DE60220250T2

DE60220250T2 - Produktion eines monoklonaken antikörpers durch eine transgene vogelspezies

Info

Publication number: DE60220250T2
Application number: DE60220250T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey C. Athens RAPP
Original assignee: Avigenics Inc
Current assignee: Synageva Biopharma Corp
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-01-29
Also published as: CA2436754C; EP1364205A4; DE60220250D1; US20020108132A1; ATE363068T1; US20110014653A1; AU2002245335B2; IL157191A; CA2436754A1; EP1364205A1; WO2002063293A1; EP1364205B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von Vogeleiern, besonders von Hühnern, die heterologe Antikörper enthalten. Ganz besonders betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von transgenen Vögeln, die in der Lage sind, ein Ei herzustellen, das einen Saugetier-Antikörper enthält, der in der Lage ist, an ein Antigen zu binden.
Hintergrund
Die Aufreinigung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für ein einzelnes Epitop ist, ist aus Serum nicht durchführbar, da die Konzentration jeder Antikörper-Art in Serum so gering ist. Um diese praktische Schwierigkeit zu überwinden, wurden Hybridomzellen entwickelt, in denen eine B-Lymphozyte mit einer Myelomzelle fusioniert ist. Die immortalisierte Hybridomzelle kann unbegrenzt in vivo als Aszites oder in vitro in Gewebekultur vermehrt werden. Der einzigartige Antikörper, der von der Hybridom-Kultur synthetisiert wird, wird dann aus dem Kulturmedium oder der Aszites-Flüssigkeit aufgereinigt (Kohler & Milstein, 1975, Nature 256: 495–497).
Monoklonale Antikörper haben sich aufgrund ihrer hohen Spezifität für Zielantigene von unbezahlbarem Wert in der Therapeutik, in der Diagnostik und als Forschungswerkzeuge erwiesen. In der Therapeutik wurden monoklonale Antikörper, die mit einem therapeutischen Wirkstoff verknüpft waren, gezielt in spezifische Zellen geliefert. Dieses Verfahren ist von besonderem Nutzen für die Behandlung von Krebs mit chemotherapeutischen Wirkstoffen, die eher gegen Krebszellen als gegen normale Zellen gerichtet sind. Monoklonale Antikörper sind auch nützlich für das gezielte Neutralisieren toxischer Proteine und anderer Antigene, die von mikrobiellen Pathogenen hergestellt werden.
In der Diagnostik haben sich monoklonale Antikörper als Werkzeuge für den Nachweis von Zielenzymen, Pathogenen, zellspezifischen Markern und dergleichen als unbezahlbar erwiesen. Ein Immunglobulin kann zum Nachweis einer Zelle, wie beispielsweise einer Krebszelle, in einem Patienten mit einer Markierung verknüpft sein, oder alternativ die essentielle Komponente eines quantitativen Tests bilden wie beispielsweise eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA). Monoklonale Antikörper sind auch für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen nützlich, wie Antigennachweis und Quantifizierungstests einschließlich ELISAs und immunhistochemischer Verfahren.
Allerdings ist die Herstellung monoklonaler Antikörper durch traditionelle Verfahren laborintensiv und teuer. Die Herstellung von ausreichend Antikörper nach Isolierung des Hybridoms erfordert oft größere Ausgaben für Gewebekultureinrichtungen und die Züchtung von Mäusen. Im letzten Fall ist der Transfer von Zellen und die Entnahme der Aszites-Flüssigkeit teuer, vermag aber dennoch nicht die Mengen bereitstellen, die für die medizinische oder industrielle Verwendung verlangt werden.
Es wurden verschiedene Strategien vorgeschlagen, um die unbefriedigenden Antikörpererträge zu überwinden, einschließlich der Herstellung von Einzelkettenantikörpern (scAb), umfassend die variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines Immunglobulins. Die Nukleinsäuresequenzen, die für diese Regionen kodieren, sind in einem Nukleinsäureexpressionsvektor verknüpft, und das exprimierte scAb-Protein kann in großen Anlagen unter Verwendung von Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, oder Tierzellen hergestellt werden. Allerdings hat sich kein Verfahren als vollständig zufriedenstellend für die Erhöhung der Antikörpererträge auf Niveaus erwiesen, die für eine angemessene gewerbliche Herstellung erwünscht sind. Daher hält die Industrie nun Ausschau nach transgenen Tieren, die beispielsweise ein exogenes Protein wie einen Antikörper unter Bedingungen exprimieren können, die einen hohen Ertrag des Proteins in einer aktiven Form ermöglichen, während posttranslationale Modifizierungen wie Glykosylierung eingefügt werden, die üblicherweise für die volle Funktionalität des Antikörpers erforderlich sind.
Das Gebiet der Transgene wurde ursprünglich entwickelt, um die Wirkung eines einzelnen Gens im Zusammenhang mit dem ganzen Tier und die Phänomene der Genaktivierung, Expression und Interaktion zu verstehen. Diese Technologie ist auch eingesetzt worden, um Modelle für verschiedene Krankheiten in Menschen und anderen Tieren zu erstellen und gehört zu den leistungsstärksten Werkzeugen, die es für die Untersuchung der Genetik und für das Verstehen von genetischen Mechanismen und der Funktion gibt. Aus einer ökonomischen Perspektive aber bietet die Verwendung der Transgentechnologie zur Umwandlung von Tieren in „Proteinfabriken" für die Produktion von spezifischen Proteinen oder anderen Substanzen von pharmazeutischem Interesse signifikante Vorteile über konventionellere Verfahren der Proteinherstellung durch Genexpression (Gordon et al., 1987, Biotechnology 5: 1183–1187: Wilmut et al., 1990, Theriogenology 33: 113–123).
In diesem Zusammenhang wurden heterologe Nukleinsäuren so hergestellt, dass ein exprimiertes Protein mit einem Protein oder Peptid verknüpft sein kann, das die Sekretion des transgenen Expressionsprodukts in Milch oder Urin, aus der/dem das Protein dann gewonnen werden kann, ermöglicht. Diese Verfahren hatten begrenzten Erfolg und können Milch gebende Tiere erfordern, mit den Begleitkosten, individuelle Tiere oder Herden großer Arten zu halten, einschließlich Kühen, Schafen oder Ziegen.
Historisch wurden transgene Tiere fast nur durch die Mikroinjektion des befruchteten Eies hergestellt. Die Pronuklei der befruchteten Eier werden in in vitro mit fremder, das heißt xenogener oder allogener, heterologer DNA oder Hybrid-DNA-Molekülen mikroinjiziert. Die mikroinjizierten befruchteten Eier werden dann in den Genitaltrakt eines scheinschwangeren, Weibchens übertragen (z.B., Krimpenfort et al. In U.S. Pat. Nrn., 5,175,384 , 5,434,340 und 5,591,669 ).
Mikroinjektionstechniken erfordern eine Ausrüstung zur Handhabung von Embryonen und die Möglichkeit, diese in vitro zu mikroinjizieren. Aufgrund einer hohen Eiverlustrate, die durch Lyse während der Mikroinjektion bedingt ist, wird eine große Anzahl befruchteter Eier benötigt. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit geringer, dass manipulierte Embryonen in die Gebärmutter eingepflanzt werden und überleben. Üblicherweise müssen 300–500 befruchtete Eier mikroinjiziert werden, um vielleicht drei transgene Tiere herzustellen. Infolgedessen ist die Herstellung großer Tiere mit diesen Techniken unerschwinglich teuer.
Genetische Information wurde auch unter Verwendung von retroviralen Vektoren in Embryonen übertragen (Jaenisch, R., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci USA 73: 1260–1264), aber diese Technik leidet unter zahlreichen Nachteilen, einschließlich dass die resultierenden Tiere Mosaiktiere mit unterschiedlichen Geninsertionen in unterschiedlichen Geweben waren (Jaenisch, R., 1980, Cell 19: 181–188).
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung eines transgenen Tieres ist der Kernaustausch von befruchteten Ova. Totipotente, das heißt unreife und undifferenzierte Zellen, werden in vitro durch Techniken, die allgemein in der Technik bekannt sind, transfiziert. Die transfizierten diploiden Zellkerne werden durch Mikromanipulation isoliert und dann in ein frisch befruchtetes Ei übertragen, wonach die „nativen" männlichen und weiblichen haploiden Pronuklei durch Absaugen entfernt werden. Die Eizelle setzt dann, basierend auf dem transfizierten diploiden Kern, der in das Ovum gebracht worden ist, die embryonale Entwicklung fort. Weil aber eine außerordentliche Fähigkeit für die Mikromanipulation notwendig ist, ist die Technik teuer und hat eine geringe Erfolgsrate.
Ein System, das Potential hat, ist das Vogelreproduktionssystem. Die Herstellung eines Vogeleies beginnt mit der Bildung eines großen Dotters im Eierstock der Henne. Die unbefruchtete Oozyte oder das Ovum befindet sich auf der Oberseite des Dottersacks. Nach dem Eisprung wandert das Ovum in das Infundibulum des Ovidukts, wo es befruchtet wird, wenn Samen vorhanden sind, und dann bewegt es sich in das Magnum des Ovidukts – das mit tubulären Drüsenzellen überzogen ist. Diese Zellen sekretieren die Eiweißproteine, einschließlich Ovalbumin, Lysozym, Ovomukoid, Conalbumin und Ovomucin in das Lumen des Magnums, wo sie auf dem Vogelembryo und dem Dotter abgelagert werden.
Aufgrund des hohen Grades an Proteinherstellung, der Aussicht auf korrekte Faltung und posttranslationale Modifikation des Zielproteins, der Einfachheit der Produktgewinnung und des kürzeren Entwicklungszeitraumes von Hühnern im Vergleich zu anderen potentiellen Tierarten, bietet das Hennen-Ovidukt ein herausragendes Potential als Protein-Bioreaktor. Deshalb wurden Anstrengungen unternommen, transgene Hühner herzustellen, die aufgrund von Mikroinjektion von DNA im Ovidukt heterologe Proteine exprimieren ( PCT-Offenlegungsschrift WO 97/47739 ).
Bosselmann et al. beschreibt in U.S. Patent Nr. 5,162,215 ein Verfahren für die Einführung eines Replikations-defizienten retroviralen Vektors in eine pluripotente Stammzelle eines unbebrüteten Hühnerembryos; zudem beschreibt er chimäre Hühner, deren Zellen eine heterologe Vektornukleinsäuresequenz exprimieren. Jedoch war der Anteil an G1 transgenen Abkömmlingen (Nachkommen von Vektor-positiven männlichen G0 Vögeln) gering und variierte zwischen 1% und ungefähr 8%. Allgemein hat DNA-Injektion in Vogeleier bis jetzt zu einer geringen und instabilen Transgen-Integration geführt (Sang & Perry, 1989, Mol. Reprod. Dev. 1: 98–106) und Naito et al., 1994, Mol. Reprod. Dev. 37: 167–71). Zusätzlich bringt die Verwendung von viralen Vektoren Einschränkungen in Bezug auf die Technik mit sich, einschließlich der Größe des Transgens, das in den Vektor eingebaut werden kann und der Möglichkeit einer viralen Infektion der Nachkommen. Die Herstellung von transgenen Hühnern durch DNA-Mikroinjektion (supra) ist sowohl ineffizient als auch zeitaufwendig.
Die Übertragung eines Spender-Ovums in das Ovidukt einer Empfänger-Henne könnte die genetische Manipulation von Vögeln vereinfachen. Tanaka et al. (1994, J. Reprod. and Fertility, 100: 447–449) stellten Küken durch in vitro Befruchtung (IVF) her und gaben das befruchtete Ovum in das Ovidukt einer Empfänger-Henne zurück, um die Ei- und Schalenbildung abzuschließen. Dieser experimentelle Ansatz legt ein nützliches Modell für die Herstellung von transgenen Vögeln nahe.
Ein weiteres vielversprechendes Verfahren für die genetische Manipulation ist die stabile Transfektion männlicher Keimzellen in vitro und ihrer Überführung in einen Empfängerhoden. PCT-Offenlegungschrift WO 87/05325 offenbart ein Verfahren für die Übertragung von organischem und/oder inorganischem Material in männlichen Samen oder Eizellen unter Verwendung von Liposomen. Bachiller et al. (1991, Mol. Reprod. Develop. 30: 194–200) verwendeten Liposomen auf Basis von Lipofektin, um DNA in Mäusesamen zu übertragen und erbrachten den Nachweis, dass die Liposomen-transfizierte DNA im Zellkern der Samen in sehr großem Maße vorhanden war, obwohl keine transgenen Mäuse durch diese Technik hergestellt werden konnten. Nakanishi & Iritani (1993, Mol. Reprod. Develop. 36: 258–261) setzten Liposomen auf Basis von Lipofektin ein, um heterologe DNA mit Hühnersamen zu vereinigen, der dann für die künstliche Befruchtung von Hennen verwendet wurde. Obwohl die heterologe DNA in vielen der resultierenden befruchteten Eier nachweisbar war, gab es weder in den DNA-Liposom behandelten Samen noch in den resultierenden Hühnern Anhaltspunkte für eine Integration der heterologen DNA in das Genom.
Heterologe DNA kann auch durch Elektroporation in Samenzellen übertragen werden, wobei Elektroporation lebende Zellen einer Abfolge kurzer elektrischer Impulse mit hoher Feldstärke aussetzt und temporäre, kurzlebige Poren in der Zellmembran der Zellen erzeugt. Die Poren ermöglichen es Zellen, heterologes Material wie beispielsweise DNA aufzunehmen, wobei die Lebensfähigkeit der Zelle nur wenig beeinträchtigt wird. Gagne et al., (1991, Mol. Reprod. Develop. 29: 6–15) offenbarten die Verwendung der Elektroporation, um heterologe DNA in Rindersamen einzuführen, der anschließend für die Befruchtung von Ova verwendet wurde. Allerdings gab es weder im Zellkern des Samens noch in den Zellkern des Eies im Anschluss an die Befruchtung durch den Samen Anhaltspunkte für eine Integration der elektroporierten DNA.
Noch ein weiteres Verfahren, das ursprünglich für die Integration heterologer DNA in Hefen und Schleimpilze entwickelt worden ist, und später für Vogelsamen angepasst worden ist, ist die Restriktionsenzym-vermittelte Integration (REMI) (Shemesh et al., in WO 99/42569 ), die eine lineare DNA einsetzt, die durch Schneiden eines Plasmids mit einem Restriktionsenzym, das einzelsträngige, kohäsive Enden schafft, aus einer Plasmid-DNA hervorgegangen ist. Die lineare DNA mit kohäsiven Enden wird dann zusammen mit dem Restriktionsenzym, das für die Herstellung der kohäsiven Enden verwendet worden ist, durch Elektroporation oder Liposomentransfektion in die Zielzellen eingeführt. Das Restriktionsenzym schneidet vermutlich die genomische DNA an Stellen, die die Integration der heterologen DNA über ihre passenden kohäsiven Enden ermöglichen (Schiestl und Petes, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7585–7589).
Sobald eine transgene Tierlinie geschaffen worden ist, sollte das Protein, das von dem eingebauten Transgen exprimiert wird, in Mengen hergestellt werden und jegliche posttranslationale Modifikation, wie beispielsweise Glykosilierung, die für die Funktionalität notwendig sein kann, aufweisen. Im Falle von Antikörpern, die mindestens zwei unterschiedliche Polypeptide aufweisen, müssen die schweren und leichten Ketten in ihre korrekten tertiären Konfirmationen gefaltet werden, durch Cystein-Brücken quervernetzt werden und dann sich gegenseitig beeinflussen, um mindestens eine Antigen-Bindestelle zu bilden. Vorzugsweise sollte der Antigen-bindende Antikörper im Eiweiß eines Vogeleies hergestellt werden, aus dem er dann leicht aufgereinigt werden kann. Der wirtschaftliche Vorteil der Züchtung von Schwärmen transgener Vögel, die Eier legen, die aktive und funktionale monoklonale Antikörper exprimieren, wäre im Vergleich zu traditionelleren Tieren, wie beispielsweise der Kuh, die ein heterologes Protein in der Milch herstellt, bedeutsam.
Benötigt wird daher ein Verfahren zur Einführung eines Transgens in einen Vogel, wie beispielsweise in ein Huhn, das für einen Antikörper kodiert, der in der Lage ist, an ein Antigen zu binden, und diesen im Eiweiß eines hartschaligen Eies exprimiert.
Insbesondere werden Verfahren zur Expression eines funktionalen Antikörpers in einem Vogelei, vorzugsweise in einem Hühnerei, benötigt. Zusätzlich werden variable Regionen von Immunglobulin-Polypeptiden für die schwere und leichte Kette benötigt, die sich, wenn einzeln oder gemeinsam exprimiert, in einem Vogelei oder nach Isolierung der einzelnen Polypeptide vereinigen und dadurch einen aktiven Antikörper bilden.
Zusätzlich werden Verfahren zur Herstellung eines transgenen Vogels, vorzugsweise eines Huhns, benötigt, der in der Lage ist, im Eiweiß eines Eies des transgenen Vogels einen Antikörper zu exprimieren, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden oder Immunglobulin-Polypeptide zu exprimieren, die sich entweder im Ei oder nach der Isolierung der Polypeptide daraus vereinigen können, um einen aktiven Antikörper zu bilden.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz beschrieben betrifft die vorliegende Erfindung neue Verfahren zur Herstellung eines Vogeleies, vorzugsweise eines Hühnereies, das ein heterologes Antikörper-Protein enthält, das in der Lage ist, an ein Antigen zu binden. Insbesonders betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung transgener Vögel, vorzugsweise von Hühnern, wobei das eingebaute Transgen exprimiert wird, um ein Protein-Bestandteil des Eiweißes eines hartschaligen Eies zu sein.
Das Transgen, das in die genomische DNA eines Empfängervogels eingebaut ist, kodiert für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid, das eine schwere Kette eines Immunglobulins, eine leichte Kette eines Immunglobulins oder die variablen Regionen davon sein kann. Die Nukleinsäure, die für die Immunglobolin-Polypeptide kodiert, kann operativ mit einem Transkriptions-Promotor und einem Transkriptions-Terminator verknüpft sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem Nukleinsäurevektoren und Transgene, die davon abgeleitet sind, die Bereiche, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodieren, einbauen, wobei ein erster Bereich, der für ein Immunglobolin-Polypeptid kodiert, operativ mit einem Transkriptionspromotor verknüpft ist, und ein zweiter Bereich, der für ein Immunglobolin-Polypeptid kodiert, operativ mit einer Internen Ribosomeneintrittssequenz (IRES) verknüpft ist. Dieses Nukleinsäurekonstrukt wird, wenn es in das Genom eines Vogels eingeführt ist und darin exprimiert wird, einzelne Immunglobulin-Polypeptide herstellen, die posttranslational modifiziert werden können und sich im Eiweiß eines hartschaligen Vogeleies vereinigen können, um einen Antikörper zu bilden, der in Lage ist, an ein Antigen zu binden. Alternativ können die exprimierten Polypeptide aus dem Vogelei isoliert werden und in vitro kombiniert werden, um einen funktionalen Antikörper zu bilden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren, die Expressionsvektoren einsetzen, die viralen Ursprungs sind oder von einem Plasmid abstammen. Die transkriptionellen Promotoren darin können gewebespezifisch sein, so dass die Immunglobulin-Polypeptide, die von den Expressionsvektoren kodiert werden, als ein Proteinbestandteil des Eiweißes eines Vogeleies exprimiert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Einführung mindestens eines Transgens, das mindestens für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, in ein Vogelgenom bereit. Diese Verfahren beinhalten Samen-vermittelte Übertragung, wobei die transgenen Gene durch Liposomen, Elektroporation, Restriktionsenzym-vermittelte Integration (REMI) und ähnliche Verfahren in Vogelsamen eingebaut werden. Der veränderte Samen kann dann in den Hoden eines männlichen Vogels zurückgegeben werden, der dann mit einem Weibchen gekreuzt werden kann und dadurch transgene Nachkömmlinge hervorbringt. In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der veränderte Samen zum Hervorbringen transgener Nachkömmlinge direkt für die Befruchtung des weiblichen Vogels durch künstliche Befruchtung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für den weiteren Einbau eines Transgens in den Zellkern einer Vogelzelle, die in vitro kultiviert wird, bereit. Der transgene Zellkern kann dann in eine befruchtete, entkernte Zelle überführt werden. Die entkernte Zelle kann eine Embryonenzelle eines Vogeleies sein, die durch die Überlagerung von Dotter oder Gewebe unter Verwendung von Zweifach-Laserrastermikroskopie visualisiert wird.
