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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges amphiphiles calixarenbasiertes
wasserdispergierbares Kolloidsystem in Form allgemein kugeliger
matrixartiger Partikel mit einer Größe im Bereich von typisch 50 bis
500 nm. Diese Partikel werden nachstehend als "feste Nanokugeln" bezeichnet, und sie sind in der Lage, ein
aktives Molekül
oder mehrere einzukapseln und zu transportieren. Sie werden im allgemeinen
unter unterschiedlichen Innenstärken
von Salzen und bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen
hergestellt. Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung
dieses Systems.
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Hintergrund der Erfindung
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Dem
Fachmann ist es bereits wohlbekannt, dass relativ kleine Moleküle von größeren Molekülen eingeschlossen
werden können,
die monomer oder polymer sein können
und einen intramolekularen oder intermolekularen Hohlraum aufweisen.
Die Größe solcher
Kombinationen von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, den
die Gastmoleküle
enthaltenden Wirtsmolekülen,
liegt wie oben erwähnt
im Submikronbereich, nämlich
zwischen 50 und 500 Nanometer.
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Submikronpartikel
werden beispielsweise in folgenden Patenten offenbart:
BE-A-808 034 ,
BE-A-839 748 ,
BE-A-869 107 ,
FR-A-2 504 408 ,
EP-A-0 275 796 ,
EP-A-0 349 428 ,
US-A-5 718 905 ,
WO 93/25 194 und
FR-A-2 681 868 .
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Die
belgischen Patente Nr. 808 034 und
839 748 beschreiben Submikronpartikel,
die durch Polymerisation von Monomeren einschließlich Acryl- oder Methacrylsäurederivaten
gebildet werden. Die Mizellare oder Grenzflächenpolymerisation der verschiedenen
Monomere ergibt Partikel mit einer Größe unter dem Mikronbereich.
Diese Systeme können
Wirkstoffe einkapseln. Die Partikel bilden stabile wässrige Kolloidsuspensionen
und ermöglichen
den Partikeln damit den Transport von biologisch wirksamen Molekülen zur
medizinischen Verabreichung. Die hohe Stabilität und das Fehlen einer geeigneten
Möglichkeit
der biologischen Ausscheidung der Polymersäuren führen jedoch zu einem schwerwiegenden
Nachteil bei deren Verwendung, indem sie im Körpergewebe oder in Körperhohlräumen verbleiben
und mögliche
Nebenreaktionen verursachen.
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Dieser
Nachteil wird gemäss
dem Patent
BE-A-869 107 teilweise
behoben, in dem biologisch abbaubare Nanopartikel aufgeführt werden,
die ein biologisch wirksames Molekül enthalten. Die verwendeten
Polymere sind Copolymere auf Alkylcyanacrylatbasis, deren biologische
Verträglichkeit
bekannt ist. Die Hauptnachteile dieser Systeme ergeben sich aus
der Toxizität
der Abbauproduk te unter physiologischen Bedingungen sowie aus der
Methodik der Einkapselung der Wirkstoffe. Bei dem beschriebenen
Verfahren liegt ein hochdichtes Polymergitter der Partikelbildung
zugrunde. Für
den Transport wird die Oberflächenabsorption
der Moleküle
verwendet, und daher sind die Inkorporationsgrade gering. Sekundäre Probleme
ergeben sich aus der Kontrolle der Polymerisationsreaktion, die
entweder lösliche
Monomere oder lösliche
kurze Oligomere hinterlassen kann, und diese Verbindungen können nachträglich aus
der Matrix ausgewaschen werden. Die verwendeten Reinigungsverfahren
sind sehr zeitraubend und kostspielig.
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Proteine
wie Albumin sind zur Herstellung von Nanosystemen verwendet worden,
entweder durch thermische Denaturierung (Kramer, P. A. J., Pharm.
Sci., 63, 1646, 1974) oder durch Salz- oder Lösungsmitteldenaturierung von
Proteinen wie Gelatine in Lösung
(Martey et al., Aust. J. Pharm. Sci., 6, 65, 1978 oder Pharm. Acta
Helv., 1, 53, 1978). Die denaturierten Proteindispersionen werden
anschließend
vernetzt. Im ersten Fall bedingt das notwendige Vordispergieren
des Proteins in einer Öl-Wasser-Emulsion
die Verwendung eines sekundären
Tensids sowie eine Ultraschallbehandlung. Im zweiten Fall müssen vor
der Verwendung großen
Mengen an anorganischem Material entfernt werden. Bei beiden Systemen
muss überschüssiger toxischer
Aldehyd entfernt werden.
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EP-A-0 275 796 und
EP-A-0 349 428 offenbaren
Nanopartikel, die durch Lösungsmitteldiffusion
aus zwei nicht mischbaren Systemen hergestellt werden. Die in
EP-A-0 349 428 beschriebenen
Nanosysteme auf Proteinbasis bedingen jedoch die Anwendung hochspezifischer
Bedingungen, die ihre Anwendung einschränken.
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Das
französische
Patent
FR-A-2 551 072 beschreibt
mikrometergroße
Kapseln als eine Form eines verzögert
freigesetzten pharmazeutischen Systems, die aus Polyolestern hergestellt
werden. Solche Mikropartikel sind jedoch für die intravaskuläre Verabreichung
nicht ohne medizinische Risiken verwendbar.
