DE60113240T2

DE60113240T2 - Retinoid-formulierungen zur aerosolbildung und zur inhalation

Info

Publication number: DE60113240T2
Application number: DE60113240T
Authority: DE
Inventors: R. Alan DAHL; E. Michael PLACKE; C. William ZIMLICH; M. Luigi DE LUCA; L. James MULSHINE
Original assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Current assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-03-08
Also published as: WO2001066104A3; EP1263420A2; AU2001245459A1; DE60113240D1; EP1263420B1; WO2001066104A2; ATE303801T1

Description

Die Erfindung wurde unter einem Cooperative Research and Development Agreement (CRADA), Nr. CACR-447, mit dem National Cancer Institute gemacht. Die Vereinigten Staaten von Amerika haben Rechte an dieser Erfindung, wie in dem CRADA angegeben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Retinoid-Formulierungen, die aerolisiert und für die Verhütung oder Behandlung von Krankheiten des aerodigestiven Trakts inhaliert werden können.
Lungenkrebs ist die führende Ursache von Krebstod bei Männern und Frauen in den Vereinigten Staaten sowie in der ganzen Welt. Da herkömmliche Behandlungen für Lungenkrebs einen begrenzten Erfolg bei der Verbesserung der Überlebensrate haben, sind von verschiedenen Forschern alternative Strategien zur Bekämpfung von Lungenkrebs eingeführt worden. Die orale und intravenöse Zufuhr von Retinoiden, wie 13-cis-RA, ist sowohl in Tier- als auch in Menschenversuchen untersucht worden. Jedoch ist die Retinoid-Verfügbarkeit für Epithel-Targets aufgrund der Retinoid-Wechselwirkung mit Albumin und/oder anderem Protein relativ gering, wenn das Retinoid systemisch verabreicht wird. Es wurde berichtet, dass 99 % der 13-cis-RA an Albumin gebunden vorlagen und dass diese Wechselwirkung durch Kompetition mit hohen Retinoid-Konzentrationen nicht umgekehrt werden konnte. 13-cis-RA hat eine Wirksamkeit als chemopräventives Mittel für orale Leukoplakie und Kopf- und Nackenkrebs gezeigt, aber mit signifikanter Toxizität. Für den Zweck der Erhöhung der Zielgewebe-Bioverfügbarkeit und der Verringerung der allgemeinen Toxizität ist die Inhalation von 13-cis-RA als alternativer chemopräventiver Ansatz vorgeschlagen worden. Idealerweise würde ein derartiger Ansatz die Zufuhr von geeigneten Konzentrationen von 13-cis-RA an das Lungenepithel ermöglichen, wobei die ausgeprägte enterohepatische Clearance sowie die nahezu universelle Wechselwirkung mit Albumin umgangen würden, wodurch eine höhere Endkonzentration von aktivem Retinoid an dem Ziel-Epithel ermöglicht würde.
Ehemalige und derzeitige Raucher sowie Individuen, die wegen eines ersten aerodigestiven Krebses erfolgreich behandelt worden sind, würden von Arzneistoffen sehr profitieren, welche die Weiterentwicklung von Lungen-Neoplasie verhüten. Diese große Menschengruppe umfasst die Hälfte der erwachsenen US-Bevölkerung, denen allen ein signifikantes Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs gemeinsam ist. Retinoide sind für die Aufrechterhaltung einer Atmungsepithel-Zelldifferenzierung in vivo notwendig und können eine terminale Differenzierung oder Apoptose von initiierten Epithelzellen induzieren und weisen so Aussichten als Präventivmittel für einige Formen von Krebs auf. Weiter ist gezeigt worden, dass ein Vitamin A-Mangel die Zahl der Benzo(a)pyren (BaP)-DNA-Addukte in kultivierter Hamster-Trachea erhöht.
In einem randomisierten klinischen Versuch schützte die orale Verabreichung von Isotretinoin (1–2 mg/kg/Tag) signifikant gegen zweite aerodigestive Tumoren in einer Kohorte von zuvor behandelten Kopf- und Halskrebs-Patienten. Wegen der Wirksamkeit von Isotretinoin als Präventivmittel für einige Krebsformen wird derzeit seine Wirksamkeit als chemopräventives Lungenkrebsmittel in mehreren klinischen Studien untersucht (Protokoll IDS: UCHSC-92382, NCI-V94-0506 und CBRG-9208, NCI-V92-0159, NBSG-9208).
Die Begeisterung für die Verwendung von Isotretinoin als chemopräventivem Mittel war zurückhaltend, teilweise aufgrund des Auftretens von entkräftenden Arzneistoff-Nebenwirkungen, die mit den in der MD-Anderson-Studie verwendeten Dosen verbunden waren, welche aufgrund von pharmakokinetischen Daten Fließgleichgewichts-Blutspiegel von 100/200 ng/ml lieferten. Sechszehn der neunundvierzig Patienten dieser Kopf- und Nacken-Chemopräventions-Studie beendeten den Therapieverlauf nicht. Da die Vorteile der Isotretinoin-Behandlung nach Aufhören mit der Behandlung verringert sind, besteht die Erwartung, dass eine chronische Arzneistoff-Verabreichung erforderlich wäre, was den Punkt der Patienten-Compliance kritisch macht.
Um die Toxizitätsprobleme anzusprechen, haben Forscher in Betracht gezogen, die Dosen des Arzneistoffs zu erniedrigen, aber es ist unklar, ob eine derartige Änderung die gewünschte therapeutische Wirkung gefährden würde. Orale Dosen von 1 mg/kg kehrten selbst Lungenmetaplasie in Rauchern nicht um. Versuche, die Schwere der toxischen Wirkungen durch Mitverabreichung von Vitamin E zu verringern, werden derzeit in klinischen Studien untersucht (Protokoll IDS: NDA-DM-97078, NCI-P98-0132), und es ist klar weitere Arbeit auf diesem kritischen Gebiet von Verdienst.
Wir überlegten, dass, da Lungenkrebs im Lungenepithel entsteht, eine direkte Aufbringung auf die Zielzellen den therapeutischen Index verbessern würde. Eine Aerosol-Inhalation kann Arzneistoff direkt auf die Population von Zellen abscheiden, die in der frühen Krebsphase erfasst werden, wobei potentiell eine viel größere Wirksamkeit im Vergleich zur Abhängigkeit von der Diffusion aus dem Blut erzielt wird. Es gibt theoretische Grundlagen, größere Unterschiede der Potenz zwischen oralen und inhalierten Retinoiden zu erwarten. Einige hoch lipophile Verbindungen können bei ihrer Clearance aus der Lungenepithel-Oberfläche in den Blutstrom signifikant verlangsamt werden. Da das Umgekehrte wahrscheinlich auch der Fall ist, können die schlechten Ergebnisse bei der oralen Verabreichung einfach ein Fall sein, in dem zu wenig Arzneistoff die Zielzellen in einigen Teilen der Lunge erreicht. Zusätzlich wird Isotretinoin in starkem Maß von Serum-Albumin gebunden, was dessen Verfügbarkeit zur Förderung der Differenzierung und Inhibierung der Proliferation beschränkt. Die direkte Aufbringung auf das Lungenepithel kann viel von der Proteinbindung vermeiden, was demgemäß die Potenz am Zielort in großem Maß steigert.
Überraschend ist trotz eines lange bestehenden Interesses an Isotretinoin die Information über seine in-vivo-Pharmakologie als Krebspräventionsmittel in Tiermodellen rar. In einer Studie vermochte oral verabreichtes Isotretinoin bei mehr als 300 mg/kg wöchentlich nicht, Urethan-induzierten Lungenkrebs im A/J-Mausmodell zu verhüten (Tabelle 1). Trotz dieses Versagens hatten wir das Gefühl, dass die direkte Aufbringung auf das Lungenepithel eine Auswertung verdiente. Um diese Voraussetzung zu testen, wählten wir, mit Karzinogen behandelte A/J-Mäuse für diese Pilotstudie Isotretinoin-Aerosol auszusetzen.
Die WO 97/39745 A beschreibt die Verabreichung einer Lösung, die unter anderem ein Retinoid enthält, mittels Inhalation an einen Patienten, um Epithelkrebse des Atmungstraktes zu verhüten. Die Verabreichung eines Retinoids bei existierenden Neoplasmen ist nicht offenbart.
Mulshine, James L. et al.: "Regional delivery of retinoids: a new approach to early lung cancer intervention", Clin. Biol. Basis Lung Cancer Prev. (1998), 273–283, Herausgeber: Martinet, Yves. Verleger: Birkhaeuser, Basel, Schweiz, stellen die Hypothese auf, dass die Verabreichung eines Retinoids über Inhalation an Patienten mit frühem Krebs einen größeren therapeutischen Index im Vergleich zur oralen Verabreichung zum Ergebnis haben könnte. Jedoch werden keine Daten für Retinoide präsentiert, um diese Spekulation zu stützen.
Die Offenbarung in Mulshine, J.L.: "Reducing lung cancer risk: Early detection", Chest (1999) 116/6 Suppl. (493S–496S) ist derjenigen in der obigen Literaturstelle Mulshine (1998) ähnlich. Wiederum werden keine experimentellen Arbeiten mitgeteilt.
Raleigh S.M. et al.: "Pharmacokinetics of isotretinoin (ISO) in rats following oral dosing or aerosol inhalation", British Journal of Cancer, Bd. 80, Nr. Suppl. 2, Juli 1999 (1999-07), Seite 96, Joint Meeting of the British Association for Cancer Research and the Royal College of Radiologists; Edingburgh, Schottland, UK; 11.–14. Juli, 1999 ISSN: 0007-0920, und Raleigh S.M. et al.: "Preclinical evaluation of an isotretinoin (iso) powder formulation for aerosol administration in lung cancer chemoprevention", Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual, Bd. 40, März 1999 (1999-03), Seite 397, 90th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, USA, 10.–14. April 1999, März 1999; ISSN: 0197-016X weisen ähnliche Offenbarungen auf. Die Autoren berichten über pharmakokinetische Studien im Hinblick auf die Inhalation einer Isotretinoin-Pulverformulierung durch gesunde weibliche und männliche Ratten im Vergleich zur oralen Verabreichung dieser Formulierung. Das Bestimmungsverfahren des Lungen-Plasma-Arzneistoffverhältnisses, das bei dem Pulver-Aerosol höher ist, gestattet keine Abschätzung, wie viel Pulver die tiefe Lunge erreicht hat. Die Behandlung von bereits existierenden Neoplasmen ist nicht erwähnt.
Die US 5 112 598 A offenbart ein pharmazeutisches Präparat, das Retinoesäure und/oder einen Ester von Retinoesäure und/oder einen Ester von Retinol in Form eines Aerosols zur Verwendung bei topischen Erkrankungen oder Schleimhauterkrankungen (z.B. Erkrankungen des Atmungsepithels) umfasst. Es sind keine Daten angegeben, wie viel Aerosol die tiefe Lunge erreicht. Es wird gesagt, dass neoplastische Veränderungen und Bronchialkarzinome durch das Präparat behandelbar sind. Jedoch ist für diese Behauptungen kein experimenteller Nachweis angegeben.
In der EP 0 003 064 A ist die Verwendung einer Kapsel eines Vitamin A-Analogons in einer Zigarette offenbart. Jedoch wird nach Aufbrechen der Kapsel wenig, falls überhaupt, aktives Material die tiefe Lunge erreichen, da die Teilchen des aktiven Materials aus dem leichteren Rauch ausfallen werden. Die Verwendung der Vitamin A-Ester für die Behandlung von Neoplasmen wird durch diese Druckschrift nicht gelehrt.
Die WO 01/10252 A, die nur gemäß Artikel 52(3) und (4) EPÜ von Bedeutung ist, offenbart die topische Verabreichung eines Retinoids nur in Verbindung mit einer Filtereinrichtung vom Zigaretten-Typ oder in einem Verfahren zur Schaffung einer Lipidperoxidation-reduzierenden Oberfläche der tiefen Lunge durch Inhalieren von mindestens 0,5 mg hochwirksamem Antioxidans und mindestens 0,1 mg Retinoid, wobei beide eine Teilchengröße von 6 μm oder weniger aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß werden diese und andere Nachteile des Standes der Technik durch diese Erfindung überwunden, welche die Verwendung von Retinoesäure oder einem Retinoesäure-Derivat bei der Herstellung eines Medikaments bereitstellt, das auf chronischer Basis über Inhalation verabreicht wird, wie in Anspruch 1 definiert.
Die vorliegende Erfindung demonstriert, dass 13-cis-RA, wenn sie topisch durch Inhalation zugeführt wird, wirksamer ist, um eine Hinaufregulierung der Schlüssel-Zielgene am Zielort hervorzurufen, als wenn sie in der Nahrung verabreicht wird.
Weiter liefert die pulmonale Zufuhr von Isotretinoin durch Inhalation einen Wirksamkeitsnachweis bei der Verringerung der pulmonalen Karzinogenität der Tabak-Karzinogene NNK und BaP in A/J-Mäusen bei wöchentlichen pulmonalen Dosen von so wenig wie 0,25 mg/kg und eine nahegelegte Wirksamkeit sogar bei 0,04 mg/kg. Da die pulmonale Arzneistoffzufuhr den Arzneistoff direkt auf dem Tumor-Kompartiment abscheidet, kann eine Wirksamkeit bei niedrigen Dosen erzielt werden: mittlere und niedrige wöchentliche pulmonale Dosen waren < 2 % bzw. < 0,3 % der höchsten empfohlenen wöchentlichen oralen Dosis von Isotretinoin für die Akne-Behandlung.
Deshalb ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von Retinoesäure oder einem Retinoesäure-Derivat bei der Herstellung eines Medikaments bereitzustellen, das aerolisiert und von einem Testsubjekt oder Patienten inhaliert werden kann, wobei die Wirksamkeit der Retinoid-Formulierung maximiert wird und die systemische Toxizität minimiert wird.
Weitere Gegenstände, Vorteile und neue Aspekte dieser Erfindung werden aus einer Betrachtung der Zeichnungen und der nachfolgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Stimulierung der TGase II-Aktivität durch Retinoide
1A. 13-cis-RA und all-trans-RA stimulieren die TGase II-Aktivität in kultivierten Human-MCF-7-Brustkrebszellen. Durchschnitt der TGase II-Aktivitäts-Analyse von drei getrennten Schalen +/– Standard-Fehler für jede Behandlungsgruppe. In "1" wurden Zellen 72 Stunden lang mit DMSO behandelt (TGase II-Aktivität = 0,183 +/– 0,005 Picomol Putrescin/μg Protein/30 Minuten); in "2" wurden Zellen mit all-trans-RA (10^–6 M) 72 Stunden lang behandelt (TGase II-Aktivität = 1,359 +/– 0,098 Picomol/μg Protein/30 Minuten); hohe Signifikanz des Unterschieds zwischen 1 und 2 (P < 0,001); in "3" wurden Zellen mit 13-cis-RA (10^–6 M) 72 Stunden lang behandelt (TGase II-Aktivität = 1,118 +/– 0,016 Picomol/μg Protein/30 Minuten), hohe Signifikanz des Unterschieds zwischen "1" und "3" (P < 0,001) ohne signifikanten Unterschied zwischen "2" und "3" (P < 0,07).
1B. 13-cis-RA erhöht durch Inhalation signifikant die TGase II-Aktivität (Experiment B) von Rattenlungengewebe. Vier linke Lungen (eine von jeder Ratte) wurden für jede Einwirkungsgruppe verwendet, mit drei Messungen pro Lunge (n = 12). Der Mittelwert der 12 Messungen ist +/– Standardfehler aufgetragen. Ratten inhalierten 13-cis-RA-Aerosol (Tabelle 1). "1" (Vehikel-Kontrolle): Lungengewebe von Ratten, die nur Vehikel inhalierten (abgeschiedene Dosis = 0) (TGase II-Aktivität = 0,0450 +/– 0,003 Picomol/μg Protein/30 Minuten); "2" (niedrige Dosis): 39 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,0955 +/– 0,004 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,001 zwischen "1" und "2"); "3" (niedrigemittlere Dosis): 117 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,1150 +/– 0,006 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,001 zwischen "1" und "3"); "4" (mittlere Dosis): 351 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,1330 +/– 0,009 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,001 zwischen "1" und "4"); "5" (mittlere-hohe Dosis): 936 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,1020 +/– 0,005 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,001 zwischen "1" und "5"); "6" (hohe Dosis). 1872 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,1025 +/– 0,004 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,001 zwischen "1" und "6").
1C. Inhaliertes 13-cis-RA ändert die Leber-TGase II-Aktivität nicht signifikant (Experiment B).
Ratten inhalierten 13-cis-RA-Aerosol (Tabelle 1). Die Messungen wurden an Lebergewebe durchgeführt. Die Verfahren waren die gleichen wie in 1B. "1" (Vehikel-Kontrolle): Lebergewebe von Ratten, die 240 Minuten lang Vehikel inhalierten (abgeschiedene Dosis = 0), TGase II-Aktivität = 0,260 +/– 0,005 Picomol/μg Protein/30 Minuten; "2" (niedrige Dosis): 39 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,289 +/– 0,007 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,285 zwischen "1" und "2"); "3" (niedrige-mittlere Dosis): 117 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,273 +/– 0,018 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,619 zwischen "1" und "3"); "4" (mittlere Dosis): 351 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,313 +/– 0,025 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,065 zwischen "1" und "4"); "5" (mittlere-hohe Dosis): 936 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,269 +/– 0,015 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,993 zwischen "1" und "5"); "6" (hohe Dosis): 1872 μg/kg ist die abgeschiedene Gesamt-Dosis von 13-cis-RA (TGase II-Aktivität = 0,271 +/– 0,015 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,758 zwischen "1" und "6").
1D. Nahrungs-RA erhöht signifikant die Mausleber-TGase II-Aktivität. Mäusen wurde RA 75 Wochen lang bei zwei Konzentrationen, 3 und 30 μg/g Nahrung, verfüttert (Tabelle 5). Vier verschiedene Mäuse aus jeder Nahrungs-RA- Gruppe wurden verwendet; was die Lungen betrifft, sind die mittleren Werte von zwölf Messungen (dreifach für jede Leber) +/– Standardfehler aufgetragen (Tabelle 6). "1 ": TGase II-Aktivität der Leber von SENCAR-Mäusen, denen 75 Wochen lang eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g) verfüttert wurde (TGase II-Aktivität = 0,125 +/– 0,02 Picomol/μg Protein/30 Minuten); "2": TGase II-Aktivität aus der Leber von SENCAR-Mäusen, denen 75 Wochen lang eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g) verfüttert wurde (TGase II-Aktivität = 0,630 +/– 0,16 Picomol/μg Protein/30 Minuten) (P < 0,003 zwischen "1" und "2").
2: Inhalierte 13-cis-RA reguliert Rattenlungen-RARs hinauf
2A. Western-Blot-Analyse von Rattenlungen-Proben (Experiment A) unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen RARα, β und γ, wie unter Materialien und Methoden erklärt. Ratten wurden einmal täglich für zwei Stunden 13-cis-RA durch Inhalation ausgesetzt (Tabelle 4). Rattenlungengewebe der Proben von Bahn 1 (Vehikel-Kontrolle 1 Tag) erhielten einen Tag lang Vehikel; Bahn 2 (hohe Dosis 13-cis-RA, 1 Tag) erhielt für einen Tag eine berechnete abgeschiedene Gesamt-Dosis von 6,4 mg 13-cis-RA/kg; Bahn 3 (hohe Dosis 13-cis-RA, 17 Tage) erhielt über 17 aufeinanderfolgende Tage eine berechnete abgeschiedene Gesamt-Dosis von 6,4 mg 13-cis-RA/kg; Bahn 4 (Vehikel-Kontrolle 28 Tage) erhielt über 28 aufeinanderfolgende Tage Vehikel; Bahn 5 (mittlere 13-cis-RA, 28 Tage) erhielt über 28 aufeinanderfolgende Tage eine berechnete abgeschiedene Gesamt-Dosis von 1,9 mg 13-cis-RA/kg.
2B. Densitometrische Analyse der in A gezeigten Western-Blots. Die vertikale Achse ist in willkürlichen densitometrischen Einheiten (IDV =Integrierter Dichtewert).
3: Inhalierte 13-cis-RA regelt RARs in Rattenlungengewebe bei verschiedenen Inhalationszeiten hinauf.
3A. Western-Blot-Analyse von Rattenlungen-Proben (Experiment B) unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen RARα, β und γ, wie unter Materialien und Methoden erklärt. Ratten inhalierten ein 13-cis-RA-Aerosol (Tabelle 1). Rattenlungengewebe der Proben von Bahn 1 erhielten über 240 Minuten Vehikel; Bahn 2 (niedrige Dosis): 39 μg/kg gesamte abgeschiedene 13-cis-RA; Bahn 3 (niedrige-mittlere Dosis): 117 μg/kg gesamte abgeschiedene 13-cis-RA; Bahn 4 (mittlere Dosis): 351 μg/kg gesamte abgeschiedene 13-cis-RA; Bahn 5 (mittlere-hohe Dosis): 936 μg/kg gesamte abgeschiedene 13-cis-RA; Bahn 6 (hohe Dosis): 1872 μg/kg gesamte abgeschiedene 13-cis-RA.
3B. Densitometrische Analyse der in A gezeigten Western-Blots. Die vertikale Achse ist in willkürlichen densitometrischen Einheiten (IDV = Integrierter Dichtewert).
4: Pharmakologische Nahrungs-RA (30 μg/lg Nahrung) reguliert RARs in Leber von männlichen SENCAR-Mäusen hinauf
4A. Western-Blot-Analyse von Leberproben von männlichen SENCAR-Mäusen unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen RARα, β und γ, wie unter Materialien und Methoden erklärt. Mäusen wurde 75 Wochen lang RA in zwei Konzentrationen, 3 und 30 μg/g Nahrung, verfüttert (Tabelle 5). Bahn 3: Lebergewebe von SENCAR-Mäusen, denen 75 Wochen lang eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g) verfüttert wurde; Bahn 30: Lebergewebe von SENCAR-Mäusen, denen 75 Wochen lang eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g) verfüttert wurde.
4B. Durchschnitt der densitometrischen Analyse der drei in A gezeigten verschiedenen Western-Blots. Die vertikale Achse ist in willkürlichen densitometrischen Einheiten (IDV = Integrierter Dichtewert). RARα 12,1 +/– 7,2 (3 μg/g), verglichen mit 264 +/– 21,3 (30 μg/g) (P < 0,0001); RARβ 18,9 +/– 7,4 (3 μg/g), verglichen mit 254 +/– 31,9 (30 μg/g) (P < 0,0002); RARγ 23,1 +/– 6,7 (3 μg/g), verglichen mit 288 +/– 17,4 (30 μg/g) (P < 0,0001).
4C. Immunhistochemische Analyse von Leberproben von männlichen SENCAR-Mäusen unter Verwendung von polyklonalem Antikörper gegen RARα, wie unter Materialien und Methoden erklärt.
5: Pharmakologische Nahrungs-RA (30 μg/g Nahrung) reguliert RARs in Leber von SENCAR-Mäusen hinauf
5A. Western-Blot-Analyse von Leberproben von SENCAR-Mäusen unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen RARα, β und γ, wie unter Materialien und Methoden erklärt. Mäusen wurde über verschiedene Zeitspannen RA bei zwei Konzentrationen, 3 und 30 μg/g Nahrung, verfüttert (Tabelle 7). Bahn 3: Leber von SENCAR-Mäusen, denen 1, 14 und 28 Tage lang eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g) verfüttert wurde; Bahn 30: Leber von SENCAR-Mäusen, denen 1, 14 und 28 Tage lang eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g) verfüttert wurde.
5B. Densitometrische Analyse der in A gezeigten Western-Blots.
Die vertikale Achse ist in willkürlichen densitometrischen Einheiten (IDV = Integrierter Dichtewert).
6. Körpergewichte von mit BaP behandelten A/J-Mäusen, die Isotretinoin-Aerosolen ausgesetzt wurden. Die Körpergewichte der mit BaP behandelten Mäuse sind repräsentativ und typisch für diejenigen von allen drei Karzinogen-Behandlungen.

