DE60201573T2

DE60201573T2 - Biokompatibles verbundmaterial

Info

Publication number: DE60201573T2
Application number: DE60201573T
Authority: DE
Inventors: Anne Karen KELSO; Roshan Bridge of Weir MAINI
Original assignee: Vascutek Ltd
Current assignee: Vascutek Ltd
Priority date: 2001-07-11
Filing date: 2002-07-08
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: US20040115237A1; CA2444089A1; JP2004533904A; EP1349539A1; ATE279177T1; WO2003005990A1; DE60201573D1; GB0116920D0; EP1349539B1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges und verbessertes Abgabesystem und ein Verfahren für die Zubereitung von diesem bereit.
Gefäßtransplantate sind aufgrund von Komplikationen oft nicht erfolgreich. Insbesondere Restenose, die zu Intima-Hyperplasie (IH) führt, ist für ihren Beitrag zum frühzeitigen Transplantatversagen bekannt. Restenose tritt aufgrund der Migration von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) von der Mediaschicht zu der Intimaschicht auf, wo sich die Zellen vermehren und extrazelluläre Matrix überproduzieren. Durch Restenose betroffene Blutgefäße werden aufgrund des unkontrollierten Wachstums von glatten Muskelzellen (SMC) mit Ablagerung von extrazellulärer Matrix eingeschnürt oder verengt.
Intima-Hyperplasie schließt die abnormale Migration und Vermehrung van glatten Media-Muskelzellen zu der Intimaschicht ein, wodurch ein Verengen des Gefäßlumens verursacht wird, was zu Thrombose führen kann. Wenn ein beliebiger Teil der Endothelschicht eines Gefäßes freigelegt wird, wird Plättchenaktivierung eingeleitet, was die Freigabe von Thrombozytenwachstumsfaktoren (PDGF) verursacht.
Die Migration und Vermehrung von glatten Muskelzellen wird als Reaktion auf eine Verletzung durch das Binden von SMCs an hochregulierte Rezeptoren mit hoher Affinität induziert. VSMC spielen eine beitragende Rolle bei der Intima-Hyperplasie. Wachstumsfaktoren und Mitogene aus der Abtragung der Endothelschicht verursachen die Aktivierung von glatten Media-Gefäßmuskelzellen (VSMC), und die Migration von VSMC von Media- zu Intimaschichten, wobei das genetische Erscheinungsbild von kontraktiler zu Synthesefunktion verändert wird. Eine große Menge an extrazellulärer Matrix wird erzeugt, um Unterstützung für die erhöhte Anzahl an Zellen bereitzustellen. VSMC werden folglich in der Intimaschicht vermehrt. Leukozyten tragen ebenfalls zur Intima-Hyperplasie bei. Gefäßpermeabilität und Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen werden erhöht, wodurch erhöhte Adhäsion von Leukozyten an Gefäßwänden und erhöhte Infiltration des Gewebes durch die Leukozyten verursacht werden. Leukozyten geben Entzündungsmediatoren frei, wodurch mehr Leukozyten an die Verletzungsstelle angezogen werden. Die Verletzung wird folglich durch das Degenerieren von Schlüsselkomponenten der extrazellulären Matrix perpetuiert.
Es besteht klar Bedarf an einem Mittel, um die oben beschriebenen Komplikationen zu kontrollieren. Dexamethason (Dex) ist ein synthetisches Glucocorticoid, das bei der Modulierung und Unterdrückung der Immunfunktion wichtig ist. Aspirin (Acetylsalicylsäure) wird üblicherweise bei der Antithrombozyten-Therapie verwendet, um Transplantatthrombose zu verhindern und die Entwicklung von Intima-Hyperplasie zu unterdrücken. Trinitroglycerin (GTN) ist ein organisches Nitrat, das ein Muskelrelaxans für glatte Gefäßmuskeln ist. Es wird üblicherweise verwendet, um mit Thrombolyse induzierter Plättchenaktivierung verbundenen koronaren Vasospasmus zu verhindern.
Die kontrollierte Freigabe eines Wirkstoffs über einen anhaltenden Zeitraum kann unter Verwendung einer Polymer/Wirkstoff-Zusammensetzung erzielt werden. Im Allgemeinen wird ein Polymer mit dem gewählten Wirkstoff verbunden, und die kontrollierte Freigabe des Wirkstoffs erfolgt aufgrund der langsamen Freigabe des Wirkstoffs von einem biostabilen Polymer oder des biologischen Abbaus eines biologisch abbaubaren Polymers. Der Wirkstoff wird gewöhnlicherweise ein Pharmazeutikum sein, andere Wirkstoffe können jedoch ebenfalls für nicht medizinische Anwendungen in Erwägung gezogen werden. Derartige Zusammensetzungen hängen von der engen Beimischung der Bestandteile ab, wobei der Wirkstoff gleichmäßig in dem ganzen Polymer dispergiert wird, um sicherzustellen, dass die Freigaberate des Wirkstoffs einheitlich bleibt. Der Wirkstoff muss infolgedessen in einer Form vorliegen, die die gleichmäßige Dispersion in dem ganzen Polymer erzielen kann.
