhuysen et al., Clin. Exp. Allergy 25 (Supplement 2): 35–38]. Gemäß der Definition liegt eine Asthmadiagnose eines Arztes bei den Probanden vor. Bei den Ehegatten liegt dies vor, wenn das Individuum angibt (1) unter einer laufenden regulären Therapie für Asthma zu sein, (2) jemals einen Allgemeinarzt oder Facharzt bezüglich Asthma besucht zu haben oder (3) jemals eine Asthmamedikation verwendet zu haben. Allergische Rhinitis wird als positive Antwort auf eine der folgenden Fragen definiert: Haben Sie eine laufende oder verstopfte Nase, wenn Sie sich in der Umgebung aufhalten von (1) Tieren (beispielsweise Hunden, Katzen, Pferden), Federn (beispielsweise in Kissen) oder in einem staubigen Teil des Hauses? oder (2) Bäumen, Gräsern und Blumen. Heuschnupfen wird als positive Antwort auf die Frage definiert: Hatten Sie jemals Heuschnupfen?
Das gesamte IgE wird in den ersten 92 Familien durch Festphasenimmuntest [Panhuysen et al., Clin. Exp. Allergy 25 (Supplement 2): 35–38] gemessen. Im ersten Satz an 108 Familien werden die Serum IgE Spiegel durch einen Enzym-gebundenen Fluoreszenztest gemessen (Mini Vidas, Biomerieux Vitek Inc., Marcy, Frankreich). Der Hauttest wird durch einen intrakutanen Hauttest mit 16 herkömmlichen Luftallergenen, einer Positiv- und einer Negativkontrolle ausgeführt. Es werden die folgenden Allergene getestet: Gemischte Gräserpollen, zwei gemischte Baumpollen, gemischte Kräuter, Hausstaubmilbe, Vorratsmilbe, Katzen- Hunde-, Pferde-, Kaninchen-/Meerschweinchenhaare, Federmischung und fünf Pilze (Aspergillus fumigatus, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Botrytis cinerea). (ALK-Abelló, Nieuwegein, Holland). Ein positiver Hauttest liegt vor, wenn der größte Kreisdurchmesser ≥ 5 mm beträgt.
Die Evidenz für eine Kopplung der Gesamt IgE Spiegel [Myers et al., Genomics 23: 464–470], der bronchialen Hyperraktivität [Postma et al., New Eng. J. Med. 333: 894–900] und Asthma [Panhuysen et al., J. Invest Med. 43: 281A, Bleker et al., Am. J. Hum. Genet. 59: A213] zum humanen Chromosom 5q wurde kürzlich in den holländischen Familien mittels eines Kandidatengenansatzes festgestellt. Jedoch ist, wie dies bei den anderen komplexen Krankheiten festgestellt wurde, die Region der Kopplung groß (> 40 cM, wobei sich die Region vom Cytokincluster bis zum β₂-Adrenoceptor erstreckt). Um die Region der Kopplung zu verfeinern wird DNA aus den Blut DNA Proben mittels Standardprotokollen extrahiert (Puregene Kit, Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN). Eine Sammlung aus 37 Markern, die aus Tri- und Tetranukleotidwiederholungen besteht, welche die Cromosom 5q31–q33 Region umfasst, wird zur Genotypisierung der DNA Proben verwendet. Es wird eine Multiplex PCR mittels Fuoreszenz-markierter Primer ausgeführt und die entstehenden amplifizierten Fragmente werden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen getrennt. Die markierten Fragmente werden mittels des ABI377 Sequenziergeräts detektiert und die Genotypen werden mittels der Genotyper Software [Applied Biosystems, USA] mittels herkömmlicher Techniken bewertet. Eine modifizierte Version des Programms Linkage Designer [Van Camp et al., Trends Genet. 13: 82] wird verwendet, um die Allele zu gruppieren und die Vererbung zu überprüfen. Das Ergebnis von Linkage Designer wird dann auf Inkonsistenzen mittels Linkage Version 5.1 Software [Lathrop und Lalouel, in Handbook of Statistics, Band 8, Rao and Chakraborty (Herausgeber), Seiten 81–123, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam] ohne Krankheitsinformation analysiert. Ale letzte Überprüfung der Daten wird Crimap [Lander und Green, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2363–2367] verwendet, um die Reihenfolge und Länge der Chromosomenkarte zu bestimmen und Doppelrekombinante zu detektieren. Bei verbundenen Familien identifiziert diese Analyse eine Kopplungsregion für BHR mit einer LCD Bewertung von mehr als 7,0: Die LOD Spitzenbewertung wird durch die Mikrosatellitenmarker D5S2011 und D5S2017 definiert.
Beispiel 2

