DE60132923T2

DE60132923T2 - Gewebekultur und -gerät

Info

Publication number: DE60132923T2
Application number: DE60132923T
Authority: DE
Inventors: R. A. Medical Scho BROWN; G. Inst. of Ort Stanmore BLUNN
Original assignee: University College London
Current assignee: University College London
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2021-12-20
Also published as: ATE386795T1; AU2002216213A1; DE60132923D1; ES2301519T3; EP1383863A2; PT1383863E; US20040058440A1; WO2002050242A3; EP1383863B1; DK1383863T3; WO2002050242A2; GB0031089D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gewebekulturverfahren und eine Gewebekulturvorrichtung. Genauer gesagt betrifft sie Aspekte der Langzeitkultur, sowie der Steuerung künstlich gezüchteter Gewebe.
Zellen können in vitro für eine bestimmte Funktion oder zu Studienzwecken gezüchtet werden, indem die Zellen auf ein Substrat geimpft werden und den Zellen die für das Wachstum erforderliche(n) Umgebung und Nährstoffe bereitgestellt werden.
So beschreibt die US-A-5981211 z. B. die Bildung extrakorporalen künstlichen Lebergewebes, und V. C. Mudera et al., Cell Motility and the Cytoskeleton, Band 45, 1–9 (2000), sowie R. A. Brown et al., J. of Cellular Physiology, Band 175, 323–332 (1998), beschreiben die Wirkungen verschiedener Lastregime auf das Wachstum von Fibroblasten.
Es besteht jedoch ein Bedarf für die Entwicklung weiterer Verfahren zum In-vitro-Züchten von Gewebe, insbesondere von Bindegewebe-Arten, die reich an Kollagen sind.
In vivo wachsen viele Zellen und erfüllen ihre Funktion als Reaktion auf spezifische mechanische Auslösesignale (viele Weichgewebearten und Organe existieren hauptsächlich unter Zugbeanspruchung). Auf Sehnenzellen wirken z. B. hauptsächlich Zugkräfte. Ein weiteres Beispiel sind Endothelzellen, die auf der inneren Oberfläche von Blutgefäßen wachsen. Diese Zellart reagiert auf die Scherkräfte, die auf sie durch den Blutfluss entlang des Blutgefäßes ausgeübt werden. Auf der anderen Seite wachsen Knorpelzellen in vivo unter externer Kompression.
In vivo werden ebenfalls Nährstoffe für die Zellen durch den mikrovaskulären Fluss zugeführt, wohingegen in vitro die Nährstoffe normalerweise durch Diffusion aus einem (typischerweise flüssigen) Kulturmedium zugeführt werden.
US 6121042 offenbart Vorrichtungen und Verfahren zur In-vivo-Stimulation von Bedingungen während der Beimpfung und des Züchtens dreidimensionaler Gewebe konstrukte. Die Flüssigkeitsströmung wird z. B. durch eine Pumpe bereitgestellt. WO 94/25584 offenbart eine Kartusche zum Züchten von Zellen, die Hohlfasern enthalten. Die Oberfläche der Kartusche kann mit Fibronectin beschichtet sein.
Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Erkenntnis, dass die geeigneten mechanischen Auslösesignale auf in vitro wachsende Zellen angewandt werden sollten und dass diese Auslösesignale auch verwendet werden können, um die Zufuhr von Nährstoffen zu den Zellen zu verbessern.
Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum In-vitro-Züchten von Gewebe nach Anspruch 1 bereit.