Ein besonderes Problem tritt auf, wenn es erwünscht wird, dass schlecht lösliche Wirkstoffe, zum Beispiel Aspirin, in eine Polymer/Wirkstoff-Zusammensetzung integriert werden. Es besteht eine Tendenz für derartige Wirkstoffe, eher in großen Klumpen zu kristallisieren (1b) zu kristallisieren als eine homogene Mischung zu erzielen (1a).
Während der Wirkstoff einfach in ein vorausgehärtetes Polymer geladen werden kann, ist der Grad an erzielbarer kontrollierter Freigabe oft begrenzt, da die Menge an Wirkstoff, die zur Freigabe verfügbar ist, von der erzielten Ladung abhängt.
Ultraschall ist bekannt dafür, dass es zum Zusammenmischen von Komponenten nützlich ist, besonders zum Herstellen von homogenen Suspensionen. Ultraschallbehandlung ist bei der Herstellung von Arzneimittelkompositionen eingesetzt worden, im Allgemeinen bei der Herstellung von Arzneimittel/Phospholipid-Komplexverbindungen.
Folglich beschreibt EP-A-0,161,445 die Verwendung von Ultraschall bei der Bildung eines wasserunlöslichen Arzneimittel/Phospholipid-Liposoms, wobei das Liposom selbst den Vorteil aufweist, dass es wasserlöslich ist.
GB 937,303 beschreibt ebenfalls die Verwendung von Ultraschall bei der Zubereitung einer homogenen Suspension eines Medikaments in der Form eines sehr feinen Pulvers. Das Pulver wird durch Ausfällung des Medikaments hergestellt und Ultraschall wird während der Ausfällung eingesetzt, um sicherzustellen, dass die so gebildeten Partikel sehr fein sind.
Keine der obigen Veröffentlichungen bezieht sich auf eine Polymer/Wirkstoff-Zusammensetzung.
In US 4,898,734 sind Mikrokapseln oder Mikrokügelchen, die ein Medikament oder einen anderen Wirkstoff enthalten, in einem Polymer eingebettet. Die Kügelchen sind homogen in dem Polymer dispergiert und sind gezwungen, ihren Inhalt freizugeben, wenn sie Temperatur, Licht oder Ultraschall ausgesetzt werden.
In WO-A-00/69942 wird ein(e) aus einem hydrophoben/hydrophilen Blockpolymer gebildete(s) Micelle oder Liposom beschrieben. Die Micelle weist einen stabilisierten Kern auf, und Arzneimittel können in den stabilen inneren Kern der Micellen inkorporiert werden. Wenn die Arzneimittel Ultraschall unterzogen werden, werden sie aus dem Kern freigegeben, aber dies ist reversibel, so dass, wenn der Ultraschall abgeschaltet wird, die verbleibenden Arzneimittel erneut eingekapselt werden. Durch das Pulsieren des Ultraschalls kann eine kontrollierbare Freigabe der Arzneimittel erzielt werden.
In beiden der obigen Veröffentlichungen wird Ultraschall verwendet, um die Freigabe der Wirksubstanz zu erzielen.
US 5,620,697 beschreibt ein Verfahren zur Zubereitung von pharmazeutischen Kompositionen unter Verwendung von Ultraschall.
Eine biologisch abbaubare Polymermatrix und mindestens ein Pharmazeutikum, das in die Matrix gemischt oder in ihr aufgelöst wird, werden Ultraschall unterzogen, so dass das Gemisch aus Polymer und pharmazeutischer Substanz zumindest teilweise geschmolzen ist. Ultraschall wird folglich verwendet, um das Arzneimittelabgabesystem weich zu machen und zu gestalten.
Wir haben nun herausgefunden, dass Ultraschall in einem effizienteren Vorgang verwendet werden kann, um die gleichmäßige Dispersion eines Wirkstoffs in einem Polymer zu fördern, selbst wenn der Wirkstoff schlecht löslich ist und eine Tendenz aufweist, zu kristallisieren, wenn er dem Polymer ausgesetzt wird. Ferner haben wir herausgefunden, dass Ultraschall verwendet werden kann, um das Laden eines vorausgehärteten Polymers mit einem Wirkstoff zu fördern, und ebenfalls, um das Aufnehmen des Wirkstoffs in das ausgehärtete Polymer zu fördern.
Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein Verfahren zum Herstellen einer biokompatiblen Zusammensetzung bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Verbindens eines Polymers und eines Wirkstoffs beinhaltet, wobei Ultraschall mit einer Frequenz von 20 bis 90 kHz während des Verbindens des Polymers und des Wirkstoffs verwendet wird.
Wünschenswerterweise wird die Polymer/Wirkstoff-Verbindung Ultraschall für eine Zeit lang ausgesetzt, die ausreichend ist, um sicherzustellen, dass eine gleichmäßige Verteilung von Wirkstoff in der ganzen Polymermatrix erzielt wird.
In einer Ausführungsform liegt das Polymer in Lösung oder Suspension vor, und die Aushärtung des Polymers folgt auf die Verbindung mit dem Wirkstoff und den Ultraschallbehandlungsschritt (2b).