Zusätzliche Ziele und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Durchsicht der detaillierten Beschreibung, die unten dargelegt ist, deutlicher werden, wenn sie mit den begleitenden Figuren, die im Folgenden kurz beschrieben werden, in Verbindung gebracht wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. stellt die Expression eines humanen monoklonalen Antikörpers durch kultivierte Wachteloviduktzellen dar. Zellen wurden mit pCMV-EGFP (Negativkontrolle), p1086 (L-Kette), p1083 (H-Kette) oder p1083 und p1086 transfiziert. p1086 und p1083 enthielten den Cytomegalovirus (CMV) Immediate Early Enhancer/Promoter, der die Expression der leichten Ketten beziehungsweise der schweren Ketten des Antikörpers steuerte. Die Proben wurden auf den Gehalt an leichter und schwerer Kette durch ELISA und FACS überprüft.
2. stellt die humane monoklonale Antikörperexpression durch kultivierte Huhnfibroblasten ganzer Embryonen (WEFs) dar, die mit cDNAs für schwere und leichte Ketten transfiziert worden sind. Zellen wurden mit pCMV-EGFP (Negativkontrolle), p1086 (L-Kette) oder 1083 (H-Kette) transfiziert oder mit beiden Plasmiden, die die leichten bzw. schweren Ketten beinhalteten, cotransfiziert. p1086 und p1083 enthielten den CMV Immediate Early Enhancer/Promoter, der die Expression der leichten bzw. der schweren Kette steuerte. Die Proben wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz aktivierten Zellsortierverfahrens (FACS) und durch ELISA untersucht.
3. stellt die Expression eines humanen monoklonalen Antikörpers durch kultivierte Huhnfibroblasten ganzer Embryonen (WEFs) dar, die mit einem IRES-Vektor transfiziert worden sind. Zellen wurden mit pCMV-EGFP allein (Negativkontrolle) transfiziert, mit p1086 (L-Kette) und p1083 (H-Kette) cotransfiziert, oder entweder mit 1 μg oder 2 μg pCMV-L-Kette-IRES-H-Kette (L-IRES-H) transfiziert. p1086 und p1083 enthielten den CMV Immediate Early Enhancer/Promoter, der die Expression der leichten bzw. schweren Kette steuerte. pCMV-L-Kette-IRES-H-Kette enthielt den CMV Immediate Early Enhancer/Promoter, der die Expression der leichten und schweren Ketten als ein einzelnes Iranskript steuerte, mit einem IRES Element, das stromabwärts von der cDNA Sequenz der leichten Kette und stromaufwärts von der cDNA Sequenz der schweren Kette liegt. L-IRES-H #1: Transfektion enthielt 1 μg Plasmid-DNA; L-IRES-H #2: enthielt 2 μg Plasmid-DNA. Proben wurden durch ELISA untersucht.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es wird im Detail auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwiesen, von denen ein oder mehrere Beispiele in den begleitenden Zeichnungen dargestellt sind. Jedes Beispiel ist als eine Erklärung der Erfindung vorgesehen, nicht als Beschränkung der Erfindung. Tatsächlich wird es den Fachleuten ersichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen, Kombinationen, Additionen, Deletionen und Variationen in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Schutzbereich oder vom Wesen der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können Merkmale, die als Teil einer Ausführungsform dargestellt oder beschrieben sind, in einer anderen Ausführungsform verwendet werden, um noch eine weitere Ausführungsform hervorbringen. Es ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung solche Modifikationen, Kombinationen, Additionen, Deletionen und Variationen, wie sie im Schutzbereich der angehängten Ansprüche und ihrer Aquivalente liegen, abdeckt.
Die Beschreibung verwendet die von der Cucurbit Genetics Cooperative anerkannte Gennomenklatur, wie sie im Cucurbit Genetics Cooperative Report 18:85 (1995) auftaucht, welcher durch diese Bezugnahme in seiner Gesamtheit Bestandteil dieses Dokumentes wird. Bei Verwendung dieser Genomenklatur sind Gene durch kursiv gedruckte, römische Buchstaben symbolisiert. Wenn ein Mutantengen rezessiv zum normalen Typ ist, dann werden das Symbol und der Name des Mutationsgens in kursiv gedruckten Kleinbuchstaben dargestellt.
In der gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die Offenbarung dieser Veröffentlichung werden in ihrer Gesamtheit durch diese Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, zu dem die Erfindung gehört.
Der Einfachheit halber werden bestimmte Begriffe, die in dieser Spezifizierung, in den Beispielen und den angehängten Ansprüchen verwendet werden, hier zusammengefasst.
Definitionen
Der Begriff „Tier" wie hier verwendet bezieht sich auf alle Wirbeltiere, einschließlich Menschen und Vögel. Er schließt auch ein einzelnes Tier in allen Entwicklungsstadien, einschließlich embryonaler und fötaler Stadien, ein.
Der Begriff „Vogel" wie hier verwendet bezieht sich auf jede Art, Unterart oder Rasse eines Organismus der taxonomischen Klasse aves, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, solche Arten wie Huhn, Truthahn, Ente, Gans, Wachtel, Fasan, Papageien, Finken, Falken, Krähen und Laufvögel, einschließlich Strauß, Emu und Kasuar. Der Begriff umfasst die verschiedenen bekannten Stämme von Gallus gallus oder Hühnern, (beispielsweise White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partridge-colored), sowie Stämme von Truthähnen, Fasanen, Wachteln, Ente, Straußen und anderem Geflügel, das üblicherweise in gewerblichen Mengen gezüchtet wird.
Der Begriff „Nukleinsäure" wie hier verwendet bezieht sich auf jegliche natürliche und synthetische, lineare und aufeinander folgende Anordnung von Nukleotiden und Nukleosiden, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA, tRNA, Oligonukleotide, Oligonukleoside und Derivate davon. Um die Diskussion zu vereinfachen, können hier solche Nukleinsäuren zusammengefasst als „Konstrukte", „Plasmide" oder „Vektoren" bezeichnet werden. Repräsentative Beispiele für Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen bakterielle Plasmidvektoren, einschließlich Expressions-, Klonierungs-, Cosmid- und Tranformationsvektoren wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, pBR322, tierische virale Vektoren wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, modifizierter Adenovirus, Influenzavirus, Adeno-assoziierter Virus, Poliovirus, Pockenvirus, Retrovirus und dergleichen, Vektoren, die von Bakteriophagen-Nukleinsäure abstammen und synthetische Oligonukleotide wie chemisch synthetisierte DNA oder RNA. Der Begriff „Nukleinsäure" umfasst zudem modifizierte und derivatisierte Nukleotide und Nukleoside wie beispielsweise, aber nicht eingeschränkt auf, halogenierte Nukleotide wie beispielsweise, aber nicht nur, 5-Bromuracil und derivatisierte Nukleotide wie beispielsweise Biotin-markierte Nukleotide.
Die Begriffe „Polynukleotid", „Oligonukleotid" und „Nukleinsäuresequenz" werden hier austauschbar verwendet und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, kodierende Sequenzen (Polynukleotid(e) oder Nukleinsäuresequenz(en), die, falls unter Kontrolle von geeigneten regulatorischen oder Kontrollsequenzen gebracht, in vitro oder in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert werden), Kontrollsequenzen (beispielsweise translationale Start- und Stoppkodons, Promotorsequenzen, Ribosombindestellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsfaktor-Bindestellen, Transkriptionsterminations-Sequenzen, stromaufwärts und stromabwärts regulatorische Domänen, Enhancer, Silencer und dergleichen) und regulatorische Sequenzen (DNA-Sequenzen, an die ein Transkriptionsfaktor/Transkriptionsfaktoren bindet/binden und die die Aktivität eines Promotors eines Gens entweder positiv (Induzierung) oder negativ (Repression) ändern). Durch die hier beschriebenen Begriffe wird keine Beschränkung wie auf Länge oder auf einen synthetischen Ursprung nahe gelegt.
Der Begriff „isolierte Nukleinsäure" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäure mit einer Struktur, die (a) mit keiner natürlich vorkommenden Nukleinsäure identisch ist, oder die (b) mit keinem Fragment einer natürlich vorkommenden genomischen Nukleinsäure, die mehr als drei unterschiedliche Gene überspannt, identisch ist und schließt DNA, RNA, oder Derivate oder Varianten davon, ein. Der Begriff umfasst beispielsweise (a) eine DNA, die die Sequenz eines Teils eines natürlich vorkommenden genomischen Moleküls hat, die aber nicht von mindestens einer der kodierenden Sequenzen flankiert wird, die den Teil des Moleküls in dem Genom der Art, in der sie natürlicherweise vorkommt, flankieren; (b) eine Nukleinsäure, die in einen Vektor oder in die genomische Nukleinsäure eines Prokaryoten oder Eukaryoten in einer Weise eingebaut worden ist, in der das resultierende Molekül mit keinem Vektor oder keiner natürlich vorkommenden genomischen DNA identisch ist; (c) ein einzelnes Molekül wie beispielsweise eine cDNA, ein genomisches Fragment, ein Fragment, das durch Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR) oder chemische Synthese hergestellt worden ist oder ein Restriktionsfragment; (d) eine rekombinante Nukleotidsequenz, die Teil eines Hybridgens ist, das heißt eines Gens, das für ein Fusionsprotein kodiert und (e) eine rekombinante Nukleotidsequenz, die Teil einer Hybridsequenz ist, die nicht natürlich vorkommt. Isolierte Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können beispielsweise natürliche Allelvarianten sowie Nukleinsäuremoleküle, die durch Nukleotiddeletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen so modifiziert worden sind, dass das resultierende Nukleinsäuremolekül noch im wesentlichen für ein Immunglobulin oder eine Variante davon kodiert, einschließen.
Wie hier verwendet, betreffen die Ausdrücke „Polypeptid" und „Protein" ein Polymer aus Aminosäuren von drei oder mehr Aminosäuren in einer seriellen Anordnung, verbunden durch Peptidbrücken. Der Begriff „Polypeptid" umfasst Proteine, Proteinfragmente, Proteinanaloga, Oligopeptide und dergleichen. Der Begriff „Polypeptid" beinhaltet Polypeptide wie oben definiert, die von Nukleinsäuren kodiert werden, die durch rekombinante Technologie hergestellt werden, die aus einer geeigneten Quelle wie beispielsweise einem Vogel isoliert werden oder die synthetisiert werden. Der Begriff „Polypeptid" beinhaltet ferner Polypeptide wie oben definiert, die chemisch modifizierte Aminosäuren oder Aminosäuren, die kovalent oder nicht kovalent mit markierenden Liganden verknüpft sind, enthalten.
Der Begriff „Fragment" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäure (beispielsweise cDNA), bezieht sich auf einen isolierten Teil der betreffenden Nukleinsäure, die künstlich (beispielsweise durch chemische Synthese) oder durch Schneiden eines natürlichen Produktes in viele Teile unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen oder durch mechanische Scherung hergestellt worden ist, oder einen Teil einer Nukleinsäure, der durch PCR, DNA-Polymerase oder jegliche andere Polymerisationstechnik, die im Stand der Technik wohl bekannt ist, hergestellt worden ist, oder in einer Wirtszelle durch rekombinante Nukleinsäuretechnologie, die dem Fachmann wohl bekannt ist, exprimiert wird. Der Begriff „Fragment" wie hier verwendet kann sich auch auf einen isolierten Teil eines Polypeptids beziehen, wobei der Teil des Polypeptids aus einem natürlich vorkommenden Polypeptid durch proteolytisches Schneiden mit mindestens einer Protease herausgeschnitten wird oder ein Teil des natürlich vorkommenden Polypeptids ist, das durch chemische Verfahren, die dem Fachmann wohl bekannt sind, synthetisiert wird.
Der Begriff „Gen" oder „Gene" wie hier verwendet bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen (einschließlich sowohl RNA oder DNA), die für die genetische Information zur Synthese einer ganzen RNA, eines ganzen Proteins oder jedes Teils einer solchen ganzen RNA oder eines solchen ganzen Proteins kodieren. Gene, die nicht natürlich Bestandteil eines Genoms eines bestimmten Organismus sind, werden als „Fremdgene", „heterologe Gene" oder „exogene Gene" bezeichnet. Gene, die natürlicher Bestandteil eines Genoms eines bestimmten Organismus sind, werden als „endogene Gene" bezeichnet. Der Begriff „Genprodukt" bezieht sich auf RNAs und Proteine, die von dem Gen kodiert werden. „Fremdgenprodukte" sind RNA oder Proteine, die von Fremdgenen kodiert werden, und „endogene Genprodukte" sind RNA oder Proteine, die von endogenen Genen kodiert werden. „Heterologe Genprodukte" sind RNAs und Proteine, die von fremden, heterologen oder heterologen Genen kodiert werden und daher nicht natürlich in der Zelle exprimiert werden.
Der Begriff „exprimiert" oder „Expression" wie hier verwendet bezieht sich auf die Transkription von einem Gen zur Herstellung eines RNA-Nukleinsäuremoleküls, das mindestens teilweise komplementär zu einer Region eines der zwei Nukleinsäurestränge des Gens ist. Der Begriff „exprimiert" oder „Expression" wie hier verwendet bezieht sich auch auf die Translation des RNA-Nukleinsäuremoleküls, um ein Protein oder ein Polypeptid oder ein Teil davon hervorzubringen.
De Begriff „regulatorische Transkriptionssequenzen" wie hier verwendet bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die mit einer Gennukleinsäuresequenz verknüpft sind, und die die transkriptionelle Expression des Gens regulieren. Die „regulatorischen Transkriptionssequenzen" können isoliert und in eine Vektornukleinsäure eingebaut werden, um eine regulierte Transkription von Teilen der Vektor-DNA in geeigneten Zellen zu ermöglichen. Den „regulatorischen Transkriptionssequenzen" kann der Bereich einer Nukleinsäuresequenz, der in dem Bereich 5' vom Ende einer Proteinkodierenden Sequenz ist, die in mRNA transkribiert werden kann, vorausgehen. Regulatorische, transkriptionelle Sequenzen können auch innerhalb des Protein-kodierenden Bereichs liegen, in Bereichen eines Gens, die als „Intron"-Bereiche identifiziert sind, oder können in Bereichen einer Nukleinsäuresequenz sein, die in dem Bereich einer Nukleinsäure sind.
Der Begriff „kodierender Bereich" wie hier verwendet bezieht sich auf eine durchgehende, lineare Anordnung von Nukleotiden, die in ein Protein translatiert werden kann. Ein Volllängen-kodierender Bereich wird in ein Volllängenprotein translatiert; das heißt in ein vollständiges Polypeptid, wie es in seinem natürlichen Zustand translatiert werden würde, ohne jegliche posttranslationale Modifikationen.
Ein Volllängen-kodierender Bereich kann auch jegliche Leitproteinsequenz oder jegliche anderen Bereich des Proteins umfassen, der natürlicherweise aus dem translatierten Protein ausgeschnitten werden kann.
Der Begriff „kohäsives Ende" wie hier verwendet bezieht sich auf die Bereiche an den Enden von Nukleinsäuremolekülen, die spezifische Wechselwirkungen miteinander eingehen können. Kohäsive Enden von Nukleinsäuren könnten durch Schneiden einer doppelsträngigen Nukleinsäure mit einer Restriktionsendonuklease erzeugt werden. In den spezifischen Wechselwirkungen kann eine Adeninbase in einem Strang einer Nukleinsäure zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu Thymin auf einem zweiten Nukleinsäurestrang ausbilden, wenn die beiden Nukleinsäurestränge entgegengesetzte Polaritäten aufweisen. In den spezifischen Wechselwirkungen kann auch eine Guaninbase in einem Strang einer Nukleinsäure drei Wasserstoffbrückenbindungen zu Cytosin auf einem zweiten Nukleinsäurestrang ausbilden, wenn die beiden Nukleinsäurestränge entgegengesetzte Polaritäten aufweisen. Komplementäre Nukleinsäuren wie hierin bezeichnet können zudem modifizierte Basen umfassen, wobei ein modifiziertes Adenin Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Thymin oder einem modifizierten Thymin ausbilden kann und ein modifiziertes Cytosin Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Guanin oder einem modifizierten Guanin ausbilden kann.
Die Begriffe „Nukleinsäurevektor" oder „Vektor" wie hierin verwendet beziehen sich auf natürliche oder synthetische einzel- oder doppelsträngige Plasmid- oder virale Nukleinsäuremoleküle, die in Zellen transfiziert oder transformiert werden können und unabhängig vom oder mit dem Wirtszellgenom replizieren. Ein zirkuläres, doppelsträngiges Plasmid kann, basierend auf der Nukleinsäuresequenz des Plasmidvektors, durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym linearisiert werden. Eine Nukleinsäure kann durch Schneiden des Vektors mit Restriktionsenzymen und durch Zusammenligieren der Teile in einen Vektor eingefügt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann RNA oder DNA sein.
Der Begriff „Plasmid" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen kleinen, zirkulären DNA-Vektor, der zur unabhängigen Replikation in einer bakteriellen Wirtszelle oder Hefewirtszelle in der Lage ist.
Der Begriff „Expressionsvektor" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Nukleinsäurevektor, der zusätzlich mindestens eine regulatorische Sequenz beinhalten kann, die operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert. Regulatorische Sequenzen sind in der Technik wohl bekannt und können ohne übermäßiges Experimentieren von Fachleuten ausgewählt werden, um eine gute Expression einer verknüpften Nukldeotidsequenz sicherzustellen. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „regulatorische Sequenzen" Promotoren, Enhancer und andere Elemente, die die Expression steuern können. Standardfachbücher der Molekularbiologie wie beispielsweise Sambrook et al. eds „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbour Press (1989) und Lodish et al., eds., „Molecular Cell Biology", Freeman (2000), die unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil werden, können herangezogen werden, um geeignete Expressionsvektoren, Promotoren und andere Expressionskontrollelemente zu entwickeln. Es sollte aber erkannt werden, dass die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors auf mehreren Faktoren beruht, einschließlich der Auswahl der Wirtszelle, die transformiert wird, und/oder der Art des Proteins, das exprimiert wird. Für verschiedene Anwendungen sind gewebeselektive (das heißt gewebespezifische) Promotoren, das heißt Promotoren durch die Expression bevorzugt in Zellen einer bestimmten Gewebeart erfolgt, im Vergleich zur Expression in einer oder mehreren anderen Gewebearten. Ein beispielhafter gewebespezifischer Promotor ist ein Ovidukt-spezifischer Promotor des Huhns, der natürlicherweise mit den Proteinen des Hühnereiweißes, einschließlich Ovalbumin, Lysozym, Ovomucoid, Conalbumin und Ovomucin und dergleichen verknüpft ist.
Nützliche Promotoren schließen auch exogen induzierbare Promotoren ein. Dies sind Promotoren, die als Antwort auf einen exogen bereitgestellten Stoff oder Stimulus, der allgemein kein endogenes Metabolit oder Cytokin ist, „angeschaltet" werden können. Beispiele umfassen einen Antibiotika-induzierbaren Promotor wie beispielsweise ein Tetrazyklin-induzierbarer Promotor, ein hitzeinduzierbarer Promotor, ein lichtinduzierbarer Promotor oder ein laserinduzierbarer Promotor. (beispielsweise Halloran et al., 2000, Development 127(9): 1953–1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16(2): 171–81; Rang and Will, 2000. Nucleic Acids Res. 28(5); 1120–5; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant. 8(4): 4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5(2): 129–137; Forster, et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27(2): 708–10; Liu et al., 1998, Biotechniques 24(4): 624–8, 630–2 (1998), die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil werden).
