DE602004008453T2

DE602004008453T2 - Künstliches immunorgan

Info

Publication number: DE602004008453T2
Application number: DE602004008453T
Authority: DE
Inventors: Hikmat Bushnaq-Josting; Marco Riedel; Uwe Marx; Christoph Giese
Original assignee: ProBioGen AG
Current assignee: ProBioGen AG
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2024-05-20
Also published as: SI1625212T1; CA2526451C; EP1625212A1; EP1479760A1; CY1107018T1; ES2290714T3; DK1625212T3; DE602004008453D1; AU2004239014B2; EP1625212B1; JP4712709B2; CA2526451A1; WO2004101773A1; US20060194320A1; PT1625212E; AU2004239014A1; ATE371019T1; PL1625212T3; JP2007500511A

Description

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen für die getreue Modellierung von Organfunktionen in vitro.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Das Kultivieren von Säugetierprimärzellen ist aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit, relativ langsamer Proliferation, komplexer Differenzierungsprozesse und der absoluten Sterilität als eine Grundbedingung grundsätzlich kompliziert.
In den letzten Jahrzehnten wurden ex vivo Gewebekulturen eingehend beschrieben (Freshney). Kulturen mit hohen Zelldichten oder als gewebeähnliche Strukturen erfordern eine Trennung des Versorgungsvolumens und Kultivierungsraumes, z.B. durch semipermeable Membranen. Außerdem muss dieses Versorgungsprinzip wirksame Lösungen für die Sauerstoffversorgung und andere essentielle Nährstoffe realisieren. Dies wurde durch spezielle Membranen, Sauerstofftransporteure in Lösung usw. sichergestellt. Außerdem sollte es möglich sein, die Kultur mechanischen Spannungen auszusetzen, um in der Lage zu sein, spezifische physiologische Funktionen und Strukturen einzuführen (z.B. funktionale Knorpelbildung).
Bei den wirksamsten Bioreaktorsystemen konnte die Induktion von de novo Selbstorganisation in vitro in der wissenschaftlichen Literatur gezeigt werden (Leber, Knorpel, Knochen, Haut usw.).
Bei den beschriebenen Systemen sind die Zellen üblicherweise in sehr gut versorgten Zellkultivierungsräumen immobilisiert und können für die therapeutische Anwendung als Ganzes daraus entfernt oder transplantiert werden (z.B. eingekapselte Inselzellen). Bei komplexeren Systemen, wie Lebersubstitutionssystemen, kann auch die Co-Kultivierung unterschiedlicher Zell- und Gewebearten realisiert werden. Jedoch stellt gemäß der entsprechenden Anwendungen der beschriebenen Kultursysteme keines von ihnen die Möglichkeit der Sicherstellung der kontinuierlichen regulierbaren/dimensionierbaren Perfusion der immobilisierten Gewebe mit mindestens einer mobilen Gewebeart/Zellpopulation gleichzeitig zusätzlich zur de novo Organisation von Primärzell- und Gewebestrukturen in einem stationären (nicht beweglichen) immobilisierten Zustand bereit.
Insbesondere wird der Prozess der Selbstorganisation von gewebeähnlichen Strukturen durch Zellmigration, Zell-Zell-Interaktion, Aktivierung und Differenzierung aufgrund der lokalen Mikroumgebung induziert. Für die Bildung multizellulärer Interaktionen in langfristiger Kultur (z.B. einige Wochen) muss eine definierte Balance zwischen minimaler, aber ausreichender Versorgung mit Nährstoffen, Entnahme inhibitorischer Metaboliten und der maximalen Unterstützung intrinsischer lokaler Mikrogradienten realisiert werden. Zytokine und Wachstumsfaktoren sekretiert durch die immobile Zellphase müssen an Ort und Stelle gehalten werden, damit sie für die suspendierten oder migrierenden Zellen der mobilen Phase anziehend sind.
Die in vitro Immunisierung von menschlichen immunkompetenten Zellen stellt im Grunde die Simulation einer Organfunktion ex vivo dar und erhöht somit die Anforderungen an die Zellkultur auf ein noch höheres Niveau. Es stehen verschiedene Zellkultursysteme zur Verfügung. Zusätzlich zu herkömmlichen zweidimensionalen Systemen, bei denen die Zellen auf einer ebenen Fläche wachsen, meist am Boden des Kultivierungsgefäßes, gibt es auch dreidimensionale Systeme für die Zellkultivierung. Aufgrund der Möglichkeit des Zellwachstums selbst in die dritte Dimension bieten Letztgenannte eine gewebeähnliche Zellkultur, welche dadurch den natürlichen Bedingungen näher ist.
Geeignete Zell- und Gewebekultivierungssysteme sind in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
WO 99/43788 beschreibt ein in vitro Modellsystem für Virusinfektion und Immunreaktion, welches aus einem Gewebeblock aus Tonsille oder Lymphknoten aufgebracht auf einer flexiblen und porösen Matrix besteht, wobei der Gewebeblock in einem Medium kultiviert wird, dessen Oberfläche der Gewebeblock/Matrix-Schnittstelle entspricht. Das Kultursystem kann verwendet werden, um auf Antivirusarzneimittel zu untersuchen, den Verlauf von Viruserkrankungen zu überwachen und eine Immunreaktion auf Antigenstimulation zu überwachen.
WO 89/11529 beschreibt einen Bioreaktor, der aus zwei Kammern, einer Zuführkammer und einer Austragskammer, und einer Zellkammer getrennt durch eine selektiv permeable Ultrafiltrationsmembran besteht. Innerhalb der Zellkammer fängt eine biokompatible dreidimensionale Matrix die Tierzellen. Aufgrund der Gegenwart dieser biokompatiblen Matrix weist die Zellkammer eine Gelphase auf, d.h. die biokompatible Matrix und die Zellen und eine Flüssigphase enthalten eine konzentrierte Lösung des Zellproduktes, welches isoliert werden kann.
US-Patentschrift Nr. 5,416,022 beschreibt eine kompakte und leicht montierbare Zellkultivierungsvorrichtung, die mindestens einen Zellkultivierungsabschnitt aufweist, dessen Inneres den Zellkultivierungsraum darstellt.
WO 01/04262 betrifft einen Bioreaktor und ein Verfahren zum Kultivieren von organischem Material, insbesondere Zellen, unter Verwendung eines Nährstoffmediums. Das Kultivieren des organischen Materials erfolgt unter einem konstanten Fluss von Nährstoffen.
DE-C-4230194 und EP-A-0 590 341 beschreiben einen Reaktor für die Zellkultivierung, welcher von zwei einzelnen Hohlfaser-Membransystemen durchquert wird und in welchem die Kultivierung der Zellen auf dem Netz gebildet durch die Hohlfasern erfolgt. Der Reaktor wird unter der Bezeichnung „Tecnomouse^®" verkauft. Der Tecnomouse^®-Bioreaktor ist ein miniaturisierter Perfusionsbioreaktor, der dreidimensionale Zellkulturen mit kontinuierlicher Zirkulation von Medium und O₂-Versorgung ermöglicht. Fünf unterschiedliche, aufeinander angeordnete Hohlfasermodule können gleichzeitig darin eingesetzt werden. Die einzelnen Module werden jeweils durch die Grundvorrichtung mit Nährstoffmedium und einer Luft/CO₂-Mischung versorgt. Das Zuführen des Nährstoffmediums erfolgt durch einen Pumpkopf, der eine variable Zufuhr von Medium zwischen 15 und 150 ml/h mit fünf Segmenten ermöglicht. Für die Gaszufuhr wird Umgebungsluft mittels einer Membranpumpe vom Inkubator durch einen Gasturm in das entsprechende Hohlfasermodul geleitet. Durch Silikonmembranen, die das entsprechende Hohlfasermodul oben und unten abgrenzen, erreicht die Gasmischung direkt den Zellkultivierungsraum. Die parallel in engen Maschen angeordneten Hohlfasern bilden den Interkapillarraum, wodurch die Zufuhr von Nährstoffen und Entsorgung von Stoffwechselendprodukten sichergestellt ist. Die eingesetzten Cuprophan-Hohlfasermembranen erlauben den Durchlass von Molekülen bis zu einer Größe von 10 kDa. Im Extrakapillarraum, welcher die Hohlfasern umgibt, werden die Zellen kultiviert. Zwei Anschlüsse ermöglichen die Inokulation mit Zellen und Medien sowie die Zellernte. Das Volumen des Extrakapillarraumes eines Hohlfasermoduls beträgt etwa 4,3 ml. Der Tecnomouse^®-Reaktor wurde ursprünglich für die Herstellung monoklonaler Antikörper als ein alternatives Verfahren zu Tierversuchen aufgebaut. Die Entwicklung des sauberen Systembetriebs hinsichtlich der Kulturtechnologie und die Berechnung von Volumen- und Größenverhältnissen waren Gegenstand paralleler Studien, zusätzlich zu Studien für die Charakterisierung der Sauerstoffbeimischung (Maier und Nagel, Di plomarbeit TU Berlin 1993; Wiesmann et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41, 531-536 (1994)).
Schließlich beschreibt EP-B-0 584 170 einen Kultivierungsprozess und eine entsprechende Vorrichtung, in der Säugetierzellen gleichzeitig in mehreren separaten Kulturgefäßen in einem gemeinsamen Versorgungskreislauf kultiviert werden, wobei der Versorgungskreislauf durch eine die Zellen zurückhaltende Membran von den Kulturgefäßen getrennt ist.
US-Patentschrift Nr. 5,290,700 offenbart auch einen Reaktor, in dem mindestens zwei unterschiedliche Versorgungskreisläufe vorhanden sind.
Der Reaktor nach DE 3409501 und DE 4209501 weist zwei Kammern auf, eine Zellkultivierungskammer und eine Versorgungskammer, welche durch eine Membran getrennt sind. DE-A-4229334 beschreibt ein entsprechendes krugähnliches Kultivierungsgefäß mit zwei Kammern.
US-Patentschrift Nr. 4,242,460 offenbart eine Zellkultivierungsvorrichtung in einer Spiralform, in welcher der Versorgungskreislauf als eine semipermeable Spule um die Reaktorspule gewickelt ist. EP-A-0 365 313 beschreibt einen zylindrischen Bioreaktor, in dem die Versorgung durch mehrere Rohrsysteme sichergestellt ist.
US-Patentschrift Nr. 4,220,725 und 4,647,539 und DE 3805414 beschreiben einen Reaktor, der von einem Bündel semipermeabler Kapillaren durchquert wird.
WO 93/18133 beschreibt eine Vorrichtung für die Behandlung von Zellkulturen auf plattenartigen Antigenzellkulturträgern, welche mindestens teilweise gasdurchlässig sind und auf welche eine Kollagenbeschichtung mit der zu kultivierenden Zellkultur aufgetragen wird. DE-A-4,322,746 schlägt Hohlfasern als die entsprechenden Zellkulturträger vor.
EP 0690125 betrifft einen Prozess für die Induktion einer Kultur aus zytotoxischen T-Lymphozyten, welche abtötende Aktivitäten gegen Tumorzellen aufweisen, welcher den Schritt der Co-Kultivierung eines Tumorgewebes, welches die Tumorzelle und einen spezifischen Lymphozyten enthält, umfasst. Das Tumorgewebe kann immobilisiert sein.
US-Patentschrift Nr. 5,677,139 offenbart die Expansion hämatopoietischer T-Zellen. Die Expression erfolgt in gemeinsamer Kultur mit Stromazellen, welche als eine Monoschicht vorliegen können.
US-Patentschrift Nr. 6,479,064 betrifft einen Prozess zum Aufbauen eines künstlichen Organs unter Verwendung eines dreidimensionalen Gerüsts, welches mit einer Schicht eines Endothelgewebes bedeckt ist und mit einer zweiten Kulturzellpopulation in Kontakt gebracht wird.
US-Patentschrift Nr. 6,251,672 betrifft einen Prozess für das Kultivieren von Säugetierzellen, bei dem eine erste Säugetierzelle mit einer zweiten Säugetierzelle in Kontakt gebracht wird, welche auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Alle der oben genannten dreidimensionalen Kultivierungsverfahren und -vorrichtungen sind dem natürlichen System hinsichtlich der Wirksamkeit noch nicht angenähert. Insbesondere ein kontrolliertes Wachstum der Zellen und eine kontrollierte Versorgung des zu kultivierenden Zellmaterials mit regulatorischen Faktoren/Agenzien, insbesondere anderen Zellarten (zusätzlich zur kontinuierlichen Zufuhr von Nährstoffen), ist nicht sichergestellt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise wurde nun herausgefunden, dass das Kultivieren von Zellen/Gewebe in einer stationären Phase durch Kontakt mit einer mobilen Phase, welche Zellen einer unterschiedlichen Zellart enthält, essentiell für die Bildung funktionaler Gewebe und von höchster Bedeutung für bestimmte Gewebearten ist. Somit betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und/oder Gewebe, welche mindestens einen Kultivierungsraum (2), welcher eine Matrix (Matrizes) (8) enthält, die für das Einführen von Zellen und/oder Gewebe geeignet ist (sind), und mindestens zwei flüssigkeitszuführende Elemente (14, 16; 27, 38), um unterschiedliche Flüssigkeiten an den Raum (2) oder die Matrix (8) zu liefern, umfasst, wobei mindestens eine zellfreie Versorgungsflüssigkeit oder ein Versorgungsgas (4) und mindestens eine mobile Phase (6) zugeführt werden, wobei