In einer alternativen Ausführungsform wird das Polymer ausgehärtet, bevor es dem Wirkstoff und dem Ultraschallbehandlungsschritt ausgesetzt wird (1a).
Die gemäß dem obigen Verfahren hergestellte Zusammensetzung bildet einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Wie oben erwähnt ist die vorliegende Erfindung insbesondere für schlecht lösliche Wirkstoffe wie beispielsweise Aspirin (Acetylsalicylat) von Nutzen, die eine Tendenz dazu zeigen, auf dem Polymer zu kristallieren. Versuche, in Chloroform gelöstes Aspirin durch Rühren mit einer Silikonpolymerlösung zu verbinden, führten nur zu großen körnigen Klumpen Aspirin, die sich auf dem ausgehärteten Polymer bilden (siehe 2a). Alternative Versuche, bei denen das Polymer ausgehärtet und dann in die gerührte Aspirinlösung getaucht worden war, führten dazu, dass kein Eindringen in das Polymer durch das Aspirin erzielt wurde, stattdessen kristallisierte Aspirin auf der Oberfläche des Polymers (siehe 3).
Die Polymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können jedes pharmazeutisch akzeptable Polymer sein. Das Polymer kann biostabil sein oder biologisch abbaubar sein. Beispielhafte Polymere umfassen (sind aber nicht begrenzt auf) Silikone, auf Silikon basierende Polymere (zum Beispiel Fluorsilikon), Polyester, Polyurethane, Polyorthoester und Poly-α-hydroxysäuren wie beispielsweise Polyglycolid (PGA), Polylactide (PLA), Polyhydroxybutyrat (PHB) und Copolymere davon (zum Beispiel PHB/Polyhydroxyvalerat-Copolymer). Silikon, Fluorsilikon und Polyurethan werden bevorzugt.
Der Wirkstoff kann jeder Wirkstoff sein, der mit Ultraschallverarbeitung kompatibel ist. Beispiele umfassen Antibiotika, Polypeptide und Steroidhormone wie beispielsweise Dexamethason. Antithrombozyten-, antiproliferative und antimikrobielle Mittel sind ebenfalls geeignet. Die Erfindung ist von besonderem Nutzen für schlecht lösliche Wirkstoffe, die anderweitig eine Tendenz aufweisen würden, Kristalle zu bilden. Aspirin ist ein besonders bevorzugter Wirkstoff, aber andere Wirkstoffe von Wichtigkeit umfassen NO-Donatoren, wie etwa Trinitroglycerin. Für Aspirin ist ein beispielhafter Lösungsbereich 100 mg bis 500 mg in 10 ml Chloroform. Wir haben herausgefunden, dass das Lösungsmittel aus der Zusammensetzung verdampft und nicht darin zurückbehalten wird. Zwei oder mehrere Wirkstoffe können mit dem Polymer verbunden werden.
Die Frequenz des verwendeten Ultraschalls kann im Bereich von 20–90 kHz, zum Beispiel 30–50 kHz, besonders 40 kHz liegen.
In der vorliegenden Erfindung können der Wirkstoff und das Polymer beide in getrennten Lösungsmitteln aufgelöst oder in geeigneten flüssigen Trägermitteln dispergiert und dann miteinander verbunden werden. Ultraschall kann dann verwendet werden, um eine gleichmäßige Beimischung zu fördern, bevor das Polymer ausgehärtet wird. Wir haben herausgefunden, dass die Zusammensetzung einen schützenden Effekt auf den Wirkstoff zu haben scheint, der auf diese Weise inkorporiert wird. Spezifischerweise ist Polymeraushärtung bei Temperaturen von 120°C 45 Minuten lang für Aspirin akzeptabel gewesen, dessen Schmelzpunkt 118°C ist.
Die Lösung/Suspension des Wirkstoffs kann vor der Beimischung zu dem Polymer wahlweise Ultraschall unterzogen werden. Auf ähnliche Weise kann die Lösung/Suspension des Polymers vor der Beimischung zu dem Wirkstoff einer Ultraschallbehandlung unterzogen werden. Wir haben herausgefunden, dass derartige zusätzliche einleitende Ultraschallbehandlungsschritte das Endprodukt verbessern, und besonders gute Ergebnisse können erzielt werden, wenn sowohl der Wirkstoff als auch das Polymer separat mit Ultraschall behandelt, dann verbunden und die Beimischung nochmals mit Ultraschall behandelt wird.
Wenn das Polymer mit dem Wirkstoff in Lösung verbunden wird, das heißt vor dem Aushärten, ist es möglich, eine Beschichtung der Zusammensetzung auf einem Substrat zu bilden. Dies ist von besonderem Interesse, wenn das Substrat zur (temporären oder permanenten) Implantation in einen Patienten vorgesehen ist und der innerhalb der Zusammensetzung gehaltene Wirkstoff die Immunabwehr, Emboliebildung, Narbenbildung, Infizierung reduziert oder Heilung fördert. Das Substrat kann entweder während der Ultraschallbehandlung oder auf sie folgend einfach in die Beimischung aus Polymer und Wirkstoff getaucht werden. Das Substrat kann aus jedem beliebigen Material gebildet werden, das geeignet ist, um mit dem Polymer beschichtet zu werden. Das Substrat wird typischerweise ein thermoplastisches Elastomer sein, aber andere spezifische Beispiele umfassen Nitinol, Polyester und ePTFE.