Klone mit einem künstlichen bakteriellen Chromosom (BAC), die die chromosomale Region zwischen den Markern D5S2011 und D5S2017 umspannen, wie dies mittels der physikalischen Karteninformation für das humane Chromosom 5q31–q33 identifiziert wird, die öffentlich auf der Webseite des Lawrence Berkley National Laboratory Genome Centre erhältlich ist (LBNL, 111-hgc.lbl.gov/biology/bacmap/2.gif), die als BAC Klonnummern h164 (22f14), c5 (50g20), h187 (35k5), h167 (8e5) und h177 (32d16) von Research Genetics (Huntsville, Alabama, USA) erhalten wurden und ein künstliches P1 Chromosom (PAC), das durch PCR mittels der Primer mit den SEQ ID Nr. 9 bis 12 für die STS Marker bac51107T (5' Ende von BAC 50g20) und bac51330T (3' Ende von BAC 22f14) isoliert wurde, die von der LBNL Webseite (www_hgc.lbl.gov/sts.html) durch Genome Systems Inc. (St. Luis, Missouri, USA) erhalten wurde, wobei die BACs und PAC zusammen eine Subregion der humanen chromosomalen Region 5q31–5q33 abdecken, werden mittels herkömmlicher Techniken mit einem ABI377 Sequenzgerät sequenziert (http://www.pebio.com/ab/about/dna/377/). Die entstehende genomische DNA Sequenz wird mittels Genscan (Burge und Karlin, J. Mol. Biol. 268: 78–94) und Genemark Version 2.4 (Borodovsky und Mclnich, Corp. Chem. 17: 123–133) Genfindungsprogramme und BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410) Homologiesuchen gegen bekanntes Protein, EST und DNA Datenbanken (Swissprot, Swissprotplus, GenBank, Genbank Updates, EMBL, Genemblplus, GenBank EST, EMBL EST, GenBank STS, EMBL STS) analysiert, wobei die Ergebnisse hiervon in eine Humanchromosom 5 spezifischen Version von ACeDb (A C. elegans Database, http://www.sanger.ac.uk/Software/Acedb/) für eine graphische Anzeige eingegeben werden. Aus dieser graphischen Darstellung werden signifikante Regionen (das heißt Gene) durch vorhergesagte Exons und alignierte EST/Proteintreffer identifiziert. Ein Gen AAGA wird anfänglich auf der graphischen Anzeige eines Genscan-vorhergesagten Gens identifiziert, das zumindest 22,5 kb genomischer DNA abdeckt und 5 Exons umfasst, die in der Größe von 153–2196 bp variieren und sich über 2 Inseln der DNA Sequenz ausdehnen, die durch einen Abschnitt nicht sequenzierter DNA getrennt sind:

Genescan Vorhergesagtes Exon	Nukleotidposition ✝ in:		Exongröße (bp)
	SEQ ID Nr. 1	SEQ ID Nr. 2
1	1053–1889	-	837
2	5031–7226	-	2196
3	12987–13206	-	220
4	16002–16396	-	395
5	-	1695–1847	153

✝ die angegebenen Koordinaten sind für das reverse Komplement der ursprünglichen genomischen Sequenz angegeben

Die DNA Sequenzen in den von Genscan vorhergesagten Exons kodieren für ein Protein mit Homologien zu Molekülen vom Cadherintyp in mehreren Organismen, einschließlich dem Menschen, was nahelegt, dass es ein Vertreter der Cadherinproteinfamilie ist. Es wird eine Homologie von 100% innerhalb der mRNA Sequenzen und ESTs detektiert, die dem Protocadherin 42 Gen entsprechen (Genbank Hinterlegungsnummern L11370, L11369 und AA481656). Die Alignierung der mRNA und der EST Sequenzen identifiziert 3 Spleißvarianten (SEQ ID Nr. 4, 5 und 6), wobei zwei davon kürzlich identifiziert wurden (Sano et al., EMBO J. 12: 2249–2256) und eine (SEQ ID Nr. 6) neu ist. Eine Analyse der SEQ ID Nr. 4, 5 und 6 bezüglich des längsten offenen Leserahmens (ORF) mittels des EditSeq Moduls der Lasergene Software (DNASTAR, Inc. Madison, Wisconsin, USA) zeigt ORFs mit 3198 Nukleotiden (SEQ ID Nr. 4, Position 377–3574) und 3729 Nukleotiden (SEQ ID Nr. 5 und 6, Position 377–4105). Es wird erwähnt, dass der ORF für die SEQ ID Nr. 4 118 Nukleotide länger ist als bisher berichtet (Position 494–3574, Sano et al., EMBO J. 12: 2249–2256 und GenBank Hinterlegungsnummer L11370), wobei die Translation zu einem Protein (SEQ ID Nr. 7) führt, das 39 Aminosäuren länger ist als das von der Gen-Bank Nr. L11370 abgeleitete (1065 Aminosäuren gegenüber 1026 Aminosäuren). Der ORF für die SEQ ID Nr. 5 und 6 wird in ein 1242 Aminosäuren langes Protein (SEQ ID Nr. 8) übersetzt.
Unter Verwendung eines 441 bp PCR Fragments, das dem Exon 2 entspricht und aus einer humanen genomischen DNA mittels der Primer mit den SEQ ID Nr. 13 und 14 erzeugt wurde, wird ein Northern Blot der mRNA aus mehreren humanen Geweben (Humaner 12 Spuren MTN Blot, Clontech Laboratories UK Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) sondiert, um das Expressionsmuster von AAGA zu untersuchen. Banden, die den Spleißvarianten entsprechen, werden im Gehirn, im Herzen, im Skelettmuskel, im Dickdarm, in der Niere, in der Leber, im Dünndarm, im Pankreas und in der Lunge detektiert. Es wird keine Hybridisierung für den Thymus, die Milz und peripheren Blutlymphozyten detektiert. Die PCR Analyse der Erststrang cDNAs, die von verschiedenen Zelllinien mittels Primer erzeugt wurden, die die SEQ ID Nr. 13 und 14 aufweisen, zeigt, dass AAGA in großer Menge in aktivierten und nicht-aktivierten humanen Bronchialepithelzellen (HBECs), in mittlerer Menge in Fibroblasten und in geringer Menge in Neutrophilen und Makrophagen exprimiert wird.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird eine konformationssensitive Gelelektrophorese (CSGE: Ganguly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10325–10329, Ganguly und Williams, Hum. Mut. 9: 339–343) verwendet, um potentielle Sequenzveränderungen in PCR-amplifizierten DNA Fragmenten aus Blut DNA zu detektieren, die aus asthmatischen Patienten isoliert wurden. Es werden einzelne Basenfehlpaarungen in DNA Heteroduplexen durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von mild denaturierenden Lösemitteln detektiert, die die Tendenz für Fehlpaarungen unter Bildung von Konformationsveränderungen verstärken und zu einer unterschiedlichen Migration von Homoduplexen und Heteroduplexen führen. Um Heteroduplexe zu erzeugen werden amplifizierte PCR Produkte thermisch denaturiert, aneliert und dann durch Polyacrylamidgelektrophorese analysiert. Die DNA Fragmente werden durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. DNA Fragmente, die unterschiedliche elektrophoretische Migrationsmuster zeigen, werden dann sequenziert, um das Vorkommen einer Veränderung der Polynukleotidsequenz und die exakte Art der Veränderung zu bestätigen.