a. Tägliche Einwirkungen.
b. Tägliche Einwirkungen während der ersten zwölf Tage, dann dreimal wöchentlich.
c. Tägliche Einwirkungen während der ersten zwölf Tage, dann zweimal wöchentlich.

7. RAR-Induktionsbestimmungen in A/J-Mäusen, die Isotretinoin-Aeorsolen ausgesetzt wurden. Fünfzehn männliche A/J-Mäuse wurden in 5 experimentelle Gruppen aufgeteilt, und ihnen wurden einzelne intraperitoneale Dosen von Urethan (UR) oder keine Behandlung verabreicht. Gruppe 1: 3 Mäusen wurde UR gegeben, dann inhalierten sie Luft; Gruppe 2: 3 Mäusen wurde UR gegeben, dann inhalierten sie Vehikel-Aerosol; Gruppe 3: 3 Mäusen wurde UR gegeben, dann inhalierten sie eine niedrige Isotretinoin-Aerosolkonzentration; Gruppe 4: 3 Mäusen wurde UR gegeben, dann inhalierten sie eine mittlere Isotretinoin-Aerosolkonzentration; Gruppe 5: 3 Mäuse wurden nicht behandelt.

a. Western-Blot-Analyse von Lungengewebe; Einzelheiten sind unter Materialien und Methoden angegeben.
b. Densitometrische Analyse der Western-Blots in 2a. IDV = integriert.