Das beschichtete Substrat kann für jeden vorgesehenen Zweck verwendet werden, abhängig von dem in die Zusammensetzung inkorporierten Wirkstoff, aber Katheter, Stents, Emboliefilter und Herzklappensegel sollten erwähnt werden.
Alternativ kann das Polymer in der erforderlichen Form (zum Beispiel als eine Platte, typischerweise einige Millimeter dick) ausgehärtet werden und in eine Lösung oder Suspension des Wirkstoffs getaucht werden, die dann einer Ultraschallbehandlung unterzogen wird. Typischerweise ist eine Zeitskala von 30 Minuten bis 2 Stunden, zum Beispiel 1 Stunde, ausreichend, um das vollständige Laden eines 3 mm dicken Polymerfilms zu ermöglichen. Alternative Dicken von Polymerfolienbahnen oder alternative Polymerformen (zum Beispiel Rohre oder Stangen) können ebenfalls eingesetzt werden.
Überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass Ultraschall die Absorption des Wirkstoffes in die Spalten des ausgehärteten Polymers sowie das Erzielen einer gleichmäßigeren Beschichtung darauf fördert. Für gewisse Polymerarten haben wir herausgefunden, dass ein Erhitzungsschritt günstig ist, um das Arzneimittel innerhalb des Polymers zu halten. Wir haben zum Beispiel herausgefunden, dass wiederholte (z. B. 3 oder 4) kurze Zeiträume (z. B. von 10 Minuten) des Erhitzens auf eine Temperatur von 80 bis 110°C das Halten von Aspirin in Silikon- und Fluorsilikonpolymeren unterstützt, aber nicht für Polyurethanpolymere erforderlich ist.
Bei zusammengesetzten Polymeren der Art, wie sie hier von Interesse ist, führt das Inkorporieren des Wirkstoffs zu einer Reduktion der Zugfestigkeit des Polymers. Das hohe Laden von Wirkstoff (entweder durch Verwendung einer konzentrierten Lösung oder eines langen Zeitraums von Inkorporierung in der Anwesenheit von Ultraschall) können zu unakzeptabel niedrigen Zugfestigkeitscharakteristiken führen. Die homogenere Verteilung des Wirkstoffs in der vorliegenden Erfindung reduziert jedoch das Auftreten von Bereichen in der Zusammensetzung, in denen der Zugspannungsbruch aufgrund der Anwesenheit von großen Ablagerungen von Wirkstoffen an einer einzelnen Stelle wahrscheinlich ist.
Zusammenfassend ermöglicht die Verwendung von Ultraschall wie oben beschrieben eine homogene Verteilung des Wirkstoffs innerhalb des Polymers und erzielt eine minimale Partikelgröße für den Wirkstoff. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung minimiert die erforderlichen Zubereitungszeiten und ist sowohl für das Laden des Polymers vor der Aushärtung- als auch für Laden des Polymers nach dem Aushärten nützlich.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung bereitgestellt, die aus dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist, und ein Polymer und einen Wirkstoff beinhaltet, wobei der Wirkstoff gleichmäßig in dem Polymer dispergiert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gefäßtransplantat bereitgestellt, das eine Zusammensetzung wie oben beschrieben beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die Beispiele und Figuren weiter beschrieben, in denen:
1 einen Querschnitt durch eine Silikonplatte zeigt, die mit Acetylsalicylat (Aspirin) unter Verwendung von Ultraschall (a) und ohne Ultraschall (b) nachgeladen wurde.
2 zeigt eine Silikonplatte, die mit Acetylsalicylat (Aspirin) ohne Ultraschall (a) und mit Ultraschall (b) vorgeladen wurde.
3 zeigt ein vergrößertes Bild einer ausgehärteten Silikonplatte, die eine Stunde lang in Aspirinlösung eingeweicht wurde. Aspirin hat in der Abwesenheit von Ultraschall charakteristische Kristallstrukturen auf und in dem Silikon gebildet. Die Aspirinverteilung ist höchst unorganisiert mit nicht einheitlicher Topographie.
4 zeigt ein vergrößertes Bild einer ausgehärteten Silikonplatte, die mit Aspirin nachgeladen ist. Die ausgehärtete Platte wurde eine Stunde lang in Aspirinlösung eingeweicht und Ultraschallbehandlung unterzogen.
Keine Kristallstrukturen sind sichtbar, die Aspirinverteilung ist höchst organisiert und einheitlich mit minimaler Partikelgrößenverteilung.
5a und b zeigen Bilder, die mit einem Lichtmikroskop von einer Silikonplatte, die ohne Ultraschallbehandlung mit Aspirin nachgeladen wurde, gemacht wurden. Dunklere Flecken zeigen Bereiche des Nicht-Durchdringens von Aspirin in der Abwesenheit von Ultraschall.