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Mehrere
Patente, beispielsweise
US-A-5
718 905 ,
WO 93/25194 und
FR-A-2 681 868 ,
beschreiben die Verwendung modifizierter Cyclodextrine als Ausgangsmaterial
für die
Nanokugeln. Sie haben den Vorteil, biologisch abbaubar zu sein,
auf ihre Verabreichung folgt die Freisetzung des wirksamen Moleküls, und
eine biologische Abbaubarkeit kann erzielt werden, die geeigneterweise
durch die Verwendung modifizierter Cyclodextrine kontrolliert wird,
welche sich in der Art der verwendeten Substituentengruppen voneinander
unterscheiden. Solche modifizierte Cycldextrine und deren Herstellung
werden insbesondere von Pin Zhang, C. C. Ling, A. W. Coleman, Parrot-Loppez
und H. Galons in Tetrahedron Letters 32, Nr. 24, 2679-70, 1991 beschrieben.
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Alle
Nanosysteme auf Cyclodextrinbasis haben jedoch eine Anzahl Probleme
gemeinsam: erstens die hohen Synthese- und Produktionskosten, da
die anfänglichen
Modifikationen alle eine Vakuumtrocknung der Cyclodextrine bei 120°C erfordern;
zweitens die Verwendung toxischen Reaktionsmaterials, einschließlich Pyridin,
Iod, Natriumazid, sekundäre
Amine, die in den Molekül hohlräumen eingeschlossen
bleiben können;
drittens kann der biologische Abbau das Ausgangs-Cyclodextrin freisetzen,
das als hochgradig hämolytisch
bekannt ist. Es konnte nicht belegt werden, dass diese hämolytische
Wirkung bei den modifizierten Spezies nicht vorliegt.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Ziel
der Erfindung ist es, alle diese Probleme zu lösen und eine neuartige Gattung
von Nanosystemen der oben beschriebenen Art anzugeben, die mit medizinischen,
biologischen, tierärztlichen,
kosmetischen und Lebensmittelanwendungen vollständig verträglich sind, aus ungiftigen
Verbindungen einfach und relativ kostengünstig herstellbar sind, während der
Herstellung keine giftigen oder unverträglichen Verbindungen einschließen, und
die beim biologischen Abbau keine giftigen oder auch unverträglichen
Stoffe ergeben.
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Die
erfindungsgemäßen Nanopartikel
enthalten amphiphil modifizierte Calixarene als Einschlussmoleküle. Die
erfindungsgemäßen neuen
Zusammensetzungen enthalten ein dispergierbares Kolloidsystem bestehend
aus den genannten Nanopartikeln als Träger und mindestens einer zu
transportierenden Wirkverbindung.
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Calixarene
sind polyzyklische Verbindungen, die seit den 1970er Jahren bekannt
sind. Eine Besprechung dieser Gattung chemischer Verbindungen findet
sich z. B. in C. D. Gutsche, "Topics
in Current Chemistry",
Vol. 123, Springer 1984, S. 1 bis 47; und C. D. Gutsche, "The calixarenes revisited", Chem. Soc., 1998. Calixarene
werden im allgemeinen aus einem parasubstituierten Phenol und einem
Aldehyd, typisch Formaldehyd, und durch Zyklisierung der primär gebildeten
linearen Oligomere gewonnen. Es handelt sich um äußerst stabile Verbindungen,
die auf Grund ihrer Inertheit, Unlöslichkeit und Wärmebeständigkeit
bereits als Einschlussmaterial für
hochgiftige Abfälle
vorgeschlagen wurden.
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Die
Erfindung beinhaltet weiter ein Verfahren zur Herstellung der neuen
calixarenbasierten Zusammensetzung. Dieses Verfahren umfasst als
Stufen (1) das Vorlegen mindestens eines amphiphilen substituierten
Calixarens, (2) das Vorlegen einer flüssigen Phase, die im Wesentlichen
aus einer Lösung
des genannten amphiphilen Calixarens in einem organischen Lösungsmittel
besteht, (3) das Vorlegen einer zweiten flüssigen Phase, die aus Wasser,
einer wässrigen
Mischung oder einer ionischen Lösung
besteht, (4) das Kombinieren der genannten zwei flüssigen Phasen
der Stufen (2) und (3), und (5) die Gewinnung einer kolloidalen
Suspension von Nanokugeln, die die genannten amphiphil substituierten
Calixarene enthält.
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Vorzugsweise
wird in Stufe (2) ein aus sauerstoffhaltigen Verbindungen wie Alkoholen,
Ketonen, Aldehyden, Ethern und Gemischen davon ausgewähltes organisches
Lösungsmittel
verwendet. Das Lösungsmittel
kann ein Gemisch zweier oder mehrerer Lösungsmittel sein und kann auch
Wasser enthalten.
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Die
Kombination der zwei Phasen gemäss
Stufe (4) erfolgt vorzugsweise unter mäßigem Rühren, während eine der beiden Phasen
in die andere gegeben wird.
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Der
mit den Nanokugeln zu verbindende Wirkstoff ist in mindestens einer
der in den Stufen (2) und (3) oben beschriebenen Flüssigphasen
enthalten, vorzugsweise jedoch nur in einer der beiden Phasen (2)
oder (3). Dieser Wirkstoff kann aus mindestens einem der folgenden
Materialien und Stoffe ausgewählt
sein, die beispielhaft als nicht erschöpfende Aufzählung angeführt werden und zu den folgenden
Gruppen gehören:
- A) Kosmetische Stoffe: beispielsweise Öle, Salben,
Antioxidantien, Farbstoffe, Vitamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Salze,
Tenside, hydratisierende Verbindungen, Emulgatoren, Gele, Seifen, ätherische Öle, Parfüms, Entwässerungs-
oder Trockenmittel.
- B) Nahrungsmittel und Getränke:
beispielsweise Öle,
Antioxidantien, Farbstoffe, Vitamine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Salze,
Tenside, hydratisierende Verbindungen, Emulgatoren, Gele, Aromastoffe, ätherische Öle, Duftstoffe,
Zucker, Lipide, Süßstoffe,
Stabilisatoren, Geschmackwandler oder flüchtige Stoffe.