Die SEQ ID Nr. 4, 5 und 6 werden manuell mit SEQ ID Nr. 1 und 2 mittels des EditSeq Moduls der Lasergene Software (DNASTAR, Inc. Madison, Wisconsin, USA) aligniert. Diese Analyse zeigt an, dass ein 470 bp Segment der DNA Sequenz am 5' Ende der SEQ ID Nr. 4, 5 und 6 nicht mit SEQ ID Nr. 1 oder 2 aligniert. Eine BLAST Suche der Genbank Datenbank wird mittels der 470 bp mRNA Sequenz ausgeführt, um die fehlende genomische Sequenz zu identifizieren. Dies identifiziert eine genomische DNA Sequenz mit 2717 bp (SEQ ID Nr. 3) in Genbank Hinterlegungsnummer ACO13643 (154594 bp Arbeitssequenz aus 13 ungeordneten Stücken des humanen Klons RP11-16P20). Die Alignmentanalyse zeigt, dass die 3 alternativen Transkripte sich von 7 Exons ableiten, die sich zumindest über 21 kb genomischer DNA erstrecken: Spleißvariante 1

Exon	SEQ ID Nr. 4	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 3✝	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 1✝	Exongröße (bp)
1	1–456	2115–2570	-	456
*	457–470	-	-	14
2	471 – 1052	-	1030–1611	582
3	1053–1298	-	1648–1893	246
4	1299–4069	-	5035–7805	2771

Spleißvariante 2

Exon	SEQ ID Nr. 5	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 3✝	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 1✝	Exongröße (bp)
1	1–456	2115–2570	-	456
*	457–470	-	-	14
2	471–1052	-	1030–1611	582
3	1053–1298	-	1648–1893	246
4	1299–3490	-	5035–7226	2192
5	3491 – 3710	-	12987–13206	220
6	3711 – 4648	-	16002–16950	949

Spleißvariante 3

Exon	SEQ ID Nr. 6	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 3✝	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 1✝	Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 2✝	Exongröße (bp)
1	1–456	2115–2570	-		456
*	457–470	-	-		14
2	471–1052	-	1030–1611		582
3	1053–1298	-	1648–1893		246
4	1299–3490	-	5035–7226		2192
5	3491–3710	-	12987–13206		220
6	3711–4691	-	16002–16896		895
7	4592–4684	-	-	797–889	93

* mRNA Sequenz aligniert nicht mit der verfügbaren genomischen Sequenz
✝ die Koordinaten sind für das reverse Komplement der ursprünglichen genomischen Sequenz angegeben

PCR Primersätze, die der AAGA Gensequenz entsprechen, werden mittels SEQ ID Nr. 1 und 2 und Primer Express^® (Version 1.0, Perkin Elmer, P/N 604313) entworfen. Diese Primersätze (SEQ ID Nr. 15–94) sind:
Unter Verwendung der obigen Primersätze werden 40 Polynukleotide aus Blut DNA Proben von 16 asthmatischen Patienten amplifiziert. Die PCR Reaktionen werden in einem Reaktionsvolumen von 10 μl ausgeführt, worin 1 × GeneAmp^® 10 fach PCR Puffer (Perkin Elmer P/N N808-0240), 13 ng Matrizen DNA, jeweils 400 μM dNTP (Amersham Life Science Nucleix Plus^®, 2,5 mM dNTP Mischung, Produktnummer US77119), jeweils 30 ng eines Primers, 2 mM MgCl₂ und 0,5 E AmpliTaq Gold^® Polymerase (Perkin-Elmer P/N N808-0242) enthalten sind.
Typische thermische Zyklusbedingungen mittels eines Biometra UNO II Cyclers (Gerätenummer 050-603, Anachem Ltd., Luton, UK) sind folgende, wobei die Sequenz Schritt 2 – Schritt 3 – Schritt 4 36 fach wiederholt wird:

Schritt 1 95°C 10 min

Schritt 2 92°C 1 min

Schritt 3 60°C 1 min

Schritt 4 72°C 2 min

Schritt 5 72°C 10 min
Um Heteroduplexe zu erzeugen, werden 2 μl PCR Produkt bei 95°C für 10 Minuten denaturiert und bei 68°C für 30 Minuten mittels eines Thermocyclers (beispielsweise Biometra UNO II) aneliert. Es werden 2 μl eines 2 fach Auftragspuffers (20% Ethylenglycol, 30% Formamid, 0,025% Xylolcyanol, 0,025% Bromphenolblau) zu jeder Probe vor der Gelanalyse gegeben.
Es wird ein Standard DNA Sequenziergerät (Owl Scientific S3S, Autogen Bioclear UK Ltd.) mit einem Kamm für 60 Proben (Owl Scientific S2S-60A, Autogen Bioclear UK Ltd) und einem Standardnetzgerät (Biorad, Katalognummer 165-5057) verwendet, das mit einer Temperatursonde ausgestattet ist (Biored, Katalognummer 165-5058). Es wird ein 0,4 mm dickes 15% Polyacrylamidgel mittels eines 99:1 Verhältnisses aus Acrylamid zu BAP Quervernetzer, 10% Ethylenglycol und 15% Formamid in 0,5 × TTE hergestellt. Die Gele lässt man für 1 Stunde bei 30 Watt vorlaufen, wobei die Temperatur auf maximal 25°C beschränkt wird (unter Verwendung eines elektrischen Gebläses, um die Temperatur erforderlichenfalls unten zu halten, beispielsweise Jencons, Katalognummer 292-004). Nach dem Vorlauf werden die Vertiefungen mit einer Pipette gespült und die Proben werden auf die Vertiefungen aufgetragen. Das Gel wird dann bei 12 Watt über Nacht (15 Stunden) bei 25°C einer Elektrophorese unterzogen. Fragmente mit mehr als 350 bp bleiben auf dem Gel.
Nach der Elektrophorese werden die Gelplatten getrennt. Das Gel wird gefärbt, indem man das Gel in 0,5 × TTE, worin 1 mg/ml Ethidiumbromid (Biorad, Katalognummer 161-0433) enthalten ist, für 10 Minuten legt, wonach eine Entfärbung in 0,5 × TTE für 10 Minuten erfolgt. Das Gel wird dann auf einem UV Transilluminator (beispielsweise UVP GDS 7500) photographiert.

Potentielle Polynukleotidveränderungen werden durch CSGE in einem oder mehreren der 16 Patienten für 15 der 40 PCR Fragmente detektiert. Für jede dieser potentiellen Veränderungen wird das PCR Fragment aus allen 16 Patienten einer Doppelstrang DNA Sequenzierung auf einem automatisierten ABI 377 Sequenziergerät mittels Standardverfahren sequenziert (http://www.pebio.com/ab/about/dna/377) und die entstehende DNA Sequenz wird mittels Consed Software (Gordon et al., Genome Res. 8: 195–202) analysiert, um das Vorkommen einer Sequenzveränderung zu bestätigen und die exakte Basenveränderung zu identifizieren. Alle 15 potentiellen Veränderungen, die durch CSGE detektiert wurden, werden bestätigt. Die Anzahl an Patienten, die die polymorphen Veränderungen zeigen, sind in der folgenden Tabelle gezeigt:

Polymorphismus	SEQ ID Nr. 1 Position	SEQ ID Nr. 2 (rev. kompl.) Position	SEQ ID Nr. 4 Position	AA Veränderung	Anzahl an Patienten
G zu T	589	-	-	Intron 1	16
C zu T	1001	-	-	Intron 1	2
C zu A	1060	-	501	Pro3-His (Exon 2)	16
G zu C	2033	-	-	Intron 3	1
T zu G	2193	-	-	Intron 3	1
A zu G	2561	-	-	Intron 3	16
G zu A	5667	-	1931	Ala480Thr (Exon 4)	1
C zu T	5804	-	2068	Pro525Pro (Exon 4)	1
C zu T	6377	-	2641	Ala716Ala (Exon 4)	14
G zu C	7390	-	3654	3' untranslatiert	5
G zu T	7531	-	3795	3' untranslatiert	1
G zu C	-	1212	-	3' untranslatiert	12
G zu A	-	1216	-	3' untranslatiert	1
G zu A	-	1964	-	3' untranslatiert	2
G zu A	-	2330	-	3' untranslatiert	5