Tatsächlich oszilliert die Last und führt zu einer entsprechenden oszillierenden Belastung im Substrat. Die wachsenden Zellen reagieren auf diese Belastung, so dass das von den Zellen erlebte mechanische Auslösesignal durch Steuerung der Last gesteuert werden kann, die auf das Substrat aufgebracht wird (Laststeuerung), oder durch Steuerung der Verformung des Substrats (Verformungssteuerung). Jedenfalls wird insgesamt das Kulturmedium als Resultat eines jeden Lastzyklus entlang dem Strömungskanal bewegt, was eine Zufuhr von frischem Kulturmedium zu den wachsenden Zellen ermöglicht, z. B. durch das Einwegventil. Dies geschieht, da die Bewegung des Kulturmediums in eine Richtung, entsprechend einem halben Lastzyklus, inhibiert ist, was während der anderen Hälfte des Lastzyklus zu einer Strömung des Kulturmediums in die entgegengesetzte Richtung führt. Auf diese Art und Weise führt die variierende Last gleichzeitig sowohl zu mechanischen Auslösesignalen als auch zu einer Erneuerung des Kulturmediums.
Bei den Zellen kann es sich z. B. um Fibroblasten, Chondrozyten, Knochenzellen, Endothelzellen, Gefäßzellen, neurale Zellen, Epithelzellen, sekretorische Zellen, transfizierte Zellen, Stammzellen oder Muskelzellen handeln. Als Resultat der mechanischen Auslösesignale können die Zellen dazu induziert werden, Bindegewebematerial mit spezifischen und nützlichen Eigenschaften zu produzieren. Dieses Material kann z. B. Kollagen sein, bei dem die Kollagenproteinfilamente in Richtung der Substratverformung angeordnet sind. Andere Bindegewebematerialien umfassen: Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen, Vitronectin, Laminin, Kerstin und gewisse natürliche Polysaccharide, wie z. B. Hyaluronan.
Die Häufigkeit der Lastzyklen liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 60 Zyklen pro Stunde, noch bevorzugter von 0,5–10 Zyklen pro Stunde. Die Häufigkeit kann mit den Veränderungen der Steifheit des Substrats variieren. Die Substrat-Belastungsvariation (d. h. der Unterschied zwischen der maximalen und der minimalen Substratverlängerung dividiert durch die Substratlänge), die durch jeden Lastzyklus hervorgerufen wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05% bis 10% und noch bevorzugter im Bereich von 0,1% bis 1%.
Das Ausmaß der Nettoverformung des Substrats kann im Laufe der Zeit auch erhöht oder stufenweise erhöht werden, um das Substrat zu verlängern, d. h. eine zunehmende Belastung kann über die zyklische Belastung gelagert werden. Die Netto-Substratbelastung wird vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 0,001% bis 0,1% pro Stunde erhöht, noch bevorzugter im Bereich von 0,005% bis 0,05% pro Stunde. Als Resultat der Erhöhung der Netto-Substratbelastung liegt die Gesamtextension (d. h. die endgültige verformte Länge/ursprüngliche Länge) des Substrats während eines vollständigen Gewebewachstumsprogramms vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50% und noch bevorzugter im Bereich von 5 bis 20%.
In Schritt (ii) kann das Lastregime als Reaktion auf eine sich verändernde mechanische Eigenschaft (z. B. Steifheit) des Substrats variiert werden. Mit der Produktion von Gewebe durch Zellen kann sich z. B. das Substrat versteifen. Die zunehmende Steifheit kann durch einen innewohnenden oder einen Fernsensor erfühlt werden und zur Variierung des Lastmusters verwendet werden.
Das Ausgangssubstrat kann aus einem Material wie z. B. einem synthetischen Polymer oder einem aggregierten natürlichen Makromolekül (Protein oder Polysaccharid etwa) hergestellt sein. Es können auch Beschichtungen natürlicher Zellbindungsproteine auf dem Substrat verwendet werden.
Das Substrat besteht vorzugsweise aus aggregiertem oder fibrösem Fibronectin oder aus fibronectinhältigen Zusammensetzungen (z. B. Fibronectin-Fibrin-Zusammensetzungen). Diese Substanzen fördern die Zellbindung und können als form- und dehnbare Materialien gebildet werden, die wesentliche Verlängerungen aushalten können. Alternativ dazu oder zusätzlich dazu kann das Substrat zumindest eines der Folgenden umfassen: Fibrin, Fibrinogen, Laminin, vitronectinbasierte Materialien und Kollagen.