Nun wird in Einzelheit auf die derzeit bevorzugte Ausführungsform der Erfindung Bezug genommen, von der Beispiele in den begleitenden Figuren veranschaulicht sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Retinoesäure oder einem Retinoesäure-Derivat als Chemoprotektor bei der Herstellung eines Medikaments gerichtet, das auf chronischer Basis über Inhalation verabreicht wird, wie in Anspruch 1 definiert.
Die Verwendung der Erfindung zieht in Betracht, dass ein Patient wegen Lungenkrebses vor Beginn einer chronischen Behandlung durch Inhalation eines Aerosols eines Retinoesäure-Derivats unter Verwendung herkömmlicher Behandlungsverfahren behandelt worden sein kann. Standard-Behandlungsverfahren liegen im Vermögen der Technik und umfassen zum Beispiel die chirurgische Entfernung von erkranktem Lungengewebe, Chemotherapie mit einem Antikrebs-Arzneistoff oder Strahlungsbehandlung. Eine Kombination derartiger Behandlungen, z. B. Chirurgie und Bestrahlung, kann ebenfalls verwendet werden.
Wie es vom Fachmann verstanden wird, wird der Ausdruck "chronisch" verwendet, um die Verabreichung der aktiven Arzneisubstanz, d.h. der hierin offenbarten Retinoesäure-Derivate, über eine längere Zeitspanne, vielleicht während des ganzen Lebens des Patienten, gewöhnlich auf täglicher Basis oder mehrerer Male pro Woche, zu bedeuten. Die hierin beschriebene aktive Arzneisubstanz wird im Allgemeinen vom Patienten über Inhalation eines Aerosols selbst verabreicht, welches unter Verwendung kommerziell erhältlicher Aerosol-erzeugender Vorrichtungen, wie eines Vernebler, eines Pumpenzerstäubers, eines Inhalators mit abgemessener Dosis oder einer Vorrichtung, die ein elektrohydrodynamisches Aerosol erzeugt, wie nachstehend beschrieben, erzeugt wird.
Der Ausdruck "aktive Arzneisubstanz" oder "Retinoesäure-Derivat", wie in der Verwendung der Erfindung verwendet, bedeutet Retinoesäure sowie andere natürliche und synthetische Retinoide und strukturell verwandte Verbindungen; und alle Verbindungen wechselwirken mit Retinoesäure-Rezeptoren (RARs) oder Retinoid X-Rezeptoren (RXRs), wie: 9-cis-Retinoesäure (9-cis-RA), 13-cis-RA, all-trans-RA, Retinal, Retinol, Fenretinid, Etretinat, Retinylpalmitat, 11-cis-Retinoesäure, CRBP-Retinal, 9-, 13- und 11-cis-Retinal, CH 55, AM 80, Retinylacetat, beta-Karotin, Heterokarotinoide, Acitretin, Tazaroten.
Die Retinoesäure-Derivate, die in der hierin offenbarten Verwendung verwendet werden, werden dem Patienten in einer "Menge, die wirksam ist, zu verhindern, dass Neoplasien" sich zu Lungenkrebs entwickeln, verabreicht. Im Allgemeinen wird die aktive Arzneisubstanz durch Inhalation eines Aerosols bei etwa 0,03 bis etwa 0,17 ng/cm² Lungenoberfläche und bevorzugt etwa 0,03 bis etwa 0,5 ng/cm² Lungenoberfläche verabreicht. Alternativ kann, wie es vom Fachmann anerkannt würde, die Dosierung der aktiven Arzneisubstanz unter Verwendung des geschätzten Gewichts des Lungengewebes des Patienten berechnet werden. Die Dosierung der aktiven Arzneisubstanz, die auf dieser Basis berechnet wird, liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,84 bis etwa 230 μg/g menschliches Lungengewebe. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zieht eine aktive Arzneisubstanz in Form eines trockenen Pulvers in Betracht. Das trockene Pulver kann durch irgendeinen von mehreren im Handel erhältlichen Trockenpulver-Inhalatoren verabreicht werden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die direkte Einwirkung des Retinoesäure-Derivats auf das Atmungsepithel, das Epithel der Nase und der Mund/Hals-Höhle und vorzugsweise der Epithelien der Trachea und des tiefen Bronchialtrakts zu ermöglichen; alle werden hierin kollektiv als "aerodigestiver Trakt" bezeichnet. Krankheiten des aerodigestiven Trakts umfassen Epithel-Erkrankungen der Nase und der Mund/Hals-Höhle und der Lunge und der Luftwege, wie Emphysem, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Neoplasmen, Dysplasie, Metaplasie, Entzündung, Hyperplasie. Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck "Preneoplasma" oder "Preneoplasie" verwendet, um kollektiv: die Zustände von Dysplasie, Metaplasie, Entzündung und Hyperplasie der Epithelien des aerodigestiven Trakts zu bezeichnen.
Die Herstellung von Aerosolformulierungen eines hierin beschriebenen Retinoesäure-Derivats liegt im Bereich des Fachwissens; siehe zum Beispiel Inhalation Aerosols: Physical and Biological Basis for Therapy, Lung Biology in Health and Disease Series, herausgegeben von A.J. Hickey, Marcel Dekker (1996) und Pharmaceutical Inhalation Aerosol Technology, herausgegeben von A.J. Hickey, Marcel Dekker, NY, (1992). Eine Aerosol-Formulierung, die ein hierin beschriebenes Retinoesäure-Derivat als aktive Arzneisubstanz enthält, kann zusätzlich einen oder mehrere inaktive Hilfsstoffe, wie Träger (z.B. Inertgas, Flüssigkeiten oder Pulver), Antioxidantien und dergleichen enthalten.
Erläuternd für die Träger, die hierin verwendet werden können, sind pharmakologisch annehmbare organische Lösungsmittel (wie: Ethanol, Benzylalkohol, Glycerin, Glycolfurol, Isopropylalkohol, Polyethylenglycol, Propylenglycol, Triacetinisopropylmyristat, Isopropylpalmitat); Antioxidantien (wie: Tocopherol, Ascorbinsäure, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Fumarsäure, Maleinsäure, Propylgallat, Ascorbat, Bisulfit, Trolox, Tocopherylacetat, Acetylcystein, Phosphatidylcholin); Emulgatoren (wie: Cetostearylalkohol, Glycerolmonostearat, Lanolin, Lanolinalkohole, Ölsäure, Polyoxyethylenalkylether und -ester, Propylenglycolester, Detergenzien).
Es wurde gefunden, dass die topische Zufuhr der aktiven Arzneisubstanz durch Inhalation wirksamer ist, um eine Hinaufregulierung der Schlüssel-Zielgene im Epithelgewebe in der Lunge hervorzurufen, als wenn das Retinoesäure-Derivat in der Nahrung verabreicht wird. Inhalierte 13-cis-Retinoesäure erhöht die Lungen-TGase II-Aktivität ohne eine signifikante Auswirkung auf die Leber-Enzymaktivität, während Nahrungs-Retinoesäure eine signifikante Auswirkung auf die Leber-TGase II-Aktivität aufweist.
I. Topische Zufuhr von 13-cis-Retinoesäure durch Inhalation reguliert die Expression von Nager-Lungen-, aber nicht von -Leber-Retinoesäure-Rezeptoren hinauf
Als vorklinische Studie für die vorliegende Erfindung wurden normale Ratten inhalierten Konzentrationen von 13-cis-RAR ausgesetzt, spezifische Biomarker wurden überprüft, um die Wirkung zu überwachen. TGase II und die RARs wurden als Biomarker gewählt, da sie Abhängigkeitsgene erster Ordnung sind, d.h., es wurde gezeigt, dass sie ein auf RA ansprechendes Element in ihrem Promotor aufweisen.
MCF-7 Zellen wurden mit einer Dichte von 1,5 × 10⁵ Zellen/ml Medium (500 ml DMEM + 56,2 ml FBS + 5,6 ml AB/AM) auf Schalen mit 6 cm Durchmesser 24 Stunden lang gesät und entweder mit DMSO, RA oder 13-cis-RA zu 10^–6 M behandelt und bis zur Konfluenz gezüchtet (etwa 72 Stunden). Die Zellen wurden geerntet, und die Transglutaminase II-Aktivität wurde gemessen, wie nachstehend beschrieben. Verneblerlösung, Inhalationsverfahren, Einzelheiten der Tierunterbringung sind nachstehend beschrieben.
Ratteninhalation, Experiment A
Ratten (n = 97) (Sprague-Dawley von Charles River) wurden in fünf experimentelle Gruppen aufgeteilt, und es wurden ihnen verschiedene Mengen an 13-cis-RA mittels Inhalation verabreicht. Die experimentellen Gruppen waren wie folgt (Tabelle 4): 1. Vehikel (10/9-Mischung von PEG 300 und Ethanol mit 0,5 % Ascorbinsäure und 0,5 % Phosphatidylcholin)-Kontrolle, Tag 1: Ratten (19) inhalierten Vehikel über 2 h an einem Tag; 2. hohe Dosis 13-cis-RA, Tag 1: Ratten (22) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 104 μg/Liter enthielt (geschätzte tägliche inhalierte Dosis 10 mg/kg Körpergewicht), über 2 h an einem Tag; 3. hohe Dosis 13-cis-RA, Tag 17: Ratten (22) inhalierten die gleiche Lösung wie in 2 über 2 h täglich während 17 Tagen; 4. Vehikel-Kontrolle, Tag 28: Ratten (16) inhalierten Vehikel wie bei Gruppe 1 über eine Zeitspanne von 28 Tagen; 5 mittlere Dosis 13-cis-RA, Tag 28: Ratten (18) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 31 μg/Liter enthielt (geschätzte tägliche inhalierte Dosis 3 mg/kg Körpergewicht) über 2 h an jedem von 28 Tagen.
Ratteninhalation, Experiment B
Männliche Ratten (n = 23) (Sprague-Dawley von Charles River) wurden in sechs experimentelle Gruppen aufgeteilt, und es wurden ihnen einmal täglich über verschiedene Zeiten jeden Tag während 14 Tagen verschiedene Mengen an 13-cis-RA mittels einer Inhalationsvorrichtung verabreicht. Die experimentellen Gruppen waren wie folgt (Tabelle 1): 1. Vehikel-Kontrolle: Ratten (3) inhalierten 240 Minuten lang Vehikel; 2. niedrige Dosis 13-cis-RA: Ratten (4) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 62,2 μg/Liter enthielt (inhalierte Dosis 115,0 μg/kg Körpergewicht) in 5 Minuten; 3. niedrig-mittlere Dosis 13-cis-RA: Ratten (4) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 62,2 μg/Liter enthielt (inhalierte Dosis 334,4 μg/kg Körpergewicht) in 15 Minuten; 4. mittlere Dosis 13-cis-RA: Ratten (4) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 62,2 μg/Liter enthielt (inhalierte Dosis 1012,3 μg/kg Körpergewicht) in 45 Minuten; 5. mittlere-hohe Dosis 13-cis-RA: Ratten (4) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 62,2 μg/Liter enthielt (inhalierte Dosis 2843,4 μg/kg Körpergewicht) in 120 Minuten; 6. hohe Dosis 13-cis-RA: Ratten (4) inhalierten eine Lösung, die 13-cis-RA bei einer Konzentration von 62,2 μg/Liter enthielt (inhalierte Dosis 5965,6 μg/kg Körpergewicht) in 240 Minuten.
Nahrungs-RA-Studien in SENCAR-Mäusen
Männliche SENCAR-Mäuse (10) wurden in zwei experimentelle Gruppen aufgeteilt, und es wurden ihnen verschiedene Menge an RA in der Nahrung verfüttert. Die experimentellen Gruppen wurden in zwei Gruppen von fünf Mäusen aufgeteilt (Tabelle 5), von denen jede eine Niedrig- und Hochdosis-Gruppe einschloss, denen über 75 Wochen entweder eine physiologische RA-Nahrung mit 3 μg/g Nahrung bzw. eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g Nahrung) verfüttert wurde.
Immunhistochemische Färbung
Lebergewebe (etwa 300 mg) wurde in 10 %-igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, und 5 μm-Schnitte wurden für die Immunhistochemie verwendet. Das Färben bezüglich RAR war unserem früher beschriebenen Protokoll {8656} ähnlich. Es wurden das ABC-Kit Maus/Kaninchen-IgG und das DAB-Substrat-Kit verwendet (Vector Laboratories Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA).
Zeitverlauf der Nahrungs-RA-Auswirkungen auf RARs
SENCAR-Mäuse (30) wurden in sechs experimentelle Gruppen eingeteilt. Die experimentellen Gruppen waren wie folgt (Tabelle 7): Den Gruppen 1, 3 und 5 (jeweils 5 Mäuse) wurde über 1, 14 und 28 Tage eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g Nahrung) verfüttert; den Gruppen 2, 4 und 6 (jeweils 5 Mäuse) wurde eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g Nahrung) verfüttert.
Antikörper
Polyklonale Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper gegen RAR und (SANTA CRUZ Biotechnology Inc., San Francisco, CA) wurden verwendet. Das BM Chemolumineszenz-Western-Blotting-Kit (Maus/Kaninchen) (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis) wurde für die Western-Blots verwendet.
Apparatur und Reagenzien für die Western-Blot-Analyse
Das X Cell II Mini-Cell & Blot Module wurde mit 10 % Tris-Glycingelen und Überführungspuffer; Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer verwendet; Tris-Glycin-SDS wurde als Laufpuffer verwendet (NOVEX – NOVEL Experimental Technology Inc., San Francisco, CA).
TGase II-Assay
Kultivierte Zellen wurden in 100 μl Kratzpuffer [A: 2800 μl (400 μl 0,5 M Na-Phosphat, 500 μl 0,01 M EDTA, 100 μl 1 M DTT, 9 ml PBS, insgesamt 10 ml) + B: 700 μl (10 μl 20 mg/ml PMSF, 790 μl PBS, insgesamt 800 μl)] für jede Schale. Die Zellen wurden durch eine Beschallungsvorrichtung zerbrochen und in Eis gehalten, bis sie verwendet wurden. Der TGase II-Assay wurde wie nachstehend und früher beschrieben {8217} durchgeführt.
Bei Lebergewebe wurde ein Stück von etwa 100–400 mg verwendet. Das Gewebe wurde in kleine Stücke gewürfelt und 2–3 Minuten in etwa 2 Volumina Kratzpuffer homogenisiert Die Proben wurden 30 Minuten bei 4 °C bei 4 °C bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bis zur Verwendung in Eis aufbewahrt.
Enzymassay-Mischungen wurden hergestellt, indem man 80 μl SUBSTRATE-Mischung (322,8 μl H₂O, 120 μl 0,5 M NaBorat, 60 μl 0,01 M EDTA, 60 μl 0,1 M CaCl₂, 6 μl 1 M DTT, 240 μl Dimethylcasein, 30 μl Triton X-100, 1,2 μl [³H]-Putrescin, 120 μl Putrescin) zu 20 μl Probe, 20 μl Kratzpuffer für die Blindkontrolle, 20 μl (18 μl Kratzpuffer + 2 μl TGase II) für eine positive Kontrolle gab. Die Proben wurden in 15 ml-Röhrchen gemischt, die Röhrchen wurden geschüttelt, bevor sie 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 28°C gegeben wurden. Die Reaktionen wurden in einem Eisbad verlangsamt. 80 μl der Inkubationsmischung wurden auf runden Papieren adsorbiert. Diese wurden sofort in kalte 10 %-ige TCA (0,1 % Putrescin) eingetaucht und unter Rühren 7 Minuten lang gewaschen, gefolgt von 2 zusätzlichen Waschschritten mit 5 %-iger TCA (0,05 % Putrescin) über 5–7 Minuten und noch einmal mit kaltem (–20°C) 95 %-igem Ethanol über 5 Minuten. Die runden Papiere wurden getrocknet und in 5 ml Aquasol gegeben und in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt. Die Protein-Konzentrationsbestimmung wurde mittels des Bradford-Verfahrens durchgeführt.
Western-Blot-Analyse
Proben-Präparation
Gewebe wurde gesammelt, in Trockeneis eingefroren und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt. 500 mg-Aliquoten wurden in kleine Stücke gewürfelt und unter Verwendung des Hand-Homogenisators 2–3 Minuten lang in 300 μl kalter PBS homogenisiert. Probe und Waschflüssigkeiten wurden 20 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 μl eiskaltem Puffer A [2 μl 0,5 M EDTA, 10 μl 100 mM EGTA, 50 μl 100 mM PMSF, 10 μl 1 M DTT, 10 ml (10 mM HEPES pH 7,9 + 10 mM KCl)] suspendiert und 15 Minuten bei Eistemperatur gelassen. 25 μl einer 10 %-igen Lösung von NP-40 wurden dazugegeben, und die Proben wurden 10 Sekunden in einem Vortexer heftig gemischt. Die Proben wurden 1 Minute bei 4°C bei 14.000 × g zentrifugiert, und das Pellet wurde noch einmal auf diese Weise behandelt (resuspendiert usw.). Der Überstand wurde entfernt, und 100 μl eiskalter Puffer C [4 μl 0,5 M EDTA, 20 μl 100 mM EGTA, 20 μl 100 mM PMSF, 2 μl 1 M DTT, 2 ml (20 mM HEPES pH 7,9 + 0,4 M NaCl)] wurden dazugegeben. Die Pellets wurden resuspendiert, indem man sanft auf den Boden der Eppendorf-Röhrchen klopfte. Die Proben wurden in einem Eimer mit Eis auf einem Rundschüttler 30 Minuten lang heftig geschüttelt. Die Proben wurden 5 Minuten bei 4°C bei 14.000 × g zentrifugiert. Die Protein-Bestimmung des Überstands wurde mittels des Bradford-Verfahrens durchgeführt.
Probenanalyse
Die Proben wurden hergestellt, indem man 1 Teil des Probenpuffers zu 1 Teil der Probe gab und gut mischte. Die Proben wurden 5 Minuten bei 95°C erwärmt, um die Denaturierung zu induzieren. 5 μl Rainbow-Standard und 5 μl biotinylierter Molekularmarker wurden in parallele Vertiefungen gegeben. 20 μg Protein pro Probe wurden in jede Bahn geladen. Die Elektrophorese wurde über etwa 1 – 1,5 Stunden mit einer bei 125 V eingestellten Spannung durchgeführt. Die Gelüberführung wurde über 2 Stunden bei 25 V durchgeführt. Die Membran wurde 5 Minuten lang mit Ponceau S. gefärbt und mit einmal Waschen mit 5 %-iger Essigsäure entfärbt. Die Membran wurde dann in TBS-Lösung gewaschen, bis die Färbung verschwand. Die Membranen wurden 60 Minuten in 1 ml Blockierungslösung und 9 ml TBS inkubiert. Die Membranen wurden über Nacht in 1 ml Blockierungslösung und 19 ml TBS zusammen mit 20 μl Lösung von primärem Antikörper (Verdünnung 1:1000) inkubiert. Die Membranen wurden in PBS-Tween 20 gewaschen, jeweils 3-mal 10 Minuten lang. Sie wurden schließlich in 1 ml Blockierungslösung und 19 ml TBS zusammen mit 20 μl HRP-verknüpftem Anitbiotin-Antikörper und 2 μl sekundärem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Verdünnung 1:10.000) 30 Minuten lang inkubiert. Die Membranen wurden in PBS-Tween 20 gewaschen, jeweils 4-mal 10 Minuten lang. Der Film wurde der Entwicklung und dem Nachweis ausgesetzt.
Demonstration, dass 13-cis-RA die TGase II-Aktivität stimuliert, und Vergleich von all-trans-RA in kultivierten MCF-7-Humanbrustkrebs-Zellen
Vor der Verwendung von 13-cis-RA auf dem Inhalationsweg wurde dessen Fähigkeit, Retinoid-Antwort und den möglichen Biomarker TGase II hinaufzuregulieren, im Vergleich zu RA getestet. Die Einzelheiten dieses Experiments sind in 1. A zeigt, dass 13-cis-RA (6,1-fach) nahezu so wirksam wie RA (7,4-fach) bei der Stimulierung der TGase II-Aktivität in kultivierten MCF-7-Humanbrustkrebs-Zellen ist.
Inhalierte 13-cis-RA stimuliert die TGase II-Aktivität in der Rattenlunge, aber nicht in Lebergewebe
Die Einzelheiten dieses Experiments sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und 1 gezeigt. B zeigt eine signifikante (2,9-fache) Stimulierung der Lungen-TGase II-Aktivität durch inhaliertes 13-cis-RA. Die Zunahme war bei einer Dosis von so wenig wie 69 μg/kg, die täglich 14 Tage lang verabreicht wurde, offenkundig und erreichte bei einer inhalierten Dosis von 1012,3 μg/kg, d.h. nach 45-minütiger Inhalation des Aerosols, ein Maximum. Sie nahm dann bei größeren Mengen an inhaliertem Retinoid auf das 1,2-fache ab. Tabelle 3 und 1C zeigen keine signifikante Wirkung von inhaliertem 13-cis-RA auf die Leber-TGase II-Aktivität bei bis zu 5,93 mg/kg inhalierter Dosis. Deshalb schien der Inhalationsweg eine sofortige und aufrechterhaltene Auswirkung des Retinoids auf die TGase II-Aktivität zu liefern.
Nahrungs-RA stimuliert die TGase II-Aktivität in der SENCAR-Mausleber
Die Einzelheiten dieses Experiments sind in Tabelle 5 und Tabelle 6 gezeigt. Wir testeten die Hypothese, dass Nahrungs-RA bei der Stimulierung der TGase II-Aktivität in SENCAR-Maus-Lebergewebe wirksam sein könnte. Wir verwendeten SENCAR-Mäuse, denen 75 Wochen lang entweder eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g Nahrung) oder eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g Nahrung) verfüttert wurde, wie in Tabelle 5 angezeigt. 1D zeigt, dass Nahrungs-RA (30 μg/g Nahrung) bei der Stimulierung der TGase II-Aktivität in Leber aus der männlichen SENCAR-Maus 5,0-fach so wirksam ist wie physiologisches RA (3 μg/g Nahrung).
Inhalierte 13-cis-RA stimuliert RAR-Proteine in der Rattenlunge, aber nicht in Lebergewebe
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die spezifische Wirkung von inhalierter 13-cis-RA auf Lungengewebe der Ratte zu untersuchen. Die Einzelheiten dieses Experiments sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Inhalationseinwirkung von 13-cis-RA (2A) bei hohen (Bahnen 2 und 3) Dosen oder mittlerer (Bahn 5) Dosis, wie in der Legende in 2 angegeben, bewirkte bei verschiedenen Zeitdauern der täglichen Einwirkung des Retinoids eine Zunahme zwischen dem 3,4- und 4,7-fachen gegenüber der Lösungsmittel-Kontrolle (Bahnen 1 und 4) bei RAR; eine Zunahme zwischen dem 7,2- und 10-fachen bei RAR; und zwischen dem 8,1- und 12,9-fachen bei RAR (2B). Deshalb scheinen RARs in hohem Maß auf inhalierte 13-cis-RA im Rattenlungengewebe anzusprechen, wenn sie inhaliert wird.