6a und b zeigen Bilder, die mit einem Lichtmikroskop von einer Silikonplatte, die mit Ultraschall mit Aspirin nachgeladen wurde, gemacht wurden. Keine dunklen Flecken oder Bereiche des Nicht-Durchdringens von Aspirin sind ersichtlich. Es besteht eine einheitliche Verteilung.
7 zeigt die durchschnittliche Anzahl an Plättchen pro Quadratmillimeter an Stents, die mit verschiedenen Beschichtungen beschichtet sind.
8 zeigt die Mengen an Aspirin in eluierten Fluorsilikon-Filmen. Die verschiedenen Filme wurden für verschiedene Mengen an Zeit eluiert.
9 vergleicht den Grad an Aspirin und die durchschnittliche Anzahl an Plättchen auf Fluorsilikon- und Aspirinfilmen. Die unterschiedlichen Filme wurden für unterschiedliche Mengen an Zeit eluiert.
10 zeigt eine Querschnittsteilansicht eines Blutgefäßes, wobei Schicht A die Tunicaschicht zeigt, die aus Bindegewebe zusammengestellt ist, Schicht B die Mediaschicht zeigt, die aus glatten Muskelzellen zusammengestellt ist und Schicht C die Intimaschicht zeigt, die aus Endothelzellen zusammengestellt ist.
11 zeigt die Ergebnisse eines MTT-Tests, der die Konzentration von Aspirin, Dexamethason und einer Verbindung aus Aspirin und Dexamethason auf einer geimpften Loch-Platte als eine Funktion eines Prozentsatzes des Kontrolldurchschnitts zeigt, wobei die Kontrolle Ethanol ist.
12 zeigt die Ergebnisse eines Neutralrot-Tests (NRA), der die Konzentrationen von Aspirin, Dexamethason und einer Verbindung aus Aspirin und Dexamethason auf einer geimpften Loch-Platte als eine Funktion eines Prozentsatzes des Kontrolldurchschnitts zeigt, wobei die Kontrolle Ethanol ist.
13 zeigt die Ergebnisse eines Neutralrot-Tests (NRA), der die Konzentration von Aspirin, GTN und einer Verbindung aus Aspirin und GTN auf einer geimpften Loch-Platte als eine Funktion eines Prozentsatzes des Kontrolldurchschnitts zeigt, wobei die Kontrolle F12-K ist.
14 zeigt die Ergebnisse eines MTT-Tests, der die Konzentration von Aspirin, GTN und einer Verbindung aus Aspirin und GTN auf einer geimpften Loch-Platte als eine Funktion eines Prozentsatzes des Kontrolldurchschnitts zeigt, wobei die Kontrolle F12-K ist.
15 zeigt die Bilder vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) von Zellproben (FFC-Knochenzellen). Während 15a das CLSM-Bild einer positiven Kontrolle zeigt, die einen primären und einen sekundären Antikörper enthält, zeigt 15b das CLSM-Bild einer negativen Kontrolle, die einen sekundären Antikörper enthält, und 15c zeigt das CLSM-Bild einer Kontrollkontrolle, das keinen primären oder sekundären Antikörper enthält. Die Fluoreszenz der Proben gleicht der Kollagenherstellung in FFCs (Knochenzellen).
16 zeigt die Bilder vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) von Proben nach der Fixierung und dem Anfärben mit Acridinorange, wobei 16a das CLSM-Bild eines Kontrollglass-Deckglases zeigt, das rote Fluoreszenz zeigt, 16b das CLSM-Bild einer Kontrollkunststoffpetrischale zeigt, die grüne Fluoreszenz zeigt, 16c das CLSM-Bild einer mit F1Si + GTN beschichteten Membran zeigt, die grüne Fluoreszenz zeigt, und 16d das CLSM-Bild einer mit F1Si beschichteten Membran zeigt, die rote Fluoreszenz zeigt. Grüne Floreszenz gibt das Binden von Acridinorange an DNA an und rote Fluoreszenz gibt das Binden von Acridinorange an RNA auf einem Deckglas aus Glas an.
17 zeigt die Bilder vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) der F1Si-Membran auf einem Deckglas aus Glas nach der Fixierung und dem Anfärben mit Acridinorange, wobei 17a Zellen auf der Oberfläche der Membran mit roter Fluoreszenz zeigt, 17b Zellen auf dem Deckglas aus Glas an der Kante der Membran mit roter Fluoreszenz zeigt, 17c Zellen auf dem Deckglas aus Glas mit einer Anhaftung an der Membran zeigt und grüne Fluoreszenz zeigt.
18 zeigt die Bilder vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) von Studien zur Lebensfähigkeit, wobei 18a ein Bild vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) von Zellen auf einer Kontrollkunststoffpetrischale nach der Fixierung und dem Anfärben mit Acridinorange zeigt. Das Bild zeigt grüne Fluoreszenz, 18b zeigt ein Bild vom Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSM) von Zellen auf einem Kontrollglas-Deckglas. Dieses Bild zeigt grüne Fluoreszenz. 18c zeigt Zellen auf einer nur mit F1Si beschichteten Membran. Dieses Bild zeigt grüne Fluoreszenz. 18d zeigt Zellen auf einer F1Si + GTN beschichteten Membran.