(i) die mindestens eine mobile Zellphase (6) durch die Matrix (8) in quer verlaufender Flussrichtung hindurchfließt; und
(ii) die bevorzugt horizontale Matrix (8) in einer hohlen Kammer (20a, 20b) aufbewahrt ist, durch welche die mindestens eine mobile Zellphase (6) in quer verlaufender Flussrichtung fließt.

Die obige Vorrichtung ist geeignet für das Durchführen eines Verfahrens zum Kultivieren von Zellen und/oder Gewebe, welches den Schritt des Kultivierens von Zellen, die in einem oder mehreren Kultivierungsräumen immobilisiert sind, in Kontakt mit

(a) mindestens einer zellfreien Versorgungsflüssigkeit oder einer definierten Gasmischung und
(b) mindestens einer mobilen Phase, welche Zellen einer Zellart enthält, die sich von der der immobilisierten Zellen unterscheidet, umfasst.

Zellen und Gewebe können durch ein solches Verfahren erhalten werden.
Die Vorrichtung gemäß Erfindung ist unter anderem geeignet für den gut gerichteten Erhalt menschlicher Antikörper und menschlicher immunkompetenter Zellen gegen ausgewählte Antigene (Zielantigene).
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine erste Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
2 zeigt eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
3 und 4 zeigen eine Detailansicht bzw. eine Queransicht der Vorrichtung dargestellt in 2.
5 zeigt ein Diagramm von Oberflächenmarkern, die üblicherweise für die DC-Charakterisierung verwendet werden. Die Balken zeigen Teile von Zellen, die jeden Marker exprimieren, im Vergleich zu allen positiv auf CD45 getesteten Zellen, einen Pan-Leukozytenmarker vor
und nach (12 h; ☐) dem Differenzierungsprozess.
6 zeigt die Quantifizierung von Phagozytose durch Flusszytometrie. Leukozyten, z.B. DC, können durch Nukleineinfärbung von Bakterien unterschieden werden (PI auf FL-2, A), Zellen, die FITC-markierte Bakterien enthalten, können mittels einer Quadrantenstatistik quantifiziert werden (FL-1, B-D), Phagozytose kann durch Inkubation auf Eis von Adsorption unterschieden werden (C und D).
7 zeigt DC, welche ein dendritisches Netz bilden. T-Zellen kommen in engen Kontakt mit Dendriten und werden für die Proliferation aktiviert, T-Zellen migrieren zu DC-Dendriten (A), T-Zellen kommen in engen Kontakt mit DCs (Pfeil in B), T-Zellen beginnen in Kontakt mit DCs zu proliferieren (Pfeil in C), T-Zellen bilden schwebende Proliferationscluster (Pfeil in D).
8 ist ein Schema der Versorgungsleitungen für eine Vorrichtung der Erfindung.
9 zeigt eine dritte Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
10 zeigt eine vierte Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung steht „immobilisierte Zell- und Gewebekultur" für eine Kultur innerhalb der Vorrichtung, in welcher die Zellen durch Anhaften an Flächen oder durch andere mechanische oder physiologische Mechanismen innerhalb eines Abschnittes (Kultivierungsraum) der Vorrichtung gehalten werden.
„Mobile Zellphase" oder „mobile Phase enthaltende Zellen" steht für all diejenigen Zellen innerhalb der Vorrichtung, welche in einem bestimmten Zeitraum durch einen gerichteten physikalischen, biophysikalischen oder biochemischen Prozess, z.B. Flüssigkeitsströme, elektromagnetische Felder, gerichtete Drücke und Lockmittelgradienten, durch die Vorrichtung bewegt werden.
Eine „zellfreie Versorgungsflüssigkeit" betrifft jede Art von Kulturmedium, welches für die Kultivierung von Säugetierzellen geeignet ist. Geeignete Kulturmedien sind dem Fachmann bekannt. Eine „definierte Gasmischung" gemäß der Erfindung ist angepasst, um die Oxygenierung des Kulturvolumens von 80-100 % bei 37 °C sicherzustellen. Im Vergleich zur standardmäßigen Luftsättigung wird eine Gasmischung bereitgestellt, die 20-95 % O₂ (v/v) enthält. Im Falle eines carbonatgepufferten Kulturmediums muss eine Kohlendioxidkonzentra tion von 5 % (v/v) bereitgestellt werden, um einen stabilen pH bei 7.4 im Kulturvolumen sicherzustellen. Stickstoff wird bis zu 75 % (v/v) ergänzt.
Beim Verfahren durchgeführt mit der Vorrichtung gemäß der Erfindung wie oben beschrieben, wird eine Co-Kultur geeigneter Zellen, z.B. von primären menschlichen immunkompetenten Zellen, über einen Zeitraum von mehreren Monaten sichergestellt. Die Funktionalität innerhalb der Co-Kultur wird durch geeignete Zellpopulationen sichergestellt (Zellkomponenten; Zellsystem), welche mittels einer Trägermatrix in einen geeigneten Kultivierungsraum eingeführt werden. Ein kontinuierliches Versorgungssystem (wie das der Vorrichtung gemäß Ausführungsform (2) der Erfindung) soll konstante Kultivierungsbedingungen über den gesamten Kultivierungszeitraum hinweg sicherstellen. Die Zellpopulationen verwendeten Form-funktionale Einheiten durch Selbstorganisation innerhalb der Stützmatrix.
Die kultivierten Zellen und/oder Gewebe (im Folgenden auch kurz als „Zellsystem" bezeichnet) sind dadurch gekennzeichnet, dass darin Zellstrukturen und immunologische Funktionen nachgeahmt werden, welche denen der immunologisch aktiven Gewebe in Form der Keimzentren eines menschlichen Lymphknotens oder der menschlichen Milz entsprechen.
Die Bildung der Zellorganisation und Mikrostruktur eines Keimzentrums wird durch ein gerichtetes Zusammentreffen unterschiedlicher Zellarten sichergestellt. Zu den in vitro nachzuahmenden Funktionen zählen die gerichtete Antigen-induzierte Zellproliferation und Antikörperexpression und die Bildung eines nachhaltigen immunologischen Gedächtnisses.
Das korrekte Zusammentreffen von Antigen-präsentierenden, regulatorischen und schließlich Antikörper-exprimierenden Zellen ist notwendig für die selektive Erzeu gung einer Immunreaktion. Die ideale räumliche Verteilung immobilisierter Zellen und das optimale Mischungsverhältnis mobilisierter Zellen (z.B. DC, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten usw.) gemäß des Verfahrens durchgeführt mit der Vorrichtung der Erfindung stellt eine optimale Zell-Zell-Interaktion sicher.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden zuerst dendritische Zellen (DC, APC), die das Zielantigen präsentieren, in die Matrix eingeführt, welche für die Kultur vorbereitet und äquilibriert wurde, und die Kultur wird gestartet. Zusammen mit der Matrix stellen die anhaftenden DC eine sozusagen „stationäre" Phase im Kultursystem dar. Zu dieser stationären Phase werden T-Lymphozyten in geeigneter Weise zugegeben, welche in die Matrix infundiert werden, darin gerichtet migrieren, sich in einer Antigen-spezifischen Art und Weise mit den DC verbinden und so aktiviert (präpariert) werden. In einem anschließenden Schritt oder gleichzeitig werden B-Lymphozyten infundiert, welche sich wiederum mit dem Komplex Antigen-präsentierender DC und entsprechend aktivierten T-Zellen verbinden und auch in einer Antigen-spezifischen Art und Weise aktiviert werden.
Ausgehend von diesen Komplexen von APC und aktivierten T- und B-Lymphozyten werden Zellstrukturen gebildet, welche der in vivo Bildung eines Keimzentrums (GC) oder extrafollikulären Keimzentrums (efGC) entsprechen.
Die in vitro efGC und DC sind durch massive Zellproliferation sowie schließlich durch Antikörperexpression gekennzeichnet. Sie erhöhen somit die Zellmasse und -größe. Für die anfängliche Interaktion der APC mit den mobilen migrierenden Lymphozyten spielt die eingesetzte Matrix eine kritische Rolle: einerseits stellt sie die Zugänglichkeit der DC für die Lymphozyten sicher, und andererseits stabilisiert sie ein System von Mikrogradienten sekretorischer Boten (Zytokine) in der unmit telbaren Umgebung der Zelle, was von höchster Bedeutung für die Zell-Zell-Interaktion ist. Außerdem wird die umgebende Matrix zunehmend in Übereinstimmung mit der Expansion der Keimzentren verschoben. Zuerst werden IgM-Antikörper exprimiert und auf der Zelloberfläche durch die aktivierten B-Lymphozyten innerhalb der Keimzentren präsentiert. Über einen Zeitraum von mehreren Tagen findet bei den Antikörpern der IgG-Unterklasse eine Veränderung statt, welche schließlich exprimiert und auf der Zelloberfläche von Plasmazellen präsentiert werden. Parallel zur Änderung der Unterklassen findet im Keimzentrum in vitro durch somatische Permutation eine Affinitätsreifung des Antikörpers hinsichtlich des Zielantigens statt. Dies erfolgt durch eine Vorzugsproliferation der Antigen-spezifischen B-Lymphozyten, deren Antikörper eine höhere Affinität für das Antigen aufweisen und dadurch einen verlängerten Zell-Zell-Kontakt mit den APC im Vergleich zu anderen konkurrierenden B-Lymphozyten (auch unter den T-Lymphozyten) haben. Somit steigt ihre Proportion in der Gesamtexpression Antigen-spezifischer Antikörper (klonale Expansion) und führt schließlich zu einer Dominanz in der Kultur.