- C) Pflanzenschutzmittel: beispielsweise Dünger, Pestizide oder Akarizide;
und
- D) Pharmazeutika: beispielsweise Medikamente, Arzneien, Kontrastmittel,
Farbstoffe, Vitamine, Aminosäuren,
Peptide, Proteine, Salze, Nukleinsäuren und DNA, Kohlenhydrate,
Lipide und Phospholipide.
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Beide
Phasen (2) und (3) können
Hilfsstoffe wie beispielsweise Tenside, Cotenside, Stabilisatoren, Dispergiermittel
oder Farbstoffe enthalten.
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Die
Nanopartikel werden als Kolloidsuspension gewonnen, die sich bildet,
weil die in der organischen Phase (2) gelösten substituierten Calixarene
in der wässrigen
Phase (3) praktisch unlöslich
sind. Daher muss bei der Herstellung der beiden Phasen natürlich darauf
geachtet werden, dass die verwendeten Lösungsmittel entsprechend der
Löslichkeit
bzw. Unlöslichkeit
des jeweils verwendeten substituierten Calixarens ausgewählt sind.
Solche Überlegungen
sind selbstredend und dem Fachmann geläufig.
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Die
in der Praxis vorliegender Erfindung verwendeten substituierten
Calixarene entsprechen der allgemeinen Formel
worin:
R
1 =
H, OH, OR oder OCOR;
R
2 = H, R, COR,
CH
2Pol, Y oder CH
2Y;
R
3 = H, OH, OR oder OCOR;
R
4 =
H, OR, OCH
2R, OCOR oder eine Ester-, Carbonsäure-, Amido-,
Amino-, Peptid- oder Kohlenhydratgruppe;
R
5 =
R oder Y;
R = eine gesättigte
oder ungesättigte
gerade oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette, welche substituiert
sein kann mit Halogen und/oder durch eine Gruppe Pol; oder R ist
ein zyklischer Kohlenwasserstoffrest, gesättigt oder nicht;
Pol
= eine polare Gruppe, ausgewählt
aus Phosphorsäure,
Schwefelsäure,
Amino, Ammonium, Carbonsäure und
deren Salzen;
Y = Halogen oder Pseudohalogen;
X = eine
direkte Bindung, O, S oder NR
6R
7;
R
6 = Alkyl, Acyl oder Wasserstoff;
R
7 = Alkyl, Acyl oder Wasserstoff;
n
= eine ganze Zahl von 3 bis 20; und
n' = eine ganze Zahl <= n;
wobei die Verbindung der
obigen Formel mindestens eine Pol-Gruppe enthält.
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Die
Verbindungen gemäss
Formel 1 können
ausgehend von wohlbekannten Calixarenen nach dem von P. Shahgaldian,
A. W. Coleman und V. I. Kalchenko in Tetrahedron Letters 42 (2001),
577-579 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
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Das
allgemeine Merkmal dieser Moleküle
besteht darin, dass eine hydrophobe Funktion, im allgemeinen eine
Acyl- oder Alkylkette, entweder am phenolischen Sauerstoff oder
am Kohlenstoffatom in der para-Stellung zur Hydroxylfunktion angebunden
ist, obwohl solche hydrophoben Gruppen auch an den Brückensubstituenten
angekoppelt sein kann (der den Rest R5 trägt), und
dass eine geeignete hydrophile Funktion, nämlich eine oder mehrere der
in Formel 1 angegebenen polaren Funktionen, an der Funktion angebunden ist,
die der durch die hydrophobe Funktion modifizierten gegenüberliegt.
Das Calix[n]aren kann von 4 bis 20 Phenolgruppen enthalten. Die
Brückenfunktion
kann eine einfache Methylengruppe sein, eine Oxomethylengruppe,
ein Brückenatom
wie O, S, NR5R6,
usw.; oder sie kann weiter verzweigt sein. Die Erfindung gestattet die
Erweiterung des möglichen
Calix[n]arenskeletts zu den bekannten Calixresorcinarenen, Systeme,
die auf chromotropischer Säure
und heterozyklischen Strukturen basieren, die die gleiche Skelettstruktur
wie die Calix[n]arene aufweisen. Spezifische Beispiele solcher Moleküle sind
in der oben bereits angeführten
Veröffentlichungen
von Felix et al. (Tetrahedron Letters 1998 vol. 39, 9171); und Shahgaldian
et al. beschrieben.
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Eine
optimale Einkapselung eines zusätzlichen
Moleküls
wird erzielt, indem dieses in der Phase gelöst wird, in der es löslich ist.
Die hier verwendeten Wirkmoleküle
sind solche mit bekannten oder möglichen
kosmetischen Anwendungen, darunter beispielsweise aber nicht erschöpfend Farbmittel,
Vitamine, ätherische Öle, Provitamine,
Peptide, Mono- oder Polysaccharide, Proteine oder Hormone.
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Die
Wahl des in 1) verwendeten Lösungsmittelsystems
kann Alkohole wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanole oder
Butanole einschließen,
Ketone wie beispielsweise Dimethylketon, Ethylmethylketon oder Diethylketon,
Aldehyde wie beispielsweise Acetaldehyd, Propionaldehyde (verzweigt
oder nicht) oder Butyraldehyde (verzweigt oder nicht), Ether wie
beispielsweise Dimethylether, Ethylmethylether, Diethylether oder
Tetrahydrofuran. Die Wahl des wässrigen
Systems in Phase (3) kann beispielsweise reines Wasser, ionische
Lösungen
in Wasser, saure oder basische Lösungen,
Lösungen
polarer gelöster
Stoffe wie Kohlenhydrate, Alkohole oder Aminosäuren einschließen. Alle
diese Lösungen
können
Moleküle
mit bekannten kosmetischen Anwendungen wie beispielsweise Vitamine,
Provitamine, Peptide, Aminosäuren,
antioxidative Moleküle,
Farbstoffe oder Aromakomponenten enthalten oder auch nicht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden (die wenig Einfluss
auf dessen Ablauf haben), insbesondere zwischen 0°C und der
Siedetemperatur der Lösungsmittel.