Die Begriffe „IRES" und „Interne Ribosomeneintrittsstelle" wie hierin verwendet beziehen sich auf einen Bereich einer Nukleinsäure, typischerweise eines RNA-Molküls, wobei die eukaryotische Initiation der Proteinsynthese weit stromabwärts vom 5'-Ende des RNA-Moleküls erfolgt. Ein 43S Präinitiationskomplex, umfassend das elf2 Protein, das an GTP und Met-tRNA_i ^Met gebunden ist, die 40S risbosomale Untereinheit und die Gruppe elf3 und elf1A können vor dem Auffinden eines AUG Startkodons an eine „IRES" binden. Eine „IRES" kann verwendet werden, um die Translation eines zweiten kodierenden Bereichs stromabwärts eines ersten kodierenden Bereichs zu initiieren, wobei jeder kodierende Bereich individuell, aber unter der anfänglichen Steuerung eines einzelnen vorgelagerten Promotors, exprimiert wird. Eine „IRES" kann sich in einer viralen RNA oder einer eukaryotischen zellulären mRNA befinden.
Der Begriff „Zytoplast" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine chromosomenfreie Empfängerzelle, wobei die chromosomale Entfernung als Enukleation bezeichnet wird, wenn der Zellkern einer Zelle entfernt oder zerstört wird.
Die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" wie hierin verwendet beziehen sich auf den Prozess des Einfügens einer Nukleinsäure in einen Wirt, vorzugsweise in eine Zelle. Zahlreiche Techniken sind den Fachleuten wohl bekannt, um die Transformation oder Transfektion einer Nukleinsäure in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus zu ermöglichen. Diese Verfahren schließen eine Vielzahl von Techniken ein, einschließlich der Behandlung der Zellen mit hohen Salzkonzentrationen wie beispielsweise, aber nicht nur, eines Kalzium- oder Magnesiumsalzes, mit einem elektrischen Feld, einem Detergenz oder Liposomen-vermittelte Transfektion, um die Wirtszelle kompetent für die Aufnahme von Nukleinsäuremolekülen zu machen, und durch solche Verfahren wie Samenvermittelte und Restriktions-vermittelte Integration, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Der Begriff „Rekombinante Zelle" bezieht sich auf eine Zelle, die eine neue Kombination von Nukleinsäuresegmenten aufweist, die natürlicherweise nicht miteinander kovalent verknüpft sind. Eine neue Kombination von Nukleinsäuresegmenten kann in einen Organismus unter Verwendung einer Vielzahl von Nukleinsäuremanipulationstechniken, die Fachleuten zur Verfügung stehen, eingeführt werden. Eine rekombinante Zelle kann eine einzelne eukaryotische Zelle oder eine einzelne prokaryotische Zelle oder eine Säugerzelle sein. Die rekombinante Zelle kann einen Vektor enthalten, der außerhalb des Genoms vorliegt. Ein extra-genomischer Nukleinsäurevektor integriert nicht in das Genom der Zelle. Eine rekombinante Zelle kann weiterhin einen Vektor oder einen Teil davon enthalten, der innerhalb des Genoms vorliegt. Der Begriff „innerhalb des Genoms" definiert ein Nukleinsäurekonstrukt, das in das Genom der rekombinanten Zelle eingebaut ist.
Der Begriff „rekombinante Nukleinsäure" wie hierin verwendet bezieht sich auf Kombinationen von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen, die nicht natürlicherweise in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen gefunden werden. Die Nukleinsäuresequenzen können Nukleinsäurevektoren, regulatorische Genexpressionselemente, Replikationsursprünge, Sequenzen, die wenn exprimiert, Antibiotikaresistenz vermitteln und proteinkodierende Sequenzen einschließen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Der Begriff „rekombinantes Polypeptid" soll ein Polypeptid einschließen, das durch rekombinante DNA-Techniken so hergestellt worden ist, dass es von einem natürlich vorkommenden Polyeptid entweder in seiner Lage, Reinheit oder Struktur verschieden ist. Allgemein wird solch ein rekombinantes Polypeptid in der Zelle in einer Menge vorliegen, die von der Menge, die normalerweise in der Natur beobachtet wird, verschieden ist.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Epitop" auf einen Teil des Proteins, der durch Einpassen in die Antigen-Bindestelle des Antikörpers spezifisch an einen Antikörper binden kann.
Der Begriff „Antikörper" wie hierin verwendet, bezieht sich auf polyklonale und monoklonale Antikörper und Fragmente davon und auf immunologische Binde-Äquivalente davon. Der Begriff „Antikörper" bezieht sich auf eine homogene molekulare Einheit oder ein Gemisch, wie beispielsweise ein polyklonales Serumprodukt, das aus einer Vielzahl verschiedener molekularer Einheiten besteht, und kann weiterhin jede modifizierte oder derivatisierte Variante davon umfassen, die die Fähigkeit, spezifisch an ein Epitop zu binden, erhält. Ein monoklonaler Antikörper ist in der Lage, selektiv an ein Zielantigen oder Epitop zu binden.
Der Begriff „Immunglobulin-Polypeptid" wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, das von einem einzelnen Polypeptid eines Antikörpers abstammt. Ein „immunologisches Polypeptid" kann eine immunologische schwere oder leichte Kette sein, und kann eine variable Region, eine diverse Region, eine Verbindungsregion oder eine konstante Region oder jegliche Kombination, Variante oder gekürzte Form davon einschließen, ist aber nicht darauf eingeschränkt. Der Begriff „immunologische Polypeptide" umfasst weiterhin Einzelkettenantikörper, bestehend aus einer variablen Region einer schweren Kette eines Immunglobulins, einer variablen Region einer leichten Kette eines Immunglobulins und optional ein Peptid-Verbindungsstück, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Hierin werden Verfahren für die Herstellung von Zellen beschrieben, die Antikörper herstellen, die in der Lage sind, spezifisch ein oder mehrere Epitope differenziell exprimierter Gene oder Stoffwechselwegsgene zu erkennen und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen, die für die nativen Immunglobulin-Polypeptide kodieren, und die für den Einbau in Expressionsvektoren, Transfektionsvektoren verwendet werden können, und für die Herstellung von Tieren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die isolierten Nukleinsäuren können auch in Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, zur Herstellung rekombinanter Nukleinsäuren verwendet werden. Für die Produktion von Serumzellen, die Antikörper zur selektiven Bindung an ein Epitop aufweisendes Antigen herstellen, können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem Zielprotein oder einem Teil davon immunisiert werden. Solche Wirtstiere können Menschen, Kaninchen, Mäuse und Ratten, um ein paar zu nennen, einschliessen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Zahlreiche Hilfsstoffe können verwendet werden, um die immunologische Antwort in Abhängigkeit von der Wirtsart zu verstärken, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Freund's (vollständig und unvollständig), Mineralgele wie beipielsweise Aluminiumhydroxide, oberflächenaktive Substanzen wie beispielsweise Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hemocyanin, Dinitrophenol und potentiell humane Hilfsstoffe wie beispielsweise BCG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren stammen, die mit einem Antigen, beispielsweise einem Zielgenprodukt oder einem antigenischen funktionellen Derivat davon immunisiert worden sind. Monoklonale Antikörper, die eine homogene Population von Antikörpern für ein bestimmtes Antigen sind, können durch jede Technik erhalten werden, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Diese umfassen die Hybridom-Technik von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495–497, und U.S. Patent Nr. 4,376,110 ; die humane B-Zell Hybridom Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci 80: 2026–2030, und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, in „Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp. 77–96), sind aber nicht darauf eingeschränkt. Kurz zusammengefasst, es werden aus einer immunisierten Maus erhaltene Milzzellen mit immortalisierenden Zellen fusioniert (das heißt Myelomzellen), um Antikörper herstellende Hybridomzellen zu erhalten. Hybridomzellen können auf Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit dem Antigen reaktiv sind, gescreened werden. Zusätzlich können Techniken verwendet werden, die für die Herstellung von „chimären Antikörpern" durch gemeinsames Splicen von Genen eines Mausantikörpermoleküls mit einer geeigneten Antigenspezifität und Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit einer geeigneten biologischen Aktivität entwickelt worden sind (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454). Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Teile aus verschiedenen Tierarten stammen, wie beispielsweise solche, die eine variable Region, die von einem Maus-mAb abstammt, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen. Alternativ oder zusätzlich können die konstanten Domänen einer variablen Region eines Immunglobulins aus einer Art gegen die entsprechenden Regionen einer zweiten Art ausgetauscht werden.
Alternativ können Techniken für die Herstellung von Einzelkettenantikörpern, wie beschrieben in beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,946,778 ; Bird, 1988, Science 242: 423–426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85; 5879–5883; und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–546 angepasst werden, um differenziell exprimierte oder Stoffwechselwegsgen-Einzelkettenantikörper herzustellen. Einzelkettenantikörper werden durch Verknüpfung der Fragmente der schweren und leichten Kette der Fv-Region über eine Aminosäurenbrücke gebildet, woraus ein Einzelkettenpolypeptid resultiert.
Sobald verfügbar können die Zellen verwendet werden, um isolierte Nukleinsäuren bereitzustellen, die für Polypeptidbestandteile des interessierenden Antikörpers kodieren und die für das Einbringen in Vektoren erhalten werden können. Geeignete Klonierungstechniken werden beispielsweise in Sambrook et al. eds „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben. Antikörper können polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte (vermenschlichte) oder chimäre Antikörper, Einzelkettenantikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab-Expressionsbibliothek hergestellt worden sind, Anti-idiotypische (Anti-Id) Antikörper und Epitop-bindende Fragmente der oben aufgeführten umfassen, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
„Genzuführungs (oder Transfektions)-Mischung" in Zusammenhang mit den Verfahren der hierin beschriebenen Samen-vermittelten Übertragung bezieht sich auf selektiertes genetisches Material, beispielsweise mit einer wirksamen Menge eines Lipid-transfizierenden Stoffes, beispielsweise ein kationisches oder polykationisches Lipid, wie beispielsweise Polybren. Die Menge jeder Komponente der Mischung wird so gewählt, dass die genetische Modifizierung einer spezifischen Zellart, beispielsweise durch Transfektion oder Transduktion, optimiert ist. Eine solche Optimierung erfordert nicht mehr als routinemäßiges Experimentieren. Das Verhältnis von DNA zum Lipid ist breit, vorzugsweise etwa 1:1, obwohl abhängig vom Typ des verwendeten Lipid-transfizierenden Stoffes auch andere Mengenverhältnisse verwendet werden können.
Der Begriff „transfizierender Stoff" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Stoffzusammensetzung, die zur Verstärkung der Aufnahme heterologer DNA-Segmente/eines heterologen DNA-Segmentes in eine eukaryotische Zelle, bevorzugt in eine Vogelzelle, bevorzugter in eine Hühnerkeimzelle, zum genetischen Material hinzugefügt ist. Die Verstärkung wird relativ zur Aufnahme in Abwesenheit des transfizierenden Stoffes gemessen. Beispiele für transfizierende Stoffe schließen Adenovirus-Transferrin-Polylysin-DNA Komplexe ein. Diese Komplexe verstärken allgemein die Aufnahme von DNA in die Zelle und reduzieren ihren Abbau während ihres Übergangs durch das Zytoplasma in den Zellkern. Diese Komplexe können auf männliche Keimzellen gerichtet sein, unter Verwendung spezifischer Liganden, die von Rezeptoren auf der Zelloberfläche der Keimzelle erkannt werden, wie beispielsweise der c-kit-Ligand oder Modifikationen davon.
Andere bevorzugte transfizierende Stoffe umfassen Lipofektin, Lipofektamin, DIMRIE C, Supeffect und Effectin (Qiagen), Unifektin, Maxifektin, DOTMA, DOGS (Transfektan; Dioctadecylamidoglycylspermin), DOPE (1,2-Dioleolyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin), DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammoniumpropan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DHDEAB (N,N-di-n-Hexadecyl-N,N-Dihydroxyethylammoniumbromid), HDEAB (N-n-Hexadexyl N,N-Dihydroxyethylammoniumbromid), Polybren oder Poly(ethylenimin) (PEI) und dergleichen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Diese nicht-viralen Stoffe haben den Vorteil, dass sie ohne Größenbeschränkungen, die allgemein mit Virus-abgeleiteten transfizierenden Stoffen verbunden sind, den stabilen Einbau von xenogenen DNA-Sequenzen in das Wirbeltiergenom erleichtern.
Der Begriff „männliche Keimzellen" wie hierin verwendet bezieht sich auf Spermatozoen (d.h. männliche Gameten) und Entwicklungsvorstufen davon. Es wird angenommen, dass in der fötalen Entwicklung primordiale Keimzellen aus dem embryonalen Ektoderm hervorgehen und zuerst im Epithel des endodermalen Dottersackes im E8 Stadium gesehen werden. Von dort wandern sie durch das Endoderm des Dickdarms zu den genitalen Leisten. In geschlechtsreifen männlichen Wirbeltieren gibt es zahlreiche Arten von Zellen, die Vorläufer von Spermatozoen sind und die genetisch modifiziert werden können, einschließlich der primitiven Stammzellen des Spermatogoniums, bekannt als A0/As, die in Typ B Spermatogonen differenzieren. Die zuletzt genannten differenzieren sich weiter, um primäre Spermatozyten zu bilden und treten in eine verlängerte meiotische Prophase ein, in deren Verlauf sich die homologen Chromosomen paaren und rekombinieren.
Nützliche Vorläuferzellen in verschiedenen morphologischen Stadien/Entwicklungsstadien sind auch unterscheidbar: präleptotäne Spermatozyten, leptotäne Spermatozyten, zygotäne Spermatozyten, Pachytän-Spermatozyten, sekundäre Spermatozyten und die haploiden Spermatide. Die zuletzt genannten durchlaufen während der Spermatogenese weitere morphologische Veränderungen, einschließlich der Umformung ihrer Kerne, der Aerosom-Bildung und der Zusammensetzung des Schwanzes. Die letzten Änderungen in der Spermatozoe (d.h. im männlichen Gameten) finden vor der Befruchtung im Genitaltrakt des Weibchens statt.
Der Begriff „transgenes Tier" wie hierin verwendet bezieht sich auf jedes Tier, vorzugsweise eine Vogelart, am meisten bevorzugt ein Huhn, in der/dem eine oder mehrere der Zellen des Vogels heterologe Nukleinsäure enthalten, die durch einen menschlichen Eingriff, wie beispielsweise durch transgene Techniken, die in der Technik wohl bekannt sind, eingeführt worden ist. Die Nukleinsäure wird in eine Zelle eingeführt, direkt oder indirekt durch Einführung in einen Vorläufer der Zelle, durch absichtliche genetische Manipulation, wie beispielsweise Samen-vermittelte oder Restriktionsenzymvermittelte Integration, Mikroinjektion oder durch Infektion mit einem rekombinanten Virus. Der Begriff genetische Manipulation umfasst nicht die klassische Kreuzungszüchtung oder in vitro Befruchtung, vielmehr ist er auf die Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls gerichtet. Dies Molekül kann in ein Chromosom eingefügt sein oder es kann extrachromosomal replizierende DNA sein. In dem typischen transgenen Tier bewirkt das Transgen, dass die Zellen eine rekombinante Form eines Immunglobulin-Polypeptids oder eine Polypeptidvariante davon exprimieren.
Die Begriffe „chimäres Tier" oder „Mosaiktier" wie hierin verwendet beziehen sich auf Tiere, in denen das rekombinante Gen gefunden wird oder in denen das rekombinante Gen in einigen, aber nicht allen Zellen des Tieres exprimiert wird. Der Begriff „gewebespezifisches chimäres Tier" zeigt an, dass das Gen in einigen Geweben vorhanden ist und exprimiert wird, aber nicht in anderen.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „Transgen" eine Nukleinsäuresequenz (kodierend beispielsweise für die schwere Kette eines Immunglobulins, für die leichte Kette eines Immunglobulins oder für Fragmente davon, die teilweise oder vollständig heterolog, das heißt fremd in Hinblick auf das transgene Tier oder die Zelle ist, in das/in die sie eingeführt ist oder die homolog zu einem endogenen Gen des transgenen Tieres oder der Zelle ist, in das/die sie eingeführt ist, die aber entwickelt worden ist, um eingefügt zu werden, oder die in das Genom des Tieres in solch einer Weise eingefügt ist, dass sie das Genom der Zelle, in die sie eingefügt ist, ändert (beispielsweise sie ist an einem Ort eingeführt, der sich von dem des natürlichen Gens unterscheidet, oder ihre Einführung resultiert in einen Knock-out). Ein Transgen kann eine oder mehrere transkriptionelle regulatorische Sequenzen und jede andere Nukleinsäure wie beispielsweise Introns einschließen, die für die optimale Expression einer ausgewählten Nukleinsäure notwendig sein können.
Die Begriffe „Ovum" und „Oozyte" werden hierin austauschbar verwendet. Obwohl zu einem Zeitpunkt nur ein Ovum reift, wird ein Tier mit einer begrenzten Anzahl Ova geboren. Die Ovulation, bei der es sich um die Abgabe eines Eies vom Eierstockfollikel handelt, erfolgt in einer Vogelart wie beispielsweise einem Huhn, wenn die Hirnanhangsdrüse ein luteinisierendes Hormon freigibt. Reife Follikel bilden einen Stil oder Stängel aus Bindegewebe und Glattem Muskel. Sofort nach der Ovulation wird das Follikel ein dünnwandiger Sack, das post-ovulatorische Follikel. Das reife Ovum bricht aus seinem Sack aus und beginnt seine Reise durch das Ovidukt. Schließlich tritt das Ovum in das Infundibulum ein, wo die Befruchtung stattfindet. Die Befruchtung muss innerhalb der 15 Minuten der Ovulation stattfinden, bevor das Ovum mit Albumin bedeckt wird. Während der Befruchtung durchdringen die Samen (Vögel haben eine polyspermale Befruchtung) die Keimscheibe. Wenn sich der Samen in diese Keimscheibe einlagert, fangt der Embryo an, sich als ein „Blastoderm" oder eine „Zygote" auszubilden.
Der Begriff „Spenderzelle" wird hierin verwendet, um die Quelle einer Kernstruktur zu beschreiben, die in den entkernten Empfänger-Zytoplasten verpflanzt wird. Alle Zellen mit normalen Karyotyp, einschließlich embryonaler, fötaler und adulter somatischer Zellen und zusätzlich einschließlich Zellen in einem Ruhezustand können Zellkern-Spender sein. Die Verwendung von nicht ruhenden Zellen als Zellkern-Spender wurde von Cibelli, et al., 1998, Science 280: 1256–8 beschrieben.
Der Begriff „Empfängerzelle" wie hierin verwendet bezieht sich auf die entkernte Empfängerzelle, einschließlich einer entkernten Metaphase I oder II Oozyte, einer entkernten, nicht aktivierten Oozyte oder einer entkernten, voraktivierten Oozyte, ist aber nicht darauf beschränkt. Eine Entkernung (Enukleation) kann durch Teilung der Zelle in Hälften erreicht werden; durch Absaugen der Metaphase-Platte, des Pronukleus oder der Pronuklei; durch Bestrahlung; oder durch jegliche Hilfsmittel, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, die eine Empfängerzelle bereitstellen, die kein funktionales, auf den Zellkern bezogenes genetisches Material mehr enthält, aber noch für die Aufnahme von genetischem Material des Spenders geeignet ist. Beispielsweise ist ein geeignetes Hilfsmittel für die Entkernung einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung die Zwei-Photonenlaser vermittelte Ablation („TPLSM"), die zudem nützlich ist, eine mechanische Entkernung durchzuführen.
Der Begriff „knock-in-Tier" bezieht sich auf ein Tier, das eine spezifische Nukleinsäuresequenz trägt, wie beispielsweise eine „knock-in Sequenz" in einer vorbestimmten kodierenden oder nicht kodierenden Region, wobei die knock-in Sequenz durch Verfahren der Rekombination, wie beispielsweise homologe Rekombination, eingeführt wird. Das Rekombinationsereignis umfasst das Ersetzen eines gesamten Gens oder Teilen eines Gens des Tieres durch ein funktionelles homologes Gen oder Gensegment eines anderen Tieres, wobei die entsprechende knock-in Sequenz in die genomische Sequenz eingebracht wird.