Die Anzahl spezifischer B- und T-Gedächtniszellen (für die Induktion einer sekundären Immunreaktion) oder naiver B- und T-Lymphozyten (für die Induktion einer primären Immunreaktion) ist angepasst auf die verfügbaren APC in der Co-Kultur. Durch ein geeignetes Verhältnis von B- und T-Lymphozyten in Bezug aufeinander und auf die APC, ist die geeignete Nähe der interagierenden Zellen (für eine erfolgreiche Migration und Assoziation) und die Kombination einer idealen Gesamtzellmasse der Co-Kultur, die gerichtete Bildung und Funktionalität der Keimzentren in Form induzierter Antikörperproduktion und Zellproliferation sichergestellt.
Als Antigen-präsentierende Zellen (APC) tragen dendritische Zellen verarbeitetes Antigen auf ihrer Zellober fläche und sind somit in der Lage, Antigen-spezifische T4-Helfer-Zellen (naiv oder T-Gedächtnis) zu aktivieren, welche sich in unmittelbarer Umgebung befinden. Die Aktivierung verursacht die Sekretion von Zytokinen (IL-2, IFNγ) und klonale Expansion. Die Präsentation des Antigens wird bewirkt durch Membran-gebundene MHC-Rezeptoren der Klasse 2 der DC. Für eine geeignete Präsentation wird das Antigen zuvor an Mikropartikel gebunden und den APC für Phagozytose und Antigenverarbeitung angeboten. Die Zugabe des Antigens erfolgt entweder vor oder während der Co-Kultivierung.
Funktionale dendritische Zellen erhält man aus Blutpräparaten und differenziert in vitro. Lymphozyten werden aus den gleichen oder unterschiedlichen Spendern hergestellt. Sie können zur gleichen Zeit hergestellt und während des Differenzierungszeitraums der DC kryokonserviert werden, oder sie können zu einem späteren Zeitpunkt hergestellt werden. Ein autologes Konzept wird bevorzugt, um immunogene Wirkungen zwischen den beteiligten Zellpopulationen zu vermeiden. Für die Co-Kultur werden allogene oder autologe T-Lymphozyten in ausreichenden Mengen und zu gegebener Zeit bereitgestellt, sobald die Differenzierung der DC und die Antigenpräsentation abgeschlossen sind. Innerhalb des Umfangs der Zell-Zell-Interaktion werden die regulatorischen Wirkungen der T-Lymphozyten ausgenutzt. Für die Induktion einer bestehenden Immunreaktion sind dies T-Gedächtniszellen (sekundäre Immunreaktion), während für die selektive de novo Erzeugung einer Immunreaktion naive T-Lymphozyten eingesetzt werden (primäre Immunreaktion). Die Bereitstellung einer ausreichenden Zellmasse mit einer hohen Zelllebensfähigkeit und die Verlängerung der Lebensdauer der hergestellten Zellpopulation werden durch selektive T-Zellexpansion bewirkt.
Für die Co-Kultur werden auch autologe B-Lymphozyten in einer ausreichenden Menge und zu gegebener Zeit bereit gestellt. Auch in diesem Fall können Gedächtniszellen oder naive B-Zellen eingesetzt werden, abhängig davon, ob eine sekundäre oder primäre Immunreaktion induziert werden soll. Die Zellmasse mit hoher Zelllebensfähigkeit kann durch Revitalisierung kryokonservierter Proben zu einem vorbestimmten Zeitpunkt erhalten werden.
Die T-Zellen, welche vorrangig für regulatorische Zwecke eingesetzt werden, können geeignete spezifische B-Zellen (naiv oder B-Gedächtnis) durch Zell-Zell-Kontakte und Zytokinsekretion aktivieren und sie zur Zytokinsekretion und klonalen Expansion induzieren. Außerdem erfolgt die Expression des Zell-spezifischen Immunglobulins entweder zuerst in Form von IgM (naiv; primäre Immunreaktion) oder in Form von IgG (B-Gedächtniszellen, sekundäre Immunreaktion, Bystander-Reaktion), welche mobil sind und durch Chemotaxis, angezogen durch die APC, migrieren. Die Zellinteraktionen manifestieren sich in Form von gerichteter Zellmigration, der Bildung von Zell-Zell-Kontakten, der selektiven gegenseitig stimulierten Sekretion von Zytokinen mit autokrinen und parakrinen Wirkungen, gerichteter Zellproliferation und der Antigen-gesteuerten Affinitätsreifung der gebildeten Antikörper (Antikörper-Arming).
Daher bestehen wichtige Funktionen der in vitro gebildeten Keimzentren in einer umfassenden gerichteten Bildung Antigen-spezifischer B-Zellen, der Expression Antigen-spezifischer Antikörper verschiedener Unterklassen, der gerichteten Veränderung von Unterklassen und der Affinitätsreifung von Antikörpern spezifisch für das Zielantigen.
Die extrazelluläre Trägermatrix und das Kulturmanagement stellen außerdem die kritisch notwendige zelluläre gewebeartige Selbstorganisation und Selbstkonditionierung innerhalb der Co-Kultur sicher. Sie muss die Mobilität der Zellen sowie die Adhäsion, Migration, Assoziation und Proliferation ermöglichen. Außerdem unterstützt die Matrix das Wachstum der Keimzentren über Kultivierungszeiträume von mehreren Monaten hinweg. Zu diesem Zweck sind optimale Diffusionseigenschaften für Substrate und Abfallprodukte des Zellstoffwechsels sichergestellt, ohne die lokale Mikroumgebung der Zytokingradienten zu stören. Außerdem ist eine kontrollierte Degradation oder Verschiebung der Matrix in Übereinstimmung mit der Expansion sich bildender Keimzentren sichergestellt.
Bei der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Matrix des Kultivierungsraumes eine Porosität aufweist, welche ausreichenden Durchfluss durch die mobile Phase, die Migration von Zellen innerhalb der Matrix und die Bildung lokaler Flussgradienten (Mikroumgebung) ermöglicht, und dass sie bevorzugt eine Porosität von mehr als 30 μm aufweist. Es ist ferner bevorzugt, dass die Hohlräume der Matrix Durchmesser von mindestens zweimal dem Durchmesser der Zellen der mobilen Phase aufweisen. Schließlich ist es auch bevorzugt, dass die Matrix aus Gelen, porösen Materialien, wie offenporigen Schäumen, Geweben und Faserstoffen ausgewählt ist.
Die Langzeitkultivierung der gebildeten Keimzentren wird durch die kontinuierliche Versorgung des Kultivierungsraumes (z.B. mit zellfreier/n Versorgungsflüssigkeit/en) sichergestellt. Das Versorgungssystem, der Kultivierungsraum und die Matrix können sterilisiert sein und zeigen ausreichende Prozessstabilität über Monate hinweg für die Langzeitkultivierung.
Die kontinuierliche Versorgung stellt eine ausreichende und konsistente Versorgung mit Substraten und die Entnahme von einschränkenden Stoffwechselendprodukten sicher. Ein Mediumvolumen zirkuliert durch das Kultursystem und wird anschließend auf ideale Kulturbedingun gen hinsichtlich der Sauerstoffkonzentration und des pH-Wertes des Mediums regeneriert (äquilibriert). Außerdem wird ein Teil des zirkulierenden Kulturmediums kontinuierlich mit einer selektiv einstellbaren Verdünnungsrate verändert. Dies stellt eine konstante Versorgung der kultivierten Zellen mit stoffwechselrelevanten Substraten und die Entsorgung von wachstumseinschränkenden Metaboliten sicher, selbst über lange Kultivierungszeiträume hinweg.
Außerdem kann der physiologische Zustand der Kultur (Substratverbrauch, Zytokinregression, Antikörperproduktion usw.) durch periodische Probenahme des zirkulierenden Kulturmediums überwacht werden.
Der Kulturraum ist ausgelegt um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an Zellen interagieren kann und somit eine Immunreaktion gegen alle gewünschten Antigene innerhalb des Umfangs einer autologen Co-Kultur induzieren kann.
Der Kultivierungsraum selbst ist gefüllt mit einer wachstumsunterstützenden Matrix und wird durchquert von mikroporösen Membranoberflächen, was die Versorgung der Zellen mit wichtigen Substraten und die Entsorgung von kritischen und gewünschten Endprodukten in einem ausreichenden Maße sicherstellt, ohne die durch die Zelle gebildete Mikroumgebung zu stören (Gradienten von Faktoren, welche autokrine und parakrine Wirkungen aufweisen).
Der ausreichende Transport von Substanzen aus dem Verdauungssystem durch die Membranoberflächen in die Matrix und schließlich zu den metabolisch aktiven Zellen wird kontrolliert durch:

1. das Material und das mikrostrukturelle Erscheinungsbild der Membranoberflächen;
2. die gegenseitige geometrische Anordnung der Mem branoberflächen;
3. eingeschränkte Diffusionslängen innerhalb des Kultivierungsraumes;
4. ausreichende Transporteigenschaften der Matrix in Form guter hydraulischer Eigenschaften und Diffusion; und
5. ausreichende Bioverfügbarkeit gelöster Substanzen innerhalb des Matrix-gefüllten Volumens.