Das Substrat kann in der Lage sein, durch die Einführung einer wirksamen Menge eines Abbaumittels in das Substrat, z. B. durch das Kulturmedium, aktiv abgebaut zu werden. Das Material des Substrats kann z. B. Ziele für das Abbaumittel enthalten, die das Substrat bei Einwirkung durch das Abbaumittel zu Komponenten abbauen, die durch die Strömung des Kulturmediums abtransportiert werden können. Solche Ziele können Peptidsequenzen sein, die auf eine spezifische Proteasespaltung empfindlich reagieren, so dass die Addition der geeigneten aktivierten Protease zum Kulturmedium in einem geeigneten Stadium der Gewebeentwicklung das Substrat in solche Komponenten spaltet. Alternativ dazu kann es sich bei den Peptidsequenzen um Proenzyme handeln, die aktivierbar sind, um das Substrat abzubauen. In jedem Fall können mit diesem Ansatz potentielle Probleme nachteiliger, allergischer, infektiöser oder toxischer Reaktionen auf das Substrat vermieden werden, wenn das Gewebe anschließend für eine In-vivo-Implantation verwendet wird. Für auf Fibronectin basierende Materialien ist eine geeignete Proenzym-Peptid-Sequenz Plasminogen, das aktivierbar ist (durch einen Aktivator, wie z. B. einen Urokinase-Plasminogen-Aktivator oder einen Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator), um Plasmin zu bilden, das wiederum Fibronectin abbaut. Derselbe Ansatz kann bei Fibrin, Fibrinogen, Laminin oder vitronectinbasierten Materialien verwendet werden sowie auch bei manchen Kollagenarten.
Nicht-physiologische Polymere, rekombinante Proteine oder Neoproteine, die zu einem passiven Abbau in der Lage sind (d. h. ohne die Addition spezifischer Mittel, wie z. B. aktivierter Proteasen), können ebenfalls verwendet werden, um das Substrat zu bilden. Daher ist ein anderes mögliches Material für das Substrat ein nicht-phy siologisches Polypeptid, das in vivo antigen sein könnte, normalerweise jedoch vollständig resorbiert wird, bevor das Gewebe für eine medizinische Anwendung verwendet wird.
Synthetisches Substratmaterial, das nicht für einen Abbau vor der In-vivo-Implantation gedacht ist, kann z. B. RGDS-Zellbindungspeptidsequenzen zur Förderung der Zellbindung, Zelladhäsion und/oder Zellmigration umfassen.
Das Substrat besitzt vorzugsweise eine Vielzahl parallel laufender Strömungskanäle. Das Substrat kann z. B. eine Anordnung oder ein Bündel im Wesentlichen paralleler länglicher Elemente umfassen, die im Wesentlichen parallel zur Richtung der Lastanlegung angeordnet sind, so dass sich das Kulturmedium entlang der Zwischenräume (d. h. Strömungskanäle) zwischen den länglichen Elementen bewegt und quer zu den Elementen diffundiert, um den wachsenden Zellen Nährstoffe zuzuführen.
In einer Ausführungsform bestehen die länglichen Elemente aus im Wesentlichen festen Fasern (z. B. aus Fibronectin), wobei das Zellwachstum auf der Oberfläche der Fasern auftritt. Diese Fasern besitzen z. B. einen Durchmesser im Bereich von 5–500 μm.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die länglichen Elemente einen im Wesentlichen festen Kern (z. B. aus Fibronectin) und eine relativ formbare Gelbeschichtung (z. B. aus Fibrin, Kollagen, Proteoglycan, Glycosaminoglycan, wie z. B. Hyaluronan, Polysaccharid oder einem synthetischen bioresorbierbaren Polymer, wie z. B. Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polycaprolacton). Der Gesamtdurchmesser des Kerns plus Gelbeschichtung kann wiederum im Bereich von 5–500 μm liegen, der feste Kern kann jedoch einen Durchmesser von nur 20–50 nm aufweisen. Das Zellwachstum kann auf der Oberfläche und/oder innerhalb der Gelbeschichtung auftreten. Die Gelbeschichtung erhöht die Gesamt-Formbarkeit des Substrats und ermöglicht dadurch größere Substratverformungen. Dies kann wiederum die Strömung des Kulturmediums entlang der Zwischenräume zwischen den länglichen Elementen erhöhen.