Abkürzungen
Abkürzungen, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, schließen die folgenden ein: aa, Aminosäure(n); bp, Basenpaar(e); cDNA, DNA komplementär zu RNA; mRNA, Boten-RNA; tRNA, Transfer-RNA; nt, Nukleotid(e); SSC, Natriumchlorid-Natriumzitrat; DMSO, Dimethylsulfoxid; TPLSM, Zweiphotonenrasterlasermikroskopie; REMI, Restriktionsenzym-vermittelte Integration; V-Region, variable Region eines Immunglobulins; D-Region, diverse Region eines Immunglobulins; J-Region, verknüpfende Region eines Immunglobulins; C Region, konstante Region eines Immunglobulins; mAb, monoklonaler Antikörper; WEFs, Fibroblasten eines ganzen Embryos.
Rekombinante, Immunglobulin-abgeleitete Nukleinsäuren und Expression davon Nukleinsäuremoleküle, die für Immunglobulin-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können in Zellen unter Verwendung konventioneller rekombinanter DNA-Technologie eingebaut werden. Das Nukleinsäuremolekül, das für einen Antikörper oder ein Fragment davon kodiert, kann in ein Expressionssystem eingeführt werden, zu dem das DNA-Molekül heterolog ist (d.h. nicht normalerweise vorhanden). Für die Expression in heterologen Systemen wird das heterologe DNA-Molekül in das Expressionssystem oder den Vektor in geeigneter Sinn-Orientierung und im korrekten Leseraster eingeführt. Der Vektor enthält die notwendigen Elemente für die Transkription und die Translation der eingeführten Protein-kodierenden Sequenzen.
U.S. Patent Nr. 4,237,224 von Cohen und Boyer, das durch diese Bezugnahme in seiner Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung wird, beschreibt die Herstellung von Expressionssystemen in Form von rekombinanten Plasmiden unter Verwendung von Restriktionsenzymspaltung und Ligation mit DNA-Ligase. Diese rekombinanten Plasmide werden dann mittels Transformation eingeführt und in einzelligen Kulturen, die prokaryotische Organismen und eukaryotische Zellen, die in Gewebekultur gewachsen sind, einschließen. Weiterhin ist beabsichtigt, dass für den Vektor jeder geeignete Vektor, der den Fachleuten bekannt ist, wie beispielsweise virale Vektoren, einschließlich virale Expressionvektoren, im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen.
Antikörperbezogene Nukleinsäuresequzenzen oder Derivate oder gekürzte Varianten davon können in Viren, wie beispielsweise in den Vaccinia-Virus eingeführt werden. Verfahren für die Herstellung eines viralen rekombinanten Vektors, der für die Expression eines Immunglobulin-Polypeptids verwendbar ist, sind analog zu Verfahren, wie offenbart in U.S. Patent Nummern 4,603,112 ; 4,769,330 ; 5,174,993 ; 5,505,941 ; 5,338,683 ; 5,494,807 ; 4,722,848 ; Paoletti E., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11349–11353; Moss, B., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11341–11348; Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11307–11302; Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11371–11377; Grunhaus et al., 1993, in Seminars in Virology 3: 237–252 und U.S. Patent Nummern 5,591,639 ; 5,589,466 ; und 5,580,859 , die sich unter anderem auf DNA-Expressionsvektoren beziehen; die Inhalte dieser Dokumente werden durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung.
Rekombinante Viren können auch durch die Transfektion von Plasmiden in Zellen, die mit dem Virus infiziert sind, hergestellt werden. Geeignete Vektoren umfassen virale Vektoren, wie beispielsweise das Lambdavektorsystem λgt11, λgt WES.tB, Charon 4, und Plasmidvektoren wie beispielsweise pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, SV 40, pBluescript II SK +/– oder KS +/– und jegliche Derivate davon, sind aber nicht auf diese eingeschränkt. Rekombinante Moleküle können in Zellen über Transformation, insbesondere Transduktion, Konjugation, Mobilisierung oder Elektroporation eingeführt werden. Die DNA-Sequenzen werden in den Vektor unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren der Technik kloniert, wie beschrieben von Maniatis et al., 1982, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., die Inhalte dieses Dokumentes werden durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung.
Unterschiedliche genetische Signale und Bearbeitungsereignisse steuern viele Stufen der Genexpression (beispielsweise DNA-Transkription und Boten-RNA (mRNA)-Translation). Transkription von DNA ist vom Vorhandensein eines Promotors abhängig. Dies ist eine DNA-Sequenz, die das Binden der RNA-Polymerase lenkt und dadurch die mRNA-Synthese voranbringt.
Sobald das isolierte DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung in ein Expressionssystem kloniert worden ist, ist es für den Einbau in eine Wirtszelle bereit. Ein solcher Einbau kann in Abhängigkeit vom Vektor-Wirtszellsystem durch die verschiedene Formen der Transformation wie oben erwähnt durchgeführt werden.
Rekombinante Expressionsvektoren können für die Expression des kodierten Proteins in eukaryotischen Zellen entworfen werden. Nützliche Vektoren können konstitutive oder induzierbare Promotoren umfassen, um die Expression von entweder Fusions- oder Nichtfusionsproteinen zu steuern. Durch Fusionsvektoren wird gewöhnlicherweise eine Anzahl an Aminosäuren zu der exprimierten Zielgensequenz hinzugefügt wie beispielsweise eine Proteinsequenz für Thioredoxin, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Eine proteolytische Schnittstelle kann zusätzlich an einer Stelle zwischen dem rekombinanten Zielprotein und der Fusionssequenz eingeführt werden. Zusätzlich kann eine Aminosäurenregion wie beispielsweise eine polymere Histidin-Region eingeführt werden, um die Bindung des Fusionsproteins an Metallionen wie beispielsweise Nickel, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist, ermöglichen und dadurch die Aufreinigung des Fusionsproteins ermöglichen. Sobald das Fusionsprotein aufgereinigt worden ist, erlaubt die Schnittstelle die Abtrennung des rekombinanten Zielproteins von der Fusionssequenz. Enzyme, die für die Spaltung der proteolytischen Spaltungsstelle geeignet sind, umfassen Faktor Xa und Thrombin, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Fusionsexpressionvektoren, die nützlich für die vorliegende Erfindung sein können, umfassen pGex (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) und pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), die Glutathion S-Transferase, Protein A- oder Maltose E bindendes Protein jeweils mit dem rekombinanten Zielprotein vereinigen.
Expression eines Fremdgens kann unter Verwendung von eukaryotischen Wirtszellen, beispielsweise Vogelzellen, erreicht werden. Die Verwendung von eukryotischen Wirtszellen erlaubt eine teilweise oder vollständige posttranslationale Modifikation wie beispielsweise, aber nicht nur Glykosylierung und/oder die Bildung der relevanten Disulfidbrücken innerhalb der Kette oder zwischen den Ketten. Beispiele für Vektoren, die für die Expression in dem Huhn Gallus gallus schließen ein pYepSecl wie in Baldari et al., 1987, E. M. B. O. 6: 229–234, welches durch diese Bezugnahme in seiner Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung wird, und gewerbliche Vektoren wie beispielsweise pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA).
Virale Wirtszelltransformation
Ein bevorzugter Ansatz für die in vivo Einführung einer Nukleinsäure, die für eines der betreffenden Immunglobulin-Polypeptide kodiert, in eine Zelle erfolgt unter Verwendung eines virales Vektors, der eine Nukleinsäure, beispielsweise eine cDNA enthält, die für das Genprodukt kodiert. Die Infektion von Zellen mit einem viralen Vektor hat den Vorteil, dass ein großer Anteil der Zielzellen die Nukleinsäure erhalten kann. Zusätzlich werden Moleküle, die von dem viralen Vektor kodiert werden, beispielsweise durch eine cDNA, die in dem viralen Vektor enthalten ist, in Zellen, die die Nukleinsäure des viralen Vektors aufgenommen haben, effizient exprimiert.
Retrovirale Vektoren und Adeno-assoziierte virale Vektoren werden allgemein als das rekombinante Genzuführungssystem der Wahl für die Übertragung von heterologen Genen in vivo verstanden. Diese Vektoren stellen eine effiziente Zuführung von Genen in Zellen bereit, und die übertragenen Nukleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA des Wirts integriert. Ein rekombinanter Retrovirus kann konstruiert werden, indem die retroviralen kodierenden Sequenzen (beispielsweise gag, pol, env) durch Nukleinsäuren, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodieren, ersetzt worden ist und dadurch die retrovirale Replikation stören. Protokolle für die Herstellung rekombinanter Retroviren und für die Infektion von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren können in Standardhandbüchern für Labore der Molekularbiologie gefunden werden, wie beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., 1989, Greene Publishing Associates. Beispiele für geeignete Retroviren sind den Fachleuten wohl bekannt und umfassen pLJ, pZIP, pWE und pEM, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Beispiele für geeignete Verpackungsviruslinien für die Herstellung sowohl ecotroper und amphotroper retroviraler Systeme umfassen psiCrip, psiCre, psi2 und psiAm, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Weiterhin ist es möglich, dass Infektionsspektrum von Retroviren und folglich von Vektoren, die auf Retroviren basieren, durch Veränderung der viralen Verpackungsproteine an der Oberfläche des viralen Partikels zu begrenzen (siehe beispielweise PCT Offenlegungsschrift WO 93/25234 , WO 94/06920 und WO 94/11524 , die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden. Beispielsweise umfassen Strategien für die Modifizierung des Infektionsspektrums von retroviralen Vektoren die Kopplung von Antikörpern, die spezifisch für Zelloberflächenantigene sind, an das virale env Protein (Roux et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 86: 9079–9083; Julan et al., 1992, Virol. 73: 3251–3255; and Goud et al., 1983, Virology 163: 251–254); oder die Kopplung von Zelloberflächenliganden an die viralen env Proteine (Neda et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14143–14146) (die Inhalte dieser Dokumente werden durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung), sind aber nicht darauf eingeschränkt. Eine Kopplung kann in der Form der chemischen Quervernetzung mit einem Protein oder einem anderen Teil erfolgen (beispielsweise chemisches Koppeln unter Verwendung von Laktose, um das env Protein in ein Sialoglykoprotein zu überführen), sowie durch Herstellung von Fusionsproteinen (beispielsweise Einzelkettenantikörper/env Fusionsproteine). Diese Technik, die nützlich für die Begrenzung der Infektion auf gewisse Gewebetypen oder andernfalls nützlich ist, die Infektion gewisser Gewebetypen zu lenken, kann auch verwendet werden, um einen ecotropen Vektor in einen amphotropen Vektor zu überführen. Zusätzlich kann die Verwendung retroviraler Genzuführung weiter durch die Verwendung von gewebe- oder zellspezifischen transkriptionellen regulatorischen Sequenzen verstärkt werden, die die Expression der Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin-Polypeptid in dem retroviralen Vektor kodiert, steuern.
Ein weiteres virales Genzuführungssystem, das nützlich für die vorliegende Erfindung ist, verwendet Adenovirus-abgeleitete Vektoren. Das Genom eines Adenovirus kann manipuliert werden, so dass es für ein interessierendes Genprodukt kodiert, es aber in Hinblick auf seine Fähigkeit, in einem normalen lytischen viralen Lebenszyklus zu replizieren, inaktiviert ist (beispielsweise Berkner et al., 1988, BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 43 1434; und Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143–155, die in ihrer Gesamtheit durch diese Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung werden. Geeignete Adenvektoren, die von dem Adenovirus Stamm Ad Typ 5 d1324 oder anderen Adenovirusstämmen (beispielsweise Ad2, Ad3, Ad7 etc.) abgeleitet sind, sind den Fachleuten wohl bekannt. Das Viruspartikel ist relativ stabil und für Aufreinigung und Konzentrierung geeignet und kann wie oben modifiziert werden, um das Infektionsspektrum zu beeinflussen. Zusätzlich ist eingeführte adenovirale DNA (und darin enthaltene Fremd-DNA) nicht in das Genom einer Wirtszelle eingebaut, sondern bleibt episomal und kann dadurch mögliche Probleme, die als eine Folge von einfügender Mutagenese in Situationen auftreten, in denen DNA in das Wirtsgenom eingebaut wird (beispielsweise retrovirale DNA), verhindern. Die meisten replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren, die zur Zeit verwendet werden und daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, sind von allen Teilen der viralen E1 und E3 Gene befreit, weisen aber noch so viel wie 80% des adenoviralen genetischen Materials auf (siehe beispielsweise Jones et al., 1979, Cell 16: 683; Berkner et al., supra; und Graham et al., in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, ed., 1991, vol. 7, pp. 109–127 (Humana, Clifton, N. J.), die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden. Die Expression der eingefügten Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, kann beispielsweise unter der Steuerung des E1A Promotors, des Major Late Promotors (MLP) und verknüpfter Leitsequenzen, des E3 Promotors, exogen hinzugefügter Promotorsequenzen und dergleichen sein.
Noch ein weiteres virales Vektorsystem, das nützlich für die Zuführung beispielsweise der betreffenden Nukleinsäure ist, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, ist der Adeno-assoziierte Virus (AAV). Vektoren, die nur 300 Basenpaare von AAV enthalten, können verpackt werden und integrieren. Der Platz für heterologe DNA ist auf ungefähr 4,5 kb beschränkt. Ein AAV Vektor so wie beispielsweise der, der in Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260 beschrieben ist, kann verwendet werden, um DNA in Zellen einzuführen. Eine Vielzahl von Nukleinsäuren ist in verschiedene Zelltypen unter Verwendung von AAV Vektoren eingeführt worden (siehe beispielsweise Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81: 6466–6470; Tratschin et al., 1985,. Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081 (1985); Wondisford et al., 1988, Mol. Endocrinol 2: 32–39; Tratchin et al. 1984, J. Virol 51: 611–619; und Flotte et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 3781–3790), die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden.
Weitere virale Vektrosysteme, die in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, sind abgeleitet vom Herpesvirus, Vaccinia-Virus, vom aviären Leukosevirus und verschiedenen RNA-Viren, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Beispielsweise können Vektorvarianten des Herpesvirus eine spezifische Strategie für die Persistenz eines interessierenden Gens, das in Zellen des zentralen Nervensystems exprimiert wird, bereitstellen.
Nicht-virale Expressionsvektoren
Die meisten nicht-viralen Verfahren für die Genübertragung beruhen auf den normalen Mechanismen, die von eukaryotischen Zellen für die Aufnahme und den intrazellulären Transport von Makromolekülen eingesetzt werden. In wechselnden Ausführungsformen beruhen nicht-virale Genzuführungssyteme der vorliegenden Erfindung zur Aufnahme der betreffenden Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, durch die Zielzelle auf Endozytose. Beispielhafte Genzuführungssysteme diesen Typs schließen liposomal abgeleitete Systeme, Polylysin Konjugate und artifizielle virale Hüllen ein.
In einer repräsentativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, in Liposomen eingeschlossen werden, die positive Ladung an ihrer Oberfläche (beispielsweise Lipofektine) aufweisen, und die (optional) mit Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene des Zielgewebes markiert sind (Mizuno et al., NO Shinkei Geka, 1992, 20: 547–551; PCT Offenlegungsschrift WO 91/06309 ; Japanische Patentanmeldung 1047381 ; und Europäische Patentveröffentlichung EP-A-43075 , die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden).
In ähnlicher Art und Weise umfasst das Genzuführungssystem einen Antikörper oder einen Zelloberflächenliganden, der mit einem Gen-bindenden Stoff quervernetzt ist, wie beispielsweise Polylysin (siehe beispielsweise PCT Offenlegungsschriften WO 93/04701 , WO 92/22635 , WO 92/20316 , WO 92/19749 und WO 92/06180 , die ihrer Gesamtheit durch diese Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung werden). Es wird auch in Erwägung gezogen, dass die effektive Zuführung der betreffenden Nukleinsäurekonstrukte über Rezeptor-vermittelte Endozytose unter Verwendung von Stoffen, die den Austritt eines Gens aus den endosomalen Strukturen verstärken, verbessert werden kann. Beispielsweise können vollständige Adenovirus oder Fusionspeptide des Influenza-HA-Genprodukts als Teil des Zuführungssystems für das Einleiten eines wirksamen Aufschlusses von DNA-enthaltenden Endosomen verwendet werden (Mulligan et al., 1993, Science 260: 926; Wagner et al., 1992, PNAS 89: 7934; und Christiano et al., PNAS 90: 2122, die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden).
Transgene Vögel
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transgene Vögel, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Hühner, die mindestens ein Transgen aufweisen, und das vorzugsweise (obwohl optional) die betreffende Nukleinsäure, die ein Immunglobulin-Polypetid kodiert, in einer oder mehreren Zellen in dem Tier, wie beispielsweise in den Oviduktzellen des Huhns exprimieren. Daher ist in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Expression des Transgens auf spezifische Teilmengen von Zellen, Geweben oder Entwicklungsstadien unter Verwendung von beispielsweise cis-agierenden Sequenzen, die die Expression in dem gewünschten räumlichen Mustern steuern, beschränkt. Zu diesem Zweck können gewebespezifische regulatorische Sequenzen, gewebespezifische Promotoren und konditionale regulatorische Sequenzen verwendet werden, um die Expression des Transgens in bestimmten räumlichen Mustern zu steuern. Zudem können zeitliche Muster der Expression beispielsweise durch konditionale Rekombinationssysteme, prokaryotische regulatorische Tranksriptionssequenzen und dergleichen bereitgestellt werden.
Konditionale Transgene können durch die Verwendung von prokaryotischen Promotorsequenzen, die prokaryotische Proteine benötigen, um gleichzeitig exprimiert zu werden, bereitgestellt werden, um die Expression des Transgens zu ermöglichen. Operatoren, die in prokaryotischen Zellen vorhanden sind, sind in vivo und in vitro umfassend charakterisiert worden und können einfach manipuliert werden, um sie durch Standardtechniken in jede Position stromaufwärts von einem Gen oder innerhalb eines Gens einzubringen. Solche Operatoren umfassen Promotorregionen und Regionen, die spezifisch an Proteine wie beispielsweise Aktivatoren und Repressoren binden. Ein Beispiel ist die Operatorregion des lexA Gens von E. coli, an die das LexA-Polypeptid bindet. Weitere beispielhafte prokaryotische regulatorische Sequenzen und die korrespondierenden trans-aktivierenden prokaryotischen Proteine sind von Brent und Ptashne in U.S. Patent Nr. 4,833,080 offenbart. Es können transgene Tiere geschaffen werden, die das entsprechende Transgen unter der transkriptionellen Steuerung einer prokaryotischen Sequenz enthalten, die durch eukaryotische Proteine nicht nennenswert aktiviert wird. Die Kreuzung dieses transgenen Tieres mit einem anderen Tier, das für den korrespondierenden prokaryotischen Transaktivator transgen ist, kann die Aktivierung der Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, erlauben. Außerdem kann die Expression eines konditionalen Transgens durch Gentherapie-ähnliche Verfahren (wie beispielsweise oben beschrieben) induziert werden, wobei ein Gen, das für das trans-aktivierende Protein kodiert, beispielsweise eine Rekombinase oder ein prokaryotisches Protein, in das Gewebe geliefert wird und zur Expression veranlasst wird, wie beispielsweise in einer Zelltyp-spezifischen Art und Weise.
Zusätzlich können gemäß der vorliegenden Erfindung induzierbare Promotoren eingesetzt werden. Beispiele für induzierbare Promotoren schließen den Tet Operator und den Metallothionin-Promotor ein, die durch die Behandlung mit Tetrazyklin bzw. mit Zinkionen induziert werden können, sind aber nicht darauf eingeschränkt (Gossen et al., 1992, PNAS 89: 5547–5551 und Walden et al., 1987, Gene 61: 317–327, die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden).