Das Volumenverhältnis
der Phase (2) zur Phase (3) kann vorzugsweise zwischen 0,1 und 1
liegen.
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Falls
dies nützlich
erscheint, können
bei der Herstellung der Matrix-Nanokugeln ein oder mehrere Cotenside
verwendet werden, diese können
ionische Tenside wie Carboxylsäuren,
Alkylphosphonate, Alkylsulfonate, Alkylamine, nichtionische Tenside
wie Pluronsäure,
Tween usw. beinhalten, und deren Anteil kann zwischen 0,01% und
10% variieren. Die Verwendung solcher Cotenside hat im Wesentlichen
keine Auswirkung auf die Zeitstabilität, kann jedoch eine Größenänderung
der Matrix-Nanokugel
gestatten.
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Die
Größe der erfindungsgemäßen matrixbasierten
Nanokugeln kann verändert
werden durch die Wahl der Geschwindigkeit der Zugabe der Phase (2)
zur Phase (3) oder umgekehrt, durch diejenige des Feststoffgehalts
in den beiden Phasen und diejenige sowie durch Änderung der Art und/oder des
Gehalts an Calix[n]aren und des verwendeten Lösungsmittels. Es wurde auch
festgestellt, dass in einigen Fällen
die Temperatur der beiden Phasen einen Einfluss auf die Größe der erhaltenen
Nanokugeln hatte. Das Rühren
der Mutterlösung
bedingt ein ausreichendes Umrühren
für die
Homogenisierung des Gemischs der Phasen (2) und (3) und erfolgt
am besten durch mechanisches Umrühren
beispielsweise mittels eines Magnetstabs bei 50–500 U/min. Das Rühren ist
für die
Herstellung von kleinen Mengen an Nanokugeln nicht wesentlich.
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Das
oben erwähnte
Tensid kann insbesondere in einem Anteil von 0,1 bis 10%, vorzugsweise
von 0,2 Gew.-% der in Stufe (4) gewonnenen kolloidalen Suspension
vorhanden sein. Die kolloidale Suspension der Nanokugeln kann nach
Bedarf konzentriert, sterilisiert, gepuffert (beispielsweise auf
physiologisches pH), zentrifugiert, dialysiert und gefriergetrocknet
werden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Nanokugeln ist vorteilhafterweise
umkehrbar. Das Kolloidsystem kann durch einfache Behandlung mit
einer wässrigen
Lösung wiederhergestellt
werden.
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Ein
großer
und völlig
unerwarteter Vorteil vorliegender Erfindung ist die hohe Zeitstabilität der Matrix-Nanokugeln.
Ihre ursprüngliche
Größe und alle
anderen physikalischen Eigenschaften bleiben über einen Zeitraum von mehr
als einem Jahr erhalten, und dies bei einer Lagerung bei 4°, 20° und 40°C.
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Die
hier beschriebenen Nanokugeln können
mittels hochauflösender
Mikroskopie (entweder SEM/TEM-Mikroskopie
oder Atomkraftmikroskopie) abgebildet werden. Die Anwendung dieses
Modus zur Abbildung des Systems verdeutlicht die hohe mechanische
Stabilität
des Systems. Dies ist vergleichbar mit der Notwen digkeit der "non-contact mode" (kontaktlosen) AFM-Bildgebung zur Visualisierung
von cyclodextrinbasierten kolloidalen Nanokugeln. (Sommer et al.,
Supramol. Chem., 1993, vol. 3, 19). Die Größe der erzeugten Nanokugeln
kann zwischen 50 und 500 nm variiert werden, mit einer allgemeinen
Größe zwischen
90 und 200 nm. Solche Größenänderungen
sind mit den oben angeführten
Verfahren erzielbar.
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Bei
der Verwendung der calix[n]arenbasierten Nanokugeln können hohe
bis sehr hohe Beladungsfaktoren eingebrachter Moleküle erzielt
werden, beispielsweise sind Beladungsfaktoren von 1 bis 25% leicht
zu erreichen. Eine derartige Beladung in der Matrix gestattet: a)
den Transport von Molekülen,
die in wässrigen Systemen
unlöslich
sind, b) den Schutz solcher Moleküle vor dem Abbau durch chemische
oder biologische Prozesse, c) die Veränderung der Kinetik des Transports
und der Verfügbarkeit
eingebrachter Moleküle
in kosmetischen Anwendungen.
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Versuche
haben keinerlei sichtbare Zytotoxizität oder hämolytische Wirkungen der hier
angegebenen calix[n]arenbasierten Nanokugeln, der Ausgangscalix[n]arene
und der Derivate auf der Zellebene ergeben. (Perret, F., Shahgaldian,
P. et al., International Symposium an Supramolecular Chemistry,
Fukuoka, 2000).
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Die
erfindungsgemäßen Nanokugeln
können
innerhalb ihrer Matrix ein oder mehrere aktive Moleküle enthalten,
beispielsweise Retinal, β-Karotin,
Menthol oder andere kosmetisch anwendbare Moleküle. Einzelheiten sind oben
beschrieben worden.