Zwei der detektierten Polynukleotidveränderungen verändern die Aminosäuresequenz (nicht synonyme Veränderung) des von AAGA kodierten Proteins, 2 sind synonym (keine Veränderung eines Rests aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes) und 11 treten in den nicht kodierenden Regionen des Gens auf.
Zweihundert Trios (beide Eltern und ein Kind betroffen) aus den holländischen Familien werden auf SNPs an den Positionen 1060, 2561, 6377, 7390 in SEQ ID Nr. 1 und der Position 2330 in SEQ ID Nr. 2 durch einen allelischen Diskriminierungstest mittels TaqMan^® Technologie auf dem ABI Prism^® 7700 Sequenzdetektor (PE Applied Biosystems, Warrington, UK) genotypisiert. Zwei fluoregene TaqMan^® Sonden, eine spezifisch für das nicht-SNP Allel und die andere spezifisch für das SNP Allel, werden entworfen, um mit der Stelle der SNP in der durch PCR amplifizierten Zielsequenz zu hybridisieren.
Die TaqMan^® Sonden bestehen aus einem Oligonukleotid mit einem Fluoreszenzreporterfarbstoff (FAM oder TET) und einem Löschfarbstoff (TAMRA), die jeweils kovalent an die 5' und 3' Enden gebunden sind. Die Nähe des Reporterfarbstoffs an den Löschfarbstoff führt zu einer Unterdrückung der Reporterfluoreszenz in den intakten Sonden. Nach der Amplifizierung der Zielsequenz wird die Sonde während des Verlängerungsschritts der PCR abgespalten. Dies entfernt den Einfluss des Löschungsfarbstoffs und erlaubt dem Reporterfarbstoff zu fluoreszieren. Da SNP und nicht-SNP Sonden unterschiedliche Reporterfarbstoffe tragen, ist das Fluoreszenzausmaß jedes Farbstoffs proportional zur Menge an SNP oder nicht-SNP Zielsequenz in der Probe.
Der Transmissionsdisäquilibriumstest [Spielman et al., Am. J. Hum. Genet. 52: 506–516] wird zum Testen einer genetischen Assoziation zwischen den 5 genotypisierten SNPs und Asthma/Asthmasubphänotypen verwendet. In diesem Test wird ein Allel, das von einem Elternteil an ein betroffenes Kind weitergegeben wird, mit dem anderen Allel verglichen, das nicht vom gleichen Elternteil übertragen wurde und dann wird der McNemar Chi-Quadrattest der Unterschiede auf die entstehenden Paare angewendet [Terwilliger und Ott, Hum. Hered. 42, 337–346]. Die TDT Analyse der aus den 200 holländischen Asthmafamilien erhaltenen Genotypdaten zeigt eine starke genetische Assoziation zwischen den SNPs and den Positionen 6377 (p = 0,00017) und 7390 (p = 0,00049) in SEQ ID Nr. 1 und bronchiale Hyperreaktivität und legt nahe, dass AAGA ein Empfänglichkeitsgen für Asthma ist und dass Individuen, die zwei SNPs tragen, einem erhöhten Risiko zur Entwicklung von bronchialer Hyperreaktivität ausgesetzt sind. Zusätzlich werden jeweils p = 0,01 und p = 0,001 für die SNPs an den Positionen 6377 und 7390 mittels des Familien-basierten Assoziationstests erhalten [FBAT, Horvath, Xu und Laird, Eur. J. Hum. Genet. 9, 301–306].
Beispiel 4
Dieses Beispiel betrifft die Expression des Volllängen AAGA mit einem Anhang aus 6 Histidinen am C-Terminus mittels des Baculovirussystems in T. ni Hi5 Zellen und die Reinigung des entstehenden Polypeptids
1. Konstruktion eines rekombinanten AAGA Baculovirus
Es wird eine EcoRI Einzelschnittstelle 5' zum AAGA Startcodon (Position 377 in SEQ ID Nr. 4, 5 und 6) durch PCR Amplifikation mittels des folgenden Primers eingeführt:
Es wird ein weiterer Primer verwendet, um 6 Histidinreste unmittelbar vor dem AAGA Stopcodon einzuführen (Position 3574 in SEQ ID Nr. 4 für 3ST1 und Position 4105 in SEQ ID Nr. 5 und 6 für 3ST2). Der Primer baut auch eine KpnI Einzelschnittstelle 3' zum AAGA Stopcodon ein.
Die rekombinante "His Anhang" Version der AAGA Spleißvariante 1 wird als 3208 bp EcoRI/KpnI Fragment in den EcoRI/KpnI verdauten pFastbac1 Baculovirustransfervektor (Life Sciences) ligiert. Die rekombinante "His Anhang" Version der AAGA Spleißvarianten 2 und 3 wird als 3739 bp EcoRI/KpnI Fragment in das EcoRI/KpnI verdaute pFastbac1 ligiert. Die rekombinanten AAGA Sequenzen werden in Bacmid DNA überführt, die in DH10Bac Zellen enthalten ist (Life Sciences, Bac to Bac Baculovirusexpressionssystem). Rekombinante AAGA Bacmide werden aus DH10Bac Zellen isoliert und in Sf9 Zellen mittels publizierter Protokolle transfiziert (Bac to Bac Baculovirusexpressionssystem Handbuch, Life Sciences).
2. Amplifizierung von rekombinanten Baculovirusstämmen
Der rekombinante Baculovirus wird durch die Infektion von Sf9 Zellen (gehalten in SF900 SFMII Medium, Life Science) bei einer Zelldichte von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml und einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 für 96 Stunden amplifiziert. Die Sf9 Zellen werden dann bei 1000 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände, die einen hohen Virustiter enthalten, werden bei 4°C gelagert.
3. Expression von rekombinantem AAGA in Hi5 Zellen