In einer anderen Ausführungsform bestehen die länglichen Elemente aus feinen Röhrchen (wie z. B. in S. I. Harding et al., The Scaleable Preparation of Fibronectin-Based Tubes, Suitable as Tissue Engineering Scaffolds, 1. NELSIC-Zusammentreffen, UCL, London (September 2000), sowie S. I. Harding, Doktorarbeit, University College London (1999), beschrieben). Hier kann sich das Kulturmedium auch entlang der Innenseiten der Röhrchen bewegen, und das Zellwachstum kann auf den inneren Oberflächen und/oder den äußeren Oberflächen der Röhrchen auftreten. Typischerweise werden diese röhrenförmigen länglichen Elemente aus Fibronectin, Fibrin und/oder Fibrinogen gebildet. Sie können einen internen Durchmesser von 0,1–2 mm, vorzugsweise von 0,1–1 mm, aufweisen. Die Wanddicke kann im Bereich von 5–250 μm liegen.
Das Substrat kann weiters ein Gemisch länglicher Elemente verschiedener Typen umfassen (z. B. ein Gemisch aus beliebigen zwei oder drei der oben genannten Ausführungsformen).
In vivo ist ein Massenübergang aus dem Gefäßsystem zu Zellen über eine Distanz von mehr als etwa 0,4 mm nicht ausreichend, um zahlreiche Zelltypen zu unterstützen, und auf ähnliche Art und Weise können Nährstoffe in vitro allgemein nicht ausreichend durch eine Gewebedicke von mehr als etwa 0,4 mm perfundieren, um Zellen und Zellwachstum zu unterstützen. Trotzdem benötigen manche medizinische Anwendungen künstlich gezüchtetes Gewebe, das eine größere Dicke als diese aufweist, und durch die Bereitstellung eines Substrats, das eine Anordnung oder ein Bündel länglicher Elemente darstellt, ist es möglich, relativ dichtes Gewebe bis auf Größen zu züchten, die signifikant größer als die maximale Perfusionstiefe sind. Im Wesentlichen ist es so, dass die mehrfachen Zwischenraum-Strömungskanäle für das Kulturmedium, die durch die Anordnung oder das Bündel gebildet werden, In-vivo-Gefäßsysteme imitieren, so dass, obwohl jeder Strömungskanal nur eine Perfusion von bis zu einer Radialdistanz von 0,4 mm vom Kanal unterstützen kann, die Kanäle in Kombination signifikant größere Gewebewachstums-Dicken mit Nährstoffen versorgen können.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Gewebewachstumsvorrichtung nach Anspruch 9 bereit.
Die Vorrichtung des zweiten Aspekts kann verwendet werden, um das Verfahren des ersten Aspekts durchzuführen, und kann weiters bevorzugte optionale Merkmale umfassen, die hinsichtlich des ersten Aspekts beschrieben werden.
Das Befestigungsmittel kann z. B. eine mechanische, magnetische oder klebende Befestigung zur Verbindung des Substrats mit der Lastanlegevorrichtung umfassen. Alternativ dazu kann das Befestigungsmittel nur das Substrat relativ zur Vorrichtung halten, und das Substrat kann mit magnetischen Endstücken ausgestattet sein, die durch Fernsteuerung durch ein extern aufgebrachtes elektromagnetisches Feld bewegbar sind, um das Substrat zu belasten. Das Lastanlegemittel kann eine computergesteuerte Vorrichtung, wie z. B. ein elektrischer Motor, sein. Es kann jedoch auch hydraulisch angetrieben sein. Alternativ dazu können die Kontraktionen exogen gesteuerter kontraktiler Zellen oder die Flüssigkeitsströmung durch und/oder um das Substrat verwendet werden, um die Last anzulegen.