Insbesondere wird die Zugabe und/oder Entnahme von Sauerstoff und/oder Kohlendioxid und/oder Substraten durch zellfreie Versorgungsflüssigkeit oder Versorgungsgas durch mikroporöse Membranen unterschiedlicher Porengrößen bereitgestellt: eine Hohlfaser mit einem Innendurchmesser (ID) von 100 bis 600 μm, einem Außendurchmesser (AD) von 200 bis 1000 μm, einer Wanddicke (WD) von 25 bis 200 μm und einer Porengröße von 0,05 bis 0,2. Eine geeignete Hohlfaser als Diffusionsmembran bei Verwendung von Gas ist z.B. ID = 200 μm, AD = 300 μm, Polypropylen (PP) und 0,2 mm Porengröße (Accurel, Membrana GmbH, Deutschland) und eine geeignete Hohlfaser als Filtrationsmembran bei Verwendung von flüssigen Medien (durchlässig für Substrate und Metaboliten, z.B. Glukose, Lactat) ist z.B. ID = 500 μm, AD = 700 μm, Polyethersulfon (PESF) mit Porengröße 0,2-5 μm (GKSS, Deutschland).
Andererseits wird eine konstante oder periodische Perfusion von Kulturvolumen durch flüssige zellfreie Kulturmedien und/oder Zellsuspension bereitgestellt durch mikroporöse Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen für die Perfusion suspendierter Zellen (mobile Zellphase), für die Interaktion mit der stationären Zellphase fixiert im Matrix-unterstützten Kulturraum, für die Zuführung von Substraten und/oder die Entnahme von Metaboliten, für die Zuführung von Sauerstoff und/oder Kohlendioxid und/oder zellfreier Versorgungsflüssigkeit oder Versorgungsgas, z.B. eine ebene Membran, welche eine Porengröße von 10 bis 150 μm und eine Dicke von 0,1 bis 2 mm aufweist. Geeignete Membranen sind eine zellpermeable, ebene Teflon-Membran mit einer Porengröße von 80 μm (definierte Isopore-Poren) mit 1 mm Dicke und ein zellpermeables, mechanisch stabilisiertes Teflonnetz mit einer Maschenweite von 80 μm (Bohlender, Deutschland).
Das Versorgungssystem und der Kultivierungsraum ermöglichen eine kontinuierliche oder auch periodische Probenahme des Kulturmediums und das Abernten von Zellen und Zellprodukten wie sekretorischen Antikörpern.
Bei der gleichen Zellkonzentration sollte der prozentuale Lymphozytengehalt in der Startpopulation erhöht werden. Dies würde eine Annäherung an die Gegebenheiten in menschlichem Blut (M. Classen et al., Urban & Schwarzenberg, München, Wien, Baltimore (1991)) und an die Formel vorgeschlagen von Borrebaeck und Danielsson bedeuten, nach welcher ein Verhältnis von T-Zellen zu B-Zellen zu Zusatzzellen von 2:1:0,25 als ein optimales Verhältnis eingeschätzt wird (C.A.K. Borrebaeck, 1989; L. Danielsson et al., Immunology 61 (1987), 51-55). Zum Vergleich: das Verhältnis der genannten Zellen in der MNC-Startpopulation war 2,7:1:1 oder 0,8:0,25:0,25 und an Tag 34 7:1:41 oder 0,04:0,006:0,25. Die Trennung der Zellen, insbesondere die Depletion der Monozytenpopulation, hat eine ungünstige Wirkung auf den Verlauf der Kultur.
Hinsichtlich der Zusammensetzung des Kulturmediums (und der Versorgungsflüssigkeit(en)), muss sich eine höhere Zugabe von menschlichem Serum hinsichtlich der Mediumergänzung als günstig erweisen. Auch aus der Analogie zu den Ergebnissen der beschriebenen Untersuchungen von zweidimensionalen Kulturen heraus, sollte die Zugabe von menschlichem Serum etwa 10-12 % betragen. Borrebaeck und Danielsson bevorzugen die Zugabe von 10 % menschlichem Serum (C.A.K. Borrebaeck, 1989; L. Da nielsson et al., Immunology 61 (1987), 51-55). Im Tecnomouse^®-Bioreaktor wurden 4 % HSA zum Kulturmedium zugegeben. Der Verzicht auf FCS als eine Mediumzugabe scheint möglich zu sein. De Serumdeaktivierung sollte im Allgemeinen streng überwacht werden. Trotz des vorteilhaften dreidimensionalen Kultivierungsmodus im Bioreaktor konnte keine wirksame in vitro Immunisierung im derzeitigen Entwicklungsstadium ohne T- oder B-Zellstimulanzien entdeckt werden. Hinsichtlich des Lymphozytenrückgangs, welcher im Verlauf unverhältnismäßig hoch war, wäre die Verwendung von z.B. IL-2 in einer Konzentration von 50 U/ml und zusätzlich die optionale Zugabe von T-Zell-konditioniertem Medium von Vorteil. Die eingesetzte Endkonzentration von 0,38 μg HBsAg pro ml lag innerhalb des Konzentrationsbereichs, der von Borrebaeck und Danielsson auch als günstig eingeschätzt wurde. Da die Zellen nicht durch Medium in das Organfragment gespült werden, sondern durch engmaschige mediumhaltige Hohlfasern in den dreidimensionalen Raum zugeführt werden, gibt es keinen Grund, die oben genannte IL-2- oder Ag-Konzentration zu erhöhen, wie durch den erhöhten Stimulansbedarf für die Lymphozytenaktivierung wie beschrieben durch Ferro und Hoffmann (Ferro et al., Immunobiology 188 (1993) 51-61; Hoffmann et al., J. Immunol. Methods 179 (1995) 37-49) impliziert.
Das Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht folgende spezielle Ausführungsformen:

– Langzeitbetrieb für Mehrfachimmunisierung, parallele Anordnungen und Dimensionen für Biomassen;
– Prozessüberwachung, zum Beispiel durch Gewinnung der gebildeten spezifischen Antikörper oder Zytokin-Cocktails;
– Gewinnung von menschlichen, spezifisch neu angeordneten und hypermutierten B-Lymphozyten/Plasmazellen und Gewinnung der einzelnen Zell-RNA/DNA;
– Transfektion einer Zelllinie mit dem Antikörpergen zum Herstellen des monoklonalen Antikörpers; und/oder
– Gewinnung von Antigen-spezifischen T-Suppressor/Killerzellen für die zellsubstituierende autologe Therapie.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist insbesondere geeignet für die Durchführung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Besondere Ausführungsformen sind in 1 bis 4 und 8 bis 10 gezeigt.
Die Erfindung wird ferner mittels der folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 und 2 zeigen alternative Ausführungsformen einer Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und/oder Gewebe, welche einen Kultivierungsraum 2 zum Einführen von Zellen und/oder Gewebe aufweist, denen unterschiedliche Flüssigkeitsströme 4, 6 bevorzugt kontinuierlich zugeführt werden können, nämlich mindestens eine zellfreie Versorgungsflüssigkeit 4 und mindestens eine mobile Zellphase 6.
In 1 werden die Flüssigkeitsströme 4, 6 in permeablen Leitungen 14, 16 parallel zu einer Umfangsfläche und entlang dieser Umfangsfläche des Kultivierungsraumes 2 geleitet.
Aufgrund der Permeabilität der Leitungen 14, 16 können die zellfreie Versorgungsflüssigkeit 4 und die mindestens eine mobile Zellphase 6 in eine Matrix 8 enthalten im Kultivierungsraum 2 diffundieren.
In 1 wird der Materialaustausch durch Pfeile angezeigt, welche auf umrissene Poren 25 der Leitungen 14, 16 zeigen. Die Leitungen bestehen bevorzugt aus Kapillaren, nämlich Hohlfasern mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 150 μm, bevorzugt etwa 80 bis 120 μm, deren Porosität etwa 30 bis 500 kDa beträgt. Die Poren 25 sind in 3 und 4 am besten zu sehen.
Die Leitungen 14, 16 sind entlang von Kontaktoberflächen 10, 12 des Kultivierungsraumes 2 oder der Matrix 8 bereitgestellt, wobei 1 auch Durchgänge durch die Kontaktoberflächen des Kultivierungsraumes 2 zeigt, welche repräsentativ für die Porosität der Matrix sind.
Wenn mehrere Leitungen 14 für die Versorgungsflüssigkeiten 4 nebeneinander verlaufen, bevorzugt parallel, dann ist ihr Abstand voneinander das Zweifache bis Zahnfache, bevorzugt Drei- bis Fünffache des Kapillardurchmessers.
Während die Leitungen 14, 16 im Beispiel von 1 für die mindestens eine Versorgungsflüssigkeit 4 und die mobile Zellphase 6 entlang einer externen seitlichen Fläche des Kultivierungsraumes 2 oder der Matrix 8 bereitgestellt sind, sieht das Beispiel von 2 vor, dass die Matrix 8 in einer hohlen Kammer 20a, 20b aufbewahrt ist, bevorzugt horizontal, wobei die Matrix 8 von der mindestens einen mobilen Zellphase 6 in quer verlaufender Flussrichtung durchflossen wird, während die mindestens eine Versorgungsflüssigkeit 4 durch mehrere poröse Leitungen 14, insbesondere Kapillaren, zugeführt werden kann, welche, bevorzugt parallel, durch das Innere der Matrix 8 verlaufen.
Die Matrix 8 kann durch ein Sieb 18a, 18b an der unteren Seite oder an beiden Seiten unterstützt werden. Die Porengröße des Siebes 18a, 18b beträgt bevorzugt etwa 30 bis 100 μm.
Im Beispiel von 2 ist die Matrix 8 ein Bogen, der eine Dicke von etwa 1 bis etwa 15 mm, bevorzugt etwa 2 bis 10 mm aufweist. Die Matrix 8 ist innerhalb der hohlen Kammer gebildet aus zwei Gehäusehälften 20a, 20b aufbewahrt, welche die Matrix 8 mit oder ohne Stützvorrichtungen 18a, 18b zwischen sich aufnehmen. Die Gehäusehälften weisen Flanschteile 22a und 22b auf, welche einen Anschluss 30 für die Versorgungsflüssigkeit 4, die an einer Seite davon bereitzustellen ist, und an der anderen Seite, einen Anschluss 32 für das Ablassen der Versorgungsflüssigkeit 4, welche optional erneut zirkuliert werden kann, aufweist. Von dem Anschlussteil 30 wird die Versorgungsflüssigkeit 4 an mehrere Leitungen 14 verteilt, die bevorzugt mittig durch die Matrix 8 verlaufen und parallel angeordnet sind, was in 4 am besten zu sehen ist.
In 2 wird in einer quer verlaufenden Richtung bezüglich des Kultivierungsraumes 2 oder der Matrix 8, von oben nach unten, eine mobile Zellphase 6 zugeführt, d.h. auf der Eingangsseite durch einen Anschluss 34. Unterhalb der Matrix 8 kann die mobile Zellphase durch einen Anschluss 36 wieder abgelassen und erneut zirkuliert werden. Die Flanschteile 22a, 22b sind gegen die Gehäusehälften 20a, 20b der hohlen Kammer mit Hilfe der Dichtungen 24 abgedichtet.
8 zeigt einen schematischen Aufbau der Vorrichtung der Erfindung, einschließlich Versorgungsleitungen, Steuerung und Überwachung. Eine definierte vorbereitete Gasmischung (z.B. N₂ 75 %, O₂ 20 %, CO₂ 5 %, Linde AG) wird in einem definierten Strom hinzugegeben (z.B. 10-100 cm²/Min.), um eine Konzentration von gelöstem Sauerstoff (pO₂) im Kulturraum von bevorzugt 90 % (im Vergleich zur relativen Luftsättigung) zu äquilibrieren. Das Gas wird aus einem Druckgaszylinder 101 entnommen, steril gefiltert durch einen Filter 102 und in einer Fritten-Waschflasche 103 angefeuchtet. Das Gas wird durch den seitlichen Anschluss 104 zugeführt, am gegenüberliegenden Anschluss 105 wieder abgegeben und in einen sterilen Abscheider (eine zweite Fritten-Waschflasche, 106) gelenkt, um eine mikrobielle Rück kontaminierung zu vermeiden.
Die Zirkulation der Zellsuspension und/oder des Zellkulturmediums für die Perfusion des Kulturmoduls wird angetrieben durch eine peristaltische Pumpvorrichtung (107) mit einem konstanten Fluss von 100 μl/Min. in einem strömungstechnisch geschlossenen Kreissystem von etwa 12 ml. Ein Anschluss für die Injektion oder Probenahme von Zellsuspension und/oder Medium ist in den Zirkulationskreis (108) integriert.
Die Analysatoren 109 für pO₂ und die Analysatoren 110 für pH sind für die Überwachung der Sauerstoffversorgung und stabiler pH-Werte (Fibox 3, pH-1 mini, PreSens GmbH) implementiert. Sterile Sensorspots (111, 112) sind im Inneren des Kulturmoduls befestigt und lesen über Faseroptik angebracht im Kulturmodulgehäuse ab. Die Transparenz des für das Kulturmodulgehäuse verwendeten Polysulfons (Dicke am Probenahmeanschluss d = 1 mm) ermöglicht die optische Fluoreszenzablesung (Fluoreszenzlebensdauer).
9 zeigt eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und/oder Gewebe in einer Schnittdarstellung. Die Vorrichtung ist ähnlich der in 2 gezeigten. Daher sind die gleichen oder ähnlichen Teile mit den gleichen Referenzzeichen benannt.
Die Hauptunterschiede sind, dass die Gehäusehälften 20a und 20b zylindrisch sind, so dass sie in den Flanschteil 22a geschraubt werden können. Jede der Gehäusehälften 20a and 20b weist eine zylindrische Öffnung 21a, 21b mit einem Gewinde auf, um ein Rohr 27a, 27b aufzunehmen. Durch die Verbindung der Gehäusehälften 20a, 20b mit den Flanschteilen 22a kann mittels der Dichtungen 24, 26, 28 eine gute Abdichtung erreicht werden. Auf der anderen Seite der Dichtungen wird die Stützvorrichtung 18a, 18b gegen eine Schulter 36 ge drückt. Zwischen den beiden Stützvorrichtungen 18a, 18b befindet sich der Kultivierungsraum 2 oder die Matrix 8.
Die Rohre 38 für die zellfreie Versorgungsflüssigkeit 4 werden im Flanschteil 22c innerhalb der Öffnungen 40 gehalten, wobei die Öffnungen 40 und die Rohre 38 entsprechende Gewinde aufweisen. Zwischen den Flanschteilen 22a und 22a ist ein drittes Flanschteil 22b bereitgestellt, um die Verbindung der beiden Flanschteile 22a und 22c abzudichten.
10 zeigt eine Vorrichtung ähnlich der in 9 in einer Schnittansicht entlang der Linie I-I in 9, wobei die Gehäusehälfte 20a weitere Mittel aufweist. Zum Überwachen der Zellen und der Medien innerhalb der Matrix 8 sind zwei Anschlüsse 40 und 42 oder Faseroptik in der Gehäusehälfte 20a bereitgestellt. Die Faseroptik kann an einen Sensorspot 46 für pH oder einen Sensorspot 44 für pO₂ angeschlossen sein.
Der andere Teil der in 10 gezeigten Vorrichtung ist identisch mit dem von 9.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
Beispiele
Materialien und Verfahren
Chemikalien, Verbrauchsstoffe und Laborausrüstung:

Blutproben zur Herstellung von Primärzellen (Beispiel 1, 2) (Haema Holding AG, Deutschland);
Blutproben zur Herstellung von MNC (Beispiel 3, 4) (IKIT, Universität Leipzig, Deutschland);
Knochenmarkproben (Beispiel 4) (Universität Leipzig, Deutschland);
T-Kolben 75 cm² (Nunclon EasyFlask, Nunc);
T-Kolben 25 cm² (Nunclon EasyFlask, Nunc);
24-Well-Multiwellplatten (Nunclon, Nunc);
Techno Mouse (Integra Biosciences, Deutschland);
Zellinkubator (CellSafe, Heraeus, Deutschland);
Luft ergänzt mit 5 % Kohlendioxid, Temperatur 37 °C, rel. Feuchtigkeit 90 %;
Flusszytometer FACScalibur (BD Biosciences, Deutschland);
Zytokinerkennung für ELISA (Quantikine-Immunoassay, R&D-Systems Bierman, Deutschland);
Zytokinerkennung für flusszytometrisches Perlen-Assay (CBA, BD Biosciences, Deutschland);
Inverses Mikroskop (Olympus IX-50, Olympus Deutschland, Deutschland);
Digitale CCD-Farbkamera (DP-50, Olympus Deutschland, Deutschland);
Autoklav (Tecnoclav 120, Fedegari, Integra Biosciences, Deutschland).

Sterilisation:

Inkubation von Artikeln in einer Wasserdampf-gesättigten Atmosphäre mit einer Temperatur von 121 °C und einem Druck von 100 kPa über Umgebung(sdruck) für 20 Minuten.

Alle Komponenten des Perfusionsbioreaktors wurden durch Gammastrahlung (17 kGy) steril angeordnet unter einer laminaren Flussvorrichtung sterilisiert. Die Inokulation suspendierter Zellen (etwa 1 × 10⁶/Modul) erfolgte auch unter sterilisierten Bedingungen. Die Bioreaktoreinstellung einschließlich des Kulturmoduls und unterstützender Fluidströmungstechnik wird in einen temperaturgesteuerten Inkubator (37 °C) übertragen.
Kultur Medium:

Kulturmedium RPMI 1640 (Gibco Invitrogen);
Fötales Kälberserum (FCS; HyClone, USA);
Zytokine (IL-4, GM-CSF, TNF-a) (AL-Immunotools, Deutschland);

Antikörper:

Antikörper für Flusszytometrie (BD Biosciences, Deutschland)

Reagenzien/Abkürzungen:

CD1a-CD86

Differenzierungscluster-definierte Marker auf der Zelloberfläche aufgebaut bei der klinischen Diagnose

FITC

Fluorescein-Isothiocyanat, Fluorchrom zum Markieren von Bindungsproteinen, z.B. Antikörpern

PerCP

Fluorchrom zum Markieren von Bindungsproteinen, z.B. Antikörpern (unterschiedliche Exzitations-/Emissionswellenlänge für Fluoreszenz im Vergleich zu FITC)

PE

Phycoerythrin, Fluorchrom zum Markieren von Bindungsproteinen, z.B. Antikörpern (unterschiedliche Exzitations-/Emissionswellenlänge für Fluoreszenz m Vergleich zu FITC oder PerCP)

T-Zellen

menschliche T-Lymphozyten peripherer Blutpräparate

B-Zellen

menschliche B-Lymphozyten peripherer Blutpräparate

APC

Antigen-präsentierende Zellen sind freilegende Teile von Antigenmolekülen unter Verwendung der Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC II) auf ihrer Zelloberfläche, z.B. dendritische Zellen (DC)

DC

Dendritische Zellen

GC

Keimzentren sind histologische Struktur in Lymphknoten und Milz und spielen eine wichtige Rolle bei der humoralen Immunreaktion beim Menschen

efGC

Extrafollikuläre Keimzentren sind eine spezielle Form von Keimzentren mit reduzierter und histologischer Struktur in Lymphknoten und Milz und sind auch in nicht-lymphatischen Organen zu finden, z.B. dem synovialen Saum von Extremitäten

IL-2-IL-12

Interleukine, hochspezifische Botensubstanzen für die Kommunikation zwischen Leukozyten beteiligt an der Zellchemotaxis und Zellaktivierung