Hi5 Zellen (Invitrogen), die bei Dichten zwischen 3 × 10⁵ und 3 × 10⁶ Zellen/ml in Excell 401 Medium (JRH Biosciences, vertrieben von AMS Biotechnology) entweder in Schüttelkolben (die bei 90 Upm rotieren) oder Rollflaschen (die bei 75 Upm rollen) gehalten werden, werden mit dem amplifizierten rekombinanten Baculovirus bei einer Zelldichte von 2,0 × 10⁶ mit einer MOI von 2,0 für 60 Stunden infiziert. Die Hi5 Zellen werden nach der Infektion bei 1000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, die Überstände werden abgegossen und die Zellpellets werden bei –80°C eingefroren.
4. Rohlysatpräparation
Die Zellen (1 × 10⁹) werden in 100 ml Lysepuffer (20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl, 5% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mM Imidazol, 0,1% Nonidet P-40, 40 μg/ml AEBSF, 0,5 mg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin und 0,7 μg/ml Pepstatin A) resuspendiert. Die Zellen werden für 15 Minuten auf Eis inkubiert und dann bei 39 000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Probe wird durch ein 0,22 μm Filter unmittelbar zur Verwendung filtriert.
5. Metallchelataffinitätschromatographie
Die Metallchelataffinitätschromatographie wird bei Raumtemperatur mit einer Säule ausgeführt, die an eine BioCAD Chromatographiestation angeschlossen ist. Eine 20 ml Poros MC/M (16 mm D × 100 mm L) Säule wird mit Ni²⁺ vor der Verwendung und nach jeder Reinigung beladen. Um sie mit Ni²⁺ zu beladen wird die Säule mit 10 Säulenvolumina (CV) an 50 mM EDTA pH 8, 1 M NaCl, gefolgt von 10 CV Wasser gewaschen. Die Säule wird mit 500 ml an 0,1 M NiSO₄ pH 4,5–5 beladen, mit 10 CV Wasser gewaschen, dann wird ungebundenes Ni²⁺ durch Waschen mit 5 CV an 0,3 M NaCl entfernt. Alle Schritte werden mit einer Flussrate von 20 ml/min ausgeführt. Die beladene MC/M Säule wird mit 5 CV Puffer B (20 mM Hepes pH 7,5, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 250 mM Imidazol) gesättigt, wonach eine Äquilibrierung mit 10 CV Puffer A (wie Puffer B, außer 0,5 mM Imidazol) erfolgt. Es werden 90 bis 95 ml des rohen Lysats auf die Säule pro Lauf bei einer Flussrate von 20 ml/min aufgetragen. Die anschließenden Schritte werden bei einer Flussrate von 30 ml/min ausgeführt. Das gesamte ungebundene Material wird durch Waschen mit 12 CV Puffer A entfernt und AAGA eluiert durch die Anwendung eines 0 bis 100% Puffer B Gradienten über 10 CV. Die Fraktionen (8 ml) werden über den Gradienten gesammelt. Die AAGA-enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und es werden Proteaseinhibtoren zu den für den Lysepuffer oben beschriebenen Endkonzentrationen zugegeben. Es wird auch DTT bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Die vereinigten Fraktionen werden über Nacht gegen 4 Liter an 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 0,2 mM PMSF bei 4°C dialysiert.
6. Ionenaustauschchromatographie (Anionenaustausch)
Es wird eine Resource^® Q Chromatographie bei 4°C mit einer Säule ausgeführt, die an eine FPLC Station (Amersham Pharmacia Biotech) angeschlossen ist. Eine 6 ml Resource^® Q Säule (16 mm D × 30 mm L) wird mit 10 CV Puffer C (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT) bei einer Flussrate von 2 ml/min äquilibriert. Das dialysierte Metallchelateluat wird auf die Säule aufgetragen und mit 10 CV Puffer C gewaschen. Das Protein wird durch Anwendung von 0 bis 100% Puffer D Gradient (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 1 mM NaCl) über 10 CV eluiert. Es werden Fraktionen (3 ml) bei der Elution der Säule gesammelt.
7. Gelfiltration
Die Gelfiltrationschromatographie wird bei 4°C mit einer Säule ausgeführt, die an eine BioCAD SPRINT Chromatographieanlage (PE Biosystems) angeschlossen ist. Eine 24 ml (10 mm D × 300 mm L) Superdex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech) Säule wird mit 10 CV Puffer E äquilibriert (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 150 mM NaCl) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Das Ionenaustauscheluat wird auf die Säule aufgetragen und mit Puffer E äquilibriert. Es werden Fraktionen (1 ml) während der Reinigung gesammelt und analysiert.
8. Probenkonzentrierung
Die Proben werden etwa 10 fach mittels Millipore Ultrafree 15 Ultrazentrifugationsvorrichtung (MG Ausschluss 50 kDa) bei 4°C konzentriert. Die Vorrrichtung wird vor der Verwendung mit Wasser vorgewaschen. Der schließliche Lagerpuffer, der für eine Langzeitlagerung bei –80°C verwendet wird, ist 20 mM Hepes pH 7,5, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 5% Glycerin. Das Glycerin kann bei einer Lagerung bei 4°C aus der Probe weggelassen werden.
Beispiel 5
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AAGA Protein, das wie in Beispiel 4 beschrieben gereinigt wurde.
Immunisierung von Kaninchen