Das Lastanlegemittel kann eine Messvorrichtung zum Messen einer Veränderung einer mechanischen Eigenschaft (z. B. Steifheit) des Substrats sowie eine Kontrollvorrichtung zum Variieren des Lastregimes als Reaktion auf die sich verändernde mechanische Eigenschaft, die durch die Messvorrichtung gemessen wird, umfassen. Die Messvorrichtung kann z. B. ein innewohnender oder ein Fernsensor für das Substrat sein.
Nun werden nur als Beispiel bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung hinsichtlich der begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 eine schematische Zeichnung einer Gewebewachstumsvorrichtung zeigt,
2 eine schematische Querschnittsansicht einer Faser zeigt, die am Anfang eines Gewebewachstumsprogramms mit Zellen geimpft ist,
3 eine schematische Querschnittsansicht der Faser aus 2 nach Belastung mit Gewebe zeigt, das um die Faser wächst,
4 eine schematische Querschnittsansicht einer anderen Faserform zeigt und
5 eine schematische Querschnittsansicht noch einer weiteren Faserform zeigt.
Für das künstliche Wachstum von Bindegewebearten kann es wichtig sein, aussagekräftige mechanische Kontroll-Auslösesignale bereitzustellen, um Gewebe zu züchten, das natürliches Gewebe so weit wie möglich imitiert. Die lokale mikromechanische Umgebung einer jeden Zelle, die in das Gewebe inkorporiert ist, beeinflusst die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf chemische Vermittler, die Morphologie und das Verhalten der Zelle und schließlich die Matrix von korrigierendem Gewebe, das von der Zelle produziert wird.
Fibroblasten und Glattmuskelzellen reagieren z. B. auf eine angelegte Belastung durch die Produktion von Kollagen, das anisotrop ist, und zwar dahingehend, dass das Kollagenprotein sowie Fibril/Faserstränge in Richtung der Belastung angeordnet werden. Dadurch wird Stress von den Zellen genommen, d. h. Stress, der auf die angelegte Belastung zurückzuführen ist, wird vom Kollagen aufgenommen, so dass weiteres von den Zellen produziertes Kollagen nicht angeordnet wird, falls nicht eine weitere Belastung aufgebracht wird.
Folglich führt die Anlegung einer statischen Belastung auf ein geimpftes Substrat lediglich zur Anordnung des anfänglich gezüchteten Gewebes. Anschließend gezüchtetes Gewebe kann nicht auf ähnliche Art und Weise angeordnet werden, es sei denn, die auf das Substrat aufgebrachte Belastung wird variiert.
Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Zufuhr von Nährstoffen zu den Zellen (sowie die Entfernung von Abfallprodukten von diesen), die das Gewebe bilden. Die Erfinder haben herausgefunden, dass diese Zufuhr durch Anlegung einer zyklisch variierenden Belastung (durch eine zyklisch variierende Last) auf das Substrat, auf dem die Zellen gezüchtet werden, gefördert werden kann, wodurch die angelegte Last dem zweifachen Zweck der Bereitstellung mechanischer Auslösesignale sowie der Erneuerung des Kulturmediums, das den Zellen Nährstoffe zuführt, dient.