19 zeigt die Effekte von Stentbeschichtung auf die Thrombusbildung.
BEISPIELE 1 BIS 3: VORAUSHÄRTUNGSLADEN VON ACETYLSALICYLSÄURE
Beispiel 1
20 ml Fluorsilikondispersion in 80 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
1 g Acetylsalicylsäure in 2 ml Dimethylacetamid auflösen. Unverzüglich 60 Minuten lang in einem Ultraschallbad platzieren.
Die Acetylsalicylsäurelösung zu 80 ml Fluorsilikondispersion zugeben. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
Beispiel 2
20 ml Fluorsilikondispersion in 60 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
1 g Acetylsalicylsäure in 2 ml Dimethylacetamid auflösen. Unverzüglich 60 Minuten lang in einem Ultraschallbad platzieren.
Die Acetylsalicylsäurelösung zu 80 ml Fluorsilikondispersion zugeben. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
Beispiel 3
30 ml Fluorsilikondispersion in 60 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
1 g Acetylsalicylsäure in 2 ml Dimethylacetamid auflösen. Unverzüglich 60 Minuten lang in einem Ultraschallbad platzieren.
Die Acetylsalicylsäurelösung zu 80 ml Fluorsilikondispersion zugeben. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen.
Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
Die obigen Beispiele wurden wiederholt, wobei Silikon und Polyurethan als Polymer verwendet wurden.
BEISPIELE 4 BIS 8: NACHAUSHÄRTUNGSSLADEN VON ACETYLSALICYLSÄURE
Beispiel 4
500 mg Acetylsalicylsäure in 10 ml Chloroform auflösen. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Gereinigtes Silikonblech in der Chloroformlösung platzieren. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Silikonblech entfernen und 1 Stunde lang auf einem 3D-Hochgeschwindigkeitsgrill trocknen.
Trockenes Silikonblech in einem Ofen bei 115 bis 120°C 10 Minuten lang platzieren, entfernen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang weitere 3 Male wiederholen.
Beispiel 5
500 mg Acetylsalicylsäure in 10 ml Chloroform auflösen. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Gereinigtes Silikonblech in der Chloroformlösung platzieren. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Silikonblech entfernen und 1 Stunde lang auf einem 3D-Hochgeschwindigkeitsgrill trocknen.
Trockenes Silikonblech in einem Ofen bei 115 bis 120°C 10 Minuten lang platzieren, entfernen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang weitere 2 Male wiederholen.
Beispiel 6
20 ml Fluorsilikondispersion in 80 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
500 mg Acetylsalicylsäure in 10 ml Chloroform auflösen. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Ausgehärtetes Fluorsilikon in der Chloroformlösung platzieren. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Fluorsilikon entfernen und 1 Stunde lang auf einem 3D-Hochgeschwindigkeitsgrill trocknen.
Fluorsilikon in einem Ofen bei 115 bis 120°C 10 Minuten lang platzieren, entfernen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang weitere 3 Male wiederholen.
Beispiel 7
20 ml Fluorsilikondispersion in 60 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
500 mg Acetylsalicylsäure in 10 ml Chloroform auflösen. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Ausgehärtetes Fluorsilikon in der Chloroformlösung platzieren. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Fluorsilikon entfernen und 1 Stunde lang auf einem 3D-Hochgeschwindigkeitsgrill trocknen.
Fluorsilikon in einem Ofen bei 115 bis 120°C 10 Minuten lang platzieren, entfernen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang weitere 3 Male wiederholen.
Beispiel 8
30 ml Fluorsilikondispersion in 60 ml Perchlorethylen : Butylacetat (95 : 5% Volumenverhältnis) auflösen. Auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min 50°C 1 Stunde lang platzieren. Entfernen und in einem Ultraschallbad 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Filme der Fluorsilikondispersion auf Objektträger aus Glas gießen. 1 Stunde lang trocknen. 45 Minuten lang bei 120°C aushärten.
500 mg Acetylsalicylsäure in 10 ml Chloroform auflösen. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Ausgehärtetes Fluorsilikon in der Chloroformlösung platzieren. 60 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Fluorsilikon entfernen und 1 Stunde lang auf einem 3D-Hochgeschwindigkeitsgrill trocknen.
Fluorsilikon in einem Ofen bei 115 bis 120°C 10 Minuten lang platzieren, entfernen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang weitere 3 Male wiederholen.
Die obigen Beispiele wurden unter Verwendung von Polyurethanfilm wiederholt.
BEISPIEL 9: KONTROLLIERTE FREIGABE
Eine 50 μm Aspirinschicht wurde in ein Fluorsilikonpolymer unter Verwendung der wie in Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Methodik inkorporiert. Die ausgehärtete Zusammensetzung wurde kontinuierlicher Wäsche mit phosphatgepufferter Salzlösung unterzogen. Nach 5 Monaten Waschen war der Antithrombozyten-Effekt von Aspirin immer noch offensichtlich (Aspirin wurde immer noch auf kontrollierte Weise von der Zusammensetzung freigegeben).