Holländische Kaninchen (Harlen-Olac) werden an 4 subkutanen Stellen mit 500 μg gereinigtem AAGA Protein in PBS gemäß dem folgenden Plan immunisiert:

Tage	Immunisierungen
0	1. Immunisierung 1:1 in komplettem Freundschem Adjuvans
15	1. Booster 1:1 in inkomplettem Freundschem Adjuvans
45	2. Booster 1:1 in inkomplettem Freundschem Adjuvans
55	1. Testblutung aus der Ohrarterie
Jeden Monat	Booster 1:1 in inkomplettem Freundschem Adjuvans bis eine gute Antikörperreaktion erhalten wird

Testblutungen (500 μl) werden entnommen und das Serum wird auf den Antikörpertiter getestet. Das Serum wird gewonnen, wenn ein maximaler Titer erreicht ist. Dies wird durch Sammeln von Blut (10 ml) ausgeführt und es kann für 2 Stunden bei 4°C gerinnen. Das Blut wird bei 1000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um das Serum abzutrennen. Das Serum wird entfernt und bei –20°C gelagert, bis es getestet wird.
ELISA Screening
Nunc-Immuno Plate Maxisorp Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Fisher Scientific UK, Loughborough, UK) werden als fester Träger verwendet und mit dem gereinigten AAGA Protein (100 ng/Vertiefung) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten werden für 3 Stunden bei 37°C mit PBS geblockt, worin 2% BSA (Sigma) und 0,02% NaN₃ (Sigma) enthalten sind. Nach dem Blockieren werden die Platten über Nacht bei Raumtemperatur mit Serum in verschiedenen Verdünnungen von PBS inkubiert. Das Vorkommen von polyklonalen Antikörpern wird sowohl mit Biotin-markierten IgG Antikörpern gegen Kaninchen (Ziege-anti-Kaninchen IgG Antiserum, 1:25 000 Verdünnung) mit einer Inkubationszeit von 40 Minuten überprüft. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Streptavidin (Immuno Research, Dianova, CH) wird dann bei einer Verdünnung von 1:10 000 zugegeben. Die Entwicklung der Reaktion wird durch die Zugabe eines Substrats für alkalische Phosphatase (Sigma, 1 mg/ml) ausgeführt, das in Diethanolamin gelöst ist. Nach 45 Minuten wird die Absorption bei 405 nm mit einer Referenz bei 490 nm mit einem ELISA Plattenlesegerät (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hemel Hempstead, UK) ausgelesen.
Reinigung
5 ml Protein A Agarose wird auf eine Chromatographiesäule aufgetragen und mit 6 Säulenvolumina an 0,1 M Tris(hydroxymethyl)methylamin (Tris) Puffer pH 7,5 gewaschen. Das Kaninchen Serum, das anti-AAGA Antikörper enthält, wird mit Tris Puffer verdünnt (1/2) und zur Protein A Agarose gegeben. Ungebundene Proteine werden von der Säule durch Waschen der Säule mit 6 Säulenvolumina an Tris Puffer entfernt. Das IgG wird von der Säule mit 3 Säulenvolumina an 0,1 M Glycinpuffer pH 3,0 eluiert und als 1 ml Fraktionen in Röhrchen gesammelt, die 28 μl an 1 M Tris enthalten. Die Fraktionen, die bezüglich des Proteingehalts positiv sind, werden auf Reinheit durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen überprüft. Es werden zwei Banden mit 50 und 25 kDa sichtbargemacht, die den schweren und leichten Ketten eines Immunglobulingens entsprechen. Fraktionen, die nur Immunglobulin enthalten, werden vereinigt, es wird erneut die Proteinkonzentration überprüft und sie werden bei –20°C gelagert.
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen AAGA Protein, wie dies in Beispiel 4 gereinigt wurde.
Immunisierung von Mäusen

Weibliche Balb/c Mäuse werden intraperitoneal mit 100 μg an AAGA Protein in PBS gemäß dem im folgenden angegebenen Plan immunisiert:

Tage	Immunisierungen
1	1. Immunisierung 1:1 mit komplettem Freundschem Adjuvans
14	1. Booster 1:1 mit inkomplettem Freundschem Adjuvans
21	2. Booster 1:1 mit inkomplettem Freundschem Adjuvans
28–30	Drei schließliche Booster in PBS
31	Fusion mit Mausmyelomzellen