IFN-a, β, γ

Interferon, hochspezifische Botensubstanzen für die Kommunikation zwischen Leukozyten beteiligt an der Zellchemotaxis und Zellaktivierung

GM-CSF

Granulozyten- und Makrophagenkolonie-Stimulationsfaktor, hochspezifische Botensubstanz für die Zellaktivierung und -differenzierung

FCS

fötales Kälberserum, biologisches Präparat aus dem Blut ungeborener Kälber

DNA/RNA

Nukleinsäuren (Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure), spezifisch codierende Informationsmoleküle des Genoms und Transkriptoms in Zellen

SFM/SFM2

Zellkulturmedium für serumfreie Anwendung (Gibco, Invitrogen)

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay, analytisches Verfahren für die spezifische Erkennung und Quantifizierung von Peptiden und Proteinen

MNC

Mononukleäre Zellen (Leukozyten aus peripheren Blutpräparaten)

HbsAG

Gängiges Hepatitis-B-Virusantigen

HLA-DR

Menschliches Leukozytenantigen, Typ DR, Zell- und Gewebeantigenfaktoren für die Erkennung des „Selbst" und „Nichtselbst" des Immunsystems

IgM/IgG

Immunglobuline, Antikörpermoleküle des Typs M oder G

PWM

Kermesbeeren-Mitogen, pflanzliches Lectin aus Kermesbeeren mit hoher immunogener und mitogener Potenz (von Sigma-Aldrich)

LPS

Lipopolysaccharid, Teile der Bakterienzellwand (E. coli) mit hoher immunogener und mitogener Potenz (von Sigma-Aldrich)

CMV

Zytomegalievirus, latentes humanpathogenes Virus

Beispiel 1: Erzeugung und Subkultivierung immunkompetenter Zellen
Zum Untersuchen zellulärer Immunfunktionen in vitro wurden B-Lymphozyten (B-Zellen), T-Lymphozyten (T-Zellen) und dendritische Zellen aus menschlichen Blutproben eines einzelnen Patienten subkultiviert oder erzeugt, um ein autologes Konzept für weitere Co-Kulturen zusammengesetzt aus unterschiedlichen Zellpopulationen sicherzustellen.
Mononukleäre Zellen (MNC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugierung aus Vollblut oder Leukapheresepräparaten getrennt. Menschliche immunkompetente Zellen wurden durch immun-magnetische Separationen durch Oberflächenmarker isoliert, in einem ersten Schritt für CD14 und in einem zweiten Schritt für CD4 oder CD19. Zusätzlich wurde eine Depletion von CD25 angewandt, um regulatorische Zellen mit suppressivem Potential zu entfernen.
Die isolierten Subpopulationen wurden in RPMI-1640-Medium ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum (FCS; HyClone) kultiviert.
Monozyten erhalten durch die CD14-Separation wurden verwendet, um menschliche dendritische Zellen (DC) durch Zytokinstimulation zu differenzieren. Daher wurden IL-4 und GM-CSF 24 h und 48 h nach der Herstellung (jeweils 800 IU/ml für 2 × 10⁶ Zellen/ml) ergänzt. Zusätzliches TNF-a wurde an Tag 8 zugegeben. Die DC waren durch Flusszytometrie für Oberflächenmarker und die Aktivität von Phagozytose gekennzeichnet.
Der CD14-negative Pool wurde in RPMI-1640-Medium ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum kultiviert und konnte bei –80 °C für 3 Monate kryokonserviert werden.
Das Kryokonservierungsmedium war zusammengesetzt aus RPMI-1640-Medium, 25 % (v/v) fötalem Kälberserum und 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich). B-Zellen und T-Zellen erhielt man unter Verwendung des CD14-negativen Pools aus CD14-(+)-Separation isoliert oder nach der Revitalisierung von kryokonservierten Proben durch Separation für CD19 bzw. CD4.
Die erzeugten DC waren durch Flusszytometrie für eine Palette von Oberflächenmarkern (CD-Marker) und die Fähigkeit zu Phagozytose (Phagotest, BD Biosciences) gekennzeichnet. Nach Tag 12 der Differenzierung zeigten die erzeugten DCs normale Verschiebungen in der Expression von Oberflächenmarkern wie in der Literatur beschrieben: der Monozytenmarker CD14 verschwand am ersten Tag der Zytokinergänzung (IL-4; GM-CSF). Im Gegensatz dazu eskalierte der Marker CD1a. Während des Differenzierungsprozesses erhöhten sich CD40, CD83 und CD86 signifikant. Der Marker HLA-DR, der Hauptteil des MHC-II-Komplexes, der für die Antigenpräsentation von Bedeutung ist, wurde konsistent exprimiert (5).
Die erzeugten DC zeigen eine gesteigerte phagozytische Aktivität im Vergleich zu frisch isolierten CD14-positiven Zellen (Monozyten/Makrophagen). Die phagozytische Aktivität erhöhte sich von 6,33 auf 16,15 %. Daher wurden DC mit fluoreszierend markierten Bakterien (E. coli-FITC) inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde durch Flusszytometrie gemessen. Zellen mit phagozytierten Bakterien konnten durch zusätzliche Propidiumiodid(PI)-Einfärbung von freien Bakterien unterschieden werden, und von adsorbierten Bakterien durch Kontrollinkubation auf Eis (0 °C) (6).
Beispiel 2: Spontane Bildung eines komplexen Zellnetzes durch Co-Kultivierung von DC und T-Zellen
Eine definierte Co-Kultur von DC und T-Zellen konnte aufgebaut werden. DC wurden in Suspensionskultur mit bestimmtem Antigen (CMV-Latexperlen, CMV-Diagnosekit, Abbott Diagnostics) für 4 Stunden vorinkubiert. Dann wurden 10⁵ DC/ml auf Multiwellplatten (24-Well) angesetzt und durch Kermesbeeren-Mitogen für Bystander stimuliert (PWM, 1 μg/ml). Nach 24 Stunden der Kultivierung verteilten sich die DC auf der Oberfläche der Kulturschalen und 10⁵ T-Zellen wurden zugegeben (nicht präpariert für CMV-Antigen durch Auswahl von Blutspendern ohne akute oder latente CMV-Infektion). Die Co-Kultur wurde für etwa 14 Tage überwacht. Nach 6-10 Tagen bildeten die DC ein komplexes Netz von Dendriten durch einen Prozess von Selbstorganisation (7). Die zuvor suspendierten T-Zellen wechselten zu Anhaftung, migrierten zum dendritischen Netz und kamen in engen Kontakt mit den Dendriten. Die Proliferation von T-Zellen wurde initiiert und schwebende Proliferationscluster konnten mit loser Kontakt zur Kulturoberfläche beobachtet werden (7).
Darüber hinaus konnte die Bildung eines Netzes bei co-kultivierten DC und T-Zellen auch in dreidimensionalen Kulturen nachgewiesen werden. Ein Hydrogel abgeleitet aus dem menschlichen Fibrinogen-Blutkoagulationssystem wurde wie im Handbuch beschrieben hergestellt (Tissucol Immuno Kit, Baxter Bioscience), jedoch unter Verwendung in einer zehnfachen Verdünnung.
DC und T-Zellen wurden in Fibrinogen-Lösung suspendiert und nach induzierter Gerinnung homogen in die gelierende Matrix auf eine Abschlusskonzentration von 0,8 × 10⁶ bzw. 4,9 × 10⁶ Zellen/ml eingebettet. Die Matrix wurde in scheibenförmigen Schichten von etwa 1 mm Höhe hergestellt. Abhängig von der Konzentration von 1:10 bis 1:5, verdünnt durch Phosphatpuffer (PBS) vor der Gerinnung, zeigten sie eine moderate Transparenz bis Opazität.
Die eingebetteten Zellen wurden durch Mitogenergänzung von 1 μg/ml bakteriellem Lipopolysaccharid (E. coli; LPS) stimuliert. Unter mikroskopischer Kontrolle wurden die eingebetteten Zellen für etwa 10 Tage kultiviert. Von Tag 4 bis 6 des Kulturzeitraums bilden DC durch Selbstorganisationsprozesse ein dendritisches Netz, wie in der zweidimensionalen Kultur gesehen. Von Tag 4 bis 6 sind die zuvor homogen verteilten T-Zellen durch Migration um die DC gedrängt und bildeten Proliferationscluster bis zum Ende der Kultur.
Beispiel 3: Untersuchung einer dreidimensionalen Langzeitkultur von menschlichen MNCs in einem Tecnomouse^®-Bioreaktor (Referenzbeispiel)
Zwei unterschiedliche Populationen aus dem gleichen MNC-Präparat von einem gesunden menschlichen Spender wurden für 56 und 34 Tage in einem Tecnomouse^®-Bioreaktor kultiviert (Beschreibung, siehe oben). Der Kultivierungsraum von etwa 4,3 ml wurde mit einer Startzellzahl von 2,4 × 10⁸ (55,8 × 10⁶ Zellen/ml) und 1,54 × 10⁸ (35,8 × 10⁶ Zellen/ml) inokuliert. Das Perfusionssystem des Bioreaktors (Intrakapillarraum) wurde durch kontinuierliche Perfusion mit dem Kulturmedium IFM aus 5 l Rezirkulationsgefäßen mit einer. Perfusionsrate von 75 ml/h für 30 Min. vorinkubiert. Der Kulturraum (Extrakapillarraum) wurde mit dem Kulturmedium SFM1 für 30 Min. vorinkubiert. Zellen wurden in 6 ml SFM2 und 0,5 ml HEVAC suspendiert und in den Kulturraum übertragen. Die Mediumgefäße wurden in 14-Tages-Intervallen gewechselt. Glutamin wurde gemäß der nominalen Konzentration in dem IFM in 7-Tages-Intervallen in den Interkapillarraum zugegeben. 2 ml SFM2 und 0,5 ml HEVAC wurden einmal an Tag 34 in den Interkapillarraum zugegeben. Für die Versorgung des Bioreaktors wurde die Gasmischung aus einem Zellkultivierungsinkubator verwendet (Luft/CO₂-Mischung, 5 % CO₂). Das Gas zirkulierte mit 1,8 l/Min. Für die Überwachung der Stoffwechselsituation wurden täglich die Nährstoffversorgung und für die frühe Erkennung jeglicher Infektionen, die Glukose- und Lactat-Konzentrationen im Zellkulturüberstand der MNC-Population gemessen. Zellzählungen wurden mit dem Ethidiumbromid/Acridin-Orange-Verfahren durchgeführt.
Kulturüberstände wurden durch ELISA für IgM, IgG, Antilipid A, Anti-LPS J5 und Anti-HbsAg-Antikörper analysiert. Die Zytokine IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 und TNF-a wurden zusätzlich analysiert. Eine komparative FACS-Analyse beider Populationen an Tag 1 und 34 der Kultur sollten jegliche Differenzierungs- und Proliferationsprozesse entdecken, die während der Kultur stattfinden. Die Zelloberflächenmarker CD45, CD2, CD3, CD20, BMA031, CD11a, CD25-F, CD45 wurden untersucht, um Verschiebungen im Muster der Differenzierungs- und Proliferationsmarker während der Kulturzeit von 34 Tagen in der MNC-Kultur zu beobachten.
Die MNC- und Lymphozytenpopulation wurde verwendet und eine Lebensfähigkeit von etwa 90 % konnte nach 5 Wochen Kultur entdeckt werden. Bezüglich der prozentualen Verteilung von immunkompetenten Subpopulationen entspricht die Zusammensetzung der MNC-Startpopulation etwa der normalen Verteilung in peripherem menschlichem Blut wie beschrieben durch Classen (M. Classen et al., Urban & Schwarzenberg München, Wien, Baltimore (1991)). In den ersten fünf Wochen der Kultur veränderte sich die Zellverteilung deutlich zu Gunsten der Makrophagen und dendritischen Zellen. Die detaillierte Auswertung der FACS-Analysen zeigt, dass Proliferationen und Aktivierungsprozesse in beiden Kulturvarianten stattfanden. Die Proliferationsmarker HLA-DR, CD 71 und CD 25 erhöhten sich in allen Subpopulationen über die ersten 5 Wochen hinweg. Die einzige Ausnahme waren die T-Suppressorzellen, bei denen kaum eine HLA-DR-Erhöhung zu verzeichnen war. Trotz der klaren Verringerung der Lymphozytenzahlen wird eine Proliferation oder Aktivierung innerhalb der Lymphozytenpopulation erkennbar. Bei beiden Kulturvarianten konnte eine Erhöhung der T-Zellmarker CD2, CD4 und TCRaß erkannt werden. Eine CD8-Erhöhung wird nur erkennbar, wenn die Medianwerte berücksichtigt werden, so dass, zum Abschluss, ein Entwicklungsschub aller T-Zell-Subpopulationen abgeleitet werden kann. Diese Ableitung wird unterstützt durch die Verringerung naiver T-Zellen (CD45RA) bei einer gleichzeitigen Erhöhung der T-Gedächtniszellen oder aktivierten T-Zellen (CD45R0). Die kontinuierliche Erkennung von CD11a und Lecam1 spricht für die funktionale Expression von Adhäsionsmolekülen. Die im Verlauf mittels ELISA untersuchten Antikörperkonzentrationen zeigten, dass hohe Konzentrationen von Antikörpern erkannt werden können, selbst bis Woche 8 der Kultur (siehe Tabelle 7).
Die Zytokine IL-8 und IL-1ra konnten während der gesamten Kulturzeit verzeichnet werden. Die Auswertung der täglichen Bestimmung von Glukose und Lactat im rezirkulierenden Medium (Intrakapillarraum) ergab ein Glukose- und Lactat-Level in den angegebenen Konzentrationen, welches über den Verlauf der Kultur hinweg stabil war, was den Schluss einer stabilen Nährstoffversorgung ohne eine kritische Ansammlung von Stoffwechselendprodukten zulässt.
Der Abfall des CD45 RA/R0-Verhältnisses und die Verringerung des IgM/IgG-Quotienten im Verlauf der Zeit zeigen, dass eine primäre und auch eine sekundäre Immunisierung möglich zu sein scheint, und zwar bereits bei recht einfachen Untersuchungsansätzen.