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Es
wird angenommen, dass die Calixarenverbindungen den Wirkstoff (falls
dieser Wirkstoff in der inneren Phase der Dispersion enthalten ist)
mittels zweier Mechanismen einschließen: Zum ersten sind Partikel des
Wirkstoffs einfach von einer kugeligen Hülle aus einem Calixarennetzwerk
umgeben, aber zusätzlich
werden spezifische Bestandteile des Wirkstoffs von den molekularen
Hohlräumen
der Calixarenmoleküle
gehalten und/oder durch sekundäre
chemische oder physikalische Kräfte
wie Wasserstoffbrücken
und Van-der-Waals-Kräfte
festgehalten.
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Demgemäss wird
der Wirkstoff von den Calixarennetzwerken recht stark festgehalten.
Die Freisetzung von Wirkstoff unterliegt einer oder mehrerer der
folgenden Maßnahmen:
- 1) Erhöhung
der Temperatur: Wenn die Temperatur der Nanodispersion erhöht wird,
z. B. auf 60°C,
so nimmt die Freisetzung des Wirkstoffs zu.
- 2) Veränderung
des pH-Werts: Bei sinkendem pH steigt die Freisetzungsgeschwindigkeit
drastisch. Dies ist höchstwahrscheinlich
auf die Zerstörung
von Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen dem Calixaren und dem Wirkstoff (s. oben) und auf das Aufbrechen
des Calixarennetzwerks zurückzuführen. Das
pH kann, sofern möglich,
auf pH 3,0 bis 2,5 oder 2,0 gesenkt werden.
- 3) Umgebungseinflüsse:
Wenn die Dispersion mit der Umgebung in Kontakt tritt, auf die der
Wirkstoff anzuwenden ist, beispielsweise auf die menschliche Haut,
wenn die Dispersion kosmetisch ist und einen kosmetischen Wirkstoff
enthält,
so beschleunigen die Ausscheidungen der Haut oder die Anwesenheit
bestimmter Aminosäuren
in den Proteine die Freisetzung des Wirkstoffs durch chemische und/oder
physische Anziehung; die äußere Phase
der Dispersion wird verändert,
und das Gleichgewicht der Dispersion ändert sich.
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Allgemein
beeinflusst jede Veränderung
des Gleichgewichts der Dispersion die Freisetzungsgeschwindigkeit
des Wirkstoffs.
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Andererseits
weisen die neuen calixarenbasierten Nanopartikel, die als kolloidale
Dispersionen vorliegen, eine unerwartet hohe Langzeitstabilität in verdünnten Salzlösungen auf.
Beispielsweise bleiben diese Dispersionen in der Anwesenheit von
Natriumsulfat, Natriumacetat, Natriumbicarbonat, Kaliumchlorid,
Kaliumdihydrophosphat und Kaliumiodid bei Raumtemperatur und bei
40°C mehr
als 250 Tage stabil, und zwar bis zu Salzkonzentrationen zwischen
10–4 und
10–2,
in einigen Fällen
bis zu 10–1 mol/l.
Eine Partikelvergrößerung,
die als partielle Aggregation interpretiert werden kann, ist vor
der Zerstörung
des Kolloids durch Ausfällung
zu beobachten.
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Wie
bereits oben erwähnt,
sind die neuen Nanopartikel-Dispersionen
in einer Vielzahl von Gebieten anwendbar. Bevorzugt sind Anwendungen
in der Kosmetik, Medizin, Landwirtschaft (Pflanzenschutz) und in der
Lebensmit telindustrie. Die Toxizität der neuen Zusammensetzungen
wurde nach drei Verfahren gestestet:
Erstens wurden phosphorylierte
p-Acylcalix[4]arene mit Vinblastin als Wirkstoff an menschlichen
Lymphoblastzellen gestestet. Es wurden Viabilitätswerte zwischen 91 und 97%
ermittelt.
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Zweitens
wurde p-Dodecanoyl-calix[4]aren an embryonalen Insektenzellen (trichiopusia
ni) gestestet. Es wurden Viabilitätswerte von über 80%
ermittelt.
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Drittens
wurden hämolytische
Tests mit fünf
verschiedenen p-Acylcalix[4]arenen an menschlichen Blutzellen durchgeführt. Die
Freisetzung von Hämoglobin,
die eine Hämolyse
anzeigt, wurde bestimmt. In allen fünf Fällen wurde bei Calixarenkonzentrationen
zwischen 15 und 150 mg/l bei 37°C
während
30 Minuten keine Anwesenheit von freiem Hämoglobin festgestellt.
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Somit
genügen
die neuen Zusammensetzungen durch die vollständige Ungiftigkeit (die Resultate
der Tests mit embryonalen Insektenzellen kann nicht als Hinweis
auf die Toxizität
bei menschlichen Zellen gelten, weist jedoch an sich auf eine außerordentlich
geringe Toxizität
hin) den vorausgehenden Anforderungen für medizinische und alle anderen
Anwendungen beim Menschen vollständig.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung wird mit den folgenden Beispielen illustriert, die die
Erfindung in keiner Weise einschränken sollen:
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Teil I Herstellung p-substituierter Calixarene
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Beispiel A
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Synthese
von Hexa-p-dodecanoylcalix[6]aren Unter Stickstoffatmosphäre wurden
3 g (4,7 mmol) Calix[6]aren, 7,2 g (7 Val) Dodecanoylchlorid und
6,3 g (10 Val) wasserfreies Aluminiumchlorid unter wasserfreien Bedingungen
zu 200 ml trockenem Nitrobenzol zugegeben. Die tieforange Lösung wird
während
20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Reaktion
gestoppt, indem das Reaktionsgemisch auf 1 kg Eis gegossen wird.