Klonierte, Transgene und Knock-in Tiere und Deren Eier
Verfahren für die Herstellung eines transgenen Tieres, wie in der vorliegenden Erfindung beabsichtigt, umfassen das Einführen eines Transgens in ein Tier unter Verwendung von: einem viralen oder einem nicht-viralen Vektor; Samen-vermittelte Genübertragung, Restriktionsenzym-vermittelter Einbau; Zellkern-Übertragung, einschließlich Zellkern-Übertragung unter Verwendung von Zweiphotonenvisualisierung und optional Laservermittelter Ablation; Ovum-Übertragung und dergleichen. Im Falle eines Vogels können ein heterologes Immunglobulin-Polypeptid oder Polypeptide, die von der transgenen Nukleinsäure kodiert werden, in das Lumen des reifen Tieres abgegeben werden und als ein Bestandteil des Eiweißes in Eiern, die von dem Tier gelegt werden, abgelagert werden. Es ist auch beabsichtigt, dass die Herstellung von heterologen Immunglobulin-Polypeptiden im Eidotter oder im Serum eines transgenen Vogels zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gehört. In einer Ausführungsform, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung beabsichtigt wird, kann ein undichter (leaky) Promotor, wie beispielsweise der CMV Promotor operativ mit einem Transgen verknüpft sein kann, was zur Expression des Transgens in vielen, wenn nicht in allen Geweben des transgenen Tieres führt, was zur Herstellung der Immunglobulin-Polypeptide im Serum führt. Transgene Vögel, die durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden, werden in der Lage sein, Eier zu legen, die eines oder mehrere der gewünschten heterologen Proteine/des gewünschten heterologen Proteins enthalten, einschließlich beispielsweise einer leichten oder schweren Kette eines Immunglobulins, eines Antikörpers oder einer Variante davon und dergleichen.
Ein Transgen kann in das Ovum eines Tieres gemäß der vorliegenden Erfindung durch Zellkernübertragung mittels Zweiphotonenvisualisierung und Ablation eingeführt werden, wobei der Zellkern-Spender eine gewünschte heterologe DNA-Sequenz in seinem Genom enthält, wie beispielsweise eine DNA, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert. Ein Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, einfach konventionelle Verfahren anzupassen, um das gewünschte Transgen in das Genom des Zellkern-Spenders einzufügen, bevor der Zellkern-Spender in den Empfänger-Zytoplasten injiziert wird oder bevor die Zellkern-Spenderzelle mit der Empfängerzelle vereinigt wird. Beispielsweise kann/können ein Transgen oder mehrere Transgene, das/die für mindestens eine Polypeptid-Kette eines Antikörpers kodiert/kodieren, unter Verwendung eines Zuführungsvehikels in eine Zellkern-Spenderzelle gebracht werden. Das Transgen wird dann gemeinsam mit dem Zellkern-Spender in das Ovum des Empfängers übertragen. Nach Wiederherstellung der Zygote wird das Ovum in den reproduktiven Trakt einer Empfänger-Henne übertragen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Ovum in das Infundibulum der Empfänger-Henne übertragen. Nach Rekonstruktion entwickelt sich der Embryo, der das Transgen enthält, innerhalb der Empfänger-Henne und wandert durch ihr Ovidukt, wo es von natürlichen Eiweißproteinen und einer natürlichen Eischale eingekapselt wird. Das Ei wird gelegt und kann bebrütet werden und ein Küken kann schlüpfen, um ein transgenes Küken zu erhalten. Das resultierende transgene Huhn wird ein geschwünschtes Transgen oder mehrere gewünschte Transgene in seiner Keimbahn tragen. Nach Reifung kann der transgene Vogel Eier legen, die ein gewünschtes heterologes Protein oder mehrere gewünschte heterologe Proteine enthalten, die einfach geerntet werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zellkern-Spenderzelle mit einem Vektorkonstrukt transfiziert, das ein Transgen enthält, das für mindestens eine Polypeptidkette eines Antikörpers oder eine Variante oder eine gekürzte Form davon kodiert. Verfahren für die Transfektion von somatischen Zellkernen sind in der Technik wohl bekannt und umfassen zum Beispiel die Verwendung von retroviralen Vektoren, Retrotransposonen, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, nackte DNA, Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, direkte Injektion in den Zellkern und dergleichen. Solche Techniken, die insbesondere für Vögel angewandt werden, werden offenbart in Bosselmann, ( U.S. Patent Nr. 5,162,215 ), Etches ( PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 99/10505 ), Hodgson ( U.S. Patent Nr. 6,027,722 ), Hughes ( U.S. Patent Nr. 4,997,763 ), Ivarie et al., ( PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 99/19472 ), NiacArthur ( PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 97/47739 ), Perry ( U.S. Patent Nr. 5,011,780 ) Petitte ( U.S. Patent Nrn. 5,340,740 und 5,656,749 ) und Simkiss ( PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 90/11355 ), deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden.
Zellkern-Übertragung und TPLSM
Zellkern-Übertragung ermöglicht die Klonierung von Tierarten, wobei die individuellen Schritte den Verfahren zur Klonierung von embryonalen, fötalen und adulten Zellen gemein sind. Diese Schritte schließen ein a). Herstellung eines Zytoplasten, b). Isolierung des Kerns der Spenderzelle (Zellkern-Spender) und c). Übertragung des Spender-Zellkerns in den Zytoplasten, um einen rekonstruierten Embryo herzustellen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Optional schließen zusätzliche Schritte ein d). Kultur des rekonstruierten Embryos und e). Übertragung des rekonstruierten Embryos in ein synchronisiertes Wirtstier.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt der in Tieren verwendete Ansatz für die Übertragung des Zellkerns die Visualisierung des Zellkerns unter Verwendung eines Zweiphotonenmikroskops ein. Das Tier, das für die Übertragung des Zellkerns verwendet wird, kann ein Vogel sein, einschließlich Hühner, Enten, Truthähne, Wachteln, Fasanen und Laufvögel, ist aber nicht darauf beschränkt. In diesem Verfahren wird ein befruchtetes oder unbefruchtetes Ei aus einem Tier entfernt und in vitro manipuliert, wobei das genetische Material des Eies visualisiert und entnommen oder ablatiert wird, und der ablatierte Zellkern durch einen Spender-Zellkern ersetzt wird. Optional kann der Spender-Zellkern mit beispielsweise einem Transgen, das für ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, genetisch modifiziert sein. Zweiphotonenrasterlasermikroskopie (TPLSM) kann verwendet werden, um die Zellkern-Strukturen zu visualisieren. Nach der Visualisierung wird der Zellkern der Empfängerzelle, wie beispielsweise einem befruchteten oder unbefruchteten Ei, entnommen oder ablatiert, optional unter Verwendung der Visualisierung durch TPLSM.
TPLSM basiert auf Fluoreszenz, die von zwei Photonen angeregt wird, in der zwei Photonen gleichzeitig mit einem fluoreszierenden Molekül kollidieren. Ihre kombinierte Energie wird von dem Fluorophor absorbiert, wodurch Emission von Fluoreszenz induziert wird, die von einer Fotovervielfacherröhre detektiert wird und in ein digitales Bild umgewandelt wird. Siehe Squirrell et al., 1999, Nature Biotechnol. 17: 763–7 und Piston et al., 1999, Trends Cell Biol. 9: 66–9, die unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden. TPLSM stellt Bilder von lebenden, optisch dichten Strukturen für verlängerte Zeiträume her, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. TPLSM verwendet biologisch harmloses, gepulstes Licht nahe dem Infrarotbereich, üblicherweise mit einer Wellenlänge von ungefähr 700 nm bis ungefähr 1000 nm, das in der Lage ist, tief in Licht-streuende Proben einzudringen. TPLSM kann unterschiedliche Laser verwenden, wie beispielsweise Modus-gesicherte Laser, wo die Wellenlänge unveränderlich ist, oder einen einstellbaren Laser, der abhängig vom Emissionsbereich des verwendeten Farbstoffs auf Wellenlängen zwischen ungefähr 700 nm und ungefähr 1000 nm eingestellt werden kann. Beispielsweise wird eine Wellenlänge von 720–770 nm bei der Verwendung von DAPI und Hoescht 33342 Farbstoffen bevorzugt. Es werden neue Fluorophore mit unterschiedlichen Emissionsbereichen hergestellt, und die Erfindung ist nicht auf die zurzeit erhältlichen Farbstoffe und ihre entsprechenden Emissionsbereiche beschränkt.
Weiterhin können Laser, die für TPLSM verwendet werden, in Femtosekunden- und Picosekunden-Laser eingruppiert werden. Diese Laser werden durch ihre Pulsdauer unterschieden. Zurzeit wird ein Femtosekunden-Laser bevorzugt, da er besonders für eine Visualisierung ohne Schädigung der Probe geeignet ist.
TPLSM stellt nicht-invasive, dreidimensionale Echtzeitbilder des optisch dichten Vogeleis her. Im Gegensatz zu Säugerzellen wurde die Visualisierung der Metaphasenplatte oder des Pronukleus in dem Vogelei während der Zellkern-Übertragung durch den großen, undurchsichtigen Vogeldotter gestört oder behindert. Allerdings erlaubt die Zweiphotonenaufnahme mit Femtosekunden-Lasern, die nahe dem Infrarotbereich arbeiten, die Visualisierung von Zellkernstrukturen von Vögeln, ohne zelluläre Bestandteile zu schädigen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Proben mit DNA-spezifischen Farbstoffen, wie beispielsweise DAPI (4',6'-Diamidino-2-phenylindolhydrochlorid) oder Hoescht 33342 (bis-Benzimid) vor der TPLSM-Visualisierung inkubiert oder injiziert werden, gefolgt von der Entfernung der Eiweißkapsel und der Platzierung des Ovums in eine Schale mit der Keimscheibe nach oben. Reste der Eiweißkapsel können dann von der Oberseite der Keimscheibe entfernt werden.
Eine wässrige Lösung wie beispielsweise Phosphat gepufferte Saline (PBS) kann in die Schale oder direkt auf das Ovum gegeben werden, um ein Austrocknen des Ovums zu verhindern. Ein Klonierungszylinder kann dann um die Keimscheibe platziert werden und DAPI in PBS kann in den Zylinder gegeben werden. Alternativ kann eine DAPI-PBS Lösung mit einer Glaspipette in die Keimscheibe injiziert werden, worauf der Farbstoff in die Zellkernstrukturen eintritt. Für die Farbstoff-Injektion ist die Entfernung der Eiweißkapsel nicht notwendig, wohingegen durch die Abwesenheit der Kapsel die Injektion von Zellkernen in die Scheibe erleichtert wird.
Durch Verwendung von TPLSM können Bilder aus dem Innern des frühen Vogelembryos hergestellt werden. Die Visualisierung kann ungefähr nach 10 bis 15 Minuten Inkubation mit dem Farbstoff oder ungefähr 10 Minuten nach Farbstoffinjektion durchgeführt werden. Während der Visualisierung wird die Keimscheibe unter das Mikroskopobjektiv gelegt und es wird unter Verwendung von relativ geringen Laserleistungen von ungefähr 3–6 Milliwatt innerhalb des zentralen Bereiches der Scheibe nach den pronuklearen Strukturen gesucht. Sobald die Strukturen gefunden worden sind, können sie unter Verwendung hoher Laserleistung oder mechanisch ablatiert werden, geleitet durch TPLSM-Visualisierung.
Zellkernübertragungstechniken erfordern die Zerstörung oder die Entfernung (Enukleation) des Pronukleus bevor ein Spender-Kern in den Zytoplasten der Oozyte eingeführt werden kann. Die Zweiphotonenlaser-vermittelte Ablation von Zellkern-Strukturen stellt eine Alternative zur Mikrochirurgie dar, um den Pronukleus, der ungefähr 25 um unterhalb der Dotterhaut des Ovums in der Keimscheibe liegt, zu visualisieren. Höhere Laserleistungen als die, die für die bildliche Darstellung verwendet werden, können für die Enukleation verwendet werden, mit minimalem Kollateralschaden für die Zelle. Die Wellenlänge für die Ablation liegt allgemein in einem Bereich von ungefähr 700 nm bis ungefähr 1000 nm, ungefähr bei 30 bis ungefähr 70 Milliwatt. TPLSM und Zweiphotonenlaser-vermittelte Entfernung sind effizienter als alternative Methoden, die in der Technik bekannt sind, da sie weniger vom Bediener abhängig und weniger invasiv sind, was zu einer verbesserten Lebensfähigkeit der Empfängerzelle führt.
Ein Zellkern von einer kultivierten somatischen Zelle (Zellkern-Spender) kann dann in den entkernten Empfängerzytoplasten injiziert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Zellkern-Spender unter Verwendung einer Mikromanipulationseinheit, umfassend einen Mikroinjektor und einen Mikromanipulator, injiziert. Der Spender-Zellkern wird in die Keimscheibe durch handgeführte Injektion unter Verwendung episkopischer Beleuchtung (d.h. Licht, das durch das Objektiv des Mikroskops auf die Probe gelangt) eingeführt. Alternativ kann eine Spender-Zelle mit der Empfängerzelle unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, fusioniert werden, beispielsweise mit Hilfe von fusionsfördernden Chemikalien, wie beispielsweise Polyethylenglykol; durch inaktivierte Viren, wie beispielsweise der Sendai Virus oder durch elektrische Stimulation. Die rekonstruierte Zygote kann dann chirurgisch in das Ovidukt der Empfängerhenne übertragen werden, um ein hartschaliges Ei herzustellen. Alternativ kann der rekonstruierte Embryo in vitro kultiviert werden, um vor Übertragung in einen Empfänger ein Screening des Embryos auf korrekte Entwicklung zu erlauben. Beispielsweise umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Kultivierung des rekonstruierten Embryos für ungefähr 24 Stunden vor dem Screening und die anschließende chirurgische Übertragung in eine Empfängerhenne.
Das Ei kann nach dem Legen und vor dem Schlüpfen eines Kükens eingesammelt werden oder weiter bebrütet werden, um ein kloniertes Küken herzustellen, optional ein kloniertes Küken, das genetisch modifiziert worden ist. Das klonierte Küken kann ein Transgen in allen, in den meisten oder in ein paar seiner Zellen enthalten. Nach Reifung kann das transgene Küken Eier legen, die ein heterologes Protein oder mehrere heterologe Proteine enthalten, einschließlich eines Antikörpers, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden oder ein Immunglobulin-Polypeptid, das isoliert und mit einem anderen isolierten Immunglobulin-Polypeptid verknüpft werden kann, und dadurch einen Antikörper formt, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden. Das klonierte Küken kann auch ein Knock-in-Küken sein, das einen alternativen Phänotypen exprimiert oder in der Lage ist, Eier zu legen, die ein heterologes Protein enthalten. Das rekonstruierte Ei kann auch unter Verwendung eines ovo Kultivierungsverfahrens bis zum Ende kultiviert werden. Beispielsweise wird das ex ovo Kultivierungsverfahren, das von Perry et al (supra) beschrieben worden ist, als ein Verfahren erachtet, das im Schutzbereich des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt.
Ovum Übertragung
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Tieres bereit, umfassend die Übertragung eines Zellkerns in Kombination mit der Übertragung eines Ovums. Zweiphotonen-Visualisierung und Ablation können verwendet werden, um eine Übertragung des Zellkerns wie oben beschrieben durchzuführen. Dementsprechend führt der Austausch des Zellkerns einer Empfängerzelle mit dem Zellkern einer Spenderzelle zu einer rekonstruierten Zygote. In einer Ausführungsform werden Eier im pronuklearen Stadium als Empfängerzytoplasten verwendet, die bereits durch Befruchtung aktiviert worden sind. Alternativ können nicht-aktivierte Metaphase II-Eier als Empfängerzytoplasten dienen und die Aktivierung nach Wiedereinführung des Kerns induziert werden. Das Ovum kann über eine Übertragung des Ovums kultiviert werden, wobei das Ovum, das die rekonstruierte Zygote enthält, in eine Empfängerhenne überführt wird. Das Ovum wird kurz nach der Eiablage chirurgisch in das Ovidukt der Empfängerhenne überführt. Dies wird entsprechend normaler züchterischer Abläufe erreicht (Eiablage, Bebrütung und Schlüpfen; siehe Tanaka et al., supra).
Alternativ kann das Ovum vor Übertragung in eine Empfängerhenne bis zum Stadium X kultiviert werden. Spezifischer, werden rekonstruierte Stadium I-Embryonen für 24–48 Stunden bis zum Stadium X kultiviert. Dies erlaubt ein Entwicklungsscreening des rekonstruierten Embryos vor der Übertragung. Stadium I-Embryonen sind von einer dicken Eiweißkapsel umgeben. In diesem neuen Verfahren wird die Eiweißkapsel entfernt, wonach der Zellkern-Spender in die Keimscheibe injiziert wird. Anschließend werden die Kapsel und die Keimscheibe durch In-Kontakt-Bringen der dicken Kapsel mit der Keimscheibe auf der Oberfläche des Dotters rekombiniert. Embryonen entwickeln sich bis zum Stadium X in ähnlichen Raten wie diejenigen, die mit ihren intakten Kapseln kultiviert worden sind. Im Stadium X wird der Embryo in das Ovidukt der Empfängerhenne übertragen.
Sobald der Embryo übertragen worden ist, entwickelt er sich im Innern der Empfängerhenne und wandert durch das Ovidukt der Henne, wo es von natürlichen Eiweißproteinen und einer natürlichen Eierschale eingekapselt wird. Das Ei, das endogenen Dotter und einen Embryo von einer anderen Henne enthält, wird gelegt und kann dann bebrütet werden, und ein normales Küken kann schlüpfen. Das resultierende Küken kann ein Transgen in allen oder in den meisten seiner Zellen enthalten. In einer Ausführungsform befindet sich das Transgen mindestens in den Oviduktzellen der Empfängerhenne. Nach Reifung kann der klonierte Vogel einen gewünschten Phänotypen exprimieren oder kann in der Lage sein, Eier zu legen, die ein gewünschtes heterologes Protein oder mehrere gewünschte heterologe Proteine enthalten.
Samen-vermittelte Integration von heterologen Transgenen
Detaillierte Beschreibungen für Verfahren der Samen-vermittelten Übertragung einer Nukleinsäure, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind unter anderem in der PCT-Offenlegungsschrift WO 00/697257 ; WO 99/42569 ; WO 00/09674 ; WO 01/19183 ; und in US Patent Nr. 5,804,191 bis Scofield beschrieben, die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil diese Anmeldung werden. Ein Verfahren für den Einbau heterologen genetischen Materials in das Genom eines Vogels liefert eine Nukleinsäure unter Verwendung bekannter Genzuführungssysteme in männliche Keimzellen in situ in den Hoden des männlichen Vogels (beispielsweise durch in vivo-Transfektion oder Transduktion). Alternativ umfasst ein in vitro-Verfahren für den Einbau heterologen genetischen Materials in das Genom eines Vogels die Isolierung männlicher Keimzellen ex corpora, die Zuführung eines Polynukleotids dorthin und dann die Zurückgabe der transfizierten Zellen in den Hoden eines männlichen Empfänger-Vogels.
In vivo-Verfahren
Ein in vivo-Verfahren, das für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, verwendet die Injektion der Genzuführungsmischung, vorzugsweise in die Samenkanälchen oder in den Hoden und am meisten bevorzugt in den Samenleiter oder die Samenleiter unter Verwendung von beispielsweise einer Mikropipette und einer Pico-Pumpe, die ein genau abgemessenes Volumen unter gesteuerten Druckmengen zuführt. Eine kleine Menge eines geeigneten, nicht toxischen Farbstoffes kann zur Genzuführungsmischung (Flüssigkeit) gegeben werden, um die Zuführung und die Verteilung an die Samenkanälchen des Hoden zu bestätigen. Die genetisch modifizierten Keimzellen differenzieren sich in ihrem eigenen Milieu. Nachkommen-Tiere, die die Integration der Nukleinsäure in ihren Keimzellen (transgene Tiere) aufweisen, werden selektiert. Die selektierten Nachkommen können dann gepaart werden, oder ihr S amen für die Befruchtung oder in vitro Befruchtung verwendet werden, um weitere Generationen transgener Nachkommen zu schaffen.
In vitro Verfahren
In einem alternativen Verfahren können männliche Keimzellen vom männlichen Spendervogel durch jegliche Hilfsmittel, die in der Technik bekannt sind, erhalten oder gesammelt werden, wie beispielsweise durch Durchschneiden des Hoden. Die Keimzellen werden dann einer Genzuführungsmischung ausgesetzt, vorzugsweise innerhalb mehrerer Stunden oder für eine spätere Verwendung kryokonserviert. Wenn die männlichen Keimzellen durch Durchschneiden der Hoden aus dem Spenderwirbeltier erhalten werden, dann können die Zellen mit einem Enzymgemisch inkubiert werden, das dafür bekannt ist, vorsichtig das Gewebegerüst aufzubrechen und unbeschädigte Zellen freizusetzen, wie beispielsweise pankreatisches Trypsin, Kollagenase Typ I, pankreatisches DNAse Typ I, sowie Rinderserum-Albumin und ein modifiziertes DMEM-Medium. Nach dem Waschen können die Zellen in ein Inkubationsmedium gegeben werden, wie beispielsweise DMEM und dergleichen, und für genetische Modifikation durch Aussetzen mit einer Genzuführungsmischung in eine Kulturschale plattiert werden.