Bei den täglichen Messungen der Glukose- und Lactat-Konzentrationen über die gesamte Zeit des Kulturverlaufs hinweg lag der Glukosegehalt bei mindestens 12,3 mmol/l. Die maximale Lactatkonzentration lag bei 1,9 mmol/l. Tabelle 1: Ergebnisse von Zellzählungen im Verlauf einer dreidimensionalen Langzeitkultur von menschlichen MNC in einem Tecnomouse^®-Bioreaktor

Zeit	Mononukleäre Zellen (Zellen/ml)			Lymphozyten (Zelle/ml)
Zeit	Gesamt	Lebend	Lebensfähigkeit	Gesamt	Lebend	Lebensfähigkeit
Start	55,8 × 10⁶	n.d.	n.d.	35,8 × 10⁶	n.d.	n.d.
Tag 34	334.000	302.000	90,4 %	182.000	167.000	91,8 %
Tag 56	728.000	349.000	47,9 %	n.d.	n.d.	n.d.
n.d. = konnte nicht bestimmt werden

Tabelle 2: Verhältnis von Lymphozyten und Makrophagen/dendritischen Zellen in der entsprechenden Gesamtoulation wie bestimmt durch FACS-Analysen:

Proportion der Gesamtpopulation:	Mononukleäre Zellen, Start der Kultur	Mononukleäre Zellen, Tag 34	Lymphozyten, Tag 34
Lymphozyten:	81 %	17 %	8 %
Makrophagen/dendritische Zellen:	19 %	83 %	92 %
Lebende Makrophagen/dendritische Zellen:	12 %	20 %	42 %

Hinweis: Die hier erwähnte Klassifizierung in Subpopulationen erfolgte mit Hilfe des Unterschiedes in der Zellabweichung in der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung der FACS-Vorrichtung aufgrund unterschiedlicher physikalischer Zelleigenschaften und durch die unterschiedliche Fluoreszenz der Zellen nach Markierung mit der Antikörpermischung CD 45-F/CD 14-PE.

Untersuchung lebender Makrophagen/dendritischer Zellen:
Positive Antigenerkennung	Mononukleäre Zellen, Start der Kultur	Mononukleäre Zellen 34, Tag	Lymphozyten, Tag 34	Antikörper
Positive Antigenerkennung	Fraktion	Median	Fraktion	Antikörper	Median	Fraktion	Median
CD 14	77,06 %	542,47	88,51 %	523,30	88,79 %	588,21	CD 14-PE
HLA-DR	87,20 %	98,22	00,00 %	5048,0	99,95 %	4697,59	HLA-DR-F
CD 4	95,73 %	7,70	64,97 %	7	58,81 %	99,10	CD 4-PerCP
CD 71	96,81 %	6,85	99,32 %	122,98	99,86 %	201,69	CD 71-F
CD 25	97,99 %	3,22	99,88 %	339,82	99,99 %	201,69	CD 25-F
				57,77

Positive Antigenerkennung	Mononukleäre Zellen, Start der Kultur	Mononukleäre Zellen, Tag 34	Lymphozyten, Tag 34	Antikörper
Positive Antigenerkennung	Fraktion	Median	Fraktion	Antikörper	Median	Fraktion	Median
Kontrolle¹	0,9 %	4	4,9 %	8	0,3 %	62
CD 2	74,1 %	15	92,6 %	30	95,6 %	33	CD 2-F
CD 3	n.d.	n.d.	88,6 %	76	89,5 %	69	CD 3-PerCP
CD 4	44,4 %	36	63,2 %	46	62,9 %	45	CD 4-PerCP
CD 8	20,0 %	155	21,6 %	262	17,1 %	223	CD 8-PerCP
CD 4/8-Verhältnis	2,2		2,9		3,7
CD 5	64,5 %	139	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	CD 5-PE
CD 20	n.d.	n.d.	8,8 %	37	12,5 %	35	CD 20-PerCP
TCR ab	66,3 %	30	87,7 %	33	82,6 %	28	BMA 031-F
CD 11a	95,8 %	47	98,1 %	55	97,5 %	51	CD 11a-F
CD 25	3,5 %	8	7,3 %	21	8,6 %	16	CD 25-F
CD 45 RA	75,5 %	86	37,7 %	51	33,8 %	43	CD 45 RA-F
CD 45 R0	19,0 %	25	72,1 %	53	70,7 %	38	CD 45 R0-F
CD 71	2,9 %	5	6,6 %	14	8,8 %	12	CD 71-F
HLA-DR	10,4 %	40	19,8 %	45	19,7 %	67	HLA-DR-F
LECAM 1	24,4 %	14	27,2 %	28	21,1 %	23	Lecam 1-F
¹ = Autofluoreszenz ohne Antikörpermarkierung, n.d. = nicht bestimmt

Positive Antigenerkennung	Mononukleäre Zellen, Start der Kultur	Mononukleäre Zellen, Tag 34	Lymphozyten, Tag 34	Antikörper
Positive Antigenerkennung	Fraktion	Median	Fraktion	Antikörper	Median	Fraktion	Median
Kontrolle¹	0,1 %	9	2,5 %	11	5,7 %	11
TCR ab	75,4 %	13	85,1 %	34	85,9 %	29	BMA 031-F
CD 11a	96,8 %	19	98,1 %	55	97,3 %	39	CD 11a
CD 25	3,8 %	10	8,4 %	26	11,0 %	17	CD 25-F
CD 45 RA	59,3 %	42	23,2 %	38	18,8 %	37	CD 45 RA-F
CD 45 R0	29,2 %	36	78,3 %	61	76,9 %	44	CD 45 R0-F
CD 71	0,4 %	9	3,6 %	15	6,5 %	13	CD 71-F
HLA-DR	3,6 %	7	9,9 %	16	13,2 %	24	HLA-DR-F
Lecam 1	18,6 %	14	19,2 %	24	18,5 %	26	LECAM 1-F
¹ = Autofluoreszenz ohne Antikörpermarkierung