Das Serum wird auf den Antikörpertiter durch ELISA (Beispiel 5) untersucht, nachdem das Tier zur Präparation der Milzzellen zur Fusion getötet wurde. Falls der Antikörpertiter ausreichend ist (1:1000 bis 1:100 000) werden die Hybridome gescreent, ansonsten verworfen.
Präparation von Myelomzellen
Sp2/0 Mausmyelomzellen (ATCC Nr. CRL 1581, die in Kulturmedium gehalten werden, das 20 μg/ml 8-Azaguanin enthält) werden für eine Woche kultiviert, bevor eine Fusion in RPMI 1640 (8-Azaguanin nicht enthalten), 10% (V/V) FCS und 1% Penicillin-Streptomycin (jeweils 50 IE/ml und 50 mg/ml) enthalten sind. Die Zellen werden durch Zentrifugation (200 × g für 5 Minuten) geerntet und dreimal in kaltem RPMI 1640 gewaschen. Etwa 2,5 × 10⁶ Zellen werden pro Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verwendet.
Herstellung einer Milzzellsuspension
Die Maus wird durch eine Überdosis Betäubungsmittel (Foren) getötet, die Milz wird herausgenommen und durch ein Zellsieb gepresst (70 μm Sieb, Becton & Dickinson, Oxford, UK, Katalognummer 2350). Die Zellsuspension wird dreimal in RPMI 1640 (wie oben) gewaschen und ausgezählt: Es sind 5 × 10⁶ Zellen/Platte mit 96 Vertiefungen erforderlich.
Fusion von Myelomzellen und Milzzellen
Die Milz- und Myelomzellen werden gemischt (2:1), zentrifugiert (200 × g für 5 Minuten) und das Pellet wird in einem 37°C Wasserbad aufgewärmt. Das vorgewärmte Polyethylenglycol 4000 (1 ml pro 10⁸ Zellen) wird langsam über 1 Minute und anschließend 20 ml an vorgewärmtem Waschmedium über 2 Minuten zugegeben. Nach der Zentrifugation wird das Pellet sorgfältig in Selektionsmedium resuspendiert (RPMI 1640, 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% BM enthaltendes H1 (Fütterzellenersatz von Boehringer Mannheim, Lewes, UK, Katalognummer 1 088 947), 10% HAT Mediumsupplement (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, um auf nicht fusionierte Myelomzellen zu selektieren, Boehringer Mannheim, Lewes, UK, Katalognummer 644 579) und mit 200 μg/Vertiefung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ausgebracht. Nach 5 Tagen können Cluster an Hybridzellen durch Untersuchung des Bodens der Mikrotitervertiefungen mit einem invertiertem Mikroskop identifiziert werden. Nach 10 bis 14 Tagen wird der Kulturüberstand auf das Vorkommen von Antikörpern durch ELISA (Beispiel 4) getestet. Die positiven Klone werden in einer Testplatte mit 24 Vertiefungen vermehrt und erneut getestet.
Klonierung positiver Hybridome
Die vermehrten Klone, die immer noch positiv sind, werden durch Grenzverdünnung kloniert. Die Zellen werden seriell in vier Verdünnungsschritten in einer Mikrotiterplatte mit 5, 2, 1 und 0,5 Zellen/Vertiefung verdünnt. Das HAT Mediumsupplement wird gegen HT Mediumsupplement ersetzt (Boehringer Mannheim, Lewes, UK, Katalognummer 623 091). Nach etwa 1 Woche werden die Zellen durch ELISA gescreent (Beispiel 4). Die Zellen der Vertiefungen, die einen einzelnen positiven Klon enthalten, werden vermehrt.
Herstellung eines Überstands mit monoklonalem Antikörper
Die Zellen werden in Kulturflaschen in Standardmedium (RPMI 1640, 10% (V/V) FCS und 1% Penicillin-Streptomycin) angezogen, bis die Hybridome das Wachstum überschreiten und sterben. Der Debris wird durch Zentrifugation entfernt und der Überstand, der die Antikörper enthält, wird mittels ELISA (Beispiel 4) titriert, bevor die Lagerung unter sterilen Bedingungen bei 4°C, –20°C oder –70°C erfolgt. Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum eine Krankheit aufweist oder hierfür gefährdet ist, die durch bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet ist, das umfasst die Bestimmung in einer Probe an Zellen aus dem Individuum (i) die Expressionsmenge eines Polynukleotids (A), das die Nukelotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 oder eine Sequenz umfasst, die hiermit unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder die Expressionsmenge eines Polypeptids (B), das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8 oder eine Variante hiervon mit Zell-Zell-Adhäsionsfunktionsäquivalenz umfasst oder die Menge an Bioaktivität dieses Polypeptids (B) durch Messen der Calcium-abhängigen Zell-Zell-Adhäsion und den Vergleich der Expressionsmenge von (A) und (B) oder der Menge an Bioaktivität von (B) mit der entsprechenden Expressionsmenge von (A) oder (B) oder der Bioaktivität in einem gesunden Individuum oder (ii) das Vorkommen einer Variante dieses Polynukleotids (A), die mit einer bronchialen Hyperreaktivität assoziiert ist, wobei die Variante von Polynukleotid (A) ein T an der Position aufweist, die der Position 6377 in SEQ ID Nr. 1 entspricht und/oder ein C an der Position aufweist, die der Position 7390 in der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Allel-spezifische Oligonukleotidsonde oder ein Allel-spezifischer Primer, welche zur Detektion eines Polymorphismus im Polynukleotid (A) fähig sind, wie dies in Anspruch 1 (i) oder (ii) an der Position 6377 oder 7390 der SEQ ID Nr. 1 definiert ist, worin die Allel-spezifische Sonde etwa 15 bis 50 Nukloetide aufweist und die Position 6377 oder 7390 der SEQ DIE Nr. 1 überlappt und worin der Primer etwa 15 bis 50 Nukleotide aufweist und die Nukleotidsequenz des Primers dem zu detektierenden Allel entspricht oder teilweise entspricht, wobei etwa 5 bis 10 der Nukleotide am 3 Ende des Primers denen des zu detektierenden Allels entsprechen.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Variante des Polynukleotids (A) nach der Definition in Anspruch 1 (i) ist, die T an der Position 6377 der SEQ ID Nr. 1 und/oder C an der Position 7390 der SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Verwendung eines Polynukleotids (A) nach der Definition in Anspruch 1 (i) oder eines Teils hiervon mit mindestens 20 aufeinanderfolgenden Basen, der Nukleotid 6377 und/oder Nukleotid 7390 der SEQ ID Nr. 1 umfasst, zur Herstellung eines Mittels zur Diagnose oder Prognose einer Erkrankung, die durch bronchiale Hyperreaktivität gekennzeichnet ist.
Verwendung eines Polynukleotids (A) nach der Definition in Anspruch 1 (i), eines Polypeptids (B) nach der Definition in Anspruch 1, eines Antikörpers (C), der mit diesem Polypeptid (B) immunreaktiv ist oder eines Oligonukleotids (D), das eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu der dieses Polynukleotids (A) gemäß der Definition in Anspruch 1 (i) komplementär ist oder (ii) einer Variante hiervon, die mit bronchialer Hyperreaktivität assoziiert ist, wobei die Variante des Polynukleotids (A) ein T an der Position aufweist, die der Position 6377 in SEQ ID Nr. 1 entspricht und/oder ein C an der Position, die der Position 7390 in SEQ ID Nr. 1 entspricht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die durch bronchiale Hyperreaktivität charakterisiert ist.
Verfahren zur Verfolgung der Effektivität der Behandlung eines Individuums mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das umfasst die Schritte der Bestimmung der Expressionsmenge oder Aktivität durch Messen der Calcium-abhängigen Zell-Zell-Wechselwirkung von Polynukleotid (A) oder Polynukleotid (B) nach der Definition in Anspruch 1 (i) oder (ii) in einer DNA Probe vor der Verabreichung aus dem Individuum und einer DNA Probe nach der Verabreichung aus dem Individuum, den Vergleich der jeweiligen Expressionsmenge oder Aktivität durch Messung der Calcium-abhängigen Zell-Zell-Wechselwirkung in der Probe vor der Verabreichung und der Probe nach der Verabreichung und Bestimmung, ob eine Veränderung der Verabreichung des Pharmazeutikums an den Patienten erforderlich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Erkrankung Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, worin die Erkrankung Asthma ist.