Je nachdem, ob in dem in vivo Verfahren oder dem in vitro Verfahren verwendet, erleichtert die Genzuführungsmischung, sobald sie in Kontakt mit den männlichen Keimzellen ist, die Aufnahme und den Transport des heterologen genetischen Materials zum geeigneten Ort der Zelle zur Integration in das Genom und zur Expression. Eine Vielzahl bekannter Genzuführungsverfahren kann zur Aufnahme von Nukleinsäuresequenzen in die Zelle verwendet werden. Solche Verfahren umfassen virale Vektoren, Liposomen, Elektroporation, Restriktionsenzym-vermittelte Integration (REMI) (nachfolgend diskutiert) und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Sowohl im in vivo- als auch im in vitro-Verfahren umfasst eine Genzuführungsmischung typischerweise ein Polynukleotid, das für die gewünschte Eigenschaft oder das Produkt (beispielsweise Immunglobulin-Polypeptide) kodiert und eine geeignete Promotorsequenz, wie beispielsweise einen gewebespezifischen Promotor, eine IRES und dergleichen und, optional, Substanzen, die die Aufnahme der Polynukleotidsequenz erhöhen oder diese umfassen, wie beispielsweise Liposomen, retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, Adenovirus-verstärkte Genzuführungssysteme und dergleichen oder Kombinationen davon. Ein Reporterkonstrukt, das einen genetischen Selektionsmarker umfasst, wie beispielsweise das Gen, das für das Green Fluorescent Protein kodiert, kann zusätzlich in die Genzuführungsmischung gegeben werden. Targeting-Moleküle, wie beispielsweise der C-kit-Ligand können zur Genzuführungsmischung gegeben werden, um die Übertragung des genetischen Materials in die männliche Keimzelle zu verstärken. Eine Substanz, die die Immunantwort unterdrückt, wie beispielsweise Cyclosporin oder ein Kortikosteroid kann auch, wie in der Technik bekannt, in die Genzuführungsmischung gegeben werden.
Jede Genzuführungsmischung, die von einer Vielzahl gewerblicher Genzuführungsmischungen erhältlich ist, kann verwendet werden. Dieser wird das Polynukleotid, das eine gewünschte Eigenschaft oder ein Produkt kodiert, zusätzlich beigemischt. Die endgültige Genzuführungsmischung, umfassend das Polynukleotid, kann dann mit den Zellen gemischt werden, und es wird ermöglicht, dass dieses Gemisch für einen Zeitraum von zwischen ungefähr zwei Stunden und ungefähr 16 Stunden, bei einer Temperatur von zwischen ungefähr 33°C bis ungefähr 37°C auf die Zellen einwirkt. Nach diesem Zeitraum werden die Zellen vorzugsweise bei einer geringeren Temperatur von ungefähr 33°C bis ungefähr 34°C für ungefähr 4 Stunden bis ungefähr 20 Stunden, vorzugsweise ungefähr 16 bis 18 Stunden, gelagert.
Die Isolierung und/oder die Selektion genetisch transgener Keimzellen (und transgener somatischer Zellen und transgener Wirbeltiere) erfolgt durch jedes geeignete Hilfsmittel wie beispielsweise durch physiologische und/oder morphologische interessierende Phänotypen unter Verwendung geeigneter Hilfsmittel, wie beispielsweise biochemische, enzymatische, immunchemische, histologische, elektrophysiologische, biometrische oder ähnliche Verfahren und durch Analyse zellulärer Nukleinsäuren, wie beispielsweise das Vorhandensein oder die Abwesenheit von spezifischen interessierenden DNAs oder RNAs und Verwendung konventioneller molekularbiologischer Techniken, einschließlich Hybridisierungsanalyse, Nukleinsäureamplifikation, einschließlich aber nicht begrenzt auf, Polymerasekettenreaktion, Transkriptions-vermittelter Amplifikation, Reverse Transkriptase-vermittelter Ligasekettenreaktion und/oder elektrophoretischer Technologien, ist aber nicht darauf beschränkt.
Ein Verfahren, das von der vorliegenden Erfindung zur Isolation oder Selektion männlicher Keimzellpopulationen in Betracht gezogen wird, umfasst das Erhalten spezifischer männlicher Keimzellpopulationen, wie beispielsweise Spermatogonien aus einer Mischpopulation testikulärer Zellen durch Extrudieren der Zellen aus den Samenkanälchen und Enzymspaltung. Die Spermatogonien oder andere männliche Keimzellpopulationen können aus einer Mischzellpopulation durch bekannte Verfahren isoliert werden, wie beispielsweise durch Verwendung einer Promotorsequenz, die in Stammzellpopulationen periodischer männlicher Keimzellen spezifisch oder selektiv aktiv ist. Geeignete Promotoren umfassen B-Myb oder einen spezifischen Promotor, wie beispielsweise die C-kit-Promotorregion, c-raf-1-Promotor, ATM (Ataxia-telangiectasia)-Promotor, Vasa-Promotor, RBM (Ribosomen-bindendes Motiv)-Promotor, DAZ (gelöscht in Azoospermien)-Promotor, XRCC-1-Promotor, HSP 90 (Hitzeschockgen)-Promotor, Cyclin-A1-Promotor, oder FRMI (von der Fragilen X-Stelle)-Promotor und der gleichen. Ein gewählter Promotor kann mit einem Reporterkonstrukt verknüpft sein, umfassend beispielsweise ein Konstrukt, das ein Gen umfasst, das für das Green Fluorescent Protein (oder EGFP), das Yellow Fluorescent Protein, das Blue Fluorescent Protein, das Phycobiliprotein, wie beispielsweise Phycoerythrin oder Phycocyanin, oder jedes andere Protein, das bei einer geeigneten Wellenlänge des Lichtes fluoresziert oder für ein Lichtemittierendes Protein kodiert, wie beispielsweise die Luciferase oder Apoaequorin. Die spezifischen Promotorsequenzen vermitteln nur während spezifischer Stadien der männlichen Keimzellentwicklung die Expression des Reporterkonstrukts (beispielsweise Mailer et al., 1999, J. Biol. Chem. 276(16): 11220–28; Schrans-Stassen et al., 1999, Endocrinology 140: 5894–5900, die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden). Im Falle eines fluoreszierenden Reporterkonstruktes können die Zellen mit Hilfe von beispielsweise einem FACS-Gerät bei der geeigneten Wellenlänge (bei den geeigneten Wellenlängen) sortiert werden, oder sie können durch chemische Verfahren selektiert werden.
Männliche Keimzellen, die die DNA in der gewünschten Art und Weise modifiziert haben, werden isoliert oder selektiert und in den Hoden eines geeigneten Empfängertieres übertragen. Eine weitere Selektion kann nach Biopsie eines oder beider Hoden des Empfängermännchens unternommen werden oder nach Untersuchung des Ejakulats des Tieres, das durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert worden ist, um zu bestätigen, dass die gewünschte Nukleinsäuresequenz eingebaut worden ist.
Die genetisch modifizierten Keimzellen, die wie oben beschrieben isoliert und selektiert worden sind, werden vorzugsweise in den Hoden eines männlichen Empfängervogels übertragen, beispielsweise eines Huhns, das dasselbe Empfängertier sein kann, aber nicht sein muss. Bevor die genetisch modifizierten männlichen Keimzellen in das Empfängertier übertragen werden, können die endogenen Keimzellen aus dem Hoden des Empfängers entfernt werden, wodurch die Kolonisierung des Empfängerhodens durch genetisch modifizierte Keimzellen erleichtert wird. Dies kann durch jedes geeignete Hilfsmittel durchgeführt werden, einschließlich durch Gamma-Bestrahlung, durch chemische Behandlung mit Hilfe von infektiösen Stoffen, wie beispielsweise Viren, oder durch Autoimmundepletion oder durch Kombinationen davon. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Hoden unter Verwendung einer Behandlung, die die Verabreichung eines alkylierenden Stoffes mit Gamma-Bestrahlung kombiniert, entleert werden.
Jedes Verfahren, das in der Technik zur Entleerung des Hodens bekannt ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass die grundlegende starre Architektur der Gonade durch die Behandlung weder zerstört noch signifikant geschädigt werden soll. Beispielsweise kann ein Zerreißen der Samenkanälchen zu einem beeinträchtigten Transport des testikulären Samen führen und in Unfruchtbarkeit resultieren. Zudem soll die ausgewählte Behandlung auch nicht die Sertoli-Zellen irreversibel schädigen, da sie einen Ausgangspunkt für die Entwicklung der Keimzellen während der Reifung und für das Verhindern der Zerstörung übertragener Fremdspermatogonien durch das Wirtsimmunabwehrsystem bieten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein zytotoxischer alkylierender Stoff, wie beispielsweise, aber nicht begrenzt auf, Bisulfan (1,4-Butanediol-dimethansulfonat), Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Ethyl-ethan-Sulfonsäure oder dergleichen mit Gamma-Bestrahlung kombiniert, was in jeder Reihenfolge verabreicht werden kann. Die Dosis des alkylierenden Stoffes und die Dosis der Gamma-Bestrahlung haben eine Menge, die ausreicht, um den Hoden umfassend zu entleeren.
Der alkylierende Stoff kann durch jedes pharmazeutisch akzeptierbare Zuführungssystem verabreicht werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, intraperitonealer, intravenöser oder intramuskulärer Injektion, intravenösem Tropf, Einpflanzung oder transdermaler oder transmukosaler Zuführungssysteme.
Die isolierten oder selektierten genetisch veränderten Keimzellen können durch direkte Injektion unter Verwendung einer geeigneten Mikropipette in den Empfängerhoden übertragen werden. Hilfszellen, wie beispielsweise Leydig- oder Sertoli-Zellen die unmodifiziert oder genetisch modifiziert sein können, können gemeinsam mit den modifizierten Keimzellen in einen Empfängerhoden übertragen werden.
Zur Bildung einer transgenen Zygote wird eine Einheit männlicher und weiblicher Gameten durch Paarung männlicher und weiblicher Wirbeltiere gleicher Art, oder durch in vitro oder in vivo künstliche Hilfsmittel geschaffen. Wenn künstliche Hilfsmittel gewählt werden, dann ist besonders der Einbau eines genetischen Selektionsmarkers, der in männlichen Keimzellen exprimiert wird, in das Genom nützlich.
Geeignete künstliche Hilfsmittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, künstliche Befruchtung, in vitro Befruchtung (IVF) und/oder andere künstliche Reproduktionstechnologien, wie beispielsweise intrazytoplasmatische Sameninjektion (ICSI), subzonale Befruchtung (SUZI) oder partielle Zona dissection (PZD). Es können auch andere Verfahren, wie beispielsweise Klonierung und Embryonentransfer, Klonierung und Embryonenteilung und dergleichen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die transgenen Wirbeltierabkömmlinge können wiederum durch natürliche Paarung, durch künstliche Befruchtung oder durch in vitro Befruchtung (IVF) und/oder andere künstliche Reproduktionstechnologien vermehrt werden. Beispielsweise können intrazytoplasmatische Sameninjektion (ICSI) und Huhn-intrazytoplasmatische Sameninjektion (CHICSI^TM), subzonale Befruchtung (SUZI), oder partielle Zona dissection (PZD) verwendet werden, um weitere Generationen transgener Nachkömmlinge zu erhalten. Obwohl das genetische Material ursprünglich nur in die Keimzellen eines parentalen Tieres eingefügt ist, wird es letztendlich in den Keimzellen zukünftiger Nachkömmlinge und nachfolgender Generationen davon vorhanden sein. Zusätzlich kann das genetische Material auch in anderen Zellen als den Keimzellen der Nachkömmlinge vorhanden sein, d.h. in somatischen Zellen.
Restriktionsenzym-vermittelte Integration (REMI)
Das REMI-Verfahren für die stabile Integration heterologer DNA in die genomische DNA einer Empfängerzelle wie beschrieben von Shemesh et al. in der PCT-Offenlegungsschrift WO 99/42569 und die durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung wird, umfasst teilweise eine Adaption der REMI-Techniken, die von Schiest und Petes (1991, PNAS U.S.A. 88: 7585–7589) und Kuspa und Loomis (1992, PNAS U.S.A. 89: 8803–8807), die beide durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden.
Das REMI-Verfahren ist geeignet für die Einführung heterologer DNA in die Genom-Nukleinsäure von Samen- und Samenvorläuferzellen, oder in eine Eizelle, in eine embryonale Zelle oder somatische Zelle eines Tieres, vorzugsweise eines Vogels, bevorzugter eines Huhns.
Die heterologe Nukleinsäure, die beispielsweise in Samen-Zellkern-DNA integriert werden soll, wird durch In-Kontakt-Bringen der heterologen DNA mit einem Typ-II-Restriktionsenzym, das nach Schneiden einzelsträngige kohäsive Enden schafft in eine lineare doppelsträngige DNA überführt, die solche Enden aufweist. Die Nukleinsäure, die geschnitten werden soll, kann eine zirkuläre Nukleinsäure sein, wie beispielsweise in einem Plasmid oder einem viralen Vektor, oder eine lineare Nukleinsäure, die mindestens eine Erkennungs- und Schnittstelle außerhalb der Gene oder der regulatorischen Regionen aufweist, die kritisch für die gewünschte Post-Integrationsfunktion der Nukleinsäure sind, und keine Erkennungs- und Schnittstellen innerhalb der kritischen Regionen.
Alternativ kann die heterologe DNA, die in die Samen-Zellkern-DNA integriert werden soll, durch chemisches und/oder enzymatisches Hinzufügen kohäsiver Enden an lineare DNA hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), das durch diese Bezugnahme in seiner Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung wird). Die hinzugefügten kohäsiven Enden müssen in der Lage sein, mit den kohäsiven Enden zu hybridisieren, die für eine Nukleinsäure, die mit einer Typ-II-Restriktionsendonuklease geschnitten worden ist, charakteristisch sind. Alternativ können die kohäsiven Enden durch Kombinieren der Verfahren, die auf Schneiden mit einem Typ-II-Restriktionsenzym und auf chemisches und/oder enzymatisches Hinzufügen basieren, hinzugefügt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können eine heterologe Nukleinsäure, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, und das geeignete Restriktionsenzym gemeinsam oder hintereinander durch beispielsweise Elektroporation oder Lipofektion in Samenzellen eingeführt werden. Allerdings zieht die vorliegende Erfindung in Betracht, dass jede Technik, die in der Lage ist, heterologes Material in Samen zu übertragen, verwendet werden kann, solange die Technik die Befruchtungsfunktionen des Samen ausreichend erhält, so dass der resultierende Samen in der Lage ist, die geeigneten Oozyten zu befruchten. Es wird verstanden, dass die heterologe Nukleinsäure für eine anschließende Übertragung in einen Embryo oder in das testikuläre Material des männlichen Empfängertieres, vorzugsweise eines Huhns, in das Genom einer Empfängerzelle, wie beispielsweise einer spermatogonalen Zelle oder einer spermatogonalen Vorläuferzelle integriert sein kann. Es wird zudem verstanden, dass die heterologe Nukleinsäure nicht in das Genom der Empfängerzelle integriert sein kann (beispielsweise episomal enthalten sein kann).
Die Kombination von REMI, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, kombiniert mit einem relativ gutartigen Verfahren der Übertragung heterologen Materials in eine Zelle kann darin resultieren, dass eine heterologe Nukleinsäure stabil in die genomische DNA eines hohen Anteils des behandelten Samen integriert wird, ohne die Lebensfähigkeit des Samen oder seine Fähigkeit, Oozyten zu befruchten, in großem Ausmaß zu reduzieren. Beispiele für geeignete Verfahren der Einführung von genetisch modifiziertem Samen, spermatogonalen Zellen oder spermatogonalen Vorläuferzellen in einen Empfängervogel, vorzugsweise in ein Huhn, sind oben beschrieben.
Es wird in Betracht gezogen, dass es zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gehört, dass Nukleinsäuren, die für Immunglobulin-Polypeptide kodieren, und die Immunglobulin-Polypeptide und Antikörpermoleküle, die daraus gebildet werden, aus jeder geeigneten Species stammen, einschließlich beispielsweise aus einem Mensch, aus einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einer Ziege, einem Schaf, einer Kuh, einem Pferd oder einem Vogel. Die Antikörper oder die Nukleinsäuren, die für diese kodieren, können monoklonale Antikörper sein. Es gehört weiterhin zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, dass die Immunglobulin-Polypeptide und davon abgeleiteten Antikörper beispielsweise durch Austauschen von Regionen innerhalb der Polypeptide einer Tierspecies durch äquivalente Regionen aus anderen Tierspecies modifiziert werden. Es wird weiterhin verstanden, dass ein Immunglobulin-Polypeptid aus einer Tierspecies mit einem Immunglobulin-Polypeptid aus einer anderen Tierspecies kombiniert werden kann.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung eines Antikörpers durch eine Vogelzelle, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Vogelzelle, die mit einem ersten Expressionsvektor und optional mit einem zweiten Expressionsvektor transformiert worden ist; wobei die Expressionsvektoren jeweils eine Transkriptionseinheit, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, einen Transkriptionspromotor und einen transkriptionellen Terminator, die operativ mit der Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, verknüpft sind, aufweisen, und wobei die kultivierte Vogelzelle einen Antikörper herstellt, der selektiv an ein Antigen bindet. Erläuternde Beispiele dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung werden hier in den Beispielen 1 und 2 unten gezeigt.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die Vogelzelle mit mindestens einem Expressionsvektor transformiert, der eine Transkriptionseinheit umfasst, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, das ausgewählt wird aus einer variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins, einer schweren Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, einer variablen Region einer leichten Kette eines Immunglobulins, einer leichten Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, und einem Einzelkettenantikörper, umfassend zwei verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die Vogelzelle mit einem Expressionsvektor transformiert, der eine Transkriptionseinheit umfasst, die für ein erstes Immunglobulin-Polypeptid und ein zweites Immunglobulin-Polypeptid kodiert, wobei die ersten und die zweiten Immunglobulin-Polypeptide ausgewählt werden aus einer variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins, einer schweren Kette eines Immunglobulins, die eine variable Region und eine konstante Region umfasst, einer variablen Region der leichten Kette eines Immunglobulins, einer leichten Kette eines Immunglobulins, das eine variable Region und eine konstante Region umfasst, und zusätzlich einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die operativ mit dem zweiten Immunglobulin-Polypeptid verknüpft ist. Die IRES wird die Translation des zweiten Immunglobulin-Polypeptids als ein individuelles Polypeptid ermöglichen.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann das einzelne Immunglobulin-Polypeptid Peptidregionen aufweisen, die für die Isolierung des Immunglobulin-Polypeptids geeignet sind, wie beispielsweise ein Polyhistidin-Peptid zur Bindung an eine Ni⁺-enthaltende Säule.
In den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehört es zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, dass die Vogelzelle eine Zelle aus einem Huhn, einem Truthahn, einer Ente, einer Gans, einer Wachtel, einem Fasan, einem Laufvogel, einem Ziervogel oder einem Wildvogel, am meisten bevorzugt aus einem Huhn, sein kann. Die Vogelzelle kann aus einer somatischen Zelle, wie beispielsweise einem Fibroblasten, einer Oviduktzelle, einer embryonalen Zelle und dergleichen ausgewählt werden, ist aber nicht darauf beschränkt, oder kann alternativ das Ovum einer Keimzellenlinie oder einer testikulären Zelle, vorzugsweise einer embryonalen Zelle, oder eine Oviduktzelle sein.
Es wird erachtet, dass Expressionsvektoren, die zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gehören, virale Vektoren, Plasmidvektoren, lineare Nukleinsäurevektoren und dergleichen oder Kombinationen davon umfassen, nicht aber darauf begrenzt sind.