Als nächstes wurde untersucht, ob inhalierte 13-cis-RA irgendeine Auswirkung auf Leber-RARs hatte. Die Western-Blot-Analyse von Rattenleberproben derselben Ratten, wie in 2A gezeigt, zeigte keine Zunahme der RARs nach Verabreichung der 13-cis-RA durch Inhalation (nicht gezeigt), was das Konzept stützte, dass die topische Verabreichung ein wirksames Mittel zur lokalen Biomarker-Verstärkung ist, dass aber die systemische Konzentration von 13-cis-RA, die aus der inhalierten Arzneistoffzufuhr resultiert, nicht ausreicht, um Leber-RARs zu induzieren.
Weiter wurden Ratten dazu gebracht, verschiedene Mengen der gleichen Lösung von 13-cis-RA zu inhalieren, indem die Einwirkungszeiten zwischen 5 und 240 Minuten täglich über 14 aufeinanderfolgende Tage variiert wurden, was verschiedene inhalierte Dosen zwischen 115,0 und 5935,6 μg/kg Körpergewicht zur Folge hatte, Tabelle 1. Die Western-Blot-Analyse dieser Rattenlungengewebe ist in 3A gezeigt, und ihre Densitometrie in 3B. Was das vorige Experiment betrifft, erhöht der inhalierte 13-cis-RA wirksam die Menge an RAR-Proteinen zwischen dem 1,2- und 38,8-fachen bei RAR, dem 1,6- und 30,6-fachen bei RAR und dem 2,2- und 74,0-fachen bei RAR (3B). Jedoch gab es keine offensichtliche Dosis-Antwort-Beziehung, und es schien, dass die wirksamste Einwirkung die kürzeste war (d.h. über 5 Minuten bei 115,0 μg/kg Körpergewicht). Im Gegensatz zu der beobachteten Stimulation der Lungen-RARs sprachen Leber-RARs nicht auf inhalierte 13-cis-RA an (nicht gezeigt).
Nahrungs-RA erhöht Leber-RARs
Als nächstes wurde die Hypothese getestet, dass Nahrungs-RA für die Erhöhung von Leber-RARs wirksam sein könnte. Wir verwendeten SENCAR-Mäuse, denen 75 Wochen lang entweder eine physiologische RA-Nahrung (3 μg/g Nahrung) oder eine pharmakologische RA-Nahrung (30 μg/g Nahrung) verfüttert wurde, wie in Tabelle 5 angezeigt. Nahrungs-RA (30 μg/g Nahrung) regulierte RARs (4A) in Leber von männlichen SENCAR-Mäusen um das 21,8-fache bei RAR, das 13,5-fache bei RAR und das 12,5-fache bei RAR hinauf (4B).
4C zeigt eine repräsentative immunhistochemische Analyse von männlichen SENCAR-Mausleber-Proben unter Verwendung von polyklonalem Antikörper gegen RARα, wie unter Materialien und Methoden erklärt. Eine deutliche Zunahme der Färbung wurde in den Zellkernen von Mäusen beobachtet, welche die pharmakologische RA-Nahrung einnahmen, verglichen mit physiologischer RA.
Nahrungs-RA weist die Fähigkeit auf, RARs in kürzeren Zeitspannen der Nahrungsaufnahme von physiologischen oder pharmakologischen RA-Konzentrationen zu erhöhen, wie in Tabelle 7 angezeigt. 5A und B zeigen eine Induktion von Leber-RAR zwischen dem 1,4- und 4,4-fachen; zwischen dem 2,2- und 14,3-fachen für RAR und zwischen dem 1,3- und 8,9-fachen für RAR. In scharfem Gegensatz dazu wurde keine Auswirkung von Nahrungs-RA auf Lungengewebe-RARs beobachtet (nicht gezeigt).
Erörterung der Hinaufregulierungs-Inhalationsexperimente
Retinoide sind Schlüssel-Regulatoren der Lungenepithel-Zelldifferenzierung und wirken als Liganden der Zellkern-Rezeptoren-RARs. Sie sind in chemopräventiven Ansätzen in verschiedenen Geweben verwendet worden, und es wurde gezeigt, dass 13-cis-RA gegen Leukoplakie sowie gegen Kopf- und Nackenkrebs wirksam ist. Jedoch bereitet eine systemische Verabreichung beträchtliche Probleme, wenn man die wechselwirkende Natur der Retinoid-Moleküle und der hohen Affinität von Albumin zu Retinoiden im Blut berücksichtigt. In der Tat haben wir früher gezeigt, dass die Aufnahme von Serum-Retinoiden in kultivierte Zellen umgekehrt mit der Konzentration an Albumin in Kulturmedium in Beziehung steht. Die Hoch-Affinitäts-Wechselwirkung von Retinoiden mit Albumin und möglicherweise anderen Proteinen kann das Erzielen von wirksamen Retinoid-Konzentrationen im Lungenepithel beschränken und die chemopräventive Wirkung behindern. Deshalb haben wir einen alternativen Ansatz vorgeschlagen, d.h. die Möglichkeit, dass die topische Zufuhr zur Lunge durch Inhalation wirksamere chemopräventive Ansätze gestatten könnte.
Mit der Art des nachstehend beschriebenen effizienten Zufuhrsystems ist die Arzneistoffmenge, die erforderlich ist, um eine kritische Retinoid-Dosis-Konzentration im Bronchialepithel zu erzielen, ein kleiner Bruchteil der Dosen, die klinisch verwendet worden sind. Da nur eine geringe Arzneistoffmenge pro Dosis verabreicht würde, sollten sowohl das Potential für Nebenwirkungen als auch die Kostengünstigkeit des Arzneistoffs im Vergleich zum oralen Standard-Arzneistoffzufuhr-Ansatz verbessert sein.
Die vorliegende Erfindung hat die Hypothese getestet, dass 13-cis-RA, wenn es topisch durch Inhalation zugeführt wird, wirksamer sein könnte, um die Hinaufregulierung von Schlüssel-Zielgenen am Zielort hervorzurufen, als wenn es in der Nahrung verabreicht wird. Unsere Experimente stehen im Einklang mit dieser Hypothese. Inhalierte 13-cis-RA erhöht die Lungen-TGase II-Aktivität (P < 0,001) ohne signifikante Wirkung auf die Leberenzym-Aktivität (P < 0,544), aber verfüttertes RA wies eine signifikante Wirkung auf die Leberenzym-Aktivität von SENCAR-Mäusen auf (P < 0,003). Weiter stimulierte inhalierte 13-cis-RA in großem Maß die pulmonale RAR-Expression auf dem Protein-Niveau bei allen drei Rezeptoren, während es keinerlei signifikante Wirkung auf Leber-RARs aufwies. Interessanterweise wurde eine deutliche Stimulierung von RARs bereits nach 5-minütiger Inhalation beobachtet (3A). Die Stimulation von RARα, β und γ in den Lungenproben bestätigt, dass die Aerosolapparatur den Lungen wirksam 13-cis-RA zuführte und deshalb die sofortige Antwort bei der Biomarker-Hinaufregulierung ermöglichte.
Zusammenfassung der Inhalations-Hinaufregulationsexperimente
Die vorliegende Erfindung testete die Hypothese, dass chemopräventive Retinoide, wie 13-cis-Retinoesäure (13-cis-RA), wirksamer sein könnten, wenn sie dem Lungenepithel durch Inhalation zugeführt werden, anstelle in der Nahrung verabreicht zu werden. Wir verwendeten das Enzym Transglutaminase II (TGase II) und Retinoesäure-Rezeptoren als mögliche Biomarker der Retinoid-Aktivität. Zuerst verifizierten wir, dass 13-cis-RA mit all-trans-Retinoesäure (RA) in ihrer Fähigkeit vergleichbar war, das Zielgen TGase II in kultivierten Humanzellen zu induzieren. Als nächstes verwendeten wir 13-cis-RA, eine Verbindung mit weniger Toxizität als RA, für unsere Inhalationsstudien. Inhalierte 13-cis-RA wies eine signifikante stimulierende Aktivität für TGase II in Lunge (P < 0,001), aber nicht in Lebergewebe (P < 0,544) auf. Weiter wurde gefunden, dass RAR und Proteine hochempfindliche Biomarker der Retinoid-Einwirkung sind. Inhalierte 13-cis-RA (eine tägliche abgeschiedene Dosis von 6,4 mg/kg/Tag) war wirksam bei der Hinaufregulierung der Expression von Lungengewebe-RAR, sowohl am Tag 1 (RAR um das 3,4-fache; RAR um das 7,2- und RA um das 9,7-fache) als auch am Tag 17 (RAR um das 4,2-fache; RAR um das 10,0- und RAR um das 12,9-fache). Eine tägliche abgeschiedene Dosis von 1,9 mg/kg/Tag war ebenso wirksam, aber erforderte mehr Einwirkungen. Am Tag 28 der Einwirkung war Lungen-RAR 4,7-fach induziert; RAR 8,0- und RAR 8,1-fach. Die Inhalation der gleichen Aerosol-Konzentration in abgestuften Einwirkungen, z.B. Dauern von 5 bis 240 min täglich über 14 Tage, induzierte alle RARs vom 30,6- bis zum 74-fachen bei der kürzesten Einwirkungszeit. Im Gegensatz dazu induzierte eine langfristige Verfütterung einer Nahrung, die pharmakologisches RA enthielt (30 μg/g Nahrung) RARs von SENCAR-Maus-Lungengewebe nicht, obwohl es deutlich Leber-RARs induzierte (RAR 21,8-fach; RAR 13,5- und RAR 12,5-fach). Eine auffällige Zunahme der RAR-Expression war in den Zellkernen von Hepatozyten dieser Mäuse ersichtlich. Eine Zeitverlaufs-Studie zeigte, dass pharmakologische Nahrungs-RA RAR ohne jegliche messbare Auswirkung auf Lungengewebe-RARs stimulierte, und bereits am Tag 1 2-, 4- bzw. 2,1-fach gegenüber physiologischer RA (3 μg/g Nahrung). Diese Daten demonstrieren, dass 13-cis-RA, die dem Lungengewebe von Ratten zugeführt wird, ein potentes Stimulans von Lungen-RARs ist, aber keine Wirkung auf Leber-RARs besitzt. Umgekehrt stimuliert Nahrungs-RA Leber-RARs, beeinflusst aber Lungengewebe-RARs nicht. Diese Daten stützen zusammen mit den Daten über TGase II das Konzept, dass die Epithel-Zufuhr von chemopräventiven Retinoiden an Lungengewebe eine wirksamere Weise für die Hinaufregulierung der Retinoid-Rezeptoren und möglicherweise für die Chemoprävention der Lungen-Karzinogenese sein könnte.
Tabelle 1: Lungen- und Leber-Proben (Experiment B)
Die Ratten wurden zwischen 2 h und 50 min und 7 h nach Einwirkung getötet
Tabelle 2: TGase II-Assay von Ratten-Lungengewebe (Experiment B)
Tabelle 3: TGase II-Assay von Ratten-Lebergewebe (Experiment B)
Tabelle 4: Ratten-Lungen- und Leber-Proben (Experiment A)
Tabelle 5: SENCAR-Maus-Leber-Proben
Tabelle 6: TGase II-Assay von SENCAR-Maus-Lebergewebe
Tabelle 7: SENCAR-Maus-Leber- und Lungen-Proben
II. Verfahren für Hinaufregulierungs-Inhalations-Experimente
Tiere und Behandlung
Die Tiere waren einzeln in Polycarbonat-Käfigen untergebracht. Allgemeine Vorgehensweisen für die Tierversorgung und -unterbringung erfüllten derzeitige AAALAC-Standards, derzeitige Anforderungen, die im "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Academy of Sciences, 1996) und im U.S. Department of Agriculture durch den Animal Welfare Act (Public Law 99–198) angegeben sind.
Es waren zwölf Stunden Licht und zwölf Stunden Dunkelheit in den Tierräumen vorgesehen. Eine Fluoreszenzlichtquelle wurde verwendet, wobei das Licht täglich um ~ 6.00 Uhr angeschaltet wurde. Der Licht/Dunkel-Zyklus wurde unterbrochen, um den Beginn oder die Beendigung einer Studie zu ermöglichen.
Alle Studien-Tiere wurden mindestens 5 Tage mit zunehmender Dauer bis zu 120 Minuten vor der ersten tatsächlichen Inhalationseinwirkung in die Inhalationseinwirkungs-Rohre eingeführt. Innerhalb von 24 Stunden nach der letzten Einwirkung wurden die Tiere durch eine Pentobarbital-Überdosis euthanisiert; ihre Lungen wurden entfernt, in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und auf Trockeneis zum NCl für die Biomarker-Bestimmung gesendet.
Mäuse
Männliche 6–8-Wochen alte A/J-Mäuse (Jackson Laboratories) wurden mindestens 7 Tage in Quarantäne gegeben. Ihre Futter während des ganzen Experiments war AIN-76A. Als Teil der Lungenkrebs-Chemopräventionsstudie (Dahl et al., 2000) wurde den Mäusen im Alter von 9–10 Wochen durch intraperitoneale Injektion eine einzige 0,2 ml-Dosis einer Karzinogen-Lösung (20 mg Urethan in Kochsalzlösung) verabreicht. Am nächsten Tag wurde mit täglichen 45-minütigen Einwirkungen von Isotretinoin-Aerosol oder Vehikel begonnen. Die Vehikel-Kontroll-Mäuse wurden mit dem Karzinogen behandelt und dem Aerosol-Vehikel ausgesetzt; Luftkontroll-Mäuse wurden mit dem Karzinogen behandelt und ohne Aerosol-Einwirkung in Käfigen gehalten. Zuerst war bei beiden Dosen die Einwirkung täglich, aber nach 12 Tagen wurde die höhere Dosis wegen schwerer lokaler Toxizität auf zweimal wöchentlich und die niedrigere Dosis als Vorsichtsmaßnahme auf dreimal wöchentlich verringert.
Ratten: Studie A
Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River Laboratory erhalten. Sie wurden in Quarantäne gegeben und über einen Zeitraum von achtundsiebzig Tagen vor der Inhalationseinwirkung beobachtet, um ihre Gesundheit zu bewerten. Nach Überprüfung durch einen Tierarzt-Mitarbeiter wurden die Tiere zur Verwendung bei der Studie freigegeben. Alle Tiere wurden als gesund und zur Verwendung in der Studie annehmbar angesehen. Die Ratten hatten ein Alter von etwa 17 Wochen, und ihr Körpergewicht lag am ersten Tag der Dosis-Verabreichung im Bereich von 512,2 bis 663,3 g. Man gestattete den Ratten Zugang zu Certified Rodent Diet (P.M.I. Feeds, Inc.) nach Belieben (außer während der Dosis-Verabreichung). Frisches Wasser aus der städtischen Wasserversorgung von Columbus wurde nach Belieben bereitgestellt (außer während der Dosis-Verabreichung).
Ratten: Studie B
Gleiche Zahlen von männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River Laboratory erhalten. Sie wurden in Quarantäne gegeben und über eine Zeitspanne von mindestens sieben Tagen vor der Inhalationseinwirkung beobachtet, um ihre Gesundheit zu bewerten. Nach der Überprüfung durch einen Tierarzt-Mitarbeiter wurden die Tiere zur Verwendung bei der Studie freigegeben. Alle Tiere wurden als gesund und zur Verwendung in der Studie annehmbar angesehen. Die Ratten wiesen ein Alter von 7–14 Wochen auf, und ihr Körpergewicht lag am ersten Tag der Einwirkung im Bereich 200–350 g. Man gestattete ihnen Zugang zu Certified Rodent Chow^® 5002 (P.M.I. Feeds, Inc.) nach Belieben (außer während der Dosis-Verabreichung). Frisches Wasser aus der städtischen Wasserversorgung von Columbus wurde nach Belieben bereitgestellt (außer während der Dosis-Verabreichung).
Isotretinoin
Isotretinoin (13-cis-Retinoesäure) wurde von Hande-Tech (Houston, TX) oder Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) oder Toronto Research (North York, Ontario) erhalten. Die Sendung wurde bei Raumtemperatur erhalten und wurde vor der Formulierung bei ~ 5EC aufbewahrt.
Formulierung von Vernebler-Lösungen
Mäuse
Pulverförmiges Isotretinoin wurde in 100 %-igem Ethanol plus 0,1 % α-Tocopherol und 0,1 % Ascorbylpalmitat so gelöst, dass sich Isotretinoin-Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 mg/ml ergaben. Die Formulierungen wurden monatlich hergestellt. Die Lösungen wurden vor Licht geschützt und bis zur Verwendung bei –5°C aufbewahrt. Die ultraviolett-sichtbare spektrophotometrische Verifikation der formulierten Testgegenstands-Konzentration wurde vor den Inhalationsbehandlungen mit der Testgegenstands-Lösung bei allen Chargen durchgeführt. Nur Formulierungen innerhalb ± 10 % der Zielkonzentration wurden bei der Studie verwendet.
Rattenstudie A
Formulierungen von Isotretinoin zu 1,4 mg/ml in Dosierungslösung mit 100 %-igem Ethanol wurden hergestellt. Die Lösungen wurden in bernsteinfarbene Glasflaschen mit Teflon^®-ausgekleideten Deckeln abgefüllt und bei ~ 5EC aufbewahrt.
Rattenstudie B
Pulverförmige 13-cis-Retinoesäure wurden in 10:90 (Vol./Vol.) PEG 300: 100 %-igem Ethanol gelöst, das 0,5 % (Gew./Vol.) Ascorbinsäure und 0,5 % (Gew./Vol.) Phosphatidylcholin enthielt. Es wurde ausreichend Testgegenstand für alle Behandlungssitzungen formuliert. Er wurde in tägliche Dosen in bernsteinfarbene Fläschchen abgefüllt und vor Licht geschützt bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Die Verifikation der Konzentration des formulierten Testgegenstands wurde wöchentlich bei allen Chargen durchgeführt. Nur Formulierungen mit Analyseergebnissen innerhalb von ± 10 % der Zielkonzentration wurden bei der Studie verwendet.
Inhalationseinwirkung
Die Lösungen wurden unter Verwendung eines Pari LC-Plus-Verneblers (Pari, Richmond, VA) aerosolisiert. Die Tiere wurden Nur-Nasen-Einwirkungseinheiten ausgesetzt, die so gebaut waren, dass sie jedem Tier eine frische Zufuhr der Testatmosphäre unabhängig von den anderen Tieren lieferten. Die Einwirkungseinheiten beruhten auf dem Aufbau, der von W. C. Cannon (Cannon et al., 1983) beschrieben wurde. Die Einheiten bestanden aus modularen Mehretagen-Abschnitten, wobei jede Etage acht Einwirkungsöffnungen enthielt, die am Umkreis um eine zentrale Zufuhrverteilungskammer herum angeordnet waren.
Während der Einwirkungen waren die Tiere in unverschlossenen Polycarbonat-Rohren (C&H Technologies, Westwood, NJ) eingeschlossen, durch die ein Aerosolstrom, 350–500 ml/min pro Tier, aus der Kammer trat. Die Rohre liefen an einem Ende konisch zu, so dass sie ungefähr an die Form des Kopfes des Tiers angepasst waren, und der Durchmesser des zylindrischen Abschnitts des Konus war so, dass sich die Tiere in den Konen nicht drehen konnten. Jeder Konus wurde an der Inhalationskammer so befestigt, dass der Nasenabschnitt durch eine Dichtung in die Kammer vorsprang. Dies ermöglichte, dass die Tiere die Test- oder Kontrollatmosphäre einatmeten, die aus dem Inneren der Steuerungsverteilungskammer ausströmte. Die Fließgeschwindigkeit durch die Kammer war so eingestellt, dass sie etwa 350 bis 500 ml/min für jedes Tier bereitstellte. Die Einwirkungseinheit wurde unter positivem Druck betrieben.
Aerosol-Charakterisierung
Um die Aerosol-Konzentrationen zu bestimmen, wurden abgemessene Aerosol-Volumina durch Filter gesaugt, die anschließend mittels eines UV/VIS-Verfahrens bezüglich Isotretinoin analysiert wurden. Um die Teilchengröße zu bestimmen, wurde Aerosol durch Kaskaden-Aufschlagvorrichtungen vom Mercer-Typ (InTox, Albuquerque, NM) gesaugt, die bei jeder Stufe mit Filtern und mit einem Sicherungsfilter ausgestattet waren. Die einzelnen Filter wurden bezüglich Isotretinoin analysiert, und die aerodynamischen Massenmedian-Durchmesser (MMADs) und die geometrischen Standardabweichungen (GSDs) wurden unter Verwendung von Battelle-Software aus den Daten berechnet.
Berechnungen der abgeschiedenen Dosis
Abgeschiedene Dosen wurden wie folgt berechnet:
worin (2,1 × KG(g)^0,75) die Guyton-Formel für Minutenvolumen in ml/min ist (Guyton, 1947), KG Körpergewicht ist und f der Abscheidungsbruchteil ist.
Es wurde angenommen, dass die Abscheidungsbruchteile bei Mäusen und Ratten die gleichen wie bei monodispersen 1,09- bzw. 1,03 μm-Aerosolen (Raabe et al., 1988) sind.
Aeorosol-Charakteristika
Mäuse
Die mittleren Aerosol-Konzentrationen und SAs waren 1,3 ± 0,7 (SA) (N = 12), 20,7 ± 10,1 (SA) (N = 36) und 481 ± 234 (SA) (N = 36) μg Isotretinoin/l bei der niedrigen, mittleren bzw. hohen Einwirkung. Die MMADs und (GSDs) bei der niedrigen, mittleren und hohen Dosis waren 1,00 (2,08), 1,33 (1,76) bzw. 1,64 (2,61) μm.
Rattenstudie A
Die Aerosol-Charakteristika befinden sich in Tabelle 9.
Rattenstudie B
Die Ziel-Aerosol-Charakteristika befinden sich in Tabelle 10.
Inhalationseinwirkungen von Isotretinoin
Ethanolische Isotretinoin-Lösungen wurden mit Teilchengrößen aerosolisiert, von denen berechnet wurde, dass sie eine beträchtliche pulmonale Abscheidung liefern. Die Vehikel-Dämpfe wurden nicht aus der Einwirkungsluft entfernt und können eine Auswirkung auf Biomarker gehabt haben, da Vehikeln ausgesetzte Tiere höhere Konzentrationen einiger Marker aufwiesen als nicht ausgesetzte Kontrollen. Jedoch war der Effekt gering und kann durch den Stress der Hantierung und der Einwirkung beeinflusst worden sein. Stress hat signifikante Auswirkungen auf einige Parameter, einschließlich Tumorgenese (Yamamoto et al., 1995), und kann zu den verringerten Tumor-Zahlen bei Mäusen beigetragen haben, die Isotretinoin (Dahl et al., 2000) und Budesonid (Wattenberg et al., 1997) ausgesetzt wurden. In jedem Fall erzeugte die Zugabe von Isotretinoin zu dem Aerosol bei der mittleren Dosiskonzentration eine signifikante Erhöhung der Biomarker-Expression im Vergleich zu Aerosolen mit Vehikel allein.
Tabelle 8. Dosis von inhaliertem Isotretinoin in Mäusen, die Isotretinoin-Aerosolen ausgesetzt wurden