BEISPIELE 10 UND 11: VERGLEICH VON SMC-WACHSTUM INHIBITION NACH DEM AUSSETZEN GEGENÜBER DEX, ASPIRIN UND GTN
Beispiel 10
Die menschliche aortische Gefäß-SMC-Zelllinie wurde untersucht. 96-Loch-Platten wurden beimpft und mindestens einen Tag lang inkubiert. Nährboden von der Platte wurde entfernt und durch Nährboden ersetzt, der variierende Konzentrationen von Arzneimitteln enthielt, wobei die Arzneimittel Dex, Aspirin, GTN oder eine Verbindung dieser Arzneimittel waren. Die Effekte der Arzneimittel wurden nach 72 Stunden mit den folgenden zwei Lebensfähigkeitsprüfungen analysiert: MTT-Prüfung und Neutralrot-Prüfung. Absorbanzwerte wurden von einem Mikroplattenlesegerät gelesen.
MTT ist ein gelbes Tetrazoliumsalz, das in Zellen aufgenommen wird. In lebensfähigen Zellen wurde das Salz im Zytosol oder in den Mitochondrien reduziert, um blaues Formazansalz zu bilden. Das Formazanprodukt war sehr unlöslich und wurde in Dimethylsulfoxid aufgelöst, bevor seine Absorbanz berechnet wurde. In nicht lebensfähigen Zellen erfolgte keine Reaktion, und die Zellen blieben gelb.
Die Neutralrot-Prüfung schloss das Zugeben von Neutralrot-Lösung, einem roten Farbstoff für Zellen, ein. In lebensfähigen Zellen färbte der Farbstoff Lysosomen. Die Zellen wurden drei Stunden lang mit Neutralrot-Lösung inkubiert (um es dem Farbstoff zu ermöglichen, in Zellen einzudringen), eine Neutralrot-Entfärbelösung wurde dann zugegeben, um den Farbstoff zu entfernen. Die Intensität der roten Farbe entsprach der Anzahl der lebensfähigen Zellen.
Sterile Deckgläser wurden in den Löchern einer 24-Loch-Platte platziert. FFCs (Knochenzellen) wurden in die Löcher bei einer Animpfdichte von 5 × 10³ Zellen geimpft. Die Schlüsselkomponente des extrazellulären Gerüsts von arteriellen Medien war Collagen. Collagenherstellung wurde mit spezifischen Antikörpern untersucht, die mit fluoreszierenden Marken gekennzeichnet waren. Die Proben wurden unter dem Konfokalmikroskop mit Laser-Abtastung (CLSH) untersucht. Zellen weisen körpereigenes Biotin auf. Wenn die Zellen Collagen hergestellt haben, umgeben Fasernetzwerke die Zellen. Sobald die Zellen konfluent waren, wurde Avidin zugegeben, um das körpereigene Biotin abzublocken. Avidin und Biotin haben eine sehr hohe Affinität zueinander. Zellen wurden mit Formalin fixiert, um weiteren Metabolismus zu stoppen. Casein wurde zugegeben, um das nicht spezifische Binden des Proteins abzublocken. (Proteine sind auf natürliche Weise „klebrig" und binden sich an Deckgläser und Kunststoff. Durch das Binden an Casein wurden Antikörper daran gehindert, sich an diese Bereiche zu binden). Ein Anti-Collagen-Biotin-Antikörper (primärer Antikörper) wurde zu positiven Kontrolllöchern zugegeben und auf spezifische Weise an das hergestellte Collagen gebunden. Schließlich wurde das Avidin-FITC (sekundärer Antikörper) zu den positiven und negativen Kontrolllöchern zugegeben. Weder der primäre noch der sekundäre Antikörper wurden zu den Kontrollkontroll-Löchern zugegeben. Isothiocyanat (FITC) bindet sich an das Biotin, das sich auf dem Antikörper befand. FITC fluoresziert und so war das gebundene FITC identifizierbar. Unter dem CLSH gab es Fluoreszenz auf den positiven Kontrolldeckgläsern, wenn Collagen hergestellt wurde, und ein gewisses Maß an Autofluoreszenz auf den negativen und den Kontrolldeckgläsern aufgrund von nicht spezifischem Binden.
Es gab immer noch etwas helle Fluoreszenz in der negativen Kontrolle, wenn sie den Kontrollergebnissen hätte ähnlich sein sollen (siehe 15). Es wurde folglich angenommen, dass immer noch ein gewisser Grad an nicht spezifischem Binden vorlag. Das Experiment wurde unter Verwendung eines alternativen blockierenden Mittels Rinderserumalbumin (RSA) anstelle von Casein wiederholt.
Beispiel 11
Das Verfahren aus Beispiel 10 wurde unter Verwendung von RSA als blockierendem Mittel anstelle von Casein wiederholt.