Positive Antigenerkennung	Mononukleäre Zellen, Start der Kultur	Mononukleäre Zellen, Tag 34	Lymphozyten, Tag 34	Antikörper
Positive Antigenerkennung	Fraktion	Median	Fraktion	Antikörper	Median	Fraktion	Median
Kontrolle¹	0,1 %	3	0,2 %	20	1,1 %	5
TCR ab	96,8 %	18	97,8 %	35	96,9 %	31	BMA 031-F
CD 11a	100,0 %	54	100,0 %	93	100,0 %	83	CD 11a-F
CD 25	2,1 %	8	0,4 %	8	2,3 %	22	CD 25-F
CD 45 RA	85,7 %	71	61,7 %	51	62,0 %	50	CD 45 RA-F
CD 45 R0	14,4 %	14	64,0 %	31	57,7 %	30	CD 45 R0-F
CD 71	0,9 %	8	0,3 %	45	0,4 %	6	CD 71-F
HLA-DR	6,2 %	9	19,1 %	15	14,1 %	23	HLA-DR-F
Lecam 1	20,3 %	16	28,6 %	31	21,1 %	23	LECAM 1-F
¹ = Autofluoreszenz ohne Antikörpermarkierung

Antikörpererkennung	Serum des MNC-Spenders	Kulturüberstand der MNC, Tag 34	Kulturüberstand der MNC, Tag 56	Kulturüberstand der Lymphozyten, Tag 34
IgM	++	+	+	+
IgG	+++	++	++	++
Lipid-A-Antikörper	+	––	––	––
LPS-J5-Antikörper	+	––	––	––
Anti-HBs-Antikörper	+++	++	+	+
Legende: „––" = 0-0,1; „+" = 0,1-1; „++" = 1-10; „+++" = 10-100 μg/ml

Zytokinerkennung (pg/ml)	Mononukleäre Zellen, Tag 34	Mononukleäre Zellen, Tag 56	Lymphozyten, Tag 34
IL-8	3879	492	4931
IL-1ra	38020	14400	36800
IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, TNFa	0	0	0

Beispiel 4: Differenzierung von leukämischen B-Lymphozyten in Plasmazellen unter Anwendung dreidimensionaler Gewebekultur
10 ml Knochenmarkgewebe von einem Patienten mit B-chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL) wurden durch Biopsie erhalten. Über 91 % der nukleierten Knochenmarkszellen waren CD19/20-positive leukämische B-Lymphozyten, die ihre Antikörper auf der Zelloberfläche tragen. Insgesamt 2,57 × 10⁹ BM-Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 100 % zusammen mit Erythrozyten und verbleibend nach Biopsie-Spekula wurden in 8 ml IFM-Medium suspendiert. Die Zellen wurden in den Kulturraum einer Tecnomouse^®-Kulturkassette gefüllt. Das Stattfinden der Gewebereorganisation in diesem Kulturraum aufgrund der wirksamen Sauerstoffversorgung über zwei flache Silikonmembranen und basale Mediumperfusion über Hohlfasern wurde zugelassen. Der Bioreaktor wurde über 145 Tage mit Perfusionsraten von 50 ml/h betrieben. Ernten wurden alle zwei Wochen entnommen. Aliquote von inokulierten und abgeernteten Zellen und Kulturmediumüberständen des Extrakapillarraumes wurden analysiert. Suspendierte Zellen waren durch Flusszytometrie für DC-Marker gekennzeichnet. Überstände wurden durch ELISA auf sekretierte Immunglobuline und Zytokine unter Verwendung des Quantikine-Immunoassay (R&D Systems, Bierman) analysiert.
Im Gegensatz zur schnellen Apoptose von B-CLL-Zellen in vitro beschrieben in der Literatur, führte die Selbstorganisation von Knochenmarksgewebe im Bioreaktor zu einem in vivo-ähnlichen Verhalten über mindestens 14 Tage. Die B-Zell-Marker CD19/20 verblieben auf über 90 % der Zellen. Nach diesem Zeitraum verringerte sich die CD19/20-Expression schnell auf abschließend 10 % an Tag 145. Ab Tag 14 wurde eine signifikante Menge von 600 pg/ml IL-6 im dreidimensionalen Kulturraum angesammelt. Die Interleukin 6-Levels blieben über den gesamten Kulturzeitraum hinweg sehr hoch, wie in der folgenden Tabelle gezeigt:

Tag der Kultur 14 56 112 145

IL-6 (pg/ml) 600 300 450 600
Im Zeitverlauf der Kultivierung sekretierte Immunglobuline akkumulierten auf sehr hohe Titer. An Tag 145 fanden sich 1,5 g/l IgM und 3,0 g/l IgG im abgeernteten Überstand.
Sowohl der Mangel an CD-Markern auf den Lymphozyten im späten Stadium der Kultivierung als auch hohe Mengen an akkumuliertem IgM und IgG entsprechen der Differenzierung von B-CLL-Tumorzellen in sich nicht teilende Antikörper-sekretierende Plasmazellen. Angetrieben durch Zytokine, wie IL6, veränderte sich anschließend die Mikroumgebung der Patienten in vitro Knochenmarkskultur nach Tag 14 in einen neuen Plasmazell-induzierenden Phänotyp. Somit konnte die Selbstorganisation und Selbstreorganisation von funktionalem dreidimensionalem menschlichem lymphatischem Gewebe induziert werden, unter Voraussetzung des richtigen Bioreaktor- und Prozess-Designs.

Claims

Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen und/oder Gewebe, welche mindestens einen Kultivierungsraum (2), welcher eine Matrix (Matrizes) (8) enthält, die für das Einführen von Zellen und/oder Gewebe geeignet ist (sind), und mindestens zwei flüssigkeitszuführende Elemente (14, 16; 27, 38), um unterschiedliche Flüssigkeiten an den Raum (2) oder die Matrix (8) zu liefern, umfasst, wobei mindestens eine zellfreie Versorgungsflüssigkeit oder ein Versorgungsgas (4) und mindestens eine mobile Zellphase (6) zugeführt werden, wobei (i) die mindestens eine mobile Zellphase (6) durch die Matrix (8) in quer verlaufender Flussrichtung hindurchfließt und (ii) die bevorzugte horizontale Matrix (8) in einer hohlen Kammer (20a, 20b) aufbewahrt ist, durch welche die mindestens eine mobile Zellphase (6) in quer verlaufender Flussrichtung fließt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeitsströme (4, 6) zu dem Kultivierungsraum (2) oder der Matrix (8) durch permeable Leitungen (14, 16), zugeführt sind, wobei mindestens eine der Leitungen für die mobile Phase permeabel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine Versorgungsflüssigkeit (4) durch permeable Leitungen (14, 16), vorzugsweise Kapillaren, durch oder entlang des Kultivierungsraums (2) oder der Matrix (8) zugeführt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zugabe oder Entnahme der zellfreien Versorgungsflüssigkeit oder des zellfreien Versorgungsgases (4) über mikroporöse Membranen bereitgestellt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei (i) die Matrix des Kultivierungsraums eine Porosität aufweist, welche einen ausreichenden Durchfluss der mobilen Phase, Migration der Zellen innerhalb der Matrix und die Bildung von lokalen Flussgradienten (Mikroumgebung) ermöglicht und vorzugsweise eine Porosität von mehr als 30 μm aufweist; und/oder (ii) die hohlen Räume der Matrix (8) Durchmesser von mindestens dem doppelten Durchmesser der Zellen der mobilen Phase aufweisen; und/oder (iii) die Matrix (8) ausgewählt ist aus Gelen, porösen Materialien, wie beispielsweise offenporigen Schäumen, Geweben und Faserstoffen.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Matrix (8) ein Bogen ist, vorzugsweise mit einer Dicke von etwa 1 bis 15 mm, insbesondere mit einer Dicke von etwa 2 bis 10 mm.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei (i) die Flüssigkeitsströme (4, 6) durch die Matrix (8) diffundieren oder fließen; und/oder (ii) die Matrix (8) an einer oder zwei Seiten davon durch Stützelemente (18a, 18b) unterstützt wird, welche für Zellen permeabel sind, insbesondere ein Sieb, wobei die Porengröße der Stützelemente (18a, 18b) vorzugsweise bei etwa 30 bis 100 μm liegt; und/oder (iii) ein Fluss der mobilen Phase durch externe Perfusionsströmungstechnik (Pumpen) oder durch Gravitätsfluss (periodisches Umwälzen) aufgebaut ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die mindestens eine Versorgungsflüssigkeit oder das Versorgungsgas (4) der Matrix (8) durch mehrere poröse Leitungen (14), insbesondere Kapillaren, zugeführt werden kann, welche vorzugsweise im Inneren der Matrix (8) parallel verlaufen, wobei der Durchmesser der Leitungen (Kapillaren) vorzugsweise von 50 bis 150 μm, insbesondere etwa 80 bis 120 μm beträgt und die Porosität der Leitungen (14) (Kapillaren) bei etwa 30 bis 500 kDa liegt und/oder der Abstand der Leitungen (14) (Kapillaren) voneinander, welche vorzugsweise parallel verlaufen, das Zweifache bis Zehnfache, vorzugsweise das Dreifache bis Fünffache des Kapillardurchmessers beträgt.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei (i) eine Mikroumgebung, die für eine gewebeähnliche Kultur geeignet ist, innerhalb der Matrix (8) gebildet wird, welche die Bildung von Konzentrationsgradienten und die optimale Versorgung dieser Phase sicherstellt durch einen kontinuierlichen oder diskontinuierlichen direkt kontrollierbaren Fluss von mindestens einer Zell- und Gewebepopulation durch die immobile Zellphase, die in der Matrix (8) vorliegt; und/oder (ii) die mobile Zellphase erneut zirkulieren oder direkt hindurchpassieren kann ohne Sedimentation in dem bleibenden Kreislauf; und/oder (iii) Antigen, falls erforderlich, zu dem Kultivierungsraum (2) hinzugegeben werden kann; und/oder (iv) ein Element, mit welchem das Abernten der Zellen oder Produkte durchgeführt werden kann, bereitgestellt ist, vorzugsweise durch Elemente mit mechanischem, dynamischem und/oder enzymatischem Mechanismus.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, welche geeignet ist für die Durchführung eines Verfahren zur Kultivierung von Säugetierzellen und/oder Geweben, welche Zellstrukturen und immunologische Funktionen von immunologisch aktiven Geweben nachahmen, wobei das Verfahren den Schritt der Kultivierung von Säugetierzellen umfasst, welche in einem oder mehreren Kultivierungsräumen in Kontakt mit mindestens einer zellfreien Versorgungsflüssigkeit oder einer definierten Gasmischung und mindestens einer mobilen Phase stehen, welche Zellen eines Zelltyps enthält, welcher unterschiedlich zu dem Zelltyp der immobilisierten Säugetierzellen ist, wobei die Zellen regulatorische Eigenschaften aufweisen oder in der Lage sind, später Antikörper zu bilden.