1 zeigt eine schematische Zeichnung eines Teils einer Vorrichtung 10 gemäß der vorliegenden Erfindung zur In-vitro-Gewebezucht. Die Fasern 14, die mit Fibroblastenzellen 20 geimpft sind, werden parallel zueinander in einem Substratbündel 12 angeordnet (das hier mit einem rechteckigen Querschnitt dargestellt wird, es können jedoch auch andere, z. B. runde, Querschnitte verwendet werden) und durch das äußere Gehäuse 13 zusammengehalten, das z. B. aus Kollagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen oder synthetischem Polymer besteht. Das Bündel weist sich in Längsrichtung erstreckende parallele Zwischenraumlücken 15 auf, die als Strömungskanäle dienen, wobei die Lücken durch die Packungsanordnung der Fasern 14 mit rundem Querschnitt gebildet werden. Die Vorrichtung kann eine Vielzahl solcher Substratbündel enthalten.
Das Gehäuse ist auf entfernbare Art und Weise an einem Ende durch eine mechanische Befestigung 19a am Körper 23 (in 1 nur schematisch dargestellt) der Vorrichtung fixiert. Das andere Ende des Gehäuses ist auf entfernbare Art und Weise durch eine Befestigung 19b an eine Belastungsvorrichtung (nicht dargestellt) gebunden, die dem Faserbündel eine zyklische Last, L, anlegt, wobei die Last durch das Gehäuse auf das Bündel übertragen wird. Die Ladevorrichtung kann ein computergesteuerter elektrischer Motor sein.
Die zyklische Last produziert eine stufenweise zunehmende zyklische Belastung im Faserbündel. Die Häufigkeit der zyklischen Belastung ist etwa 1 Zyklus pro Stunde, und die Belastung besitzt eine Amplitude von etwa 0,5% pro Zyklus. Die maximale Belastung in anschließenden Zyklen nimmt um etwa 0,001% zu.
Das Zufuhrmittel (nicht dargestellt, es kann jedoch ein Flüssigkulturmedium-Reservoir und einen Zufuhrkanal zum Transport des Kulturmediums zum fixierten Ende des Gehäuses umfassen) führt das Kulturmedium dem fixierten Ende des Gehäuses zu, wo ein Klappenventil 21 das Eintreten des Kulturmediums in das Gehäuse ermöglicht, jedoch einen Rückfluss in die entgegengesetzte Richtung verhindert. Das Kulturmedium, das durch Bündel 12 geflossen ist, fließt aus dem anderen (sich bewegenden) Ende des Gehäuses aus.
Die Erfinder glauben, dass die zyklische Verformung des Substratbündels eine entsprechende Druckänderung in dem in den Lücken 15 enthaltenen Kulturmedium schafft. Ist der Druck relativ hoch, so verhindert das Klappenventil 21 großteils den Ausfluss des Kulturmediums aus dem fixierten Ende des Gehäuses, und Kulturmedium fließt daher aus dem sich bewegenden Ende des Gehäuses aus. Umgekehrt ermöglicht das Klappenventil 21 bei relativ niedrigem Druck das Einfließen von frischem Kulturmedium aus dem Zufuhrmittel. So entsteht insgesamt ein Nettofluss an Kulturmedium entlang der Lücken vom fixierten Ende zum sich bewegenden Ende des Gehäuses, wobei frisches Kulturmedium durch das Klappenventil dem Substratbündel zugeführt wird.
Da die Fasern relativ schmal sind (im Vergleich zur Größe des vollständigen Bündels) und jede nur einen geringen Anteil der Gesamtanzahl wachsender Zellen trägt, ist das Kulturmedium in der Lage, quer zu im Wesentlichen allen der auf dem Substrat wachsenden Zellen zu perfundieren. Im Wesentlichen bildet die Konstruktion des Faserbündels eine Anordnung paralleler „Kapillaren", entlang derer das Kulturmedium fließen kann. Die Druckänderung im Kulturmedium hilft wahrscheinlich auch bei der Verbesserung der quer verlaufenden Perfusion zu den Zellen. Das „Kapillarnetz" stellt eine starke Imitation von natürlichem Gewebe dar, was zu der Erwartung führt, dass auf diese Art und Weise gebildetes Gewebe sich bei In-vivo-Implantation gut integrieren sollte. D. h. Blutkapillaren und Nervenzellen des Wirts können vorzugsweise entlang der Kapillaren wachsen.