a. Vehikel-Kontrolle und niedrige Dosis durchwegs 45 Minuten täglich einwirken gelassen; hohe Dosis während der ersten 12 Tage 45 Minuten täglich, in den Wochen 3–10 45 Minuten 3-mal pro Woche einwirken gelassen.
b. Vehikel war 0,1 % α-Tocopherol und 0,1 % Ascorbylpalmitat in Ethanol.

Tabelle 9. Dosis von inhaliertem Isotretinoin in Ratten der Studie A, die Isotretinoin-Aerosolen ausgesetzt wurden^a

a. Vier männliche Ratten bei jeder Einwirkungsdauer wurden Isotretinoin-Aerosol bei Konzentrationen von ~ 62,2 μg/l, MMAD (GSD), 1,5 μm (~ 2,0) täglich über 14 Tage ausgesetzt und wurden am Tag 15 geopfert.
b. Drei Vehikel-Kontrolltiere wurden täglich 240 Minuten ausgesetzt. Das Vehikel war 100 % Ethanol.

Tabelle 10. Dosis von inhaliertem Isotretinoin in Ratten der Studie B, die Isotretinoin-Aerosolen ausgesetzt wurden^a

a. Ratten wurden Aerosol 2 Stunden/Tag ausgesetzt. Ziel-MMADs (GSDs) waren 1,3 μm (2,0).
b. Vehikel-Kontrollratten wurden 1 oder 28 Tage ausgesetzt. Vehikel war 10:90 (%); PEG 300:100 %-iges Ethanol, USP, 0,5 % (Gew./Vol.) Ascorbinsäure (Gew./Vol.) 0,5 % Phosphatidylcholin.