Das Reaktionsprodukt wird mit Chloroform extrahiert, danach mit
500 ml 1M Salzsäure,
2'500 ml 1M NaCl-Lösung und
2'500 ml entionisiertem
Wasser gewaschen. Die organische Phase wird auf Magnesiumsulfat
getrocknet und das Lösungsmittel
unter Vakuum bis auf ein Endvolumen von 50 ml verdampft. Der braunorange
Rückstand
wird zu 500 ml Methanol zugegeben, und der feine Niederschlag wird
abgefiltert und unter Vakuum getrocknet. Das so erhaltene weiße Pulver
wird mittels NMR analysiert und die Struktur des Hexa-p-dodecanoylcalix[6]arens
bestätigt.
Ausbeute: 50%.
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Mit
geänderten
Anteilen der Calixarenkomponente und unter Anwendung der gleichen
Reaktionsbedingungen und Arbeitstechniken wurden andere p-Dodecanoylcalixarene
und andere p-Acylcalixarene mit einer Ausbeute zwischen 50 und 85%
erhalten.
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Teil II Herstellung der Nanokugel-Zusammensetzungen
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Beispiel 1: Herstellung einer Nanopartikel-Dispersion
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Dieses
Beispiel illustriert die typische Arbeitstechnik zur Herstellung
von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
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Die
Herstellung von durch Ankoppeln einer Acylkette mit 12 Kohlenstoffatomen
in der para-Stellung an die phenolische Hydroxylfunktion modifizierten
Calixarenen ist beispielsweise in Shahgaldian et al. (a. a. O) beschrieben.
Siehe auch Beispiel A oben.
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Tetra-p-dodecanoylcalix[4]aren
wird in einem geeigneten Lösungsmittel
gelöst,
im Fall des vorliegenden Beispiels Tetrahydrofuran, um die Phase
(2) zu erzeugen (3 ml). Die Phase (2) wird unter magnetischem Rühren einer
wässrigen
Phase (3) (100 ml) zugegeben. Das Medium wird durch die Bildung
von Nanokugeln aus modifiziertem Calix[4]aren sofort opaleszierend.
Die mittlere Größe der Nanokugeln,
gemessen mit einem Laserstrahl-Diffraktometer
(4700C von Malvern), beträgt
150 nm bei einem mittleren Streuungsindex von 0,1.
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Die
Suspension kann unter vermindertem Druck auf das gewünschte Volumen
konzentriert werden, beispielsweise auf ca. 10 ml.
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Das
Aussehen der Nanokugel-Suspension bleibt nach längerem Stehen (12 Monate) unverändert, und es
gibt insbesondere keine Anzeichen einer irreversiblen Sedimentation
oder einer Größenänderung
der Nanokugeln.
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Beispiel 2: (Variante von Beispiel 1)
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch indem die wässrige Phase
(3) zur Tetrahydrofuranphase (2) zugegeben wird. Die erhaltene Nanokugel-Dispersion
weist die gleichen Eigenschaften auf wie im Beispiel 1 beschrieben.
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Beispiel 3: (Variante von Beispiel 1)
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch indem die Tetrahydrofuranphase
(0,5 ml) ohne Rühren
des Mediums zur wässrigen
Phase (10 ml) zugegeben wird. Die erhaltenen Nanokugeln sind 145 nm
groß und
weisen einen mittleren Streuungsindex von 0,11 auf.
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Beispiel 4: (Variante von Beispiel 1)
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch unter Zugabe eines
oberflächenaktiven Stoffs
(Tween, 0,1–1%
v/v) zur wässrigen
Phase. Die erhaltenen Nanokugeln sind 150 nm groß und weisen einen mittleren
Streuungsindex von 0,3 auf.
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Beispiel 5:
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Sterile Herstellung von Nanokugeln
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, und die erhaltene Suspension
aus Nanokugeln wird darauf in einem Autoklav bei 120°C während 15
Minuten sterilisiert. Die mittlere Partikelgröße bleibt nach der Sterilisierung
im Wesentlichen unverändert.
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Beispiel 6:
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Gefriergetrocknete Herstellung von Nanokugeln
aus 12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifiziertem
Calix[4]aren
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, und die Suspension wird
nachfolgend gefriergetrocknet. Die Zugabe eines Kryoprotektors (Maltose,
Trehalose und dergleichen) ist nicht wesentlich. Die unmittelbar
nach dem Gefriertrocknen gemessene mittlere Partikelgröße bleibt
unverändert.
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Beispiel 7:
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Herstellung von Nanokugeln aus para-Galactosyl-O-5-Kohlenstoffatom-modifiziertem
Calix[4]aren
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei das 12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifizierte
Calix[4]aren durch para-Galactosyl-O-5-Kohlenstoffatommodifiziertes
Calix[4]aren ersetzt wird. Die mittlere Größe der Nanokugeln beträgt 110 nm
bei einem mittleren Streuungsindex von 0,1.
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Diese
Nanokugeln können
wie die im Beispiel 1 angegebenen im Autoklav sterilisiert und gefriergetrocknet
werden.
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Beispiel 8:
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Herstellung 12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifiziertem
Calix[6]aren
-
Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei das Calix[4]arenderivat
durch ein Calix[6]arenderivat mit 6 phenolischen Einheiten ersetzt
wird. Die mittlere Größe der gebildeten
Nanokugeln beträgt
145 nm bei einem hohen Polydispersitätsindex von 0,21.
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Beispiel 9:
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Herstellung 12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifiziertem
Calix[8]aren
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei das Calix[4]arenderivat
durch ein Calix[8]arenderivat mit 8 phenolischen Einheiten ersetzt
wird. Auch unter diesen Bedingungen wurden stabile Nanokugeln erhalten.
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Beispiel 10:
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Herstellung gemischter Nanokugeln aus
12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifiziertem Calix[n]aren mit n =
4, 6 und 8.
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei das Calix[4]arenderivat
durch ein Gemisch aus 12-Kohlenstoffatom-Acylketten-modifizierten
Calix[n]arenen im Verhältnis
1:1 für
binäre
Gemische und 1:1:1 und 1:1:2 für
tertiäre
Gemische ersetzt wird.