Das Substratbündel 12 und das Gehäuse 13 können vollständig oder teilweise in das flüssige Kulturmedium getaucht werden. Dies kann dabei helfen, das Substratbündel zu unterstützen, und, falls das Gehäuse durchlässig ist, ebenfalls bei der Zufuhr von Nährstoffen zum Substrat helfen.
Jede Faser 14 besitzt einen Durchmesser von etwa 100–200 μm und besteht aus Fibronectin, einem Material, an das viele Arten von Zellen binden und haften können. Fibronectin-Fasern sind auch in der Lage, sich auf ein Vielfaches ihrer ursprünglichen Länge zu verformen, wie z. B. von den Erfindern bereits zuvor in WO 92/13003 beschrieben.
Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass die für das Zellwachstum benötigten Nährstoffe nicht durch eine Gewebedicke von mehr als etwa 0,4 bis 1 mm angeliefert werden können, abhängig z. B. von der Dichte des Gewebes, der Zellstoffwechselaktivität etc. Daher würde, falls die Zellen z. B. auf einem flachen Substrat gezüchtet würden, die maximal mögliche Gewebedicke, die mit gesunden, reifen Zellen erhalten werden könnte, etwa 0,4 bis 1 mm betragen. In der vorliegenden Erfindung bedeutet die Bereitstellung von Strömungskanälen im gesamten Substrat, dass eine Gesamt-Gewebedicke erzielt werden kann, die signifikant höher als 0,4 bis 1 mm ist.
Die Fibronectin-Fasern sind resorbierbar, und während des Gewebewachstumsprogramms wird das Fibronectin allmählich resorbiert. Daher nimmt das wachsende Gewebe mit der Resorbierung des Fibronectins mehr und mehr der angelegten Last auf, die ursprünglich von der Faser getragen wurde. Wurde das gesamte Fibronectin resorbiert, so nimmt das Gewebe die gesamte der angelegten Last auf.
2 zeigt eine schematische Querschnittsansicht einer Faser 14, die mit Zellen 20 geimpft wurde, am Beginn eines Gewebewachstumsprogramms. 3 zeigt eine schematische Querschnittsansicht derselben Faser 14 zu einem späteren Zeitpunkt des Gewebewachstumsprogramms. Die Faser wurde in Bezug auf die Querschnittsfläche reduziert, da sie durch die Belastung verlängert wurde und ebenfalls resorbiert wurde. Die Zellen haben sich multipliziert und produzierten eine extrazelluläre Matrix aus Kollagen-Bindegewebe 22.
4 zeigt eine Querschnittsansicht einer alternativen Faserform zur Bildung des Substratbündels, bei dem ein fester Kern 24 aus Fibronectin von einer relativ formbaren Fibrin- oder Kollagen-Gelbeschichtung 26 umgeben ist. Der Gesamt-Durchmesser des Kerns plus Gelbeschichtung beträgt etwa 250 μm, der feste Kern besitzt jedoch einen Durchmesser von nur etwa 40 nm. Das Zellwachstum kann auf der Oberfläche und innerhalb der Gelbeschichtung auftreten.
5 zeigt eine Querschnittsansicht einer röhrenförmigen Fibronectin-Faser, die auch verwendet werden kann, um das Substratbündel zu bilden. Diese Faser besitzt einen inneren Durchmesser von etwa 0,2 mm und eine Wanddicke von etwa 100 μm. Mit dieser Faserart kann das Kulturmedium entlang der Innenseite der Röhrchen sowie entlang der Zwischenraum-Lücken zwischen den röhrenförmigen Fasern des Substratbündels fließen. Das Zellwachstum kann auf den inneren und den äußeren Oberflächen der röhrenförmigen Fasern auftreten.