III. Demonstration, dass inhaliertes Isotretinoin (13-cis-Retinoesäure) bei niedrigen Dosen ein wirksames chemopräventives Mittel für Lungenkrebs in A/J-Mäusen ist.
Die Abkürzungen sind: BaP für Benzo(a)pyren; NNK für 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon; RAR für Retinoesäure-Rezeptor; SDS für Natriumdodecylsulfat; PBS für Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; EDTA für Ethylendiamintetraessigsäure; EGTA für Ethylenglycolbis[beta-aminoethylether]-N,N,N',N'-tetraessigsäure; PMSF für Phenylmethylsulfonylfluorid; HEPES für N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]; DTT für Dithiothreit; MMAD für aerodynamischer Massenmedian-Durchmesser; GSD für geometrische Standardabweichung; IDV für integrierter Dichtewert.
Verfahren Lungenkarzigonese-Modell
Die A/J-Maus ist ein gut etabliertes Tiermodell für vorklinische Chemopräventionsstudien. Dieser Stamm weist eine erbliche Anfälligkeit für Lungenkrebs auf, die sogenannten pulmonalen Adenom-Empfänglichkeits (Pas)-Gene. Ein starker Kandidat für eines dieser Gene, Pas-1, ist das K-ras-Protoonkogen. Die Karzinogenese in diesem Modell mit NNK als Stimulierungsmittel ist untersucht worden, so dass die Zeiten, die erforderlich sind, um hyperplastische Bereiche, Adenome und Karzinome zu entwickeln, wohlbekannt sind. Zusätzlich ist der Zeitverlauf der molekularen Änderungen, die mit der Karzinogenese verbunden sind, untersucht worden und ist dem bei Menschen ähnlich. In beiden Arten sind K-ras-Mutationen gemeinsame frühe Ereignisse.
Versuchsplan
Mäusen wurde eines von drei Karzinogenen injiziert, und sie wurden 10 (Urethanbehandelte Mäuse) oder 16 (NNK- oder BaP-behandelte Mäuse) Wochen in Gruppen von 21 drei abgestuften Konzentrationen von Isotretinoin oder Vehikel mittels Inhalation ausgesetzt. 46 mit jedem Karzinogen behandelte Mäuse und 46 unbehandelte Kontrollen wurden in Käfigen gehalten und nicht ausgesetzt. Einige von diesen wurden zu Zwischenzeiten geopfert, um den Fortschritt der Karzinogenese zu bestimmen. Zuerst war die Einwirkung bei allen Dosen täglich, aber nach 12 Tagen wurde sie bei der höchsten Dosis wegen schwerer lokaler Toxizität auf zweimal wöchentlich und bei der mittleren Dosis als Vorsichtsmaßnahme auf dreimal wöchentlich verringert (Tabelle 2).
Tiere und Behandlung
Männliche 6–8 Wochen alte A/J-Mäuse (Jackson Laboratories) wurden mindestens 7 Tage in Quarantäne gegeben. Ihr Futter im ganzen Experiment war AIN-76A, welches bei NNK höhere Tumorraten als NIH-07 ergibt. Im Alter von 9–10 Wochen wurden den Mäusen mittels intraperitonealer Injektion eine einzige 0,2 ml-Dosis (20 mg Urethan in Kochsalzlösung, 0,6 mg NNK in Kochsalzlösung oder 2 mg BaP in Tricaprylin) verabreicht. Am nächsten Tag wurde mit 45-minütigen Einwirkungen von Isotretinoin-Aerosol oder Vehikel begonnen.
Formulierung der Vernebler-Lösung
Pulverförmiges Isotretinoin wurden in 100 %-igem Ethanol plus 0,1 % α-Tocopherol und 0,1 % Ascorbylpalmitat so gelöst, dass sich Isotretinoin-Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 mg/ml ergaben. Die Formulierungen wurden monatlich hergestellt. Die Lösungen wurden vor Licht geschützt und bis zur Verwendung bei –5°C aufbewahrt. Ultraviolett-sichtbare spektrophotometrische Verifikation der Konzentration des formulierten Testgegenstands wurde vor den Inhalationsbehandlungen mit der Testgegenstands-Lösung bei allen Chargen durchgeführt. Nur Formulierungen innerhalb von ± 10 % der Ziel-Konzentration wurden bei der Studie verwendet.
Inhalations-Einwirkung
Die Lösungen wurden unter Verwendung eines Pari LC-Plus-Verneblers (Pari, Richmond, VA) aerosolisiert. Die Tiere wurden Nur-Nasen-Einwirkungseinheiten ausgesetzt, die so gebaut waren, dass sie jedem Tier eine frische Zufuhr der Testatmosphäre unabhängig von den anderen Tieren lieferten. Die Einwirkungseinheiten beruhten auf dem Aufbau, der von W. C. Cannon (Cannon et al., 1983) beschrieben wurde. Die Einheiten bestanden aus modularen Mehretagen-Abschnitten, wobei jede Etage acht Einwirkungsöffnungen enthielt, die am Umkreis um eine zentrale Zufuhrverteilungskammer herum angeordnet waren. Während der Einwirkungen waren die Tiere in unverschlossenen Polycarbonat-Rohren (C&H Technologies, Westwood, NJ) eingeschlossen, durch die ein Aerosolstrom, 350–500 ml/min pro Tier, aus der Kammer trat. Die Rohre liefen an einem Ende konisch zu, so dass sie ungefähr an die Form des Kopfes des Tiers angepasst waren, und der Durchmesser des zylindrischen Abschnitts des Konus war so, dass sich die Tiere in den Konen nicht drehen konnten. Jeder Konus wurde an der Inhalationskammer so befestigt, dass der Nasenabschnitt durch eine Dichtung in die Kammer vorsprang. Dies ermöglichte, dass die Tiere die Test- oder Kontrollatmosphäre einatmeten, die aus dem Innneren der zentralen Verteilungskammer ausströmte.
Aerosol-Charakterisierung
Um die Aerosol-Konzentrationen zu bestimmen, wurden abgemessene Aerosol-Volumina durch Filter gesaugt, die anschließend mittels eines UV/VIS-Verfahrens bezüglich Isotretinoin analysiert wurden. Um die Teilchengröße zu bestimmen, wurde Aerosol durch Kaskaden-Aufschlagvorrichtungen vom Mercer-Typ (InTox, Albuquerque, NM) gesaugt, die bei jeder Stufe mit Filtern und mit einem Sicherungsfilter ausgestattet waren. Die einzelnen Filter wurden bezüglich Isotretinoin analysiert, und die aerodynamischen Massenmedian-Durchmesser (MMADs) und die geometrischen Standardabweichungen (GSDs) wurden unter Verwendung von Battelle-Software aus den Daten berechnet.
Quantifizierung der Lungenläsionen
Innerhalb von 24 h nach der letzten Einwirkung wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital euthanasiert, und ihre Lungen wurden entfernt und in Bouin-Lösung fixiert oder für die RAR-Bestimmung biltzeingefroren. Die Lungen wurden auf blinde Weise ausgewertet, so dass der auswertenden Person, die visuell hyperplastische Bereiche und Adenome auf der Lungenpleura-Oberfläche zählte, wie zuvor beschrieben, weder Karzinogen noch Isotretinoindosis-Konzentrationen bekannt waren. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen dem mittleren Tumor-Vorkommen der Behandlungs- und Kontrollgruppen wurde unter Verwendung des Mann-Whitney-Rank-Sum-Tests (Statmost TM, DataMost Corp., Sandy, Utah) bestimmt.
Biomarker: RAR-Induktion
Antikörper: Polyklonale Antikörper gegen RARα, β und γ (Santa Cruz Biotechnology Inc., San Francisco, CA) wurden mit einem BM Chemolumineszenz Western-Blotting-Kit (Maus/Kaninchen) (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis) verwendet.
Apparatur und Reagenzien für die Western-Blot Analyse: Das X Cell II Mini-Cell & Blot Module wurde mit 10 % Tris-Glycingelen und Überführungspuffer; Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer verwendet; Tris-Glycin-SDS wurde als Laufpuffer verwendet (NOVEX – NOVEL Experimental Technology Inc., San Francisco, CA).
Versuchsplan: Jeweils fünf Lungen der mit Urethan behandelten Vehikel-, Niedrigdosis- und Mitteldosis-Tiere wurden in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und für die Bestimmung der RARs α, β und γ durch Western-Blot-Analyse bei –70°C aufbewahrt. Zusätzlich wurden jeweils fünf Lungen von nicht-ausgesetzten Mäusen, denen Urethan injiziert worden war, und unbehandelten Kontrollmäusen für Western-Blots bestimmt. Die Lungen wurden homogenisiert, und die RARs wurden durch Standard-Western-Blotting (21, 22) bestimmt. Aufgrund von Todesfällen früh im Hochdosis-Experiment waren keine Lungen für die Western-Blot-Analyse für die Hochdosis-Einwirkungen verfügbar, d.h. alle Gewebe wurden für Läsions-Quantifizierungszwecke verwendet.
Proben: Lungengewebe wurde gesammelt, auf Trockeneis eingefroren und bis zur Verwendung bei –70°C gehalten. Eine 500 mg-Portion wurde in kleine Stücken gewürfelt und in 300 μl kalter PBS unter Verwendung eines Hand-Homogenisators 2–3 min lang homogenisiert. Die Proben wurden 5 min, oder bis der Überstand klar war, bei 500 U/min zentrifugiert. Das Pellet in 400 μl kaltem Puffer A (2 μl 0,5 M EDTA, 10 μl 1 mM EGTA, 50 μl 100 mM PMSF, 10 μl 1 M DTT, 10 ml (10 mM HEPES pH 7,9 + 10 mM KCl)] suspendiert und 15 min bei Eistemperatur gelassen. Ein 25 μl-Volumen einer 10 %-igen NP-40-Lösung wurde dazugegeben, und die Proben wurden heftig 10 Sekunden lang in einem Vortexer gemischt. Die Proben wurden 1 min bei 4°C bei 14.000 U/min zentrifugiert, und das Pellet wurde noch einmal auf diese Weise behandelt. Der Überstand wurde entfernt, und 25–100 μl Puffer C [4 μl 0,5 M EDTA, 20 μl 100 mM EGTA, 20 μl 0,1 M PMSF, 2 μl 1 M DDT, 2 ml (20 mM HEPES pH 7,9 + 0,4 M NaCl)] wurden dazugegeben. Die Pellets wurden durch sanftes Klopfen auf den Boden des Eppendorf-Röhrchens resuspendiert. Die Proben wurden heftig in einem Eimer mit Eis auf einem Rundschüttler 30 min lang geschüttelt. Die Proben wurden 5 min bei 4°C bei 14.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden bei –70°C gefroren gehalten, bis sie benötigt wurden. Die Protein-Konzentrationsbestimmung wurde mittels des Bradford-Verfahrens (23) durchgeführt.
Analyse: Proben wurden hergestellt, indem man 1 Teil des Probenpuffers zu 1 Teil Probe gab und gut mischte. Für Denaturierungsbedingungen wurden Proben 5 min bei 95°C erwärmt. 5 μl Rainbow-Standard und 5 μl biotinylierter Molekularmarker wurden verwendet. 20 μg Protein pro Probe wurde in jede Bahn geladen. Die Elektrophorese wurde 1–1,5 h mit bei 125 V eingestellter Spannung durchgeführt. Die Gelüberführung wurde 2 h bei 25 V durchgeführt. Die Membran wurde 5 min in Ponceau S. gefärbt und in einem Waschschritt mit 5 %-iger Essigsäure entfärbt. Die Membran wurde in TBS-Lösung gewaschen, bis die Färbung verschwand, und wurde dann 1 ml Blockierungslösung und 9 ml TBS 60 min zusammen mit 20 μl Lösung von primärem Antikörper über Nacht inkubiert (Verdünnung 1:1000). Die Membran wurde dreimal 10 min in PBS-Tween-20 gewaschen, wonach sie in 1 ml Blockierungslösung und 19 ml TBS zusammen mit 20 μl HRP-verknüpftem Antibiotin-Antikörper und 2 μl sekundärem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (1:10.000 Verdünnung) 30 min inkubiert wurde. Die Membran wurde viermal jeweils 10 min in PBS-Tween-20 gewaschen. Der Film wurde dem Nachweis und der Entwicklung ausgesetzt.
Aerosol-Charakteristika
Die mittleren Aerosol-Konzentrationen und SAen waren 1,3 ± 0,7 (N = 12), 20,7 ± 10,1 (N = 36) und 481 ± 234 (N = 36) μg Isotretinoin/l für die niedrige, mittlere bzw. hohe Einwirkung. Die MMADs und (GSDs) der niedrigen, mittleren und hohen Dosis waren 1,00 (2,08), 1,33 (1,76) bzw. 1,64 (2,61) μm. [Das Fortschreiten zu größeren MMADs bei höheren Aerosol-Konzentrationen ist das Ergebnis von höheren relativen Konzentrationen an nicht-flüchtigen Stoffen, welche die Zusammensetzungen dominieren, nachdem das Ethanol-Vehikel teilweise verdampft ist; so waren die Prozentsätze an nicht-flüchtigen Stoffen – einschließlich des α-Tocopherolacetat- und Ascorbylpalmitat-Stabilisators – 0,21, 0,3 und 1,2, was zu minimalen Tröpfchengrößen (d.h., wenn alles Ethanol verdampft ist) von 0,38, 0,43 bzw. 0,69 μm führt. Die minimalen Tröpfchengrößen wurden berechnet, indem man einen MMAD von 3 μm bei den in diesen Experimenten verwendeten Pari-LC-Jet-Plus-Verneblern annahm und die Beziehung d_End = d_urspf verwendet, worin d_End der Enddurchmesser ist, d_ursp der ursprüngliche Durchmesser ist und f der Massenbruchteil von gelöstem Stoff ist.
Berechnungen der abgeschiedenen Dosis
Inhalierte monodisperse Teilchen mit einem aerodynamischen Durchmesser (AD) von 1,09 μm scheiden sich zu 9,2 % im pulmonalen Bereich ab, mit einer Gesamtabscheidung von 59,2 % (24). Wenn man das durchschnittliche Mausgewicht als 22 g annimmt, beträgt das Atmungsminutenvolumen – berechnet, wie es Raabe und Mitarbeiter (1998) gemacht haben – 2,1 × [Masse (g)]^0,75 ml/min (25). Wenn man den gleiche Abscheidungswirkungsgrad wie bei monodispersen 1,09 μm-Teilchen annimmt – aus Gründen der Einfachheit, da die tatsächlichen Werte für diese Aerosole etwas variieren – betrugen die berechneten täglichen pulmonalen Isotretinoin-Dosen bei jeder 45-minütigen Einwirkung ~ 0,005, 0,081 und 0,2 mg/kg pro Einwirkung. Die berechneten abgeschiedenen Gesamtdosen betrugen 0,034, 0,54 und 12,4 mg/kg pro Einwirkung (Tabelle 2).
Chemoprävention durch inhaliertes Isotretinoin
Alle Vergleiche sind gegenüber Vehikel ausgesetzten Kontrollmäusen, wenn nicht anders angemerkt. Mäuse, die einer hohen Isotretinoin-Dosis ausgesetzt wurden, wiesen beträchtliche Verringerungen der Tumor-Zahlen – im Bereich von 56 % bis 80 % unter den Vehikelkontrollen – bei allen drei Karzinogenen auf (Tabelle 3), aber während der täglichen Einwirkungen während der ersten zwei Wochen unterlagen sie einer übermäßigen Toxizität für die Schnauze und Vorderglieder. Diese Mäuse verloren Gewicht (1), und ~ 35 % starben, Nach 2-tägigem Aussetzen wurde die Einwirkungshäufigkeit auf zweimal wöchentlich verringert, und die Körpergewichte nahmen auf jene der Vehikel ausgesetzten Kontrollmäuse zu (1) und die Läsionen lösten sich auf, obwohl zwei weitere Mäuse früh in der Studie starben (Tabelle 4). Am Ende der Einwirkung waren die Gewichte wieder unterhalb jener der Vehikelkontrollen (1). Im Licht der signifikanten Folgen der lokalen Retinoid-Toxizität in diesem Modell ist eine Extrapolation dieser Ergebnisse auf Menschen schwierig.
Mit NNK und BaP behandelte Mäuse, die der mittleren Isotretinoin-Dosis ausgesetzt wurden, zeigten Verringerungen der Zahl der Tumorknoten um 88 bzw. 67 % (Tabelle 3). Am Ende der Einwirkung waren die Gewichte dieser Mäuse 11 % unterhalb jener der Vehikelkontrollen. Andere Zeichen von Toxizität fehlten, obwohl 3 % (2/63) der Mäuse vor Ende der Einwirkung starben (Tabelle 4). [Die Verringerung des Körpergewichts ist von ungewisser Signifikanz. Eine Kalorienbeschränkung > 10 % über einen signifikanten Abschnitt der Lebenszeit eines Tieres verringert die Tumorgenese in einigen Organen (26), aber erhöht die Tumorgenese in der Lunge (27).] Hyperplastische Bereiche waren bei den mit NNK und BaP behandelten Mäusen, die mittlerem und hohem Isotretinoin ausgesetzt wurden, signifikant erhöht. Die Gesamt-Läsionen, d.h. hyperplastische Bereiche plus Adenome, waren durch die Behandlung in den NNK-induzierten Tieren nicht beeinflusst, waren aber bei den mit Urethan behandelten Tieren bei der hohen Isotretinoin-Dosis und bei den mit BaP behandelten Tieren sowohl bei der mittleren als auch bei der hohen Isotretinoin-Dosis weniger (Tabelle 3).
Bei den mit einer niedrigen Isotretinoin-Dosis behandelten Tieren war die Zahl der Tumoren durch die Behandlung auf dem 95 % Vertrauensniveau nicht beeinflusst, aber sowohl bei den mit NNK als auch den mit BaP behandelten Mäusen waren Trends in Einklang mit jenen der mit mittlerer und hoher Isotretinoin-Dosis behandelten Mäusen sowohl bei Tumoren als auch bei hyperplastischen Bereichen sichtbar.
Bei den Urethan- und BaP-Behandlungen hatten die Vehikel ausgesetzten Mäuse weniger Tumoren als die Käfig-Kontrolltiere (Tabelle 3). Dieses Phänomen wurde zu einem sogar noch größeren Maß in einer Chemopräventionsstudie in A/J-Mäusen mit aerosolisiertem Budesonid beobachtet, bei der die Kontrollmäuse im Wesentlichen nur Luft ausgesetzt wurden (28), und dies ist möglicherweise mit der Tumorgenese-hemmenden Wirkung von Stress verbunden (29), obwohl ein Beitrag des Ethanol-Vehikels oder der Antioxidans-Hilfsstoffe Ascorbylpalmitat und α-Tocopherol in den hier mitgeteilten Studien nicht ausgeschlossen werden kann.
Biomarker: RAR-Induktion
Inhaliertes Isotretinoin regelte Lungengewebe-RARα um das 3,9-fache gegenüber Lösungsmittel, RARβ um das 3,3-fache und RARγ um das 3,7-fache hinauf (2a und b). RARs könnten nützliche Biomarker der Aktivität von inhaliertem Isotretinoin sein, da alle drei Gene Retinoid-Antwortelemente in ihren Promotoren enthalten und als Antwortgene erster Ordnung angesehen werden können (30).
DISKUSSION
Trotz vielversprechender anfänglicher klinischer Berichte und beträchtlichen grundsätzlichen Interesses an Retinoiden als chemopräventiven Mitteln für Lungenkrebs gab es nur überraschend begrenzte Arbeit mit diesen Mitteln in vorklinischen Wirksamkeitsmodellen. In diesem Pilotexperiment verwendeten wir das Karzinogen-induzierte A/J-Mausmodell, um anzufangen, einige einfache pharmakologische Punkte zu untersuchen. Die vorläufige Natur dieser Arbeit schließt es aus, definitive Schlussfolgerungen zu ziehen, aber eine Reihe von Beobachtungen ist stützbar.
Inhalationseinwirkungen von Isotretinoin
Ethanolische Isotretinoin-Lösungen wurden mit Teilchengrößen aerosolisiert, von denen berechnet wurde, dass sie für eine wesentliche pulmonale Abscheidung sorgen. Das Ethanol wurde aus der Einwirkungsluft nicht entfernt. Das inhalierte Ethanol sowie die Hilfsstoffe α-Tocopherol und Ascorbylpalmitat können bei der Urethan- und BaP-Behandlung eine Auswirkung auf die Karzinogenese gehabt haben, da Vehikel ausgesetzte Tiere weniger Tumoren aufwiesen als nicht ausgesetzte Kontrollen. Jedoch war die Auswirkung in diesen Experimenten – 20 und 30 % verringerte Tumor-Häufigkeit bei Urethan bzw. BaP – geringer als jene, die bei anderen beobachtet wurde – 50 % -, wenn mit BaP behandelte Kontrollmäuse im Wesentlichen nur Luft ausgesetzt wurden. In jedem Fall erzeugte der Zusatz von Isotretinoin zu den Aerosolen signifikante Abnahmen der Tumoren im Vergleich zu Nur-Vehikel-Aerosolen.
Lungentumor-Verhütung durch inhalierte Retinoide