Der Expressionsvektor kann jeder geeignete virale Vektor sein, wie beispielsweise ein aviärer Leukose-Virus-Vektor, ein adenoviraler Vektor, ein Transferrin-Polylysin verstärkter adenoviraler Vektor, ein humaner Immundefizienz-Virus-Vektor, ein lentiviraler Vektor, ein Moloney-Maus-Leukämievirus-abgeleiteter Vektor und dergleichen oder alternativ Virusabgeleitete DNAs, die die Polynukleotidaufnahme durch und die Freigabe in das Zytoplasma der Keimzellen erleichtern.
Transkriptionelle Promotoren eines Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung können ein konstitutiv aktiver Promotor wie beispielsweise der Cytomegalovirus Promotor oder ein gewebespezifischer Promotor sein. Beispielsweise zieht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors in Betracht, der in Oviduktzellen einer Vogelart funktional ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, der Promotoren der Gene, die für Ovalbumin, Lysozym, Ovomucoid, Ovotransferrin (Conalbumin), Ovomucin und dergleichen kodieren. Optional kann der transkriptionelle Promotor eines Expressionsvektors ein regulierbarer Promotor sein.
Der transkriptionelle Terminator mindestens eines Expressionsvektors kann zusätzlich eine Region umfassen, die für einen transkriptionellen Terminator kodiert, wie beispielsweise für den transkriptionellen Terminator eines Rinderwachstumshormons.
In den verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung kann ein Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit mindestens eines Expressionsvektors kodiert wird, ein Polypeptid einer schweren Kette eines Immunglobulins sein, umfassend eine variable Region oder eine Variante davon, und kann zusätzlich eine D-Region, eine J-Region, eine C-Region oder eine Kombination davon umfassen. Ein Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit eines Expressionsvektors kodiert wird, kann auch ein Polypeptid einer leichten Kette eines Immunglobulins sein, das eine variable Region oder eine Variante davon umfasst, und das zusätzlich eine J-Region und eine C-Region umfassen kann. Es wird auch zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gezählt, dass die Immunglobulin-Regionen aus der gleichen Tierspecies oder einer Mischung von Arten, einschließlich, aber nicht nur, Mensch, Maus, Ratte, Kaninchen und Huhn stammen.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit von mindestens einem Transkriptionsvektor kodiert wird, eine variable Region einer schweren Kette eines Immunglobulins, eine variable Region einer leichten Kette eines Immunglobulins und ein Linkerpeptid und bildet dadurch einen Einzelkettenantikörper, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins in einem Vogel bereit, das in der Lage ist, einen Antikörper zu bilden, der für die selektive Bindung an ein Antigen geeignet ist, umfassend den Schritt der Herstellung eines transgenen Vogels, den Einbau mindestens eines Transgens, wobei das Transgen für mindestens ein heterologes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins, aus der schweren Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, aus der variablen Region der leichten Kette eines Immunglobulins, der leichten Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, und aus einem Einzelkettenantikörper, umfassend zwei Peptid-verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins. Zusätzliche Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beinhalten die Einlagerung des heterologen Polypeptids in das Weiß des sich entwickelnden Vogeleis, das Einsammeln der so hergestellten hartschaligen Vogeleier und die Isolierung des heterologen Polypeptids, das in der Lage ist, einen Antikörper zu bilden, aus dem eingesammelten Ei. Es wird auch verstanden, dass die heterologen Polypeptide auch unter der transkriptionellen Kontrolle von Promotoren exprimiert werden können, die die Abgabe der Polypeptide in das Serum des transgenen Tieres erlauben. Ein beispielhafter Promotor für die nicht-gewebespezifische Herstellung eines heterologen Proteins ist der CMV-Promotor.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst das Transgen eine Transkriptionseinheit, die für ein erstes und zweites Immunglobulin-Polypeptid kodiert, die operativ mit einem Transkriptionspromotor, einem Transkriptionsterminator und optional einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) verknüpft sind (siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,937,190 bis Palmenberg et al., deren Inhalte durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil dieser Anmeldung werden).
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das isolierte heterologe Protein ein Antikörper, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden. In dieser Ausführungsform kann der Antikörper im Serum eines Vogels oder im Eiweiß des Vogeleis hergestellt werden durch Kombination mindestens einer variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins und mindestens einer variablen Region der leichten Kette eines Immunglobulins, die vorzugsweise durch mindestens eine Cystein-Brücke quervernetzt sind. Die Kombination der beiden variablen Regionen wird eine Bindestelle schaffen, die in der Lage ist, ein Antigen zu binden.
Es wird aber zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gezählt, dass die leichten und schweren Ketten eines Immunglobulins oder Varianten oder Derivate davon in verschiedenen transgenen Vögeln exprimiert werden und daher aus verschiedenen Medien, einschließlich Serum oder Eiern, isoliert werden, wobei jedes Isolat eine einzelne Art eines Immunglobulin-Polypeptids umfasst. Das Verfahren kann zusätzlich den Schritt der Kombination einer Vielzahl von isolierten heterologen Immunglobulin-Polypeptiden umfassen, wodurch ein Antikörper hergestellt wird, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden. In dieser Ausführungsform können zwei individuelle transgene Vögel geschaffen werden, wobei ein transgener Vogel Serum oder Eier herstellt, in dem/in denen eine variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins oder ein Polypeptid, das eine solche enthält, exprimiert wird. Ein zweiter transgener Vogel, der ein zweites Transgen aufweist, stellt Serum oder Eier her, in dem/in denen eine variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins oder ein Polypeptid, das eine solche enthält, exprimiert wird. Die Polypeptide können aus ihren entsprechenden Seren und Eiern isoliert werden und in vitro kombiniert werden, um eine Bindestelle zu schaffen, die in der Lage ist, an ein Antigen zu binden.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird der transgene Vogel, der ein Transgen aufweist, das für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, beispielsweise ein transgenes Huhn, hergestellt durch Einführen eines transgenen, Vogel-Spender-Zellkerns in eine Rezipientenzelle zur Herstellung einer rekonstruierten Vogel-Zygote, Aktivierung der rekonstruierten Zygote und Ermöglichung der rekonstruierten Zygote, sich vollständig zu entwickeln. Die Empfängerzelle kann eine entkernte Zelle sein und unter Verwendung von Zweiphotonen-Rasterlaser-Mikroskopie visualisiert werden.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung kann der transgene Vogel durch Samen-vermittelte Übertragung mindestens eines Transgens hergestellt werden, wobei das mindestens eine Transgen für eine variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins, für eine schwere Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, für eine variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins, für eine leichte Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, oder für einen Einzelkettenantikörper, umfassend zwei verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins, kodiert, und wobei das Transgen in das Genom einer Spermatozoen-Zelle oder eines Vorläufers davon eingebaut wird, so dass vom männlichen Vogel eine genetisch modifizierte männliche Gamete hergestellt wird. Die Paarung des männlichen Vogels mit einem weiblichen seiner Art wird einen transgenen Abkömmling schaffen, der mindestens ein Transgen in seinem Genom trägt.
In noch einer anderen Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung wird das Transgen in die genomische DNA einer Vogel-Spermie durch ein in vivo Verfahren integriert, umfassend die Schritte der Gabe einer Genzuführungsmischung, umfassend einen viralen Vektor, der mindestens ein Polynukleotid umfasst, das für mindestens ein heterologes Immunglobulin-Polypeptid kodiert, an einen Vogel-Hoden, vorzugsweise einen Hühnerhoden; wobei das heterologe Polypeptid beispielsweise ausgewählt wird aus einer variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins, einer schweren Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, einer variablen Region der leichten Kette eines Immunglobulins, einer leichten Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, und einem Einzelkettenantikörper, umfassend zwei verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins; wobei das heterologe Nukleotid operativ mit einer transkriptionellen Promotorsequenz verknüpft ist, so dass eine transkriptionelle Einheit unter Bedingungen gebildet wird, die das Erreichen einer Spermatozoen-Zelle oder einer Vorläuferzelle im Hoden ermöglichen. Die Vorläuferzelle kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus spermatogonalen Stammzellen, Typ-B-Spermatogonen, primäre Spermatozyten, präleptotäne Spermatozyten, weiterhin leptotäne Spermatozyten, zytogene Spermatozyten, Pachytän-Spermatozyten, sekundäre Spermatozyten, Spermatide und dergleichen. Die Ausführungsform kann zusätzlich die Schritte des Einbauens des Polynukleotids, das für das mindestens ein heterologes Polypeptid kodiert, in das Genom der Spermatozoen-Zelle oder der Vorläuferzelle, so dass eine genetisch modifizierte männliche Gamete vom männlichen Vogel hergestellt wird und der Paarung des männlichen Vogels mit einem weiblichen der gleichen Spezies umfassen, so dass dadurch ein transgener Nachkömmling hergestellt wird, der das Polynukleotid in seinem Genom trägt.
In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung kann das Transgen, wie in der vorherigen Ausführungsform oben beschrieben, in die genomische DNA einer Vogel-Spermatozoen-Zelle oder einer Vorläuferzelle durch ein in vitro Verfahren eingebaut werden, wie beispielsweise durch In-Kontakt-Bringen der Spermatozoen-Zelle oder einer Vorläuferzelle mit einer Genzuführungsmischung, umfassend einen viralen Vektor, ungefähr bei oder unterhalb der Körpertemperatur des Vogels und für einen effektiven Zeitraum, so dass die Transkriptionseinheit in das Genom der Zelle eingebaut wird; Isolieren oder Selektieren der genetisch modifizierten Zelle mit Hilfe eines genetischen Selektionsmarkers, der in der genetisch modifizierten Zelle exprimiert wird; Übertragen der isolierten oder selektierten genetisch modifizierten Zelle in den Hoden eines männlichen Empfängervogels, so dass die Zelle in einem Samenkanälchen des Hodens eingelagert wird und eine genetisch modifizierte männliche Gamete darin hergestellt wird; und Paarung des männlichen Empfängervogels mit einem weiblichen Vogel seiner Art, so dass dadurch ein transgener Nachkömmling hervorgebracht wird, der das Polynukleotid in seinem Genom trägt.
In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung kann das Transgen in die genomische DNA eines Vogel-Samens durch Restriktionsenzym vermittelte Integration (REMI) integriert werden, umfassend die Gabe einer Genzuführungsmischung an eine Vogel-Samenzelle oder eine Vorläufer-Samenzelle, worin ein heterologes Polynukleotid für eine variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins, eine schwere Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, eine variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins, eine leichte Kette eines Immunglobulins, umfassend eine variable Region und eine konstante Region, einen Einzelkettenantikörper, umfassend zwei verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins und dergleichen kodiert, so dass das heterologe Polynukleotid operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, so dass eine transkriptionelle Einheit gebildet wird, und wo kohäsive Enden in dem heterologen Polynukleotid geschaffen worden sind, wobei die kohäsiven Enden mit den kohäsiven Enden identisch sind, die charakteristisch für eine DNA sind, die mit einer gegebenen Typ-II-Restriktionsendonuklease geschnitten worden ist. Das heterologe Polynukleotid und die Typ-II-Restriktionsendonuklease können in eine Spermatozoen-Zelle oder eine Vorläuferzelle überführt werden, wodurch das heterologe Polynukleotid in das Genom der Spermatozoen-Zelle oder der Vorläuferzelle eingebaut wird, so dass vom männlichen Vogel eine genetisch modifizierte männliche Gamete hergestellt wird. Der männliche Vogel kann dann mit einem Weibchen der gleichen Art gepaart werden, so dass dadurch ein transgener Nachkömmling hergestellt wird, der das Polynukleotid in seinem Genom trägt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen transgenen Vogel bereit, der in einem Vogelei einen Antikörper herstellt, wobei der transgene Vogel mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, die für die Polypeptidkomponenten eines Antikörpermoleküls, das in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden, kodiert, und wobei der Antikörper von einem Vogelweibchen in das Eiweiß eines Vogeleis abgegeben wird.
In einer Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung umfasst der transgene Vogel eine Transkriptionseinheit, umfassend eine heterologe Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid, einen Transkriptionspromotor und einen transkriptionellen Terminator kodiert, die operativ mit der Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, verknüpft sind.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung umfasst das Transgen des transgenen Vogels zusätzlich eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die operativ mit einer Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert, verknüpft ist.
Noch ein weitererer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein transgenes Vogelei, das von einem transgenen Vogel erhalten wird, wobei das Ei mindestens ein heterologes Polynukleotid enthält, das für einen Antikörper kodiert, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden, wobei das Eiweiß des Vogeleis den Antikörper, der von dem heterologen Polynukleotid kodiert wird, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen transgenen Vogel bereit, der in einem Vogel-Serum einen Antikörper produziert, wobei der transgene Vogel mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, die für die Polypeptid-Komponenten eines Antikörpermoleküls kodiert, das in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden, und wobei der Antikörper in das Serum des Vogels abgegeben wird.
In einer Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung umfasst der transgene Vogel eine Transkriptionseinheit, umfassend eine heterologe Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid, einen Transkriptionspromotor und einen transkriptionellen Terminator kodiert, die operativ mit der Nukleotidsequenz verknüpft sind, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung umfasst das Transgen des transgenen Vogels zusätzlich eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die operativ mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid kodiert.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein transgenes Serum, das von einem transgenen Vogel erhalten wird, wobei das Serum mindestens ein heterologes Polynukleotid beinhaltet, das für einen Antikörper kodiert, der in der Lage ist, selektiv an ein Antigen zu binden, und wobei das Vogel-Serum den Antikörper, der von dem heterologen Polynukleotid kodiert wird, umfasst.
Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung unter Verwendung von spezifischen Begriffen, Vorrichtungen und Verfahren beschrieben worden sind, ist eine solche Beschreibung nur für erklärende Zwecke. Die verwendeten Wörter sind eher beschreibende Wörter als beschränkende. Es wird verstanden werden, dass Änderungen und Variationen von Durchschnittsfachleuten durchgeführt werden können, ohne vom Geist und dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, die in den angehängten Ansprüchen dargelegt ist, abzuweichen. Zusätzlich sollte es verstanden werden, dass Aspekte der verschiedenen Ausführungsformen sowohl gesamt als auch teilweise ausgetauscht werden können. Die vorliegende Erfindung wird zusätzlich durch die folgenden Beispiele erläutert, die zur Erläuterung hinzugefügt worden sind und nicht als beschränkend ausgelegt werden sollen.
Beispiel 1: Transfektion von kultivierten Wachteloviduktzellen
Das Ovidukt wurde aus einer Japanischen Wachtel entfernt (Coturnix coturnix japonica) und der Magnumanteil wurde zerhackt und enzymatisch mit 0,8 mg/ml Kollagenase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 1,0 mg/ml Dispase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) durch Schütteln und Reiben für 30 Minuten bei 37°C aufgetrennt. Die Zellsuspension wurde dann durch ein steriles OP-Tuch filtriert, dreimal mit F-12 Medium (Life Technologies, Grand Island, NY) durch Zentrifugation bei 200 × g gewaschen und in OPTIMEM^TM (Life Technologies) resuspendiert, so dass die OD₆₀₀ ungefähr 2 war. 300 μl der Zellsuspension wurden pro Loch einer 24-Loch-Platte plattiert. Separate Vektoren, die eine cDNA enthielten, die entweder für die schwere oder leichte Kette eines humanen monoklonalen Antikörpers gegen DTLA-4 kodieren ( WO 01/14424 , deren Inhalt in seiner Gesamtheit durch diese Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung wird), wurden von einer Antikörperfirma bereitgestellt. Für jede Transfektion wurden 2,5 μl DMRIE-C Liposomen (Life Technologies) und 1 μg cDNA 15 Minuten bei Raumtemperatur in 100 μl OPTIMEM^TM vorinkubiert und dann zu den Oviduktzellen gegeben. Zellen mit DNA/Liposomen wurden 5 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Dann wurden 0,75 ml DMEM (Life Technologies), enthaltend 15% fötales Rinderserum (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), 2X Penicillin/Streptomycin (Life Technologies), 10^–6 M Insulin (Sigma), 10^–8 M β-Estradiol (Sigma) und 10^–7 M Kortikosteron (Sigma) in jede Vertiefung gegeben, und die Inkubation wurde für 72 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Medium geerntet und bei 110 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ELISA und FACS auf Antikörpergehalt analysiert. Bezugnehmend auf 1 zeigen die Ergebnisse an, dass nur die Zellen, die mit sowohl schwerer Kette (p1083) als auch leichter Kette (p 1086) cotransfiziert worden sind, monoklonalen Antikörper exprimierten, der durch ELISA nachweisbar war, allerdings waren die Spiegel unterhalb der FACS-Nachweisgrenzen.
Beispiel 2: Herstellung von pCMV-L Kette-IRES-H Kette (L-IRES-H)
Der pCMV-L-IRES-H Vektor (bezeichnet als pAVIWH-A149.70.1.8) wurde durch Prozessieren von drei DNA-Fragmenten aus drei einzelnen Plasmiden hergestellt: p1087, pBS-IRES, p1083. Die Plasmide p1087 und p1083 wurden, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, erhalten, während pBS-IRES von Dr. Peter Mountford (University of Edingburgh) erhalten wurde. Restriktionsenzymspaltung von p1087 mit XbaI und EcoRI, gefolgt von einer Behandlung mit alkaliner Phosphatase, wurde gemäß molekularer Standardtechniken durchgeführt (Sambrook et al., supra). Das resultierende 6259 Basenpaar (bp) Fragment wurde durch Elektroelution aus einem Gel aufgereinigt.
Das zweite Plasmid, pBS-IRES, wurde mit EcoRI und NcoI geschnitten und das resultierende 592 bp Fragment wurde wie oben beschrieben aus einem Gel aufgereinigt. In einer ähnlichen Art und Weise wurde p 1083 mit NcoI und XbaI geschnitten und das resultierende 1500 bp Fragment aus einem Gel aufgereinigt. Alle drei aufgereinigten DNA-Fragmente wurden über Nacht bei 16°C in Gegenwart von T4 DNA Ligase ligiert und zur Transformation von E. coli DH5α verwendet. Ampicillin-resistente Kolonien wurden durch Restriktionsspaltung gescreent. Das resultierende Plasmid, pCMV-L-IRES-H wurde durch QIAGEN-Präp aufgereinigt (Qiagen Inc., Valencia, CA) und wie in Beispiel 3 beschrieben verwendet.
Beispiel 3: Transfektion von kultivierten Huhn-Gesamtembryofibroblasten
Zur Bestimmung, ob Antikörper von Zellen hergestellt wurden, die mit cDNAs für die schwere und leichte Kette transfiziert waren, die entweder auf getrennten Plasmiden lagen, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden, oder zusammen auf dem gleichen Plasmid kodiert waren, wie beschrieben in Beispiel 2, wurden Huhn-Gesamtembryofibroblasten (WEFs) wie folgt erhalten und vorbereitet. Befruchtete Hühnereier wurden ungefähr für 65 Stunden bebrütet. Embryonen wurden unter Verwendung von Filterpapierringen gesammelt, dann dreimal in Phosphat gepufferter Saline mit Glukose gewaschen (PBS-G), gefolgt von einem Waschschritt in kalzium- und magnesiumfreiem EDTA (CMF-EDTA). Die Embryonen wurden dann 30 Minuten in frischem CMF-EDTA bei 4°C unter leichtem Schütteln inkubiert. CMF-EDTA wurde entfernt und durch eine 0,5% Trypsin-Lösung (kein EDTA) für 3 Minuten bei 37°C ersetzt. Die Zellen wurden zehnmal verrieben, dann wurden 5% Hühnerserum hinzugefügt, um die Trypsin-Reaktion zu inhibieren. Die Zellsuspension wurde dann zu α-MEM (Life Technologies), versetzt mit 2,2 g/l NaHCO₃, 2,52 g/L EPPS, 0,18 g/l D-Glukose, 5% FBS, 5% Kükenserum (für 1 Stunde Hitze inaktiviert bei 55°C), 5 × 10^–5 M β-Merkaptoethanol, 0,2 mM L-Glutamin, 2X Penicillin/Streptomycin gegeben und zentrifugiert. Die Zellen wurden in α-MEM resuspendiert, das wie oben beschrieben ergänzt war, und in 6-Loch-Platten in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Loch plattiert.