Anteil
in 1 | Anteil
in 2 | Anteil
in 3 | Durchmesser
in nm | Polydispersitätsindex |
1/3 | 1/3 | 1/3 | 122 | 0.31 |
1/2 | - | 1/2 | 176 | 0.26 |
- | 1/2 | 1/2 | 140 | 0.25 |
1/2 | 1/4 | 1/4 | 155 | 0.20 |
1/4 | 1/4 | 1/2 | 140 | 0.37 |
Tabelle
1: Durchmesser und Polydispersitätsindex
für Suspensionen
gemischter Nanokugeln (1: para-Dodecanoylcalix[4]aren, 2: para-Dodecanoylcalix[6]aren
und 3: para-Dodecanoylcalix[8]aren).
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Beispiel 11:
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Stabilität der Calix[4]aren-Nanokugeln
bei unterschiedlichen Innenstärken
-
Das
Verfahren wird durchgeführt
wie im Beispiel 1 angegeben. Nach dem Konzentrieren der Suspension
modifizierter Calix[4]aren-Nanokugeln auf ein Volumen von 10 ml
werden zunehmende Mengen an Natriumchlorid zugegeben. Die Nanokugelsuspension
ist völlig
stabil, wenn die Natriumchloridkonzentration der physiologischen
Innenstärke
(0.154 M) entspricht, und die Stabilität bleibt bei Konzentrationen
bis zu einer Größenordnung über der
physiologischen Innenstärke
erhalten.
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Beispiel 12:
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Stabilität der Calix[n]aren-Nanokugeln
in Anwesenheit eines sauren oder basischen Mediums
-
Das
Verfahren wird durchgeführt
wie im Beispiel 1 angegeben. Nach dem Konzentrieren der Calixaren-Nanokugelsuspension
auf ein Volumen von 10 ml werden dem Medium schrittweise zunehmende
Mengen an Salzsäure
(1 Mol pro Liter) oder Natronlauge (1 Mol pro Liter) zugegeben.
Die Nanokugelsuspension ist bei einem pH im Bereich von 1 bis 12
völlig
stabil.
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Beispiel 13:
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Temperaturbeständigkeit der Calix[n]aren-Nanokugeln
-
Das
Verfahren wird durchgeführt
wie im Beispiel 1 angegeben. Nach dem Konzentrieren der Calix[n]aren-Nanokugelsuspension
auf ein Volumen von 30 ml werden drei Chargen von jeweils 10 ml
hergestellt. Die Chargen werden auf 3°C, 20°C bzw. 40°C gebracht. Die Suspensionen
bleiben zeitlich stabil und zeigen nach einer Lagerung während mindestens
12 Monaten weder eine irreversible Sedimentation noch eine Größenänderung
der Nanokugeln.
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Beispiel 14:
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Herstellung von Nanokugeln in Anwesenheit
eines Salzes
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Das
Verfahren wird durchgeführt
wie im Beispiel 1 angegeben, in diesem Fall wird eine Lösung von 0,154
Mol/Liter Natriumchlorid als Phase (3) verwendet. Die unter physiologischer
Innenstärke
hergestellten Nanokugeln haben eine Größe von 160 nm bei einem Streuungsindex
von 0,15 nm.
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Die
Suspension bleibt zeitlich stabil und zeigt nach einer Lagerung
während
12 Monaten weder eine irrever sible Sedimentation noch eine Größenänderung
der Nanopartikel.
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Beispiel 15:
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Zugabe eines Nichtlösungsmittels zur Lösungsmittelphase
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, das Calix[n]aren wird
jedoch in einem Tetrahydrofuran-Wasser-Gemisch
(90/10 v/v) anstatt in reinem Tetrahydrofuran gelöst. Die
Anwesenheit eines geringen Anteils eines Nichtlösungsmittels für das Calix[n]aren
in einem Lösungsmittel
bewirkt eine mittlere Größe der erhaltenen
Nanokugeln von 160 nm bei einem mittleren Streuungsindex von 0,11.
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Beispiel 16:
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Beständigkeit
der Calix[n]aren-Nanokugeln gegenüber Ultraviolettstrahlung
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt. Nach dem Konzentrieren
der Suspension aus Calixaren-Nanokugeln auf ein Volumen von 30 ml
wird die erhaltene Suspension aus Calix[n]aren-Nanokugeln während 12
Stunden mit Ultraviolettstrahlung (254 nm) behandelt, wobei die
Größe der Nanokugeln
nach der Bestrahlung 160 nm bei einem mittleren Streuungsindex von
0,15 beträgt.
Die Suspension bleibt zeitlich stabil und zeigt nach einer Lagerung
während
12 Monaten weder eine irreversible Sedimentation noch eine Größenänderung
der Nanokugeln.
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Beispiel 17:
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Herstellung von Nanokugeln in Anwesenheit
eines lipophilen Wirkprinzips
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch werden 5 mg α-Carotin
zur Lösungsmittelphase
(2) zugegeben. Die erhaltenen Nanokugeln haben eine mittlere Größe von 145
nm bei einem Streuungsindex von 0,12. Die Analyse mittels sichtbarer
Spektroskopie zeigt eine Einlagerung des α-Carotins von > 70%. Bei einer Lagerzeit
von über
6 Monaten erfolgt kein Abbau des α-Carotins.
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Beispiel 18:
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Herstellung von mentholhaltigen Nanokugeln
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch werden 10 mg Menthol
zur organischen Phase zugegeben. Die erhaltenen Nanokugeln haben
eine mittlere Größe von 100
nm und einen mittleren Streuungsindex von 0,14.