In dieser Studie untersuchten wir täglich inhalierte Isotretinoin-Aerosole bei verschiedenen Dosen. Die niedrigste Dosis war nicht signifikant wirksam. Die höchste Dosis war mit letaler Toxizität verbunden, vermutlich aufgrund der umfangreichen Ulzeration der Schauze und Vorderglieder der Mäuse. Es wurde angenommen, dass dies mit den wohlbekannten lokalen toxischen Wirkungen von Retinoiden auf die Haut in Beziehung stand. Diese offensichtliche lokale toxische Antwort löste sich mit einer Verringerung der Dosis-Häufigkeit auf, und bei allen drei Karzinogenen traten bei diesem Dosierungsschema signifikant weniger Lungenknötchen auf. Im Licht der häufigen letalen Toxizität, die mit der Hochdosis-Einwirkung verbunden war, beschränkten wir jedoch unser Interesse auf die Einwirkung der mittleren Dosis als der relevanten Arzneistoff-Dosis.
Bei der mittleren Dosis wurden keine signifikanten toxischen Anzeichen außer Gewichtsverlust beobachtet, welcher nahe dem Ende der Studie auftrat (1). Die drei Prozent Sterberate in dieser Kohorte wäre in einem Experiment, an dem dieser Manipulationsgrad der Versuchstiere beteiligt ist, nicht ungewöhnlich. Selbst in den Vehikelkontrollen gab es aufgrund des experimentellen Verfahrens mehr als 10 % Gewichtsverlust im Vergleich zu nicht ausgesetzten Tieren. Man erwartet, dass der Stress der erzwungenen Aerosolinhalation bei Nagern von der freiwilligen Aerosolinhalation bei Menschen sehr verschieden ist.
Obwohl die Häufigkeit der inhalierten Dosis als Vorsichtsmaßnahme gegen eine potentielle lokale nasale Toxizität verringert wurde, war die mittlere Dosis immer noch mit einer signifikanten Verringerung der Zahl der Lungenknötchen bei beiden mit Tabak in Beziehung stehenden Karzinogenen BaP und NNK verbunden. Dieser Befund ist noch signifikanter, wenn man die Arzneistoffmenge berücksichtigt, die zur Erzielung dieser Wirkung erforderlich war. Zum Beispiel war über den größten Teil der Studie die mittlere Dosismenge, einschließlich extrapulmonaler Dosis, < 0,5 % einer oralen Dosis, die in den vorstehend erörterten in-vivo-Experimenten verwendet wurde (Tabelle 1); auf der Grundlage der pulmonalen Dosis allein (Tabelle 2) war die Dosierung < 0,15 % während der ersten zwei Wochen und < 0,06 % während des Rests des Experiments. Unter Berücksichtigung aller Umstände legen diese Vergleiche eine bemerkenswerte Arzneistoffpotenz für das inhalierte Aeorosol nahe.
Der Befund, dass eine mäßige Dosis von inhaliertem Retinoid sowohl verträglich als auch wirksam ist, stützt die Behauptung, dass eine Lungentherapie mittels Inhalation der bevorzugte Weg der Zufuhr an die Lunge ist, um mit der auf den Luftweg beschränkten Phase eines Krankheitsprozesses umzugehen, wie es bei gewissen Mitteln, die verwendet werden, um pulmonale Infektionen zu behandeln, und bei Corticosteroiden für die Krebsverhütung mitgeteilt worden ist. Eine offensichtliche Anwendung für den Inhalationsansatz ist die Verwendung von Retinoiden als chemopräventiven Mitteln für Lungenkrebs.
Hyperplasie und Gesamtläsionen: Wirkungsweise
Die vorläufigen Daten für die mit NNK behandelten Mäuse legen nahe, dass Isotretinoin initiierte Zellen nicht eliminiert, sondern deren Fortschreiten zum Tumorstadium inhibiert, da hyperplastische Bereiche umgekehrt mit Tumoren korrelieren, während die Gesamtläsionen, d.h. hyperplastische Bereiche plus Adenome, relativ konstant blieben (Tabelle 3). Eine ähnliche Zunahme der hyperplastischen Bereiche trat in den mit BaP behandelten Mäusen auf, aber in diesem Fall nahmen die Gesamtläsionen ab, was nahelegt, dass die initiierten Zellen entweder eliminiert wurden oder auf mikroskopische Cluster beschränkt waren.
BaP und NNK sind mutmaßliche Haupt-Karzinogene im Tabakrauch und sind demgemäß die relevantesten Karzinogene, die in dieser Studie verwendet wurden. Die Ähnlichkeiten zwischen den dominanten molekularen Läsionen, die von BaP und NNK verursacht werden – BaP verursacht G-C- zu T-A-Transversionen im ersten Nukleotid und NNK verursacht G-C- zu A-T-Transitionen im zweiten Nukleotid, beide im Codon 12 – ist ein Argument gegen einen wesentlichen biologischen Unterschied zwischen Zellen, die von den zwei Karzinogenen initiiert wurden.
Im Gegensatz zu den mit NNK und BaP behandelten Tieren nahm die Tumor-Zahl in den mit Urethan behandelten Mäusen nur bei der hohen Isotretinoin-Dosis ab, wobei die Bedeutung davon durch die damit verbundene Toxizität verdunkelt wird, und es gab keine Auswirkung auf die Zahl der hyperplastischen Bereiche (Tabelle 3). Die Gesamtzahl der Läsionen war in den Hochdosis-Tieren deutlich verringert, was eine Eliminierung von initiierten Zellen oder eine Begrenzung der klonalen Expansion auf mikroskopische Läsionen nahelegt. Wie NNK und BaP mutiert Urethan, ein Ethylierungsmittel, K-ras, aber am Codon 61 anstelle vom Codon 12. Morphologische Unterschiede der Tumoren traten ebenfalls auf. Der Bruchteil von Tumoren, der als feste Tumoren klassifiziert wurde, betrug 78 % und 88 % bei BaP- bzw. NNK-induzierten Tumoren, aber lediglich 57 % bei Urethan-induzierten Tumoren. Es ist interessant zu spekulieren, dass diese Unterschiede zu den unterschiedlichen Antworten auf inhaliertes Isotretinoin beitrugen, aber es scheint keine stützenden Daten in der Literatur zu geben.
Retinoid-Toxizität bei wirksamen Dosen
Obwohl die hohe Dosis mit dem zweimal-wöchentlichen Schema nur 6 % einer nicht-toxischen oralen Dosis betrug (Tabelle 1), war sie mit einem Gewichtsverlust gegen Ende der Studie verbunden (1, Tabelle 4). Bei den mit NNK und BaP behandelten Mäusen war diese Dosis im Wesentlichen nicht wirksamer als die viel kleinere mittlere Dosis (Tabelle 3). Vielleicht überraschend bewirkte die mittlere inhalierte Dosis von nur 0,4 % einer nicht-toxischen oralen Dosis ebenfalls einen Gewichtsverlust bei Mäusen, die > 10 Wochen ausgesetzt wurden. Die Überprüfung der Gewichtsdaten im Verlauf des Experiments (Daten der mit BaP behandelten Mäuse in 4, Daten der mit NNK und Urethan behandelten Mäuse nicht gezeigt) bestätigen den späten Beginn des Gewichtsverlusts.
Es gibt mindestens zwei mögliche Erklärungen für diesen Befund. Zuerst kann die Gesamt-Dosis als Ergebnis der Aufnahme durch die Haut der ausgesetzten Schnauze höher als berechnet sein; zweitens kann die lokale Toxizität im Atmungstrakt aufgetreten sein. Es scheint unwahrscheinlich, dass ausreichend Isotretinoin durch die Haut absorbiert werden konnte, um eine systemische Toxizität zu erzeugen, noch würde eine derartige Schlussfolgerung durch zahlreiche Inhalationsstudien in Mäusen mit Aeorosolen von anderen Verbindungen gestützt werden. Dies lässt eine lokale Toxizität als mögliche Erklärung. Die mikroskopische Überprüfung von Gewebe bezüglich pathologischer Änderungen bei dieser Pilot-Wirksamkeitsstudie wurde weder geplant, noch durchgeführt; jedoch zeigte eine grobe Überprüfung der Lungen keine Unterschiede zwischen Kontroll- und behandelten Lungen, außer den Unterschieden bei der Anzahl von Tumoren und hyperplastischen Bereichen. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die pulmonale Dosis laut Berechnung nur 13 % der abgeschiedenen Gesamtdosis ist und über ~ 600 cm² verteilt würde, erscheint eine pulmonale Toxizität unwahrscheinlich.
Im Gegensatz zu der großen Oberfläche der Lunge weist der obere Atmungstrakt, zum größten Teil Nasen-Schleimhaut, eine Oberfläche von lediglich ~ 3 cm² auf (37), aber empfängt ~ 87 % der abgeschiedenen Dosis. Durch Verbinden dieser hohen Dosis mit der Leichtigkeit, mit der Nager entkräftende Nasalläsionen entwickeln, schlagen wir vor, dass eine Erklärung für den Gewichtsverlust der Mäuse mit mittlerer Dosis die lokale Nasen-Toxizität ist, die sich nach ~ 10 Wochen Einwirkung zu signifikanten Ausmaßen entwickelte.
Nur toxikologische Studien mit eingeschlossener Histopathologie werden definitive Erklärungen für das Phänomen des Gewichtsverlusts bei diesen niedrigen Dosen liefern, aber wenn unser Vorschlag, dass die Toxizität für den oberen Atmungstrakt verantwortlich zu machen ist, korrekt ist, ist die Beobachtung wahrscheinlich für die Sicherheit von inhalierten Retinoiden bei Menschen nicht relevant. Bei pulmonalen Toxikologie-Studien, außer bezüglich Neoplasie, wird eine Nasen-Toxizität bei Nagern – die obligatorische Nasen-Atmer sind – aus Inhalationsmitteln gewöhnlich nicht als relevant für die Bewertung möglicher Auswirkungen bei Menschen angesehen, falls nicht eine Einwirkung beim Menschen die Nasenhöhle einschließen wird. In diesen Einwirkungsstudien ist aufgrund der Nager-Physiologie und -Anatomie die verabreichte Arzneistoff-Dosis für den Nasenrachenraum bei Nagern vielfach höher, als man es bei Menschen erwarten würde. Zum Beispiel wäre eine lokale Nasen-Toxizität bei einem chemopräventiven Mittel, das durch orale Inhalation verabreicht wird, nicht bedenklich, da dieser Verabreichungsweg den Arzneistoff-Durchgang durch die Nasenhöhle auslässt. Darüber hinaus scheint die Dosis-Antwort-Kurve der Wirksamkeit bereits bei der mittleren Dosis ein Plateau erreicht zu haben (Tabelle 3), was nahelegt, dass die Dosis bis zu einem Punkt zwischen der niedrigen Dosis und der mittleren Dosis ohne Opferung an Wirksamkeit erniedrigt werden könnte.
Grenzen des A/J-Mausmodells: Die mögliche Rolle von Entzündung bei Lungenkrebs
Eine spezielle Beschränkung des Maus-Inhalationsmodells besteht darin, dass mit der Natur des Arzneistoff-Zufuhrsystems ein Haupt-Bruchteil des gesamten verabreichten Arzneistoffs sich auf der Schnauze und im oberen Atmungstrakt abscheidet. Ohne Zufuhr des Arzneistoffs über Tracheostomie gibt es keine Alternative. Deshalb beruht ein Artefakt dieses Modells auf der ineffizienten Arzneistoffzufuhr in die tiefe Lunge. Bei Menschen, wo es viel effizientere pulmonale Arzneistoff-Zufuhrvorrichtungen gibt, würde man erwarten, dass der Bruchteil des Arzneistoffs, der in und um die Schnauze der Maus herum auftritt, direkt in den pulmonalen Luftweg wandert. Dieser verbesserte Arzneistoff- Zufuhrwirkungsgrad würde das Potential für eine lokale Toxizität in großem Maß verringern.
Bei einigen Arzneistoffen konnte die hohe extrapulmonale Abscheidung im Mausmodell die Interpretationen im Hinblick auf die Wirksamkeit des pulmonalen Arzneistoff-Zufuhrwegs verhindern. Im Fall von Isotretinoin schlagen wir vor, dass der extrapulmonal abgeschiedene Arzneistoff wahrscheinlich nicht relevant ist, da er entweder geschluckt oder in viel geringeren Mengen als unwirksame orale Dosen in den Blutstrom absorbiert würde (Tabelle 1) und so wahrscheinlich nicht signifikant zur Wirksamkeit beigetragen hat.
Wir verwendeten für die Bewertung der Wirksamkeit ein Tiermodell. Tiermodelle für menschlichen Lungenkrebs sind in großem Maß akzeptiert, aber wie alle vorklinischen Modelle ist das A/J-Mausmodell unvollkommen. Bei dem A/J-Modell entwickeln Mäuse, die mit vollständigen Karzinogenen behandelt worden sind, keine Lungenentzündung und die begleitende rasche Zellproliferation, die bei menschlicher Lungenerkrankung üblich ist. Der Beitrag von Entzündung zur aerodigestiven Krebsbildung wird zur Zeit offenkundiger, und dies kann teilweise die Weise sein, wie Retinoide ihren chemopräventiven Vorteil beim Menschen bewirken können.
Eine Verbindung zwischen dem mit Entzündung assoziierten Enzym COX-2 und dem Retinoid-Stoffwechselweg wird durch die Tatsache nahegelegt, dass der Ras/ERK-Signalweg eine Rolle bei der Regulierung der COX-2-Expression zu spielen scheint. Menschliche nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC)-Zelllinien mit Mutationen in K-ras weisen hohe Expressionsniveaus von COX-2 auf, und die Inhibierung der ras-Aktivität in diesen Zelllinien verringert die COX-2-Expression. Ratten-Darmepithelzellen und -Fibroblasten, die mit K-ras transfiziert sind, überexprimieren COX-2, wohingegen Inhibitoren von ERK diese Antwort verbessern. Wir und andere haben gefunden, dass die COX-Aktivität bei aerodigestiven Krebsen potentiell von Bedeutung ist. Ein hoher Prozentsatz von Maus- und Human-Lungen-Adenokarzinomen weist ein mutiertes ras-Gen und einen konstitutiv aktivierten ras-Signalweg auf, was die hohen Niveaus von COX-2 erklären kann, die in einigen Lungentumoren gesehen werden. Von RARβ ist bekannt, dass es den ras-Signalweg stört, indem es die Funktion des AP-1-Transkriptionsfaktors inhibiert. Ein erwartetes Ergebnis dieser Störung wäre die Hinunterregulierung der COX-2-Expression, die eine Rolle bei der abnehmenden Tumorgenese spielen kann, die im A/J-Lungenkrebsmodell nach Isotretinoin-Inhalation gesehen wird. Eine solche Auswirkung von RARs auf die COX-2-Expression wird durch veröffentlichte Daten gestützt, die zeigen, dass Retinoide die EGF (d.h. ras)-induzierte Transkription von COX-2 in menschlichen oralen Plattenepithelkarzinom-Zellen inhibieren.
Mit der Zeit wäre die Entwicklung von in-vivo-Modellen, welche den tatsächlichen Prozess der Karzinogenese bei Menschen näher widerspiegeln, hoch wünschenswert. Wir glauben, dass für die in diesem Manuskript erörterten Pilot-Bewertungen das A/J-Mausmodell ausreichend ist, solange seine Nachteile anerkannt werden. In zukünftigen Experimenten kann die lokale Aerosol-Arzneistoffdosis in und auf der Schnauze durch Modifikationen des Einwirkungssystems, um eine Gesichtseinwirkung zu verhindern, und durch Verringerung des Teilchendurchmessers auf ~ 0,3 μm verringert werden, was das Verhältnis von pulmonaler zu Gesamt-Dosis auf ~ 64 % erhöhen wird (24).
Induktion von RARs
RARs wurden als Biomarker untersucht, da ihre Gene Retinoesäure-Antwortelemente enthalten und als solche wahrscheinlich bald nach Einwirkung von Retinoiden hinaufreguliert werden, d.h., sie sind Abhängigkeitsgene erster Ordnung (30). Die Induktion aller drei RARs war in Lungen, die mittleren Isotretinoin-Konzentrationen ausgesetzt wurden, mindestens dreifach. Nur die mit Urethan behandelten Mäuse wurden in dieser Pilotstudie untersucht, aber diese repräsentieren wahrscheinlich die anderen Behandlungsgruppen bei dieser Bestimmung, da alle Mäuse den gleichen Aerosolen ausgesetzt wurden. Die Induktion der RARs in den Mäusen mit mittlerer Dosis korrelierte mit der Wirksamkeit in den mit BaP und NNK behandelten Mäusen und könnte nicht nur Biomarker für die Einwirkung liefern, sondern könnte auch ein Teil des Mechanismus für die Wirksamkeit des inhalierten Isotretinoins sein. Die Hinaufregulierung von Lungen-RARs durch inhaliertes Isotretinoin findet über die Arten hinweg statt, wie in einer begleitenden Veröffentlichung mitgeteilt. Diese Veröffentlichung zeigt auch, dass die orale Verabreichung Leber-, aber nicht Lungen-RARs induziert und dass die Verabreichung durch Inhalation nur Lungen- und nicht Leber-Rezeptoren induziert.
Folgerungen aus der Verbesserung des therapeutischen Index der Retinoid-Verabreichung
Die klinischen Versuche, eindeutig den chemopräventiven Nutzen von oralem Isotretinoin festzustellen, werden wahrscheinlich in naher Zukunft beendet sein. Jedoch selbst wenn sie positiv sind, wird erwartet, dass die Langzeit-Compliance aufgrund der signifikanten Häufigkeit von schwächenden Nebenwirkungen ein Hauptproblem sein wird. Selbst wenn die Abänderung des Verabreichungswegs von Retinoiden nur das Nebenwirkungsprofil verringern würde, würde dies den Arzneistoff viel interessanter für eine In-Betracht-Ziehung einer breiten klinischen Brauchbarkeit machen. Da die Rolle von Retinoiden bei der Aufrechterhaltung einer optimalen Bronchialepithel-Differenzierung umfangreich untersucht worden ist, sind darüber hinaus andere allgemeine vorteilhafte Auswirkungen von Retinoesäure auf Epithelien gut dokumentiert worden. Zum Beispiel wird unter Verwendung eines Nager-Modells chronischer obstruktiver Lungenkrankheit (COPD) nahegelegt, dass Retinoide parenchymale Lungenverletzungen, die mit einer beeinträchtigenden Atemfunktion in Beziehung stehen, umkehren können. In der Tat könnte dieser Vorteil, wenn es eine kausale Beziehung gibt, zu den Krebspräventiven Wirkungen beitragen, da Individuen, die an COPD und anderen mit Rauchen in Beziehung stehenden Krankheiten leiden, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs aufweisen.
Schlussfolgerung
In dieser vorläufigen Analyse der pulmonalen Isotretinoin-Zufuhr mittels Inhalation gab einen Wirksamkeitsnachweis für der Verringerung der pulmonalen Karzino genität der Tabak-Karzinogene NNK und BaP in A/J-Mäusen bei wöchentlichen pulmonalen Dosen von so wenig wie 0,25 mg/kg und eine nahegelegte Wirksamkeit selbst bei 0,04 mg/kg. Da die pulmonale Arzneistoff-Zufuhr den Arzneistoff direkt auf dem Tumor-Kompartiment abscheidet, kann eine Wirksamkeit bei niedrigen Dosen erzielt werden: Die mittlere und niedrige wöchentliche pulmonale Dosis war < 2 % bzw. < 0,3 % der höchsten empfohlenen wöchentlichen oralen Dosis von Isotretinoin für die Akne-Behandlung. Die hier mitgeteilten Ergebnisse sind aber umso ermutigender, als sie wahrscheinlich durch < 10 % des inhalierten Aerosols bewirkt wurden, welches sich in der Lunge abgeschieden hat, da die extrapulmonale Dosis wahrscheinlich zu gering war, um eine systemische Wirkung aufzuweisen. Dies legt nahe, dass durch eine selektivere Zufuhr von chemopräventiven Retinoid-Mitteln in tiefes Lungengewebe unter Verwendung von Aerosolen bei Menschen ein verbesserter therapeutischer Index erzielt werden kann. Weitere Arbeit mit diesem Ansatz, sowohl vorklinisch als auch in der Klinik, ist gerechtfertigt, um den wahren Nutzen dieses wichtigen neuen Chemopräventions-Zufuhransatzes zu validieren.
Tabelle 1 Vergleich des oralen Wegs mit dem Inhalationsweg für die chemopräventive Wirksamkeit von Isotretinoin gegen Lungentumor in A/J-Mäusen