Für jede Transfektion wurden 6 μl FuGene 6 Liposomen (Roche Molecular Biochemicals) und 2 μg DNA in OPTIMEM^TM für 15 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert, und dann zu den WEFs gegeben. WEFs mit DNA/Liposomen wurden für 5 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Das Transfektionsmedium wurde dann entfernt und durch 2 ml α-MEM, das wie oben beschrieben ergänzt worden war, ersetzt. 72 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und bei 110 × g für 5 Minuten zentrifugiert.
Die Überstände wurden durch ELISA und FACs auf Antikörpergehalt analysiert. Nun Bezug nehmend auf 2, zeigten die Resultate, dass die Cotransfektion von Zellen mit Plasmiden für sowohl schwere als auch leichte Kette monoklonale Antikörper herstellte, die sowohl durch ELISA- und FACS-Analyse nachgewiesen wurden.
3 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn WEFs mit pCMV-EGFP alleine (Negativkontrolle) transfiziert wurden, mit p1086 (L-Kette) und p1083 (H-Kette) cotransfiziert wurden, oder mit entweder 1 μg oder 2 μg pCMV-L Kette-IRES-H Kette (L-IRES-H) transfiziert wurden. Die ELISA-Analyse zeigt an, dass Zellen, die mit dem Vektor transfiziert waren, der für beide cDNAs kodierte, die durch ein IRES-Element getrennt waren, nachweisbaren Antikörper herstellten. Allerdings war die Antikörperherstellung in Zellen, die das IRES-Konstrukt enthielten, ungefähr zehnfach geringer als Antikörper, der durch cotransfizierte Zellen hergestellt worden war.
Beispiel 4: Herstellung von Humanen Antikörper in Kükenserum durch Samen-Vermittelte Transgenese
DNA-Konstrukte, die, wie in Beispielen 1 und 2 oben beschrieben, hergestellt wurden, wurden auch unter Verwendung von Samen-vermittelter Transgenese (SMT) in das Hühnergenom integriert, und es wurde gezeigt, dass diese Konstrukte Antikörper im Serum der resultierenden Küken exprimieren. SMT kann Transfektion, Elektroporation oder Inkubation von Samen mit dem gewünschten DNA-Konstrukt (das heißt der Lysozym-Promotor, der die Expression der schweren und leichten Ketten des MAb steuert) und Befruchtung des Ovums mit dem behandelten Samen durch künstliche Befruchtung oder durch Huhn-intrazytoplasmatische Sameninjektion (chICSI^TM) beinhalten.
Liposomenkomplexe wurden mit jeweils 5 μg mit MluI geschnittenen Plasmiden p1086 und p1083 und 10 μg LIPTOFECTAMINE in 200 μl OPTIMEM (Life Technologies) gebildet. In einem separaten Gefäß wurden 100 Einheiten Mlul-Restriktionsenzym mit 10 μg LIPOFECTAMINE in 200 μl OPTIMEM gemischt. Beide Gefäße wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, zu 10⁹ frisch ejakulierten Samen von einem White Leghorn Hahn gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Samen/Liposom/DNA/Restriktionsenzym-Gemisch wurde dann für die künstliche Befruchtung von vier White Leghorn Hennen verwendet. Am zweiten und den folgenden Tagen nach der Befruchtung wurden die Eier gesammelt und bei 38°C bis zum Schlüpfen bebrütet.
Serumproben wurden von 40 Küken genommen, deren Alter im Bereich von 3 bis 6 Wochen lag. Für jede Probe wurden ungefähr 100 μl Kükenblut in heparinisierten Kapillargefäßen aufgenommen und zu 100 μl Phosphat gepufferter Saline in 96-Loch-Platte gegeben. Die Platte wurde 5 Minuten bei 110 × g zentrifugiert und ungefähr 100 μl des Überstandes aus jedem Loch wurden zum Antikörpernachweis in 0,5 ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die ELISA-Ergebnisse wiesen nachweisbare Spiegel (–2 ng/ml) humaner monoklonaler Antikörper in fünf der 40 Proben auf.
Beispiel 5: Herstellung Transgener Hühner, die Humane Monoklonale Antikörper (MAbs) Exprimieren unter Verwendung einer Retroviralen Plattform
Ein retroviraler Vektor, basierend entweder auf dem aviären Leukosevirus (ALV) oder auf den Moloney-Maus-Leukämievirus (MOMLV) wird so konstruiert werden, dass die leichten (L) und die schweren (H) Ketten des MAb mit einem Element für eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) verknüpft sind. Beide Gene werden dann transkriptionell von einem Promoter reguliert werden, wie beispielsweise vom Cytomegalovirus (CMV) immediate early Promotor/Enhancer oder von einem Promotor, der Gewebespezifität für das Hennenovidukt zeigt (das heißt Lysozym-Promotor, Ovalbumin-Promotor, etc.). Die Promotor-L Kette-IRES-H Kette DNA-Expressionskassette wird von den langen terminalen Wiederholungen (LTRs) des Retrovirus flankiert werden. Hühnerembryonen im Stadium X werden zur Herstellung transgener Hühner mit übertragenden Partikeln injiziert werden, die das obige Konstrukt enthalten.
Alternativ werden die schweren und leichten Ketten in separaten retroviralen Vektoren enthalten sein und verschiedene Linien transgener Hühner werden hergestellt werden. Jede Linie wird entweder die schwere oder die leichte Kette des MAb exprimieren. Sobald die Übertragung des Transgens in die Keimbahn in beiden Linien etabliert ist, werden sie miteinander gepaart werden, um die schweren und leichten Ketten gemeinsam zu exprimieren, um funktionale MAbs in der Nachkommenschaft herzustellen.
Beispiel 6: Herstellung eines Empfänger-Zytoplasten unter Verwendung von TPLSM
Herstellung eines Vogelembryos zur Visualisierung
Eizellen wurden aus eingeschläferten Hennen zwischen 2–4 Stunden nach Eiablage des vorherigen Eies isoliert. Alternativ können Eier von Hennen isoliert werden, deren Ovidukte ausgehöhlt worden sind (Gilbert & Woddgush, 1963, J. Reprod. & Fertility 5: 451–453 und Pander et al., 1998, Br. Poult. Sci. 30: 953–7).
Bevor Bilder vom frühen Vogelembryo hergestellt wurden, wurde DNA nach dem folgenden Protokoll mit einem spezifischen Farbstoff inkubiert. Die Eiweißkapsel wurde entfernt und das Ovum wurde in eine Platte mit der Keimscheibe nach oben gelegt. Reste der Eiweißkapsel wurden von der Oberseite der Keimscheibe entfernt. Phosphat-gepufferte Saline wurde in die Schale gegeben, um ein Austrocknen des Ovums zu verhindern. Ein Klonierungszylinder wurde um die Keimscheibe gelegt, und 1,0 μg/ml DAPI in PBS wurde in den Zylinder gegeben. Die Visualisierung wurde ungefähr nach 15 Minuten Inkubation durchgeführt.
Injektion der Keimscheibe
Die Vorbereitung des Eies wurde durchgeführt wie für die Inkubation beschrieben. Nach Entfernung der Kapsel wurden 10–50 Nanoliter einer 0,1 μg/ml DAPI-Lösung in PBS unter Verwendung einer Glaspipette in die Keimscheibe injiziert. Die Visualisierung wurde ungefähr 15 Minuten nach Injektion durchgeführt.
Visualisierung, Zellkernablation und Entkernung
Nach der Inkubation wurden Bilder aus dem Innern des frühen Vogelembryos unter Verwendung von TPLSM erstellt. Die Keimscheibe wurde unter das Mikroskopobjektiv gelegt und die pronuklearen Strukturen wurden im zentralen Bereich der Scheibe gesucht, bis zu einer Tiefe von 60 μm unter Verwendung geringer Laserleistung von 3–6 Milliwatt bei einer Wellenlänge von 750 nm.
Sobald die pronuklearen Strukturen lokalisiert waren, wurden sie einer Laser-vermittelten Ablation unterzogen. In diesen Experimenten wurde eine Olympus 20x/0,5NA (numerische Apertur) Wasser-Immersions-Linse verwendet. Die zu entfernenden x- und y-Ebenen wurden durch die Zweiphotonen-Software definiert, wobei die z-Ebene (Tiefe) für diesen Objektivtyp gerade unter 10 μm war. Da jede pronukleare Struktur ungefähr einen Durchmesser von 20 μm hatte, umfasste die Ablation zwei Schritte (2 mal 10 μm). Der Brennpunkt wurde abgesenkt, um die Reste des Pronukleus zu visualisieren, die anschließend ablatiert wurden. Die Laserleistung, die zur Ablation der Pronuklei verwendet wurde, lag bei einer Wellenlänge von 750 nm zwischen 30 bis 70 Milliwatt. Für die oben beschriebenen Ablationsexperimente wurde das Bild um einen Faktor von 4 bis 5 vergrößert, was eine 16–25 fache Bereichskomprimierung ergab. Dann wurde die Leistung für einen 160–300 fachen Anstieg der Gesamtintensität verglichen zur Visualisierungsintensität von 3–6 Milliwatt 10–12 fach erhöht. Die Ablationsintensität (Leistungsdichte) ist der funktionale Parameter, das heißt der 10–12 fache Leistungsanstieg ergibt eine Ablationsleistung von 30–70 Milliwatt, aber der Vergrößerungsfaktor komprimierte diese Leistung in einem 16–25x kleineren Bereich, was einen 160–300 fachen Anstieg der Leistungsdichte ergab.
Beispiel 7: Aufbereitung einer Zellkern-Spender-Zelle und Spender-Zellkern-Isolierung
Fibroblastenzellen in Kultur wurden trypsiniert (0,25% Trypsin und 1 μM EDTA) zweimal in PBS, enthaltend 5% fötales Kälberserum (FCS), zentrifugiert und in eine 60 mm Plastikschale in PBS, enthaltend 5% FCS, gegeben. Unter Verwendung der Mikroskop/Mikromanipulationseinheit, die unten beschrieben ist, unter Durchlicht, wurden dann Zellkern-Spender durch wiederholtes Pipettieren der Zellen isoliert, was die zytoplasmatische Membran zerriss und den Zellkern aus dem Innern der Zelle freigab.
Beispiel 8: Aufbereitung einer rekonstruierten Zygote
Injektion
Eine Mikromanipulationseinheit, umfassend einen IM-16 Mikroinjektor und einen MM-188NE-Mikromanipulator, beide von Nikon/Marishige, wurden an ein aufrecht stehendes Nikon Eclipse E800 angepasst. Dieses Mikroskop war angepasst worden, um sowohl unter Durchlicht- als auch Auflicht-Bedingungen zu arbeiten. Diese einzigartige Konfiguration erlaubte uns, somatische Zellen in Suspension morphologisch zu untersuchen und aufzuarbeiten (Isolieren der Zellkerne wie oben beschrieben) und die Injektionspipette unter Verwendung trockener oder Wasserimmersionslinsen unter diaskopischer Beleuchtung oder Durchlicht zu beladen. Darauf wurde eine sofortige Lokalisierung und Positionierung der Keimscheibe unter dem Mikroskop und eine anschließende handgeführte Injektion der somatischen Zellen durchgeführt, wobei trockene Linsen und Fernlinsen unter Faseroptik- sowie episkopischer Beleuchtung (Licht, das von der Seite bzw. durch die Objektive auf die Probe kommt) verwendet wurden.
Beispiel 9: Ovum-Überführung
Zum Zeitpunkt der Eiablage wurden Empfänger-Hennen durch Injektion in die Flügelader mit Pentobarbital (0,7 ml einer 68 mg/ml Lösung) betäubt. Zu diesem Zeitpunkt ist das Infundibulum empfänglich für ein Spender-Ovum, hat aber noch kein Ei ausgestoßen. Aus dem abdominalen Bereich wurden Federn entfernt, der Bereich wurde mit Betadin geschrubbt und mit 70% Ethanol gespült. Der Vogel wurde in Rückenlage gebracht und ein OP-Abdecktuch wurde über den Vogel gelegt, mit dem Operationsbereich exponiert. Ein Einschnitt, ungefähr zwei Inches lang, wurde gemacht, der an der Kontaktstelle zwischen Brustbein und Brustknochen anfing und parallel zum Brustknochen verlief. Nach Schneiden durch die Glattmuskelschichten und durch das Bauchfell wurde das Infundibulum lokalisiert, herausgenommen und unter Verwendung von behandschuhten Händen und Steriltechnik geöffnet. Das Spender-Ovum wurde vorsichtig an das offene Infundibulum angebracht und es wurde ermöglicht, dass es sich aufgrund des Eigengewichts in das Infundibulum und schließlich in das vordere Magnum bewegte. Das internalisierte Ovum wurde in die Körperhöhle eingebracht und der Einschnitt durch ineinander greifende Stiche sowohl für die Glattmuskelschicht als auch für die Haut verschlossen. Die Empfänger-Hennen wurden in ihre Käfige zurückgegeben, und es wurde ermöglicht, dass sie sich bei freiem Zugang zu sowohl Futter als auch Wasser erholen. Die Eier, die von den Empfänger-Hennen gelegt wurden, wurden am nächsten Tag ein gesammelt, bebrütet, und 21 Tage später schlüpften Küken.
Alternativ stellt eine Henne, die ein ausgehöhltes Ovidukt aufweist (Gilbert and Woddgush, supra und Pancer et al., supra) ein Verfahren zur Eiersammlung bereit, das nützlich ist für die Prozedur zur Entfernung des Zellkerns wie oben beschrieben. Die Überführung eines rekonstruierten Embryos in eine Empfänger-Henne für die Herstellung eines hartschaligen Eies ist beschrieben in Wentworth, 1960, Poultry Science, 39: 782–784, inter alia). Die Technik zur Entfernung des Zellkerns wird verwendet werden, um Eizellen für Empfänger-Zytoplasten zu erhalten und die letztgenannte Technik wird verwendet werden, um Empfänger-Hühner herzustellen, die wiederholt für die Übertragung von rekonstruierten Embryonen verwendet werden.

Claims

Methode für die Herstellung eines heterologen Antikörpers, umfassend Kultivieren einer Vogel-Oviduktzelle, die mit mindestens einem Expressionsvektor transfiziert ist, der eine Transkriptionseinheit umfasst, die eine Nukleotidsequenz aufweist, kodierend für mindestens ein Immunglobulin-Polypeptid, operativ mit einem Transkriptionspromotor und einem transkriptionellen Terminator unter solchen Bedingungen verknüpft, dass die besagte Nukleotidsequenz exprimiert wird, wobei die kultivierte Vogelzelle ein Immunglobulin-Polypeptid herstellt, das einen Antikörper bildet, der selektiv ein Antigen bindet, oder ein Immunglobulin-Polypeptid herstellt, das, wenn kombiniert mit seiner verwandten leichten oder schweren Kette, einen Antikörper bildet, der selektiv ein Antigen bindet.
Methode nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Expressionsvektor ferner für ein zweites Immunglobulin-Polypeptid und eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle kodiert (Internal Ribosome entry site; IRES).
Methode nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Expressionsvektor ausgewählt wird aus einem viralen Vektor, einem Plasmidvektor, oder einem linearen Nukleinsäurevektor.
Methode nach Anspruch 3, wobei der mindestens eine Expressionsvektor ein viraler Vektor ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aviäres Leukosevirus, Adenovirusvektoren, Transferrin-Polylysin verstärkten Adenovirus-Vektoren, humane Immundefizienz Virus Vektoren, Lentivirus Vektoren, Moloney-Maus-Leukämievirus abgeleitete Vektoren oder Varianten davon.
Methode nach Anspruch 3, wobei der mindestens eine Expressionsvektor ein Plasmidvektor ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei der transkriptionelle Promotor des mindestens einen Expressionsvektors ein konstitutiv aktiver Promotor ist.
Methode nach Anspruch 6, wobei der transkriptionelle Promotor des mindestens einen Expressionsvektors ein Cytomegalovirus-Promotor ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei der transkriptionelle Promotor des mindestens einen Expressionsvektors ein gewebespezifischer Promotor ist.
Methode nach Anspruch 8, wobei der gewebespezifische Promotor Expression in Oviduktzellen einer Vogelspezies vermittelt.
Methode nach Anspruch 9, wobei der gewebespezifische Promotor aus den Promotoren der Gene ausgewählt wird, die für Ovalbumin, Lysozym, Ovomucoid, Ovotransferrin (Conalbumin) und Ovomucin kodieren.
Methode nach Anspruch 1, wobei der transkriptionelle Promotor des mindestens einen Expressionsvektors ein regulierbarer Promotor ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei der transkriptionelle Terminator des mindestens einen Expressionsvektors eine Region umfasst, die für einen transkriptionellen Terminator eines Rinderwachstumshormons kodiert.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Vogelzelle eine Huhnzelle, eine Truthahnzelle, eine Entenzelle, eine Gänsezelle, eine Wachtelzelle, eine Fasanenzelle, eine Laufvogelzelle, eine Ziervogelzelle oder eine Wildvogelzelle ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Oviduktzelle eine Magnumzelle ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid die variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins, die variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins und eine konstante Region, die variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins, die variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins und eine konstante Region, oder ein einzelkettiger Antikörper, umfassend zwei verknüpfte variable Regionen eines Immunglobulins, ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid eine Peptidregion für die Isolierung des Immunglobulin-Polypeptids aufweist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit des mindestens einen Expressionsvektors kodiert wird, die variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins oder eine Variante davon ist.
Methode nach Anspruch 17, wobei die schwere Kette des Immunglobulins ferner eine D Region, eine J Region und eine C Region umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit des mindestens einen Expressionsvektors kodiert wird, die variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins oder eine Variante davon ist.
Methode nach Anspruch 19, wobei die leichte Kette des Immunglobulins ferner eine J Region und eine C Region umfasst.
Methode nach Anspruch 17, wobei das Immunglobulin-Polypeptid die schwere Kette eines Immunglobulins aus einem Säuger oder einem Vogel kodierendes Polypeptid ist.
Methode nach Anspruch 21, wobei die schwere Kette des Immunglobin-Polypeptids mindestens zwei Domänen umfasst, die aus mindestens zwei Tierspezies abgeleitet sind.
Methode nach Anspruch 21, wobei der Säuger ein Mensch, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Schaf, eine Kuh oder ein Pferd ist, und wobei der Vogel ein Huhn, ein Truthahn, eine Ente, eine Gans, eine Wachtel, ein Fasan, ein Laufvogel, ein Ziervogel, oder ein Wildvogel ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid die leichte Kette eines Immunglobulins aus einem Säuger oder einem Vogel kodierendes Polypeptid ist.
Methode nach Anspruch 24, wobei das Immunglobulin-Polypeptid mindestens zwei Domänen umfasst, die aus mindestens zwei Tierspezies abgeleitet sind.
Methode nach Anspruch 24, wobei der Säuger ein Mensch, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Schaf, eine Kuh oder ein Pferd ist, und wobei der Vogel ein Huhn, ein Truthahn, eine Ente, eine Gans, eine Wachtel, ein Fasan, ein Laufvogel, ein Ziervogel, oder ein Wildvogel ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid, das von der transkriptionellen Einheit des mindestens einen Expressionsvektors kodiert wird, die variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins, die variable Region der leichten Kette eines Immunglobulins und ein Bindepeptid umfasst, und dadurch einen einzelkettigen Antikörper bildet.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid menschlich ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulin-Polypeptid humanisiert ist.
Methode wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz einen Antikörper kodiert, der spezifisch für CTLA4 ist.
Methode wie in Anspruch 30 beansprucht, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Methode nach Anspruch 30, wobei die Vogelzelle ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus einer Huhnzelle, einer Truthahnzelle, einer Entenzelle, einer Gänsezelle, einer Wachtelzelle, einer Fasanenzelle, einer Laufvogelzelle, einer Ziervogelzelle und einer Wildvogelzelle besteht.
Methode nach Anspruch 30, wobei die Vogelzelle eine Huhnzelle ist.
Methode nach Anspruch 30, wobei der Antikörper ein menschlicher Antikörper ist.
Methode nach Anspruch 30, wobei die Oviduktzelle eine Magnumzelle ist.