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Beispiel 19:
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Herstellung von Nanokugeln in Anwesenheit
einer Aminosäure
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Das
Verfahren wird wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch werden 10 mg einer
Aminosäure,
beispielsweise Alanin, zur wässrigen
Phase zugegeben. Die erhaltenen Nanokugeln haben eine mittlere Grösse von 130
nm und einen mittleren Streuungsindex von 0,12.
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Beispiel 20:
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Herstellung
eines wässrigen
Gels
Phase
A | Wasser | 84,5% |
| Carbomer | 0,5% |
| Propylenglykol | 15% |
Phase
B | Calixaren-Nanokugeln | 0,01%
bis 10% |
-
Die
Phase A wird hergestellt durch Erhitzen aller Bestandteile auf 80°C, worauf
das Gemisch homogen ist. Phase B wird unter kräftigem Rühren beigegeben. Das Gel bildet
sich beim Abkühlen
des Gemischs. Die Grösse
der Nanokugeln wird wegen der Viskosität des entstandenen Gels nicht
gemessen. Nach zweimonatiger Lagerung bei 4°C, 20°C und 40°C ist jedoch keine sichtbare
Sedimentation zu beobachten.
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Wie
oben beschrieben sind die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen
calix[n]arenbasierten Nanokugeln für eine große Vielfalt von Anwendungen
verwendbar. So können
die erfindungsgemäßen Nanokugeln
beispielsweise für
folgende Zwecke verwendet werden:
- – als Modifikatoren
der Freisetzungskinetik von Wirkstoffen zur Hautbehandlung wie beispielsweise
Retinal,
- – als
Wirkstoffe für
die Stabilisierung empfindlicher Moleküle wie beispielsweise α-Carotin,
um die Haltbarkeit von Kosmetikprodukten zu verlängern,
- – als
Wirkstoffe zur Veränderung
der Aromaeigenschaften von Kosmetikprodukten,
- – als
Modulatoren der oberflächenaktiven
Eigenschaften von in Kosmetikprodukten verwendeten Emulgatoren,
- – als
Modulator der Hautpenetration von Wirkmolekülen,
- – als
Dispergiermittel für
Kosmetikprodukte zur Verwendung in Sonnen-Hautcremes,
- – als
Modifikatoren der Pharmakokinetik der Freisetzung aktiver Verbindungen
wie Cisplatin für
die Behandlung von Krebs,
- – als
Wirkstoffe für
die Stabilisierung empfindlicher Moleküle wie beispielsweise gegenüber Lipasen
empfindlichen Fettestern, um die Biostabilität von Pharmaprodukten zu verlängern,
- – als
Wirkstoffe zur Geschmacksveränderung
oral verabreichter Arzneien,
- – als
Modulatoren zur Verminderung der in Kochverfahren verwendeten Menge
an Aromastoffen,
- – als
Stabilisatoren zur Erhöhung
der Lebensdauer von oxidationsempfindlichen Molekülen zur
Verwendung in der Lebensmittelindustrie,
- – als
kontrolliertes Abgabesystem für
die Freisetzung oral verabreichter Arzneien bei Magen-pH,
- – als
Träger
für den
selektiven Transport von Medikamenten an bestimmte biologische Orte,
- – als
Mittel zur kontrollierten Freisetzung von Pheromonen für "grüne" Insektizidbehandlungen.
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Ihre
Verwendung in anderen Gebieten ergibt ähnliche Wirkungen. So sind
die Nanopartikel beispielsweise mit Lipoproteinen mischbar. Die
Plasmamembran lebender Zel len ist ein wesentlicher Bestandteil der Strukturintegrität von Zellen.
Diese Membran enthält
Lipide und Proteine und wirkt nicht nur als physikalische Schranke
zur Trennung unterschiedlicher Abteilungen, sondern auch als Substrat
für eine
große
Anzahl von Reaktionen, die in deren Innerem ablaufen.
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Diese
Membranlipide sind amphiphile Moleküle. Diese Affinitätsambivalenz
befähigt
sie zur Adsorption an Grenzflächen
und zur Selbstassemblierung in wässrigen
Medien.
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Die
oben beschriebenen Nanopartikel bildenden Calixarenderivate, d.
h. am oberen Rand mit langkettigen Fettsäuren acylierte und am unteren
Rand selektiv phosphorylierte Calixarene, insbesondere die Calix[4]arene,
zeigen eine hohe Kristallisationstendenz, während natürliche Phospholipide nur eine
geringe Fähigkeit
zur Kristallisation aufweisen. Bei unserer Arbeit wurden zahlreiche
Kristalle der substituierten Calixarene erhalten.
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Die
Untersuchung der Langmuir-Monomolekularschichten hat gezeigt, dass
unsere synthetischen Calixarene, substituiert wie oben beschrieben,
mit natürlichen
Phospholipiden (DPPA und DPPC) sehr gut mischbar sind. Die in Wasser
gebildeten Selbstassemblierungen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung
und Atomkraftmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass
sich diese supramolekularen Assemblierungen von den allgemein von
Lipiden gebildeten Strukturen unterscheiden; tatsächlich sind
die neuen Strukturen weder Mizellen noch Liposome (G. Gregoriadis,
B. E. Ryman, "Liposomes
as carriers of enzymes or drugs",
Biochem. J. 124 (1971), 58P), sondern Nanopartikel. Diese Nanopartikel
unterscheiden sich von den anderen vorgenannten Strukturen durch
ihre hohe mechanische Festigkeit und ihre Langzeitstabilität. Die neuen
erfindungsgemäßen Strukturen
können
daher auch für
das Löslichmachen
von Membranproteinen und für
die Rekonstitution von biomimetischen Systemen verwendet werden,
bei welchen der Vorgang der Kristallnukleation bevorzugt ist.