a. Frasca und Garfinkel, 1981. Unter Annahme von 4 g täglich eingenommenem Futter pro 21 g Maus.
b. Berechnete abgeschiedene Gesamt-Dosis (Tabelle 2).
c. Trend für Wirksamkeit: p < 0,13 für NNK-behandelt; p < 0,30 für BaP-behandelt.

Zusammenfassung der Isotretinoin-Experimente
Bei zuvor behandelten Kopf- und Nackenkrebs-Patienten verringerte oral verabreichtes Isotretinoin (13-cis-Retinoesäure) das Auftreten von zweiten aerodigestiven Tumoren, einschließlich Lungentumoren, aber Nebenwirkungen machten eine chronische Therapie problematisch. Wir überlegten, dass inhaliertes Isotretinoin den Zielzellen ausreichend Arzneistoff für eine Wirksamkeit zur Verfügung stellen könnte, während eine systemische Toxizität vermieden wird, und wir begannen mit der hierin mitgeteilten Pilotstudie. Männlichen A/J-Mäusen wurden einzelne intraperitoneale (i.p.) Dosen von Urethan, einem üblichen experimentellen Lungen-Karzinogen, oder Benzo(a)pyren (BaP) oder 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK), mutmaßlichen Haupt-Karzinogenen in Tabakrauch, verabreicht. Am nächsten Tag begann man mit dem Einwirkenlassen von Isotretinoin-Aerosolen bei 1,3, 20,7 oder 481 μg/l über 45 min täglich. Nach zwei Wochen verursachte die hohe Dosis eine schwere Toxizität, was eine Verringerung der Dosishäufigkeit auf zweimal pro Woche erforderte. Als Vorsichtsmaßnahme wurde die mittlere Dosis auf drei Einwirkungen pro Woche verringert. Die wöchentlich abgeschiedenen Gesamt-Dosen nach den Dosis-Häufigkeitsverringerungen wurden zu 0,24, 1,6 und 24,9 mg/kg bei der niedrigen, mittleren und hohen Dosis berechnet, wobei abgeschätzt wurde, dass 16 % in der Lunge abgeschieden werden. Die wöchentlich abgeschiedenen pulmonalen Arzneistoff-Dosen wurden zu 0,01, 0,07 und 1,1 % einer früher mitgeteilten unwirksamen oralen Dosis in mit Urethan behandelten A/J-Mäusen berechnet. Nach 10–16 Wochen wurden die Mäuse geopfert, um die Bereiche von pulmonaler Hyperplasie und Adenomen zu zählen. Bei allen Karzinogenen zeigten die Mäuse, die der hohen Isotretinoin-Dosis ausgesetzt wurden, Verringerungen der Tumor-Zahl im Bereich von 56 bis 80 % (p < 0,005). Die mittlere Dosis war mit Verringerungen der Tumor-Zahl um 67 und 88 % (p < 0,005) in mit BaP bzw. NNK behandelten Mäusen verbunden, und wurde bis zu ~ 12 Wochen vertragen, als die Mäuse begannen, Gewicht zu verlieren. Die Mäuse mit niedriger Dosis hatten insignifikante Verringerungen von 30 % (p < 0,13) und 16 % (p < 0,30) bei mit BaP bzw. NNK behandelten Mäusen ohne irgendein Anzeichen von Nebenwirkungen. Bei mit BaP und NNK behandelten Mäusen korrelierten die Zahlen der hyperplastischen Bereiche direkt mit der Dosismenge und umgekehrt zur Tumor-Zahl, was eine gehemmte Weiterentwicklung nahelegte. Inhaliertes Isotretinoin mit mittlerer Dosis bewirkte im Vergleich zu Vehikel ausgesetzten Mäusen die Hinaufregulierung der Lungengewebe-Zellkern-Retinoesäure-Rezeptoren RARα (3,9-fach Vehikel), RARβ (3,3-fach) und RARγ (3,7-fach), was nahelegte, dass diese Rezeptoren der Retinoid-Aktivität in diesem System nützlich Biomarker sein könnten. Die ermutigenden Ergebnisse aus dieser Pilotstudie legen nahe, dass inhaliertes Isotretinoin eine Bewertung bei Menschen mit einem Lungenkrebs-Risiko verdient.
IV. Elektrohydrodynamische Aerosole
Therapeutische Formulierungen müssen mit einer Aerosol-erzeugenden Vorrichtung kompatibel sein, so dass eine Aerosol-Wolke mit gewissen bevorzugten Merkmalen jedes Mal reproduziert werden kann, wenn die Vorrichtung verwendet wird. Aerosole mit gleichförmigen Teilchen sind gegenüber Aerosolen mit ungleichförmigen Teilchen wegen der verbesserten Abscheidungsmerkmale des Aerosols wünschenswert. Wenn sie mit einer kompatiblen Formulierung verwendet werden, sind elektrohydrodynamische Aerosol-erzeugende Vorrichtungen in der Lage, monomodale Aerosole mit Teilchen mit einer gleichförmigeren Größe als bei anderen Vorrichtungen oder Verfahren zu schaffen.
Typisch umfassen elektrohydrodynamische Vorrichtungen eine Sprühdüse in Fluid-Kommunikation mit einer zu aerosolisierenden Flüssigkeitsquelle, mindestens eine Sprühelektrode, eine erste Spannungsquelle mit einer erster Leistung für die Aufrechterhaltung der Sprühdüse bei einem negativen (oder positiven) Potential relativ zu dem Potential der Sprühelektrode und eine zweite Spannungsquelle zur Aufrechterhaltung der Sprühelektrode bei einem positiven (oder negativen) Potential relativ zu dem Potential der Sprühdüse.
Eine elektrohydrodynamische Vorrichtung schafft ein Aerosol, indem sie veranlasst, dass eine Flüssigkeit Tröpfchen bildet, die in einen Bereich mit hoher elektrischer Feldstärke eintreten. Das elektrische Feld verleiht diesen Flüssigkeitströpfchen eine elektrische Nettoladung, und diese elektrische Nettoladung tendiert dazu, auf der Oberfläche des Tröpfchens zu bleiben. Die Abstoßungskraft der Ladung auf der Oberfläche des Tröpfchens steht im Gleichgewicht mit der Oberflächenspannung der Flüssigkeit in dem Tröpfchen, wodurch verursacht wird, dass das Tröpfchen eine Konus-artige Struktur bildet, die als Taylor-Konus bekannt ist. In der Spitze dieser Konus-artigen Struktur überwindet die elektrische Kraft, die auf die Oberfläche des Tröpfchens ausgeübt wird, die Oberflächenspannung der Flüssigkeit, wodurch ein Flüssigkeitsstrom erzeugt wird, der in viele kleinere Tröpfchen von etwa der gleichen Größe zerteilt wird. Diese kleineren Tröpfchen bilden einen Nebel, der die Aerosol-Wolke bildet, welche der Benutzer letztendlich inhaliert.

In der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist das Medikament dem Patienten oder dem Testsubjekt unter Verwendung einer elektrohydrodynamischen Aeorsol-erzeugenden Vorrichtung zuzuführen. Die Verwendung einer elektrohydrodynamischen Aerosol-erzeugenden Vorrichtung erzielt eine größere Arzneistoff-Wirksamkeit, da der Arzneistoff direkt den Geweben oder dem Organ (z. B. Epithelgewebe, Lunge usw.) zugeführt wird, die eine Behandlung erfordern, wodurch die Gesamt-Dosierung oder Arzneistoffmenge, die dem Empfänger zugeführt werden muss, verringert wird. Eine gesteuerte Teilchengröße und vorhersagbare Abscheidungsmuster machen elektrohydrodynamische Aerosol-erzeugende Vorrichtungen anderen Aerosol-erzeugenden Vorrichtungen bei Anwendungen, wie den die durch die Erfindung repräsentierten, überlegen. Verringerte Dosen und die gezielte Zufuhr dienen auch dazu, die unerwünschte Einwirkung von Antikrebs-Arzneistoffen auf benachbarte Gewebe zu minimieren sowie die systemische Toxizität zu verringern oder zu minimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Teilchengröße der Aerosol-Wolke, die von einer elektrohydrodynamischen Aerosol-erzeugenden Vorrichtung erzeugt wird, etwa 1,0 bis 6,0 Mikrometer. Man wende sich bitte an die anhängige U.S. Provisional Patent Application 60/132,215 "Therapeutic Formulations for Aerosolization and Inhalation". Siehe auch die anhängige U.S. Patent Applications 09/263,986 "Pulmonary Dosing System and Method" und 09/220,249 "Pulmonary Aerosol Delivery Device and Method". Beispiel Aerosolisierte 13-cis-Retinoesäure

Pulmonaler Dosis-Bereich	5,2 μg/kg täglich 83 μg/kg 3 × pro Woche 1931 μg/kg 2 × pro Woche
Mäuse:	5–2000 μg/kg Körpergewicht tägliche abgeschiedene pulmonale Dosis
Mäuse:	0,03–0,17–67,6 ng/cm² Lungenoberfläche
Menschen:	0,03–0,17–67,6 ng/cm² Lungenoberfläche
Menschen:	3–1310 μg/kg Körpergewicht für eine äquivalente Lungen-Dosis

Obwohl die obige Beschreibung viele spezielle Einzelheiten enthält, sollten diese nicht als Beschränkungen des Bereichs der Erfindung angesehen werden, sondern vielmehr als Beispiele für bevorzugte Ausführungsformen. Zahlreiche andere Abwandlungen der vorliegenden Erfindung sind möglich, und es ist nicht beabsichtigt, hierin alle möglichen äquivalenten Formen oder Verzweigungen dieser Erfindung zu erwähnen. Verschiedene Abänderungen können mit Bezug auf die vorliegende Erfindung vorgenommen werden, ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verwendung von Retinoesäure oder einem Retinoesäure-Derivat als Chemoprotektor bei der Herstellung eines Medikaments, das auf chronischer Basis über Inhalation in einer wirksamen Menge zur Inhibierung der Progression von Neoplasmen des Aerodigestionstrakts bei einem Patienten verabreicht wird, der einem Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs aus einer derartigen Progression unterliegt, wobei das Medikament zur Verabreichung durch eine elektrohydrodynamische Vorrichtung angepasst ist, wobei die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat mit 0,03 bis 0,17 ng/cm² Lungenoberfläche oder mit 0,84 bis 230 μg/g Human-Lungengewebe verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die wirksame Menge an inhalierter Retinoesäure oder inhaliertem Retinoesäure-Derivat Retinoesäure-Rezeptoren in der Lunge eines solchen Patienten aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 13-cis-Retinoesäure, all-trans-Retinoesäure, 9-cis-Retinoesäure, 11-cis-Retinoesäure und Retinol.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 13-cis-Retinoesäure und all-trans-Retinoesäure.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat mit 0,03 bis 0,05 ng/cm² Lungenoberfläche verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat dem Patienten einmal täglich verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der bei dem Patienten Lungenkrebs diagnostiziert worden ist und der vor dem Beginn der chronischen Behandlung durch Inhalation der Retinoesäure oder des Retinoesäure-Derivats bezüglich der Inhibierung oder der Entfernung des Lungenkrebses behandelt worden ist.
Verwendung nach Anspruch 7, bei der sich der Patient vor Beginn der Inhalationstherapie mit der Retinoesäure oder dem Retinoesäure-Derivat einer Behandlung durch Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie oder einer Kombination dieser Behandlungsschemata unterzieht.
Verwendung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat mit 0,03 bis 0,17 ng/cm² Lungenoberfläche verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat mit 0,03 bis 0,05 ng/cm² Lungenoberfläche verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die inhalierte Retinoesäure oder das inhalierte Retinoesäure-Derivat unter Verwendung einer elektrohydrodynamischen Vorrichtung verabreicht wird und bei der die einatembaren Teilchen des inhalierten Retinoesäure-Derivats im Größenbereich von 0,5 bis 6,0 Mikrometer liegen.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die Retinoesäure oder das Retinoesäure-Derivat einem Patienten mit einer Dosis von 0,03 bis 0,17 ng/cm² Lungenoberfläche 3 mal pro Woche verabreicht wird.