HA-VSCMs wurden auf Film-Membranen auf Silikonbasis, geliefert von Vascutek, gezüchtet. 2 Membranarten wurden getestet: eine unbeschichtete FISi-Membran und eine mit GTN beschichtete FISi-Membran. Zellen wurden mit einer Animpfdichte von 5 × 10³ beimpft. Zellen wurden eine Woche lang gezüchtet und der Nährboden wurde alle zwei Tage gewechselt. Es wurde herausgefunden, dass es aufgrund der Hydrophobie der Filme, die bedeutete, dass die Filme auf dem Nährboden trieben, schwierig war sicherzustellen, dass die Zellen an den Filmen anhafteten. Dieses Problem wurde bewältigt, indem die Deckgläser mit doppelseitigem Klebeband an die Platte geklebt wurden, bevor die Löcher beimpft wurden. Des Weiteren wurden die Zellen während des Anfärbens weggespült, oder die Zellen wurden zu lange geschont. Manche Zellen wurden durch das Einführen eines sanften Waschschritts geschont. Am siebten Tag wurden die Deckgläser angefärbt und unter dem CLSM zu Studien zur Lebensfähigkeit betrachtet.
Die Folgenden wurden als Anfärbungen zur Lebensfähigkeit verwendet: CFDA (Carboxyfluorescein Diacetat) ist eine Vitalfärbung, die in Zellmembranen eindringt. Lebensfähige Zellen enthalten Esterase-Enzyme, die Diacetat aus dem Molekül entfernen, wodurch CF gebildet wird, das fluoreszent ist. Sobald CF gebildet ist, akkumuliert es in der Membran, und lebensfähige Zellen fluoreszieren hell grün.
Ethidiumbromid: ist ein Vitalfarbstoff, der nur durch die beeinträchtigte Membran von toten Zellen passieren kann und sie rot anfärben kann.
Acridinorange: ist ein Farbstoff, der mit DNA und RNA durch Interkalation oder elektrostatische Anziehung interkaliert. Dieser kationische Farbstoff weist grüne Fluoreszenz auf, wenn er an DNA gebunden ist, und rote, wenn er an RNA gebunden ist.
Zellen wuchsen besser in Deckgläsern aus Glas als in denen aus Kunststoff (siehe 16a und b). Morphologisch gesehen sahen Zellen in beiden Kontrollen gesund aus. In den FISi + GTN-Membranen wuchsen Zellen ziemlich gut (siehe 16c). Nur tote Zellen und Zellüberreste waren in den Nur-FISi-Membranen sichtbar (siehe 16d). Auf der GTN + FISi-Membran gab es intensives rotes Anfärben im Zytoplasma und grünes andernorts. Zellen bevorzugten das Wachsen auf der unbeschichteten Kante der Membranen und waren auf den Membranen zerstreut und zusammengezogen (siehe 17).
Hohe Dosierungen an Dex und Aspirin scheinen eine vorteilhafte Rolle bei der Behandlung von proliferativen Gefäß-Störungen zu spielen. GTN scheint VSM-Relaxation zu fördern und kann als ein interaktiver Endothelium-Vasodilatator betrachtet werden. GTN verringert jedoch im Vergleich zu Nur-FISi-Film-Membranen Zellwachstum nicht signifikant.

Claims

Ein Verfahren zum Herstellen einer biokompatiblen Zusammensetzung, wobei das Verfahren den Schritt des Verbindens eines Polymers und eines Wirkstoffs in Lösungsform beinhaltet, wobei Ultraschall mit einer Frequenz von 20 bis 90 kHz in einem Ultraschallschritt während des Verbindens des Polymers und des Wirkstoffs verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Polymer/Wirkstoff-Verbindung Ultraschall für eine Zeit lang ausgesetzt wird, die ausreichend ist, um eine gleichmäßige Verteilung von Wirkstoff in der ganzen Zusammensetzung zu erzielen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer ausgehärtet wird, bevor es dem Wirkstoff und dem Ultraschallschritt ausgesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Ultraschallschritt vor dem Aushärten des Polymers stattfindet.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff und das Polymer vor dem Verbinden und nach dem Verbinden Ultraschall unterzogen werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff in Wasser schlecht löslich ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff Aspirin, ein Antibiotikum, Polypeptid, Steroidhormon, Antithrombozyten-Mittel, antiproliferatives Mittel, antimikrobielles Mittel, ein NO-Donator oder eine Verbindung davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Wirkstoff Aspirin, Dexamethason oder Trinitroglycerin ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polymer ein Silikon, ein auf Silikon basierendes Polymer, Polyester, Polyurethan, Polyorthoester, Poly-α-Hydroxysäure, Copolymere davon oder jede beliebige Verbindung davon ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polymer ein Fluorsilikon, Polyglycolid (PgA), Polylactid (PLA), Polyhydroxybutyrat (PHB) oder Copolymere davon ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Frequenz des verwendeten Ultraschalls 40 bis 90 kHz beträgt.
Eine Zusammensetzung, die aus dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 erhalten werden kann, die ein Polymer und einen Wirkstoff beinhaltet, wobei der Wirkstoff in dem Polymer gleichmäßig dispergiert ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Wirkstoff Aspirin ist.
Ein Gefäßtransplantat, das eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder 13 beinhaltet.