Das Substratbündel kann auch aus einem Gemisch dieser Faserarten gebildet werden, wobei die relative Anzahl und Position im Substratbündel einer jeden Art optimiert wird, um die gewünschten Substrateigenschaften bereitzustellen. Feste Fibronectin-Fasern mit einem relativ weiten Durchmesser (2) versteifen z. B. die Matrix und stellen weite Zwischenraum-Lücken bereit, mit Gel beschichtete Fasern (4) stellen ein verstärktes Ausmaß an Zellimpfung und eine verbesserte Perfusion bereit, und röhrenförmige Fasern (5) verbessern die Perfusion im frühen Stadium, insbesondere in tiefere Regionen des Substratbündels.
Während verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wurden, sind für den Fachmann Modifikationen und Adaptierungen dieser und weiterer Ausführungsformen erkennbar. Es ist jedoch explizit davon auszu gehen, dass solche weiteren Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.

Claims

Verfahren zum In-Vitro-Züchten von Gewebe, umfassend die folgenden Schritte des: (i) Bereitstellens eines verformbaren Substrats (12), das mit Gewebe ausbildenden Zellen (20) geimpft ist und das zumindest einen Strömungskanal (15) definiert, der ein Kulturfluidmedium enthält, (ii) Anlegens einer sich periodisch ändernden Last (L) an das Substrat im Wesentlichen parallel zum Strömungskanal, welche Last das Substrat verformt, um ein mechanisches Auslösesignal für die Zellen bereitzustellen und (iii) Blockierens des Stroms des Kulturmediums in einer Richtung des Strömungskanals, dadurch gekennzeichnet, dass die Verformung des Substrats eine Nettoströmung des Kulturmediums entlang des Strömungskanals in entgegengesetzter Richtung verursacht, wodurch das Kulturmedium im Strömungskanal erneuert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Frequenz der Wechsellast im Bereich von 0,1 bis 60 Zyklen pro Stunde ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Substratdehnungsänderung, welche die Differenz zwischen der maximalen und der minimalen Substratverlängerung geteilt durch die Substratlänge ist, pro Lastzyklus im Bereich von 0,05% bis 1% ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nettosubstratdehnung mit einer Rate im Bereich von 0,001% bis 0,1% pro Stunde ansteigt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Substrat Fibronectin umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte des: (iv) Zerlegens des Substrats durch Einführen einer wirksamen Menge eines Zerlegungsmittels ins Substrat.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Substrat eine Vielzahl an Strömungskanälen definiert.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Substrat ein Bündel im Wesentlichen paralleler länglicher Elemente (14) umfasst, die im Wesentlichen parallel zur Richtung des Lastanlegens ausgerichtet sind, wobei die Strömungskanäle durch die Zwischenräume zwischen den länglichen Elementen ausgebildet sind.
Gewebewachstumsvorrichtung (10), umfassend: (i) ein Befestigungsmittel (19a, 19b), das an die Vorrichtung ein verformbares Substrat ablösbar anbringt, welches zumindest einen Strömungskanal (15) definiert und mit Gewebe ausbildenden Zellen geimpft wird, wobei bei Verwendung der Strömungskanal ein Kulturfluidmedium enthält, (ii) ein Fluidzufuhrmittel zum Zuführen frischen Kulturfluidmediums in den Strömungskanal, (iii) ein Lastanlegemittel zum im Wesentlichen zum Strömungskanal parallelen Anlegen einer zyklisch änderbaren Last (L) an das Substrat, dessen Last – bei Verwendung – das Substrat verformt, um ein mechanisches Auslösesignal für die Zellen bereitzustellen und (iv) ein Einwegventilmittel (21) zum Blockieren des Kulturmediumstroms in einer Richtung des Strömungskanals, dadurch gekennzeichnet, dass das Einwegventilmittel und das verformbare Substrat so angeordnet sind, dass die Verformung des Substrats eine Nettoströmung des Kulturmediums entlang des Strömungskanals in der entgegengesetzten Richtung hervorruft, wodurch frisches Kulturmedium aus dem Fluidzufuhrmittel in den Strömungskanal gesaugt wird.